KR100612551B1

KR100612551B1 - 핵산의 합성방법

Info

Publication number: KR100612551B1
Application number: KR1020027005901A
Authority: KR
Inventors: 노토미쯔구노리; 하세데쯔
Original assignee: 에이켄 카가꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 1999-11-08
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2006-08-11
Also published as: NO20022171L; NO20022171D0; ZA200203293B; RU2252964C2; RU2002115268A; CN1876843A; CN1876843B; KR20020064896A; CA2390309C; BR0015382B1; CA2390309A1; WO2001034790A1; NO331732B1; CN100393875C; CN1420928A; BR0015382A; IL149446A0

Abstract

본 발명은, 신규한 구조의 올리고뉴클레오티드와, 그것을 프라이머로 하는 핵산의 합성방법이다. 이 올리고뉴클레오티드는, 프라이머의 5'측에 이 프라이머를 합성기점으로 하여 합성되는 영역과 실질적으로 동일한 염기서열을 갖춘다. 본 발명은, 단순한 시약구성으로 등온반응을 토대로 하는 핵산의 합성을 실현한다. 또 본 발명은, 이 핵산 합성방법을 토대로 하여, 높은 특이성을 갖는 핵산의 합성방법을 제공한다.

올리고뉴클레오티드, 베타인, 핵산의 합성방법

Description

핵산의 합성방법{Method for synthesizing nucleic acid}

기술분야

본 발명은, 핵산의 증폭방법으로서 유용한, 특정 염기서열로 구성되는 핵산을 합성하는 방법에 관한 것이다.

배경기술

핵산염기서열의 상보성을 토대로 하는 분석방법은, 유전적인 특징을 직접적으로 분석하는 것이 가능하다. 그 때문에, 유전적 질환, 암화(canceration), 미생물의 식별 등에는 매우 유력한 수단이다. 또 유전자 그 자체를 검출대상으로 하기 때문에, 예를 들면 배양과 같은 시간과 수고가 드는 조작을 생략할 수 있는 경우도 있다.

그렇다고는 해도 시료중에 존재하는 목적 유전자량이 적은 경우의 검출은 일반적으로 용이하지는 않아, 표적유전자 그 자체를, 또는 검출시그날 등을 증폭하는 것이 필요해진다. 표적유전자를 증폭하는 방법의 하나로서 PCR(Polymerase Chain Reaction)법이 알려져 있다(Science, 230, 1350-1354, 1985). PCR법은, in vitro에 있어서의 핵산의 증폭기술로서 현재 가장 일반적인 방법이다. 그 지수적인 증폭효과를 토대로 하는 높은 감도에 의해 우수한 검출방법으로서 정착했다. 또, 증폭생 성물을 DNA로서 회수할 수 있기 때문에, 유전자클로닝이나 구조결정 등의 유전자공학적 수법을 지지하는 중요한 수단으로서 폭 넓게 응용되고 있다. 그러나 PCR법에 있어서는, 실시를 위해 특별한 온도조절장치가 필요한 것; 증폭반응이 지수적으로 진행되기 때문에 정량성에 문제가 있는 것; 시료나 반응액이 외부로부터의 오염을 받아, 잘못 혼입된 핵산이 주형으로서 기능해 버리는 오염(contamination)의 영향을 받기쉬운 것 등의 문제점이 지적되고 있다.

게놈정보의 축적에 동반하여, 1염기 다형(SNPs; single nucleotide polymorphism)의 해석이 주목되고 있다. 프라이머의 염기서열에 SNPs를 포함하도록 설계함으로써 PCR을 이용한 SNPs의 검출이 가능하다. 즉, 반응생성물의 유무에 의해 프라이머에 상보적인 염기서열의 유무를 알 수 있다. 그러나 PCR에 있어서는, 만일 잘못하여 상보사슬 합성이 행해져 버린 경우에는, 그 생성물이 이후 반응의 주형으로서 기능하여 잘못된 결과를 부여하는 원인이 된다. 현실적으로는, 프라이머의 말단에 있어서의 1염기의 상이함 만으로는, PCR을 엄밀하게 제어하는 것은 어렵다고 한다. 따라서, PCR을 SPNs의 검출에 이용하기 위해서는 특이성의 개선이 필요로 되어 있다.

한편 리가아제를 토대로 하는 핵산 합성방법도 실용화되어 있다. LCR법(Ligase Chain Reaction, Laffler TG; Carrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 1993, 51:9, 821-6)은, 검출대상이 되는 서열상에 있어서 인접하는 2개의 프로브를 하이브리다이즈시켜, 리가아제에 의해 양자를 연결하는 반응이 기본원리로 되어 있다. 표적염기서열이 존재하지 않는 경우에는 2개의 프로브를 연결 하는 것은 불가능하기 때문에, 연결생성물의 존재는 표적염기서열의 지표가 된다. LCR법도 합성한 상보사슬과 주형과의 분리에 온도제어가 필요해지기 때문에, PCR법과 동일한 문제점을 동반하고 있다. LCR에 대해서는, 인접하는 프로브 사이에 갭을 설치하여, 이것을 DNA 폴리머라아제로 충전하는 공정을 가하여 특이성을 개선하는 방법도 보고되어 있다. 그러나, 이 개량방법에 의해 기대할 수 있는 것은 특이성 뿐으로, 온도제어를 요구하는 점에 대해서는 여전히 과제를 남기고 있다. 또한, 필요한 효소가 늘어나기 때문에, 비용이 증가한다는 문제점이 있다.

검출대상서열을 주형으로 하여 상보적인 서열을 갖는 DNA를 증폭하는 방법에는, SDA법(Strand Displacement Amplification)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396;1992][Nucleic Acid. Res., 20, 1691-1696; 1992]라고 불리는 방법도 알려져 있다. SDA법은, 어느 염기서열의 3'측에 상보적인 프라이머를 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행할 때에, 5'측에 이중가닥 사슬의 영역이 있으면 그 사슬을 치환하면서 상보사슬의 합성을 행하는 특수한 DNA 폴리머라아제를 이용하는 방법이다. 또한 이하 본 명세서에 있어서 간단히 5'측, 또는 3'측이라고 표현할 때에는, 모두 주형으로 되어 있는 쪽의 사슬에 있어서의 방향을 의미하고 있다. 5'측의 이중가닥 사슬부분이 새롭게 합성된 상보사슬에 의해 치환(displacement)되기 때문에 SDA법이라 불리고 있다. SDA법에서는, 프라이머로서 어닐링시킨 서열에 미리 제한효소 인식서열을 삽입해 둠으로써, PCR법에 있어서는 필수로 되어 있는 온도변화공정의 생략을 실현할 수 있다. 즉, 제한효소에 의해 초래되는 닉(nick)이 상보사슬의 합성기점이 되는 3'-OH기를 부여하고, 거기서부터 사슬 치환합성을 행함으로써 먼저 합성된 상보사슬이 단일가닥 사슬로서 유리되어 다음의 상보사슬 합성의 주형으로서 재이용된다. 이와 같이 SDA법은 PCR법에서 필수로 되어 있었던 복잡한 온도제어를 불필요하게 했다.

그러나, SDA법에서는 사슬 치환형 DNA 폴리머라아제에 가하여, 반드시 닉을 초래하는 제한효소를 조합시킬 필요가 있다. 필요한 효소가 늘어난다고 하는 것은, 비용 증가의 요인이다. 또한, 사용하는 제한효소에 의해 이중가닥 사슬의 절단이 아니라 닉의 도입(즉 한쪽 사슬만 절단)을 행하기 위해, 한쪽 사슬에는 효소소화에 내성을 가지도록 합성시의 기질로서 α티오 dNTP와 같은 dNTP 유도체를 이용하지 않으면 안 된다. 이 때문에, SDA에 의한 증폭산물은 천연 핵산과는 다른 구조가 되어, 제한효소에 의한 절단이나, 증폭산물의 유전자 클로닝으로의 응용이라고 하는 이용은 제한된다. 또한 이 점에 있어서도 비용 증가의 요인을 동반하고 있다고 할 수 있다. 더하여, 미지의 서열에 SDA법을 응용할 때에는, 합성되는 영역 중에 닉 도입을 위한 제한효소 인식서열과 동일한 염기서열이 존재할 가능성을 부정할 수 없다. 이러한 케이스에서는 완전한 상보사슬의 합성이 방해될 우려가 있다.

복잡한 온도제어가 불필요한 핵산의 증폭방법으로서, NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification, TMA/Transcription Mediated Amplification법으로도 불린다)가 공지이다. NASBA는, 표적 RNA를 주형으로 하여 T7 프로모터를 부가한 프로브로 DNA 폴리머라아제에 의한 DNA 합성을 행하고, 이것을 더욱이 제2 프로브로 이중가닥 사슬로 하여, 생성되는 이중가닥 사슬 DNA를 주형으로 하여 T7 RNA 폴리머라아제에 의한 전사를 행하게 하여 다량의 RNA를 증폭하는 반응계이다(Nature, 350, 91-92, 1991). NASBA는 이중가닥 사슬 DNA를 완성할 때까지 몇개의 가열변성공정을 요구하지만, 이후의 T7 RNA 폴리머라아제에 의한 전사반응은 등온에서 진행한다. 그러나, 역전사효소, RNaseH, DNA 폴리머라아제, 그리고 T7 RNA 폴리머라아제라고 하는 복수 효소의 조합이 필수가 되기 때문에, SDA와 동일하게 비용면에서는 불리하다. 또 복수의 효소반응을 행하게 하기 위한 조건설정이 복잡하기 때문에, 일반적인 분석방법으로서 보급시키는 것이 어렵다. 이와 같이 공지의 핵산 증폭반응에 있어서는, 복잡한 온도제어의 문제점, 또는 복수의 효소가 필요로 해진다고 하는 과제가 남겨져 있다.

더욱이, 이들 공지의 핵산 합성반응에 대해서, 특이성이나 비용을 희생으로 하지 않고 핵산의 합성효율을 더욱 향상시키는 시도에 대해서는, 거의 보고가 없다. 예를 들면, RCA(Rolling-circle amplification)라 불리는 방법에서는, 표적염기서열의 존재하에서 패드록 프로브(padlock probe)에 상보적인 염기서열이 연속된 단일가닥 사슬의 DNA를 계속해서 합성할 수 있는 것이 나타내어졌다(Paul M.Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July, 1998). RCA에서는, 단일가닥의 올리고뉴클레오티드의 5'말단과 3'말단이 LCR에 있어서의 인접 프로브를 구성하는 특수한 구조의 패드록 프로브가 이용된다. 그리고 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제를 조합시킴으로써, 표적염기서열의 존재하에서 라이게이션되어 고리화한 패드록 프로브를 주형으로 하는 연속적인 상보사슬 합성반응이 트리거된다. 동일한 염기서열로 된 영역이 반복하여 연속된 구조를 갖는 단일가닥 사슬 핵산이 생성된다. 이 단일가닥 핵산에 대해 더욱이 프라이머를 어닐링시켜 그 상보사슬의 합성을 행하여, 고도의 증폭을 실현하고 있다. 그러나, 복수의 효소가 필요한 점은 여전히 남겨진 과제이다. 또한, 상보사슬 합성의 트리거는, 2개의 인접영역의 연결반응에 의존하고 있어, 그 특이성은 원리적으로 LCR과 동일한 레벨이다.

3'-OH의 공급이라고 하는 과제에 대해서는, 3'말단에 동일 사슬 상의 염기서열에 상보적인 서열을 갖게 하여, 말단에서 헤어핀 루프를 형성시키는 방법이 공지이다(Gene 71, 29-40, 1988). 이와 같은 헤어핀 루프(hair pin loop)로부터는, 자신을 주형으로 한 상보사슬 합성이 행해지고, 상보적인 염기서열로 구성된 단일가닥 사슬의 핵산을 생성한다. 예를 들면, PCT/FR95/00891에서는, 상보적인 염기서열을 연결한 말단부분에서 동일 사슬 상에 어닐링하는 구조를 실현하고 있다. 그러나 이 방법에서는, 말단이 상보사슬과의 염기쌍 결합(base pairing)을 해소하여 새롭게 동일 사슬 상에서 염기쌍 결합을 구성하는 스텝이 필수이다. 이 스텝은 염기쌍 결합을 동반하는 상보적인 염기서열 끼리의 말단에 있어서의 미묘한 평형상태에 의존하여 진행하는 것으로 되어 있다. 즉, 상보사슬과의 염기쌍 결합과, 동일 사슬 상에서의 염기쌍 결합과의 사이에서 유지되는 평형상태를 이용하여, 동일 사슬 상의 염기서열과 어닐링한 것 만이 상보사슬의 합성기점이 된다. 따라서, 고도의 반응효율을 달성하기 위해서는, 엄밀한 반응조건의 설정이 요구되는 것으로 생각된다. 더욱이 이 선행기술에 있어서는, 프라이머 자신이 루프 구조를 만들고 있다. 그 때문에 프라이머 다이머(primer dimer)가 일단 생성되면, 표적염기서열의 유무에 상관 없이 자동적으로 증폭반응이 개시되어 비특이적인 합성산물을 형성해 버린 다. 이것은 중대한 문제점이라고 할 수 있다. 더욱이, 프라이머 다이머의 생성과 그것에 동반되는 비특이적인 합성반응에 의한 프라이머의 소비가, 목적으로 하는 반응의 증폭효율의 저하로 이어진다.

그 밖에, DNA 폴리머라아제에 대해 주형이 되지 않는 영역을 이용하여 동일 사슬에 어닐링하는 3'말단구조를 실현한 보고(EP713922)가 있다. 이 보고도 말단부분에 있어서의 동적 평형을 이용하고 있는 점, 또한 프라이머 다이머 형성에 동반되는 비특이적인 합성반응의 가능성에 있어서는 앞선 PCT/FR95/00891과 동일한 문제점을 갖는다. 더욱이, DNA 폴리머라아제의 주형이 되지 않는 특수한 영역을 프라이머로서 준비하지 않으면 안 된다.

또한 상기 NASBA의 원리를 응용한 각종 시그날 증폭반응에 있어서는, 이중가닥 사슬의 프로모터영역을 공급하기 위해 종종 말단에서 헤어핀상의 구조를 동반한 올리고뉴클레오티드가 이용된다(일본국 특개평5-211873). 그러나 이들은, 상보사슬 합성의 3'-OH의 연속적인 공급을 가능하게 하는 것은 아니다. 더욱이 일본국 특표평10-510161(WO96/17079)에 있어서는, RNA 폴리머라아제에 의해 전사되는 DNA 주형을 얻는 것을 목적으로 동일 사슬 상에 3'말단을 어닐링시킨 헤어핀 루프구조가 이용되고 있다. 이 방법에서는, RNA로의 전사와, RNA에서 DNA로의 역전사를 이용하여 주형의 증폭이 행해진다. 그러나, 이 방법도 복수의 효소를 조합시키지 않으면 반응계를 구성할 수 없다.

발명의 개시

본 발명의 과제는, 신규한 원리를 토대로 하는 핵산의 합성방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는, 저비용으로 효율적으로 서열에 의존한 핵산의 합성을 실현할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 단일 효소를 사용하고, 또한 등온 반응 조건하에서도 핵산의 합성과 증폭을 달성할 수 있는 방법의 제공이, 본 발명의 과제이다. 더욱이 본 발명은, 공지의 핵산 합성반응 원리로는 달성하는 것이 곤란한 높은 특이성을 실현할 수 있는 핵산의 합성방법 및 이 합성방법을 응용한 핵산 증폭방법의 제공을 과제로 한다.

본 발명자 등은, 먼저 사슬 치환형 상보사슬 합성을 촉매하는 폴리머라아제의 이용이, 복잡한 온도제어에 의존하지 않는 핵산합성에 유용한 것에 착안했다. 이러한 DNA 폴리머라아제는, SDA나 RCA에서도 이용되는 효소이다. 그러나, 설령 이러한 효소를 사용했다고 하더라도, 공지의 프라이머를 토대로 하는 수법에서는, 예를 들면 SDA와 같이 합성기점이 되는 3'-OH를 공급하기 위해 항상 다른 효소반응이 요구된다.

