WO2001034790A1

WO2001034790A1 - Procede de synthese d'un acide nucleique

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Publication number: WO2001034790A1
Application number: PCT/JP2000/001919
Authority: WO
Inventors: Tsugunori Notomi; Tetsu Hase
Original assignee: Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1999-11-08
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2001-05-17
Also published as: CN1876843A; RU2252964C2; NO20022171L; CA2390309A1; ZA200203293B; BR0015382B1; RU2002115268A; NO20022171D0; KR100612551B1; CN100393875C; NO331732B1; CN1876843B; BR0015382A; IL149446A0; CA2390309C; CN1420928A; KR20020064896A

Description

明細書核酸の合成方法技術分野

本発明は、核酸の増幅方法として有用な、特定の塩基配列で構成される核酸を合成する方法に関する。背景技術

核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。また遺伝子そのものを検出対象とするために、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略できる場合もある。

とはいえ試料中に存在する目的の遺伝子量が少ない場合の検出は一般に容易ではなく、標的遺伝子そのものを、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。標的遺伝子を増幅する方法の一つとして PClKPolymerase Chain Reaction)法が知られている（Science, 230, 1350-1354, 1985)。 PCR法は、 in vitro における核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法である。その指数的な増幅効果に基づく高い感度により優れた検出方法として定着した。また、増幅生成物を DNAとして回収できることから、遺伝子クロ一ニングゃ構造決定などの遺伝子工学的手法を支える重要なツールとして幅広く応用されている。しかし PCR法においては、実施のために特別な温度調節装置が必要なこと；増幅反応が指数的に進むことから定量性に問題があること；試料や反応液が外部からの汚染を受け、誤って混入した核酸が銪型として機能してしまうコン夕ミネ一シヨンの影響を受け易いこと等の問題点が指摘されている。

ゲノム情報の蓄積に伴って、 1塩基多型（SNPs; single nucleotide polymorph ism)の解析が注目されている。プライマーの塩基配列に SNPsを含むように設計することによって PCRを利用した SNPsの検出が可能である。すなわち、反応生成物の有無によってプライマーに相補的な塩基配列の有無を知ることができる。しかし PCRにおいては、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合には、その生成物が以降の反応の錶型として機能して誤つた結果を与える原因となる。現実には、プライマーの末端における 1塩基の相違のみでは、 PCRを厳密に制御することは難しいといわれている。したがって、 PCRを SNPsの検出に利用するには特異性の改善が必要とされている。

一方リガーゼに基づく核酸合成方法も実用化されている。 LCR法（Ligase Chai n Reaction, Laffler TG; Carrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Cl in. (Pari s)， 1993, 51 : 9, 82卜 6)は、検出対象となる配列上において隣接する 2つのプローブをハイブリダィズさせ、リガーゼによって両者を連結する反応が基本原理になっている。標的塩基配列が存在しない場合には 2つのプローブを連結することはできないので、連結生成物の存在は標的塩基配列の指標となる。 LCR法も合成した相補鎖と錡型との分離に温度制御が必要となることから、 PCR法と同じ問題点を伴っている。 LCR については、隣接するプローブの間にギャップを設け、これを DNAポリメラーゼで充填する工程を加え特異性を改善する方法も報告されている。しかし、この改良方法によって期待できるのは特異性のみであり、温度制御を要求する点については依然として課題を残している。しかも、必要な酵素が増えるため、コストを犠牲にしているといえる。

検出対象配列を鎵型として相補的な配列を持つ DNAを増幅する方法には、 SDA法 (Strand Displacement Amplification) [Proc . Nat 1. Acad. Sc i . USA, 89 , 392-396； 1 992] [Nucleic Acid.Res.，20，1691-1696; 1992]と呼ばれる方法も知られている。 S DA法は、ある塩基配列の 3'側に相補的なプライマ一を合成起点として相補鎖合成を行うときに、 5'側に 2本鎖の領域が有るとその鎖を置換しながら相補鎖の合成を行う特殊な DNAポリメラーゼを利用する方法である。なお以下本明細書において単に 5'側、あるいは 3'側と表現するときには、いずれも銪型となっている方の鎖における方向を意味している。 5'側の 2本鎖部分が新たに合成された相補鎖によつて置換（displacement)されることから SDA法と呼ばれている。 SDA法では、ブライマ一としてァニールさせた配列に予め制限酵素認識配列を挿入しておぐことによって、 PCR法においては必須となっている温度変化工程の省略を実現できる。すなわち、制限酵素によってもたらされるニックが相補鎖合成の起点となる 3' -0H 基を与え、そこから鎖置換合成を行うことによって先に合成された相補鎖が 1本鎖として遊離して次の相補鎖合成の錶型として再利用される。このように SDA法は PCR法で必須となつていた複雑な温度制御を不要とした。

しかし、 SDA法では鎖置換型の DNAポリメラ一ゼに加え、必ずニックをもたらす制限酵素を組み合わせる必要がある。必要な酵素が増えるということは、コストアップの要因である。また、用いる制限酵素によって 2本鎖の切断ではなくニックの導入（すなわち一方の鎖だけの切断）を行うために、一方の鎖には酵素消化に耐性を持つように合成の際の基質としてひチォ dNTPのような dNTP誘導体を利用しなければならない。このため、 SDAによる増幅産物は天然の核酸とは異なった構造となり、制限酵素による切断や、増幅産物の遺伝子クローニングへの応用といつた利用は制限される。またこの点においてもコストアップの要因を伴っているといえる。加えて、未知の配列に SDA法を応用するときには、合成される領域の中にニック導入のための制限酵素認識配列と同じ塩基配列が存在する可能性を否定できない。このようなケースでは完全な相補鎖の合成が妨げられる心配がある。複雑な温度制御を不要とする核酸の増幅方法として、 NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplifications TMA/Transcription Mediated Amplification法とも呼ばれる）が公知である。 NASBAは、標的 Aを銪型として T7プロモーターを付加したプロ一ブで DNAポリメラ一ゼによる DNA合成を行い、これを更に第 2 のプローブで 2本鎖とし、生成する 2本鎖 DNAを鎵型として T7 RNAポリメラーゼによる転写を行わせて多量の A を増幅する反応系である（Nature, 350，9卜 92，1991)。 NASBAは 2本鎖 DNAを完成するまでにいくつかの加熱変性工程を要求するが、以降の T7 RNAポリメラーゼによる転写反応は等温で進行する。しかし、逆転写酵素、 RNaseH、 DNAポリメラ一ゼ、そして T7 Aポリメラ一ゼといった複数の酵素の組み合わせが必須となることから、 SDA と同様にコストの面では不利である。また複数の酵素反応を行わせるための条件設定が複雑なので、一般的な分析方法として普及させることが難しい。このように公知の核酸増幅反応においては、複雑な温度制御の問題点、あるいは複数の酵素が必要となることといった課題が残されている。

更に、これらの公知の核酸合成反応について、特異性やコストを犠牲にすることなく核酸の合成効率を更に向上させる試みについては、ほとんど報告が無い。たとえば、 RCA(Rolling- circle amplification)と呼ばれる方法では、標的塩基配列の存在下でパドロックプローブ (padlock probe)に相補的な塩基配列が連続した 1本鎖の DNA を継続して合成できることが示された（Paul M.Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July, 1998)。 RCAでは、 1本のオリゴヌクレォチドの 5'末端と 3'末端が LCRにおける隣接プローブを構成する特殊な構造のパドロックプローブが利用される。そして鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼを組み合わせることにより、標的塩基配列の存在下でライゲ一シヨンされ環ィ匕したパドロックプローブを錶型とする連続的な相補鎖合成反応がトリガ一される。同じ塩基配列からなる領域が繰り返し連続した構造を持つた 1本鎖核酸が生成される。この 1本鎖核酸に対して更にプライマーをァニールさせてその相補鎖の合成を行って、高度な増幅を実現している。しかし、複数の酵素が必要な点は依然として残された課題である。また、相補鎖合成のトリガ一は、 2つの隣接領域の連結反応に依存しており、その特異性は原理的に LCRと同じレベルである。

3' -0Hの供給という課題に対しては、 3'末端に同一鎖上の塩基配列に相補的な配列を持たせ、末端でヘアピンループを形成させる方法が公知である（ Gene 71，29-40，1988)。このようなヘアピンループからは、自身を錡型とした相補鎖合成が行われ、相補的な塩基配列で構成された 1本鎖の核酸を生成する。たとえば PCT/FR95/00891では、相補的な塩基配列を連結した末端部分で同一鎖上にァニールする構造を実現している。しかしこの方法では、末端が相補鎖との塩基対結合 (base pairing)を解消して改めて同一鎖上で塩基対結合を構成するステツプが必須である。このステップは塩基対結合を伴う相補的な塩基配列同士の末端における微妙な平衡状態に依存して進むとされている。すなわち、相補鎖との塩基対結合と、同一鎖上での塩基対結合との間で維持される平衡状態を利用し、同一鎖上の塩基配列とァニールしたもののみが相補鎖合成の起点となる。したがって、高度な反応効率を達成するためには、厳密な反応条件の設定が求められるものと考えられる。更にこの先行技術においては、プライマー自身がループ構造を作っている。そのためプライマーダイマ一がいつたん生成すると、標的塩基配列の有無にかかわらず自動的に増幅反応が開始され非特異的な合成産物を形成してしまう。これは重大な問題点といえる。更に、プライマ一ダイマーの生成とそれに伴う非特異的な合成反応によるプライマーの消費が、目的とする反応の増幅効率の低下につながる。

その他に、 DNAポリメラ一ゼに対して錡型とならない領域を利用して同一鎖にァニールする 3'末端構造を実現した報告（EP713922)がある。この報告も末端部分における動的平衡を利用している点、あるいはプライマーダイマー形成にともなう非特異的な合成反応の可能性においては先の PCT/FR95/00891 と同様の問題点を持つ。更に、 DNAポリメラ一ゼの銪型とならない特殊な領域をプライマ一として用意しなければならない。

また前記 NASBAの原理を応用した各種のシグナル増幅反応においては、 2本鎖のプロモーター領域を供給するためにしばしば末端でヘアビン状の構造を伴ったオリゴヌクレオチドが利用される（特開平 5-211873)。しかしこれらは、相補鎖合成の 3' - 0H の連続的な供給を可能とするものではない。更に特表平 10- 510161(W096/17079)においては、 RNAポリメラ一ゼによって転写される MA鍊型を得ることを目的として同一鎖上に 3'末端をァニールさせたヘアピンループ構造が利用されている。この方法では、 RNAへの転写と、 MAから DNAへの逆転写を利用して踌型の増幅が行われる。しかし、この方法も複数の酵素を組み合わせなければ反応系を構成できない。発明の開示

本発明の課題は、新規な原理に基づく核酸の合成方法を提供することである。より具体的には、低コス卜で効率的に配列に依存した核酸の合成を実現することができる方法を提供することである。すなわち、単一の酵素を用い、しかも等温反応条件の下でも核酸の合成と増幅を達成することができる方法の提供が、本発明の課題である。更に本発明は、公知の核酸合成反応原理では達成することが困難な高い特異性を実現することができる核酸の合成方法、並びにこの合成方法を応用した核酸の増幅方法の提供を課題とする。

本発明者らは、まず鎖置換型の相補鎖合成を触媒するポリメラーゼの利用が、複雑な温度制御に依存しない核酸合成に有用であることに着目した。このような DNAポリメラ一ゼは、 SDAや RCAでも利用された酵素である。しかし、たとえこのような酵素を用いたとしても、公知のプライマーに基づく手法では、たとえば SDA のように合成起点となる 3' -0Hを供給するために常に他の酵素反応が要求される。そこで本発明者らは、公知のアプローチとはまったく異なる角度から 3' - 0Hの供給について検討した。その結果、特殊な構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用することによって、付加的な酵素反応に頼らずとも 3' -0Hの供給が可能となることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の核酸の合成方法、更にはこの核酸合成方法を応用した核酸の増幅方法、ならびにこれらの方法を可能とする新規なオリゴヌクレオチドに関する。

〔 1〕以下の工程を含む 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。

a )同一鎖上の一部 F 1 cにァニールすることができる領域 F 1を 3'末端に備え、この領域 F 1が F 1 cにァニールすることによって、塩基対結合が可能な領域 F 2 cを含むループを形成することができる核酸を与える工程

b ) F 1 cにァニールした F 1の 3'末端を合成起点として相補鎖合成を行うェ程

c )領域 F 2 cに相補的な配列からなる F 2を 3'末端に含むォリゴヌクレオチドをァニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラ一ゼによる相補鎖合成を行って、工程 b ) で合成された相補鎖を置換する工程

d )工程 c ) で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を 3'末端に含むポリヌクレオチドをァニールさせ、その 3'末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程 c ) で合成された相補鎖を置換する工程

〔2〕工程 d )において、合成起点が領域 R 1 cにァニールすることができる同一鎖上の 3'末端に存在する領域 R 1であり、 R 1が R 1 cにァニールすることによって塩基対結合が可能な領域 R 2 cを含むループが形成される〔1〕に記載の方法。

