KR20150132481A

KR20150132481A - 핵산 증폭

Info

Publication number: KR20150132481A
Application number: KR1020157029640A
Authority: KR
Inventors: 카밀라 벨호신; 조세핀 리; 프라나브 파텔; 애런 리처드슨; 스콧 타바크만
Original assignee: 테라노스, 인코포레이티드
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-15
Publication date: 2015-11-25
Also published as: WO2014145296A3; US10745745B2; CA2906805A1; EP2971123B1; US20140295440A1; JP2019141058A; US11649487B2; US11603558B2; WO2014145296A2; US20210024987A1; US20180094306A1; MX2015011435A; JP2021129582A; CN106715710B; JP2016521120A; EP3943610A1; US9725760B2; AU2014233150A1; US9551027B2; SG11201507272RA

Abstract

핵산을 증폭하고 연쇄동일서열을 생성하기 위한 방법과 구성물이 공개되었습니다. 본 문서에 제공된 증폭 방법은 등온 조건(isothermal conditions) 하에서 수행할 수도 있습니다. 방법과 구성물에는 핵산 중합효소 및 프라이머 같은 시약이 포함될 수도 있습니다.

Description

핵산 증폭 {Nucleic Acid Amplification}

배경

핵산 증폭에 대한 방법과 시약의 필요성이 증가하고 있습니다. 특정 핵산의 다수 복사본을 생성하는 것은 특정 응용에 핵산을 사용하기 위해 흔히 필요하고 도움됩니다. 예를 들어, 관심 핵산의 뉴클레오티드 서열을 분석하려면, 서열을 분석하기 전에 복사본 개수를 증가하기 위해 핵산을 흔히 복제합니다. 다른 한 예에서, 시료에 들어 있는 특정 핵산의 유무를 결정하려면, 시료를 특정 조건으로 처리하여 시료에 특정 핵산이 들어 있을 경우 이것이 증폭되도록 합니다. 다른 한 예에서, 프로브(probe)로 사용할 핵산은 반복적으로 복사되어 원본 핵산 주형(nucleic acid template) 같은 동일한 서열이 들어 있는 핵산을 대량으로 생성하고, 이렇게 생산된 대량의 핵산 복사본을 프로브로 사용합니다.

핵산을 증폭하기 위한 다양한 방법이 알려져 있습니다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응("PCR")(예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,202 참조)은 핵산 증폭에 많이 사용되는 방법입니다. PCR 반응을 성공적으로 수행하려면, 반응은 다수의 서로 다른 온도에서 수행해야 하고, 다수의 사이클에 대해 반복해야 합니다. 이렇게 하려면 PCR 반응의 온도를 반복적으로 변경하는 하드웨어와 기타 장치가 필요합니다. 핵산 증폭의 다른 한 방법은 루프 매개 등온 증폭("LAMP" loop-mediated isothermal amplification)(미국 특허 번호 6,410,278 참조)입니다. LAMP 반응은 등온적으로 수행할 수 있으나 일반적으로 4 가지 서로 다른 프라이머(primer)를 사용하고, 표적 핵산에 대해 총 6개의 분명한 서열을 식별할 수 있습니다.

증폭된 핵산을 사용하는 수많은 응용에 대해, 증폭된 핵산의 생성을 용이하게 하기 위해, 핵산 증폭을 위한 새로운 방법과 시약이 바람직합니다.

참조를 통한 결합(INCORPORATION BY REFERENCE)

본 명세서(문서)에서 언급된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은, 각각이 참조를 통해 결합되었다고 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로, 참조를 통해 결합되어 있습니다. 그러나, 현재 명시된 공개의 내용과 본 문서에 참조로 통합된 문서의 내용이 충돌할 경우, 현재 명시된 공개의 내용이 우선합니다.

요약

본 문서에는 핵산 증폭과 연쇄동일서열(concatemer)의 생성에 대한 방법과 구성물이 제공되어 있습니다.

일부 구현에서, 2중가닥 핵산 주형의 둘 이상의 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열을 생성하는 방법이 제공되었으며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: (A) 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되고, 이것이 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥으로 서냉결합하도록 하는 조건 하에서 2중가닥 핵산 주형이 들어 있는 1차 2중가닥 핵산을 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본과 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서 첫 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 두 개의 영역이 포함되어 있으며, 이 두 개의 영역에는 다음이 포함되고: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 주형 결합 영역은 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥으로 서냉결합되는 것인 단계, (B) 두 번째 프라이머의 연장 결과물이 합성되어 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물로 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 두 번째 프라이머와 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서 두 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 두 개의 영역이 포함되며, 두 영역은 다음과 같이 구성되고: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하고 첫 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하는 방식으로 서열들이 정렬될 경우, 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역은 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물로 서냉결합되고, 두 번째 프라이머의 연장 결과물에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드가 들어 있는 3' 말단 영역이 들어 있고, 3' 말단 영역에는 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계, (C) 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되어 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물로 서냉결합하도록 하는 조건 하에서 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물을 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본과 중합효소로 처리하여, 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 들어 있는 두 번째 핵산의 첫 번째 복사본을 생성하는 단계이며, 여기서 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드가 들어 있는 3' 말단 영역이 포함되어 있고, 3' 말단 영역에는 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계, (D) 단계 적어도 (C)를 한 번 이상 추가 반복하여 단계 (C)의 2차 핵산의 적어도 두 번째 복사본을 생성하는 단계, (E) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역으로 서냉결합하도록 하는 조건 하에서 단계 (C)의 2차 핵산의 첫 번째 복사본과 단계 (D)의 2차 핵산의 두 번째 복사본을 처리하여, 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물과 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물이 포함되어 있는 교차 구조(cross-over structure)를 생성하는 단계, (F) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되고 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되도록 하는 조건 하에서 단계 (E)의 교차 구조를 중합효소로 처리하여, 단계 (A)의 2중가닥 핵산 주형의 두 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열(concatemer)을 생성하는 단계이며, 여기서 연쇄동일서열에는 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물과 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물이 포함되는 것인 단계.

일부 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형 또는 그와 유사한 서열의 둘 이상의 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열(concatemer)을 생성하는 방법이 제공되었으며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: (A) 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되고, 이것이 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 가닥으로 서냉결합하도록 하는 조건 하에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 들어 있는 1차 핵산을 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본과 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서 첫 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 두 개의 영역이 포함되어 있으며, 이 두 개의 영역에는 다음이 포함되고: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 주형 결합 영역은 폴리뉴클레오티드 주형으로 서냉결합되는 것인 단계, (B) 두 번째 프라이머의 연장 결과물이 합성되어 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물로 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 두 번째 프라이머와 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서 두 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 두 개의 영역이 포함되며, 두 영역은 다음과 같이 구성되고: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하고 첫 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하는 방식으로 서열들이 정렬될 경우, 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역은 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물로 서냉결합되고, 두 번째 프라이머의 연장 결과물에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드가 들어 있는 3' 말단 영역이 들어 있고, 3' 말단 영역에는 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계, (C) 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되어 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물로 서냉결합하도록 하는 조건 하에서 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물을 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본과 중합효소로 처리하여 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 들어 있는 두 번째 핵산의 첫 번째 복사본을 생성하는 단계이며, 여기서 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드가 들어 있는 3' 말단 영역이 포함되어 있고, 3' 말단 영역에는 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계, (D) 적어도 단계 (C)를 한 번 이상 추가로 반복하여 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 단계 (C)의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 들어 있는 두 번째 핵산의 두 번째 복사본을 생성하는 단계, (E) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역으로 서냉결합하도록 하는 조건 하에서 단계 (C)의 2차 핵산의 첫 번째 복사본과 단계 (D)의 2차 핵산의 두 번째 복사본을 처리하여, 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물과 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물이 포함되어 있는 교차 구조(cross-over structure)를 생성하는 단계, (F) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되고, 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되도록 하는 조건 하에서 단계 (E)의 교차 구조를 중합효소로 처리하여, 단계 (A)의 폴리뉴클레오티드 주형의 두 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열(concatemer)을 생성하는 단계이며, 여기서 연쇄동일서열에는 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물과 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물이 포함되는 것인 단계. 일부 구현에서, 단계 (A)의 핵산 중합효소는 DNA 중합효소입니다. 일부 구현에서, 단계 (A)의 핵산 중합효소는 역전사효소(reverse transcriptase)입니다.

일부 구현에서, 2중가닥 핵산 주형의 둘 이상의 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열을 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: (A) 반응 혼합물 준비, 여기서 반응 혼합물은 다음과 같이 구성됩니다: (i) 2중가닥 핵산 주형이 들어 있는 1차 핵산, (ii) 단리된 핵산 중합효소, (iii) 첫 번째 프라이머, 이 첫 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 두 개의 영역이 포함되어 있으며, 이 두 개의 영역에는 다음이 포함됩니다: (a) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (b) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션 (여기서 주형 결합 영역은 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 대해 상보적임), (iv) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 두 개의 영역이 포함되어 있는 두 번째 프라이머, 여기서 이 두 개의 영역은 다음과 같이 구성됩니다: (a) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (b) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션 (여기서, 주형 결합 영역은 핵산 주형의 두 번째 가닥에 대해 상보적이고, 여기에서 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하고 첫 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하는 방식으로 서열들이 정렬될 경우 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있음), 및 (B) 반응 혼합물을 열 순환 없이 적어도 3 분 동안 배양함.

일부 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형의 둘 이상의 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열을 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: (A) 반응 혼합물 준비, 반응 혼합물은 다음과 같이 구성됩니다: (i) 폴리뉴클레오티드 주형이 들어 있는 핵산, (ii) 단리된 핵산 중합효소, (iii) 첫 번째 프라이머, 이 첫 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 두 개의 영역이 포함되어 있으며, 이 두 개의 영역에는 다음이 포함됩니다: (a) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (b) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 여기서 주형 결합 영역은 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 상보적이고, (iv) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 두 개의 영역이 포함되어 있는 두 번째 프라이머, 여기서 이 두 개 영역은 다음과 같이 구성됩니다: (a) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (b) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 여기서 주형 결합 영역은 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 여기에서 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하고 첫 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하는 방식으로 프라이머의 서열들이 정렬된 경우, 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 및 (B) 반응 혼합물을 80 C 이하의 온도에서 적어도 3 분 동안 배양함.

일부 구현에서, 2중가닥 핵산 주형의 둘 이상의 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열을 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: 2중가닥 핵산 주형과 중합효소로 구성된 2중가닥 핵산 분자의 첫 번째 복사본과 두 번째 복사본을 함께 배양하는 것을 포함하며, 여기서 2중가닥 핵산 분자에는 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥이 포함되어 있고, 각각은 다수의 뉴클레오티드가 포함되어 있으며, 첫 번째 가닥에는 5' 말단 뉴클레오티드와 3' 말단 뉴클레오티드가 포함되어 있고 A1-B-A2의 5'에서 3' 방향으로 영역의 일반 형식이 포함되어 있으며, 두 번째 가닥에는 5' 말단 뉴클레오티드와 3' 말단 뉴클레오티드가 포함되어 있고 C1-D-C2의 5'에서 3' 방향으로 영역의 일반 형식이 포함되어 있으며, 영역 B에는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열이 포함되고, 영역 D에는 2중가닥 핵산 주형의 두 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열이 포함되고, 2중가닥 핵산 분자에서, 영역 A1은 C2로 서냉결합되고, B는 D로 서냉결합되고, A2는 C1으로 서냉결합되며, 2중가닥 핵산 분자의 첫 번째 복사본의 첫 번째 가닥과 2중가닥 핵산 분자의 두 번째 복사본의 두 번째 가닥이 들어 있는 교차 구조가 생성되고, 첫 번째 가닥의 A2 영역이 두 번째 가닥의 C2 영역으로 서냉결합되고, 교차 구조의 첫 번째 가닥의 연장 결과물이 합성되고 교차 구조의 두 번째 가닥의 연장 결과물이 합성되어, 교차 구조의 두 번째 가닥의 연장 결과물에 서냉결합된 교차 구조의 두 번째 가닥의 연장 결과물이 들어 있는 연쇄동일서열(concatemer)을 생성하며, 연쇄동일서열에는 2중가닥 핵산 주형의 두 복사본이 들어 있습니다.

구현에서, 뉴클레오티드 주형을 복사하는 방법이 제공되며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: 첫 번째 프라이머의 다수 복사본과 두 번째 프라이머의 다수 복사본으로 구성된 반응 혼합물에서 뉴클레오티드 주형을 배양하고, 여기에서, 첫 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있으며; 두 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 두 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적이고; 첫 번째 프라이머의 다수의 복사본과 두 번째 프라이머의 다수의 복사본과 함께 폴리뉴클레오티드 주형을 배양하면, 적어도 하나의 연쇄동일서열 가닥이 형성되고, 연쇄동일서열 가닥에는 5' 말단과 3' 말단이 포함되고, 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 여기에서, C'는 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, X는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타냅니다.

일부 구현에서, 연쇄동일서열(concatemer) 가닥의 형성이 관련된 방법이 제공되었으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있고, 연쇄동일서열 가닥은 첫 번째 연쇄동일서열 가닥이고, 두 번째 연쇄동일서열 가닥도 형성되고, 두 번째 연쇄동일서열 가닥에는 5' 말단과 3' 말단이 포함되어 있고, 5'에서 3' 방향으로 C-X'-T'-C-T'-C의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있고, 여기에서, C는 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T'은 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고, X'은 X의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타냅니다.

구현에서, 생체 시료에 들어 있는 표적 폴리뉴클레오티드 주형에 대한 분석 검사 방법이 제공되며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: A) 생체 시료 또는 그의 일부분을 첫 번째 프라이머의 다수 복사본과 두 번째 프라이머의 다수 복사본이 들어 있는 반응 혼합물에서 배양하고, 여기에서, 첫 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있으며; 두 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 두 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적이고; 첫 번째 프라이머의 다수의 복사본과 두 번째 프라이머의 다수의 복사본과 함께 폴리뉴클레오티드 주형을 배양하면, 적어도 하나의 연쇄동일서열 가닥이 형성되고, 연쇄동일서열 가닥에는 5' 말단과 3' 말단이 포함되고, 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 여기에서, C'는 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, X는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내고; 및 B) 단계 A)의 배양을 시작한 후에 하나 이상의 시점에서, 단계 A)의 반응 혼합물에서 증폭된 핵산의 양을 측정합니다. 구현에서, 반응 혼합물에서 증폭된 핵산의 양을 측정하는 것에는 반응 혼합물의 형광 수준을 결정하는 것이 포함될 수도 있습니다. 구현에서, 방법에는 반응 혼합물에서 핵산 증폭의 변곡 시간(inflection time)을 결정하는 것이 포함될 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, X에는 5'에서 3' 방향으로 [(C'-T)_N]의 일반 구조를 갖는 서열이 포함될 수 있고, 여기에서, C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, N은 0 ~ 2000 사이의 정수입니다. 구현에서, N은 0 ~ 10 사이, 0 ~ 100 사이, 0 ~ 1000 사이, 0 ~ 5000 사이, 0 ~ 10,000 사이, 1 ~ 10 사이, 1 ~ 100 사이, 1 ~ 1000 사이, 1 ~ 2000 사이, 1 ~ 5000 사이, 또는 1 ~ 10,000 사이 정수가 될 수 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, X에는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 50,000, 100,000 또는 500,000 개 이하의 뉴클레오티드가 포함될 수 있습니다. 구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, X에는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 50,000, 100,000 또는 500,000 개의 뉴클레오티드가 포함될 수 있습니다. 구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, X에는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 50,000, 100,000 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있거나 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 50,000, 100,000 또는 500,000 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있을 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 적어도 하나의 C'과 T 사이에 C' 또는 T 서열의 일부가 아닌 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드가 있습니다. 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드는, 예를 들어, 1 ~ 10 사이, 1 ~ 20 사이, 1 ~ 100 사이, 1 ~ 1000 사이 개수의 뉴클레오티드가 될 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 적어도 하나의 C' 또는 T 서열에는 하나 이상의 뉴클레오티드가 없을 수도 있습니다. 둘 이상의 뉴클레오티드가 누락된 경우, 누락된 뉴클레오티드는 연속적일 수도 있고 별도의 위치에 있을 수도 있습니다. 하나 이상의 누락된 뉴클레오티드는, 예를 들어, 1 ~ 10 사이, 1 ~ 20 사이, 1 ~ 100 사이, 1 ~ 1000 사이 개수의 뉴클레오티드가 될 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 적어도 하나의 C' 또는 T 서열에는 하나 이상의 점 돌연변이(point mutations)가 있을 수도 있습니다. 둘 이상의 점 돌연변이가 있을 경우, 점 돌연변이는 연속적일 수도 있고 별도의 위치에 있을 수도 있습니다. 하나 이상의 점 돌연변이는, 예를 들어, 1 ~ 10 사이, 1 ~ 20 사이, 1 ~ 100 사이, 1 ~ 1000 사이 개수의 점 돌연변이 일 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 뉴클레오티드 서열에는 다음 특성들 중 둘 또는 셋 모두를 가지고 있을 수도 있습니다: i) 적어도 하나의 C'과 T 사이에 C' 또는 T 서열의 일부가 아닌 하나 이상의 추가적인 뉴클레오티드가 있고; ii) 적어도 하나의 C' 또는 T 서열에는 하나 이상의 뉴클레오티드가 누락되었을 수도 있고; 및 iii) 적어도 하나의 C' 또는 T 서열에는 하나 이상의 점 돌연변이(point mutations)가 있을 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 폴리뉴클레오티드 주형이 RNA 분자인 구현에서, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 RNA 서열과 유사한 DNA 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타낼 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 연쇄동일서열 가닥에는 5'-최근접 위치 C' 서열의 5'에 하나 이상의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 하나 이상의 뉴클레오티드는, 예를 들어, 1 ~ 10 사이, 1 ~ 20 사이, 1 ~ 100 사이, 1 ~ 1000 사이 개수의 뉴클레오티드가 될 수도 있습니다.

구현에서, 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, 연쇄동일서열 가닥에는 3'-최근접 위치 C' 서열의 3'에 하나 이상의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 하나 이상의 뉴클레오티드는, 예를 들어, 1 ~ 10 사이, 1 ~ 20 사이, 1 ~ 100 사이, 1 ~ 1000 사이 개수의 뉴클레오티드가 될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 2중가닥 핵산 주형의 적어도 둘 이상의 복사본이 들어 있는 연쇄동일서열을 생성하는 방법이 제공되었으며, 이 방법은 다음과 같이 구성됩니다: 적어도 첫 번째 주형 분자와 두 번째 주형 분자를 반응 혼합물에서 배양하고, 여기에서, 첫 번째 주형 분자에는 첫 번째 핵산 가닥과 두 번째 핵산 가닥이 포함되어 있으며, 여기에서, 첫 번째 주형 분자의 첫 번째 핵산 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₁-H'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 여기에서, H'은 첫 번째 상동 서열(homology sequence)의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, Y₁은 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내며; 첫 번째 주형 분자의 두 번째 핵산 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H-Y₁'-S'-H의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 여기에서, H는 두 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 첫 번째 상동 서열과 두 번째 상동 서열은 서로 상보적이고, Y₁'은 Y₁의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고 , S'은 2중가닥 핵산 주형의 두 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 여기에서 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥은 서로 상보적이고; 두 번째 주형 분자에는 첫 번째 핵산 가닥과 두 번째 핵산 가닥이 포함되어 있고, 여기에서, 두 번째 주형 분자의 첫 번째 핵산 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₂-H'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 여기에서, H'은 첫 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, Y₂는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내며; 첫 번째 주형 분자의 두 번째 핵산 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H-Y₂'-S'-H의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 여기에서, H는 두 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, Y₂'은 Y₂의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S'은 2중가닥 핵산 주형의 두 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내며; 두 번째 주형 분자와 함께 첫 번째 주형 분자를 반응 혼합물에서 배양하면, 2중가닥 핵산 주형의 적어도 두 개의 복사본이 포함되어 있는 적어도 하나의 연쇄동일서열이 형성되고, 연쇄동일서열에는 첫 번째 연쇄동일서열 가닥과 두 번째 연쇄동일서열 가닥이 포함될 수 있고, 첫 번째 연쇄동일서열 가닥에는 5' 말단과 3' 말단이 포함되어 있고, 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₂-H'-S-Y₁-H'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있고, 여기에서, H', Y₁, S 및 Y₂ 각각은 상기한 바의 뉴클레오티드 서열을 나타내고; 두 번째 연쇄동일서열 가닥에는 5' 말단과 3' 말단이 포함되고, 5'에서 3' 방향으로 H-Y₁'-S'-H-Y₂'-S'-H의 일반 구조를 갖는 서열이 포함되고, 여기에서 H', Y₁, S 및 Y₂ 각각은 상기한 바의 뉴클레오티드 서열을 나타냅니다.

구현에서, 첫 번째 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₂-H'-S-Y₁-H'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, Y₁ 및 Y₂ 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 0 개의 뉴클레오티드를 나타낼 수도 있습니다.

구현에서, 첫 번째 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₂-H'-S-Y₁-H'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, Y₁은 5'에서 3' 방향으로 [(H'-S)_N1]의 일반 구조가 있는 서열을 포함하고 있으며, 여기에서, H'과 S는 상기된 것과 같은 뉴클레오티드 서열을 나타내고, N1은 0 ~ 2000 사이의 임의의 정수입니다.