따라서 본 발명자 등은, 공지의 어프로치와는 전혀 다른 각도로부터 3'-OH의 공급에 대해서 검토했다. 그 결과, 특수한 구조를 가진 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, 부가적인 효소반응에 의존하지 않고도 3'-OH의 공급이 가능해지는 것을 발견하고 본 발명을 완성했다. 즉 본 발명은, 아래 핵산의 합성방법, 더 나아가서는 이 핵산 합성방법을 응용한 핵산의 증폭방법 및 이들의 방법을 가능하게 하는 신규한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

[1] 아래의 공정을 포함하는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결 된 핵산의 합성방법.

a) 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 3'말단에 갖추고, 이 영역 F1이 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 핵산을 부여하는 공정

b) F1c에 어닐링한 F1의 3'말단을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행하는 공정

c) 영역 F2c에 상보적인 서열로 된 F2를 3'말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 b)에서 합성된 상보사슬을 치환하는 공정

d) 공정 c)에서 치환되어 염기쌍 결합이 가능해진 상보사슬에 있어서의 임의의 영역에 상보적인 서열을 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 어닐링시키고, 그 3'말단을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 c)에서 합성된 상보사슬을 치환하는 공정

[2] [1]에 있어서, 공정 d)에 있어서, 합성기점이 영역 R1c에 어닐링할 수 있는 동일 사슬 상의 3'말단에 존재하는 영역 R1이고, R1이 R1c에 어닐링함으로써 염기쌍 결합이 가능한 영역 R2c를 포함하는 루프가 형성되는 방법.

[3] 적어도 아래 2개의 영역 X2 및 X1c로 구성되고, X2의 5'측에 X1c가 연결된 올리고뉴클레오티드.

X2 : 특정 염기서열을 갖는 핵산의 임의의 영역 X2c에 상보적인 염기서열을 갖는 영역

X1c : 특정 염기서열을 갖는 핵산에 있어서의 영역 X2c의 5'측에 위치하는 영역 X1c와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 영역

[4] [1]에 있어서, 공정 a)에 있어서의 핵산이, 아래의 공정에 의해 제공되는 제2 핵산인 방법.

i) 영역 X2가 영역 F2이고, 영역 X1c가 영역 F1c인 [3]의 올리고뉴클레오티드의 영역 F2를 주형이 되는 핵산의 영역 F2c에 어닐링시키는 공정,

ii) 올리고뉴클레오티드의 F2를 합성기점으로 하여, 주형에 상보적인 염기서열을 갖는 제1 핵산을 합성하는 공정

iii) 공정 ii)에서 합성된 제1 핵산의 임의의 영역을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정,

iv) 공정 iii)에 있어서의 제1 핵산의 염기쌍 결합을 가능하게 한 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고, 그것을 합성기점으로 하여 제2 핵산을 합성하여, 그 3'말단의 F1을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정

[5] [4]에 있어서, 공정 iii)의 염기쌍 결합을 가능하게 하는 영역이 R2c이고, 또한 공정 iv)에 있어서의 올리고뉴클레오티드가, 영역 X2c가 영역 R2c이고, 영역 X1c가 영역 R1c인 [3]의 올리고뉴클레오티드인 방법.

[6] [4] 또는 [5]에 있어서, 공정 iii) 및 iv)에 있어서의 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정을, 주형에 있어서의 F2c의 더욱이 3'측에 어닐링하는 아웃터 프라이머(outer primer) 및 제1 핵산에 있어서의 공정 iv)에서 합성기점으로 한 영역의 더욱이 3'측에 어닐링하는 아웃터 프라이머를 합성기점으로 하는 사슬 치환 상 보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 사슬 치환 상보사슬 합성에 의해 행하는 방법.

[7] [6]에 있어서, 반응에 사용하는 각 올리고뉴클레오티드와 주형에 있어서의 그 상보영역과의 융해온도가, 동일한 스트린젠시하에서 다음의 관계에 있는 방법.

(아웃터 프라이머/주형에 있어서의 3'측의 영역)≤(F2c/F2 및 R2c/R2)≤(F1c/F1 및 R1c/R1)

[8] [4] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 주형이 되는 핵산이 RNA이고, 공정 ii)에 있어서의 상보사슬 합성을 역전사 효소활성을 갖는 효소로 행하는 방법.

[9] 다음의 공정을 반복하는 것에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 증폭방법.

A) 3'말단과 5'말단에 있어서, 각각 말단영역에 상보적인 염기서열로 된 영역을 동일 사슬 상에 갖추고, 이 서로 상보적인 염기서열이 어닐링했을 때에 양자 사이에 염기쌍 결합이 가능해지는 루프가 형성되는 주형을 제공하는 공정

B) 동일 사슬에 어닐링시킨 상기 주형의 3'말단을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행하는 공정,

C) 상기 루프 중 3'말단측에 위치하는 루프내에 상보적인 염기서열을 3'말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드를, 루프부분에 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 B)에서 합성된 상보사슬을 치환하여 그 3'말단을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정, 및

D) 공정 C)에 있어서 3'말단을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 한 사슬을 공정 A)에 있어서의 새로운 주형으로 하는 공정

[10] [9]에 있어서, 공정 C)에 있어서의 올리고뉴클레오티드가, 그의 5'측 말단에 공정 B)에 있어서 합성기점이 된 3'말단에 상보적인 염기서열을 갖춘 것인 증폭방법.

[11] [10]에 있어서, 더욱이 공정 C)에 있어서의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬을 공정 A)에 있어서의 주형으로 하는 공정을 포함하는 증폭방법.

[12] [9]에 있어서, 공정 A)에 있어서의 주형이 [5]의 방법에 의해 합성된 것인 증폭방법.

[13] [1] 또는 [9]에 있어서, 융해온도 조정제의 존재하에서 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 행하는 방법.

[14] [13]에 있어서, 융해온도 조정제가 베타인인 방법.

[15] [14]에 있어서, 반응액중에 0.2~3.0 M의 베타인을 존재시키는 방법.

[16] [9] 내지 [15] 중 어느 하나의 증폭방법을 행하여, 증폭반응 생성물이 생겼는지의 여부를 관찰함으로써 시료중의 표적염기서열을 검출하는 방법.

[17] [16]에 있어서, 증폭반응 생성물에, 루프에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브를 가하여, 양자의 하이브리다이즈를 관찰하는 방법.

[18] [17]에 있어서, 프로브가 입자표지되어 있어, 하이브리다이즈에 의해 생기는 응집반응을 관찰하는 방법.

[19] [16]에 있어서, 핵산의 검출제 존재하에서 [9] 내지 [15] 중 어느 하나의 증폭방법을 행하여, 검출제의 시그날변화를 토대로 하여 증폭반응 생성물이 생겼는지의 여부를 관찰하는 방법.

[20] [16]의 검출방법에 의해 표적염기서열의 변이를 검출하는 방법으로서, 증폭대상인 염기서열에 있어서의 변이가, 증폭방법을 구성하는 어느 하나의 상보사슬 합성을 방해하는 것인 방법.

[21] 아래의 요소를 포함하는, 단일가닥 사슬상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성용 키트.

i) [3]에 있어서, 주형이 되는 핵산의 영역 F2c를 X2c로 하고, F2c의 5'측에 위치하는 F1c를 X1c로 하는 올리고뉴클레오티드

ii) i)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드

iii) 주형이 되는 핵산의 영역 F2c의 3'측에 위치하는 영역 F3c에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드

iv) 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 DNA 폴리머라아제 및

v) 요소 iv)의 기질이 되는 뉴클레오티드

[22] [21]에 있어서, ii)의 올리고뉴클레오티드가 i)의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c를 X2c로 하고, R2c의 5'에 위치하는 R1c를 X1c로 하는 [3]의 올리고뉴클레오티드인 키트.

[23] [22]에 있어서, 더욱이 부가적으로 아래의 요소를 포함하는 키트.

vi) i)의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c의 3'측에 위치하는 영역 R3c에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.

[24] [21] 내지 [23] 중 어느 하나의 키트에, 더욱이 부가적으로 핵산 합성반응의 생성물을 검출하기 위한 검출제를 포함하는, 표적염기서열의 검출용 키트.

본 발명에 있어서 합성의 목적으로 하고 있는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이란, 단일가닥 사슬 상에 서로 상보적인 염기서열을 나란히 연결한 핵산을 의미한다. 더욱이 본 발명에 있어서는, 상보적인 염기서열 사이에 루프를 형성하기 위한 염기서열을 포함하지 않으면 안 된다. 본 발명에 있어서는, 이 서열을 루프 형성서열이라고 부른다. 그리고 본 발명에 의해 합성되는 핵산은, 실질적으로 상기 루프 형성서열에 의해 연결된 서로 상보적인 염기서열로 구성된다. 또한 일반적으로는, 그것이 부분적으로 염기쌍 결합을 동반하고 있는지의 여부에 상관 없이, 염기쌍 결합을 해리시켰을 때에 2개 이상의 분자로 분리되지 않는 것을 단일가닥 사슬이라고 부른다. 상보적인 염기서열은, 동일 사슬 상에서 염기쌍 결합을 형성할 수 있다. 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을, 동일 사슬 상에서 염기쌍 결합시킴으로써 얻을 수 있는 분자내 염기쌍 결합 생성물은, 외관상 이중가닥 사슬을 구성하는 영역과, 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프부분을 부여한다.

즉, 본 발명에 있어서의 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이란, 동일 사슬 상에서 어닐링하는 것이 가능한 상보적인 염기서열을 포 함하여, 그 어닐링 생성물은 구부러진 힌지부분에 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프를 구성하는 단일가닥 사슬 핵산이라고 정의할 수도 있다. 그리고 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프에는, 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 어닐링할 수 있다. 루프 형성서열은 임의의 염기서열일 수 있다. 치환을 위한 상보사슬 합성을 개시할 수 있도록 염기쌍 결합이 가능하고, 바람직하게는 특이적인 어닐링을 달성하기 위해 다른 영역에 존재하는 염기서열로부터 식별 가능한 서열을 갖춘다. 예를 들면 바람직한 태양에 있어서는, 주형이 되는 핵산에 유래하여 동일 사슬 상에서 어닐링하는 영역(즉 F1c나 R1c)의 더욱이 3'측에 위치하는 영역 F2c(또는 R2c)와 실질적으로 동일한 염기서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, 실질적으로 동일한 염기서열이란, 다음과 같이 정의된다. 즉, 어느 한 서열을 주형으로 하여 합성된 상보사슬이, 목적의 염기서열에 대해 어닐링하여 상보사슬의 합성기점을 부여할 때, 이 어느 한 서열은 목적의 염기서열에 대해 실질적으로 동일하다. 예를 들면 F2에 대해 실질적으로 동일한 염기서열이란, F2와 완전히 동일한 염기서열에 더하여, F2에 어닐링하여 상보사슬의 합성기점이 될 수 있는 염기서열을 부여하는 주형으로서 기능하는 염기서열을 포함한다. 본 발명에 있어서의 용어 「어닐링」은, 핵산이 와트슨-크릭(Watson-Crick)의 법칙을 토대로 하는 염기쌍 결합에 의해 이중가닥 사슬 구조를 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 염기쌍 결합을 구성하는 핵산사슬이 단일가닥 사슬이더라도, 분자내의 상보적인 염기서열이 염기쌍 결합을 형성하면, 어닐링이다. 본 발명에 있어서, 어닐링과 하이브리다이즈는, 핵산이 염기쌍 결합에 의한 이중가닥 사슬 구조를 형성하는 점에서 같은 뜻이다.

본 발명에 의한 핵산을 구성하는 상보적인 염기서열의 수는, 적어도 1쌍이다. 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 이 정수배가 되는 경우도 있다. 그리고 이 경우, 이론적으로는 본 발명에 있어서의 상기 핵산을 구성하는 상보적인 염기서열쌍의 수에 상한은 없다. 본 발명의 합성 생성물인 핵산이 복수쌍의 상보적인 염기서열로 구성될 때, 이 핵산은 동일한 염기서열의 반복으로 된다.

본 발명에 의해 합성되는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산은, 반드시 천연 핵산과 동일한 구조를 취할 필요는 없다. 핵산 중합화효소의 작용에 의해 핵산을 합성할 때에 기질로서 뉴클레오티드 유도체를 이용하면, 핵산 유도체의 합성이 가능한 것은 공지이다. 이러한 뉴클레오티드 유도체에는, 방사성동위원소(radioisotope)로 표지한 뉴클레오티드나, 비오틴(biotin)이나 디곡신(digoxin)과 같은 결합성 리간드로 표지한 뉴클레오티드 유도체 등을 사용할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 유도체를 사용함으로써, 생성물인 핵산 유도체의 표지가 달성된다. 또한, 형광성 뉴클레오티드를 기질로서 사용함으로써, 생성물인 핵산을 형광성 유도체로 할 수 있다. 더욱이 이 생성물은, DNA일 수도 있고, RNA로 할 수도 있다. 어느 것을 생성하는 가는, 프라이머의 구조, 중합을 위한 기질의 종류, 그리고 핵산의 중합을 행하는 중합화 시약과의 조합에 의해 결정된다.

상기의 구조를 가진 핵산의 합성은, 사슬 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라아제와, 3'말단에 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 갖추고, 이 영역 F1이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 핵산에 의해 개시할 수 있다. 헤어핀 루프를 형성시켜 자신을 주형(template)으로 하는 상보사슬 합성반응의 보고는 많지만, 본 발명에 있어서는 헤어핀 루프부분에 염기쌍 결합을 가능하게 하는 영역을 갖추고 있어, 이 영역을 상보사슬 합성에 이용하고 있는 점에 있어서 신규하다. 이 영역을 합성기점으로 함으로써, 먼저 자신을 주형으로 하여 합성된 상보사슬이 치환된다. 그리고 치환된 사슬의 3'측에 존재하는 영역 R1c(임의의 영역)가 염기쌍 결합 가능한 상태로 된다. 이 R1c에 상보적인 염기서열을 갖는 영역이 어닐링하여 상보사슬 합성을 행할 수 있고, 결과로서 F1에서 R1c에 이르는 염기서열과 그 상보사슬이 루프 형성서열을 매개로 하여 번갈아 결합한 핵산(2분자)이 생성된다. 본 발명에 있어서, 예를 들면 상기 R1c와 같이 임의로 선택되는 영역은, 그 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 어닐링할 수 있고, 그리고 그 폴리뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성되는 상보사슬이 본 발명에 필요한 기능을 갖추고 있는 한, 임의의 영역으로부터 선택할 수 있다.

더욱이 본 발명에서는, 핵산이라고 하는 용어를 사용한다. 본 발명에 있어서 핵산이란, 일반적으로는 DNA와 RNA 양쪽을 포함한다. 그러나, 구성 뉴클레오티드가 인공적인 유도체로 치환되어 있는 것이나, 또는 천연 DNA나 RNA가 수식된 것이더라도, 상보사슬 합성을 위한 주형으로서 기능하는 한, 본 발명의 핵산에 포함된다. 본 발명의 핵산은, 일반적으로 생물학적인 시료에 포함된다. 생물학적 시료란, 동물, 식물, 또는 미생물의 조직, 세포, 배양물, 배설물 또는 그들의 추출물을 나타낼 수 있다. 본 발명의 생물학적 시료에는, 바이러스나 마이코플라즈마 (mycoplasma)와 같은 세포내 기생체의 게놈 DNA, 또는 RNA가 포함된다. 또 본 발명의 핵산은, 상기 생물학적 시료에 포함되는 핵산으로부터 유도된 것이더라도 좋다. 예를 들면, mRNA를 토대로 합성된 cDNA나, 생물학적 시료에 유래하는 핵산을 토대로 증폭된 핵산은, 본 발명에 있어서의 핵산의 대표적인 것이다.

본 발명의 특징으로 되어 있는, 3'말단에 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 갖추고, 이 영역 F1이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 핵산은, 여러 방법에 의해 얻을 수 있다. 가장 바람직한 태양에 있어서는, 다음의 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용한 상보사슬 합성반응을 토대로 그 구조를 부여할 수 있다.

즉 본 발명에 있어서 유용한 올리고뉴클레오티드란, 적어도 아래의 2개의 영역 X2 및 X1c로 구성되고, X2의 5'측에 X1c가 연결된 올리고뉴클레오티드로 된다.

X2 : 특정 염기서열을 갖는 핵산의 영역 X2c에 상보적인 염기서열을 갖는 영역

여기에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 구조를 결정하는 특정 염기서열을 갖는 핵산이란, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 이용할 때에, 그 주형이 되는 핵산을 의미한다. 본 발명의 합성방법을 토대로 핵산의 검출을 행하는 경우에는, 특정 염기서열을 갖는 핵산이란, 검출대상, 또는 검출대상으로부터 유도된 핵산이다. 특정 염기서열을 갖는 핵산은, 적어도 그 일부의 염기서열이 명 확해져 있거나. 또는 추측이 가능한 상태에 있는 핵산을 의미한다. 염기서열을 명확하게 해야할 부분이란, 상기 영역 X2c 및 그 5'측에 위치하는 영역 X1c이다. 이 2개의 영역은, 연속하는 경우, 그리고 떨어져 존재하는 경우를 상정할 수 있다. 양자의 상대적인 위치관계에 의해, 생성물인 핵산이 자기 어닐링했을 때에 형성되는 루프부분의 상태가 결정된다. 또한, 생성물인 핵산이 분자간의 어닐링이 아니라 자기 어닐링을 우선적으로 행하기 위해서는, 양자의 거리가 불필요하게 떨어지지 않는 쪽이 바람직하다. 따라서, 양자의 위치관계는, 통상 0-500염기분의 거리를 사이에 두고 연속하도록 하는 것이 바람직하다. 단, 뒤에 기술하는 자기 어닐링에 의한 루프의 형성에 있어서, 양자가 지나치게 접근해 있는 경우에는 바람직한 상태의 루프의 형성을 행하기에는 불리해지는 케이스도 예상된다. 루프에 있어서는, 새로운 올리고뉴클레오티드의 어닐링과, 그것을 합성기점으로 하는 사슬 치환을 동반하는 상보사슬 합성반응을 순조롭게 개시할 수 있는 구조가 요구된다. 따라서 보다 바람직하게는, 영역 X2c 및 그 5'측에 위치하는 영역 X1c와의 거리가, 0~100염기, 더욱 바람직하게는 10~70염기가 되도록 설계한다. 또한 이 수치는 X1c와 X2를 포함하지 않은 길이를 나타내고 있다. 루프부분을 구성하는 염기수는, 더욱이 X2에 상당하는 영역을 가한 길이가 된다.