〔3〕少なくとも以下の 2つの領域 X 2および X 1 cとで構成され、 X 2の 5，側に X 1 cが連結されたオリゴヌクレオチド。

X 2 ：特定の塩基配列を持つ核酸の任意の領域 X 2 cに相補的な塩基配列を持つ領域

X 1 c：特定の塩基配列を持つ核酸における領域 X 2 cの 5'側に位置する領域 X 1 cと実質的に同じ塩基配列を持つ領域

〔4〕工程 a )における核酸が、以下の工程によって提供される第 2の核酸である〔 1〕に記載の方法。 i ) 領域 X 2が領域 F 2であり、領域 X 1 cが領域 F 1 cである〔3〕に記載のオリゴヌクレオチドの領域 F 2を鎵型となる核酸の領域 F 2 cにァニールさせる工程、

ii )ォリゴヌクレオチドの F 2を合成起点とし、鍊型に相補的な塩基配列を持つ第 1の核酸を合成する工程

iii )工程 ii )で合成された第 1の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、

iv)工程 iii )における第 1の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つォリゴヌクレオチドをァニールさせ、それを合成起点として第 2 の核酸を合成し、その 3'末端の F 1を塩基対結合が可能な状態とする工程

〔5〕工程 iii)の塩基対結合を可能とする領域が R 2 cであり、かつ工程 iv) におけるオリゴヌクレオチドが、領域 X 2 cが領域 R 2 cであり、領域 X 1 c が領域 R 1 cである〔3〕に記載のオリゴヌクレオチドである〔4〕に記載の

〔6〕工程 iii)および iv)における塩基対結合が可能な状態とする工程を、鍊型における F 2 cの更に 3'側にァニールするアウタープライマー、および第 1の核酸における工程 iv)で合成起点とした領域の更に 3'側にァニールするァゥ夕一プライマーを合成起点とする鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる鎖置換相補鎖合成によって行う〔4〕または〔5〕に記載の方法。

〔7〕反応に用いる各オリゴヌクレオチドと錶型におけるその相補領域との融解温度が、同じストリンジエンシーの下で次の関係にある〔6〕に記載の方法。 (アウタープライマ一/铸型における 3，側の領域） ≤ ( F 2 c ZF 2および R 2 c /R 2 ) ≤ ( F 1 c /F 1および R 1 c /R 1 )

〔8〕鎵型となる核酸が RNAであり、工程 ii )における相補鎖合成を逆転写酵素活性を持つ酵素で行う〔4〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法。

〔9〕次の工程を繰り返すことによる 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。

A) 3'末端と 5'末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がァニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される銪型を提供する工程

B)同一鎖にァニールさせた前記錡型の 3'末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、

C) 前記ループのうち 3'末端側に位置するループ内に相補的な塩基配列を 3' 末端に含むオリゴヌクレオチドを、ループ部分にァニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程 B)で合成された相補鎖を置換してその 3'末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、および

D)工程 C) において 3'末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程 A)における新たな銪型とする工程

〔10〕工程 C )におけるオリゴヌクレオチドが、その 5，側末端に工程 B ) において合成起点となった 3'末端に相補的な塩基配列を備えたものである〔9〕に記載の増幅方法。

〔1 1〕更に工程 C) におけるオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖を工程 A) における錶型とする工程を含む〔10〕に記載の増幅方法。

〔12〕工程 A) における錡型が〔5〕に記載の方法によって合成されたものである〔9〕に記載の増幅方法。

〔13〕融解温度調整剤の存在下で鎖置換相補鎖合成反応を行う〔 1〕または〔9〕に記載の方法。

〔14〕融解温度調整剤がベ夕インである〔13〕に記載の方法。

〔15〕反応液中に 0.2〜3·0Μのべ夕インを存在させる〔14〕に記載の方法。〔16〕〔9〕〜〔15〕に記載のいずれかの増幅方法を行い、増幅反応生成物が生じたかどうかを観察することにより試料中の標的塩基配列を検出する方法。

〔17〕増幅反応生成物に、ループに相補的な塩基配列を含むプローブを加え、両者のハイブリダィズを観察する〔16〕に記載の方法。

〔18〕プローブが粒子標識されており、ハイブリダィズによって生じる凝集反応を観察する〔17〕に記載の方法。

〔19〕核酸の検出剤存在下で〔9；) 〜〔15〕に記載のいずれかの増幅方法を行い、検出剤のシグナル変化に基づいて増幅反応生成物が生じたかどうかを観察する〔16〕に記載の方法。

〔20〕〔16〕に記載の検出方法によって標的塩基配列の変異を検出する方法であって、増幅対象である塩基配列における変異が、増幅方法を構成するいずれかの相補鎖合成を妨げるものである方法。

〔21〕以下の要素を含む、 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成用キット。

i)錶型となる核酸の領域 F 2 cを X2 cとし、 F2 cの 5，側に位置する F 1 c を XI cとする〔3〕に記載のオリゴヌクレオチド

ii) i)のォリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域に相補的な塩基配列を含むォリゴヌクレオチド

iii)鍀型となる核酸の領域 F 2 cの 3'側に位置する領域 F 3 cに相補的な塩基配列を持つォリゴヌクレオチド

iv)鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラ一ゼ、および

V)要素 iv)の基質となるヌクレオチド

〔22〕 ii)のォリゴヌクレオチドが、 i)のォリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域 R 2 cを X2 cとし、 R2 cの 5' に位置する R 1 cを X 1 cとする〔3〕に記載のオリゴヌクレオチドである〔2 1〕に記載のキット。

〔2 3〕更に付加的に以下の要素を含む、〔2 2〕に記載のキット。

vi ) i )のォリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域 R 2 cの 3'側に位置する領域 R 3 cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド。

〔2 4〕〔2 1〕〜〔2 3〕に記載のいずれかのキッ卜に、更に付加的に核酸合成反応の生成物を検出するための検出剤を含む、標的塩基配列の検出用キット。

本発明において合成の目的としている 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸とは、 1本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合せに連結した核酸を意味する。更に本発明においては、相補的な塩基配列の間にループを形成するための塩基配列を含まなければならない。本発明においては、この配列をループ形成配列と呼ぶ。そして本発明によって合成される核酸は、実質的に前記ループ形成配列によって連結された互いに相補的な塩基配列で構成される。なお一般的には、それが部分的に塩基対結合を伴っているかどうかにかかわらず、塩基対結合を解離させたときに 2つ以上の分子に分離しないものを 1本鎖と呼ぶ。相補的な塩基配列は、同一鎖上で塩基対結合を形成することができる。本発明による 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸を、同一鎖上で塩基対結合させることによって得ることができる分子内塩基対結合生成物は、見かけ上 2本鎖を構成する領域と、塩基対結合を伴わないループ部分を与える。

すなわち、本発明における 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸とは、同一鎖上でァニールすることが可能な相補的な塩基配列を含み、そのァニ —ル生成物は折れ曲がったヒンジ部分に塩基対結合を伴わないループを構成する 1本鎖核酸と定義することもできる。そして塩基対結合を伴わないループには、相補的な塩基配列を持つヌクレオチドがァニールすることができる。ループ形成配列は任意の塩基配列であることができる。置換のための相補鎖合成を開始することができるように塩基対結合が可能であり、望ましくは特異的なァニーリングを達成するために他の領域に存在する塩基配列から識別可能な配列を備える。たとえば望ましい態様においては、鎵型となる核酸に由来し同一鎖上でァニールする領域（すなわち F 1 cや R 1 c ) の更に 3，側に位置する領域 F 2 c (あるいは R 2 c ) と実質的に同じ塩基配列を含む。

本発明において、実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、ある配列を錡型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してァニ一ルし相補鎖合成の起点を与えるとき、このある配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。たとえば F 2に対して実質的に同一な塩基配列とは、 F 2とまったく同一な塩基配列に加えて、 F 2にァニールして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える錡型として機能する塩基配列を含む。本発明における用語「ァニール」は、核酸がヮトソン—クリックの法則に基づく塩基対結合によって 2本鎖構造を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が 1本鎖であっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、ァニールである。本発明において、ァニールとハイブリダィズは、核酸が塩基対結合による 2本鎖構造を構成する点で同義である。

本発明による核酸を構成する相補的な塩基配列の数は、少なくとも 1組である。本発明の望ましい態様によれば、その整数倍となることもある。そしてこの場合、理論的には本発明における前記核酸を構成する相補的な塩基配列のペアの数に上限はない。本発明の合成生成物である核酸が複数組の相補的な塩基配列で構成されるとき、この核酸は同じ塩基配列の繰り返しからなる。

本発明によって合成される 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸は、必ずしも天然の核酸と同じ構造を取る必要はない。核酸重合化酵素の作用によって核酸を合成するときに基質としてヌクレオチド誘導体を利用すれば、核酸の誘導体の合成が可能なことは公知である。このようなヌクレオチド誘導体には、ラジオアイソト一プで標識したヌクレオチドゃ、ピオチンやジゴキシンのような結合性リガンドで標識したヌクレオチド誘導体などが用いられる。これらのヌクレオチド誘導体を用いることにより、生成物である核酸誘導体の標識が達成される。あるいは、蛍光性のヌクレオチドを基質として用いることによって、生成物である核酸を蛍光性の誘導体とすることができる。更にこの生成物は、 DNA であることもできるし、 RNA とすることもできる。いずれを生成するかは、プライマ一の構造、重合のための基質の種類、そして核酸の重合を行う重合化試薬との組み合わせによって決定される。

上記の構造を持った核酸の合成は、鎖置換活性を持った DNAポリメラ一ゼと、 3'末端に同一鎖上の一部 F 1 cにァニールすることができる領域 F 1を備え、この領域 F 1が同一鎖上の F 1 cにァニールすることによって、塩基対結合が可能な領域 F 2 cを含むループを形成することができる核酸によつて開始することができる。ヘアピンループを形成させて自身を錶型（template)とする相補鎖合成反応の報告は多いが、本発明においてはヘアピンループ部分に塩基対結合を可能とする領域を備えており、この領域を相補鎖合成に利用している点において新規である。この領域を合成起点とすることにより、先に自身を錡型として合成された相補鎖が置換される。そして置換された鎖の 3'側に存在する領域 R 1 c (任意の領域）が塩基対結合可能な状態となる。この R 1 cに相補的な塩基配列を持つ領域がァニールして相補鎖合成を行われ、結果として F 1から R 1 cにいたる塩基配列とその相補鎖とがループ形成配列を介して交互に結合した核酸（2分子）が生成する。本発明において、たとえば前記 R 1 cのように任意に選択される領域は、その領域に相補的な塩基配列を持つポリヌクレオチドをァニールすることができ、そしてそのポリヌクレオチドを合成起点として合成される相補鎖が本発明に必要な機能を備えている限り、任意の領域から選択することができる。

更に本発明では、核酸という用語を用いる。本発明において核酸とは、一般的には DNAと RNAの双方を含む。しかしながら、構成ヌクレオチドが人工的な誘導体に置換されているものや、あるいは天然の DNAや RNAが修飾されたものであっても、相補鎖合成のための铸型として機能する限り、本発明の核酸に含まれる。本発明の核酸は、一般に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、動物、植物、あるいは微生物の組織、細胞、培養物、排泄物あるいはそれらの抽出物を示すことができる。本発明の生物学的試料には、ウィルスやマイコプラズマのような細胞内寄生体のゲノム DNA、あるいは RNAが含まれる。また本発明の核酸は、前記生物学的試料に含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、 mRNA をもとに合成された cDMや、生物学的試料に由来する核酸をもとに増幅された核酸は、本発明における核酸の代表的なものである。

本発明の特徴となっている、 3'末端に同一鎖上の一部 F 1 cにァニールすることができる領域 F 1を備え、この領域 F 1が同一鎖上の F 1 cにァニールすることによって、塩基対結合が可能な領域 F 2 cを含むループを形成することができる核酸は、様々な方法によって得ることができる。もっとも望ましい態様においては、次の構造を持ったォリゴヌクレオチドを利用した相補鎖合成反応に基づいてその構造を与えることができる。

すなわち本発明において有用なオリゴヌクレオチドとは、少なくとも以下の 2 つの領域 X 2および X 1 cとで構成され、乂2の5'側に乂 1 cが連結されたオリゴヌクレオチドからなる。

X 2 ：特定の塩基配列を持つ核酸の領域 X 2 cに相補的な塩基配列を持つ領域 X 1 c：特定の塩基配列を持つ核酸における領域 X 2 cの 5'側に位置する領域 X 1 cと実質的に同じ塩基配列を持つ領域

ここで、本発明のオリゴヌクレオチドの構造を決定する特定の塩基配列を持つ核酸とは、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマ一として利用するときに、その錡型となる核酸を意味する。本発明の合成方法に基づいて核酸の検出を行う場合には、特定の塩基配列を持つ核酸とは、検出対象、あるいは検出対象から誘導された核酸である。特定の塩基配列を持つ核酸は、少なくともその一部の塩基配列が明らかとなっている、あるいは推測が可能な状態にある核酸を意味する。塩基配列を明らかにすべき部分とは、前記領域 X 2 cおよびその 5'側に位置する領域 X I cである。この 2つの領域は、連続する場合、そして離れて存在する場合とを想定することができる。両者の相対的な位置関係により、生成物である核酸が自己ァニールしたときに形成されるループ部分の状態が決定される。また、生成物である核酸が分子間のァニールではなく自己ァニールを優先的に行うためには、両者の距離が不必要に離れないほうが望ましい。したがって、両者の位置関係は、通常 0-500塩基分の距離を介して連続するようにするのが望ましい。ただし、後に述べる自己ァニールによるループの形成において、両者があまりにも接近している場合には望ましい状態のループの形成を行うには不利となるケースも予想される。ループにおいては、新たなオリゴヌクレオチドのァニールと、それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応がスムーズに開始できる構造が求められる。したがってより望ましくは、領域 X 2 cおよびその 5'側に位置する領域 X I cとの距離が、 0〜1 0 0塩基、さらに望ましくは 1 0〜7 0塩基となるように設計する。なおこの数値は X 1 cと X 2を含まない長さを示している。ループ部分を構成する塩基数は、更に X 2に相当する領域を加えた長さとなる。なお本発明に基づくォリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語は、いずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを意味しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してァニールすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でァニールすることができ、相補鎖合成の起点となる 3'末端を提供することができる配列を意味する o