구현에서, 첫 번째 연쇄동일서열 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 이 연쇄동일서열 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₂-H'-S-Y₁-H'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되며, Y₂는 5'에서 3' 방향으로 [(H'-S)_N2]의 일반 구조가 있는 서열을 포함하고 있으며, 여기에서, H'과 S는 상기된 것과 같은 뉴클레오티드 서열을 나타내고, N2는 0 ~ 2000 사이의 임의의 정수입니다.

구현에서, 첫 번째 주형 분자와 두 번째 주형 분자가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 첫 번째 주형 분자와 두 번째 주형 분자는 모두 2중가닥 DNA 분자입니다.

구현에서, 첫 번째 주형 분자의 첫 번째 핵산 가닥이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 여기에서, 첫 번째 핵산 가닥에는 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₁-H'의 일반 구조가 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있고, 여기에서, H'은 첫 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 첫 번째 상동 서열에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있을 수도 있습니다. 구현에서, 첫 번째 상동 서열에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 뉴클레오티드가 들어 있을 수도 있습니다. 구현에서, 첫 번째 상동 서열에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 뉴클레오티드 및 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 200 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있을 수도 있습니다.

구현에서, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 핵산 중합효소가 포함될 수도 있습니다. 구현에서, 핵산 중합효소는 가닥 치환 활성(strand-displacement activity)이 있는 DNA 중합효소입니다. 구현에서, 핵산 중합효소는 RNA 중합효소입니다. 구현에서, 핵산 중합효소는 역전사효소(reverse transcriptase)입니다. 구현에서, 반응 화합물, 용기 또는 키트에는 가닥 치환 활성(strand displacement activity)이 있는 DNA 중합효소와 역전사효소 같은 둘 이상 종류의 핵산 중합효소가 포함되어 있습니다. 구현에서, 반응 혼합물, 용기, 또는 키트가 제공되어 있으며, 뉴클레오티드와 완충제가 포함됩니다.

구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 폴리뉴클레오티드 주형은 단일 가닥 분자입니다. 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 폴리뉴클레오티드 주형에는 2중가닥 핵산 주형의 가닥 한 개만 포함되어 있습니다. 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 폴리뉴클레오티드 주형은 DNA 또는 RNA 분자입니다.

구현에서, 핵산 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 본 문서에 제공되어 있으며, 핵산 주형은 DNA 또는 RNA 분자입니다. 구현에서, 핵산 주형은 단일 가닥 분자 또는 2중가닥 분자가 될 수도 있습니다.

구현에서, 반응 혼합물 배양과 관련하여 제공된 방법에서, 반응 혼합물 배양 동안, 반응 혼합물의 온도는 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 37, 35, 30, 25 또는 20 C를 넘을 수 없습니다. 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 방법의 모든 단계는 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 37, 35, 30, 25 또는 20 C 이하의 온도에서 수행됩니다. 구현에서, 본 문서에 제공된 반응 혼합물, 용기 또는 키트는 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 37, 35, 30, 25 또는 20 C 이하의 온도에서 유지됩니다. 구현에서, 본 문서에 제공된 방법은 열 순환(thermocycling) 없이 수행됩니다.

구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 폴리뉴클레오티드 주형에는 첫 번째 부분이 들어 있고, 첫 번째 부분에는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 200 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 폴리뉴클레오티드 주형에는 첫 번째 부분이 들어 있고, 첫 번째 부분에는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 200 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 폴리뉴클레오티드 주형에는 첫 번째 부분이 들어 있고, 첫 번째 부분에는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 200 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다.

구현에서, 첫 번째 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 첫 번째 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 구현에서, 첫 번째 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 첫 번째 영역에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 구현에서, 첫 번째 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 첫 번째 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 첫 번째 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 첫 번째 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머 모두에는 상기된 특성들을 갖고 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 첫 번째 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 첫 번째 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역과 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역에는 같은 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 첫 번째 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 첫 번째 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역과 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역에는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다.

구현에서, 두 번째 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 구현에서, 두 번째 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 영역에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 구현에서, 두 번째 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 두 번째 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 두 번째 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머 모두에는 상기된 특성들을 갖고 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 두 번째 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 두 번째 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역과 두 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 같은 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 두 번째 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 두 번째 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역과 두 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다.

구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 두 번째 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머와 두 번째 영역이 들어 있는 폴리뉴클레오티드 주형이 관련되어 있고,

두 번째 프라이머의 두 번째 영역의 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분의 뉴클레오티드 서열과 동일합니다.

구현에서, 꼬리 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 꼬리 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 구현에서, 꼬리 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 꼬리 영역에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 구현에서, 꼬리 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 꼬리 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 꼬리 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 꼬리 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머 모두에는 상기된 특성들을 갖고 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 꼬리 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 꼬리 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역과 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 같은 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 꼬리 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 꼬리 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역과 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다.

구현에서, 주형 결합 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 뉴클레오티드가 들어 있습니다.[TK1] 구현에서, 주형 결합 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 주형 결합 영역에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 구현에서, 주형 결합 영역이 들어 있는 프라이머가 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 주형 결합 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 주형 결합 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 주형 결합 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머 모두에는 상기된 특성들을 갖고 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 주형 결합 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 주형 결합 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역과 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역에는 같은 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 주형 결합 영역이 들어 있는 첫 번째 프라이머와 주형 결합 영역이 들어 있는 두 번째 프라이머가 관련되어 있고, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역과 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역에는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다.

구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 폴리뉴클레오티드 주형에는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 또는 5000 개의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 폴리뉴클레오티드 주형에는 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10,000 개 이하의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 폴리뉴클레오티드 주형에는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, or 5000 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10,000 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있을 수 있습니다.

구현에서, 2중가닥 핵산 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 2중가닥 핵산 주형의 각 가닥에는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000 또는 5000 개의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, 2중가닥 핵산 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 2중가닥 핵산 주형의 각 가닥에는 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10,000 개 이상의 뉴클레오티드가 들어 있을 수도 있습니다. 구현에서, 2중가닥 핵산 주형이 관련된 방법, 반응 혼합물, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 2중가닥 핵산 주형의 각 가닥에는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 또는 5000 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있고, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10,000 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있을 수 있습니다.

구현에서, 반응 혼합물, 용기, 또는 키트가 제공되어 있으며, 여기에는 재조합효소(recombinase enzyme)가 들어 있지 않습니다.

구현에서, 본 문서에 제공된 방법, 반응 화합물, 용기 또는 키트에는 프라이머의 다수 복사본이 들어 있거나 관련되어 있을 수 있습니다. 다수의 복사본은, 예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 개의 프라이머 복사본이 될 수도 있습니다.

구현에서, 본 문서에 제공된 반응 혼합물 또는 용기에는 피험자로부터 확보한 생체 시료의 적어도 일부분이 포함될 수 있습니다. 생체 시료는, 예를 들어, 타액, 혈액, 소변, 볼 면봉 또는 코 면봉이 될 수도 있습니다. 피험자는 인간이 될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 모든 단계들은 70, 65, 60, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10 C 이하의 온도에서 수행됩니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 일부 단계들은 70, 65, 60, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10 C 이하의 온도에서 수행됩니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 둘 이상의 단계는 동일한 반응 혼합물 속에서 동시에 수행됩니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 모든 단계는 동일한 반응 혼합물 속에서 동시에 수행됩니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 핵산 주형은 방법을 시작한 이후로 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 또는 180 분 내에, 적어도 10, 100, 1000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 배로 증폭됩니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 반응 혼합물 속에 있는 핵산 주형의 복사본 개수는 방법을 시작한 이후로 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120 또는 180 분 내에 적어도 10, 100, 1000, 10,000, 100,000 또는 1,000,000 배로 증폭됩니다.

구현에서, 본 문서에 제공된 핵산 주형은 단일 가닥(single-stranded) 핵산 주형이거나 2중가닥 핵산 주형(double-stranded nucleic acid template)이 될 수도 있습니다.

구현에서, 용기 내에서 유체 소통하는 하기를 포함하는 용기가 제공되며: 첫 번째 프라이머가 있으며, 첫 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있으며; 두 번째 프라이머가 있고, 두 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 두 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적이고; 및 적어도 하나의 연쇄동일서열 가닥이 있고, 연쇄동일서열 가닥에는 5' 말단과 3' 말단이 포함되고, 5'에서 3'으로 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있으며, 여기에서, C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, X는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타냅니다.

일부 구현에서, 용기 내에서 유체 소통하는 하기를 포함하는 용기가 제공됩니다: (A) 단리된 핵산 중합효소, (B) 적어도 첫 번째 가닥이 들어 있는 핵산 주형, (C) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 다음과 같은 두 영역이 포함되어 있는 첫 번째 프라이머: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션 (여기서 주형 결합 영역은 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 대해 상보적임), 및 (D) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 다음과 같은 두 개의 영역이 포함되어 있는 두 번째 프라이머: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션 (여기에서, 주형 결합 영역은 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 대해 상보적인 뉴클리오티드 서열에 대해 상보적이고, 여기에서 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하고 첫 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하는 방식으로 프라이머의 서열들이 정렬될 경우 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있음).

구현에서, 유체상으로 단리되어 있는 두 개 이상의 용기가 들어 있는 키트가 제공되며, 이 용기들은 종합적으로 다음과 같이 구성되어 있습니다: 첫 번째 프라이머가 있으며, 첫 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있으며; 두 번째 프라이머가 있고, 두 번째 프라이머에는 첫 번째 영역과 두 번째 영역이 들어 있고, 두 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적이고; 및 가닥 치환 활성(strand-displacement activity)이 있는 단리된 DNA 중합효소가 있고; 여기에서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역과 두 번째 프라이머의 두 번째 영역은 상보적입니다.

일부 구현에서, 첫 번째 가닥이 포함되어 있는 관심 표적 핵산을 검출하기 위한 키트가 제공되며, 이 키트에는 유체적으로 단리된 둘 이상의 용기가 들어 있고, 이 용기들은 종합적으로 다음과 같이 구성되어 있습니다: (A) 단리된 핵산 중합효소, (B) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 다음과 같은 두 영역이 포함되어 있는 첫 번째 프라이머: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션 (여기서, 주형 결합 영역은 표적 핵산의 첫 번째 가닥에 대해 상보적임), 및 (C) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 다음과 같은 두 개의 영역이 포함되어 있는 두 번째 프라이머: (i) 다음이 포함되는 꼬리 영역: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 및 (ii) 다음이 포함되는 주형 결합 영역: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션 (여기에서, 주형 결합 영역은 표적 핵산의 첫 번째 가닥에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 여기에서 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하고 첫 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하는 방식으로 프라이머의 서열들이 정렬될 경우 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있음).

일부 구현에서, 핵산이 들어 있는 키트가 제공되고, 이 핵산에는 관심 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열이 들어 있습니다.

일부 구현에서, 반응 혼합물, 용기, 또는 키트가 제공되어 있으며, 핵산 염료가 포함되어 있습니다.

일부 구현에서, 단리된 핵산 중합효소가 들어 있는 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 단리된 핵산 중합효소는 DNA 중합효소입니다. 일부 구현에서, 단리된 핵산 중합효소가 들어 있는 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 단리된 핵산 중합효소는 역전사효소(reverse transcriptase)입니다. 일부 구현에서, 단리된 핵산 중합효소가 들어 있는 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 용기 또는 키트에는 DNA 중합효소와 역전사효소(reverse transcriptase) 모두가 포함되어 있습니다.

일부 구현에서, 핵산 중합효소가 들어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되어 있으며, 핵산 중합효소에는 가닥 치환 활성(strand displacement activity)이 있습니다.

일부 구현에서, 방법이 제공되었으며, 이 방법에는 하나 이상의 반응 성분을 처리하거나 핵산 염료를 처리하는 단계가 포함되어 있습니다.

일부 구현에서, 핵산 주형이 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 핵산 주형은 DNA 분자입니다. 일부 구현에서, 핵산 주형이 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 핵산 주형은 RNA 분자입니다.

일부 구현에서, 첫 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 60 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다.

일부 구현에서, 두 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 일부 구현에서, 두 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 60 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다.

일부 구현에서, 첫 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 60 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다.

일부 구현에서, 두 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역에는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다. 일부 구현에서, 두 번째 프라이머가 포함되어 있는 방법, 용기 또는 키트가 제공되었으며, 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역에는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 60 개 이하의 뉴클레오티드가 포함되어 있습니다.

일부 구현에서, 방법과 구성물이 제공되었으며, 여기에서, RNA 분자는 주형 분자 또는 1차 핵산(primary nucleic acid)이고, 주형 증폭(amplification of the template)은 RNA 분자에 대응하는 DNA 가닥의 복사본 생성을 뜻할 수도 있습니다.

일부 구현에서, 분석 검사에서 형광 신호를 측정하는 방법이 제공되어 있습니다.

일부 구현에서, 핵산 라이게이스(nucleic acid ligase)가 포함된 방법 또는 구성물이 제공될 수 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 핵산 라이게이스가 반응에 포함되지 않을 때와 비교하여, 라이게이스(ligase, 결합효소)가 반응 혼합물에 들어 있을 때, 핵산 주형을 더 신속하게 증폭할 수 있습니다. 구현에서, 반응 혼합물, 용기, 또는 키트가 제공되어 있으며, 라이게이스 활동(ligase activity)이 있는 효소가 포함될 수도 있습니다.

구현에서, 시료에 들어 있는 병원체를 분석 검사하기 위한 방법이 제공되었으며, 병원체의 핵산을 증폭하기 위해 이 방법을 수행할 수 있습니다. 구현에서, 합성물 또는 방법에 사용하는 표적 핵산이 제공되었으며, 표적 핵산은 병원체의 핵산이 될 수도 있습니다. 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서 첫 번째와 두 번째 프라이머가 사용되고, 각각에는 병원체 핵산의 서열에 상보적인 영역 또는 병원체 핵산의 서열에 대해 상보적인 서열에 상보적인 영역이 포함될 수도 있습니다. 구현에서, 병원체 핵산은 DNA 또는 RNA가 될 수도 있습니다. 병원체에는, 제한 없이, 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 원생생물(protists)이 포함될 수도 있습니다. 시료는 피험자로부터 확보할 수도 있고, 시료에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 시료의 특성이 들어 있을 수도 있습니다.

구현에서, 핵산 증폭을 위한 방법이 제공되었으며, 이 방법을 인간 또는 동물의 신체에 대해 외부적으로 진단하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 인간 또는 동물로부터 시료를 확보하고, 본 문서에 제공된 핵산 증폭 방법을 사용하여 관심 표적 핵산에 대해 시료를 분석 검사할 수 있습니다.

구현에서, 다음과 같은 방법이 제공되었습니다: a) 반응 혼합물 속에서 본 문서에 제공된 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약이 제공되었으며(예를 들어, 하나 이상의 첫 번째 프라이머, 두 번째 프라이머, 핵산 주형, 핵산 중합효소, 뉴클레오티드, 완충제, 물, 등등), 및 b) 거의 등온 온도에서 반응 혼합물을 배양하고, 여기에서, 배양하는 동안 반응 혼합물의 온도는 중심 온도에서 섭씨 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 도 이상으로 변하지 않습니다. 구현에서, 중심 온도는, 예를 들어, 섭씨 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80 도가 될 수도 있습니다.

구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 거의 등온 온도로 작업을 수행합니다. 구현에서, 거의 등온 온도(substantially isothermal temperature)는 섭씨 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80 도, 플러스 또는 마이너스 섭씨 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 도가 될 수 있습니다.

구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 하나 이상의 온도를 사용하거나 또는 전혀 사용하지 않거나 또는 섭씨 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30 또는 25 도를 초과할 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 구성물 및 방법에서, 첫 번째 프라이머에는 첫 번째 영역이 포함되고 두 번째 프라이머에는 첫 번째 영역이 포함되며, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역에 대해 상보적이고, 구현에서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역과 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역에는 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, Watson-Crick 염기 짝짓기 법칙(base pairing rules)에 따라 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역을 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역으로 서냉결합하여 형성할 수 있는 2중가닥 구조가 제한 효소 인식 서열(restriction enzyme recognition sequence)을 형성하지 않도록 합니다.

핵산 중합효소와 관련하여 제공된 구성물 및 방법에서, 구현에서, 핵산 중합효소에는 3'에서 5' 엑소뉴클레아제(exonuclease, 핵산말단분해효소) 활동이 있습니다.

폴리뉴클레오티드 주형 또는 핵산 주형의 복사본 생성 또는 증폭에 대한 참조(또는 언급)에는 폴리뉴클레오티드 주형 / 핵산 주형의 서열이 들어 있는 복사본의 생성이 포함되고, 문맥상 별도로 명시하지 않는 한, 폴리뉴클레오티드 주형 / 핵산 주형의 유사 서열이 들어 있는 복사본의 생성도 포함됩니다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 주형이 RNA일 경우, 주형 복사본의 생성에는 폴리뉴클레오티드 주형의 RNA 서열의 DNA 버전이 포함된 DNA 분자의 복사본 생성도 포함될 수 있습니다(즉, DNA 서열에서 U 대신에 T가 포함됨).

도면에서,
도 1은 본 문서에 제공된 방법의 일반 도식입니다; 도 1a-1k는 이 방법의 단계 또는 특징물이 설명되어 있습니다. 도 1에는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있습니다: 103: AACGGTTGCTC (서열 ID 번호: 1); 104: GAGCAACCGTT (서열 ID 번호: 2); 105: ATGGGAGC (서열 ID 번호: 3); 106: CCATAACG (서열 ID 번호: 4); 111: ATGGGAGCAACCGTT (서열 ID 번호: 5); 112: CCATAACGGTTGCTCCCAT (서열 ID 번호: 6); 113: ATGGGAGCAACCGTTATGG (서열 ID 번호: 7); 121: CCATAACGGTTGCTCCCATAACGGTTGCTCCCAT (서열 ID 번호: 8); 122: ATGGGAGCAACCGTTATGGGAGCAACCGTTATGG (서열 ID 번호: 9).
도 2a에는 본 문서에 제공된 방법에서 사용하는, 특정 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 표시되어 있습니다. 도 2a에는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있습니다: CGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 10); P1 프라이머, 35 개의 뉴클레오티드: CCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 11); P1 프라이머, 33 개의 뉴클레오티드: GGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 12); P1 프라이머, 31 개의 뉴클레오티드: ATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 13); P1 프라이머, 30 개의 뉴클레오티드: TGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 14); P1 프라이머, 29 개의 뉴클레오티드: GGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 15); P1 프라이머, 28 개의 뉴클레오티드: GCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 16); P1 프라이머, 27 개의 뉴클레오티드: CTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 17); P1 프라이머, 26 개의 뉴클레오티드: TCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 18); P1 프라이머, 25 개의 뉴클레오티드: CTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 19); P1 프라이머, 24 개의 뉴클레오티드: TTGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호); P1 프라이머, 23 개의 뉴클레오티드: TGGGAAACCAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 21); P2 프라이머, 36 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGCCATCCGGCGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 22); P2 프라이머, 34 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGCCATCCGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 23); P2 프라이머, 32 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGCCATCCATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 24); P2 프라이머, 30 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGCCATATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 25); P2 프라이머, 29 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGCCAATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 26); P2 프라이머, 28 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGCCATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 27); P2 프라이머, 27 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGCATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 28); P2 프라이머, 26 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 29); P2 프라이머, 25 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGAATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 30); P2 프라이머, 24 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 31); P2 프라이머, 23 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAAATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 32); 및 P2 프라이머, 22 개의 뉴클레오티드: GTTTCCCAATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 33).
도 2b에는 본 문서에 제공된 방법에 따라 수행한 반응의 결과가 그래프로 표시되어 있습니다.
도 3a와 3b에는 본 문서에 제공된 방법에서 사용하는, 특정 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 표시되어 있습니다. 도 3a에는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있습니다: C5: ATGGCTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 34); D5: GTTTCCCAAGAGCCATGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 35); C6: GGCTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 36); D6: GTTTCCCAAGAGCCGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 37); C7: CTCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 38); D7: GTTTCCCAAGAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 39); C8: TCTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 40); D8: GTTTCCCAAGAGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 41); C9: CTTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 42); D9: GTTTCCCAAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 43); C10: TTGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 44); D10: GTTTCCCAAGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 45); C11: TGGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 46); D11: GTTTCCCAGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 47); C12: GGGAAACTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 48); 및 D12: GTTTCCCGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 49). 도 3a에는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있습니다: A1: ATGGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 50); B1: GTTTCCCAAGAGCCATACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 51); A2: GGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 52); B2: GTTTCCCAAGAGCCACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 53); A3: CTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 54); B3: GTTTCCCAAGAGACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 55); A4: TCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 56); B4: GTTTCCCAAGAACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 57); A5: CTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 58); B5: GTTTCCCAAGACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 59); A6: TTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 60); B6: GTTTCCCAAACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 61); A7: TGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 62); B7: GTTTCCCAACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 63); A8: GGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 64); 및 B8: GTTTCCCACAGGGATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 65).
도 3c 및 3d에는 본 문서에 제공된 방법에 따라 수행한 반응의 결과가 그래프로 표시되어 있습니다.
도 4에는 본 문서에 제공된 방법에 따라 수행한 반응의 결과가 그래프로 표시되어 있습니다.
도 5에는 본 문서에 제공된 방법에 따라 수행한 반응의 결과가 그래프로 표시되어 있습니다.
도 6에는 본 문서에 제공된 방법에 따라 수행한 반응의 결과가 그래프로 표시되어 있습니다.
도 7에는 본 문서에 제공된 방법에 따라 수행한 반응에서 생성된 결과물의 뉴클레오티드 서열을 설명하는 서열 정렬(sequence alignment)이 표시되어 있습니다. 도 7에는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열이 포함되어 있습니다(정렬의 상단 서열에서 정렬의 하단 서열 순서로): 서열 ID 번호: 66: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGA; 서열 ID 번호: 67: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 68: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 69: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 70: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACTGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 71: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 72: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 73: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 74: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 75: TCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAATTCTTGAGAGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 76: GAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTACAGAAGGGGAAGACCAAATGAACCCACTAACAGTAGAAGTACCATACATTT; 서열 ID 번호: 77: TCTTGAGAGAACCCACTAACTCTTGAGAGAACCCACTAAC; 및 서열 ID 번호: 78: GGAAGACCAAATTCTTGAGA.
본 문서에 들어 있는 도면 및 요소는 모양과 크기(척도)가 일치하지 않을 수도 있습니다. 예를 들어, 도면에 들어 있는 요소의 모양 또는 크기는 쉽고 분명하게 발표하기 위해 간략화 하거나 또는 수정될 수도 있습니다. 본 문서에 들어 있는 도면과 요소는 설명하기 위한 용도이며 어떤 방식으로도 제한적이지 않음을 인지해야 합니다.