또한 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 구성하는 염기서열의 특징부여를 위해 사용되는 동일, 또는 상보적이라고 하는 용어는, 모두 완전하게 동일, 또는 완전히 상보적인 것을 의미하지 않는다. 즉, 어느 서열과 동일하다고 하는 것은, 어느 서열에 대해 어닐링할 수 있는 염기서열에 대해 상보적인 서열도 포 함할 수 있다. 한편, 상보적이란, 스트린젠트한 조건하에서 어닐링할 수 있고, 상보사슬의 합성기점이 되는 3'말단을 제공할 수 있는 서열을 의미한다.

상기 특정 염기서열을 갖는 핵산에 대해 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드를 구성하는 영역 X2 및 X1c는, 통상은 중복되지 않게 연속하여 배치된다. 또는 만일 양자의 염기서열에 공통 부분이 있는 것이라면, 부분적으로 양자를 겹쳐 배치할 수도 있다. X2는 프라이머로서 기능할 필요가 있기 때문에, 항상 3'말단이 되도록 하지 않으면 안 된다. 한편 X1c는 뒤에 기술하는 바와 같이, 이것을 주형으로 하여 합성된 상보사슬의 3'말단에 프라이머로서의 기능을 부여할 필요가 있기 때문에, 5'말단에 배치한다. 이 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 얻어지는 상보사슬은, 다음의 스텝에 있어서는 역방향으로부터의 상보사슬 합성의 주형으로 되고, 최종적으로는 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드부분도 주형으로서 상보사슬에 카피된다. 카피됨으로써 생기는 3'말단은 염기서열 X1을 갖추고 있어, 동일 사슬 상의 X1c에 어닐링하는 동시에, 루프를 형성한다.

본 발명에 있어서 올리고뉴클레오티드란, 상보적인 염기쌍 결합을 형성할 수 있는 것, 그리고 그 3'말단에 있어서 상보사슬의 합성기점이 되는 -OH기를 부여하는 것의 2개의 조건을 충족하는 것을 의미한다. 따라서, 그 백본은 반드시 포스포디에스테르결합에 의한 것에 한정되지 않는다. 예를 들면 O가 아니라 S를 백본으로 한 포스포티오에이트체 및 펩티드결합을 토대로 하는 펩티드핵산으로 된 것인 것일 수도 있다. 또한, 염기는, 상보적인 염기쌍 결합을 가능하게 하는 것이라면 좋다. 천연 상태에서는, 일반적으로는 ACTG 및 U의 5종류가 되지만, 예를 들면 브로모데 옥시우리딘(bromodeoxyuridine)이라고 하는 유사체일 수도 있다. 본 발명에 사용하는 올리고뉴클레오티드는, 합성의 기점이 될 뿐 아니라, 상보사슬 합성의 주형으로서도 기능하는 것인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용어로서 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 용어 폴리뉴클레오티드는, 그 사슬길이를 제한하지 않는 경우에 사용하고, 올리고뉴클레오티드는 비교적 짧은 사슬길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미하는 용어로서 사용된다.

본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 아래에 기술하는 각종 핵산 합성반응에 있어서, 주어진 환경하에서 필요한 특이성을 유지하면서 상보사슬과의 염기쌍 결합을 행할 수 있는 정도의 사슬길이를 갖는다. 구체적으로는, 5-200염기, 보다 바람직하게는 10-50염기쌍으로 한다. 서열 의존적인 핵산 합성반응을 촉매하는 공지의 폴리머라아제가 인식하는 프라이머의 사슬길이가, 최저 5염기 전후이기 때문에, 어닐링하는 부분의 사슬길이는 그 이상일 필요가 있다. 더하여, 염기서열로서의 특이성을 기대하기 위해서는, 확률적으로 10염기 이상의 길이를 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 지나치게 긴 염기서열은 화학합성에 의해 조제하는 것이 곤란하기 때문에, 상기와 같은 사슬길이가 바람직한 범위로서 예시된다. 또한, 여기에서 예시한 사슬길이는 어디까지나 상보사슬과 어닐링하는 부분의 사슬길이다. 뒤에 기술하는 바와 같이, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는 최종적으로는 적어도 2개의 영역에 개별적으로 어닐링할 수 있다. 따라서, 여기에 예시하는 사슬길이는, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 영역의 사슬길이로 이해해야 할 것이다.

더욱이, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 공지의 표지물질에 의해 표 지할 수 있다. 표지물로서는, 디곡신이나 비오틴과 같은 결합성 리간드, 효소, 형광물질이나 발광물질, 또는 방사성 동위원소 등을 나타낼 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 염기를 형광성 아날로그로 치환하는 기술(WO95/05391, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6644-6648, 1994)도 공지이다.

이 밖에 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 그 자신을 고상으로 결합시켜 둘 수도 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 임의의 부분에 비오틴과 같은 결합성 리간드로 표지해 두고, 이것을 고상화 아비딘과 같은 결합 파트너에 의해 간접적으로 고상화할 수도 있다. 고상화 올리고뉴클레오티드를 합성 개시점으로 하는 경우에는, 핵산의 합성반응 생성물이 고상으로 포착되기 때문에, 분리가 용이해진다. 분리된 생성물에 대해, 핵산 특이적인 지시약이나, 또는 더욱이 표지 프로브를 하이브리다이즈시킴으로써, 검출을 행하는 것도 가능하다. 또한, 임의의 제한효소로 소화함으로써, 목적으로 하는 핵산의 단편을 회수할 수도 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 주형이라는 용어는, 상보사슬 합성의 주형이 되는 측의 핵산을 의미한다. 주형에 상보적인 염기서열을 갖는 상보사슬은, 주형에 대응하는 사슬로서의 의미를 갖지만, 양자의 관계는 어디까지나 상대적인 것에 지나지 않는다. 즉, 상보사슬로서 합성된 사슬은, 다시 주형으로서 기능할 수 있다. 즉, 상보사슬은 주형이 될 수 있다.

본 발명에 유용한 올리고뉴클레오티드는 상기 2개의 영역 뿐 아니라, 더욱이 부가적인 영역을 포함할 수 있다. X2와 X1c가 각각 3'말단과 5'말단에 배치되는 한편, 양자 사이에 임의의 서열을 개재시키는 것이 가능하다. 그것은, 예를 들면 제 한효소 인식서열, RNA 폴리머라아제가 인식하는 프로모터, 또는 리보자임을 코드하는 DNA 등일 수 있다. 제한효소 인식서열로 함으로써, 본 발명의 합성산물인 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 동일한 길이를 가진 이중가닥 사슬 핵산으로 자를 수 있게 된다. RNA 폴리머라아제가 인식하는 프로모터서열을 배치하면, 본 발명의 합성 생성물을 주형으로 하여 더욱이 RNA로의 전사가 행해진다. 이 때에, 더욱이 리보자임을 코드하는 DNA를 배치하면, 전사생성물을 자신이 절단하는 계가 실현된다. 또한, 이들 부수적인 염기서열은 모두 이중가닥 사슬로 된 경우에 기능하는 것이다. 따라서, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬의 핵산이 루프를 형성하고 있을 때에는, 이들 서열은 기능하지 않는다. 핵산의 신장이 진행되어, 루프를 포함하지 않는 상태에서 상보적인 염기서열을 갖는 사슬과 어닐링한 상태가 되었을 때에 비로소 기능한다.

본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드에 대해, 합성된 영역의 전사를 가능하게 하는 방향으로 프로모터를 조합시킨 경우, 동일한 염기서열을 반복하는 본 발명을 토대로 하는 반응생성물은, 고도로 효율적인 전사계를 실현한다. 이것을 적당한 발현계와 조합시킴으로써, 단백질로의 번역도 가능하다. 즉, 세균이나 동물세포내에서 또는 in vitro에서의 전사와 단백질로의 번역에 이용할 수 있다.

상기와 같은 구조의 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 천연 핵산을 제한효소 등에 의해 절단하여, 상기와 같은 염기서열로 구성되도록 개변하거나 또는 연결하는 것도 가능하다.

본 발명에 의한 핵산의 합성방법에 있어서 유용한 상기 올리고뉴클레오티드 를 이용하여, 사슬 치환 활성을 가진 DNA 폴리머라아제와 조합시켜 합성을 행하는 반응에 대해서, 기본적인 원리를 도 5-6을 참고로 하면서 아래에 설명한다. 상기 올리고뉴클레오티드(도 5에 있어서의 FA)는, 먼저 X2(F2에 상당)가 주형이 되는 핵산에 어닐링하여 상보사슬의 합성기점이 된다. 도 5에 있어서는 FA를 기점으로 하여 합성된 상보사슬이 아웃터 프라이머(F3)로부터의 상보사슬 합성(후술)에 의해 치환되어, 단일가닥 사슬(도 5-A)로 되어 있다. 얻어진 상보사슬에 대해 더욱이 상보사슬 합성을 행하면, 이 때 도 5-A의 상보사슬로서 합성되는 핵산의 3'말단부분은, 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는다. 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 그 5'말단부분에 영역 X1c(F1c에 상당)와 동일한 서열을 갖기 때문에, 이 때 합성되는 핵산의 3'말단부분은 그 상보서열 X1(F1)을 갖게 된다. 도 5는, R1을 기점으로 하여 합성된 상보사슬이 아웃터 프라이머 R3을 기점으로 하는 상보사슬 합성에 의해 치환되는 모습을 나타내고 있다. 치환에 의해 3'말단부분이 염기쌍 결합이 가능한 상태로 되면, 3'말단의 X1(F1)은, 동일 사슬 상의 X1c(F1c)에 어닐링하여, 자기를 주형으로 한 신장반응이 진행된다(도 5-B). 그리고 그 3'측에 위치하는 X2c(F2c)를 염기쌍 결합을 동반하지 않는 루프로서 남긴다. 이 루프에는 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드의 X2(F2)가 어닐링하여, 이것을 합성 기점으로 하는 상보사슬 합성이 행해진다(도 5-B). 이 때, 먼저 합성된 자신을 주형으로 하는 상보사슬 합성반응의 생성물이, 사슬 치환반응에 의해 치환되어 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다.

본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드를 1종류, 그리고 이 올리고뉴클레오티드 를 프라이머로 하여 합성된 상보사슬을 주형으로 하여 핵산합성을 행하는 것이 가능한 임의의 리버스 프라이머를 사용한 기본적인 구성에 의해, 도 6에 나타내는 바와 같은 복수의 핵산 합성 생성물을 얻을 수 있다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, (D)가 본 발명에 있어서 합성의 목적으로 되어 있는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이다. 다른쪽 생성물(E)는, 가열변성 등의 처리에 의해 단일가닥 사슬로 하면 다시 (D)를 생성하기 위한 주형으로 된다. 또 이중가닥 사슬 상태에 있는 핵산인 생성물(D)는, 만일 가열변성 등에 의해 단일가닥 사슬로 된 경우, 원래의 이중가닥 사슬은 되지 않고 높은 확률로 동일 사슬 내부에서의 어닐링이 일어난다. 왜냐하면, 동일한 융해온도(Tm)를 갖는 상보서열이라면, 분자간(intermolecular)반응 보다도 분자내(intramolecular)반응 쪽이 훨씬 우선적으로 진행되기 때문이다. 동일 사슬 상에서 어닐링한 생성물(D)에 유래하는 단일가닥 사슬은, 각각이 동일 사슬 내에서 어닐링하여 (B)의 상태로 되돌아가기 때문에, 더욱이 각각이 1분자씩의 (D)와 (E)를 부여한다. 이들 공정을 반복함으로써, 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 차례로 합성해 가는 것이 가능하다. 1사이클로 생성되는 주형과 생성물이 지수적으로 늘어가기 때문에, 대단히 효율적인 반응이 된다.

그런데 도 5-(A)의 상태를 실현하기 위해서는, 처음에 합성된 상보사슬을 적어도 리버스 프라이머가 어닐링하는 부분에 있어서 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하지 않으면 안 된다. 이 스텝은 임의의 방법에 의해 달성할 수 있다. 즉, 최초의 주형에 대해 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 어닐링하는 영역 F2c 보다도 더욱이 주형상에서 3'측의 영역 F3c에 어닐링하는 아웃터 프라이머(F3)를 별도로 준비한다. 이 아웃터 프라이머를 합성기점으로 하여 사슬 치환형 상보사슬 합성을 촉매하는 폴리머라아제에 의해 상보사슬 합성을 행하면, 본 발명의 상기 F2c를 합성 개시점으로 하여 합성된 상보사슬은 치환되고, 이윽고 R1이 어닐링해야 할 영역 R1c를 염기쌍 결합이 가능한 상태로 한다(도 5). 사슬 치환반응을 이용함으로써, 지금까지의 반응을 등온 조건하에서 진행시킬 수 있다.

아웃터 프라이머를 이용하는 경우에는, F2c로부터의 합성 보다도 나중에 아웃터 프라이머(F3)로부터의 합성이 개시될 필요가 있다. 가장 단순한 방법은 인너 프라이머의 농도를 아웃터 프라이머의 농도 보다도 높게 하는 것이다. 구체적으로는, 통상 2~50배, 바람직하게는 4~10배의 농도차로 프라이머를 사용함으로써, 기대한 대로의 반응을 행하게 할 수 있다. 또 아웃터 프라이머의 융해온도(Tm)를 인너 프라이머의 X1(F1이나 R1에 상당)영역의 Tm 보다 낮아지도록 설정함으로써 합성 시기를 조절할 수도 있다. 즉, (아웃터 프라이머 F3 : F3c)≤(F2c/F2)≤(F1c/F1), 또는 (아웃터 프라이머/주형에 있어서의 3'측의 영역)≤(X2c : X2)≤(X1c : X1)이다. 또한 여기서 (F2c/F2)≤(F1c/F1)로 한 것은, F2가 루프부분에 어닐링하는 것 보다도 먼저 F1c/F1 사이의 어닐링을 행하게 하기 위해서이다. F1c/F1 사이의 어닐링은 분자내의 반응이기 때문에 우선적으로 진행할 가능성이 높다. 그러나 보다 바람직한 반응조건을 주기 위해 Tm을 고려하는 것에는 의미가 있다. 동일한 조건은, 리버스 프라이머의 설계에 있어서도 고려해야 할 것은 말할 것도 없다. 이러한 관계로 함으로써, 확률적으로 이상적인 반응조건을 달성할 수 있다. 융해온도(Tm)는, 다른 조건이 일정하다면 어닐링하는 상보사슬의 길이와 염기쌍 결합을 구성하는 염기의 조합에 의해 이론적으로 산출할 수 있다. 따라서 당업자는, 본 명세서의 개시를 토대로 바람직한 조건을 용이하게 이끌 수 있다.

더욱이 아웃터 프라이머의 어닐링 시기를 조정하기 위해, 콘티규어스 스태킹(contiguous stacking)이라 불리는 현상을 응용할 수도 있다. 콘티규어스 스태킹이란, 단독으로는 어닐링할 수 없는 올리고뉴클레오티드가 이중가닥 사슬부분에 인접함으로써 어닐링이 가능해지는 현상이다(Chiara Borghesi-Nicoletti et al. Bio Techniques 12, 474-477(1992)). 즉, 아웃터 프라이머를 F2c(X2c)에 인접시켜, 단독으로는 어닐링할 수 없도록 설계해 두는 것이다. 이렇게 하면, F2c(X2c)가 어닐링했을 때에 처음 아웃터 프라이머의 어닐링이 가능해지기 때문에, 필연적으로 F2c(X2c)의 어닐링이 우선되어진다. 이 원리를 토대로 하여, 일련의 반응에 프라이머로서 필요한 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 설정한 예가 실시예에 기재되어 있다. 또한, 이 공정은 가온에 의한 변성이나, DNA 헬리카아제(helicase)에 의해 달성할 수도 있다.