上記特定の塩基配列を持つ核酸に対して本発明によるォリゴヌクレオチドを構成する領域 X 2および X 1 cは、通常は重複することなく連続して配置される。あるいはもしも両者の塩基配列に共通の部分があるのであれば、部分的に両者を重ねて配置することもできる。 X 2はプライマ一として機能する必要があることから、常に 3'末端となるようにしなければならない。一方 X 1 cは、後に述べるように、これを鎵型として合成された相補鎖の 3'末端にプライマーとしての機能を与える必要があることから、 5'末端に配置する。このオリゴヌクレオチドを合成起点として得られる相補鎖は、次のステップにおいては逆向きからの相補鎖合成の鍩型となり、最終的には本発明によるオリゴヌクレオチド部分も鎵型として相補鎖に写し取られる。写し取られることによって生じる 3'末端は塩基配列 X 1 を備えており、同一鎖上の X 1 cにァニールするとともに、ループを形成する。本発明においてオリゴヌクレオチドとは、相補的な塩基対結合を形成できること、そしてその 3'末端において相補鎖合成の起点となる- 0H基を与えること、の 2つの条件を満たすものを意味する。したがって、そのパックボーンは必ずしもホスホジエステル結合によるものに限定されない。たとえば Pではなく Sをバックボーンとしたホスホチォェ一ト体やべプチド結合に基づくベプチド核酸からなるものであることもできる。また、塩基は、相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。天然の状態では、一般には ACTGおよび Uの 5種類となるが、たとえばブロモデォキシゥリジン（bromodeoxyuridine)といった類似体であることもできる。本発明に用いるオリゴヌクレオチドは、合成の起点となるのみならず、相補鎖合成の錡型としても機能するものであることが望ましい。なお、本発明においてはオリゴヌクレオチドを含む用語としてポリヌクレオチドを用いる。用語ポリヌクレオチドは、その鎖長を制限しない場合に用い、オリゴヌクレオチドは比較的短い鎖長のヌクレオチド重合体を意味する用語として用いられる。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、以下に述べる各種の核酸合成反応において、与えられた環境の下で必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を持つ。具体的には、 5-200 塩基、より望ましくは 10-50 塩基対とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長が、最低 5塩基前後であることから、ァニールする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を期待するためには、確率的に 10塩基以上の長さを利用するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。なお、ここで例示した鎖長はあくまでも相補鎖とァニールする部分の鎖長である。後に述べるように、本発明によるオリゴヌクレオチドは最終的には少なくとも 2つの領域に個別にァニールすることができる。したがって、ここに例示する鎖長は、オリゴヌクレオチドを構成する各領域の鎖長と理解するべきである。

更に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、公知の標識物質によって標識することができる。標識物質としては、ジゴキシンやピオチンのような結合性リガンド、酵素、蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素などを示すことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを構成する塩基を蛍光性のアナログに置換する技術 (W095/05391 , ?1 1 1. 0&(1. 3(^ .118八，91，6644-6648, 1994)も公知でぁる。この他本発明によるオリゴヌクレオチドは、それ自身を固相に結合させておくこともできる。あるいは、オリゴヌクレオチドの任意の部分にピオチンのような結合性のリガンドで標識しておき、これを固相化アビジンのような結合パートナ —によって間接的に固相化することもできる。固相化オリゴヌクレオチドを合成開始点とする場合には、核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されることから、分離が容易となる。分離された生成物に対して、核酸特異的な指示薬や、あるいは更に標識プロ一ブをハイブリダィズさせることによって、検出を行うこともできる。あるいは、任意の制限酵素で消化することによって、目的とする核酸の断片を回収することもできる。

本発明において用いられる鎵型という用語は、相補鎖合成の錡型となる側の核酸を意味する。鍊型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、錶型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び錡型として機能することができる。つまり、相補鎖は铸型になることができる。本発明に有用なォリゴヌクレオチドは前記 2つの領域のみならず、更に付加的な領域を含むことができる。 X 2と X 1 cとがそれぞれ 3'末端と 5'末端に配置される一方、両者の間に任意の配列を介在させることが可能である。それは、たとえば制限酵素認識配列、 RNA ポリメラ一ゼが認識するプロモー夕一、あるいはリボザィムをコードする DNA等であることができる。制限酵素認識配列とすることにより、本発明の合成産物である 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を同じ長さを持った 2本鎖核酸に切りそろえることができるようになる。 RNA ポリメラーゼが認識するプロモー夕一配列を配置すれば、本発明の合成生成物を錡型として更に RNAへの転写が行われる。このときに、更にリボザィムをコードする DNAを配置すれば、転写生成物を自身で切断する系が実現する。なお、これらの付随的な塩基配列はいずれも 2本鎖となった場合に機能するものである _c したがって、本発明による 1本鎖の核酸がループを形成しているときには、これらの配列は機能しない。核酸の伸長が進み、ループを含まない状態で相補的な塩基配列を持つ鎖とァニールした状態になったときにはじめて機能する。

本発明に基づくォリゴヌクレオチドに対して、合成された領域の転写を可能とする方向でプロモーターを組み合わせた場合、同じ塩基配列を繰り返す本発明に基づく反応生成物は、高度に効率的な転写系を実現する。これを適当な発現系と組み合わせることによって、タンパク質への翻訳も可能である。すなわち、細菌や動物細胞内で、あるいは in vitroでの転写とタンパク質への翻訳に利用することができる。

上記のような構造の本発明によるオリゴヌクレオチドは、化学的に合成することができる。あるいは天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変する、あるいは連結することも可能である。本発明による核酸の合成方法において有用な上記ォリゴヌクレオチドを利用し、鎖置換活性を持った DNAポリメラーゼと組み合わせて合成を行う反応について、基本的な原理を図 5— 6を参考にしながら以下に説明する。上記ォリゴヌクレオチド（図 5における FA) は、まず X2 (F2に相当）が銪型となる核酸にァニールし相補鎖合成の起点となる。図 5においては F Aを起点として合成された相補鎖がアウタープライマ一（F 3)からの相補鎖合成（後述）によって置換され、 1本鎖（図 5—A) となっている。得られた相補鎖に対して更に相補鎖合成を行うと、このとき図 5— Aの相補鎖として合成される核酸の 3'末端部分は、本発明によるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を持つ。つまり、本発明のオリゴヌクレオチドは、その 5'末端部分に領域 X 1 c (F l cに相当）と同じ配列を持つことから、このとき合成される核酸の 3'末端部分はその相補配列 X 1 (F 1) を持つことになる。図 5は、 R 1を起点として合成された相補鎖がアウターブライマ一 R 3を起点とする相補鎖合成によって置換される様子を示している。置換によって 3'末端部分が塩基対結合が可能な状態となると、 3'末端の XI (F 1) は、同一鎖上の XI c (F l c) にァニールし、自己を銪型とした伸長反応が進む（図 5— B)。そしてその 3'側に位置する X 2 c (F 2 c) を塩基対結合を伴わないループとして残す。このループには本発明によるオリゴヌクレオチドの X 2 (F2) がァニールし、これを合成起点とする相補鎖合成が行われる（図 5— B)。このとき、先に合成された自身を錄型とする相補鎖合成反応の生成物が、鎖置換反応によって置換され塩基対結合が可能な状態となる。

本発明によるオリゴヌクレオチドを 1種類、そしてこのオリゴヌクレオチドをプライマ一として合成された相補鎖を錶型として核酸合成を行うことが可能な任意のリバースプライマ一を用いた基本的な構成によって、図 6に示すような複数の核酸合成生成物を得ることができる。図 6からわかるとおり、（D)が本発明において合成の目的となっている 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸である。他方の生成物 (E)は、加熱変性などの処理によって 1本鎖とすれば再び (D)を生成するための錶型となる。また 2本鎖状態にある核酸である生成物 (D)は、もしも加熱変性などによって 1本鎖にされた場合、もとの 2本鎖とはならずに高い確率で同一鎖内部でのァニールが起きる。なぜならば、同じ融解温度（Tm)を持つ相補配列ならば、分子間（intermolecular)反応よりも分子内（intramolecular) 反応のほうがはるかに優先的に進むためである。同一鎖上でァニールした生成物 (D)に由来する 1本鎖は、それぞれが同一鎖内でァニールして（B)の状態に戻るので、更にそれぞれが 1分子づつの (D)と（E)を与える。これらの工程を繰り返すことによって、 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を次々に合成していくことが可能である。 1サイクルで生成される銪型と生成物が指数的に増えていくので、たいへん効率的な反応となる。

ところで図 5—（A)の状態を実現するためには、はじめに合成された相補鎖を少なくともリバースプライマーがァニールする部分において塩基対結合が可能な状態にしなければならない。このステヅプは任意の方法によって達成することができる。すなわち、最初の銪型に対して本発明のオリゴヌクレオチドがァニールする領域 F 2 cよりも更に錡型上で 3'側の領域 F 3 cにァニールするアウタープライマ一（F 3 ) を別に用意する。このアウタープライマ一を合成起点として鎖置換型の相補鎖合成を触媒するポリメラーゼによって相補鎖合成を行えば、本発明の前記 F 2 cを合成開始点として合成された相補鎖は置換され、やがて R 1がァニールすべき領域 R 1 cを塩基対結合が可能な状態とする（図 5 )。鎖置換反応を利用することによって、ここまでの反応を等温条件下で進行させることができる。

アウタープライマ一を利用する場合には、 F 2 cからの合成よりも後にァウタ一プライマ一（F 3 ) からの合成が開始される必要がある。最も単純な方法はィンナ一プライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高くすることである。具体的には、通常 2〜5 0倍、望ましくは 4〜1 0倍の濃度差でプライマ一を用いることにより、期待どおりの反応を行わせることができる。またアウタープライマーの融解温度（Tm)をィンナープライマーの X 1 ( F 1や R 1に相当）領域の Tmより低くなるように設定することによって合成のタイミングをコント口ールすることもできる。すなわち、（アウタープライマ一 F 3 ： F 3 c ) ≤ ( F 2 c/F 2) ≤ (F 1 c/F 1)、あるいは（アウタープライマ一/銪型における 3，側の領域） ^ (X2 c ： X2) ≤ (X 1 c ： X 1) である。なおここで（F 2 c/F 2) ≤ (F 1 c/F 1 ) としたのは、 F 2がループ部分にァニールするよりも先に F 1 c/F 1間のァニールを行わせるためである。 F 1 c/F 1間のァニールは分子内の反応なので優先的に進む可能性が高い。しかしより望ましい反応条件を与えるために Tmを考慮することには意義がある。同様の条件は、リバースプライマ一の設計においても考慮すべきであることは言うまでもない。このような関係とすることにより、確率的に理想的な反応条件を達成することができる。融解温度 (Tm)は、他の条件が一定であればァニールする相補鎖の長さと塩基対結合を構成する塩基の組み合わせによって理論的に算出することができる。したがって当業者は、本明細書の開示に基づいて望ましい条件を容易に導くことができる。

更にアウタープライマーのァニールのタイミングを調整するために、コンティギユアスス夕ッキング（contiguous stacking)と呼ばれる現象を応用することもできる。コンティギユアスス夕ッキングとは、単独ではァニールすることができないオリゴヌクレオチドが 2本鎖部分に隣接することによつてァニールが可能となる現象である (Chiara Borghesi - Nicoletti et.al. Bio Techniques 12，

474-477(1992)。つまり、アウタープライマ一を F 2 c (X 2 c) に隣接させ、単独ではァニールできないように設計しておくのである。こうすれば、 F 2 c(X 2 c)がァニールしたときに初めてアウタープライマーのァニールが可能となるので、必然的に F 2 c (X 2 c)のァニールが優先されることになる。この原理に基づいて、一連の反応にプライマ一として必要なォリゴヌクレオチドの塩基配列を設定した例が実施例に記載されている。なお、この工程は加温による変性や、 DNAヘリ力一ゼによって達成することもできる。

F 2 c (X2 c) を持つ鎵型核酸が RNAの場合には、異なる方法により図 5— (A)の状態を実現することもできる。たとえば、この RNA鎖を分解してしまえば、 R 1は塩基対結合が可能な状態となる。すなわち、 F 2を RNAの F 2 cにァ二一ルさせ、逆転写酵素によって DNAとして相補鎖合成を行う。次いで銪型となった RNAをアル力リ変性や DNA/RNA 2本鎖の RNAに作用するリボヌクレァ一ゼによる酵素処理によつて分解すれば、 F 2から合成した DNAは 1本鎖となる。 DNA/ A 2本鎖の RNAを選択的に分解する酵素には、 RNaseHや、一部の逆転写酵素が備えているリボヌクレァーゼ活性を利用することができる。こうして塩基対結合を可能とした R 1 cにリバースプライマ一をァニールさせることができる。したがって R 1 cを塩基結合可能な状態とするためのアウタープライマーが不要となる。