상세 설명

본 발명에는 다양한 변경과 대체 형태가 포함되지만, 도면에 표시된 특정 구현은 예를 제공하기 위한 용도이며, 본 문서에 자세하게 설명되어 있습니다. 본 발명을 본 문서에 공개된 특정 형태로 제한하려는 의도는 없으며, 이와는 반대로, 본 발명은 청구항에 정의된 것처럼, 본 발명의 정신과 범위 내의 모든 변경, 등가물 및 대체물에 대해서도 적용됨을 인지해야 합니다.

일부 구현에서, 본 문서에는 핵산 증폭과 연쇄동일서열(concatemer)의 생성에 대한 방법과 구성물이 제공되어 있습니다.

본 문서에 제공된 방법에서, 핵산 연쇄동일서열의 생성은 또한 연쇄동일서열에 들어 있는 핵산 주형 / 특정 핵산의 복사본 개수를 증폭합니다. 따라서, 연쇄동일서열의 생성에 대한 방법 및 구성물에 대한 참조는 핵산 증폭에도 적용됩니다.

본 문서에 사용된 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 둘 이상의 뉴클레오티드가 들어 있는 고분자 사슬(또는 중합체 사슬, polymeric chain)을 뜻합니다. "폴리뉴클레오티드(polynucleotides)"에는 프라이머(primers), 올리고뉴클레오티드, 핵산 가닥 등이 포함되어 있습니다. 폴리뉴클레오티드에는 표준 또는 비표준 뉴클레오티드가 포함될 수도 있습니다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드에는 한 말단(5' terminus)에 5' 인산염이 들어 있고 사슬의 다른 말단(3' terminus)에 3' 하이드록실기(3' hydroxyl group)가 들어 있습니다. 폴리뉴클레오티드에서 가장 끝단에 있는 5' 뉴클레오티드를 해당 뉴클레오티드의 "5' 말단 뉴클레오티드"라고 부릅니다. 폴리뉴클레오티드에서 가장 끝단에 있는 3' 뉴클레오티드를 해당 뉴클레오티드의 "3' 말단 뉴클레오티드"라고 부릅니다.

5' 말단 뉴클레오티드와 3' 말단 뉴클레오티드가 들어 있는 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 사용된 용어 "하류(downstream)"는 폴리뉴클레오티드에 들어 있는 기준 위치 보다 3' 말단 뉴클레오티드에 더 가까운 폴리뉴클레오티드에서의 위치를 뜻합니다. 예를 들어, 5' ATAAGC 3' 서열을 갖고 있는 프라이머에서 "G"는 "T"의 하류(downstream)이고 모든 "A"의 하류(downstream)입니다.

5' 말단 뉴클레오티드와 3' 말단 뉴클레오티드가 들어 있는 폴리뉴클레오티드의 문맥에서 사용된 용어 "상류(upstream)"는 폴리뉴클레오티드에 들어 있는 기준 위치 보다 5' 말단 뉴클레오티드에 더 가까운 폴리뉴클레오티드에서의 위치를 뜻합니다. 예를 들어, 5' ATAAGC 3' 서열의 프라이머에서, "T"는 "G" 및 "C"의 상류이고, "G"에 가장 가까운 두 개의 "A"의 상류입니다.

본 문서에 사용된 "핵산(nucleic acid)"에는 DNA와 RNA가 모두 포함되며, DNA와 RNA에는 비표준 뉴클레오티드가 포함됩니다. "핵산"에는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드("핵산 가닥")가 들어 있습니다. "핵산"은 단일 가닥 또는 2중가닥이 될 수도 있습니다.

본 문서에서 사용된 "연쇄동일서열(concatemer)"은 둘 이상의 특정 핵산이 내부에 들어 있고 이런 복사본들이 연속으로 연결되어 있는 핵산 분자를 뜻합니다. 연쇄동일서열 내에서, 특정 핵산의 복사본들은 서로 직접 연결되어 있거나 또는 간접적으로 연결되어 있을 수도 있습니다(예를 들어, 특정 핵산의 복사본들 사이에 뉴클레오티드가 있을 수도 있음). 한 예에서, 특정 핵산은 2중가닥 핵산 주형의 연쇄동일서열일 수도 있고, 이런 연쇄동일서열에는 2중가닥 핵산 주형의 둘 이상의 복사본이 들어 있을 수도 있습니다. 다른 한 예에서, 특정 핵산은 2중가닥 폴리뉴클레오티드 주형의 연쇄동일서열일 수도 있고, 이런 연쇄동일서열에는 폴리뉴클레오티드 주형의 둘 이상의 복사본이 들어 있을 수도 있습니다.

본 문서에 사용된 "표적" 핵산 또는 분자는 관심 핵산을 뜻합니다. 표적 핵산 / 분자는 단일 가닥 또는 2중가닥 DNA 또는 RNA(예, mRNA)를 포함하여 임의의 종류가 될 수도 있습니다.

본 문서에 사용된 "상보(complementary)" 서열은 두 개의 뉴클레오티드 서열로, 서로 역평행하게(anti-parallel) 정렬했을 때, 표준 염기 짝짓기 규칙(예, A-T, G-C 또는 A-U)에 따라 서로 짝지을 수 있는 다수의 개별 뉴클레오티드 염기가 포함되어 있으며, 이런 분자에는 서로 특정적으로 서냉결합될 수 있는 서열이 들어 있습니다. 두 서열에 들어 있는 모든 뉴클레오티드 염기가 서로 짝짓기 할 수 없어도, "상보적(complementary)"인 서열이 될 수도 있습니다. 예를 들어, 서열들이 상보 형성(complementation)을 위해 최적으로 정렬되었을 때, 두 서열에 들어 있는 뉴클레오티드 염기의 적어도 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%만 서로 짝을 지을 수 있을 경우에도, 서열들은 상보적(complementary)이라고 여겨집니다. 게다가, 두 서열의 총 길이가 서로 상당히 다를 때에도, 서열들은 "상보적"인 것으로 여겨집니다. 예를 들어, 프라이머가 더 긴 폴리뉴클레오티드의 특정 영역에 대해 역평행(anti-parallel)하게 정렬되었을 때, 프라이머의 다수 개별 뉴클레오티드 염기들이 더 긴 폴리뉴클레오티드에 들어 있는 뉴클레오티드 염기들과 짝을 지을 수 있을 경우, 15 개의 뉴클레오티드가 들어 있는 프라이머는 수백개의 뉴클레오티드가 들어 있는 더 긴 폴리뉴클레오티드에 대해 "상보적(complementary)"이라고 여겨집니다. 또한, "상보적인" 서열들에는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사물 또는 핵염기 유사물(nucleobase analogs)이 들어 있을 수 있습니다.

본 문서에 사용된 용어 "단리된(isolated)"을 단백질, 핵산, 기타 생체분자에 대해 적용할 때, 용어 "단리된"은 자연 발생적인 환경의 성분에서 정제되었거나(purified) 분리된(separated) 분자를 뜻합니다(예를 들어, 단백질은 단백질이 자연적으로 생성된 세포에서 정제됩니다). "단리된(isolated)" 분자는 다른 분자와 접촉할 수도 있습니다(예를 들어, 반응 혼합물의 일부로). 본 문서에 사용된 "단리된" 분자에는 재조합 생성된 단백질 또는 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 있는 핵산이 포함될 수도 있습니다. "단리된" 핵산에는 세포에 들어 있는 폴리펩티드 부호화 핵산이 포함되어 있고, 세포들은, 예를 들어, 핵산 분자가 자연 세포의 염색체 위치와는 다른 위치에 있을 때 일반적으로 폴리펩티드를 발현합니다(express). 일부 구현에서, 쿠마시(Coomassie) 블루, 실버 또는 기타 단백질 염색 방법으로 처리한 후에 폴리펩티드의 SDS-PAGE 증거를 통해, "단리된" 폴리펩티드들은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 균질성까지 정제할 수 있습니다.

본 분서에 사용된 것처럼, 주형 "서열" 또는 기타 핵산이 들어 있는 것으로 설명된 핵산 분자에는, 문맥상 별도로 명시하지 않는 한, 주형 또는 기타 핵산 자체가 들어 있는 것으로 간주할 수도 있습니다(예를 들어, 주형 서열이 들어 있다고 설명된 분자에는 주형이 들어 있다고 설명될 수도 있습니다).

본 문서에 사용된 것처럼, 첫 번째 폴리뉴클레오티드가 두 번째 폴리뉴클레오티드에 "서냉결합되었다(annealed)", "서냉결합하는(annealing)" 또는 등등으로 설명될 때, 첫 번째 폴리뉴클레오티드 전체 또는 일부가 두 번째 폴리뉴클레오티드에 서냉결합(anneal)될 수 있고 그 반대도 가능합니다.

본 문서에 사용된 것처럼, 특정 물체를 특정 상태 또는 다른 물체로 또는 유사한 것으로 "처리한다(treating)"는 말은 해당 물체를 기술된 상태 또는 다른 물체로 직접 또는 간접적으로 노출하는 것을 뜻합니다. 그러므로, "처리(treating)" 단계에는 분명한 관련된 작업(예를 들어, 효소를 용기에 추가하거나, 용기를 흔들거나 등)이 관련될 수 있다는 것을 뜻하며, 모든 "처리" 단계에 분명한 관련 작업이 관련될 필요는 없습니다. 예를 들어, 하나 이상의 시약이 관련된 반응을 용기 내에서 설정할 수도 있고, 일단 해당 반응이 시작되면, 용기의 내용물에 대해 인간 또는 기계적 간섭 없이 다수의 사건 또는 단계가 발생할 수도 있습니다. 반응이 시작된 후에 용기의 내용물을 분리하는 작업이 없더라도, 용기 속에서 다수의 사건 또는 단계의 하나 또는 그 이상을 용기 속에서 물체를 "처리한다"라고 설명합니다.

본 문서에 제공된 방법 및 구성물의 구현은 도 1을 참조하면서 설명할 수 있습니다. 1차 핵산 101이 제공되었습니다(도 1a). 1차 핵산 101에는 핵산 주형 102의 서열이 포함되어 있을 수 있습니다. 핵산 주형 102는 첫 번째 가닥 103과 두 번째 가닥 104가 들어 있는 2중가닥 핵산일 수도 있습니다. 도 1에서, 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥 102에는 AACGGTTGCTC (서열 ID 번호: 1)의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 있습니다. 첫 번째 가닥 103에는 5' 말단 뉴클레오티드 (5'-most A) 및 3' 말단 뉴클레오티드 (3'-most C)가 들어 있습니다. 두 번째 가닥 104에는 GAGCAACCGTT (서열 ID 번호: 2)의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있습니다. 두 번째 가닥 104에는 5' 말단 뉴클레오티드 (5'-most G) 및 3' 말단 뉴클레오티드 (3'-most T)가 들어 있습니다.

첫 번째 프라이머 105와 두 번째 프라이머 106도 제공될 수 있습니다(도 1b). 도 1에서, 첫 번째 프라이머 105에는 ATGGGAGC (서열 ID 번호: 3)의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 있습니다. 첫 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드 (5'-most A) 및 3' 말단 뉴클레오티드 (3'-most C)가 들어 있습니다. 두 번째 프라이머 106에는 CCATAACG (서열 ID 번호: 4)의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있습니다. 두 번째 프라이머에는 5' 말단 뉴클레오티드 (5'-most C) 및 3' 말단 뉴클레오티드 (3'-most G)가 들어 있습니다. 도 1의 핵산 주형 102의 뉴클레오티드 길이가 11 (개)이고 대표적인 뉴클레오티드 서열을 갖고 있지만, 이것은 예를 들이 위한 것(exemplary)이며 제한적인 것으로 여기면 안 됩니다.

첫 번째 프라이머 105에는 두 개의 영역이 포함될 수 있습니다: i) 꼬리 영역 및 ii) 주형 결합 영역("주형" 영역). 첫 번째 프라이머 105의 꼬리 영역에는 다음과 같은 3 개의 성분이 포함될 수 있으며: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 하나 이상의 뉴클레오티드로 구성됩니다. 도 1에서, 첫 번째 프라이머 105의 꼬리 영역에는 ATGG의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 있고, 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 A이고, 중간 섹션은 중간 TG이고, 가장 안쪽 뉴클레오티드는 3'-most G입니다. 첫 번째 프라이머 105의 주형 결합 영역에는 다음과 같은 3 개의 성분이 포함될 수 있으며: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 하나 이상의 뉴클레오티드로 구성됩니다. 도 1에서, 첫 번째 프라이머 105의 주형 결합 영역에는 GAGC의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 있고, 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드는 C이고, 중간 섹션은 중간 AG이고, 가장 안쪽 뉴클레오티드는 5'-most G입니다.

두 번째 프라이머 106에는 두 개의 영역이 포함될 수 있습니다: i) 꼬리 영역 및 ii) 주형 결합 영역. 첫 번째 프라이머 106의 꼬리 영역에는 다음과 같은 3 개의 성분이 포함될 수 있으며: (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드, (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)의 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 하나 이상의 뉴클레오티드로 구성됩니다. 도 1에서, 두 번째 프라이머 106의 꼬리 영역에는 CCAT의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 있고, 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 C이고, 중간 섹션은 중간 CA이고, 가장 안쪽 뉴클레오티드는 T입니다. 두 번째 프라이머 106의 주형 결합 영역에는 다음과 같은 3 개의 성분이 포함될 수 있으며: (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드, (b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드(innermost nucleotide), (c) 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 섹션, 하나 이상의 뉴클레오티드로 구성됩니다. 도 1에서, 두 번째 프라이머 106의 주형 결합 영역에는 AACG의 5'에서 3' 방향으로 대표적인 뉴클레오티드 서열이 있고, 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드는 G이고, 중간 섹션은 중간 AC이고, 가장 안쪽 뉴클레오티드는 5'-most A입니다.

일부 구현에서, 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있을 수 있고, 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하고 첫 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬하는 방식으로 프라이머의 서열들이 정렬될 경우. 예를 들어, 도 1에서, 두 번째 프라이머 106의 꼬리 영역에는 CCAT의 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열이 있고, 첫 번째 프라이머 105의 꼬리 영역에는 ATGG의 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열이 있습니다. 두 번째 프라이머(C)의 5' 말단 뉴클레오티드가 첫 번째 프라이머(G)의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬되고 첫 번째 프라이머(A)의 5' 말단 뉴클레오티드가 두 번째 프라이머(T) 107의 꼬리 영역의 가장 안쪽 뉴클레오티드와 정렬되어 있을 때, 이런 서열들은 상보적입니다(도 1b).

두 번째 프라이머의 꼬리 영역에 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있을 수 있지만, 일반적으로, 첫 번째 프라이머를 두 번째 프라이머에 서냉결합하여 형성한 결과물은 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물에 대해 바람직하지 않거나 유용하지 않습니다. 따라서, 일부 구현에서, 첫 번째 프라이머 - 두 번째 프라이머 서냉결합 결과물의 형성을 최소화하기 위한 단계를 수행해야 할 수도 있습니다. 이런 단계에는, 예를 들어, 본 문서에 제공된 방법을 시작하기 전에 연장된 기간 동안 프라이머들이 상호작용하는 조건 하에서 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머를 미리 배양(pre-incubating)하는 것이 포함되지 않을 수도 있습니다.

첫 번째 프라이머 105a의 첫 번째 복사본의 주형 결합 영역이 핵산 주형 103(도 1c)의 첫 번째 가닥에 서냉결합되고 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물이 형성되는(도 1d) 조건하에서, 1차 핵산 101은 첫 번째 프라이머 105a와 중합효소 108로 처리될 수도 있습니다. 중합효소 108은 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 형성을 촉매 할 수도 있습니다. 중합효소에는 가닥 치환 활성이 있습니다. 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 합성하는 동안, 중합효소는 핵산 주형 103의 첫 번째 가닥에서 핵산 주형 104의 두 번째 가닥을 치환(displace)할 수도 있습니다. 일반적으로, 연장 결과물은 첫 번째 프라이머 105a의 첫 번째 복사본의 3' 말단에서 생성됩니다. 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 생성하는 동안, 첫 번째 프라이머 105a의 첫 번째 복사본은 합성된 연장 결과물과 공유 결합할 수도 있으며, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본은, "첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물"로 설명된, 분자의 일부분이 됩니다. 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물은 핵산 주형 103의 첫 번째 가닥에 대해 상보적입니다. 일부 구현에서, 첫 번째 프라이머 105a의 첫 번째 복사본이 핵산 주형 103의 첫 번째 가닥에 서냉결합될 때, 첫 번째 프라이머 105a의 첫 번째 복사본의 꼬리 영역을 서냉결합되지 않고 주형 결합 영역은 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 서냉결합됩니다.

일부 구현에서, 첫 번째 프라이머 105a의 첫 번째 복사본의 주형 결합 영역이 핵산 주형 103의 첫 번째 가닥에 서냉결합하고 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물이 형성되는 조건에는 중합효소 기반 핵산 합성을 지원하는 데 충분한 조건이 포함될 수도 있습니다. 중합효소 기반 핵산 합성에 대한 예시 조건은 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 분자 클로닝(Molecular Cloning)에 제공되어 있습니다: A Laboratory Manual, M.R. Green and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012), 이 문서는 참조에 의해 그 자체로 본 문서에 통합되었습니다. 구현에서, 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역은 핵산 중합효소에 의한 프라이머 주형 의존 연장(template-dependent extension)을 지원할 수도 있으며, 프라이머의 3' 말단에서 프라이머를 연장할 수도 있습니다.

두 번째 프라이머 106의 주형 결합 영역이 첫 번째 프라이머 111(도 1e)의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 서냉결합되고 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물이 형상(도 1f)되는 조건하에서, 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 두 번째 프라이머 106과 중합효소 108로 처리할 수 있습니다. 중합효소 108은 두 번째 프라이머 106의 연장 결과물의 형성을 촉매 할 수도 있습니다. 중합효소에는 가닥 치환 활성이 있습니다. 중합효소는 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 생성하는 데 사용한 중합효소와 동일한 종류일 수도 있고 다른 종류일 수도 있습니다. 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물을 합성하는 동안, 중합효소는 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에서 핵산 주형 103의 첫 번째 가닥을 치환할 수도 있습니다. 일반적으로, 연장 결과물은 두 번째 프라이머 106의 3' 말단에서 생성됩니다. 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물을 생성하는 동안, 두 번째 프라이머 106은 합성된 연장 결과물과 공유 결합할 수도 있으며, 두 번째 프라이머는 "두 번째 프라이머의 연장 결과물"로 설명된 분자의 일부분이 됩니다. 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물은 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 대해 상보적입니다. 일부 구현에서, 두 번째 프라이머 106이 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 서냉결합될 때, 두 번째 프라이머 106의 꼬리 영역은 서냉결합되지 않고 주형 결합 영역은 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 서냉결합됩니다. 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 3' 말단 영역이 포함됩니다. 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드(T)는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드(T)이고 3' 말단 영역에는 CCAT의 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이 들어 있습니다.

일부 구현에서, 두 번째 프라이머 106의 주형 결합 영역이 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 서냉결합하고 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물이 형성되는 조건에는, 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 조건을 포함하여, 중합효소 기반 핵산 합성을 지원하는 데 충분한 조건이 포함될 수 있습니다. 이런 조건은 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 생성하는 데 사용한 조건과 동일하거나 다를 수도 있습니다.