F2c(X2c)를 갖는 주형 핵산이 RNA인 경우에는, 다른 방법에 의해 도 5-(A)의 상태를 실현할 수도 있다. 예를 들면, 이 RNA 사슬을 분해해 버리면, R1은 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다. 즉, F2를 RNA의 F2c에 어닐링시켜, 역전사효소에 의해 DNA로서 상보사슬 합성을 행한다. 이어서 주형이 된 RNA를 알칼리 변성이나 DNA/RNA 이중가닥 사슬의 RNA에 작용하는 리보뉴클레아제에 의한 효소처리에 의해 분해하면, F2로부터 합성한 DNA는 단일가닥 사슬로 된다. DNA/RNA 이중가닥 사슬의 RNA를 선택적으로 분해하는 효소에는, RNaseH나, 일부의 역전사효소가 갖춰져 있는 리보뉴클레아제 활성을 이용할 수 있다. 이렇게 하여 염기쌍 결합을 가능하게 한 R1c에 리버스 프라이머를 어닐링시킬 수 있다. 따라서 R1c를 염기결합 가능한 상태로 하기 위한 아웃터 프라이머가 필요없게 된다.

또는 역전사효소가 갖추고 있는 사슬 치환 활성을 이용하여, 앞서 기술한 아웃터 프라이머에 의한 사슬 치환을 행할 수도 있다. 이 경우는 역전사효소 만으로 반응계를 구성할 수 있다. 즉, RNA를 주형으로 하여, 그 F2c에 어닐링하는 F2로부터의 상보사슬 합성, 더욱이 그 3'측에 위치하는 F3c에 어닐링하는 아웃터 프라이머 F3을 합성기점으로 하는 상보사슬 합성과 치환이, 역전사효소로 가능해진다. 역전사효소가 DNA를 주형으로 하는 상보사슬 합성반응을 행하는 것이라면, 치환된 상보사슬을 주형으로 하여 그 R1c에 어닐링하는 R1을 합성기점으로 하는 상보사슬 합성, 그리고 3'측에 위치하는 R3c에 어닐링하는 R3을 합성기점으로 하는 상보사슬 합성과 치환반응도 포함하여 모든 상보사슬 합성반응이 역전사효소에 의해 진행한다. 또는, 얻어진 반응조건하에서 역전사효소에 DNA/DNA사슬의 치환 활성을 기대할 수 없을 때에는, 앞서 기술한 사슬 치환 활성을 가진 DNA 폴리머라아제를 조합시켜 사용하더라도 좋다. 이상과 같이, RNA를 주형으로 하여 제1의 단일가닥 사슬 핵산을 얻는다고 하는 태양은, 본 발명에 있어서의 바람직한 태양을 구성한다. 반대로, 사슬 치환 활성을 가지고, 역전사효소 활성을 함께 갖는 Bca DNA 폴리머라아제와 같은 DNA 폴리머라아제를 이용하더라도, 동일하게 RNA로부터의 제1의 단일가닥 사슬 핵산의 합성 뿐 아니라, 이후의 DNA를 주형으로 하는 반응도 동일한 효소에 의 해 행할 수 있다.

이상과 같은 반응계는 상기 리버스 프라이머로서 특정 구조를 갖는 것을 이용함으로써, 본 발명에 고유의 여러 변이(variation)를 초래한다. 가장 효과적인 변이에 대해 아래에 기술한다. 즉, 본 발명의 가장 유리한 태양에 있어서는, 상기 리버스 프라이머로서, [5]에 기술한 바와 같은 구성으로 된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이다. [5]의 올리고뉴클레오티드란, 즉 F2를 프라이머로 하여 합성되는 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c를 X2c로 하고, R1c를 X1c로 하는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 리버스 프라이머의 이용에 의해, 루프의 형성과 이 루프부분으로부터의 상보사슬 합성과 치환이라고 하는 일련의 반응이, 센스사슬과 안티센스사슬(포워드측과 리버스측) 양쪽에서 일어나게 된다. 그 결과, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법의 합성효율이 비약적으로 향상되는 동시에, 일련의 반응을 등온으로 실시 가능하게 하는 것이다. 아래에, 이 태양을 정리한 도 1-도 3을 토대로 하여, 구체적으로 설명한다.

아래의 태양에 있어서는, 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드로서 2종류를 준비한다. 이것을 설명하기 위해 FA와 RA라고 이름 붙인다. FA와 RA를 구성하는 영역은, 아래와 같다.

X2 X1c

FA F2 F1c

RA R2 R1c

여기에서, F2는 주형이 되는 핵산의 영역 F2c에 상보적인 염기서열이다. 또 한 R2는 F2를 프라이머로 하여 합성되는 상보사슬에 포함되는 임의의 영역 R2c에 상보적인 염기서열이다. F1c와 R1c는 각각, F2c 및 R2c의 각각 하류에 위치하는 임의의 염기서열이다. 여기에서 F2-R2 사이의 거리는 임의더라도 좋다. 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제의 합성능력에도 의존하지만, 적합한 조건에서는 1 kbp 정도의 길이더라도 충분히 합성이 가능하다. 보다 구체적으로는, Bst DNA 폴리머라아제를 사용한 경우, F2/R2c 사이에서 800 bp, 바람직하게는 500 bp 이하의 길이라면 확실하게 합성된다. 온도 사이클을 동반하는 PCR에서는, 온도변화 스트레스에 의한 효소활성의 저하가 긴 염기서열의 합성효율을 낮추는 것으로 되어 있다. 본 발명에 있어서의 바람직한 태양으로는, 핵산 증폭공정에 있어서의 온도 사이클이 필요없게 되기 때문에, 긴 염기서열이더라도 합성 및 증폭을 확실하게 달성할 수 있다.

먼저 주형이 되는 핵산에 대해 FA의 F2를 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행한다. 이하, 도 1의 (4)에 이르기까지는 먼저 설명한 본 발명의 기본적인 태양(도 5)과 동일한 반응공정으로 되어 있다. 도 1의 (2)에서 F3으로서 어닐링하고 있는 서열은, 먼저 설명한 아웃터 프라이머이다. 이 프라이머를 합성기점으로 하여 사슬 치환형 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제로 행함으로써, FA로부터 합성한 상보사슬은 치환되어, 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다.

(4)에서 R2c가 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된 시점에서, 리버스 프라이머로서의 RA가 R2c/R2의 조합으로 어닐링한다. 이것을 합성기점으로 하는 상보사슬 합성은, FA의 5'측 말단인 F1c에 이르는 부분까지 행해진다. 이 상보사슬 합성반응에 이어, 역시 치환용 아웃터 프라이머 R3가 어닐링하여, 사슬 치환을 동반하여 상보사슬 합성을 행함으로써, RA를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬이 치환된다. 이 때 치환되는 상보사슬은, RA를 5'측에 가지고 FA에 상보적인 서열이 3'말단에 위치한다.

이렇게 치환된 단일가닥 사슬 핵산의 3'측에는, 동일 사슬 상의 F1c에 상보적인 서열 F1이 존재한다. F1은, 동일 분자내에 늘어선 F1c에 신속하게 어닐링하여, 상보사슬 합성이 시작된다. 3'말단(F1)이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링할 때에, F2c를 포함하는 루프가 형성되어 있다. 이 루프부분은 염기쌍 결합이 가능한 상태로 유지되어 있는 것은, 도 2-(7)로부터도 명백하다. F2c에 상보적인 염기서열을 갖는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 FA는, 이 루프부분에 어닐링하여 상보사슬의 합성기점이 된다(7). 루프부분으로부터의 상보사슬 합성은, 먼저 개시한 F1로부터의 상보사슬 합성의 반응생성물을 치환하면서 진행된다. 그 결과, 자신을 주형으로 하여 합성된 상보사슬은, 다시 3'말단에 있어서 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다. 이 3'말단은, 동일 사슬 상의 R1c에 어닐링할 수 있는 영역 R1을 3'말단에 갖추고 있어, 역시 동일 분자내에의 신속한 반응에 의해 양자는 우선적으로 어닐링한다. 이렇게 하여, 먼저 설명한 FA를 주형으로 하여 합성된 3'말단으로부터의 반응과 동일한 반응이, 이 영역에서도 진행한다. 결과로서, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산은 차례로 상보사슬 합성과 치환을 계속하여, 그 3'말단 R1을 기점으로 하는 신장을 계속하게 된다. 3'말단 R1의 동일 사슬로의 어닐링에 의해 형성되는 루프에는 항상 R2c가 포함되기 때문에, 이후의 반응에서 3'말단의 루프부분에 어닐링하는 것은 항상 R2를 갖춘 올리고뉴클레오티드(즉 RA)가 된다.

한편, 자기 자신을 주형으로 하여 신장을 계속하는 단일가닥 사슬의 핵산에 대해, 그 루프부분에 어닐링하는 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 상보사슬 합성되는 핵산에 주목하면, 여기에서도 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성이 진행되고 있다. 즉, 루프부분으로부터의 상보사슬 합성은, 예를 들면 도 2-(7)에 있어서는, RA에 달한 시점에서 완료된다. 그리고, 이 핵산의 합성에 의해 치환된 핵산이 상보사슬 합성을 개시(도 3-(8))하면, 이윽고 그 반응은 이전에 합성기점이었던 루프부분에 달하여 다시 치환이 시작된다. 이렇게 하여 루프부분으로부터 합성을 개시한 핵산도 치환되고, 그 결과 동일 사슬 상에 어닐링할 수 있는 3'말단 R1을 얻는다(도 3-(10)). 이 3'말단 R1은 동일 사슬의 R1c에 어닐링하여 상보사슬 합성을 개시한다. 이 반응의 F와 R을 바꿔 읽으면, 도 2-(7)에서 일어나고 있는 반응과 동일하다. 따라서 도 3-(10)에 나타내는 구조는, 자신의 신장과 새로운 핵산의 생성을 계속하는 새로운 핵산으로서 기능할 수 있다.

또한 도 3-(10)에 나타내는 핵산으로부터 개시하는 핵산의 합성반응은, 지금까지 기술해 온 것과는 반대로 항상 3'말단 F1을 합성기점으로 하는 신장이 된다. 즉 본 발명에 있어서는, 하나의 핵산의 신장에 동반하여, 이와는 별도로 신장을 개시하는 새로운 핵산을 계속해서 공급하는 반응이 진행된다. 더욱이 사슬이 신장됨 에 따라 말단 뿐 아니라, 동일 사슬 상에 복수의 루프 형성서열이 초래된다. 이들 루프 형성서열은, 사슬 치환 합성반응에 의해 염기쌍 형성 가능한 상태가 되면, 올리고뉴클레오티드가 어닐링하여, 새로운 핵산의 생성반응의 기점이 된다. 말단 뿐 아니라 사슬의 도중으로부터의 합성반응도 조합시킴으로써, 더욱 효율이 좋은 증폭반응이 달성되는 것이다. 이상과 같이 리버스 프라이머로서 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드 RA를 조합시킴으로써, 신장과 그것에 동반되는 새로운 핵산의 생성이 일어난다. 더욱이 본 발명에 있어서는, 이 새롭게 생성된 핵산 자신이 신장되어, 그것에 부수되는 더욱이 새로운 핵산의 생성을 초래한다. 일련의 반응은, 이론적으로는 영구히 계속되어, 지극히 효율적인 핵산의 증폭을 달성할 수 있다. 또한 본 발명의 반응은, 등온 조건하에서 행할 수 있다.

이 때 축적되는 반응생성물은, F1-R1 사이의 염기서열과 그 상보서열이 번갈아 연결된 구조를 갖는다. 단 반복단위로 되어 있는 서열의 양단에는, F2-F1(F2c-F1c), 또는 R2-R1(R2c-R1c)의 염기서열로 구성되는 영역이 연속되고 있다. 예를 들면 도 3-(9)에서는, 5'측으로부터(R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c)라고 하는 순서로 연결된 상태가 된다. 이것은, 본 발명을 토대로 하는 증폭반응이, 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 F2(또는 R2)로부터 개시하여, 계속해서 자신의 3'말단을 합성기점으로 하는 F1(또는 R1)로부터의 상보사슬 합성반응에 의해 신장된다고 하는 원리하에 진행하고 있기 때문이다.

여기에서는 가장 바람직한 태양으로서 루프부분에 어닐링하는 올리고뉴클레오티드에 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드 FA 및 RA를 사용했다. 그러나 본 발 명에 의한 핵산의 증폭반응은, 이들의 한정된 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 뿐 아니라, 루프로부터의 상보사슬 합성을 개시할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하기만 하면 실시할 수 있다. 즉, 신장을 계속하는 3'말단은 루프로부터의 상보사슬 합성에 의해 치환되기만 하면, 다시 루프부분을 부여한다. 루프부분으로부터 개시하는 상보사슬 합성은, 항상 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 주형으로 하고 있기 때문에, 본 발명에서 목적으로 하고 있는 핵산의 합성이 가능한 것은 자명하다. 단, 여기에서 합성되는 핵산은, 치환 후에 루프를 형성하여 상보사슬 합성은 행하지만, 이후의 루프를 형성하기 위한 3'말단을 가지지 않기 때문에, 새로운 주형으로서는 기능할 수 없게 된다. 따라서, FA 또는 RA에 의해 합성을 개시한 핵산과 달라서 지수적인 증폭은 기대할 수 없다. 이러한 이유로부터, FA나 RA와 같은 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는, 본 발명을 토대로 하는 고도로 효율적인 핵산의 합성에 유용한 것이다.

일련의 반응은, 주형이 되는 단일가닥 사슬의 핵산에 대해, 아래의 성분을 가하여, FA 및 RA를 구성하는 염기서열이 상보적인 염기서열에 대해 안정적인 염기쌍 결합을 형성할 수 있고, 또한 효소활성을 유지할 수 있는 온도에서 인큐베이트하는 것 만으로 진행한다.

·4종류의 올리고뉴클레오티드:

FA,

RA,

아웃터 프라이머 F3,

및 아웃터 프라이머 R3,

·사슬 치환형 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제,

·DNA 폴리머라아제의 기질이 되는 뉴클레오티드

따라서, PCR과 같은 온도 사이클은 불필요하다. 또한 여기에서 말하는 안정적인 염기쌍 결합이란, 반응계에 존재하는 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 상보사슬의 합성기점을 부여할 수 있는 상태를 의미한다. 안정적인 염기쌍 결합을 초래하는 바람직한 조건은, 예를 들면 융해온도(Tm) 이하로 설정하는 것이다. 일반적으로 융해온도(Tm)는, 서로 상보적인 염기서열을 갖는 핵산의 50%가 염기쌍 결합한 상태가 되는 온도로 되어 있다. 융해온도(Tm) 이하로 설정하는 것은 본 발명의 필수의 조건은 아니지만, 고도의 합성효율을 달성하기 위해서는 고려해야 할 반응조건의 하나이다. 주형으로 할 핵산이 이중가닥 사슬인 경우에는, 적어도 올리고뉴클레오티드가 어닐링하는 영역을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 할 필요가 있다. 그를 위해서는 일반적으로 가열변성이 행해지지만, 이것은 반응개시 전의 전처리로서 한번만 행하면 된다.

이 반응은, 효소반응에 적절한 pH를 주는 완충제, 효소의 촉매활성의 유지나 어닐링을 위해 필요한 염류, 효소의 보호제, 더 나아가서는 필요에 따라 융해온도(Tm)의 조정제 등의 공존하에서 행한다. 완충제로서는, Tris-HCl 등의 중성으로부터 약알칼리성에서 완충작용을 갖는 것이 사용된다. pH는 사용하는 DNA 폴리머라아제에 따라 조정한다. 염류로서는 KCl, NaCl, 또는 (NH₄)₂SO₄ 등이, 효소의 활성유지와 핵산의 융해온도(Tm) 조정을 위해 적절히 첨가된다. 효소의 보호제로서는, 소혈청 알부민이나 당류가 이용된다. 더욱이 융해온도(Tm)의 조정제에는, 디메틸설폭시드(DMSO)나 포름아미드가 일반적으로 이용된다. 융해온도(Tm)의 조정제를 이용함으로써, 상기 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 한정된 온도조건하에서 조정할 수 있다. 더욱이 베타인(N,N,N,-trimethylglycine)이나 테트라알킬암모늄염은, 그 isostabilize 작용에 의해 사슬 치환효율의 향상에도 유효하다. 베타인은, 반응액 중 0.2~3.0 M, 바람직하게는 0.5~1.5 M 정도의 첨가에 의해, 본 발명의 핵산 증폭반응의 촉진작용을 기대할 수 있다. 이들 융해온도의 조정제는, 융해온도를 낮추는 방향으로 작용하기 때문에, 염농도나 반응온도 등의 그 밖의 반응조건을 고려하여, 적절한 스트린젠시와 반응성을 부여하는 조건을 경험적으로 설정한다.