あるいは逆転写酵素が備えている鎖置換活性を利用して、先に述べたアウターブライマ一による鎖置換を行うこともできる。この場合は逆転写酵素のみで反応系を構成することができる。すなわち、 A を鍊型として、その F 2 cにァ二一ルする F 2からの相補鎖合成、更にその 3'側に位置する F 3 cにァニールするァウタ一プライマー F 3を合成起点とする相補鎖合成と置換とが、逆転写酵素で可能となる。逆転写酵素が DNAを銪型とする相補鎖合成反応を行うものであれば、置換された相補鎖を鍩型としてその R 1 cにァニールする R 1を合成起点とする相補鎖合成、そして 3'側に位置する R 3 cにァニールする R 3を合成起点とする相補鎖合成と置換反応をも含めてすべての相補鎖合成反応が逆転写酵素によって進行する。あるいは、与えられた反応条件の下で逆転写酵素に DNA/DNA鎖の置換活性が期待できないときには、先に述べた鎖置換活性を持った DNAポリメラ一ゼを組み合わせて用いても良い。以上のように、 RNA を鍀型として第 1の 1本鎖核酸を得るという態様は、本発明における望ましい態様を構成する。逆に、鎖置換活性を有し、逆転写酵素活性を併せ持つ Bca DNAポリメラーゼのような DNAポリメラーゼを利用しても、同様に MAからの第 1の 1本鎖核酸の合成のみならず、以降の DNAを鎵型とする反応も同一の酵素によって行うことができる。

さて、以上のような反応系は前記リバースプライマーとして特定の構造を持つものを利用することによって、本発明に固有の様々なバリエーションをもたらす。もっとも効果的なバリエーションについて以下に述べる。すなわち、本発明のもつとも有利な態様においては、前記リバースプライマーとして、〔 5〕に述べたような構成からなるオリゴヌクレオチドを用いるのである。〔5〕のオリゴヌクレオチドとは、すなわち F 2をプライマーとして合成される相補鎖における任意の領域 R 2 cを X 2 cとし、； 1 cを X 1 cとするオリゴヌクレオチドである。このようなリバースプライマ一の利用により、ループの形成とこのループ部分からの相補鎖合成と置換という一連の反応が、センス鎖とアンチセンス鎖（フォーヮ一ド側とリバース側）の両方で起きるようになる。その結果、本発明による 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法の合成効率が飛躍的に向上すると共に、一連の反応を等温で実施可能とするものである。以下に、この態様をまとめた図 1一図 3に基づき、具体的に説明する。

以下の態様においては、本発明に基づくオリゴヌクレオチドとして 2種類を用意する。これを説明のために F Aと R Aと名づける。 F Aと R Aを構成する領域は、以下のとおりである。

X 2 X 1 c

F A F 2 F 1 c

R A R 2 R 1 c

ここで、 F 2は銪型となる核酸の領域 F 2 cに相補的な塩基配列である。また R 2は F 2をプライマ一として合成される相補鎖に含まれる任意の領域 R 2 cに相補的な塩基配列である。 F 1 cと R 1 cはそれぞれ、 F 2 cおよび R 2 cのそれぞれ下流に位置する任意の塩基配列である。ここで F 2— R 2間の距離は任意であって良い。相補鎖合成を行う DNAポリメラーゼの合成能力にも依存するが、好適な条件では lkbp程度の長さであっても十分に合成が可能である。より具体的には、 Bst DNAポリメラ一ゼを用いた場合、 F2/R2c間で 800bp、望ましくは 500bp 以下の長さであれば確実に合成される。温度サイクルを伴う PCRでは、温度変化ストレスによる酵素活性の低下が長レゝ塩基配列の合成効率を下げるとされている。本発明における望ましい態様では、核酸増幅工程における温度サイクルが不要となるので、長い塩基配列であっても合成、ならびに増幅を確実に達成することができる。

まず銪型となる核酸に対して F Aの F 2をァニールさせ、これを合成起点として相補鎖合成を行う。以下、図 1の (4)にいたるまでは先に説明した本発明の基本的な態様（図 5 ) と同様の反応工程となっている。図 1の（2)で F 3としてァニ一ルしている配列は、先に説明したアウタープライマーである。このプライマ一を合成起点として鎖置換型の相補鎖合成を行う DNAポリメラーゼで行うことにより、 F Aから合成した相補鎖は置換され、塩基対結合が可能な状態となる。

(4)で R 2 cが塩基対結合が可能な状態となったところで、リバースプライマーとしての R Aが R 2 c ZR 2の組み合わせでァニールする。これを合成起点とする相補鎖合成は、 F Aの 5'側末端である F 1 cに至る部分まで行われる。この相補鎖合成反応に続いて、やはり置換用のアウタープライマー R 3がァニールし、鎖置換を伴って相補鎖合成を行うことにより、 R Aを合成起点として合成された相補鎖が置換される。このとき置換される相補鎖は、 R Aを 5'側に持ち F Aに相補的な配列が 3'末端に位置する。

さて、こうして置換された 1本鎖核酸の 3'側には、同一鎖上の F l cに相補的な配列 F 1が存在する。 F 1は、同一分子内に並ぶ F 1 cに速やかにァニールし、相補鎖合成が始まる。 3'末端（F 1 )が同一鎖上の F 1 cにァニールするときに、 F 2 cを含むループが形成されている。このループ部分は塩基対結合が可能な状態で維持されていることは、図 2 -(7)からも明らかである。 F 2 cに相補的な塩基配列を持つ本発明のォリゴヌクレオチド F Aは、このループ部分にァニールして相補鎖合成の起点となる（7)。ループ部分からの相補鎖合成は、先に開始した F 1からの相補鎖合成の反応生成物を置換しながら進む。その結果、自身を錡型として合成された相補鎖は、再び 3'末端において塩基対結合が可能な状態となる。この 3'末端は、同一鎖上の R 1 cにァニールしうる領域 R 1を 3'末端に備えており、やはり同一分子内の速やかな反応により両者は優先的にァニールする。こうして、先に説明した F Aを錡型として合成された 3'末端からの反応と同様の反応が、この領域でも進行する。結果として、本発明による 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸は次々と相補鎖合成と置換とを継続し、その 3'末端 R 1を起点とする伸長を続けることになる。 3'末端 R 1の同一鎖へのァニールによって形成されるループには常に R 2 cが含まれることから、以降の反応で 3'末端のループ部分にァニールするのは常に R 2を備えたォリゴヌクレオチド（すなわち R A ) となる。

一方、自分自身を銪型として伸長を継続する 1本鎖の核酸に対して、そのループ部分にァニールするォリゴヌクレオチドを合成起点として相補鎖合成される核酸に注目すると、ここでも本発明による 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成が進行している。すなわち、ループ部分からの相補鎖合成は、たとえば図 2—( 7)においては、 R Aに達した時点で完了する。そして、この核酸の合成によって置換された核酸が相補鎖合成を開始（図 3—（8))すると、やがてその反応はかって合成起点であつたループ部分に達して再び置換が始まる。こうしてループ部分から合成を開始した核酸も置換され、その結果同一鎖上にァニールすることができる 3，末端 R 1を得る（図 3—（10))。この 3'末端 R 1は同一鎖の R 1 cにァニールして相補鎖合成を開始する。さて、この反応の Fと Rを読みかえれば、図 2—( 7)で起きている反応と同じである。したがって図 3—( 10)に示す構造は、自身の伸長と新たな核酸の生成を継続する新しい核酸として機能することができる。

なお図 3— ( 10)に示す核酸から開始する核酸の合成反応は、ここまで述べてきたものとは逆に常に 3'末端 F 1を合成起点とする伸長となる。すなわち本発明においては、 1つの核酸の伸長に伴って、これとは別に伸長を開始する新たな核酸を供給しつづける反応が進行する。更に鎖が伸長するのに従い、末端のみならず、同一鎖上に複数のループ形成配列がもたらされる。これらのループ形成配列は、鎖置換合成反応により塩基対形成可能な状態となると、ォリゴヌクレオチドがァニールし、新たな核酸の生成反応の基点となる。末端のみならず鎖の途中からの合成反応も組み合わされることにより、さらに効率のよい増幅反応が達成されるのである。以上のようにリバースプライマーとして本発明に基づくオリゴヌクレォチド R Aを組み合わせることによって、伸長とそれに伴う新たな核酸の生成が起きる。更に本発明においては、この新たに生成した核酸自身が伸長し、それに付随する更に新たな核酸の生成をもたらす。一連の反応は、理論的には永久に継続し、きわめて効率的な核酸の増幅を達成することができる。しかも本発明の反応は、等温条件のもとで行うことができる。

このとき蓄積する反応生成物は、 F 1— R 1間の塩基配列とその相補配列が交互に連結された構造を持つ。ただし繰り返し単位となっている配列の両端には、 F 2 -F 1 (F2 c— F l c)、または R 2 -R 1 (R 2 c -R 1 c)の塩基配列で構成される領域が連続している。たとえば図 3— (9)では、 5'側から（R2— F 2 c) - (F 1 -R 2 c) - (R 1 -F 1 c) - (F 2 -R 2 c) という順序で連結された状態となる。これは、本発明に基づく増幅反応が、オリゴヌクレオチドを合成起点として F 2 (または R2)から開始し、続いて自身の 3'末端を合成起点とする F 1 (または R 1) からの相補鎖合成反応によって伸長するという原理のもとに進行しているためである。

さて、ここでは最も望ましい態様としてループ部分にァニールするォリゴヌクレオチドに本発明によるオリゴヌクレオチド FA、および R Aを用いた。しかし本発明による核酸の増幅反応は、これらの限られた構造を持ったオリゴヌクレオチドのみならず、ループからの相補鎖合成を開始できるオリゴヌクレオチドを利用しさえすれば実施することができる。つまり、伸長を続ける 3'末端はループからの相補鎖合成によって置換されさえすれば、再びループ部分を与える。ループ部分から開始する相補鎖合成は、常に 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を錡型としていることから、本発明で目的としている核酸の合成が可能なことは自明である。ただし、ここで合成される核酸は、置換後にループを形成して相補鎖合成は行うものの、以降のループを形成するための 3'末端を持たないため、新たな錶型としては機能できなくなる。したがって、 F A、あるいは R Aによって合成を開始した核酸と違って指数的な増幅は期待できない。このような理由から、 F Aや R Aのような構造を持ったオリゴヌクレオチドは、本発明に基づく高度に効率的な核酸の合成に有用なのである。

一連の反応は、錡型となる 1本鎖の核酸に対して、以下の成分を加え、 F Aおよび R Aを構成する塩基配列が相補的な塩基配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュベートするだけで進行する。

• 4種類のォリゴヌクレオチド：

F A,

R A、

ァゥ夕一プライマ一 F 3、

およびアウタープライマー R 3、

•鎖置換型の相補鎖合成を行う MAポリメラーゼ、

• DNAポリメラ一ゼの基質となるヌクレオチド

したがって、 PCR のような温度サイクルは必要無い。なおここでいう安定な塩基対結合とは、反応系に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が相補鎖合成の起点を与えうる状態を意味する。安定な塩基対結合をもたらす望ましい条件は、たとえば融解温度 (Tm)以下に設定することである。一般に融解温度 (Tm)は、互いに相補的な塩基配列を持つ核酸の 50%が塩基対結合した状態となる温度とされている。融解温度 (Tm)以下に設定することは本発明の必須の条件ではないが、高度な合成効率を達成するためには考慮すべき反応条件の一つである。錡型とすべき核酸が 2本鎖である場合には、少なくともオリゴヌクレオチドがァニールする領域を塩基対結合が可能な状態とする必要がある。そのためには一般に加熱変性が行われるが、これは反応開始前の前処理として 1度だけ行えば良い。

この反応は、酵素反応に好適な pHを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持ゃァニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度 (Tm)の調整剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、 Tris-HCl等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。 pHは使用する DNAポリメラ一ゼに応じて調整する。塩類としては KC1、 NaCl、あるいは (NH₄)₂S0₄等が、酵素の活性維持と核酸の融解温度 (Tm)調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ゥシ血清アルブミンや糖類が利用される。更に融解温度（Tm)の調整剤には、ジメチルスルホキシド（DMS0)やホルムアミドが一般に利用される。融解温度 (Tm)の調整剤を利用することによって、前記ォリゴヌクレオチドのァニールを限られた温度条件の下で調整することができる。更にべ夕イン（N,N，N，- trimethylglycine)ゃテトラアルキルアンモニゥム塩は、その isostabilize作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。ベタインは、反応液中 0.2〜3.0M、好ましくは 0.5〜1.5 M程度の添加により、本発明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジエンシーと反応性を与える条件を経験的に設定する。