첫 번째 프라이머 105b의 두 번째 복사본의 주형 결합 영역이 두 번째 프라이머 112(도 1g)의 연장 결과물에 서냉결합되고 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 형성되는(도 1h) 조건하에서, 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물은 첫 번째 프라이머 105b의 두 번째 복사본과 중합효소 108로 처리될 수도 있습니다. 중합효소 108은 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 형성을 촉매 할 수도 있습니다. 중합효소에는 가닥 치환 활성이 있습니다. 중합효소는 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물 또는 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물을 생성하는 데 사용한 중합효소와 동일한 종류일 수도 있고 다른 종류일 수도 있습니다. 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 합성하는 동안, 중합효소는 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물에서 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 치환할 수도 있습니다. 일반적으로, 연장 결과물은 첫 번째 프라이머 105b의 두 번째 복사본의 3' 말단에서 생성됩니다. 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 생성하는 동안, 첫 번째 프라이머 105b의 두 번째 복사본은 합성된 연장 결과물과 공유결합 할 수도 있으며, 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본은 "첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물"로 설명된 분자의 일부분이 됩니다. 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물은 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물에 대해 상보적입니다. 일부 구현에서, 첫 번째 프라이머 105b의 두 번째 복사본이 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물에 서냉결합될 때, 첫 번째 프라이머 105b의 주형 결합 영역과 꼬리 영역 모두는 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물에 서냉결합됩니다. 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물에는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 3' 말단 영역이 포함됩니다. 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드(G)는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드(G)이고 3' 말단 영역에는 ATGG의 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열이 들어 있습니다.

일부 구현에서, 첫 번째 프라이머 105b의 두 번째 복사본의 주형 결합 영역이 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물에 서냉결합하고 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 형성되는 조건에는, 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 조건을 포함하여, 중합효소 기반 핵산 합성을 지원하는 데 충분한 조건이 포함될 수 있습니다. 조건은 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물 또는 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물을 생성하는 데 사용한 조건과 동일할 수도 있고 다를 수도 있습니다.

첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 생성하면 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물과 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물이 들어 있는 분자가 생성될 수도 있으며, 이것을 본 문서에서 "2차 핵산" 115라고 부를 수도 있습니다. 2차 핵산 115 내에서, 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물은 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물에 서냉결합될 수도 있습니다. 또한, 2차 핵산 115에는 핵산 주형 102의 서열이 들어 있습니다. 2차 핵산 115에는 핵산 주형 102보다 더 큰 길이의 뉴클레오티드가 들어 있고, 핵산 주형 102의 서열 외에도, 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 서열과 이런 것들의 상보 서열이 들어 있을 수도 있습니다. 특히, 2차 핵산 115에는 첫 번째 말단 영역 116과 두 번째 말단 영역 117이 들어 있을 수 있습니다. 첫 번째 말단 영역 116에는 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물의 3' 말단 영역과 이런 것들의 보체(complement)가 포함되어 있을 수도 있습니다. 두 번째 말단 영역 117에는 첫 번째 프라이머 113의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역과 이런 것들의 보체(complement)가 포함될 수도 있습니다.

2차 핵산 115의 첫 번째 복사본 115a와 두 번째 복사본 115b가 형성되거나 제공될 수도 있습니다(도 1i). 2차 핵산 115의 일반 구조가 있는 핵산을 생성하는 과정(process)이나 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 과정으로 2차 핵산 115의 첫 번째 복사본 115a와 두 번째 복사본 115b를 생성할 수 있습니다. 예를 들어, 1차 핵산 101로부터 2차 핵산 115를 생성하기 위한 상기 전체 과정은 2차 핵산의 첫 번째 복사본 115a와 두 번째 복사본 115b를 생성하기 위해 2회 반복할 수 있습니다. 다른 한 예에서, 2차 핵산의 첫 번째 복사본 115a와 두 번째 복사본 115b는 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 단일 복사본으로부터 생성할 수도 있습니다. 이 예에서, 두 번째 프라이머 112a의 연장 결과물의 첫 번째 복사본이 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 단일 복사본에서 치환(displaced)되어, 두 번째 프라이머 112b의 연장 결과물의 두 번째 복사본이 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 단일 복사본으로부터 생성이 가능해 질 때, 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 두 복사본 112a와 112b는 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 단일 복사본으로부터 생성될 수 있습니다. 그런 다음, 예를 들어, 첫 번째 프라이머 113a와 113b의 두 번째 복사본의 연장 결과물은 두 번째 프라이머 112a와 112의 연장 결과물의 각각의 복사본으로부터 생성될 수 있습니다. 2차 핵산의 첫 번째 복사본 115a와 두 번째 복사본 115b를 생성하기 위한 추가적인 절차는 본 문서에 제공된 방법으로 수행하거나 본 문서에 제공된 방법에서 사용할 수 있습니다.

이런 가닥들(도 1j, 간결성을 위해 가닥 113b와 112a는 표시 안 됨)이 들어 있는 교차 구조 118을 생성하기 위해, 2차 핵산 113a의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 2차 핵산 112b의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역에 서냉결합되는 조건 하에서, 2차 핵산의 첫 번째 복사본 115a와 두 번째 복사본 115b를 처리할 수도 있습니다. 성분 가닥 112b와 113a 모두의 연장 결과물이 형성되는 조건 하에서 교차 구조 118을 중합효소로 추가적으로 처리할 수 있으며, 연장 결과물은 본 문서에서 "첫 번째 연쇄동일서열 가닥" 121 및 "두 번째 연쇄동일서열 가닥" 122로 각각 부를 수도 있습니다. 첫 번째 연쇄동일서열 가닥 121과 두 번째 연쇄동일서열 가닥 122는 함께 서냉결합되고 집단적으로 연쇄동일서열 120으로 부를 수도 있습니다(도 1k). 연쇄동일서열 120에는 핵산 주형 102의 둘 이상의 복사본이 들어 있을 수도 있습니다. 연쇄동일서열 120 내에서, 핵산 주형 102의 둘 이상의 복사본의 일부 또는 전체는 첫 번째 프라이머 105와 두 번째 프라이머 106의 꼬리 영역의 서열에 의해 서로 분리될 수 있으며, 꼬리 영역의 서열들은 서로 서냉결합됩니다. 예를 들어, 도 1k의 연쇄동일서열 120에서, 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 첫 번째 복사본은 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 두 번째 복사본으로부터 CCAT의 5'-3' 순서로 된 서열에 의해 분리되었습니다. CCAT는 두 번째 프라이머 106의 꼬리 영역의 5'-3' 순서의 서열입니다. 이와 비슷하게, 도 1k의 연쇄동일서열 120에서, 2중가닥 핵산 주형의 두 번째 가닥의 첫 번째 복사본은 2중가닥 핵산 주형의 두 번째 가닥의 두 번째 복사본으로부터 ATGG의 5'-3' 순서로 된 서열에 의해 분리되었습니다. ATGG는 첫 번째 프라이머 105의 꼬리 영역의 5'-3' 순서의 서열입니다. 연쇄동일서열 내에서, 첫 번째 연쇄동일서열 가닥의 CCAT는 두 번째 연쇄동일서열 가닥의 ATGG에 서냉결합되었습니다.

일부 구현에서, 교차 구조 118 또는 교차 구조의 가닥들의 연장 결과물이 형성되는 조건에는, 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 조건을 포함하여, 중합효소 기반 핵산 합성을 지원하는 데 충분한 조건이 포함될 수도 있습니다. 조건은 첫 번째 프라이머 111의 첫 번째 복사본의 연장 결과물, 두 번째 프라이머 112의 연장 결과물, 또는 첫 번째 프라이머 111의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 생성하는 데 사용한 조건과 동일할 수도 있고 다를 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 연쇄동일서열은 도 1i-1k에 설명된 과정에 따라 길이가 추가적으로 늘어날 수도 있습니다. 예를 들어, 도 1k에 표시된 연쇄동일서열 분자 120 두 개는 도 1j에 표시된 것과 비슷한 교차 구조를 형성하고(긴 가닥 제외), 핵산 주형 102의 복사본 4 개가 들어 있는 더 큰 연쇄동일서열 분자를 생성하도록 처리될 수 있습니다. 다른 한 예에서, 2차 핵산 115와 연쇄동일서열 120은 교차 구조를 형성하고, 핵산 주형 102의 복사본 3 개가 들어 있는 더 큰 연쇄동일서열 분자를 생성할 수 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 서로 다른 길이의 서로 다른 연쇄동일서열을 동시에 생성할 수도 있습니다.

구현에서, 본 문서에 제공된 방법 및 구성물은 도 8을 참조하면서 설명할 수 있습니다. 폴리뉴클레오티드 주형 800(도 8a)은 증폭의 목표물이 될 수도 있습니다. 폴리뉴클레오티드 주형 800은 단일 뉴클레오티드 가닥입니다. 폴리뉴클레오티드 주형 가닥은 자유롭게(free) 존재하거나 단일 가닥 분자로 존재할 수도 있고, 2중가닥 분자의 일부로 존재할 수도 있으며, 폴리뉴클레오티드 주형 가닥이 상보 가닥(complementary strand)에 서냉결합 될 수도 있습니다. 폴리뉴클레오티드 주형 800은 DNA 또는 RNA가 될 수도 있습니다.

폴리뉴클레오티드 주형 800에는 적어도 첫 번째 부분 801(또한 "(i)"로 표시됨)과 두 번째 부분 802(또한 "(ii)"로 표시됨)가 들어 있을 수도 있습니다. 첫 번째 부분 801과 두 번째 부분 802에는 각각 임의 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있으며, 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3 개 이하의 뉴클레오티드가 각각 들어 있거나 또는 적어도 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3 개의 뉴클레오티드가 각각 들어 있을 수도 있습니다. 첫 번째 부분 801과 두 번째 부분 802에는 동일한 개수 또는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 뉴클레오티드 주형 800에는 첫 번째 부분 801과 두 번째 부분 802 외에도 다른 부분이 들어 있을 수도 있습니다. 다른 구현에서, 첫 번째 부분 801과 두 번째 부분 802는 폴리뉴클레오티드 주형 800 전체를 구성할 수도 있습니다. 폴리뉴클레오티드 주형 800에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 핵산 주형의 길이가 있을 수도 있습니다. 폴리뉴클레오티드 주형 800은 1차 핵산의 한 부분일 수도 있습니다. 폴리뉴클레오티드 주형은 피험자로부터 확보한 시료에 들어 있을 수도 있습니다.

폴리뉴클레오티드 주형 800은 첫 번째 프라이머 810과 두 번째 프라이머 820이 들어 있는 반응 혼합물 속에서 배양될 수도 있습니다(도 8b). 일반적으로, 반응 혼합물에는 각 프라이머의 복사본이 다수 들어 있으며, 프라이머 각각의 복사본은, 예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 10,000, 100,000 또는 1백만 개 이상일 수도 있습니다. 첫 번째 프라이머 810에는 첫 번째 영역 811(또한 "(i)"로 표시됨)과 두 번째 영역 812(또한 "(ii)"로 표시됨)가 있을 수도 있습니다. 첫 번째 프라이머 811의 첫 번째 영역에는 5' 말단이 있고, 첫 번째 프라이머 812의 두 번째 영역에는 3' 말단이 있을 수 있습니다. 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역에는 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역의 뉴클레오티드 서열과는 다른 뉴클레오티드 서열이 들어 있을 수도 있습니다. 두 번째 프라이머 820에는 첫 번째 영역 821(또한 "(i)"로 표시됨)과 두 번째 영역 822(또한 "(ii)"로 표시됨)가 있을 수도 있습니다. 두 번째 프라이머 821의 첫 번째 영역에는 5' 말단이 있고, 두 번째 프라이머 822의 두 번째 영역에는 3' 말단이 있을 수 있습니다. 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역에는 두 번째 프라이머의 두 번째 영역의 뉴클레오티드 서열과는 다른 뉴클레오티드 서열이 들어 있을 수도 있습니다.

첫 번째 프라이머 812의 두 번째 영역에는 폴리뉴클레오티드 주형 801의 첫 번째 부분의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있을 수도 있습니다. 도 8에서, 폴리뉴클레오티드 주형 801의 첫 번째 부분의 뉴클레오티드 서열은 알파벳 A로 표시되고, 첫 번째 프라이머 812의 두 번째 영역의 뉴클레오티드 서열은 알파벳 A'으로 표시되며, A와 A'은 서로 상보적입니다. 두 번째 프라이머 822의 두 번째 영역에는 파트너 뉴클레오티드 서열 830에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 있고, 파트너 뉴클레오티드 서열 830은 폴리뉴클레오티드 주형 802의 두 번째 부분의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적입니다. 도 8에서, 폴리뉴클레오티드 주형 802의 두 번째 부분의 뉴클레오티드 서열은 알파벳 B로 표시되어 있고, 파트너 뉴클레오티드 서열 830의 뉴클레오티드 서열은 알파벳 B'으로 표시되고, 두 번째 프라이머 822의 두 번째 영역의 뉴클레오티드 서열은 알파벳 B로 표시되고, B와 B'은 서로 상보적입니다. 즉, 도 8에 표시된 것처럼, 폴리뉴클레오티드 주형 802 (B)의 두 번째 부분의 뉴클레오티드 서열은 두 번째 프라이머 822 (B)의 두 번째 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일합니다. 본 문서에 제공된 구성물과 방법으로, 파트너 뉴클레오티드 서열 830은, 예를 들어, 첫 번째 프라이머의 3' 말단에서부터 연장 결과물의 일부로 생성될 수도 있습니다. 구현에서, 첫 번째 프라이머 811의 첫 번째 영역은 두 번째 프라이머 821의 첫 번째 영역에 대해 상보적입니다. 도 8에서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열은 알파벳 C로 표시되어 있고, 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열은 알파벳 C'으로 표시되어 있으며, C와 C'은 서로 상보적입니다.

구현에서, 도 8의 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머의 특성이 각각 들어 있을 수 있습니다(예를 들어, 도 1). 또한, 구현에서, 도 8의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명되어 있는 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 특성이 들어 있을 수도 있습니다. 구현에서, 도 8의 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명되어 있는 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역의 특성이 들어 있을 수도 있습니다. 구현에서, 도 8의 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명되어 있는 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 특성이 들어 있을 수도 있습니다. 구현에서, 도 8의 두 번째 프라이머의 두 번째 영역에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명되어 있는 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역의 특성이 들어 있을 수도 있습니다.

구현에서, 폴리뉴클레오티드 주형 800, 첫 번째 프라이머 810의 적어도 두 개의 복사본 및 두 번째 프라이머 820의 적어도 두 개의 복사본이 들어 있는 반응 혼합물에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명되어 있는 중합효소 기반 핵산 합성을 지원하는 하나 이상의 구성성분이 들어 있을 수도 있습니다(예를 들어, 중합효소, 뉴클레오티드, 완충제, 물, 등등). 이와 비슷하게, 폴리뉴클레오티드 주형 800, 첫 번째 프라이머 810의 적어도 두 개의 복사본 및 두 번째 프라이머 820의 적어도 두 개의 복사본이 들어 있는 반응 혼합물은 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명되어 있는 핵산 주형의 증폭 또는 연쇄동일서열의 생성을 지원하는 반응 조건에서 배양할 수도 있습니다.

구현에서, 본 문서에 설명된 반응 혼합물에서 폴리뉴클레오티드 주형 800, 첫 번째 프라이머 810의 적어도 두 개의 복사본 및 두 번째 프라이머 820의 적어도 두 개의 복사본을 배양할 때, 하나 이상의 연쇄동일서열 가닥이 형성될 수도 있습니다(도 8c). 구현에서, 형성된 연쇄동일서열 가닥 840에는 5' 말단과 3' 말단이 있을 수 있고, 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 서열이 있을 수 있으며, 여기에서, C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열이고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 서열 또는 이런 것의 유사 서열이고, X는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드입니다. 그러므로, 연쇄동일서열 가닥의 일반 구조로 표시된 것처럼, 연쇄동일서열 가닥에는 폴리뉴클레오티드 주형의 서열 또는 이런 것의 유사 서열의 적어도 두 개의 복사본이 포함될 수도 있고, 여기에서, 폴리뉴클레오티드 주형의 서열의 복사본들은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 서열에 의해 분리되어 있습니다. 구현에서, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 유사 서열이 될 수도 있습니다. 본 문서에 사용된 폴리뉴클레오티드 주형의 "유사 서열(analogous sequence)"은 폴리뉴클레오티드 주형과 비슷한 서열이 들어 있으나 폴리뉴클레오티드 주형에 들어 있는 뉴클레오티드와 비슷한 하나 이상의 서열이 들어 있는 서열을 뜻합니다. 그러므로, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 주형에 RNA 서열이 들어 있을 경우, 이것의 유사 서열은 동일한 서열의 DNA 버전이 될 수도 있고(즉, RNA 서열의 우라실(uracils)은 유사 DNA 서열의 티민(thymines)에 해당), 또는 그 반대도 가능합니다. 이 예를 계속 설명하자면, 폴리뉴클레오티드 주형에 RNA 서열 5' UACCUG 3'이 들어 있을 경우, 유사 서열 DNA 서열은 5' TACCTG 3'입니다.

구현에서, 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조가 들어 있는 서열에서, X는 영(0) 개의 뉴클레오티드입니다(즉, X의 양쪽에 있는 T와 C 서열은 직접 연결되어 있습니다). 다른 구현에서, X는 10,000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3 개 미만의 뉴클레오티드입니다. X에 들어 있는 뉴클레오티드들은 (있을 경우) 임의의 서열을 가질 수도 있습니다. 구현에서, X에는 5'에서 3' 방향으로 [(C'-T)_N]의 일반 구조를 갖는 서열이 포함될 수 있고, 여기에서, C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레이티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, N은 1000, 500, 200, 100, 50 또는 10 미만의 임의의 정수이고, 1 ~ 500, 1 ~ 200, 1 ~ 100, 1 ~ 50 또는 1 ~ 10 사이의 임의의 정수입니다. 예를 들어, X에 5'에서 3' 방향으로 [(C'-T)_N]의 일반 구조가 들어 있는 서열이 들어 있고 "N"이 3일 경우, C'-T-C'-T-X-C' 구조의 X 위치에 (C'-T)가 3 번 순차 반복되고, 해당 구조는 C'-T-C'-T-C'-T-C'-T-C'-T-C'처럼 쓸 수 있고, 밑줄친 C'과 T는 [(C'-T)₃] 공식의 C'-T가 반복된 것입니다. 그러므로, 예를 들어, 본 문서에 제공된 구성물과 방법에 따라, 연쇄동일서열 가닥은 폴리뉴클레오티드 주형의 수십 또는 수백개의 복사본이 포함되도록 구성될 수 있습니다. 구현에서, 도 8에 제공된 연쇄동일서열 가닥에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 연쇄동일서열 가닥의 특성이 있을 수 있습니다. 또한, 일부 구현에서, 연쇄동일서열을 생성하는 동안, C'-T-C'-T-X-C' 일반 구조가 있는 서열 속에서 하나 이상의 C' 또는 T에 소수의 뉴클레오티드(예를 들어, 15 개 또는 미만, 10 개 또는 미만, 5 개 또는 미만, 3 개 또는 미만)를 C'과 T 사이에 삽입할 수 있습니다. 또한, 일부 구현에서, 연쇄동일서열을 생성하는 동안, C'-T-C'-T-X-C' 일반 구조가 있는 서열 속에서 하나 이상의 C' 또는 T에서, 소수의 뉴클레오티드(예를 들어, 15 개 또는 미만, 10 개 또는 미만, 5 개 또는 미만, 3 개 또는 미만)를 C' 또는 T 서열에서 삭제할 수도 있습니다. 그러므로, 본 문서에 제공된 방법에 따라 생성된 연쇄동일서열 가닥에는 여기에 제공된 것과 같은 일반 구조가 있는 가닥이 포함될 수 있으나, 연쇄동일서열 가닥의 서로 다른 서열 성분들 사이의 하나 이상의 접합점에서 소수의 뉴클레오티드가 추가되거나 제거될 수도 있습니다. 또한, 구현에서, 본 문서에 제공된 연쇄동일서열 가닥에는 C'-T-C'-T-X-C' 일반 구조의 서열이 있는 연쇄동일서열이 들어 있는 분자의 5' 또는 3' 말단에서 추가적인 뉴클레오티드(예를 들어, 3, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000 또는 그 이상의 추가적인 뉴클레오티드)가 들어 있을 수도 있습니다. 구현에서, C'-T-C'-T-X-C' 일반 구조의 C'에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 특성(예, 길이, 서열)이 들어 있을 수 있습니다. 구현에서, C'-T-C'-T-X-C' 일반 구조의 T에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 폴리뉴클레오티드 주형 가닥의 특성(예, 길이, 서열)이 들어 있을 수 있습니다.

구현에서, 본 문서에 제공된 방법에 따라 생성된 연쇄동일서열 가닥 840은 단일 가닥 분자의 일부분일 수도 있습니다. 다른 구현에서, 본 분서에 제공된 방법에 따라 생성된 연쇄동일서열 가닥 840은 2중가닥 연쇄동일서열의 일부분이 될 수도 있으며, 여기에서 연쇄동일서열 가닥 840은 연쇄동일서열 가닥 850에 대해 상보적인 가닥에 서냉결합됩니다. 도 8c에서 C'-T-C'-T-X-C' (가닥 840) 또는 C-T'-C-T'-X'-C (가닥 850)의 5'에서 3' 방향으로 일반 구조가 들어 있는 서열이 있는 연쇄동일서열 가닥들이 표시되어 있고, X는 0 개의 뉴클레오티드이고, 도 8의 도식에 따라 생성된 연쇄동일서열 가닥에는 상기되었거나 또는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 연쇄동일서열 가닥의 특성이 있을 수 있습니다. 또한, 도 8c에서처럼, 서열 A와 B는 주형 가닥의 부분이므로 C'-T-C'-T -X-C' 또는 C-T'-C-T'-X'-C 일반 구조물에서 별도로 표기되어 있지 않습니다.