본 발명에 있어서는, 일련의 반응이 항상 복수 영역의 위치관계를 유지한 상태가 아니면 진행하지 않는 것이 중요한 특징이다. 이 특징에 의해, 비특이적인 상보사슬 합성에 동반되는 비특이적인 합성반응을 효과적으로 방지할 수 있는 것이다. 즉, 설령 어떠한 비특이적인 반응이 일어났다고 해도, 그 생성물이 이후의 증폭공정에 대해 출발재료가 될 가능성을 낮게 억제하는 것으로 이어지는 것이다. 또한 보다 많은 영역에 의해 반응의 진행이 제어되고 있다고 하는 것은, 유사한 염기서열의 엄밀한 식별을 가능하게 하는 검출계를 자유롭게 구성할 수 있는 가능성을 초래한다.

이 특징을 유전자 변이의 검출에 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 아웃터 프라이머를 사용하는 태양에 있어서는, 이 아웃터 프라이머 2종, 본 발명의 올 리고뉴클레오티드로부터 된 프라이머 2종의 합계 4종의 프라이머가 사용되고 있다. 즉 4종의 올리고뉴클레오티드에 포함되는 6영역이 설계 대로 작용하지 않으면 본 발명의 합성반응은 진행하지 않는다. 특히, 상보사슬의 합성기점이 되는 각 올리고뉴클레오티드의 3'말단 및 상보서열이 합성기점이 되는 X1c 영역의 5'말단의 서열은 중요하다. 따라서, 이 중요한 서열을 검출해야 할 변이에 대응하도록 설계하면, 본 발명에 의한 합성반응 생성물을 관찰함으로써, 염기의 결실이나 삽입이라는 변이의 유무, 또는 SNPs와 같은 유전자 다형을 종합적으로 분석할 수 있다. 보다 구체적으로는, 변이나 다형이 예상되는 염기가, 상보사슬의 합성기점이 되는 올리고뉴클레오티드의 3'말단 부근(상보사슬이 기점이 되는 경우에는 5'말단 부근)에 상당하도록 설계하는 것이다. 상보사슬의 합성기점이 되는 3'말단이나, 그 부근에 미스매치(mismatch)가 존재하면 핵산의 상보사슬 합성반응은 현저히 저해된다. 본 발명에 있어서는, 반응초기의 생성물에 있어서의 말단구조가 반복되어 반응을 행하지 않으면 고도의 증폭반응으로 연결되지 않는다. 따라서, 설령 잘못된 합성이 행해졌다고 하더라도, 증폭반응을 구성하는 상보사슬 합성이 어느 하나의 단계에서 항상 방해되기 때문에 미스매치를 포함한 채로는 고도의 증폭은 일어나지 않는다. 결과적으로 미스매치가 증폭반응을 효과적으로 억제하고, 최종적으로는 정확한 효과를 초래하게 된다. 즉 본 발명을 토대로 하는 핵산의 증폭반응은, 보다 완성도가 높은 염기서열의 체크 기구를 갖추고 있다고 할 수 있다. 이들 특징은, 예를 들면 단순하게 2개의 영역에서 증폭반응을 행하고 있는 PCR법 등에서는 기대하기 어려운 이점이다.

더욱이 본 발명에 사용하는 올리고뉴클레오티드를 특징짓는 영역 X1c는, 상보서열이 합성되어 비로소 합성기점으로 되어, 이 상보서열이 새롭게 합성된 동일 사슬 내의 서열 X1에 어닐링함으로써, 자기를 주형으로 하는 합성반응이 진행된다. 이 때문에, 설령 선행기술에서 종종 중요한 문제가 되는 소위 프라이머 다이머를 생성하더라도, 본 올리고뉴클레오티드는 루프를 형성하지 않는다. 따라서, 프라이머 다이머에 기인하는 비특이적인 증폭은 원리적으로 생길 수 없어, 반응의 특이성 향상에 공헌하고 있다.

더욱이 본 발명에 의하면, F3(도 1-(2))이나 R3(도 2-(5))으로 나타낸 아웃터 프라이머를 조합시킴으로써, 상기 일련의 반응을 등온 조건하에서 행할 수 있다. 즉 본 발명은, 상기 [9]에 나타낸 공정을 포함하는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법으로는, F2c/F2 사이, R2c/R2 사이, F1c/F1 사이, 그리고 R1c/R1 사이에서 안정적인 어닐링이 일어나는 온도조건이 선택되고, 그리고 바람직하게는 F3c/F3 사이 및 R3c/R3 사이는, 각각 F2c/F2 사이 및 R2c/R2 사이의 어닐링에 의해 촉진되는 콘티규어스 스태킹 현상에 의해 어닐링하도록 설정된다.

본 발명에 있어서는 핵산의 합성(synthesis)과 증폭(amplification)이라고 하는 용어를 사용한다. 본 발명에 있어서의 핵산의 합성이란, 합성기점이 된 올리고뉴클레오티드로부터의 핵산의 신장을 의미한다. 합성에 더하여, 더욱이 다른 핵산의 생성과, 이 생성된 핵산의 신장반응이 연속해서 일어날 때, 일련의 반응을 종합하여 증폭이라고 한다.

3'말단에 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 갖추고, 이 영역 F1이 동일 사슬 상의 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 단일가닥 사슬 핵산은, 본 발명의 중요한 구성요소이다. 이러한 단일가닥 사슬 핵산은, 다음과 같은 원리를 토대로 하여 공급할 수도 있다. 즉, 미리 다음과 같은 구조를 가진 프라이머를 토대로 하여 상보사슬 합성을 진행하는 것이다.

5'-[프라이머 내에 위치하는 영역 X1c에 어닐링하는 영역 X1]-[염기쌍 결합이 가능한 상태에 있는 루프 형성서열]-[영역 X1c]-[주형에 상보적인 서열을 갖는 영역]-3'

주형에 상보적인 서열을 갖는 영역에는, F1에 상보적인 염기서열(프라이머-FA) 및 R1c에 상보적인 염기서열(프라이머 RA)의 2종류를 준비한다. 또한, 이 때 합성해야 할 핵산을 구성하는 염기서열은, 영역 F1에서 영역 R1c에 이르는 염기서열과, 이 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 영역 R1에서 영역 F1c에 이르는 염기서열을 포함하는 것이다. 한편, 프라이머 내부에서 어닐링할 수 있는 X1c와 X1은, 임의의 서열로 할 수 있다. 단 프라이머 FA와 RA 사이에서는, 영역 X1c/X1의 서열을 다른 것으로 하는 것이 바람직하다.

먼저 주형 핵산의 영역 F1으로부터 상기 프라이머 FA에 의한 상보사슬 합성을 행한다. 이어서 합성된 상보사슬의 영역 R1c를 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하여, 여기에 한쪽 프라이머를 어닐링시켜 상보사슬의 합성기점으로 한다. 이 때 합성된 상보사슬의 3'말단은, 최초에 합성된 사슬의 5'말단부분을 구성하는 프라이머 FA에 상보적인 염기서열을 갖기 때문에, 3'말단에는 영역 X1을 갖고, 이것이 동일 사슬 상의 영역 X1c에 어닐링하는 동시에 루프를 형성한다. 이렇게 하여, 상기 본 발명에 의한 특징적인 3'말단구조가 제공되어, 이후의 반응은 가장 바람직한 형태로서 나타낸 앞의 반응계 그것이 된다. 또한 이 때 루프부분에 어닐링하는 올리고뉴클레오티드는, 3'말단에 루프 내에 존재하는 영역 X2c에 상보적인 영역 X2를 가지고, 5'측에는 영역 X1을 갖는 것으로 한다. 앞의 반응계에서는 프라이머 FA와 RA를 사용하여 주형 핵산에 상보적인 사슬을 합성함으로써 핵산의 3'말단에 루프구조를 초래했다. 이 방법은, 짧은 프라이머로 효과적으로 본 발명에 특징적인 말단구조를 제공한다. 한편, 본 태양에 있어서는, 프라이머로서 처음부터 루프를 구성하는 염기서열 전체를 제공하고 있어, 보다 긴 프라이머의 합성이 필요해진다.

리버스 프라이머에 제한효소 인식영역을 포함하는 염기서열을 이용하면, 본 발명에 의한 다른 태양을 구성할 수 있다. 도 6을 토대로 하여, 리버스 프라이머가 제한효소 인식서열을 포함하는 경우에 대해서 구체적으로 설명한다. 도 6-(D)가 완성한 시점에서, 리버스 프라이머 내의 제한효소 인식부위에 대응하는 제한효소에 의해 닉이 생긴다. 이 닉을 합성기점으로 하여 사슬 치환형 상보사슬 합성반응이 개시된다. 리버스 프라이머는 (D)를 구성하는 이중가닥 사슬 핵산의 양단에 위치하고 있기 때문에, 상보사슬 합성반응도 양단으로부터 개시하게 된다. 기본적으로는 선행기술로서 기재한 SDA법의 원리를 토대로 하지만, 주형이 되는 염기서열이 본 발명에 의해 상보적인 염기서열을 번갈아 연결된 구조로 되어 있기 때문에, 본 발명에 특유의 핵산 합성계가 구성되는 것이다. 또한, 닉을 넣는 리버스 프라이머의 상보사슬로 된 부분에는 제한효소에 의한 이중가닥 사슬의 절단이 생기지 않도록 뉴클레아제 내성이 되도록 dNTP 유도체가 삽입되도록 설계하지 않으며 안 된다.

리버스 프라이머에 RNA 폴리머라아제의 프로모터를 삽입해 둘 수 있다. 이 경우도 SDA법을 응용한 앞의 태양과 동일하게, 도 6-(D)의 양단으로부터 이 프로모터를 인식하는 RNA 폴리머라아제에 의해 전사가 행해진다.

본 발명에 의해 합성된 핵산은, 단일가닥 사슬이라고는 해도 상보적인 염기서열로부터 구성되기 때문에, 그 대부분이 염기쌍 결합을 형성하고 있다. 이 특징을 이용하여, 합성 생성물의 검출이 가능하다. 에티디움브로마이드 (ethidiumbromide), SYBR Green I, 또는 Pico Green과 같은 이중가닥 사슬 특이 인터칼레이터(intercalater)인 형광색소의 존재하에서 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 실시하면, 생성물의 증가에 동반하여 형광강도의 증대가 관찰된다. 이것을 모니터하면, 폐쇄계에서 리얼타임 합성반응의 추적이 가능하다. 이 종의 검출계는 PCR법으로의 응용도 생각되고 있지만, 프라이머 다이머 등에 의한 시그날의 발생과 구별이 되지 않기 때문에 문제가 많은 것으로 되고 있다. 그러나 본 발명에 응용한 경우에는, 비특이적인 염기쌍 결합이 증가할 가능성이 매우 낮기 때문에, 높은 감도와 적은 노이즈를 동시에 기대할 수 있다. 이중가닥 사슬 특이 인터칼레이터와 동일하게, 균일계의 검출계를 실현하는 방법으로서, 형광에너지 전이의 이용이 가능하다.

본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 지지하고 있는 것은, 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 DNA 폴리머라아제이다. 상기 반응중에는, 반드시 사슬 치 환형 폴리머라아제를 필요로 하지 않는 반응 스텝도 포함되어 있기는 하다. 그러나, 구성시약의 단순화, 그리고 경제성면에서, 1종류의 DNA 폴리머라아제를 이용하는 것이 유리하다. 이 종의 DNA 폴리머라아제에는, 아래와 같은 것이 알려져 있다. 또한, 이들 효소의 각종 변이체에 대해서도, 그것이 서열의존형 상보사슬 합성활성과 사슬 치환 활성을 갖는 한, 본 발명에 이용할 수 있다. 여기에서 말하는 변이체란, 효소가 필요로 하는 촉매활성을 초래하는 구조만을 꺼낸 것, 또는 아미노산의 변이 등에 의해 촉매활성, 안정성, 또는 내열성을 개변한 것 등을 나타낼 수 있다.

Bst DNA 폴리머라아제

Bca(exo-)DNA 폴리머라아제

DNA 폴리머라아제 I의 클레노우 ·프래그먼트(Klenow fragment)

Vent DNA 폴리머라아제

Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제(Vent DNA 폴리머라아제로부터 엑소 뉴클레아제 활성을 제거한 것)

DeepVent DNA 폴리머라아제

DeepVent(Exo-)DNA 폴리머라아제(DeepVent DNA 폴리머라아제로부터 엑소 뉴클레아제 활성을 제거한 것)

φ29 파지 DNA 폴리머라아제

MS-2 파지 DNA 폴리머라아제

Z-Taq DNA 폴리머라아제(다까라주조)

KOD DNA 폴리머라아제(도요보세키)

이들 효소 중에서도 Bst DNA 폴리머라아제나 Bca(exo-)DNA 폴리머라아제는, 어느 정도의 내열성을 가지고, 촉매활성도 높기 때문에 특히 바람직한 효소이다. 본 발명의 반응은, 바람직한 태양에 있어서는 등온에서 실시할 수 있지만, 융해온도(Tm)의 조정 등을 위해 반드시 효소의 안정성에 적합한 온도조건을 이용할 수 있다고는 한정할 수 없다. 따라서, 효소가 내열성인 것은 바람직한 조건의 하나이다. 또한, 등온반응이 가능하다고는 해도, 최초의 주형이 되는 핵산의 제공을 위해서도 가열변성은 행해질 가능성이 있어, 그 점에 있어서도 내열성 효소의 이용은 어세이 프로토콜(assay protocol)의 선택의 폭을 넓힌다.

Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제는, 사슬 치환 활성과 함께 고도의 내열성을 갖춘 효소이다. 그런데 DNA 폴리머라아제에 의한 사슬 치환을 동반하는 상보사슬 합성반응은, 단일가닥 사슬 결합단백질(single strand binding protein)의 첨가에 의해 촉진되는 것이 알려져 있다(Paul M. Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232, July, 1998). 이 작용을 본 발명에 응용하여, 단일가닥 사슬 결합단백질을 첨가함으로써 상보사슬 합성의 촉진효과를 기대할 수 있다. 예를 들면 Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제에 대해서는, 단일가닥 사슬 결합단백질로서 T4 gene 32가 유효하다.

또한 3'-5' 엑소 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라아제에는, 상보사슬 합성이 주형의 5'말단에 달한 부분에서 정지하지 않고, 1염기 돌출시킨 상태까지 합성을 진행하는 현상이 알려져 있다. 본 발명에서는, 상보사슬 합성이 말단에 이르렀을 때의 3'말단의 서열이 다음의 상보사슬 합성의 개시로 이어지기 때문에, 이러한 현상은 바람직하지 않다. 그러나, DNA 폴리머라아제에 의한 3'말단으로 의 염기의 부가는, 높은 확률로 A가 된다. 따라서, dATP가 잘못해서 1염기 부가되더라도 문제가 되지 않도록, 3'말단으로부터의 합성이 A에서 개시하도록 서열을 선택하면 좋다. 또한, 상보사슬 합성시에 3'말단이 설령 돌출되어 버려도, 이것을 소화하여 blunt end로 하는 3'→5' 엑소뉴클레아제활성을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 천연형 VentDNA 폴리머라아제는 이 활성을 갖는 것으로부터, Vent(Exo-)DNA 폴리머라아제와 혼합하여 이용함으로써, 이 문제를 회피할 수 있다.

본 발명에 의한 핵산의 합성방법, 또는 증폭방법에 필요한 각종 시약류는, 미리 팩키징하여 키트로서 공급할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명을 위해, 상보사슬 합성의 프라이머로서, 또는 치환용 아웃터 프라이머로서 필요한 각종 올리고뉴클레오티드, 상보사슬 합성의 기질이 되는 dNTP, 사슬 치환형 상보사슬 합성을 행하는 DNA 폴리머라아제, 효소반응에 적합한 조건을 부여하는 완충액, 더욱이 필요에 따라 합성반응 생성물의 검출을 위해 필요한 시약류로 구성되는 키트가 제공된다. 특히, 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 반응액중에서 시약의 첨가가 불필요하기 때문에, 1회의 반응에 필요한 시약을 반응용기에 분주한 상태에서 공급함으로써, 샘플의 첨가 만으로 반응을 개시할 수 있는 상태로 할 수 있다. 발광 시그날이나 형광 시그날을 이용하여, 반응생성물의 검출을 반응용기 그대로 행할 수 있는 시스템으로 하면, 반응 후 용기의 개봉을 전면적으로 폐지할 수 있다. 이것은, 오염의 방지상, 대단히 바람직한 것이다.