本発明においては、一連の反応が常に複数の領域の位置関係を維持した状態でなければ進行しないことが重要な特徴である。この特徴によって、非特異的な相補鎖合成に伴う非特異的な合成反応が効果的に防止できるのである。すなわち、たとえ何らかの非特異的な反応が起きたとしても、その生成物が以降の増幅工程に対して出発材料となる可能性を低く押さえることにつながるのである。またより多くの領域によつて反応の進行が制御されているということは、類似した塩基配列の厳密な識別を可能とする検出系を自由に構成できる可能性をもたらす。この特徴を遺伝子変異の検出に利用することができる。本発明におけるァウタ一プライマーを用いる態様においては、このアウタープライマ一 2種、本発明のオリゴヌクレオチドからなるプライマー 2種の合計 4種のプライマーが用いられている。すなわち 4種のォリゴヌクレオチドに含まれる 6領域が設計通りに働かなければ本発明の合成反応は進行しない。特に、相補鎖合成の起点となる各オリゴヌクレオチドの 3'末端、および相補配列が合成起点となる X 1 c領域の 5'末端の配列は重要である。そこで、この重要な配列を検出すべき変異に対応するように設計すれば、本発明による合成反応生成物を観察することによって、塩基の欠失や挿入といった変異の有無、あるいは SNPsのような遺伝子多型を総合的に分析することができる。より具体的には、変異や多型が予想される塩基が、相補鎖合成の起点となるオリゴヌクレオチドの 3'末端付近（相補鎖が起点となる場合には 5'末端付近）に相当するように設計するのである。相補鎖の合成起点となる 3'末端や、その付近にミスマッチが存在すると核酸の相補鎖合成反応は著しく阻害される。本発明においては、反応初期の生成物における末端構造が繰り返し反応を行わなければ高度な増幅反応に結びつかない。したがって、たとえ誤った合成が行われたとしても、増幅反応を構成する相補鎖合成がいずれかの段階で常に妨げられるのでミスマッチを含んだままでは高度な増幅は起きない。結果的にミスマツチが増幅反応を効果的に抑制し、最終的には正確な結果をもたらすことになる。つまり本発明に基づく核酸の増幅反応は、より完成度の高い塩基配列のチェック機構を備えていると言うことができる。これらの特徴は、たとえば単純に 2つの領域で増幅反応を行っている PCR法などでは期待しにくい利点である。

更に本発明に用いるオリゴヌクレオチドを特徴付ける領域 X 1 cは、相補配列が合成されてはじめて合成起点となり、この相補配列が、新たに合成された同一鎖内の配列 X 1にァニールすることにより、自己を錡型とする合成反応が進行する。このため、ことえ先行技術でしばしば重要な問題となるいわゆるプライマーダイマーを生成しても、本オリゴヌクレオチドはループを形成しない。したがつて、プライマーダイマーに起因する非特異的な増幅は原理的に生じ得ず、反応の特異性向上に貢献している。 ' 更に本発明によれば、 F3 (図 1-(2)) や R3 (図 2-(5)) で示したアウターブラィマーを組み合わせることによって、上記の一連の反応を等温条件下で行うことができる。すなわち本発明は、前記〔9〕に示した工程を含む 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を増幅する方法を提供するものである。この方法では、 F2cZF2間、 R2 c/R2間、 F l c/F l間、そして R 1 c/R 1間で安定なァニールが起きる温度条件が選択され、そして望ましくは F 3 c/F3間、ならびに R 3 c/R 3間は、それぞれ F2 c/F2間、ならびに R 2 c/R 2間のァニールに助けられるコンティギユアスス夕ッキング現象によってァニールするように設定される。

本発明においては核酸の合成（synthesis)と増幅（amplification)という用語を用いる。本発明における核酸の合成とは、合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。合成に加えて、更に他の核酸の生成と、この生成された核酸の伸長反応とが連続して起きるとき、一連の反応を総合して増幅とい

Ό。

さて、 3'末端に同一鎖上の一部 F 1 cにァニールすることができる領域 F 1を備え、この領域 F 1が同一鎖上の F 1 cにァニールすることによって、塩基対結合が可能な領域 F 2 cを含むループを形成することができる 1本鎖核酸は、本発明の重要な構成要素である。このような 1本鎖核酸は、次のような原理に基づいて供給することもできる。すなわち、予め次のような構造を持ったプライマーに基づいて相補鎖合成を進めるのである。

5'- [プライマ一内に位置する領域 XI cにァニールする領域 XI] - [塩基対結合が可能な状態にあるループ形成配列] ― [領域 Xl c] - [鍊型に相補的な配列を持つ領域] - 3'

铸型に相補的な配列を持つ領域には、 F 1に相補的な塩基配列（プライマー F A) および R 1 cに相補的な塩基配列（プライマ一 RA) の 2種類を用意する。なお、このとき合成すべき核酸を構成する塩基配列は、領域 F 1から領域 Rl c にいたる塩基配列と、この塩基配列に相補的な塩基配列を持つ領域 R 1から領域 F 1 cにいたる塩基配列とを含むものである。一方、プライマー内部でァニールすることができる X 1 cと X 1は、任意の配列とすることができる。ただしプライマ一 F Aと R Aの間では、領域 X I c /X lの配列を異なるものとするのが望ましい。

まず錶型核酸の領域 F 1から前記プライマー F Aによる相補鎖合成を行う。次いで合成された相補鎖の領域 R 1 cを塩基対結合が可能な状態とし、ここに一方のプライマ一をァニールさせて相補鎖合成の起点とする。このとき合成される相補鎖の 3'末端は、最初に合成された鎖の 5'末端部分を構成するブライマ一 F Aに相補的な塩基配列を持つので、 3'末端には領域 X Iを持ち、これが同一鎖上の領域 X I cにァニールするとともにループを形成する。こうして、前記本発明による特徴的な 3'末端構造が提供され、以降の反応は最も望ましい態様として示した先の反応系そのものとなる。なおこのときループ部分にァニールするオリゴヌクレオチドは、 3'末端にループ内に存在する領域 X 2 cに相補的な領域 X 2を持ち、 5，側には領域 X Iを持つものとする。先の反応系ではプライマ一 F Aと R Aを使つて銪型核酸に相補的な鎖を合成することによつて核酸の 3'末端にループ構造をもたらした。この方法は、短いプライマーで効果的に本発明に特徴的な末端構造を提供する。一方、本態様においては、プライマ一としてはじめからループを構成する塩基配列全体を提供しており、より長いブライマーの合成が必要となる。

リバースプライマーに制限酵素認識領域を含む塩基配列を利用すれば、本発明による異なった態様を構成することができる。図 6に基づき、リバースプライマ —が制限酵素認識配列を含む場合について具体的に説明する。図 6—(D)が完成したところで、リバースブラィマー内の制限酵素認識部位に対応する制限酵素によりニックが生じる。このニックを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成反応が開始する。リバースプライマ一は (D)を構成する 2本鎖核酸の両端に位置しているので、相補鎖合成反応も両端から開始することになる。基本的には先行技術として記載した SDA法の原理に基づくが、錡型となる塩基配列が本発明によって相補的な塩基配列を交互に連結した構造となっているので、本発明に特有の核酸合成系が構成されるのである。なお、ニックを入れるリバースプライマーの相補鎖となる部分には制限酵素による 2本鎖の切断が生じないようにヌクレァ一ゼ耐性となるように dNTP誘導体が取りこまれるように設計しなければならない。

リバースプラィマ一に RNAポリメラーゼのプロモー夕一を揷入しておくこともできる。この場合も SDA法を応用した先の態様と同様に、図 6— (D)の両端からこのプロモー夕一を認識する MAポリメラ一ゼにより転写が行われる。

本発明によって合成された核酸は、 1本鎖とは言え相補的な塩基配列から構成されるため、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、合成生成物の検出が可能である。ェチジゥムブ口マイド、 SYBR Green I、あるいは Pico Greenのような 2本鎖特異ィン夕一力レーターである蛍光色素の存在下で本発明による核酸の合成方法を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニタ一すれば、閉鎖系でリアルタイムな合成反応の追跡が可能である。この種の検出系は PCR法への応用も考えられているが、プライマ一ダイマ一等によるシグナルの発生と区別がつかないことから問題が多いとされている。しかし本発明に応用した場合には、非特異的な塩基対結合が増加する可能性が非常に低いことから、高い感度と少ないノイズが同時に期待できる。 2本鎖特異インターカレー夕一と同様に、均一系の検出系を実現する方法として、蛍光エネルギー転移の利用が可能である。

本発明による核酸の合成方法を支えているのは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラ一ゼである。上記反応中には、必ずしも鎖置換型のポリメラーゼを要しない反応ステップも含まれてはいる。しかし、構成試薬の単純化、そして経済性の点で、 1種類の DNAポリメラ一ゼを利用するのが有利である。この種の DNAポリメラーゼには、以下のようなものが知られている。また、これらの酵素の各種変異体についても、それが配列依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、本発明に利用することができる。ここで言う変異体とは、酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示すことができる。

Bst MAポリメラ一ゼ

Bca(exo- )DNAポリメラ一ゼ

DNA ポリメラ一ゼ Iのクレノウ ·フラグメント

Vent DNAポリメラ一ゼ

Vent( Exo- )DNAポリメラ一ゼ（Vent DNAポリメラ一ゼからェクソヌクレア一ゼ活性を除いたもの）

DeepVent DNAポリメラ一ゼ

DeepVent(Exo- )DNAポリメラ一ゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからェクソヌクレァーゼ活性を除いたもの）

Φ29ファージ DNAポリメラーゼ

MS- 2ファージ DNAポリメラーゼ

Z-Taq DNAポリメラ一ゼ（宝酒造）

KOD DNAポリメラ一ゼ（東洋紡績）

これらの酵素の中でも Bst DNAポリメラ一ゼゃ Bca(exo- )DNAポリメラーゼは、ある程度の耐熱性を持ち、触媒活性も高いことから特に望ましい酵素である。本発明の反応は、望ましい態様においては等温で実施することができるが、融解温度 (Tm)の調整などのために必ずしも酵素の安定性にふさわしい温度条件を利用できるとは限らない。したがって、酵素が耐熱性であることは望ましい条件の一つである。また、等温反応が可能とは言え、最初の鎵型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行われる可能性があり、その点においても耐熱性酵素の利用はアツセィプロトコールの選択の幅を広げる。

Vent(Exo-)DNAポリメラ一ゼは、鎖置換活性と共に高度な耐熱性を備えた酵素である。ところで DNAポリメラ一ゼによる鎖置換を伴う相補鎖合成反応は、 1本鎖結合タンパク質（single strand binding protein)の添加によって促進されることが知られている（Paul M. Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July 998)。この作用を本発明に応用し、 1本鎖結合タンパク質を添加することによつて相補鎖合成の促進効果を期待することができる。たとえば Vent(Exo-)DNAポリメラーゼに対しては、 1本鎖結合タンパク質として T4 gene 32が有効である。

なお 3， -5，ェクソヌクレア一ゼ活性を持たない DNAポリメラ一ゼには、相補鎖合成が銪型の 5'末端に達した部分で停止せず、 1塩基突出させた状態まで合成を進める現象が知られている。本発明では、相補鎖合成が末端に至ったときの 3'末端の配列が次の相補鎖合成の開始につながるため、このような現象は望ましくない。しかし、 DNAポリメラ一ゼによる 3'末端への塩基の付加は、高い確率で Aとなる。したがって、 dATPが誤って 1塩基付加しても問題とならないように、 3'末端からの合成が Aで開始するように配列を選択すれば良い。また、相補鎖合成時に 3'末端がたとえ突出してしまっても、これを消化して blunt endとする 3'→5' ェクソヌクレア一ゼ活性を利用することもできる。たとえば、天然型の Vent DNA ポリメラ一ゼはこの活性を持つことから、 Vent(Exo-)DNA ポリメラ一ゼと混合して利用することにより、この問題を回避することができる。

本発明による核酸の合成方法、あるいは増幅方法に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキットとして供給することができる。具体的には、本発明のために、相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のァゥ夕一プライマ一として必要な各種のオリゴヌクレオチド、相補鎖合成の基質となる dNTP、鎖置換型の相補鎖合成を行う DNAポリメラ一ゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、更に必要に応じて合成反応生成物の検出のために必要な試薬類で構成されるキットが提供される。特に、本発明の望ましい態様においては、反応途中で試薬の添加が不要なことから、 1回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給することにより、サンプルの添加のみで反応を開始できる状態とすることができる。発光シグナルや蛍光シグナルを利用して、反応生成物の検出を反応容器のままで行えるようなシステムとすれば、反応後の容器の開封を全面的に廃止することができる。これは、コン夕ミネ一シヨンの防止上、たいへん望ましいことである。

さて、本発明によって合成される、 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸には、たとえば次のような有用性がある。第一には、相補的な塩基配列を 1分子内に備えた特殊な構造に伴う利点の活用である。この特徴により、検出が容易となることが期待される。すなわち、相補的な塩基配列との塩基対結合に伴って、シグナルを増減する核酸の検出系が公知である。たとえば先に述べたような 2本鎖特異ィン夕一カレーターを検出剤として利用する方法などを組み合わせれば、本発明の合成生成物の特徴を生かした検出系を実現することができる。このような検出系において本発明の合成反応生成物を一度熱変性して元の温度に戻すと、分子内のァニールが優先的に起きるため速やかに相補的配列の間で塩基対結合を構成する。一方、もしも非特異的反応生成物が存在していても、それは分子内に相補的配列を持っていないので熱変性により 2分子以上に分離してしまい、すぐにはもとの二本鎖には戻れない。こうして、検出前に加熱変性工程を追加することによって、非特異反応に伴うノイズを軽減することができる。熱に対して耐性を持たない DNAポリメラーゼを使用しているときには、加熱変性工程は反応停止の意味も持ち、反応時間の制御の点で有利である。