본 문서에 제공된 방법과 구성물에 따라 생성된 연쇄동일서열은 임의의 길이의 뉴클레오티드로 되어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 여기에 생성된 연쇄동일서열 분자들은 길이가 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000 또는 25,000 개의 뉴클레오티드로 되어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 여기에 생성된 연쇄동일서열 분자들은 길이가 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000 또는 25,000 개 이하의 뉴클레오티드로 되어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 여기에 생성된 연쇄동일서열 분자들은 뉴클레오티드 길이가 초소 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000 또는 20,000 개에서 최대 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000 또는 25,000 개 사이의 범위에서 선택한 길이가 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물에 따라 생성된 연쇄동일서열의 적어도 일부에는 상기된 특성이 들어 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물에 따라 생성된 연쇄동일서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 상기된 특성이 들어 있습니다.

본 문서에 제공된 방법 및 구성물에 따라 생성된 연쇄동일서열에는 핵산 주형의 임의의 개수의 복사본 또는 특정 핵산이 들어 있을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 여기에 생성된 연쇄동일서열 분자들에는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개의 핵산 주형의 복사본 또는 특정 핵산이 들어 있을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 여기에 생성된 연쇄동일서열 분자들에는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 이하의 핵산 주형의 복사본 또는 특정 핵산이 들어 있을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 여기에 생성된 연쇄동일서열 분자들에는 핵산 주형의 복사본 또는 특정 핵산이 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 또는 90 개에서 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 사이의 범위에서 선택한 개수가 들어 있을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물에 따라 생성된 연쇄동일서열의 적어도 일부에는 상기된 특성이 들어 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물에 따라 생성된 연쇄동일서열의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 상기된 특성이 들어 있습니다.

본 문서에 제공된 방법의 진행은 여러 가지 서로 다른 방법으로 모니터링 할 수 있습니다. 구현에서, 핵산 증폭 결과물에 대해 반응을 분석 검사할 수도 있습니다(예를 들어, 결과물의 양 또는 생성 속도). 다른 구현에서, 핵산 주형과 함께 중합효소의 활동에 대해 반응을 분석 검사할 수도 있습니다(예를 들어, 주형 가닥을 따라 중합효소의 이동). 그러므로, 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 사건(events)은 방법으로부터 생성된 결과물의 누적에 따라(방법의 단계 동안 또는 완료된 후에) 또는 방법의 단계 동안 발생한 검출 가능 사건에 따라 관찰됩니다.

예를 들어, 반응 결과물(증폭된 핵산 또는 반응의 부산물)을 검출하거나 또는 반응 진행과 관련된 프로브를 검출하여, 증폭된 핵산의 유무를 분석 검사할 수 있습니다.

일부 구현에서, 반응 결과물은 결과물을 염료로 염색하여 식별될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 염료는 핵산과 결합하지 않았을 때보다 핵산과 결합되었을 때 형광이 더 클 수도 있습니다. 구현에서, 염료는 2중가닥 핵산에 삽입되거나(intercalate) 핵산의 외부 영역에 결합될 수도 있습니다. 본 문서에 제공된 방법 및 구성물에 대해 사용할 수 있는 핵산 염료에는, 예를 들어, 시아닌 염료(cyanine dyes), PicoGreen ®, OliGreen ®, RiboGreen ®, SYBR® dyes, SYBR ® Gold, SYBR ® Green I, SYBR ® Green II, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), 디하이드로에티듐(dihydroethidium), BlueView™, TOTO ® 염료, TO-PRO ® 염료, POPO ® 염료, YOYO ® 염료, BOBO ® 염료, JOJO ® 염료, LOLO ® 염료, SYTOX ® 염료, SYTO ® 염료, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide), 헥시디움 요오드화물(hexidium iodide), 메틸렌 블루(methylene blue), DAPI, 아크리딘 오렌지(acridine orange), 퀴나크린(quinacrine), 아크리딘 다이머(acridine dimers), 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine, 비스벤지미드 염료(bisbenzimide dyes), 훼스트 염료(Hoechst dyes), 7-aminoactinomycin D, 악티노마이신 D(actinomycin D), 히드록시스틸아미딘(hydroxystilbamidine), 피로닌 Y(pyronin Y), Diamond™ 염료, GelRed™, GelGreen™ 및 LDS 751이 포함됩니다.

일부 구현에서, 반응 결과물은 증폭 반응의 비탁도(turbidity)를 분석하여 식별할 수도 있습니다. 예를 들어, 구현에서, 비탁도가 증가하면 반응 결과물이나 반응 부산물의 형성과 연관될 수도 있습니다(예를 들어, 마그네슘과 결합한 피로인산염).

일부 구현에서, 반응 결과물은 여기에 들어 있는 방법에 따라 겔 전기영동법(gel electrophoresis)을 수행하고 핵산 염색용 염료로 겔(gel)을 염색하여 수행한 반응을 분리하여 식별할 수 있습니다. 염료는 본 문서에 공개되었거나 또는 기술 분야에 알려져 있는 핵산 염료가 될 수도 있습니다.

구현에서, 핵산 검출과 핵산 생성에 대해 기술 분야에 알려져 있는 방법 또는 구성물을 본 문서에 제공된 방법 및 구성물과 함께 사용할 수도 있습니다.

일부 구현에서, 핵산 주형 가닥(또는 비슷하거나 동일한 서열이 있는 가닥)의 일부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 들어 있고, 형광 보고물질(fluorescent reporter, 즉 형광단(fluorophore))과 소광제(quencher) 중 하나 또는 둘 모두가 포함된 핵산 프로브는 본 문서에 제공된 반응에 포함되어 있습니다.

한 예에서, 핵산 프로브에는 5' 또는 3' 말단에 형광 보고물질(fluorescent reporter)이 들어 있고 다른 말단(terminus)에는 소광제(quencher)가 들어 있을 수도 있습니다. 프로브에는 순서 대로 적어도 첫 번째 영역, 두 번째 영역, 세 번째 영역이 들어 있는 뉴클레오티드 서열이 추가도 들어 있을 수도 있으며, 첫 번째와 세 번째 영역은 서로 상보적이고, 두 번째 영역의 적어도 일부분은 핵산 주형(프로브 "검출 서열")의 한 가닥의 일부분에 대해 상보적입니다. 일부 구현에서, 두 번째 영역의 길이는 첫 번째 또는 세 번째 영역의 길이 보다 더 클 수도 있습니다. 일부 구현에서, 두 번째 영역의 길이는 10 ~ 40 개의 뉴클레오티드 사이 일 수도 있으며, 첫 번째와 세 번째 영역의 길이는 4 ~ 10 개의 뉴클레오티드 사이 일 수도 있습니다. 프로브에는 적어도 두 개의 서로 다른 배치구조(conformations)가 있을 수 있습니다: (A) 프로브가 검출 서열에 서냉결합되어 있지 않고 첫 번째와 세 번째 영역이 서로 서냉결합되어 있는 배치구조가 있습니다; 이런 배치구조는 "스템-루프(stem-loop)" 구조가 될 수 있으며, 첫 번째 영역과 두 번째 영역은 스템(stem, 줄기)를 구성하고 두 번째 영역은 루프(loop, 고리)를 구성하고, 및 (B) 프로브가 검출 서열에 서냉결합 된 배치구조(conformation)가 있습니다; 이런 구조에서, 두 번째 영역과 두 번째 영역의 일부분은 검출 서열에 서냉결합되어 있고 첫 번째와 세 번째 영역은 서로 서냉결합되어 있지 않습니다. 프로브의 배치구조 (A)에서, 형광 보고물질(fluorescent reporter)과 소광제(quencher)(이것들은 프로브의 서로 반대편 말단 / 첫 번째와 세 번째 영역의 외곽 말단(outer ends)에 위치)는 서로 가깝게 인접하여(둘 모두는 첫 번째와 세 번째 영역이 서냉결합되어 형성된 스템 구조의 말단에 위치), 형광 보고물질이 소광됩니다(quenched). 프로브의 배치구조 (B)에서, 형광 보고물질과 소광제는 서로 인접하지 않고, 형광 보고물질이 소광되지 않습니다(not quenched). 예를 들어, 프로브가 스템-루프 구조를 형성하거나 또는 검출 서열과 서냉결합하는 반응 조건하에서, 선택한 반응 결과물의 누적을 감시하는 데 프로브를 사용할 수 있습니다. 일부 구현에서, 검출 서열이 있을 경우, 프로브는 검출 서열과 서냉결합하고, 프로브는 형광단의 여기 스펙트럼(excitation spectrum)의 파장의 빛에 응답하여 형광발광할 수도 있습니다. 대조적으로, 검출 서열이 없을 경우, 프로브는 스템-루프 구조를 형성할 수 있으나 형광단의 여기 스펙트럼의 파장의 빛에 대해 형광발광(fluoresce)하지 않을 수 있습니다.

다른 한 예에서, 핵산 프로브에는 5' 또는 3' 말단에서 형광 보고물질이 들어 있고 소광제(quencher)가 들어 있는 핵산 프라이머에 서냉결합될 수도 있습니다. 핵산 프로브가 프라이머에 서냉결합될 때 형광 보고물질이 소광되도록 하기 위해, 소광제가 들어 있는 핵산 프라이머에는 프라이머의 특정 위치에 소광제가 들어 있을 수도 있습니다. 예를 들어, 프로브가 프라이머에 서냉결합 되거나 또는 반응 결과물에 들어 있는 검출 서열에 서냉결합하는 반응 조건하에서, 선택한 반응 결과물의 누적을 감시하는 데 프로브를 사용할 수 있습니다. 일부 구현에서, 검출 서열이 있을 경우, 프로브는 검출 서열과 서냉결합하고, 프로브는 형광단의 여기 스펙트럼(excitation spectrum)의 파장의 빛에 응답하여 형광발광할 수도 있습니다(반응 결과물의 유무를 알려줌). 대조적으로, 검출 서열이 없을 경우, 프로브는 프라이머와 쌍을 이룬 상태로 남아 있을 수 있으나, 형광단의 여기 스펙트럼의 파장의 빛에 대해 형광발광(fluoresce)하지 않을 수 있습니다.

형광 보고물질(fluorescent reporter)과 소광제(quencher) 쌍이 들어 있는 프로브에서, 형광 보고물질과 소광제를 선택하여 소광제가 보고물질을 효과적으로 소광하도록 할 수 있습니다. 일부 구현에서, 형광 보고물질은 형광 보고물질의 최대 방출량이 소광제의 최대 흡수량과 비슷할 때 소광제와 쌍을 이룰 수 있습니다(paired). 형광 보고물질로 사용할 수 있는 형광단에는, 예를 들어, CAL Fluor Gold, CAL Fluor Orange, Quasar 570, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 610, CAL Fluor Red 635, Quasar 670 (Biosearch Technologies), VIC, NED (Life Technologies), Cy3, Cy5, Cy5.5 (GE Healthcare Life Sciences), Oyster 556, Oyster 645 (Integrated DNA Technologies), LC red 610, LC red 610, LC red 640, LC red 670, LC red 705 (Roche Applies Science), Texas red, FAM, TET, HEX, JOE, TMR 및 ROX가 포함됩니다. 사용할 수 있는 소광제(quenchers)에는, 예를 들어, DDQ-I, DDQ-II (Eurogentec), Eclipse (Epoch Biosciences), Iowa Black FQ, Iowa Black RQ (Integrated DNA Technologies), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 (Biosearch Technologies), QSY-7, QSY-21 (Molecular Probes) 및 Dabcyl이 포함됩니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에 따라 수행된 반응은 광원과 광센서가 들어 있는 장치에서 모니터링할 수 있습니다. 일부 상황에서, 반응은 광원의 광도(path of light)에 위치할 수 있으며, 시료에 의해 흡수된 빛(예를 들어, 비탁도 반응의 경우), 시료에 의해 산란된 빛(예를 들어, 비탁도 반응의 경우), 시료에서 방출된 빛(예를 들어, 형광 분자가 들어 있는 반응의 경우)를 측정할 수도 있습니다. 일부 예에서, 본 문서에 제공된 방법은 2013년 2월 18일 접수된 미국 특허 출원 번호 13/769,779에 공개된 기기 또는 모듈에서 수행하거나 모니터링할 수 있으며, 이 특허 출원은 참조에 의해 그 자체로 본 문서에 통합되었습니다.

본 문서에 제공된 방법을 사용하여, 관심 핵산 주형의 특정 증폭 결과물은 증폭 반응을 시작한 이후, 예를 들어, 30 초 내에, 1 분 내에, 3 분 내에, 5 분 내에, 10 분 내에, 15 분 내에, 20 분 내에, 30 분 내에, 45 분 내에, 60 분 내에, 90 분 내에, 120 분 내에, 180 분 내에 또는 240 분 내에 식별할 수도 있습니다. 다른 예에서, 본 문서에 제공된 방법을 사용하여, 관심 핵산 주형에 대해 양성(positive) 판정을 얻기 위해, 주형 복사본이 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000 또는 1,000,000 개가 생성되었을 때, 증폭 반응을 식별할 수 있습니다. 다른 예에서, 본 문서에 제공된 방법을 사용하여, 방법을 시작한 후에 시료에 관심 주형의 복사본이 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000 또는 10,000 개 들어 있으면, 관심 핵산 주형의 유무를 식별할 수 있습니다.

구현에서, 관심 표적 핵산에 대해 시료를 분석 검사하는 데 본 문서에 제공된 방법을 사용할 수 있습니다. 특정 구현에서, 반응에서 핵산 증폭의 변곡 시간(inflection time)을 결정하는 방법을 사용하여, 시료에 들어 있는 관심 표적 핵산의 유무 또는 양(quantity)을 결정할 수도 있습니다. 변곡 시간 / 변곡점(inflection point)은 핵산 주형에 대해 증폭 반응이 양성 판정되는 시간 또는 시점입니다. 변곡 시간 / 변곡점은 다음과 같은 하나 이상의 표시기(indicators)로 식별될 수 있습니다: 예를 들어, 반응에서 선택한 양의 핵산이 생성되었을 때의 반응 시작 후 시간(time post-initiation), 반응에서 증폭 변화율이 기준선 단계(baseline phase)에서 지수적 증가 단계(exponential phase)로 변하는 시간, 반응에서 증폭 변화율이 지수적 증가 단계에서 안정 단계(plateau phase)로 변하는 시간 등. 구현에서, 변곡 시간 / 변곡점은 반응의 형광도(fluorescence) 또는 흡수도의 변화를 기반으로 식별하거나 반응의 형광도 또는 흡수도가 선택한 값에 도달할 때를 기반으로 식별할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 시료에 들어 들어 있는 관심 표적 핵산의 유무 또는 양은 반응의 핵산 증폭 변곡 시간을 비교하는 다음과 같은 방법으로 결정할 수 있습니다: 양을 알고 있지 않은 관심 표적 핵산 반응 대 i) 관심 표적 핵산이 들어 있지 않은 반응(즉, 음성 제어) 또는 ii) 관심 핵산 표적이 들어 있는 반응(즉, 양성 제어), 이들 중 하나 또는 둘 모두와 비교하여, 관심 표적 핵산의 유무 또는 양을 결정할 수 있습니다. 구현에서, 선택한 변곡 시간에 대해, 관심 표적 핵산이 들어 있는 반응과 관심 표적 핵산이 들어 있지 않은 반응 모두를 측정할 수 있습니다. 구현에서, 시료에 들어 있는 관심 표적 핵산의 유무는 반응의 변곡 시간 차이를 평가하는 방법으로 결정할 수 있습니다. 관심 표적 핵산이 들어 있거나 들어 있지 않은 시료가 들어 있는 반응의 변곡 시간과 관심 표적 핵산의 유무가 알려져 있는(예를 들어, 관심 표적 핵산의 포함 여부가 알려져 있음) 하나 이상의 반응의 변곡 시간 간의 차이를 평가합니다. 예를 들어, 본 문서에 제공된 방법에 따라 반응의 변곡 시간이 관심 표적 핵산이 들어 있지 않은 것이 알려져 있는 해당 반응 보다 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180 분 적어도 빠를 때(earlier), 시료에는 관심 표적 핵산이 들어 있는 것으로 식별될 수 있습니다. 다른 한 예에서, 본 문서에 제공된 방법에 따라 반응의 변곡 시간이 관심 표적 핵산이 들어 있는 것이 알려져 있는 해당 반응 보다 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180 분 이하로 늦을 때(later), 시료는 관심 표적 핵산이 들어 있는 것으로 식별될 수 있습니다.

본 문서에 제공된 방법은 임의의 시간 동안 수행할 수 있습니다. 일반적으로, 예를 들어, 핵산 복제 비율, 중합효소 활동 발생 또는 증폭 결과물의 누적을 모니터링하는 데 충분한 시간 동안 방법을 수행할 수 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법은 총 10 초 이하, 30 초 이하, 1 분 이하, 5 분 이하, 10 분 이하, 20 분 이하, 30 분 이하, 45 분 이하, 1 시간 이하, 2 시간 이하, 3 시간 이하, 4 시간 이하, 6 시간 이하, 8 시간 이하, 12 시간 이하, 16 시간 이하 또는 24 시간 이하 동안 수행할 수 있으며, 이 시간 동안 핵산 복제 비율, 중합효소 활동 발생 또는 증폭 결과물의 누적이 측정됩니다.

본 문서에 제공된 방법은 다양한 방법으로 종료될 수 있습니다. 한 구현에서, 방법의 단계들은 방법의 하나 이상의 단계와 관련된 하나 이상의 시약의 농도가 감소하거나 또는 완전히 소모될 때 종료될 수 있습니다(예를 들어, dNTP). 다른 한 구현에서, 방법의 단계들은 방법의 하나 이상의 단계와 관련된 하나 이상의 효소가 비활성화될 때(inactivation) 종료될 수 있습니다(예, 중합효소). 효소는 다양한 방법으로 비활성화될 수 있습니다. 예를 들어, 효소는 효소의 구조에 영향을 주는 무작위 사건으로 인해 시간을 두고 효소 활동성을 점차적으로 상실할 수 있고, 또는 효소는 효소 활동의 비활성화를 가속하는 조건에 노출될 수도 있습니다(예를 들어, 고열, 높은 수준의 pH, 등등).

일부 구현에서, 1차 핵산은 단일 가닥 또는 2중 가닥이 될 수도 있습니다. 단일 가닥 1차 핵산을 본 문서에서 "1차 폴리뉴클레오티드(primary polynucleotide)"라고 부를 수도 있습니다. 1차 핵산은 선형(linear) 또는 원형(circular)이 될 수도 있습니다. 1차 핵산에는 핵산 주형이 들어 있을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 1차 핵산 전체가 핵산 주형일 수도 있습니다. 다른 구현에서, 1차 핵산에는 핵산 주형의 일부가 아닌 하나 이상의 뉴클레오티드가 포함될 수도 있습니다(예를 들어, 1차 핵산은 1차 핵산 속에 들어 있는 핵산 주형 보다 길이가 더 길 수도 있습니다). 일부 구현에서, 1차 핵산에는 핵산 주형의 복사본이 둘 또는 그 이상 들어 있을 수도 있습니다. 1차 핵산에는 DNA, RNA 또는 이런 것들의 혼합물이 들어 있을 수도 있습니다. 2중가닥 선형 1차 핵산에는 둔단(blunt ends) 또는 접착단(sticky ends)이 있을 수도 있습니다("접착단(sticky ends)"은 하나 이상의 짝지어 지지 않은 뉴클레오티드(unpaired nucleotides)가 있는, 돌출 가닥(overhanging strand)이 있는 말단을 뜻합니다).