본 발명에 의해 합성되는, 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산에는, 예를 들면 다음과 같은 유용성이 있다. 첫째로는, 상보적인 염기 서열을 1분자 내에 갖춘 특수한 구조에 동반되는 이점의 활용이다. 이 특징에 의해, 검출이 용이해지는 것이 기대된다. 즉, 상보적인 염기서열과의 염기쌍 결합에 동반하여, 시그날을 증감하는 핵산의 검출계가 공지이다. 예를 들면 앞서 기술한 바와 같은 이중가닥 사슬 특이 인터칼레이터를 검출제로서 이용하는 방법 등을 조합시키면, 본 발명 합성 생성물의 특징을 살린 검출계를 실현할 수 있다. 이러한 검출계에 있어서 본 발명의 합성반응 생성물을 한번 열변성하여 원래의 온도로 되돌리면, 분자내의 어닐링이 우선적으로 일어나기 때문에 신속하게 상보적 서열 사이에서 염기쌍 결합을 구성한다. 한편, 만일 비특이적 반응생성물이 존재하고 있더라도, 그것은 분자내에 상보적 서열을 가지고 있지 않기 때문에 열변성에 의해 2분자 이상으로 분리되어 버려, 곧바로 원래의 이중가닥 사슬로 돌아갈 수는 없다. 이렇게 하여 검출 전에 가열변성공정을 추가함으로써, 비특이반응에 동반되는 노이즈를 줄일 수 있다. 열에 대해 내성을 갖지 않는 DNA 폴리머라아제를 사용하고 있을 때에는, 가열변성공정은 반응정지의 의미도 가져, 반응시간의 제어면에서 유리하다.

두번째 특징은, 염기쌍 결합이 가능한 상태에 있는 루프를 항상 형성하는 것이다. 염기쌍 결합이 가능한 상태에 있는 루프의 구조를, 도 4에 나타냈다. 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 루프는 프라이머의 어닐링이 가능한 염기서열 F2c(X2c)와, F2c-F1c(X1c) 사이에 개재하는 염기서열로 구성된다. F2c-F1c 사이(보편적으로 나타내면 X2c-X1c 사이)의 서열은, 주형에 유래하는 염기서열이다. 따라서 이 영역에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 프로브를 하이브리다이즈시키면, 주 형 특이적인 검출을 행할 수 있다. 또한, 이 영역은 항상 염기쌍 결합이 가능한 상태에 있기 때문에, 하이브리다이즈에 앞서 가열변성할 필요가 없다. 또한 본 발명의 증폭반응 생성물에 있어서의 루프를 구성하는 염기서열은, 임의의 길이로 할 수 있다. 따라서, 프로브의 하이브리다이즈를 목적으로 하는 경우에는, 프라이머가 어닐링해야 할 영역과 프로브가 하이브리다이즈해야 할 영역을 따로 해서 양자의 경합을 피함으로써 이상적인 반응조건을 구성할 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 단일가닥 핵산사슬 상에 염기쌍 결합이 가능한 다수의 루프가 초래된다. 이것은, 핵산 1분자에 다수의 프로브가 하이브리다이즈 가능한 것을 의미하고 있어, 감도 높은 검출을 가능하게 한다. 또한 감도 뿐 아니라, 예를 들면 응집반응과 같은 특수한 반응원리를 토대로 하는 핵산의 검출방법을 가능하게 하는 것이기도 하다. 예를 들면 폴리스티렌라텍스와 같은 미립자에 고정한 프로브를 본 발명에 의한 반응생성물에 가하면, 프로브와의 하이브리다이제이션에 동반하여 라텍스입자의 응집이 관찰된다. 응집의 강도를 광학적으로 측정하면, 높은 감도로, 또한 정량적인 관찰이 가능하다. 또한, 응집반응을 육안으로 관찰할 수도 있기 때문에, 광학적인 측정장치를 사용하지 않는 반응계를 구성할 수도 있다.

더욱이, 1핵산분자 당 많은 표지를 결합할 수 있는 본 발명의 반응생성물은, 크로마토그래피 검출도 가능하게 한다. 이뮤노 어세이 분야에서는, 육안으로 검출 가능한 표지를 이용한 크로마토 매체를 사용한 분석방법(이뮤노 크로마토그래피법)이 실용화되어 있다. 이 방법은, 크로마토매채에 고정한 항체와 표지항체에서 아날 라이트(analyte)를 샌드위치하여, 미반응 표지성분을 씻어내는 원리를 토대로 하고 있다. 본 발명의 반응생성물은, 이 원리를 핵산의 분석에도 응용 가능하게 한다. 즉, 루프부분에 대한 표지 프로브를 준비하여, 이것을 크로마토 매체에 고정화한 포착용 프로브로 트랩함으로써 크로마토 매체중에서의 분석이 행해진다. 포착용 프로브에는, 루프부분에 대한 상보서열을 이용할 수 있다. 본 발명의 반응생성물은, 다수의 루프부분을 동반하고 있기 때문에, 다수의 표지 프로브를 결합하여, 육안으로 인식 가능한 시그날을 초래한다.

루프로서 항상 염기쌍 결합이 가능한 영역을 부여하는 본 발명에 의한 반응생성물은, 이 밖에도 여러 검출계를 가능하게 한다. 예를 들면, 이 루프부분에 대한 프로브를 고정한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용한 검출계가 가능하다. 또한, 루프부분에 대한 프로브를 이중가닥 사슬 특이적인 인터칼레이터로 표지해 두면, 보다 고감도의 형광분석을 행할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 합성되는 핵산이 3'측과 5'측 양쪽에 염기쌍 결합이 가능한 루프를 형성하는 것을 적극적으로 이용할 수도 있다. 예를 들면, 한쪽 루프를 정상형과 이상형에서 공통의 염기서열로 된 부분으로 하여, 다른 쪽 루프에 양자의 차이가 생기는 영역으로 되도록 설계해 두는 것이다. 공통부분에 대한 프로브에서 유전자의 존재를 확인하여, 다른쪽 영역에서 이상의 유무를 확인한다고 하는 특징적인 분석계를 구성할 수 있다. 본 발명에 의한 핵산의 합성반응은, 등온에서 진행하는 것도 가능하기 때문에, 일반적인 형광광도계에 의해 리얼 타임 분석이 가능해지는 것도 특필할 만한 이점이다. 지금까지도 동일 사슬 상에 어닐링하는 핵산의 구조는 공지이다. 그 러나 본 발명에 의해 얻을 수 있는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산은, 다른 올리고뉴클레오티드가 염기쌍 결합할 수 있는 다수의 루프부분을 포함하는 점에 있어서 신규하다.

한편, 본 발명에 의한 반응생성물에 의해 부여되는 다수의 루프부분 그 자체를 프로브로 하여 이용하는 것도 가능하다. 예를 들면, DNA 칩에 있어서는, 한정된 영역에 높은 밀도로 프로브를 집적할 필요가 있다. 그러나 현재의 기술로는, 일정 면적에 고정할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 수는 제한된다. 따라서 본 발명의 반응생성물을 이용하면, 어닐링이 가능한 다수의 프로브를 높은 밀도로 고정화할 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 반응생성물을 프로브로 하여 DNA 칩상에 고정하면 좋다. 반응생성물은, 증폭후에 공지의 수법에 의해 고정할 수도 있고, 또한 고정화한 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 증폭반응에 있어서의 올리고뉴클레오티드로서 이용함으로써 결과적으로 고정화된 반응생성물로 할 수도 있다. 이렇게 하여 고정화된 프로브를 사용하면, 한정된 영역 속에 많은 시료 DNA를 하이브리다이즈할 수 있어, 결과적으로 높은 시그날을 기대할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은, 본 발명의 바람직한 태양의 반응원리의 일부(1)-(4)를 나타내는 모식도이다.

도 2는, 본 발명의 바람직한 태양의 반응원리의 일부(5)-(7)을 나타내는 모식도이다.

도 3은, 본 발명의 바람직한 태양의 반응원리의 일부(8)-(10)을 나타내는 모식도이다.

도 4는, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산이 형성하는 루프의 구조를 나타내는 모식도이다.

도 5는, 본 발명에 의한 기초적인 태양의 일부(A)-(B)를 나타내는 모식도이다.

도 6은, 본 발명에 의한 기초적인 태양의 일부(C)-(D)를 나타내는 모식도이다.

도 7은, M13mp18의 표적 염기서열에 있어서의, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 염기서열의 위치관계를 나타내는 도이다.

도 8은, M13mp18을 주형으로 하여 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.

레인 1 : XIV size marker

레인 2 : 1 fmol M13mp18 dsDNA

레인 3 : target 없음

도 9는, 실시예 1에 의해 얻어진 본 발명에 의한 핵산 합성반응의 생성물을 제한효소로 소화하여 아가로우즈 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

레인 1 : XIV size marker

레인 2 : 정제물의 BamHI 소화물

레인 3 : 정제물의 PvuII 소화물

레인 4 : 정제물의 HindIII 소화물

도 10은, M13mp18을 주형으로 하여, 베타인 첨가에 의한 본 발명의 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다. 0, 0.5, 1, 2는 반응액중에 첨가한 베타인 농도(M)를 나타낸다. 또, N은 음성대조를, -21은 주형 DNA의 농도 10^-21 mol을 나타낸다.

도 11은, HBV 유래의 표적염기서열에 있어서의, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 염기서열의 위치관계를 나타내는 도이다.

도 12는, M13mp18에 삽입된 HBV-M13mp18을 주형으로 하여 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.

레인 1 : XIV size marker

레인 2 : 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA

레인 3 : target 없음

도 13은, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 알칼리 변성 겔전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.

레인 1 : 람다 파지(lambda phage)의 HindIII 소화단편

레인 2 : 실시예 1의 반응생성물

레인 3 : 실시예 3의 반응생성물

도 14는, 타겟인 M13mp18의 농도를 바꿨을 때에, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다. 위는 반응시간 1시간, 아래는 반응시간 3시간의 결과이다.

레인 1 : M13mp18 dsDNA 1×10^-15 mol/tube

레인 2 : M13mp18 dsDNA 1×10^-16 mol/tube

레인 3 : M13mp18 dsDNA 1×10^-17 mol/tube

레인 4 : M13mp18 dsDNA 1×10^-18 mol/tube

레인 5 : M13mp18 dsDNA 1×10^-19 mol/tube

레인 6 : M13mp18 dsDNA 1×10^-20 mol/tube

레인 7 : M13mp18 dsDNA 1×10^-21 mol/tube

레인 8 : M13mp18 dsDNA 1×10^-22 mol/tube

레인 9 : target 없음

레인 10 : XIV size marker

도 15는, 변이의 위치 및 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 나타내는 도이다. 밑줄로 나타낸 구아닌(guanine)이, 변이형에서는 아데닌(adenine)으로 치환되어 있다.

도 16은, 본 발명의 증폭반응에 의한 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.

M : 100 bp ladder(New England Biolabs)

N : 주형 없음(정제수)

WT : 야생형 주형 M13mp18 1 fmol

MT : 변이형 주형 M13mp18FM 1 fmol

도 17은, 표적 mRNA를 코드하는 염기서열에 있어서의, 올리고뉴클레오티드를 구성하는 각 염기서열의 위치관계를 나타내는 도이다.

도 18은, mRNA를 타겟으로 하여 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 핵산의 합성방법에 의해 얻어진 생성물의 아가로우즈 전기영동의 결과를 나타내는 사진이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

실시예 1 M13mp18내 영역의 증폭

M13mp18을 주형으로 하여, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법을 시도했다. 실험에 사용한 프라이머는, M13FA, M13RA, M13F3, 그리고 M13R3의 4종류이다. M13F3과 M13R3은, 각각 M13FA와 M13RA를 합성기점으로 하여 얻어진 제1 핵산을 치환하기 위한 아웃터 프라이머이다. 아웃터 프라이머는 M13FA(또는 M13RA) 보다도 뒤에서 상보사슬의 합성기점이 될 프라이머이기 때문에, M13FA(또는 M13RA)와 인접하는 영역에 콘티규어스 스태킹 현상을 이용하여 어닐링하도록 설계했다. 또한, M13FA(또는 M13RA)의 어닐링이 우선적으로 일어남으로써 이들 프라이머 농도를 높게 설정했다.

각 프라이머를 구성하는 염기서열은 서열표에 나타낸 바와 같다. 프라이머의 구조적인 특징을 아래에 정리했다. 또 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 도 7에 나타냈다.

프라이머 5'측의 영역 / 3'측의 영역

M13FA M13FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 F1c와 동일

/ M13mp18의 영역 F2c에 상보

M13RA M13RA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R1c와 동일

/ M13FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c에 상보

M13F3 M13mp18의 영역 F2c의 3'측에 인접하는 F3c에 상보

M13R3 M13FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c의 3'측에 인접하는 R3c에 상보

이와 같은 프라이머에 의해, M13mp18의 영역 F1c에서 R1c에 이르는 영역과 그 상보적인 염기서열이, F2c를 포함하는 루프 형성서열을 통하여 단일가닥 사슬 상에 번갈아 연결된 핵산이 합성된다. 이들 프라이머에 의한 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 위한 반응액조성을 아래에 나타낸다.

반응액조성(25 μL 중)

20 mM Tris-HCl pH8.8

10 mM KCl

10 mM (NH₄)₂SO₄

6 mM MgSO₄

0.1% Triton X-100

5% 디메틸설폭시드(DMSO)

0.4 mM dNTP

프라이머 :

800 nM M13FA/서열번호 : 1

800 nM M13RA/서열번호 : 2

200 nM M13F3/서열번호 : 3

200 nM M13R3/서열번호 : 4

타겟 : M13mp18 dsDNA/서열번호 : 5

반응 : 상기 반응액을 95℃에서 5분간 가열하여, 타겟을 변성시켜 단일가닥 사슬로 했다. 반응액을 빙수로 옮겨, Bst DNA 폴리머라아제(NEW ENGLAND BioLabs)를 4U 첨가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 반응후, 80℃ 10분간에서 반응을 정지하고 다시 빙수로 옮겼다.

반응의 확인 : 상기 반응액의 5 μL에 1 μL의 loading buffer를 첨가하고, 2% 아가로우즈 겔(0.5% TBE)을 사용하여, 1시간, 80 mV로 전기영동했다. 분자 사이즈 마커로서, XIV(100 bp ladder, Boehringer Mannheim제)를 사용했다. 영동 후의 겔을 SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)로 염색하여 핵산을 확인했다. 결과는 도 8에 나타내는 바와 같다. 각 레인은 다음의 샘플에 대응하고 있다.

1. XIV size marker

2. 1 fmol M13mp18 dsDNA

3. target 없음

레인 3에서는 미반응 프라이머가 염색되어 있는 것 이외에는 밴드는 확인되지 않았다. 레인 2는 타겟이 존재하는 경우, 저사이즈 밴드의 래더와 고사이즈에서의 스메어한 염색(smeared staining) 및 겔 내에서 거의 영동되어 있지 않는 밴드로서 생성물이 확인되었다. 저사이즈의 밴드 중, 290 bp, 450 bp 부근의 밴드는, 각각 본 발명의 합성반응에 의해 예상되는 산물인, 서열번호: 11 및 서열번호: 12가 이중가닥 사슬로 된 것(도 2-(7) 및 도 2-(10)이 이중가닥 사슬로 된 것에 상당) 및 서열번호: 13(도 3-(9)에 있는 긴 단일가닥 사슬에 상당)과 사이즈가 일치하기 때문에, 반응이 예상되는 바와 같이 진행하고 있는 것이 확인되었다. 고사이즈의 스메어한 패턴(smeared pattern) 및 영동되어 있지 않은 밴드는, 본 반응이 기본적으로 연속적인 반응이기 때문에, 반응산물이 일정 사이즈로는 되지 않는 것, 그리고 부분적인 단일가닥 사슬, 또는 이중가닥 사슬의 복합체를 형성한 복잡한 구조를 동반하고 있기 때문에, 결과로서 이러한 영동결과를 부여하는 것으로 생각되었다.

실시예 2 반응산물의 제한효소 소화 확인

실시예 1에서 얻어진 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 구조를 명확하게 하는 것을 목적으로 하여, 제한효소에 의한 소화를 행했다. 제한효소를 사용한 소화에 의해 이론 대로의 단편이 생기는 한편, 실시예 1에서 관찰된 고사이즈의 스메어한 패턴이나 영동되지 않는 밴드가 소멸되면, 이들이 모두 본 발명에 의해 합성된 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열을 번갈아 연결된 핵산인 것을 추정할 수 있다.