第二の特徴は、塩基対結合が可能な状態にあるループを常に形成することである。塩基対結合が可能な状態にあるループの構造を、図 4に示した。図 4からわかるように、ループはプライマーのァニールが可能な塩基配列 F 2 c ( X 2 c ) と、 F 2 c— F l c ( X 1 c ) の間に介在する塩基配列とで構成される。 F 2 c — F l c間（普遍的に示せば X 2 c— X 1 c間）の配列は、鎵型に由来する塩基配列である。したがつてこの領域に対して相補的な塩基配列を持つプローブをハイブリダィズさせれば、銪型特異的な検出を行うことができる。しかも、この領域は常に塩基対結合が可能な状態にあることから、ハイブリダィズに先だって加熱変性する必要がない。なお本発明の増幅反応生成物におけるループを構成する塩基配列は、任意の長さとすることができる。したがって、プローブのハイプリダイズを目的とする場合には、ブライマ一がァニールすべき領域とプロ一ブがハイブリダィズすべき領域を別々にして両者の競合を避けることにより理想的な反応条件を構成することができる。

本発明の望ましい態様によれば、 1 本の核酸鎖上に塩基対結合が可能な多数のループがもたらされる。このことは、核酸 1分子に多数のプローブがハイブリダィズ可能なことを意味しており、感度の高い検出を可能とする。また感度のみならず、たとえば凝集反応のような特殊な反応原理に基づく核酸の検出方法を可能とするものでもある。たとえばポリスチレンラテックスのような微粒子に固定したプローブを本発明による反応生成物に加えると、プローブとのハイブリダィゼ

—シヨンに伴ってラテックス粒子の凝集が観察される。凝集の強度を光学的に測定すれば、高感度に、しかも定量的な観察が可能である。あるいは、凝集反応を肉眼的に観察することもできるので、光学的な測定装置を使わない反応系を構成することもできる。

更に、 1核酸分子当たり多くの標識を結合できる本発明の反応生成物は、クロマトグラフィックな検出をも可能とする。ィムノアツセィの分野では、肉眼的に検出可能な標識を利用したクロマト媒体を用いた分析方法（ィムノクロマトグラフィ一法）が実用化されている。この方法は、クロマト媒体に固定した抗体と標識抗体でアナライトをサンドイッチし、未反応の標識成分を洗い去る原理に基づいている。本発明の反応生成物は、この原理を核酸の分析にも応用可能とする。すなわち、ループ部分に対する標識プローブを用意し、これをクロマト媒体に固定化した捕捉用プローブでトラップすることによってクロマト媒体中での分析が行われる。捕捉用プローブには、ループ部分に対する相補配列を利用することができる。本発明の反応生成物は、多数のループ部分を伴っていることから、多数の標識プローブを結合し、肉眼的に認識可能なシグナルをもたらす。

ループとして常に塩基対結合が可能な領域を与える本発明による反応生成物は、この他にもさまざまな検出系を可能とする。たとえば、このループ部分に対するプローブを固定した表面プラズモン共鳴を利用した検出系が可能である。また、ループ部分に対するプローブを 2本鎖特異的なィン夕一カレー夕一で標識しておけば、より高感度な蛍光分析を行うことができる。あるいは、本発明によって合成される核酸が 3'側と 5'側の両方に塩基対結合が可能なループを形成することを積極的に利用することもできる。たとえば、一方のループを正常型と異常型で共通の塩基配列となる部分とし、他方のループに両者の違いが生じる領域となるように設計しておくのである。共通部分に対するプローブで遺伝子の存在を確認し、他方の領域で異常の有無を確認するといつた特徴的な分析系を構成することができる。本発明による核酸の合成反応は、等温で進めることも可能なことから、一般的な蛍光光度計によってリアルタイムな分析が可能となることも特筆すベき利点である。これまでにも同一鎖上にァニールする核酸の構造は公知である。しかし本発明によって得ることができる 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸は、他のォリゴヌクレオチドが塩基対結合することができる多数のループ部分を含む点において新規である。

一方、本発明による反応生成物によって与えられる多数のループ部分そのものをプローブとして利用することも可能である。たとえば、 DNAチップにおいては、限られたエリアに高密度にプローブを集積する必要がある。しかし現在の技術では、一定の面積に固定することができるオリゴヌクレオチドの数は制限される。そこで本発明の反応生成物を利用すれば、ァニールが可能な多数のプローブを高密度に固定化することができる。すなわち、本発明による反応生成物をプローブとして DNAチップ上に固定すればよい。反応生成物は、増幅後に公知の手法によつて固定することもできるし、あるいは固定化したオリゴヌクレオチドを本発明の増幅反応におけるォリゴヌクレオチドとして利用することにより結果的に固定化された反応生成物とすることもできる。このようにして固定化されたプローブを用いれば、限られたェリァ中に多くの試料 DNAをハイプリダイズすることができ、結果的に高いシグナルを期待することができる。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部（1 )- (4)を示す模式図である。図 2は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部（5 )-(7)を示す模式図である。図 3は、本発明の望ましい態様の反応原理の一部 (8)- ( 10)を示す模式図である。図 4は、本発明による 1本鎖核酸が形成するループの構造を示す模式図である。図 5は、本発明による基礎的な態様の一部 (A)-(B)を示す模式図である。

図 6は、本発明による基礎的な態様の一部 (C)-(D)を示す模式図である。

図 7は、 M13mpl8 の標的塩基配列における、オリゴヌクレオチドを構成する各塩基配列の位置関係を示す図である。

図 8は、 M13mpl8 を銪型として本発明による 1本鎖核酸の合成方法によって得られた生成物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。

レ一ン 1 ： XIV size marker

レーン 2 ： l fmol M13mpl8 dsDNA

レーン 3 ： targetなし

図 9は、実施例 1によって得られた本発明による核酸合成反応の生成物を制限酵素で消化しァガロース電気泳動した結果を示す写真である。

レ一ン 1 ： XIV size marker

レーン 2 ：精製物の BamHI消化物

レーン 3 ：精製物の PvuII消化物

レーン 4 ：精製物の Hindi I I消化物

図 1 0は、 M13mpl8 を铸型として、ベ夕イン添加による本発明の 1本鎖核酸の合成方法によって得られた生成物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。

0、 0.5、 1、 2は反応液中に添加したベ夕イン濃度 (M)を表す。また、 Nは陰性対照を、 -21は鍊型 DMの濃度 10—²¹molを表す。

図 1 1は、 HBV 由来の標的塩基配列における、オリゴヌクレオチドを構成する各塩基配列の位置関係を示す図である。

図 1 2は、 M13mpl8に組みこまれた HBV-M13mpl8を鍊型として本発明による 1 本鎖核酸の合成方法によって得られた生成物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。

レ一ン 1 ： XIV size marker

レ一ン 2 ： l fmol HBV-M13mpl8 dsDNA

レーン 3 ： targetなし

図 1 3は、本発明による 1本鎖核酸の合成方法によって得られた生成物のアル力リ変性ゲル電気泳動の結果を示す写真である。

レーン 1 ：ラムダファージの Hindll l消化断片

レーン 2 ：実施例 1の反応生成物

レーン 3 ：実施例 3の反応生成物

図 1 4は、ターゲットである M13mpl8の濃度を変えてときに、本発明による 1 本鎖核酸の合成方法によって得られた生成物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。上は反応時間 1時間、下は反応時間 3時間の結果である。

レーン 1 ： M13mpl8 dsDNA lxl0"¹⁵mol/tube

レーン 2 ： M13mpl8 dsDNA lxl0-¹⁶mol/tube

レーン 3 ： M13mpl8 dsDNA lxl0-¹⁷mol/tube

レーン 4 ： M13mpl8 dsDNA lxl(T¹⁸mol/tube

レーン 5 ： M13mpl8 dsDNA lxl0—¹⁹mol/tube

レーン 6 ： 13mpl8 dsDNA lxl0—²¾ol/tube

レーン 7 ： M13mpl8 dsDNA lxl0-²¹mol/tube

レーン 8 ： M13mpl8 dsDNA 1x10— ²²mol/tube

レーン 9 : target なしレーン 1 0 ： XIV size marker

図 1 5は、変異の位置、および標的塩基配列 (target)に対する各領域の位置関係を表す図である。下線で示したグァニンが、変異型ではアデニンに置換されている。

図 1 6は、本発明の増幅反応による生成物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。

M: lOObp ladder (New England Biolabs)

N: 銪型なし（精製水）

WT: 野生型錶型 M13mpl8 1 fmol

MT: 変異型鍊型 M13mpl8FM 1 fmol

図 1 7は、標的 mRNAをコードする塩基配列における、オリゴヌクレオチドを構成する各塩基配列の位置関係を示す図である。

図 1 8は、 mRNAを夕ーゲットとして本発明による 1本鎖核酸の合成方法によつて得られた生成物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

実施例 1 M13mpl8内の領域の増幅

M13mpl8 を錡型として、本発明による 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を試みた。実験に使用したプライマーは、 M13FA、 13RA, M13F3,そして M13R3の 4種類である。 M13F3と M13R3は、それぞれ M13FAと M13RA を合成起点として得られた第 1の核酸を置換するためのァゥ夕一プライマ一である。アウタープライマ一は M13FA (あるいは M13RA)よりも後から相補鎖合成の起点となるべきプライマ一なので、 M13FA (あるいは M13RA) と隣接する領域にコンティギユアスス夕ッキング現象を利用してァニールするように設計した。また、 M13FA (あるいは M13RA)のァニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定した。各プライマーを構成する塩基配列は配列表に示したとおりである。プライマーの構造的な特徴を以下にまとめた。また標的塩基配列 (target)に対する各領域の位置関係を図 7に示した。プライマ一 5，側の領域 / 3，側の領域

M13FA M13FAによる合成相補鎖の領域 Flcと同じ

/M13mpl8の領域 F2cに相補

M13RA M13RAによる合成相補鎖の領域 Rlcと同じ

/M13FAによる合成相補鎖の領域 R2cに相補

M13F3 M13mpl8の領域 F2cの 3，側に隣接する F3cに相補

M13 3 M13FAによる合成相補鎖の領域 R2cの 3'側に隣接する R3cに相補このようなプライマ一によって、 M13mpl8の領域 Flcから Mcにいたる領域とその相補的な塩基配列とが、 F2c を含むループ形成配列を挟んで 1本鎖上に交互に連結した核酸が合成される。これらのプライマーによる本発明による核酸の合成方法のための反応液組成を以下に示す。

反応液組成（2 5 L中）

20mM Tris-HCl pH8.8

lOmM KC1

lOmM (NH₄)₂S0₄

6mM MgS0₄

0.1% Triton X-100

5¾ ジメチルスルホキシド（DMSO)

0.4mM dNTP

プライマー：

800nM M13FAZ配列番号： 1 800nM M13RA/配列番号： 2

200nM M13F3/配列番号： 3

200nM M13R3/配列番号： 4

ターゲット： M13mpl8 dsDNA /配列番号： 5

反応：上記反応液を 9 5 °Cで 5分間加熱し、夕ーゲットを変性させて 1本鎖とした。反応液を氷水上に移し、 Bst DNAポリメラ一ゼ（NEW ENGLAND BioLabs)を 4 U添加し、 6 5 °Cで 1時間反応させた。反応後、 8 0 °C 1 0分間で反応を停止し再び氷水上に移した。

反応の確認：上記反応液の 5〃Lに 1〃Lの loading bufferを添加し、 2 %ァガロースゲル（0.5% TBE) を使って、 1時間、 80mVで電気泳動した。分子サイズマ一カーとして、 XIV( 100bp ladder, Boehringer Mannheim製）を使用した。泳動後のゲルを SYBR Green I (Molecular Probes, Inc. )で染色して核酸を確認した。結果は図 8に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応している。

1. XIV size marker

2. lfmol M13mpl8 dsDNA

3. targetなし

レーン 3では未反応のプライマーが染色されている以外にバンドは確認されなかった。レーン 2はターゲットが存在する場合、低サイズのバンドのラダーと高サイズでのスメァな染色、およびゲル内でほとんど泳動されていないバンドとして生成物が確認された。低サイズのパンドのうち、 290bp、 450bp付近のバンドは、それぞれ本発明の合成反応により予想される産物である、配列番号： 1 1および配列番号： 1 2が 2本鎖となったもの（図 2— (7)および図 2— ( 10 )が 2本鎖となつたものに相当）および配列番号： 1 3 (図 3—（9)にぁる長ぃ 1本鎖に相当）とサイズが一致することから、反応が予想されるとおりに進行していることが確認された。高サイズのスメァなパターン、および泳動されていないバンドは、本反応が基本的に連続的な反応であることから、反応産物が一定のサイズにはならないこと、そして部分的な 1本鎖、あるいは 2本鎖の複合体を形成した複雑な構造をともなつているため、結果としてこのような泳動結果を与えるものと考えられた。実施例 2 反応産物の制限酵素消化確認

実施例 1で得られた本発明による 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の構造を明らかにすることを目的として、制限酵素による消化を行った。制限酵素を使った消化によって理論どおりの断片を生じる一方、実施例 1で観察された高サイズのスメァなパターンや泳動されないバンドが消滅すれば、これらがいずれも本発明によって合成された 1本鎖上に相補的な塩基配列を交互に連結した核酸であることが推定できる。