1차 핵산은 임의 길이의 뉴클레오티드로 구성될 수 있습니다. 예를 들어, 1차 핵산의 뉴클레오티드 길이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500이 될 수도 있습니다. 다른 한 예에서, 1차 핵산의 뉴클레오티드 길이(개수)는 2 ~ 100,000 개 사이, 5 ~ 100,000 개 사이, 10 ~ 100,000 개 사이, 15 ~ 100,000 개 사이, 20 ~ 100,000 개 사이, 25 ~ 100,000 개 사이, 30 ~ 100,000 개 사이, 50 ~ 100,000 개 사이, 70 ~ 100,000 개 사이, 100 ~ 100,000 개 사이, 200 ~ 100,000 개 사이, 2 ~ 10,000 개 사이, 5 ~ 10,000 개 사이, 10 ~ 10,000 개 사이, 15 ~ 10,000 개 사이, 20 ~ 10,000 개 사이, 25 ~ 10,000 개 사이, 30 ~ 10,000 개 사이, 50 ~ 10,000 개 사이, 70 ~ 10,000 개 사이, 100 ~ 10,000 개 사이, 200 ~ 10,000 개 사이, 2 ~ 5,000 개 사이, 5 ~ 5,000 개 사이, 10 ~ 5,000 개 사이, 15 ~ 5,000 개 사이, 20 ~ 5,000 개 사이, 25 ~ 5,000 개 사이, 30 ~ 5,000 개 사이, 50 ~ 5,000 개 사이, 70 ~ 5,000 개 사이, 100 ~ 5,000 개 사이, 200 ~ 5,000 개 사이, 2 ~ 3,000 개 사이, 5 ~ 3,000 개 사이, 10 ~ 3,000 개 사이, 15 ~ 3,000 개 사이, 20 ~ 3,000 개 사이, 25 ~ 3,000 개 사이, 30 ~ 3,000 개 사이, 50 ~ 3,000 개 사이, 70 ~ 3,000 개 사이, 100 ~ 3,000 개 사이, 200 ~ 3,000 개 사이, 2 ~ 1,000 개 사이, 5 ~ 1,000 개 사이, 10 ~ 1,000 개 사이, 15 ~ 1,000 개 사이, 20 ~ 1,000 개 사이, 25 ~ 1,000 개 사이, 30 ~ 1,000 개 사이, 50 ~ 1,000 개 사이, 70 ~ 1,000 개 사이, 100 ~ 1,000 개 사이, 200 ~ 1,000 개 사이, 2 ~ 500 개 사이, 5 ~ 500 개 사이, 10 ~ 500 개 사이, 15 ~ 500 개 사이, 20 ~ 500 개 사이, 25 ~ 500 개 사이, 30 ~ 500 개 사이, 50 ~ 500 개 사이, 70 ~ 500 개 사이, 100 ~ 500 개 사이 또는 200 ~ 500 개 사이가 될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 핵산 주형은 단일 가닥 또는 2중 가닥이 될 수도 있습니다. 핵산 주형의 단일 가닥을 본 문서에서 "폴리뉴클레오티드 주형(polynucleotide template)"이라고 부를 수도 있습니다. 본 문서에서 "폴리뉴클레오티드 주형(polynucleotide template)"이라는 말에는 상보 서열과 결합되는 것을 배제하지는 않습니다. 다시 말해서, "폴리뉴클레오티드 주형"은, 예를 들어, 단일 가닥 핵산 주형 전체가 될 수도 있고 2중가닥 핵산 주형의 한 가닥이 될 수도 있습니다. 핵산 주형은 1차 핵산 분자에 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 핵산 주형은 1차 핵산 분자 전체를 구성할 수도 있습니다. 다른 구현에서, 핵산 주형은 핵산 주형의 일부분이 아닌 하나 이상의 뉴클레오티드가 들어 있는 1차 핵산에 포함될 수도 있습니다(예를 들어, 핵산 주형은 핵산 주형을 포함하고 있는 1차 핵산 보다 길이가 짧을 수도 있습니다).

핵산 주형은 임의 길이의 뉴클레오티드로 구성될 수 있습니다. 예를 들어, 핵산 주형의 뉴클레오티드 길이(개수)는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개가 될 수도 있습니다. 다른 한 예에서, 핵산 주형의 뉴클레오티드 길이(개수)는 2 ~ 100,000 개 사이, 5 ~ 100,000 개 사이, 10 ~ 100,000 개 사이, 15 ~ 100,000 개 사이, 20 ~ 100,000 개 사이, 25 ~ 100,000 개 사이, 30 ~ 100,000 개 사이, 50 ~ 100,000 개 사이, 70 ~ 100,000 개 사이, 100 ~ 100,000 개 사이, 200 ~ 100,000 개 사이, 2 ~ 10,000 개 사이, 5 ~ 10,000 개 사이, 10 ~ 10,000 개 사이, 15 ~ 10,000 개 사이, 20 ~ 10,000 개 사이, 25 ~ 10,000 개 사이, 30 ~ 10,000 개 사이, 50 ~ 10,000 개 사이, 70 ~ 10,000 개 사이, 100 ~ 10,000 개 사이, 200 ~ 10,000 개 사이, 2 ~ 5,000 개 사이, 5 ~ 5,000 개 사이, 10 ~ 5,000 개 사이, 15 ~ 5,000 개 사이, 20 ~ 5,000 개 사이, 25 ~ 5,000 개 사이, 30 ~ 5,000 개 사이, 50 ~ 5,000 개 사이, 70 ~ 5,000 개 사이, 100 ~ 5,000 개 사이, 200 ~ 5,000 개 사이, 2 ~ 3,000 개 사이, 5 ~ 3,000 개 사이, 10 ~ 3,000 개 사이, 15 ~ 3,000 개 사이, 20 ~ 3,000 개 사이, 25 ~ 3,000 개 사이, 30 ~ 3,000 개 사이, 50 ~ 3,000 개 사이, 70 ~ 3,000 개 사이, 100 ~ 3,000 개 사이, 200 ~ 3,000 개 사이, 2 ~ 1,000 개 사이, 5 ~ 1,000 개 사이, 10 ~ 1,000 개 사이, 15 ~ 1,000 개 사이, 20 ~ 1,000 개 사이, 25 ~ 1,000 개 사이, 30 ~ 1,000 개 사이, 50 ~ 1,000 개 사이, 70 ~ 1,000 개 사이, 100 ~ 1,000 개 사이, 200 ~ 1,000 개 사이, 2 ~ 500 개 사이, 5 ~ 500 개 사이, 10 ~ 500 개 사이, 15 ~ 500 개 사이, 20 ~ 500 개 사이, 25 ~ 500 개 사이, 30 ~ 500 개 사이, 50 ~ 500 개 사이, 70 ~ 500 개 사이, 100 ~ 500 개 사이 또는 200 ~ 500 개 사이가 될 수도 있습니다.

본 문서에 사용된 "프라이머(primer)"는 i) 원본 핵산 가닥과 교접할 수 있고(hybridizing) ii) 새로운 핵산 가닥에 대해 합성 시발점(point of initiation) 역할을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 뜻할 수도 있습니다. 여기에서, 새로운 핵산 가닥은 프라이머의 연장 결과물이고 원본 가닥에 대해 상보적입니다. 프라이머에는 3' 말단에 자유 -OH 그룹이 있을 수 있으며, 이것은 연장 결과물에 대한 합성 원점(origin of synthesis) 역할을 할 수도 있습니다.

프라이머에는 표준 뉴클레오티드[예를 들어, 표준 DNA 디옥시리보뉴클레오티드(디옥시아데노신 1인산염, 디옥시구아노신 1인산염, 티미딘 1인산염, 디옥시시티딘 1인산염) 또는 표준 RNA 리보뉴클레오티드(아데노신 1인산염, 구아노신 1인산염, 우리딘 1인산염, 시티딘 1인산염)], 대체 뉴클레오티드(예, 이노신), 수정 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사물 또는 이런 것들의 조합이 포함될 수도 있습니다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)에는 펩티드 핵산, 모폴리노(morpholinos, 예를 들어, 포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고, phosphorodiamidate morpholino oligos), 잠김 핵산[예를 들어, Kaur, H, et. al, Biochemistry 45 (23), 7347-55 (2006) 참조], 글리콜 핵산 또는 트레오스 핵산(threose nucleic acids)이 포함될 수도 있습니다. 프라이머에는, 예를 들어, 포스포디에스테라제 결합(phosphodiester linkages), 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkages, 비가교(non-bridging) O가 황으로 교체됨) 또는 펩티드 결합(펩티드 핵산의 일부)을 포함하여, 백본(backbone)이 있습니다. 본 문서에서 대체 뉴클레오티드, 수정 뉴클레오티드 및 뉴클레오 유사물을 총체적으로 "비표준 뉴클레오티드(non-standard nucleotides)"로 부를 수도 있습니다.

프라이머에 비표준 뉴클레오티드가 있으면 프라이머의 다양한 특성에 영향을 줄 수도 있습니다. 일부 구현에서, 프라이머에 비표준 뉴클레오티드를 포함시키면 상보 서열에 대한 프라이머의 열역학적 안정성(thermodynamic stability)을 증가시키거나 감소시킬 수도 있습니다. 예를 들어, 열역학적 안정성이 증가된 프라이머에는 잠김 핵산(locked nucleic acid)이 들어 있을 수도 있습니다. 열역학적 안정성이 줄어든 프라이머에는, 예를 들어, 이노신(inosine, Auer et al., Nucl. Acids Res. 24; 5021-5025 (1996)에 설명되어 있음) 또는 카복실산(carboxylic acid) 같은 음전하 화학 그룹이 들어 있을 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머는 임의의 길이가 될 수도 있습니다. 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머에는 동일한 개수의 뉴클레오티드 또는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 뉴클레오티드 길이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개가 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 뉴클레오티드 길이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개 이하가 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 뉴클레오티드 길이는 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750 또는 1000 개에서 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개 사이의 범위에서 선택한 길이가 될 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머의 꼬리 영역은 임의의 길이가 될 수도 있습니다. 일반적으로, 동일한 주형으로 향하는 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 같은 수의 뉴클레오티드가 들어 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개가 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개 이하가 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이는 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750 또는 1000 개에서 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개 사이의 범위에서 선택한 길이가 될 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역은 임의의 길이가 될 수도 있습니다. 동일한 주형으로 향하는 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역에는 같은 개수의 뉴클레오티드 또는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드가 들어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역의 뉴클레오티드 길이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개가 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역의 뉴클레오티드 길이는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개 이하가 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역의 뉴클레오티드 길이는 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750 또는 1000 개에서 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 750, 1000 또는 1500 개 사이의 범위에서 선택한 길이가 될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 프라이머의 관련 방법 또는 단계에서 사용하는 온도에서 프라이머와 보체(complement)가 충분히 안정적이고 구체적으로 서냉결합할 수 있도록, 프라이머는 임의의 길이가 될 수 있고 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있습니다. 프라이머의 원하는 정확한 길이는 반응 온도, 프라이머의 화학적 구성성분, 프라이머의 관련 반응 등을 포함하여 여러 가지 요소에 의해 달라집니다. 일부 구현에서, 프라이머의 관련 방법 또는 단계에서 사용하는 온도에서 프라이머의 주형 결합 영역과 보체(complement)가 충분히 안정적이고 구체적으로 서냉결합할 수 있도록, 프라이머의 주형 결합 영역은 임의의 길이가 될 수 있고 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있습니다. 프라이머의 주형 결합 영역의 원하는 정확한 길이는 반응 온도, 프라이머의 주형 결합 영역의 화학적 구성성분, 프라이머의 관련 반응 등을 포함하여 여러 가지 요소에 의해 달라집니다. 프라이머에 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드가 포함되면, 본 문서에 제공된 방법에 사용하기 위해, 비표준 뉴클레오티드가 없는 해당 프라이머의 길이와 비교하여, 프라이머의 원하는 길이를 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 본 문서에 제공된 방법에서, 특정 녹는 온도("Tm")가 있는 프라이머가 바람직할 경우, 일부 구현에서, 선택한 용융 온도의 프라이머의 길이는 해당 프라이머에 일부 비표준 뉴클레오티드가 포함되어 있을 경우, 표준 뉴클레오티드만 들어 있는 프라이머와 비교하여, 길이가 더 짧을 수도 있습니다. 일반적으로, 뉴클레오티드 서열의 "녹는 온도"는 뉴클레오티드 서열이 있는 핵산의 50%가 상보 서열(즉, 2중가닥 분자)과 염기 쌍(based paired)을 이루고, 뉴클레오티드 서열이 있는 핵산의 50%가 단일 가닥 형태로 있는 온도를 뜻합니다.

본 문서에 제공된 프라이머는 알맞은 방법을 사용하여 준비할 수 있습니다. 예를 들어, 프라이머는 화학적으로 합성할 수도 있습니다. 다른 한 예에서, 자연 발생 핵산은 단리될 수 있고, 쪼개질 수도 있고(예를 들어, 제한 효소로) 및/또는 변경되어 본 문서에 설명된 프라이머를 생성하거나 프라이머의 일부가 될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 표식을 프라이머에 부착할 수도 있습니다. 표식에는, 예를 들어, 결합 리간드(예, 디곡신(digoxin) 또는 비오틴(biotin)), 효소, 형광 분자 / 형광단, 발광 분자, 소광제 분자(quencher molecules) 또는 방사성 동위원소 등이 포함됩니다. 다른 구현에서, 올리고뉴클레오티드의 염기는

2-aminopurine 같은 형광 유사체(fluorescent analog)에 의해 교체될 수도 있습니다(예를 들어, Proc.Acad. Sci. USA, 91, 6644―6648 (1994), 이 문서는 참조에 의해 그 자체로서 본 문서에 통합되었습니다).

일부 구현에서, i) 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 주형 결합 영역이 핵산 주형의 가닥에 서냉결합하고, ii) 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물과 서냉결합하고, iii) 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 주형 결합 영역이 두 번째 프라이머의 연장 결과물에 서냉결합하거나, 또는 iv) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역과 서냉결합하여, 이런 가닥들이 들어 있는 교차 구조(cross-over)를 생성하기 위한 조건들에서, 각각의 조건( i), ii), iii) 또는 iv) 조건)에는, 2중가닥 분자의 가닥들 사이에 프라이머 또는 서로 다른 핵산 가닥이 들어 갈 수 있고, 프라이머 또는 서로 다른 핵산 가닥이 열려 있는 2중가닥 핵산 분자의 가닥들 중 하나와 서냉결합하는 데 충분한 정도로, 2중가닥 핵산 분자들의 가닥들이 "호흡(breathe)"(즉, 염기 쌍과 결합된 수소 결합의 국부 파열이 발생하는 기간을 줌)할 수 있는 온도에서 핵산을 배양하는 것이 포함될 수 있습니다. 일부 구현에서, 방법 또는 단계는 적어도 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90 또는 95 C의 온도에서 수행하거나 배양될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 방법 또는 단계는 적어도 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90 또는 95 C 이하의 온도에서 수행하거나 배양될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 방법 또는 단계는 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 90 C와 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90 또는 95 C 사이의 온도에서 수행하거나 배양될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 단계에 대해, 잠재적으로 쌍을 이룬 뉴클레오티드 가닥들 또는 이런 것들의 영역의 녹는 온도(Tm) 이하의 온도에서 단계 또는 방법을 수행합니다(예를 들어, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 핵산 주형의 첫 번째 가닥과 쌍을 이룰 경우, 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물과 쌍을 이룰 경우, 첫 번째 프라이머가 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 쌍을 이룰 경우, 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 보체와 쌍을 이룰 경우, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 보체와 쌍을 이룰 경우, 등등). 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 단계에 대해, 잠재적으로 쌍을 이룬 뉴클레오티드 가닥들 또는 이런 것들의 영역의 녹는 온도(Tm) 이상의 온도에서 단계 또는 방법을 수행합니다(예를 들어, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 핵산 주형의 첫 번째 가닥과 쌍을 이룰 경우, 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물과 쌍을 이룰 경우, 첫 번째 프라이머가 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 쌍을 이룰 경우, 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 보체와 쌍을 이룰 경우, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 보체와 쌍을 이룰 경우, 등등). 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 단계에 대해, 잠재적으로 쌍을 이룬 뉴클레오티드 가닥들 또는 이런 것들의 영역의 녹는 온도(Tm)의 +/- 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 또는 25 C 내의 온도에서 단계 또는 방법을 수행합니다(예를 들어, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 핵산 주형의 첫 번째 가닥과 쌍을 이룰 경우, 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물과 쌍을 이룰 경우, 첫 번째 프라이머가 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 쌍을 이룰 경우, 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 보체와 쌍을 이룰 경우, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 보체와 쌍을 이룰 경우, 등등).

일부 구현에서, 핵산 중합효소(nucleic acid polymerase)가 포함된 방법 또는 구성물이 제공될 수 있습니다. 중합효소는 프라이머의 연장 결과물을 생성할 수도 있습니다. 프라이머와 프라이머의 연장 결과물은 주형 핵산 가닥에 대해 상보적일 수도 있습니다. 일반적으로, 핵산 중합효소는 프라이머의 3' 말단에서 프라이머의 연장 결과물의 합성을 시작합니다. 일부 구현에서, DNA 중합효소가 포함된 방법 또는 구성물이 제공될 수 있습니다. 본 문서에서 사용된 "DNA 중합효소(DNA polymerase)"는 DNA 주형에 대해 1차 또는 배타적 중합효소 활동이 있는 핵산 중합효소를 뜻합니다. 일부 구현에서, 역전사효소(reverse transcriptase)가 포함된 방법 또는 구성물이 제공될 수 있습니다. 본 문서에서 사용된 "역전사효소(reverse transcriptase)"는 RNA 주형으로부터 DNA 가닥을 합성할 수 있는 핵산 중합효소를 뜻합니다. 일부 구현에서, RNA 중합효소가 포함된 방법 또는 구성물이 제공될 수 있습니다. 본 문서에서 사용된 "RNA 중합효소"는 DNA 또는 RNA 주형으로부터 RNA 가닥을 합성할 수 있는 핵산 중합효소를 뜻합니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 중합효소에는 가닥 치환 활성(strand displacement activity)이 있을 수 있습니다. 가닥 치환 활성이 있는 중합효소에는, 예를 들어, exo-Bca DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, Klenow Fragment of E. coli DNA 중합효소 I, VentR DNA 중합효소, Deep VentR DNA 중합효소, 9°Nm DNA 중합효소, Bst 2.0 DNA 중합효소, 및 Large Fragment of Bst DNA 중합효소가 포함됩니다. 가닥 치환 활성이 있는 다른 중합효소도 사용할 수 있습니다.