실시예 1의 반응액을 8 튜브(200 μL)로부터 풀(pool)하여, 페놀처리 후, 에탄올 침전을 행하여 정제했다. 이 침전을 회수하여 200 μL의 TE 완충액으로 재용해하여, 그 10 μL를 제한효소 BamHI, PvuII 및 HindIII로 각각 37℃에서 2시간 소화했다. 소화물을 2% 아가로우즈 겔(0.5% TBE)을 사용하여, 1시간, 80 mV로 전기영동했다. 분자 사이즈 마커로서, SUPER LADDER-LOW(100 bp ladder)(Gensura Laboratories, Inc.제)를 사용했다. 영동 후의 겔을 SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)로 염색하여 핵산을 확인했다. 결과를 도 9에 나타내는 바와 같다. 각 레인은 다음의 샘플에 대응하고 있다.

1. XIV size marker

2. 정제물의 BamHI 소화물

3. 정제물의 PvuII 소화물

4. 정제물의 HindIII 소화물

여기에서 비교적 사슬 길이가 짧은 증폭 생성물을 구성하고 있는 염기서열은, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15 및 서열번호:16 등으로 추정된다. 이들 염기서열로부터, 추측되는 각 제한효소 소화단편의 사이즈는 표 1과 같다. 표중 L은, 루프(단일가닥 사슬)를 포함하는 단편이기 때문에 영동위치가 미확정인 것 을 나타낸다.

미소화에서의 밴드의 대부분이 소화후에는 추정되는 사이즈의 밴드로 변화되었기 때문에, 목적 반응산물이 증폭되어 있는 것이 확인되었다. 또한 비특이적 산물은 거의 없는 것도 나타내어졌다.

실시예 3 베타인 첨가에 의한 증폭반응의 촉진

증폭반응액 속으로의 베타인(betaine: N,N,N,-trimethylglycine, SIGMA) 첨가에 의한, 핵산의 증폭반응에 대한 효과를 조사하는 실험을 행했다. 실시예 1과 동일하게, M13mp18을 주형으로 하여, 본 발명에 의한 단일가닥 사슬 상에 상대적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법을, 여러 농도의 베타인 존재하에서 행했다. 실험에 사용한 프라이머는, 실시예 1에서 사용한 것과 동일하다. 주형 DNA량은, 10^-21 mol(M13mp18)이고, 음성 대조로서 물을 사용했다. 첨가하는 베타인은, 0, 0.5, 1, 2 M의 농도가 되도록 반응액에 가했다. 반응액 조성을 아래에 나타낸다.

반응액조성(25 μL 중)

20 mM Tris-HCl pH8.8

4 mM MgSO₄

0.4 mM dNTPs

10 mM KCl

10 mM (NH₄)₂SO₄

0.1% Triton X-100

프라이머 :

800 nM M13FA/서열번호: 1

800 nM M13RA/서열번호: 2

200 nM M13F3/서열번호: 3

200 nM M13R3/서열번호: 4

타겟 : M13mp18 dsDNA/서열번호: 5

사용한 폴리머라아제, 반응조건, 반응후의 전기영동조건은, 실시예 1에 기재한 것과 동일하다.

결과를 도 10에 나타낸다. 베타인농도 0.5, 1.0 M 존재하에서의 반응에서는, 증폭산물량이 증대되었다. 또한 2.0 M까지 늘리면 증폭산물은 확인되지 않았다. 이것에 의해, 적절한 베타인 존재로, 증폭반응이 촉진되는 것이 나타내어졌다. 베타인농도 2 M의 경우에, 증폭산물이 저하된 것은, Tm이 지나치게 저하된 것이 원인이라고 생각되었다.

실시예 4 HBV 유전자서열의 증폭

HBV 유전자의 부분서열을 삽입한 M13mp18 dsDNA를 주형으로 하여, 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 시도했다. 실험에 사용한 프라이머는, HB65FA(서열번호: 6), HB65RA(서열번호: 7), HBF3(서열번호: 8), 그리고 HBR3(서열번호: 9)의 4종류이다. HBF3과 HBR3은, 각각 HB65FA와 HB65RA를 합성기점으로 하여 얻어진 제1 핵산을 치환하기 위한 아웃터 프라이머이다. 아웃터 프라이머는 HB65FA(또는 HB65RA) 보다도 뒤로부터 상보사슬의 합성기점이 될 프라이머이기 때문에, HB65FA(또는 HB65RA)와 인접하는 영역에 콘티규어스 스태킹 현상을 이용하여 어닐링하도록 설계했다. 또한, HB65FA(또는 HB65RA)의 어닐링이 우선적으로 일어나도록 이들 프라이머 농도를 높게 설정했다. M13mp18에 삽입된 HBV에 유래하는 본 실시예의 타겟서열(430 bp)을 서열 10에 나타냈다.

각 프라이머를 구성하는 염기서열은 서열표에 나타낸 바와 같다. 프라이머의 구조적인 특징을 아래에 정리했다. 또 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 도 11에 나타냈다.

프라이머 5'측의 영역 / 3'측의 영역

HB65FA HB65FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 F1c와 동일

/ HBV-M13mp18의 영역 F2c에 상보

HB65RA HB65RA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R1c와 동일

/ HB65FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c에 상보

HBF3 HBV-M13mp18의 영역 F2c의 3'측에 인접하는 F3c에 상보

HBR3 HB65FA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c의 3'측에 인접하는 R3c에 상보

이러한 프라이머에 의해, HBV 유전자의 부분서열을 삽입한 M13mp18(HBV-M13mp18)의 영역 F1c에서 R1c에 이르는 영역과 그의 상보적인 염기서열이, F2c를 포함하는 루프 형성서열을 통하여 단일가닥 사슬 상에서 번갈아 연결된 핵산이 합성된다. 상기 프라이머를 사용하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조건으로 반응시켜, 그 반응액을 아가로우즈 전기영동에 의해 분석했다. 결과는 도 12에 나타내는 바와 같다. 각 레인은 다음의 샘플에 대응하고 있다.

1. XIV size marker

2. 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA

3. target 없음

실시예 1과 동일하게, target이 존재할 때에만, 저사이즈의 밴드의 래더와 고사이즈에서의 스메어한 염색 및 겔 내에서 거의 영동되어 있지 않는 밴드로서 생성물이 확인되었다(레인 2). 저사이즈의 밴드 중, 310 bp 및 480 bp 부근의 밴드는 각각, 본 반응에 의해 예상되는 산물인, 서열번호: 17 및 서열번호: 18의 이중가닥 사슬과 사이즈가 일치하기 때문에, 반응이 예상되는 대로 진행하고 있는 것이 확인되었다. 고사이즈의 스메어한 패턴 및 영동되어 있지 않은 밴드는, 실시예 1의 결과에서 기술한 바와 같이, 본 발명에 특징적인 합성 생성물의 구조가 원인이 되어 있는 것으로 추정되었다. 이 실험에 의해, 증폭하는 서열(target)이 다르더라도 본 발명을 실시 가능한 것이 확인되었다.

실시예 5 합성반응 생성물 사이즈의 확인

본 발명을 토대로 하여 합성된 핵산의 구조를 확인하기 위해, 그 길이를 알칼리 변성 조건하에서의 전기영동에 의해 분석했다. 실시예 1과 실시예 4의 타겟 존재하에서의 반응액의 5 μL에, 각각 1 μL의 alkaline loading buffer를 첨가하여, 0.7% 아가로우즈 겔(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)을 사용하여, 14시간, 50 mA로 전기영동했다. 분자 사이즈 마커로서, 람다 파지의 HindIII 소화단편을 사용했다. 영동후의 겔을 1 M Tris pH 8로 중화후, SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)로 염색하여 핵산을 확인했다. 결과는 도 13에 나타낸다. 각 레인은 아래의 샘플에 대응하고 있다.

1. 람다 파지의 HindIII 소화단편

2. 실시예 1의 반응생성물

3. 실시예 4의 반응생성물

반응생성물을 알칼리 변성조건으로 영동하면 단일가닥 사슬 상태에서의 사이즈확인이 가능하다. 실시예 1(레인 2), 실시예 4(레인 3) 모두 주된 생성물은 2 kbase 내인 것이 확인되었다. 또한, 본 발명에 의한 생성물은 이 분석에 의해 확인할 수 있는 범위에서 적어도 6 kbase 이상으로까지 신장되어 있는 것이 판명되었다. 더하여, 실시예 1이나 실시예 4의 미변성 조건하에서 영동되지 않은 밴드는, 변성상태에서는 개개의 단일가닥 사슬로 분리되어 사이즈가 작아지는 것이 새롭게 확인되었다.

실시예 6 M-13mp13내 영역의 증폭에 있어서의 타겟 농도 의존적 증폭의 확인

본 발명에 의한 핵산의 합성방법에 미치는, 타겟의 농도변화의 영향을 관찰했다. 타겟인 M13mp18 dsDNA를 0~1 fmol로 하고, 반응시간을 1시간 및 3시간으로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 조건으로 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 실시했다. 실시예 1과 동일하게, 2% 아가로우즈 겔(0.5% TBE)로 전기영동하여, SYBR Green I(Molecular Probes, Inc.)염색에 의해 핵산을 확인했다. 분자 사이즈 마커로서, XIV(100 bp ladder, Boehringer Mannheim)를 사용했다. 결과는 도 14(위: 반응시간 1시간, 아래: 반응시간 3시간)에 나타냈다. 각 레인은, 다음의 샘플에 대응한다.

1 : M13mp18 dsDNA 1×10^-15 mol/tube

2 : M13mp18 dsDNA 1×10^-16 mol/tube

3 : M13mp18 dsDNA 1×10^-17 mol/tube

4 : M13mp18 dsDNA 1×10^-18 mol/tube

5 : M13mp18 dsDNA 1×10^-19 mol/tube

6 : M13mp18 dsDNA 1×10^-20 mol/tube

7 : M13mp18 dsDNA 1×10^-21 mol/tube

8 : M13mp18 dsDNA 1×10^-22 mol/tube

9 : target 없음

10 : XIV size marker

영동후의 하부에 보이는 각 레인에 공통의 밴드는 미반응 프라이머가 염색된 것이다. 반응시간에 상관 없이, 타겟이 존재하지 않을 때에는 전혀 증폭산물은 관찰되지 않는다. 타겟 존재하에서만, 타겟의 농도 의존적으로 증폭산물의 염색 패턴이 얻어졌다. 또한, 반응시간을 길게 함으로써, 보다 저농도까지 증폭산물을 확인할 수 있었다.

실시예 7 점변이(point mutation)의 검출

(1) M13mp18FM(변이형)의 제작

타겟 DNA로서, M13mp18(야생형) 및 M13mp18FM(변이형)을 사용했다. 변이형인 M13mp18FM의 제작은, LA PCR™ in vitro Mutagenesis Kit(다까라주조)를 사용하여, 1염기 치환을 도입했다. 그 후, 시퀀싱에 의해 서열을 확인했다. F1 영역에서의 서열을 아래에 나타낸다.

야생형 : CCGGGGATCCTCTAGAGTCG(서열번호: 19)

변이형 : CCGGGGATCCTCTAGAGTCA(서열번호 :20)

(2) 프라이머의 디자인

사용하는 프라이머는, FA 프라이머의 F1c 영역의 5'말단에 야생형, 변이형에서 서열이 다른 염기가 되도록 했다. 변이의 위치 및 표적염기서열(target)에 대한 각 영역의 위치관계를 도 15에 나타낸다.

(3) 증폭반응

M13mp18(야생형) 및 M13mp18FM(변이형)을 주형으로 하여, 아래에 나타내는 각각에 특이적인 프라이머의 조합으로 주형 특이적인 증폭반응이 일어나는지의 여부의 실험을 행했다.

야생형 증폭용 프라이머 세트 : FAd4, RAd4, F3, R3

변이형 증폭용 프라이머 세트 : FAMd4, RAd4, F3, R3

각 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.

FAd4 : CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(서열번호: 21)

FAMd4 : TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT(서열번호: 22)

RAd4 : CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC(서열번호: 23)

F3 : ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA(서열번호: 24)

R3 : GTTGGGAAGGGCGATCG(서열번호: 25)

(4) M13mp18의 점돌연변이의 검출

반응액의 조성은 아래와 같다.

상기 반응액에 타겟 M13mp18, 또는 M13mp18FM 1 fmol(2 ㎕)를 첨가하고, 95℃에서 5분간 가열하여, 타겟을 변성시켜 단일가닥 사슬로 했다. 반응액을 빙수로 옮겨, Bst DNA 폴리머라아제(NEW ENGLAND BioLabs)를 1 μL(8U) 첨가하여, 68℃ 또는 68.5℃에서 1시간 반응시켰다. 반응후, 80℃ 10분간에서 반응을 정지하여 다시 빙수로 옮겼다.

도 16에서 나타내는 바와 같이, FA 프라이머로서 야생형용 FAd4를 사용했을 때는, 야생형 주형 존재만 효과적으로 증폭이 관찰되었다. 한편, FA 프라이머로서 변이형용 FAMd4를 사용했을 때는, 야생형 주형 존재만 효과적으로 증폭이 관찰되었다.

이상의 결과로부터, 본 발명의 증폭반응을 이용함으로써, 점변이를 효율적으로 검출할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예 8 mRNA를 타겟으로 한 증폭반응

타겟이 되는 핵산을 mRNA로서, 본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 시도했다. 타겟이 되는 mRNA는, 전립선 특이항원(Prostate specific antigen; PSA)을 발현한 세포인 전립선암 세포주 LNCaP cell(ATCC No. CRL-1740)과, 비발현세포인 만성 골수성 백혈병 세포주 K562 cell(ATCC No. CCL-243)을, 1:10⁶~100:10⁶으로 혼합하여, Qiagen사(독일)의 RNeasy Mini kit를 사용하여 전 RNA를 추출했다. 실험에 사용한 프라이머는, PSAFA, PSARA, PSAF3 그리고 PSAR3의 4종류이다. PSAF3과 PSAR3은, 각각 PSAFA와 PSARA를 합성기점으로 하여 얻어지는 제1 핵산을 치환하기 위한 아웃터 프라이머이다. 또한, PSAFA(또는 PSARA)의 어닐링이 우선적으로 일어나도록 이들 프라이머 농도를 높게 설정했다. 각 프라이머를 구성하는 염기서열은 아래와 같다.

프라이머 :

PSAFA: TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG(서열번호: 26)

PSARA: TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(서열번호: 27)

PSAF3: TGCTTGTGGCCTCTCGTG(서열번호: 28)

PSAR3: GGGTGTGGGAAGCTGTG(서열번호: 29)

프라이머의 구조적인 특징을 아래에 정리했다. 또한, 표적의 mRNA를 코드하는 DNA 염기서열에 대한 각 프라이머의 위치관계 및 제한효소 Sau3AI의 인식부위를 도 17에 나타냈다.

프라이머 5'측의 영역 / 3'측의 영역

PSAFA PSAFA에 의한 합성 상보사슬의 영역 F1c와 동일

/ 표적염기서열의 영역 F2c에 상보

PSARA PSARA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R1c와 동일

/ PSAFA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c에 상보

PSAF3 표적염기서열의 영역 F2c의 3'측에 인접하는 F3c에 상보

PSAR3 PSAFA에 의한 합성 상보사슬의 영역 R2c의 3'측에 인접하는 R3c에 상보

본 발명에 의한 핵산의 합성방법을 위한 반응액조성을 아래에 나타낸다.

반응액조성(25 μL 중)

20 mM Tris-HCl pH8.8

4 mM MgSO₄

0.4mM dNTPs

10 mM KCl

10 mM (NH₄)₂SO₄

0.1% Triton X-100

0.8 M betaine

5 mM DTT

1600 nM PSAFA & PSARA 프라이머

200 nM PSAF3 & PSAR3 프라이머

8U Bst DNA 폴리머라아제

100U ReverTra Ace(TOYOBO, 일본)

5 ㎍ 전 RNA

모든 성분은 빙상에서 혼합했다. 본 실험에 있어서는 mRNA(단일가닥 사슬)를 target으로 하고 있기 때문에, 가열변성에 의해 단일가닥 사슬로 하는 공정은 불필요하다. 반응은, 65℃에서 45분간 행하고, 85℃에서 5분간, 반응을 정지시켰다. 반응종료후, 5 μL의 반응액을 2% 아가로우즈를 사용하여 전기영동하여, SYBR Green I로 검출했다.

결과를 도 18에 나타낸다. 각 레인은, 아래의 샘플에 대응하고 있다.

레인 Bst RT LNCaP 세포수/10⁶개의 K562

1 - + 0

2 - + 10

3 + - 0

4 + - 10

5 + + 0

6 + + 1

7 + + 10

8 레인 6의 반응액 1 μL분을 Sau3AI로 소화한 것

9 레인 7의 반응액 1 μL분을 Sau3AI로 소화한 것

10 사이즈 마커 100 bp 래더(New England Biolabs)

Bst DNA 폴리머라아제, ReverTra Ace의 어느 한쪽이 없으면, 증폭산물이 얻어지지 않았다(레인 1~4). 양쪽 효소 존재하에서는, LNCaP 유래의 RNA가 존재하면, 증폭산물이 검출되었다(레인 5~7). 100만개의 K562 세포에 1개의 LNCaP로부터의 추출 RNA로도 검출 가능했다(레인 6). 증폭산물은, 타겟 내부의 서열에 있는 제한효소부위 Sau3AI로 소화한 바, 예상되는 크기의 단편으로 소화되었다(레인 8, 9).