実施例 1の反応液を 8本分（200 /L) プールし、フヱノール処理後、エタノール沈でんを行って精製した。この沈でんを回収して 200 /Lの TE緩衝液で再溶解し、そのを制限酵素 BamHI、 PvuI I、および Hindi 11でそれぞれ 3 7 °C 2時間消化した。消化物を 2%ァガロースゲル（0· 5% ΤΒΕ) を使って、 1時間、 80mVで電気泳動した。分子サイズマーカーとして、 SUPER LADDER-LOW ( lOObp ladder) (Gensura Laboratories, Inc.製）を使用した。泳動後のゲルを SYBR Green I (Molecular Probes, Inc . )で染色して核酸を確認した。結果は図 9に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応している。

丄. XIV size marker

2. 精製物の BamHI消化物

3. 精製物の PvuI I消化物

4. 精製物の Hindi I I消化物

ここで比較的鎖長の短い増幅生成物を構成している塩基配列は、配列番号： 1 3、配列番号： 1 4、配列番号： 1 5、および配列番号： 1 6等と推定される。これらの塩基配列から、推測される各制限酵素消化断片のサイズは表 1のとおりである。表中の Lは、ループ（ 1本鎖）を含む断片なので泳動位置が未確定であることを示す。

表 1 . 本発明による増幅生成物の制限酵素消化断片

配列番号 BaiiiHI PvuI I Hindi 11

1 3 177 +L 56 +L 147 +L

1 4 15+101 +L 142 +L

1 5 171+101 +L 56 +L 147+161 +L

1 6 11+101+230 +L 237 +L 142+170 +L まとめ 101, 177, 230 56, 237 142， 147, 161, 170

( 11，15;確認できない)

未消化でのバンドのほとんどが消化後には推定されるサイズのバンドへ変化したことから、目的の反応産物が増幅されていることが確認された。また非特異的産物はほとんどないことも示された。

実施例 3 ベ夕イン添加による増幅反応の促進

増幅反応液中へのベタイン（betaine : N，N，N, -trimethylglycine、 SIGMA)添加による、核酸の増幅反応に対する効果を調べる実験を行った。実施例 1と同様に、 M13mpl8 を鍊型とし、本発明による 1本鎖上に相対的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を、種々の濃度のぺ夕イン存在下で行った。実験に使用したプライマーは、実施例 1で使用したものと同じである。鍊型 DNA量は、 10—²¹ mol (M13mpl8)で、陰性対照として水を用いた。添加するべ夕インは、 0、 0.5、 1、 2 M の濃度になるように反応液に加えた。反応液組成を以下に示す。

反応液組成（2 5 L中）

20mM Tris-HCl pH8.8

4mM MgS0₄

0.械 dNTPs

lOmM KC1

lOmM (NH₄)₂S0₄ 0. 1% TritonX-100

プライマー：

800nM M13FA/配列番号： 1

800nM M13RA/配列番号： 2

200nM M13F3/配列番号： 3

200nM M13R3Z配列番号： 4

夕一ゲット： M13mpl8 dsDNA /配列番号： 5

使用したポリメラーゼ、反応条件、反応後の電気泳動条件は、実施例 1に記載したものと同じである。

結果を図 1 0に示す。ベ夕イン濃度 0.5、 1.0M存在下での反応では、増幅産物量が増大した。また 2. 0Mまで増やすと逆に増幅産物は確認されなかった。これにより、適度のベタイン存在で、増幅反応が促進されることが示された。ベ夕イン濃度 2Mの場合に、増幅産物が低下したことは、 Tmが低下しすぎたのが原因と考えられた。実施例 4 HBV遺伝子配列の増幅

HBV遺伝子の部分配列を組み込んだ M13mpl8 dsDNAを錶型として、本発明による核酸の合成方法を試みた。実験に使用したプライマーは、 HB65FA (配列番号： 6 )、 HB65RA (配列番号： 7 )、 HBF3 (配列番号： 8 )、そして HBR3 (配列番号： 9 ) の 4種類である。 HBF3と HBR3は、それぞれ HB65FAと HB65RAを合成起点として得られた第 1の核酸を置換するためのアウタープライマーである。アウタープライマ一は HB65FA (あるいは HB65RA)よりも後から相補鎖合成の起点となるベきプライマ一なので、 HB65FA (あるいは HB65RA) と隣接する領域にコンティギュァスス夕ッキング現象を利用してァニールするように設計した。また、 HB65FA (あるいは HB65RA)のァニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定した。 M13mpl8に組みこまれた HBVに由来する本実施例の夕ーゲット配列（430bp)を配列 1 0に示した。

各ブラィマ一を構成する塩基配列は配列表に示したとおりである。プライマ一の構造的な特徴を以下にまとめた。また標的塩基配列 (target )に対する各領域の位置関係を図 1 1に示した。プライマー 5，側の領域 / 3，側の領域

HB65FA HB65FAによる合成相補鎖の領域 Flcと同じ

/HBV- M13即 18の領域 F2cに相補

HB65RA HB65RAによる合成相補鎖の領域 Rlcと同じ

/HB65FAによる合成相補鎖の領域 R2cに相補

HBF3 HBV-M13mpl8の領域 F2cの 3，側に隣接する F3cに相補

HBR3 HB65FAによる合成相補鎖の領域 R2cの 3，側に隣接する R3cに相補このようなプライマ一によって、 HBV 遺伝子の部分配列を組み込んだ M13mpl8(HBV-M13mpl8)の領域 Flcから Rlcにいたる領域とその相補的な塩基配列とが、 F2c を含むループ形成配列を挟んで 1本鎖上で交互に連結した核酸が合成される。上記プライマ一を用いる他は実施例 1と同じ条件で反応させ、その反応液をァガロース電気泳動により分析した。結果は図 1 2に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応している。

1. XIV size marker

2. 1 fmol HBV-M13mpl8 dsDNA

3. targetなし

実施例 1と同様に、 targetが存在するときにのみ、低サイズのバンドのラダーと高サイズでのスメァな染色、およびゲル内でほとんど泳動されていないバンドとして生成物が確認された（レーン 2 )。低サイズのバンドのうち、 310bp、および 480bp付近のバンドはそれぞれ、本反応により予想される産物である、配列番号： 1 7および配列番号： 1 8の 2本鎖とサイズが一致することから、反応が予想されるとおりに進行していることが確認された。高サイズのスメァなパターン、および泳動されていないバンドは、実施例 1の結果で述べたように、本発明に特徴的な合成生成物の構造が原因となっているものと推定された。この実験により、増幅する配列（ target )が異なっても本発明を実施可能であることが確認された。実施例 5 合成反応生成物のサイズの確認

本発明に基づいて合成された核酸の構造を確認するために、その長さをアル力リ変性条件下での電気泳動によって分析した。実施例 1と実施例 4の夕一ゲット存在下での反応液の 5 ulに、それぞれ 1 /Lの alkaline loading bufferを添加し、 0.7%ァガロースゲル（50mM NaOH, ImM EDTA)を使って、 14時間、 50mAで電気泳動した。分子サイズマ一カーとして、ラムダファージの Hindll l消化断片を使用した。泳動後のゲルを 1M Tris pH 8 で中和後、 SYBR Green I (Molecular Probes, Inc. )で染色して核酸を確認した。結果は図 1 3に示す。各レーンは以下のサンプルに対応している。

1. ラムダファージの Hindll l消化断片

2. 実施例 1の反応生成物

3. 実施例 4の反応生成物

反応生成物をアル力リ変性条件で泳動すると 1本鎖状態でのサイズ確認が可能である。実施例 1 (レーン 2 )、実施例 4 (レーン 3 )ともに主な生成物は 2 kbase 内であることが確認された。また、本発明による生成物はこの分析によって確認できる範囲で少なくとも 6 kbase以上にまで伸びていることが判明した。加えて、実施例 1や実施例 4の未変性条件下で泳動されなかったバンドは、変性状態では個々の 1本鎖に分離されサイズが小さくなることが改めて確認された。実施例 6 M-13mpl3内の領域の増幅における、夕ーゲット濃度依存的増幅の確認本発明による核酸の合成方法に及ぼす、ターゲッ卜の濃度変化の影響を観察した。夕一ゲットである M13mpl8 dsDNAを 0〜1 fmolとし、反応時間を 1時間および 3時間とする他は、実施例 1と同じ条件で本発明による核酸の合成方法を実施した。実施例 1と同様に、 2 %ァガロースゲル（0.5% TBE)で電気泳動し、 SYBR Green I (Molecular Probes, Inc. )染色により核酸を確認した。分子サイズマーカーとして、 XIV( 100bp ladder, Boehringer Mannheim)を使用した。結果は図 1 4 (上：反応時間 1時間、下：反応時間 3時間）に示した。各レーンは、次のサンプルに対応する。

1. M13mpl8 dsDNA lxl0"¹⁵mol/tube

2. M13mpl8 dsDNA lxlO^mol/tube

3. 13mpl8 dsDNA lxlO^mol/tube

4. M13mpl8 dsDNA lxlD^mol/tube

5. M13mpl8 dsDNA lxl(T¹⁹mol/tube

6. M13mpl8 dsDNA lxl(T^2l)mol/tube

7. M13mpl8 dsDNA lxl0—²¹mol/tube

8. M13mpl8 dsDNA lxl 0"²¾ol /tube

9. target なし

10. XIV size marker

泳動像の下部に見られる各レーンに共通のバンドは未反応のブラィマーが染色されたものである。反応時間にかかわらず、ターゲットが存在しないときは全く増幅産物は観察されない。ターゲット存在下でのみ、ターゲットの濃度依存的に増幅産物の染色パターンが得られた。また、反応時間を長くすることにより、より低濃度まで増幅産物が確認できた。実施例 7 点変異（ポイントミューテーシヨン）の検出

( 1 ) M13mpl8FM (変異型）の作製

夕一ゲッ卜 DNAとして、 M13mpl8 (野生型)、および M13即 18FM (変異型）を用いた。変異型である M13mpl8FMの作製は、 LA PCR™ in vitro Mutagenesis Kit (宝酒造）を使用し、 1 塩基置換を導入した。その後、シークェンシングにより配列を確認した。 F1領域での配列を以下に示す。

野生型： CCGGGGATCCTCTAGAGTCG (配列番号： 19)

変異型： CCGGGGATCCTCTAGAGTCA (配列番号： 20)

( 2 ) プライマ一のデザイン

使用するプライマ一は、 FAプライマ一の Flc領域の 5'末端に野生型、変異型で配列の異なる塩基となるようにした。変異の位置、および標的塩基配列（target) に対する各領域の位置関係を図 15に示す。

( 3 ) 増幅反応

M13mpl8 (野生型）、および M13mpl8FM (変異型）を銪型にして、以下に示すそれぞれに特異的なブラィマ一の組み合わせで錡型特異的な増幅反応が起きるかどうか実験を行った。

野生型増幅用プライマ一セット： FAd4， RAd4, F3, R3

変異型増幅用プライマーセット： FAMd4, RAd4， F3， R3

各プライマーの塩基配列は以下の通りである。

FAd4： CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCG GAT (配列番号： 21)

FAMd4： TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGC GGAT (配列番号： 22)

RAd4 ： CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTAT TAC (配列番号： 23)

F3 ： ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA (配列番号 : 24)

R3 ： GTTGGGAAGGGCGATCG (配列番号： 25)

(4) M13mpl8の点突然変異の検出

反応液の組成は以下のとおりである。終濃度

D2W 3.75 L

10X Thermo pol buffer(NEB) 2.5 L 20mM Tris-HCl pH8.8 lOmM KC1

lOmM (NH₄)₂S0₄ 6mM MgS0₄

0.1% TritonX-100

lOOmM MgS0₄ 0.5/u.L

4M Betaine 6.25 zL 1M

M13FAd4 primer(10pmol/〃L)又は

M13FAMd4 rimer(10pmol/ L) 2 zL 800nM

M13RAd4 primer(10pmol/ /L) 2〃L 800nM

M13F3 primer(10pmol/ iL) 0.5 iL 200nM

M13R3 primer(10pmol/ /L) 0.5〃L 200nM

全量 22 /L

上記反応液に夕一ゲット M13mpl8、または M13mpl8FM 1 fmol (2〃1)を添加し、 9 5°Cで 5分間加熱し、ターゲットを変性させて 1本鎖とした。反応液を氷水上に移し、 BstDNAポリメラ一ゼ（NEWENGLANDBioLabs)を 1〃L(8U)添加し、 6 8°C または 68.5°Cで 1時間反応させた。反応後、 8 0°C 1 0分間で反応を停止し再び氷水上に移した。

図 1 6で示すように、 FAプライマーとして野生型用の FAd4を用いたときは、野生型の錡型存在のみ効果的に増幅が観察された。一方、 FAプライマーとして変異型用の FAMd4を用いたときは、野生型の錶型存在のみ効果的に増幅が観察された。

以上の結果から、本発明の増幅反応を利用することにより、点変異を効率的に検出できることが示された。実施例 8 mRNAをターゲットとした増幅反応

夕ーゲットとなる核酸を mRNA として、本発明による核酸の合成方法を試みた。夕一ゲットとなる mRNAは、前立腺特異抗原 (Prostate specific antigen; PSA) を発現した細胞である前立腺癌細胞株 LNCaP cell (ATCC No. CRL-1740)と、非発現細胞である慢性骨髄性白血病細胞株 K562 cell (ATCC No. CCL-243)を、 1:10⁶ 〜： L00:10⁶で混合し、 Qiagen社（ドイツ）の RNeasy Mini kitを用いて全 RNA を抽出した。実験に使用したプライマ一は、 PSAFA、 PSAKA, PSAF3、そして PSAR3の 4種類である。 PSAF3と PSAK3は、それぞれ PSAFAと PSARAを合成起点として得られた第一の核酸を置換するためのアウタープライマーである。また、 PSAFA (あるいは PSARA)のァニールが優先的に起こるようにこれらのプライマー濃度を高く設定した。各プライマ一を構成する塩基配列は以下のとおりである。

プライマ一：

PSAFA: TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG

(配列番号： 2 6 )

PSARA:

TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG (配列番号： 2 7 )

PSAF3: TGCTTGTGGCCTCTCGTG (配列番号： 2 8 )

PSAR3: GGGTGTGGGAAGCTGTG (配列番号： 2 9 )

プライマーの構造的な特徴を以下にまとめた。また、標的の mRNAをコードする DNA塩基配列に対する各プライマーの位置関係、および制限酵素 Sau3A Iの認識部位を図 1 7に示した。

プライマ- 5'側の領域 / 3'側の領域 PSAFA PSAFAによる合成相補鎖の領域 Flcと同じ

/標的塩基配列の領域 F2cに相補

PSARA PSARAによる合成相補鎖の領域 Rlcと同じ

/PSAFAによる合成相補鎖の領域 R2cに相補

PSAF3 標的塩基配列の領域 F2cの 3'側に隣接する F3cに相補

PSAR3 PSAFAによる合成相補鎖の領域 R2cの 3'側に隣接する R3cに相補 .