수정된 중합효소에 서열 종속적인 핵산 합성 활동이 있을 경우, 수정된 중합효소도 본 문서에 제공된 방법과 구성물에 대해 사용할 수 있습니다. 중합효소의 수정된 버전("수정된 중합효소")에는, 예를 들어, 중합효소의 부모 버전의 서열과는 다른 100 개 또는 이하, 70 개 또는 이하, 50 개 또는 이하, 40 개 또는 이하, 30 개 또는 이하, 20 개 또는 이하, 10 개 또는 이하, 5 개 또는 이하, 4 개 또는 이하, 3 개 또는 이하, 2 개 또는 이하 또는 1 개의 아미노산이 들어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 중합효소에는 부모 중합효소와는 다른 아미노산이 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 개 많이 또는 적게 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 중합효소에는 부모 중합효소의 조각이 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 중합효소에는 중합효소에서 파생된 부분이나 비중합효소 단백질(non-polymerase protein)에서 파생된 부분이 있는 키메라 폴리펩티드(chimeric polypeptide)가 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 중합효소에는 부모 중합효소와 비교하여, 예를 들어, 증가된 촉매 활동, 증가된 안정성, 증가된 내열성(thermostability)이 있을 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 중합효소는 내열성(thermostable)일 수도 있습니다. 내열성 중합효소는, 예를 들어, 25, 30, 35 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 C 온도에서 반감기(half-life)가 적어도 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180 분이 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 중합효소는 내열성(thermostable)일 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법과 단계는 중합효소 기반 핵산 합성을 지원하는 데 충분한 조건하에서 수행되거나 이런 조건을 포함할 수도 있습니다. 중합효소 기반 핵산 합성에 대한 예시 조건들(example conditions)은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 상기된 Green and Sambrook에 제공되어 있습니다. 중합효소 기반 핵산 합성 반응의 비제한적인 구성요소에는 다음 중에서 하나 또는 그 이상이 포함될 수도 있습니다: 중합효소 효소(예를 들어, 50 마이크로리터 반응 부피 당 0.01-10 단위 효소의 농도, 또는 50 마이크로리터 반응 부피 당 0.01-1, 0.1-10, 0.1-5, 0.5-10, 0.5-5, 0.5-2, 1-10 또는 1-5 단위 사이의 임의 범위의 농도, 여기에서 효소 1 단위에는 75 C에서 30분 동안 dNTP의 15 nmol을 중합 결과물(polymerization product)에 병합하고; 주형(반응 당 적어도 1, 10, 100, 1,000, 10,000 또는 100,000 개의 복사본 농도); 프라이머(예를 들어, 0.01-10 마이크로몰 사이의 농도, 또는 0.01-1, 0.1-10, 0.1-5, 0.5-5 또는 0.5-2 마이크로몰 사이 임의 범위의 농도); dNTP (각각의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 50-500 마이크로몰 사이의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 농도, 또는 각각의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 50-350, 100-500, 100-300, 200-500 또는 300-400 사이의 임의 범위의 농도); 염분(예를 들어, KCl 또는 초산 칼륨으로, 1-200 밀리몰 사이의 농도, 또는 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 10-20, 10-50 또는 10-200 밀리몰 사이의 임의 범위의 농도); 완충제(예를 들어, Tris-HCl 또는 Tris-acetate, pH 7.8 - 8.5, 예를 들어, 1-100 밀리몰 사이의 농도, 또는 1-50, 1-20, 1-10, 1-5, 10-100, 20-100 또는 50-100 밀리몰 사이의 임의 범위의 농도); 마그네슘 이온(예를 들어, 0.1-10 밀리몰 사이의 농도, 또는 0.1-5, 0.1-1, 0.5-10, 0.5-5 또는 0.5-2.5 밀리몰 사이의 임의 범위의 농도). 중합효소 기반 핵산 합성의 비제한적인 추가 구성요소는 반응 속도를 증가할 수 있고, 반응 충실도(fidelity)를 향상하거나 반응에 사용된 효소 또는 DNA의 안정성을 향상시키고 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있습니다: 젤라틴(예를 들어, 0.0001%와 0.1% w/v 사이 농도), BSA(예를 들어, 0.01와 1 마이크로리터 당 마이크로그램 사이 농도), 자당(예를 들어, 0.01 몰과 0.8 몰 사이 농도), 트레할로스(trehalose, 예를 들어, 0.01 몰과 0.8 몰 사이 농도), DMSO (예를 들어, 0.01과 10% v/v 사이 농도), 베타인(betaine, 예를 들어, 0.1 몰과 10 몰 사이 농도), 포름아미드(formamide, 예를 들어, 0.1과 10% v/v 사이 농도), 글리세롤(glycerol, 예를 들어, 0.1과 20% v/v 사이 농도), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, 예를 들어, 0.1과 20% v/v 사이 농도), 비이온성 세제[예를 들어, NP-40 (예를 들어, 0.01과 1% v/v 사이 농도), Tween-20 (예를 들어, 0.01과 1% v/v 사이 농도), Triton X-100 (예를 들어, 0.01과 1% v/v 사이 농도)], 암모늄 이온[예를 들어, 황산 암모늄(예를 들어, 1 밀리몰과 100 밀리몰 사이 농도)] 및 EDTA (예를 들어, 0.001 밀리몰과 0.1 밀리몰 사이 농도). 본 문서에 제공된 중합효소 기반 핵산 합성 반응에는 다른 시약이 존재할 수도 있습니다. 예를 들어, RNA 반응 결과물을 합성하거나 비표준 뉴클레오티드가 들어 있는 반응 결과물을 합성하는 데 충분한 시약을 사용할 수도 있습니다. 중합효소 기반 핵산 합성을 지원하는 데 충분한 조건에는 다양한 온도와 pH 값들이 포함될 수도 있습니다. 예를 들어, 중합효소 기반 핵산 합성 반응의 pH 농도는, 예를 들어, pH 6.0 ~ pH 10.0 사이 범위의 임의의 값 또는 6.5,7, 7.5, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.5, 9 또는 9.5가 될 수도 있습니다. 중합효소 기반 핵산 합성 반응의 온도는 일정하거나 변할 수도 있습니다. 일정한 온도는, 예를 들어, 10 C ~ 95 C 사이 온도 또는 20, 25, 30, 35, 37, 40, 42, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85 C가 될 수도 있습니다. 변하는 온도는, 예를 들어, 10 C ~ 95 C 사이의 둘 이상의 서로 다른 온도가 될 수 있으며 20, 25, 30, 35, 37, 40, 42, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85 C에서 선택한 온도가 될 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 방법은 다양한 온도에서 수행할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 모든 단계와 방법은 동일한 온도에서 수행됩니다. 그러므로, PCR에서 온도 순환은 본 문서에 공개된 방법에서 필요하지 않을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법은 둘 이상의 서로 다른 온도에서 수행될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서 사용하는 시약이 들어 있는 반응 혼합물은 둘 이상의 서로 다른 온도에서 배양됩니다. 일부 예에서, 서로 다른 온도를 선택하여 본 문서에 제공된 방법의 서로 다른 단계의 속도, 정확성 또는 기타 특성을 최적화할 수도 있습니다. 예를 들어, 중합효소의 효소 활동을 증가하기 위해 온도를 선택할 수도 있습니다. 일부 예에서, 특정 온도에 대한 프라이머의 결합 특이성(binding specificity)을 증가하거나 프라이머에 대한 주형의 접근성을 증가하기 위해 다른 온도를 선택할 수도 있습니다(예를 들어, 온도가 높으면 2중 주형 핵산(duplex template nucleic acids)의 분리를 촉진할 수도 있음). 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 모든 단계들은 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 °C 이하의 온도에서 수행될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법은 20-60, 30-70, 40-80, 20-40, 30-50, 40-60, 50-70, 60-80, 30-40, 35-45, 40-50, 45-55, 50-60, 55-65 °C 사이의 온도에서 수행될 수도 있습니다. 특정 구현에서, 표적 핵산이 들어 있는 시료는 본 문서에 제공된 방법을 시작하기 전에 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95 C 이상의 온도로 가열할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 반응 혼합물은 본 문서에 제공된 방법을 시작하기 전에 또는 시작한 후에 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 C 이상의 온도로 1회 가열될 수도 있습니다. 반응 혼합물을 상승된 온도로 가열한 후에, 방법의 나머지 수행 기간 동안 본 문서에 제공된 낮은 온도(예를 들어, 40-70 C 사이)로 유지할 수도 있습니다. 구현에서, 본 문서에 제공된 방법을 시작하기 전에 반응 혼합물 또는 시료를 상승된 온도로 가열하는 경우, 반응 혼합물 또는 시료를 상승된 온도로 가열한 후에 핵산 중합효소를 반응 혼합물 또는 시료에 추가하고, 반응 혼합물 또는 시료를 본 문서에 제공된 낮은 온도로 되돌릴 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 방법은 열순환기(thermocycler)를 사용하거나 사용하지 않고 수행할 수도 있습니다.

한 고려사항으로, 방법의 단계에서 사용하는 효소에 대해 적합하도록 본 문서에 제공된 방법 또는 단계에 사용하는 온도를 선택할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 중합효소가 사용되는 방법에 대해, 중합효소의 활동을 심각하게 손상하지 않도록 반응 온도를 선택할 수 있습니다(예를 들어, 중합효소의 반감기가 적어도 24, 12, 6, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.25 또는 0.1 시간이 되도록 반응 온도를 선택할 수도 있습니다). 그렇지 않은 경우, 방법에서 사용되는 효소의 활동을 손상하는 온도에서 방법을 수행할 수도 있습니다(예를 들어, 반응에서 효소의 반감기가 24, 12, 6, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5, 0.25 또는 0.1 시간 이하가 되도록 반응 온도를 선택할 수도 있습니다). 일부 구현에서, 하나 이상의 효소 활동을 손상하는 온도 또는 기타 조건(예를 들어, pH)에서 방법을 수행할 경우, 손상된 효소의 활동을 보충하기 위해, 방법을 시작한 후에 하나 이상의 간격으로 반응에 추가적인 효소를 추가할 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 하나 이상의 단계는 동일한 반응 용기(예를 들어, 튜브, 팁, 용기, 등등)에서 발생합니다. 일부 예에서, 방법의 모든 단계들은 동일한 반응 용기에서 발생합니다.

본 문서에 제공된 방법에서 사용하는 시약 전체는 반응 시작 시에 함께 제공될 수도 있고, 순차적으로 추가될 수도 있고, 하나, 둘, 또는 그 이상의 단계에서 새로운 시약을 반응에 추가할 수도 있습니다. 일부 상황에서, 반응 과정 동안 반응 용기에 새로운 시약(예를 들어, 효소, 프라이머)을 추가하여, 기질(substrates)에 반응하는 시약의 양을 증가하거나 또는 비활성화된 시약(예를 들어, 효소)의 기능을 대체할 수도 있습니다. 본 문서에 제공된 방법의 반응을 시작한 후에, 하나 이상의 선택한 시간 간격으로 반응에 새로운 시약을 추가할 수도 있습니다(예를 들어, 반응 시작 후 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 45 또는 60 분 후에).

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법의 하나 이상의 단계는 동시에 발생할 수도 있습니다. 예를 들어, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 단일 복사본을 생성한 후에, 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 다수 복사본을 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 단일 복사본으로부터 순차적으로 생성할 수 있습니다. 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 복사본들이 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 단일 복사본으로부터 순차적으로 생성되므로, 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 개별 복사본들은, 예를 들어, 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 형성하기 위한 주형 역할을 할 수 있고, 2차 핵산의 구성성분이 될 수도 있고, 교차 구조(cross-over structure)의 구성성분이 될 수도 있고, 두 번째 프라이머 / 첫 번째 연쇄동일서열 가닥의 연장 결과물의 연장 결과물을 생성하기 위한 시발점이 될 수도 있습니다. 다는 한 예에서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물이 핵산 주형의 첫 번째 가닥으로부터 생성되는 시점과 동시(at the same time)에, 2차 핵산의 두 복사본들은 교차 구조를 형성할 수도 있습니다. 다른 한 예에서, 두 번째 프라이머의 연장 결과물이 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 다른 복사본으로부터 생성되는 시점과 동시에, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물의 한 복사본이 핵산 주형의 첫 번째 가닥으로부터 생성됩니다. 본 문서에 제공된 다른 단계도 동시에 발생할 수도 있습니다. 또한, 2중가닥 핵산 주형이 관련된, 본 문서에 제공된 방법과 구성물에서, 핵산 주형의 한 가닥은 "첫 번째 가닥(first strand)"로 간주되고, 본 문서에 제공된 프라이머 쌍의 한 프라이머는 "첫 번째 프라이머(first primer)"로 간주됩니다. 따라서, 일부 예에서, 2중가닥 핵산의 두 가닥 모두는 본 문서에 제공된 방법에 따라 핵산의 "첫 번째 가닥"으로 동시에 사용될 수도 있으며, 프라이머 쌍의 반대편 프라이머는 다른 "첫 번째 가닥"에 대해 "첫 번째 프라이머" 역할을 할 수도 있습니다. 또한, 본 문서에 제공된 방법에 따라 생성된 다양한 구조체는 본 문서에 제공된 방법의 다른 경로로 선택적으로 들어갈 수도 있습니다. 예를 들어, 구현에서, 첫 번째 2차 핵산은 두 번째 2차 핵산과 짝을 지어 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명한 교차 구조를 형성할 수도 있습니다. 다른 구현에서, 첫 번째 2차 핵산은 첫 번째 프라이머에 의해 침범될 수도 있고, 두 번째 프라이머의 연장 결과물은 첫 번째 프라이머의 새로운 연장 결과물을 생성하기 위한 주형 역할을 할 수도 있습니다. 첫 번째 프라이머의 새로운 연장 결과물을 생성하기 위해, 2차 핵산의 일부인 첫 번째 프라이머의 연장 결과물이 치환됩니다. 다른 한 예에서, 구현에서, 첫 번째 연쇄동일서열은 다른 연쇄동일서열과 짝을 지어 교차 구조를 형성할 수도 있습니다. 다른 구현에서, 첫 번째 연쇄동일서열은 첫 번째 프라이머에 의해 침입받을 수 있고, 첫 번째 연쇄동일서열 가닥은 새로운 두 번째 연쇄동일서열 가닥을 생성하기 위한 주형 역할을 할 수도 있습니다. 새로운 첫 번째 연쇄동일서열 가닥을 생성하기 위해, 연쇄동일서열의 일부인 첫 번째 연쇄동일서열 가닥이 치환됩니다. 본 문서에 제공된 방법을 수행하는 동안 다른 유사한 사건이 발생할 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 반응과 구성물에는 첫 번째 프라이머 및 두 번째 프라이머의 다수 복사본, 1차 핵산, 2차 핵산, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물, 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물, 두 번째 프라이머의 연장 결과물, 교차 구조, 연쇄동일서열, 등등이 포함될 수 있습니다. 따라서, 본 문서에 제공된 방법에는 본 문서에 제공된 다수의 단계가 동시에 발생하고, 이런 단계들이 관련 분자의 다수 복사본에 대해 발생할 수 있는 과정이 포함될 수 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물에 첫 번째와 두 번째 프라이머의 둘 이상의 세트들이 제공되어 있고, 각각의 세트에는 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머가 들어 있고, 여기에서, 서로 다른 프라이머 세트들은 서로 다른 핵산 주형에 대해 상보적입니다. 세트에 들어 있는 첫 번째와 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역은 동일한 2중가닥 핵산 주형의 서로 다른 가닥에 대해 상보적일 수도 있습니다. 일반적으로, 주어진 세트에 들어 있는 첫 번째와 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 동일한 방법 또는 구성물에서 사용하는 다른 프라이머 세트의 첫 번째와 두 번째 프라이머의 꼬리 영역과는 다른 비상보(non-complementary) 서열이 들어 있고, 다른 프라이머 세트의 프라이머 꼬리는 상보적이지 않습니다. 이것은 다른 핵산 주형에서 파생된 가닥이 들어 있는 혼성 교차 구조(hybrid cross-over structures)가 형성되는 것을 방지하기 위해 바람직합니다. 그렇지 않은 경우, 둘 이상의 서로 다른 프라이머 세트에 들어 있는 첫 번째 및 두 번째 프라이머의 꼬리 영역에는 다른 핵산 주형에서 파생된 가닥이 들어 있는 혼성 교차 구조와 연쇄동일서열을 생성하기 위해 상보 서열이 들어 있을 수도 있습니다. 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물에 둘 이상의 프라이머 세트를 포함시키면, 동일한 반응 용기에서 다수의 서로 다른 핵산 주형을 동시에 증폭할 수도 있습니다. 이렇게 하면, 예를 들어, 시료에 들어 있는 다수의 관심 주형을 증폭하고 시료에 들어 있는 다수의 서로 다른 주형의 유무에 대해 분석 검사하는 데 유용합니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서 서로 다른 핵산 주형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 500 개 또는 그 이상을 증폭하거나 핵산 주형의 유무에 대해 분석 검사하기 위해, 첫 번째와 두 번째 프라이머의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 500 개 또는 그 이상의 세트가 제공되었습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 핵산 주형을 신속하게 증폭할 수도 있습니다. 예를 들어, 일부 구현에서, 방법을 시작한 후 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180 분 내에 핵산 주형을 적어도 500 배 증폭할 수도 있습니다. 다른 한 예에서, 일부 구현에서, 방법을 시작한 후 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180 분 내에 핵산 주형을 적어도 10,000 배 증폭할 수도 있습니다. 다른 한 예에서, 일부 구현에서, 방법을 시작한 후 0.1 분, 0.5 분, 1 분, 3 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 90 분, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간 또는 24 시간 내에, 반응 혼합물에 들어 있는 핵산 주형의 원래 양의 적어도 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000 또는 1,000,000 배 증폭할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 방법이 시작될 때, 방법의 첫 번째 단계에 필요한 모든 시약은 해당 방법의 반응 혼합물이 들어 있는 용기에 들어 있습니다. 일부 구현에서, 방법이 시작될 때, 방법의 모든 단계에 필요한 모든 시약은 해당 방법의 반응 혼합물이 들어 있는 용기에 들어 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 핵산 주형을 선형 속도(linear rate) 보다 더 큰 속도로 증폭할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 핵산 주형을 지수 함수 속도로 증폭할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에서, 핵산 주형의 개수는 방법을 시작한 이후 매 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 또는 240 분 마다 적어도 2배 이상으로 증가할 수 있습니다. 일부 구현에서, 방법을 시작하면 반응에 들어 있는 핵산 주형의 원래 양의 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000 또는 10,000,000 배로 증폭할 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 방법에 따라 생성된 연쇄동일서열에 들어 있는 핵산 주형의 다수 복사본의 양은 본 문서에 제공된 방법에 따라 핵산 주형의 신속한 증폭에 영향을 줄 수도 있습니다. 특히, 핵산 주형의 가닥의 다수 복사본들이 단일 연쇄동일서열 가닥에 들어 있을 수 있기 때문에, 단일 연쇄동일서열에 단일 중합효소를 적재하면(loading) 중합효소가 연쇄동일서열 가닥을 따라 이동할 때 핵산 주형의 가닥의 다수 복사본이 생성될 수 있습니다. 일부 상황에서, 핵산 중합효소가 핵산 가닥을 만나고 적재되는 데 걸리는 시간은 증폭 반응의 전반적인 속도에 크게 영향을 줄 수도 있습니다. 예를 들어, 복제 반응 동안 중합효소와 만나는 각 핵산 가닥에 핵산 주형의 단일 가닥의 단일 복사본만 들어 있을 경우, 주형 가닥의 각각의 복사본이 생성된 후에 중합효소는 새로운 주형 가닥을 만나고 새로운 주형 가닥에 적재되어야(load) 할 수도 있습니다. 대조적으로, 연쇄동일서열의 경우, 중합효소가 연쇄동일서열 가닥을 만나 적재되면, 연쇄동일서열 가닥을 떠나지 않거나 다른 가닥에 적재될 필요 없이 주형 가닥의 다수 복사본을 합성할 수도 있습니다.

일부 구현에서, 단일 가닥 또는 2중가닥 RNA 주형으로부터 2중가닥 DNA 연쇄동일서열을 생성하기 위한 방법과 구성물이 제공되었습니다. 역전사효소(reverse transcriptase)(예를 들어, AMV 역전사효소, M-MLV 역전사효소, Superscript II ™ 역전사효소, Superscript III ™ 역전사효소 또는 ThermoScript™ 역전사효소)도 본 문서에 제공된 방법에 포함된 것을 제외하면, 이 방법은 본 문서에 설명된 방식으로 수행할 수 있습니다. 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본이 RNA 주형과 서냉결합하고, 역전사효소가 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 생성하고, 연장 결과물은 역전사 과정(reverse transcription)을 통해 DNA 가닥으로 형성됩니다. RNA 역전사에 대한 방법과 조건은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, RNA: A Laboratory Manual, D. Rio et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2011)에 공개되어 있습니다. 이 문서는 그 자체로 참조에 의해 완전히 통합되었습니다. 역전사효소로 첫 번째 프라이머(DNA 가닥)의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 (RNA 가닥으로부터) 생성한 후에, 연쇄동일서열을 생성하기 위한 나머지 단계는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 것과 동일할 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법과 구성물에는 하나 이상의 "범핑 프라이머(bumping primer)"가 포함될 수도 있습니다. 범핑 프라이머(bumping primers)는 본 문서에 제공된 방법과 구성물에 대해 사용할 수 있으며, 예를 들어, 핵산 주형의 두 번째 가닥이 핵산 주형의 첫 번째 가닥에서 치환되는 속도를 증가시키고, 핵산 주형의 첫 번째 가닥이 첫 번째 프라이머 연장 결과물에서 치환되는 속도를 증가시키거나, 첫 번째 프라이머 연장 결과물이 두 번째 프라이머 연장 결과물에서 치환되는 속도를 증가시켜, 반응 결과물의 생성 특이성 또는 속도를 증가시킬 수 있습니다. 본 문서에 사용된 "범핑 프라이머(bumping primer)"는 핵산 주형의 첫 번째 가닥 또는 두 번째 가닥에 있는 서열에 대해 상보적인 프라이머를 뜻하며, 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머의 주형 결합 영역이 결합되는 동일한 가닥에 있는 서열의 하류(downstream)입니다. 그러므로, 범핑 프라이머는 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머가 서냉결합되는 동일한 핵산 가닥에 서냉결합되고, 범핑 프라이머의 3' 말단은 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머의 5' 말단 방향으로 향합니다(즉, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드와 꼬리 영역). 핵산 중합효소와 함께, 프라이머 연장 결과물의 생성을 지원하는 조건하에서 배양할 때, 범핑 프라이머의 연장 결과물은 범핑 프라이머의 3' 말단으로부터 중합효소에 의해 형성될 수 있습니다. 범핑 프라이머의 3' 말단이 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머의 5' 말단으로 향하기 때문에, 범핑 프라이머의 연장 결과물의 길이가 증가하면, 연장 결과물처럼 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머의 5' 말단과 결국 만날 수 있게 됩니다. 그런 다음, 중합효소는 가닥에서 첫 번째 프라이머 또는 두 번째 프라이머를 치환하고, 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머의 연장 결과물을 치환합니다. 따라서, 범핑 프라이머는 본 문서에 제공된 반응을 가속할 수 있습니다.

일부 구현에서, 하나 이상의 효소, 프라이머 또는 기타 시약이 들어 있는 용기가 제공되었습니다. 용기에는 액체 또는 고체 물질을 지원하거나 담을 수 있는 구조가 포함될 수 있으며, 튜브, 용기, 팁, 등을 포함할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 용기의 벽을 통해 빛이 전달될 수도 있습니다. 용기는 광학적으로 투명할 수도 있습니다. 용기에는 다음 중에서 하나 또는 그 이상이 포함될 수도 있습니다: 예를 들어, 단리된 핵산 중합효소, 단리된 DNA 중합효소, 단리된 역전사효소, 첫 번째 프라이머, 두 번째 프라이머, 핵산 염료, 또는 본 문서의 다른 어는 곳에서 설명되어 있는 핵산 프로브. 용기 내용물의 임의 개수의 복사본이 제공될 수도 있습니다(예를 들어, 첫 번째 복사본, 두 번째 복사본, 세 번째 복사본 등). 용기 내용물은 유체 소통할 수도 있습니다. 일부 구현에서, 용기에는 핵산 주형이 추가적으로 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 용기에는 뉴클레오티드, 완충제, 소금, 물, 또는 핵산 증폭을 위해 본 문서에 제공된 기타 시약이 추가적으로 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 용기에는 둘 이상의 프라이머 세트가 포함될 수 있고, 각각의 프라이머 세트에는 첫 번째와 두 번째 프라이머가 포함되며, 서로 다른 프라이머 세트들은 서로 다른 핵산 주형에 대해 상보적입니다.