이상의 결과로부터, 본 발명에 의한 핵산의 합성방법에 있어서, 타겟으로서 RNA를 사용한 경우에도, 목적의 반응산물이 얻어지는 것이 확인되었다.

산업상이용가능성

본 발명에 의한 신규한 올리고뉴클레오티드와 그것을 사용한 핵산의 합성방법에 의해 복잡한 온도제어가 불필요한 단일가닥 사슬 상에 번갈아 상보적인 염기서열이 연결된 핵산의 합성방법에 제공된다. 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성되는 상보사슬은, 항상 그 3'말단이 자신을 주형으로 하는 새로운 상보사슬 합성의 합성기점이 된다. 이 때, 새로운 프라이머의 어닐 링을 초래하는 루프의 형성을 동반하여, 이 부분으로부터의 상보사슬 합성에 의해 먼저 합성된 자신을 주형으로 하는 상보사슬 합성반응의 생성물은 다시 치환되어 염기쌍 결합이 가능한 상태가 된다. 이와 같이하여 얻을 수 있는 자신을 주형으로 하여 합성된 핵산은, 예를 들면 SDA와 같은 공지의 핵산 합성방법과 조합하여, 그들의 핵산합성의 효율향상에 공헌한다.

더욱이 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 단순히 공지의 핵산 합성방법의 효율향상을 달성할 뿐 아니라, 복잡한 온도제어를 필요로 하지 않고, 또한 고도의 증폭효율을 기대할 수 있으며, 더 나아가서는 높은 특이성을 달성할 수 있는 신규한 핵산의 합성방법이 제공된다. 즉, 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 주형사슬과 그 상보사슬에 대해 적용함으로써, 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산이 연속하여 합성되어진다. 이 반응은, 원리적으로는 합성에 필요한 출발재료가 고갈될 때까지 계속되고, 그 사이에 루프부분으로부터 합성을 개시한 새로운 핵산을 계속해서 생성한다. 이렇게 하여, 루프에 어닐링한 올리고뉴클레오티드로부터의 신장이, 긴 단일가닥 사슬 핵산(즉, 복수쌍의 상보적인 염기서열이 연결된 것)의 신장을 위한 3'-OH를 공급하는 사슬 치환을 행한다. 한편, 긴 단일가닥 사슬의 3'-OH는 자신을 주형으로 하는 상보사슬 합성반응을 행함으로써 자신의 신장을 달성하는 동시에, 루프로부터 합성개시한 새로운 상보사슬의 치환을 행한다. 이러한 증폭반응공정이, 높은 특이성을 유지하면서 등온 조건하에서 진행한다.

본 발명에 있어서의 올리고뉴클레오티드는, 2개의 연속된 영역이 설계와 같 이 배치되어 있을 때 비로소 본 발명에 의한 핵산 합성반응을 위한 프라이머로서 기능한다. 이것이, 특이성 유지에 크게 공헌한다. 예를 들면 PCR에서는, 2개의 프라이머가 의도한 위치관계와는 관계 없이, 비특이적인 미스어닐링 (missannealing)에 의해, 비특이적 증폭반응이 개시되어 버리는 것과 비교하면, 본 발명에서는 높은 특이성을 기대할 수 있는 것은 용이하게 설명할 수 있다. 이 특징을 이용하여 SNPs를 높은 감도로 정확하게 검출할 수 있다.

본 발명의 특징은, 이러한 반응이 극히 단순한 시약구성으로 용이하게 달성할 수 있는 것에 있다. 예를 들면 본 발명에 의한 올리고뉴클레오티드는, 특수한 구조를 갖는다고는 해도 그것은 염기서열의 선택의 문제로서, 물질로서는 단순한 올리고뉴클레오티드이다. 또한, 바람직한 태양에 있어서는, 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 DNA 폴리머라아제 만으로 반응을 진행시킬 수 있다. 더욱이, RNA를 주형으로 하여 본 발명을 실시하는 경우에는, Bca DNA 폴리머라아제와 같은 역전사 효소활성과 사슬 치환형 DNA 폴리머라아제 활성을 함께 갖는 DNA 폴리머라아제를 이용함으로써, 모든 효소반응을 단일 효소에 의해 행할 수 있다. 이러한 심플한 효소반응으로 고도의 핵산의 증폭반응을 실현하는 반응원리는 지금까지 알려져 있지 않다. 또한, SDA 등의 공지의 핵산 합성반응에 적용한다고 해도, 본 발명과의 조합에 의해 새로운 효소를 필요로 하지 않고, 단순히 본 발명을 토대로 하는 올리고뉴클레오티드를 조합하는 것 만으로 각종 반응계로의 적응이 가능하다. 따라서, 본 발명에 의한 핵산 합성방법은, 비용면에 있어서도 유리하다고 할 수 있다.

이상 기술한 바와 같이, 본 발명의 핵산의 합성방법과 그를 위한 올리고뉴클 레오티드는, 조작성(온도제어 불필요), 합성효율의 향상, 경제성, 그리고 높은 특이성이라고 하는, 복수의 곤란한 과제를 동시에 해결하는 새로운 원리를 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha <120> Method for Synthesizing The Nucleic Acid. <130> E2-001PCT2 <140> <141> <150> PCT/JP99/06213 <151> 1999-11-08 <160> 29 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequense <400> 1 cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at 52 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequense <400> 2 acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta c 51 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequense <400> 3 actttatgct tccggctcgt a 21 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequense <400> 4 gttgggaagg gcgatcg 17 <210> 5 <211> 600 <212> DNA <213> Bacteriophage M13mp18 <400> 5 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120 cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180 tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 240 cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg 300 ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 360 atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 420 agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc 480 cggaaagctg gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac ggtcgtcgtc ccctcaaact 540 ggcagatgca cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca 600 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence <400> 6 ctcttccaaa agtaaggcag gaaatgtgaa accagatcgt aatttggaag acccagcatc 60 cag 63 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial 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tcggtacccg gggatcctct 120 agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180 ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240 gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300 cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360 tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420 ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcg 458 <210> 15 <211> 790 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized sequence <400> 15 acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 60 cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 120 gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 180 ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 240 tatccgctca caattccaca caacaaaaag tacccgggga tcctctagag tcgacctgca 300 ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 360 ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 420 aggcccgcac aaaaagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag 480 cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgggta ctttttgttg tgtggaattg 540 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgagctcg 600 gtacccgggg atcctctaga gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt 660 ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 720 ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca caaaaagggt tttcccagtc 780 acgacgttgt 790 <210> 16 <211> 789 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized sequence <400> 16 cgactctaga ggatccccgg gtactttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60 cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct 120 agagtcgacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 180 ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 240 gcgtaatagc gaagaggccc gcacaaaaag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 300 cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgagc 360 tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 420 ccacacaaca aaaagtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg 480 cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tttttgtgcg ggcctcttcg 540 ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 600 gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag 660 gtcgactcta gaggatcccc gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt 720 tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac aaaaagtacc cggggatcct 780 ctagagtcg 789 <210> 17 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized sequence <400> 17 gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60 cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120 cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 180 gtgaaaccac aatagttgtc tgatttttag gcccatatta acattgacat agctgactac 240 taattccctg gatgctgggt cttccaaatt acgatctggt ttcacatttc ctgccttact 300 tttggaagag 310 <210> 18 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized sequence <400> 18 gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgtctaacaa cagtagtttc 60 cggaagtgtt gataagatag gggcatttgg tggtctgtaa gcgggaggag tgcgaatcca 120 cactccaaaa gataccaaat actccaaaac agtttctctt ccaaaagtaa ggcaggaaat 180 gtgaaaccac aatagttgtc tgatttttag gcccatatta acattgacat agctgactac 240 taattccctg gatgctgggt cttccaaatt acgatctggt ttcacatttc ctgccttact 300 tttggaagag aaactgtttt ggagtatttg gtatcttttg gagtgtggat tcgcactcct 360 cccgcttaca gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac tactgttgtt 420 agacgacgag gcaggtcccg atcagcggga ggagtgcgaa tccac 465 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> M13mp18 <400> 19 ccggggatcc tctagagtcg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> M13mp18 mutant <400> 20 ccggggatcc tctagagtca 20 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description 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Claims

아래의 공정을 포함하는 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성방법.

a) 동일 사슬 상의 일부 F1c에 어닐링할 수 있는 영역 F1을 3'말단에 갖추고, 이 영역 F1이 F1c에 어닐링함으로써, 염기쌍 결합이 가능한 영역 F2c를 포함하는 루프를 형성할 수 있는 핵산을 부여하는 공정

b) F1c에 어닐링한 F1의 3'말단을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행하는 공정

c) 영역 F2c에 상보적인 서열로 된 F2를 3'말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 b)에서 합성된 상보사슬을 치환하는 공정

d) 공정 c)에서 치환되어 염기쌍 결합이 가능해진 상보사슬에 있어서의 임의의 영역에 상보적인 서열을 3'말단에 포함하는 폴리뉴클레오티드를 어닐링시키고, 그 3'말단을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 c)에서 합성된 상보사슬을 치환하는 공정
제1항에 있어서, 공정 d)에 있어서, 합성기점이 영역 R1c에 어닐링할 수 있는 동일 사슬 상의 3'말단에 존재하는 영역 R1이고, R1이 R1c에 어닐링함으로써 염기쌍 결합이 가능한 영역 R2c를 포함하는 루프가 형성되는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 공정 a)에 있어서의 핵산이, 아래의 공정에 의해 제공되는 제2 핵산인 방법.

i) 영역 F2c를 갖는 주형이 되는 핵산의 영역 F2c에 상보적인 염기서열로 된 영역 F2를 3'말단에 가지고, 주형이 되는 핵산에 있어서의 F2c의 5'측에 위치하는 F1c와 동일한 염기서열로 된 영역 F1c를 5'말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 FA의 영역 F2를 주형이 되는 핵산의 영역 F2c에 어닐링시키는 공정

ii) 올리고뉴클레오티드 FA의 F2를 합성기점으로 하여, 주형에 상보적인 염기서열을 갖는 제1 핵산을 합성하는 공정

iii) 공정 ii)에서 합성된 제1 핵산의 임의의 영역을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정

iv) 공정 iii)에 있어서의 제1 핵산의 염기쌍 결합을 가능하게 한 영역에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고, 그것을 합성기점으로 하여 제2 핵산을 합성하여, 그 3'말단의 F1을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정
제4항에 있어서, 공정 iii)의 염기쌍 결합을 가능하게 하는 영역이 R2c이고, 또한 공정 iv)에 있어서의 올리고뉴클레오티드가, 올리고뉴클레오티드 FA를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c에 상보적인 염기서열로 된 영역 R2를 3'말단에 가지고, 상보사슬에 있어서의 R2c의 5'측에 위치하는 R1c와 동일한 염기서열로 된 영역 R1c를 5'말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 RA인 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 공정 iii) 및 iv)에 있어서의 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정을, 주형에 있어서의 F2c의 더욱이 3'측에 어닐링하는 아웃터 프라이머 및 제1 핵산에 있어서의 공정 iv)에서 합성기점으로 한 영역의 더욱이 3'측에 어닐링하는 아웃터 프라이머를 합성기점으로 하는 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 사슬 치환 상보사슬 합성에 의해 행하는 방법.
제6항에 있어서, 반응에 사용하는 각 올리고뉴클레오티드와 주형에 있어서의 그 상보영역과의 융해온도가, 동일한 스트린젠시하에서 다음의 관계에 있는 방법.

(아웃터 프라이머/주형에 있어서의 3'측의 영역)≤(F2c/F2 및 R2c/R2)≤(F1c/F1 및 R1c/R1)
제4항에 있어서, 주형이 되는 핵산이 RNA이고, 공정 ii)에 있어서의 상보사슬 합성을 역전사 효소활성을 갖는 효소로 행하는 방법.
다음의 공정을 반복하는 것에 의한 단일가닥 사슬 상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 증폭방법.

A) 3'말단과 5'말단에 있어서, 각각 말단영역에 상보적인 염기서열로 된 영역을 동일 사슬 상에 갖추고, 이 서로 상보적인 염기서열이 어닐링했을 때에 양자 사이에 염기쌍 결합이 가능해지는 루프가 형성되는 주형을 제공하는 공정

B) 동일 사슬에 어닐링시킨 상기 주형의 3'말단을 합성기점으로 하여 상보사슬 합성을 행하는 공정

C) 상기 루프 중 3'말단측에 위치하는 루프 내에 상보적인 염기서열을 3'말단에 포함하는 올리고뉴클레오티드를, 루프부분에 어닐링시키고, 이것을 합성기점으로 하여 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 촉매하는 폴리머라아제에 의한 상보사슬 합성을 행하여, 공정 B)에서 합성된 상보사슬을 치환하여 그 3'말단을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 하는 공정, 및

D) 공정 C)에 있어서 3'말단을 염기쌍 결합이 가능한 상태로 한 사슬을 공정 A)에 있어서의 새로운 주형으로 하는 공정
제9항에 있어서, 공정 C)에 있어서의 올리고뉴클레오티드가, 그의 5'측 말단에 공정 B)에 있어서 합성기점이 된 3'말단에 상보적인 염기서열을 갖춘 것인 증폭방법.
제10항에 있어서, 더욱이 공정 C)에 있어서의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬을 공정 A)에 있어서의 주형으로 하는 공정을 포함하는 증폭방법.
제9항에 있어서, 공정 A)에 있어서의 주형이 제5항의 방법에 의해 합성된 것인 증폭방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 융해온도 조정제의 존재하에서 사슬 치환 상보사슬 합성반응을 행하는 방법.
제13항에 있어서, 융해온도 조정제가 베타인인 방법.
제14항에 있어서, 반응액 중에 0.2~3.0 M의 베타인을 존재시키는 방법.
제9항의 증폭방법을 행하여, 증폭반응 생성물이 생겼는지의 여부를 관찰함으로써 시료중의 표적염기서열을 검출하는 방법.
제16항에 있어서, 증폭반응 생성물에 루프에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브를 가하여, 양자의 하이브리다이즈를 관찰하는 것에 의해 표적염기서열을 검출하는 방법.
제17항에 있어서, 프로브가 입자표지되어 있어, 하이브리다이즈에 의해 생기는 응집반응을 관찰하는 것에 의해 표적염기서열을 검출하는 방법.
제16항에 있어서, 핵산의 검출제 존재하에서 제9항의 증폭방법을 행하여, 검출제의 시그날변화를 토대로 하여 증폭반응 생성물이 생겼는지의 여부를 관찰하는 것에 의해 표적염기서열을 검출하는 방법.
제16항의 검출방법에 의해 표적염기서열의 변이를 검출하는 방법으로서, 증폭대상인 염기서열에 있어서의 변이가, 증폭방법을 구성하는 어느 하나의 상보사슬 합성을 방해하는 것인 방법.
아래의 요소를 포함하는, 단일가닥 사슬상에 상보적인 염기서열이 번갈아 연결된 핵산의 합성용 키트.

i) 영역 F2c를 갖는 주형이 되는 핵산의 영역 F2c에 상보적인 염기서열로 된 영역 F2를 3'말단에 가지고, 주형이 되는 핵산에 있어서의 F2c의 5'측에 위치하는 F1c와 동일한 염기서열로 된 영역 F1c를 5'말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 FA

ii) i)의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역에 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드

iii) 주형이 되는 핵산의 영역 F2c의 3'측에 위치하는 영역 F3c에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드

iv) 사슬 치환형 상보사슬 합성반응을 촉매하는 DNA 폴리머라아제 및

v) 요소 iv)의 기질이 되는 뉴클레오티드
제21항에 있어서, ii)의 올리고뉴클레오티드가, i)의 올리고뉴클레오티드 FA를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c에 상보적인 염기서열로 된 영역 R2를 3'말단에 가지고, 상보사슬에 있어서의 R2c의 5'측에 위치하는 R1c와 동일한 염기서열로 된 영역 R1c를 5'말단에 갖는 올리고뉴클레오티드 RA인 키트.
제22항에 있어서, 더욱이 부가적으로 아래의 요소를 포함하는 키트:

vi) i)의 올리고뉴클레오티드를 합성기점으로 하여 합성된 상보사슬에 있어서의 임의의 영역 R2c의 3'측에 위치하는 영역 R3c에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 키트에, 더욱이 부가적으로 핵산 합성반응의 생성물을 검출하기 위한 검출제를 포함하는, 표적염기서열의 검출용 키트.