本発明による核酸の合成方法のための反応液組成を以下に示す。

反応液組成（2 5〃L中）

20mM Tris-HCl pH8.8

4mM MgSO₄

0.4mM dNTPs

lOmM KC1

lOmM (NH₄)₂S0₄

0.1% TritonX-100

0.8M betaine

5mM DTT

1600nM PSAFA & PSARAプライマ一

200nM PSAF3 & PSAR3 プライマー

8U Bst DNAポリメラ一ゼ

100U ReverTra Ace (TOYOBO, 日本）

5 zg全 RNA

全ての成分は氷上で混合した。本実験においては mRNA ( 1本鎖）を target としているので、加熱変性によって 1本鎖とする工程は不要である。反応は、 65°C で 45分間行い、 85°C、 5分で、反応を停止させた。反応終了後、 5〃Lの反応液を 2%ァガロースを使って電気泳動し、 SYBR Green Iで検出した。結果を図 1 8に示す。各レーンは、以下のサンプルに対応している。

レーン Bst RT LNCaP細胞数/ 10⁶個の K562

1 + 0

2 + 10

3 + 0

4 + 10

5 + + 0

6 + +

7 + + 10

8 レーン 6の反応液 1 j L分を Sau3A Iで消化したもの

9 レーン 7の反応液 1 iL分を Sau3A Iで消化したもの

1 0 サイズマ一力一 lOObpラダ一 (New England Biolabs)

Bst DNAポリメラ一ゼ、 ReverTra Aceのいずれか一方がないと、増幅産物が得られなかった（レーン 1〜4 )。両方の酵素存在下では、 LNCaP由来の RNAが存在すると、増幅産物が検出された（レーン 5〜7 )。 100万個の K562細胞に 1 個の LNCaPからの抽出 RNAでも検出可能であった（レーン 6 )。増幅産物は、夕一ゲット内部の配列にある制限酵素部位 Sau3AIで消化したところ、予想される大きさの断片に消化された（レーン 8 , 9 )。

以上の結果から、本発明による核酸の合成方法において、ターゲットとして RNAを用いた場合でも、目的の反応産物が得られることが確認された。産業上の利用の可能性

本発明による新規なォリゴヌクレオチドとそれを用いた核酸の合成方法により、複雑な温度制御の不要な 1本鎖上に交互に相補的な塩基配列が連結した核酸の合成方法が提供される。本発明に基づくオリゴヌクレオチドをプライマ一として合成される相補鎖は、常にその 3'末端が自身を铸型とする新たな相補鎖合成の合成起点となる。このとき、新たなプライマーのァニールをもたらすループの形成を伴い、この部分からの相補鎖合成によって先に合成された自身を錄型とする相補鎖合成反応の生成物は再び置換され塩基対結合が可能な状態となる。このようにして得ることができる自身を錡型として合成された核酸は、たとえば SDAのような公知の核酸合成方法との組み合わせによって、それらの核酸合成効率の向上に貝献する。

更に本発明の望ましい態様によれば、単に公知の核酸合成方法の効率向上を達成するのみならず、複雑な温度制御を必要としない、しかも高度な増幅効率を期待でき、更には高い特異性を達成できる新規な核酸の合成方法が提供される。すなわち、本発明に基づくオリゴヌクレオチドを錡型鎖とその相補鎖に対して適用することによって、 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸が連続して合成されるようになる。この反応は、原理的には合成に必要な出発材料が枯渴するまで続き、その間にループ部分から合成を開始した新たな核酸を生成し続ける。こうして、ループにァニールしたオリゴヌクレオチドからの伸長が、長い 1本鎖核酸（すなわち、複数組の相補的な塩基配列が連結したもの）の伸長のための 3' - 0Hを供給する鎖置換を行う。一方、長い 1本鎖の 3' -0Hは自身を鍊型とする相補鎖合成反応を行うことによって自身の伸長を達成すると同時に、ループから合成開始した新たな相補鎖の置換を行う。このような増幅反応工程が、高い特異性を維持しながら等温条件下で進行する。

本発明におけるオリゴヌクレオチドは、 2つの連続した領域が設計どおりに配置されているときにはじめて本発明による核酸合成反応のためのプライマーとして機能する。このことが、特異性の維持に大きく貢献する。たとえば PCRでは、 2つのブラィマーの意図した位置関係とは無関係に、非特異的なミスァニールにより、非特異的増幅反応が開始してしまうことと比べれば、本発明では高い特異性が期待できることは容易に説明できる。この特徴を利用して SNPsを高い感度で精確に検出することができる。本発明の特徴は、このような反応がごく単純な試薬構成で容易に達成できることにある。たとえば本発明によるオリゴヌクレオチドは、特殊な構造を持つとは言えそれは塩基配列の選択の問題であって、物質としては単なるオリゴヌクレオチドである。また、望ましい態様においては、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラ一ゼのみで反応を進めることができる。更に、 MAを錶型として本発明を実施する場合には、 Bca DNAポリメラーゼのような逆転写酵素活性と鎖置換型の DNAポリメラ一ゼ活性を併せ持つ DNAポリメラーゼを利用することによって、全ての酵素反応を単一の酵素によって行うことができる。このようなシンプルな酵素反応で高度な核酸の増幅反応を実現する反応原理はこれまでに知られていない。あるいは、 SDA等の公知の核酸合成反応に適用するとしても、本発明との組み合わせによって新たな酵素が必要となるようなことはなく、単に本発明に基づくォリゴヌクレオチドを組み合わせるだけで各種反応系への適応が可能である。したがて、本発明による核酸合成方法は、コストの点においても有利といえる。

以上述べたように、本発明の核酸の合成方法とそのためのオリゴヌクレオチドは、操作性（温度制御不要)、合成効率の向上、経済性、そして高い特異性という、複数の困難な課題を同時に解決する新たな原理を提供する。

Claims

請求の範囲

. 以下の工程を含む 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。

c )領域 F 2 cに相補的な配列からなる F 2を 3'末端に含むオリゴヌクレオチドをァニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラ一ゼによる相補鎖合成を行って、工程 b ) で合成された相補鎖を置換する工程

. 工程 d ) において、合成起点が領域 R 1 cにァニールすることができる同一鎖上の 3'末端に存在する領域 R 1であり、 R 1が R 1 cにァニールすることによって塩基対結合が可能な領域 R 2 cを含むループが形成される請求項 1 に記載の方法。

. 少なくとも以下の 2つの領域 X 2および X 1 cとで構成され、 X 2の 5'側に X I cが連結されたオリゴヌクレオチド。

. 工程 a ) における核酸が、以下の工程によって提供される第 2の核酸である請求項 1に記載の方法。

i ) 領域 X 2が領域 F 2であり、領域 X 1 cが領域 F 1 cである請求項 3に記載のオリゴヌクレオチドの領域 F 2を銪型となる核酸の領域 F 2 cにァ二一ルさせる工程、

ii )ォリゴヌクレオチドの F 2を合成起点とし、铸型に相補的な塩基配列を持つ第 1の核酸を合成する工程

iii )工程 ii)で合成された第 1の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、

iv)工程 iii)における第 1の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つォリゴヌクレオチドをァニールさせ、それを合成起点として第 2 の核酸を合成し、その 3'末端の F 1を塩基対結合が可能な状態とする工程. 工程 iii )の塩基対結合を可能とする領域が R 2 cであり、かつ工程 iv)におけるォリゴヌクレオチドが、領域 X 2 cが領域 R 2 cであり、領域 X 1 cが領域 R 1 cである請求項 3に記載のオリゴヌクレオチドである請求項 4に記載の方法。

. 工程 iii)および iv)における塩基対結合が可能な状態とする工程を、銪型における F 2 cの更に 3，側にァニールするアウタープライマ一、および第 1の核酸における工程 i V )で合成起点とした領域の更に 3'側にァニールするァゥ夕 —プライマ一を合成起点とする鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる鎖置換相補鎖合成によって行う請求項 4または 5に記載の方法。

. 反応に用いる各ォリゴヌクレオチドと鎵型におけるその相補領域との融解温度が、同じストリンジエンシーの下で次の関係にある請求項 6に記載の方法。 (アウタープライマー Z錡型における 3，側の領域） ≤ ( F 2 c /F 2および R 2 c /R 2 ) ≤ ( F 1 c /F 1および R 1 c/R 1 )

. 銪型となる核酸が Aであり、工程 ii)における相補鎖合成を逆転写酵素活性を持つ酵素で行う請求項 4〜 7のいずれかに記載の方法。

. 次の工程を繰り返すことによる 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。

A ) 3'末端と 5'末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がァニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される錡型を提供する工程

B )同一鎖にァニールさせた前記錡型の 3'末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、

C ) 前記ループのうち 3'末端側に位置するループ内に相補的な塩基配列を 3' 末端に含むオリゴヌクレオチドを、ループ部分にァニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程 B )で合成された相補鎖を置換してその 3'末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、および

D )工程 C )において 3'末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程 A)における新たな鍊型とする工程

0 . 工程 C ) におけるオリゴヌクレオチドが、その 5，側末端に工程 B ) において合成起点となった 3'末端に相補的な塩基配列を備えたものである請求項 9に記載の増幅方法。

1 . 更に工程 C )におけるオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖を工程 A) における錡型とする工程を含む請求項 1 0に記載の増幅方法。 2 . 工程 A)における錶型が請求項 5に記載の方法によって合成されたものである請求項 9に記載の増幅方法。

3 . 融解温度調整剤の存在下で鎖置換相補鎖合成反応を行う請求項 1または 9に記載の方法。

4 . 融解温度調整剤がベ夕インである請求項 1 3に記載の方法。

5 . 反応液中に 0.2〜3.0Mのべ夕インを存在させる請求項 1 4に記載の方法。

6 . 請求項 9〜1 5に記載のいずれかの増幅方法を行い、増幅反応生成物が生じたかどうかを観察することにより試料中の標的塩基配列を検出する方法。 7 . 増幅反応生成物に、ループに相補的な塩基配列を含むプローブを加え、両者のハイブリダイズを観察する請求項 1 6に記載の方法。

8 . プローブが粒子標識されており、イブリダィズによって生じる凝集反応を観察する請求項 1 7に記載の方法。

9 . 核酸の検出剤,存在下で請求項 9〜 1 5に記載のいずれかの増幅方法を行レ、、検出剤のシグナル変化に基づいて増幅反応生成物が生じたかどうかを観察する請求項 1 6に記載の方法。

0 . 請求項 1 6に記載の検出方法によって標的塩基配列の変異を検出する方法であって、増幅対象である塩基配列における変異が、増幅方法を構成するいずれかの相補鎖合成を妨げるものである方法。

1 . 以下の要素を含む、 1本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成用キット。

i)鍊型となる核酸の領域 F 2 cを X 2 cとし、 F 2 cの 5'側に位置する F 1 c を X 1 cとする請求項 3に記載のオリゴヌクレオチド

ii ) i )のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域に相補的な塩基配列を含むォリゴヌクレオチド

iii )錡型となる核酸の領域 F 2 cの 3'側に位置する領域 F 3 cに相補的な塩基配列を持つォリゴヌクレオチド

iv)鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼ、および

V )要素 iv)の基質となるヌクレオチド。

2 . ii )のオリゴヌクレオチドが、 i )のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域 R 2 cを X 2 cとし、 R 2 cの 5'に位置する R 1 cを X 1 cとする請求項 3に記載のオリゴヌクレオチドである請求項 2 1に記載のキヅト。

23. 更に付加的に以下の要素を含む、請求項 22に記載のキット。

vi) i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域 R2 cの 3'側に位置する領域 R3 cに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド

24. 請求項 21〜23に記載のいずれかのキットに、更に付加的に核酸合成反応の生成物を検出するための検出剤を含む、標的塩基配列の検出用キット。