본 문서에 제공된 방법에 대해 유용한 둘 이상의 시약들이 하나의 키트로 포장되어 제공될 수 있습니다. 예를 들어, 키트에는 다음 중 둘 또는 그 이상이 포함될 수도 있습니다: 핵산 주형, 첫 번째 프라이머, 두 번째 프라이머, 핵산 중합효소, DNA 중합효소, 역전사효소, 완충제, 핵산 염료, 핵산 프로브 또는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 것과 같은 dNTP. 키트 내에서 둘 이상의 시약들이 별도의 용기에 포장되거나 동일한 용기에 포장되어 있을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 키트에는 뉴클레오티드, 완충제, 소금, 물, 또는 핵산 증폭을 위해 본 문서에 제공된 기타 시약이 추가적으로 포함될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머는 하나의 프라이머 세트로 함께 제공될 수도 있습니다. 프라이머 세트는 독립적인 키트 또는 구성물로 제공될 수도 있고 또는 프라이머 세트는 본 문서에 제공된 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 다른 시약들이 들어 있는 하나의 키트로 제공될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 핵산 라이게이스(nucleic acid ligase)가 포함된 방법 또는 구성물이 제공될 수 있습니다. 라이게이스(ligases)는 뉴클레오티드들 사이에, 일반적으로 한 뉴클레오티드의 5' 인산염과 다른 뉴클레오티드의 3' 히드록실 그룹 사이에, 포스포디에스터 결합(인산(燐酸)이(二)에스터 결합(結合), phosphodiester bonds)의 형성을 촉매합니다. 본 문서에 제공된 반응은, 라이게이스(결합효소, ligase)를 포함하지 않은 반응과 비교하여, 반응에 라이게이스를 포함하면, 표적 핵산을 더 빠른 속도로 증폭할 수 있습니다. 라이게이스는, 예를 들어, 본 문서에 제공된 반응에서 연쇄동일서열의 크기 또는 개수를 증가시킵니다.

핵산 라이게이스에는 E. coli DNA 라이게이스, Taq DNA 라이게이스, T3 DNA 라이게이스, T4 DNA 라이게이스, T7 DNA 라이게이스, Ampligase ™, T4 RNA 라이게이스 1 및 T4 RNA 라이게이스 2가 포함됩니다.

결찰 반응(ligation reaction)을 촉매하기 위해, 특정 라이게이스는 ATP (예, T4 DNA 라이게이스) 또는 NAD+ (E. coli DNA 라이게이스)를 필요로 합니다. 일부 구현에서, 라이게이스는 둔단(blunt end)이 있는 핵산을 결찰(ligate)합니다. 일부 구현에서, 라이게이스는 접착단(sticky end)이 있는 핵산을 결찰(ligate)합니다. 일부 구현에서, 라이게이스는 둔단과 접착단이 모두 있는 핵산을 결찰(ligate)합니다.

수정된 라이게이스가 뉴클레오티드들 사이에 포스포디에스터 결합(phosphodiester bonds)을 형성하는 데 촉매할 수 있을 경우, 수정된 라이게이스도 본 문서에 제공된 방법과 구성물에 대해 사용할 수 있습니다. 라이게이스의 수정된 버전("수정된 라이게이스(modified ligase)")에는, 예를 들어, 라이게이스의 자연 발생적인 부모 버전의 서열과는 다른 100 개 또는 이하, 70 개 또는 이하, 50 개 또는 이하, 40 개 또는 이하, 30 개 또는 이하, 20 개 또는 이하, 10 개 또는 이하, 5 개 또는 이하, 4 개 또는 이하, 3 개 또는 이하, 2 개 또는 이하 또는 1 개의 아미노산이 들어 있을 수 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 라이게이스에는 부모 라이게이스와는 다른 아미노산이 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 개 많이 또는 적게 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 라이게이스에는 부모 라이게이스의 조각이 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 라이게이스에는 라이게이스에서 파생된 부분이나 비라이게이스 단백질(non-ligase protein)에서 파생된 부분이 있는 키메라 폴리펩티드(chimeric polypeptide)가 포함될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 라이게이스에는 부모 라이게이스와 비교하여, 예를 들어, 증가된 촉매 활동, 증가된 안정성, 증가된 내열성(thermostability)이 있을 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 라이게이스는 내열성(thermostable)일 수도 있습니다. 내열성 라이게이스는, 예를 들어, 25, 30, 35 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 C 온도에서 반감기(half-life)가 적어도 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180 분이 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 라이게이스는 내열성(thermostable)일 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법과 구성물에 포함된 라이게이스는 다음과 같은 아미노산 서열이 있는 "50-Tth" 수정된 라이게이스가 될 수도 있습니다: LEARTGKKAEELV (서열 ID 번호: 79). 라이게이스 p50-Tth는 적어도 60 C의 온도에서 내열성 둔단 결찰 활동(ligation activity)있습니다. 라이게이스 p50-Tth는 키메라 단백질이며, 이 키메라 단백질에는 His10 함유 선도서열(leader sequence), 인간 NF-kappa-B 단백질 수납번호 NP_003989 아미노산 40-366(이탤릭 글꼴로 표시)의 p50 서열, 유연성 있는 글리신 풍부 서열(glycine rich sequence) 및 써머스 내열성 세균 HBB(Thermus Thermophilus HB8), 수납번호 YP_144363(밑줄로 표시)에서 얻은 Tth DNA 라이게이스 서열이 포함되어 있습니다. 일부 구현에서, 수정된 p50-Tth 라이게이스를 본 문서에 제공된 방법과 구성물에 대해 사용할 수도 있습니다(예를 들어, p50-Tth와는 다른 100 개 또는 이하, 70 개 또는 이하, 50 개 또는 이하, 40 개 또는 이하, 30 개 또는 이하, 20 개 또는 이하, 10 개 또는 이하, 5 개 또는 이하, 4 개 또는 이하, 3 개 또는 이하, 2 개 또는 이하, 또는 1 개의 다른 아미노산과 함께). 구현에서, 본 문서에 제공된 구성물 또는 방법에 대해 사용하는 라이게이스는 미국 잠정 특허 출원 번호 61/802,124(2013년 3월 15일 접수) 또는 PCT 출원 번호 PCT/US14/30003(2014년 3월 15일 접수)에 설명된 라이게이스일 수도 있으며, 이런 특허들은 모든 용도에 대해 그 자체로 참조에 의해 본 문서에 통합되었습니다.

핵산 주형의 증폭 / 주형의 적어도 복사본 2 개가 들어 있는 연쇄동일서열의 생성을 위해 본 문서에 제공된 다양한 방법과 구성물은 등온 및 열순환기 의존 핵산 증폭을 위해 이전에 다른 방법과 구성물을 사용하여 수행했었던 수많은 기능을 수행할 수도 있습니다. 본 문서에 제공된 방법에 따라 증폭하기 위해 사용하는 핵산 주형을 본 문서에서 "표적 핵산(target nucleic acid)" 또는 이와 비슷한 것으로 부릅니다. 본 문서에 제공된 방법과 구성물은, 예를 들어, 관심 핵산의 단리 및 복제, 유전자 발현 분석(gene expression analysis), 핵산의 진단 식별, 새로운 핵산의 합성, 핵산 프로브 합성 및 표식, 피험자의 법의학적 식별(forensic identification), 피험자의 대립유전자 식별(allele identification), 유전자 선별검사(genetic screening), 핵산 서열화 및 관련 응용에 사용할 수 있습니다. 표적 핵산 분자는 단일 가닥 또는 2중가닥 및 DNA 또는 RNA(예, mRNA)를 포함하여 임의의 종류가 될 수도 있습니다. 표적 핵산은 임의의 종류 또는 기능(예를 들어, 단백질 부호화 서열, 조절 서열(regulatory sequence), 인트론(intron) 등등)이 될 수도 있습니다. 표적 핵산은 유전자 전체 또는 부분이 될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물을 사용하여 시료에 들어 있는 표적 핵산의 양을 검출하고(표적의 유무 포함), 선택한 기간 동안 시료에서 형성된 표적의 증폭 결과물의 양을 측정하고, 시료에서 주형의 특정 개수의 복사본을 생성하는 데 필요한 시간을 결정할 수 있습니다. 본 문서에 제공된 방법과 구성물에 사용할 수 있는 시료는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명되어 있으며, 예를 들어, 피험자의 체액, 분비물, 조직 등이 포함될 수 있습니다. 구현에서, 본 문서에 제공된 방법에 따라 시료에 들어 있는 표적 핵산을 증폭하기 위해, 분석 검사에서 시료를 사용하기 전에 시료를 처리할 수도 있습니다. 시료 처리에는 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명한 처리 단계가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 초음파 파괴(sonication) 또는 화학적 용해 단계가 포함될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법은 동일한 반응 용기에 들어 있는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 개 또는 그 이상의 서로 다른 표적 핵산에 대해 분석 검사를 동시에 수행하기 위해 사용할 수도 있습니다. 일반적으로, 관심 표적 핵산 각각에 대해, 첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머가 제공되고, 각각은 핵산 표적의 가닥에 대해 상보적이거나, 핵산 표적의 보체(complment)일 수도 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 표적 핵산에 들어 있는 검출 서열 및 서로 다른 형광단에 대해 서열 특이성이 있는 핵산 프로브를 사용하여, 동일한 용기에서 서로 다른 표적 핵산을 증폭하는 것을 모니터링할 수 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법 또는 구성물을 사용하여 표적 핵산에 들어 있는 특정 관심 뉴클레오티드의 유무를 검출할 수 있습니다(예를 들어, 돌연변이 또는 SNP의 경우). 예를 들어, 관심 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 인접한 표적 핵산의 영역과 선택적으로 결합하는, 첫 번째 또는 두 번째 프라이머를 선택할 수도 있습니다. 프라이머는 선택적으로 i) 관심 뉴클레오티드가 영역에 들어 있을 때 영역과 결합하거나 또는 ii) 관심 뉴클레오티드가 영역에 들어 있을 때 영역과 결합하지 않도록 고안할 수 있습니다. 본 문서에 설명된 방법을 선택한 프라이머에 대해 수행할 수 있으며, 증폭 반응의 결과는 표적 핵산에 들어 있는 관심 뉴클레오티드의 유무에 대한 정보를 제공할 수도 있습니다. 예를 들어, 특정 관심 뉴클레오티드(예를 들어, 돌연변이)가 들어 있는 표적 핵산의 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열이 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역에 들어 있도록, 첫 번째 프라이머의 주형 결합 영역을 고안할 수 있으며, 선택한 프라이머를 사용하여 시료로부터 표적 핵산을 성공적으로 증폭하면, 특정 관심 뉴클레오티드가 들어 있는 표적 핵산이 해당 시료에 들어 있는 것을 나타낼 수도 있습니다. 일부 구현에서, 표적 핵산에 들어 있는 관심 뉴클레오티드를 분석하는 데 사용하는 프라이머에는 프라이머의 3' 말단에 임계 뉴클레오티드(critical nucleotide, 즉, 표적 핵산에서 관심 뉴클레오티드의 위치와 동일한 위치에 해당하는 뉴클레오티드)가 포함될 수도 있습니다. 이런 경우, 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드의 서냉결합은(annealing) 표적 핵산의 관심 뉴클레오티드의 유무에 따라 달라집니다. 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드가 표적 핵산의 뉴클레오티드와 서냉결합하지 않을 경우(예를 들어, 뉴클레오티드들 간의 불일치로 인해), 이런 불일치는 핵산 중합효소가 프라이머로부터 연장 결과물을 생성하는 것을 심각하게 손상할 수도 있습니다. 따라서, 일부 구현에서, 관심 뉴클레오티드에 대응하는 3' 말단 뉴클레오티드가 있는 프라이머는 표적 핵산에 특정 뉴클레오티드의 유무를 결정하는 데 유용할 수도 있습니다. 이런 구현의 일부 상황에서, 표적 핵산에 들어 있는 관심 뉴클레오티드에 대해 상보적이도록, 프라이머의 3' 말단에 있는 임계 뉴클레오티드(critical nucleotide)를 선택할 수 있으며, 일부 다른 상황에서, 표적 핵산에 들어 있는 관심 뉴클레오티드에 대해 비상보적이도록(non-complementary), 프라이머의 3' 말단에 있는 임계 뉴클레오티드(critical nucleotide)를 선택할 수도 있습니다. 관심 뉴클레오티드는, 예를 들어, 표적 핵산의 야생형(wild-type) 형태일 수도 있고, 돌연변이 형태일 수도 있고 또는 다변형(polymorphism)일 수도 있습니다.

본 문서에 제공된 방법 및 구성물은 핵산이 들어 있을 수도 있는 시료에서 핵산을 증폭하는 데 사용할 수 있습니다. 시료의 예에는 다양한 종류의 유체 시료가 포함될 수 있습니다. 일부 예에서, 시료는 피험자의 체액 시료일 수도 있습니다. 시료에는 하나 이상의 유체 성분이 들어 있을 수 있습니다. 일부 예에서, 고체 또는 반고체(semi-solid) 시료가 제공될 수도 있습니다. 시료에는 피험자로부터 수집한 조직이 포함되어 있을 수도 있습니다. 시료에는 피험자의 체액, 분비물 또는 조직이 들어 있을 수도 있습니다. 시료는 생체시료가 될 수도 있습니다. 생체 시료는 체액, 분비물 또는 조직 시료가 될 수도 있습니다. 생체 시료의 예에는 다음이 포함되나 이런 것들에만 국한되지는 않습니다: 혈액, 혈청, 타액, 소변, 위액 및 소화액, 눈물, 대변, 정액, 질액, 종양 조직에서 파생된 간질액, 안구액, 땀, 점액, 귀지, 오일, 선분비물(glandular secretions), 호흡, 척수액, 머리카락(체모), 손톱, 피부 세포, 혈장, 코 면봉 또는 코인두 세척액(nasopharyngeal wash), 척수액, 뇌척수액, 조직, 정액, 질액, 인후 면봉(throat swab), 생검, 태수(placental fluid), 양수(amniotic fluid), 제대혈, 림프액(lymphatic fluids), 공동액(cavity fluids), 가래, 점액, 고름, 미생물총(microbiota), 태변, 모유 및 기타 배설물이 포함됩니다. 생검, 태수, 양수, 제대혈, 림프액, 강액(cavity fluids), 가래, 고름, 미생물총(microbiota), 태변, 모유 또는 기타 분비물. 시료는 인간 또는 동물에서 제공될 수 있습니다. 시료는 식물, 미생물(예를 들어, 바이러스, 박테리아), 또는 기타 생물학적 물질에서 확보할 수 있습니다.

일부 구현에서, 본 문서에 제공된 방법과 구성물은 서비스 제공 지점에서 수행하거나 사용될 수 있습니다(예를 들어, 피험자의 집 또는 직장, 식료품점, 약국, 진료소, 학교 등등). 본 문서에 제공된 방법과 구성물은 피험자에 대한 진단 또는 치료를 위해 피험자로부터 확보한 시료에 들어 있는 핵산을 신속하게 증폭할 수 있습니다. 예를 들어, 본 문서에 제공된 방법과 구성물은 바이러스(예, 인플루엔자) 또는 박테리아(예, 연쇄구균(streptococcus)) 같은 병원체의 핵산이 피험자로부터 확보한 시료에 들어 있는지 검사하는 데 사용할 수도 있습니다.

본 문서에서 공개된 분석 검사 및 방법은 시료를 처리하기 위한 장치 또는 시스템 상에서 수행할 수도 있습니다. 본 문서에 공개된 분석 검사와 방법은 시료 처리용 기기 또는 시료 처리용 시스템에 즉시 통합되거나 사용할 수 있으며, 이런 기기 또는 시스템은 자동 분석 검사 기기 또는 자동 분석 검사 시스템이 될 수도 있습니다. 이런 기기 및 이런 시스템은 본 문서에 공개된 방법을 수행하는 데 유용할 수도 있습니다. 예를 들어, 기기는 시료를 받아 들이는 데 유용할 수도 있습니다. 기기는 시료 준비 및 시료 처리에 유용할 수도 있습니다. 기기는 시료에 대해 분석 검사를 수행하는 데 유용할 수도 있습니다. 기기는 시료로부터 데이터를 확보하는 데 유용할 수도 있습니다. 기기는 시료에서 확보한 데이터를 전송하는 데 유용할 수도 있습니다. 기기는 시료 처리 또는 분석 검사 후에 시료를 폐기하는 데 유용할 수도 있습니다.

기기는 시스템의 일부분일 수도 있으며, 시료 처리 기기의 부품일 수도 있습니다. 기기는 시료 처리 기기일 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 시료 수집이 용이하도록 구성되거나 임상 검사를 위해 시료를 준비하도록 구성되거나, 본 문서에 공개된 것처럼, 하나 이상의 시약으로 방법을 수행하도록 구성될 수 있습니다. 시료 처리 기기는 시료로부터 데이터를 확보하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 시료에서 확보한 데이터를 전송하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 시료에서 확보한 데이터를 분석하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 시료에서 확보한 데이터를 분석하기 위해 다른 기기, 검사실, 검사실과 관련 있는 인간과 통신하도록 구성될 수도 있습니다.

시료 처리 기기는 피험자 속에 또는 피험자에게 배치하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 피험자로부터 직접 또는 간접적으로 시료를 받아 들이도록 구성될 수도 있습니다. 시료는, 예를 들어, 혈액 시료(예를 들어, 핑거스틱 또는 정맥천자로부터 확보한 시료 또는 동맥혈 시료), 뇨 시료, 생검 시료, 조직 조각, 대변 시료, 또는 기타 생체 시료가 될 수 있으며; 물 시료, 흙 시료, 식품 시료, 공기 시료; 또는 기타 시료가 될 수도 있습니다. 혈액 시료에는, 예를 들어, 전혈, 혈장 또는 혈청이 포함될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 기기의 하우징을 통해 피험자로부터 시료를 받을 수도 있습니다. 시료 수집은 시료 수집 현장 또는 다른 어느 곳에서 발생할 수도 있습니다. 시료는 시료 수집 현장에 있는 기기에 제공될 수도 있습니다.

일부 구현에서, 시료 처리 기기는 카트리지를 수용하거나 고정하도록 구성될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 시료 처리 기기에는 카트리지가 포함될 수도 있습니다. 카트리지는 시료 처리 기기에서 분리(제거)될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 시료는 시료 처리 기기의 카트리지에 제공될 수도 있습니다. 그렇지 않은 경우, 시료는 시료 처리 기기의 다른 부분에 제공될 수도 있습니다. 카트리지 및/또는 기기에는 시료를 받아 들일 수 있는 시료 수집 유닛이 포함되어 있을 수도 있습니다.

카트리지에는 시료가 포함될 수 있으며, 시료를 처리하거나 검사하는 데 사용하는 시약이 포함될 수도 있고, 시료 처리 또는 검사에 필요한 일회용품 또는 기타 물질이 포함될 수도 있습니다. 카트리지에는 본 문서에 공개된 방법을 수행하기 위해 본 문서에 공개된 시약이 들어 있을 수도 있습니다. 시료 처리 기기에 카트리지를 넣거나 삽입한 후에 카트리지의 하나 이상의 부품은 시료 처리 기기의 다른 부품과 유체 소통(fluid communication)수도 있습니다. 예를 들어, 시료가 카트리지에 수집된 경우, 시료는 시료 처리 기기의 다른 부분으로 이동될 수도 있습니다. 이와 비슷하게, 하나 이상의 시약이 카트리지에 제공된 경우, 시약은 시료 처리 기기의 다른 부분으로 이동하거나, 시료 처리 기기의 다른 부품을 시약으로 가져올 수도 있습니다. 일부 구현에서, 카트리지의 시약 또는 부품이 카트리지의 온보드 상태로 남아 있을 수도 있습니다. 일부 구현에서, 튜브 관리 및 정비(예, 수동 또는 자동 정비)가 필요한 유체 처리 장치(fluidics)가 포함되지 않을 수도 있습니다.

시료 또는 시약은 시료 처리 기기 같은 기기로 이동될 수도 있습니다. 시료 또는 시약은 기기 내에서 이동될 수도 있습니다. 시료 또는 시약의 이런 이동은 카트리지에서 기기로 연결된 유체 도관(fluid pathway) 없이도 수행될 수도 있습니다. 시료 또는 시약의 이런 이동은 기기 내에 연결된 유체 도관(fluid pathway) 없이도 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 시료 또는 시약의 이런 이동은 시료 취급 시스템에 의해 수행될 수도 있습니다(예, 피펫); 예를 들어, 시료, 시약 또는 이런 것의 부분표본(aliquot)은 피펫 팁 같은 입구가 열려 있는 이동 부품으로 흡인되고, 이런 이동 부품은 시료 취급 시스템의 작동과 연결되어 있으며, 시료 취급 시스템은 내부에 시료, 시약 또는 이런 것의 부분표본이 들어 있는 팁을 시료 처리 기기가 있는 위치로 또는 시료 처리 기기 내부로 이동할 수도 있습니다. 시료, 시약 또는 이런 것의 부분표본은 시료 처리 기기가 있는 위치에 또는 시료 처리 기기 내부에 보관될 수도 있습니다. 시료 취급 시스템을 비슷한 방법으로 사용하여 시료 및 시약, 다수의 시약을 혼합할 수도 있습니다. 카트리지의 하나 이상의 부품이 시료 처리 기기의 다른 부분으로 자동으로 이동되거나 그 반대가 될 수도 있습니다.

시료 처리 기기 같은 기기에는 유체 취급 시스템이 들어 있을 수도 있습니다. 유체 취급 시스템은 시료 같은 유체를 이동, 희석, 추출, 부분표본으로 나누기(aliquotting), 혼합 및 기타 작업을 수행하거나 수행하는 데 도움될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 유체 취급 시스템은 기기의 하우징 내부에 들어 있을 수도 있습니다. 유체 취급 시스템을 사용하여 유체를 수집, 배달, 처리 및/또는 이동, 건시약(dry reagent) 용해, 액체 혼합 및/또는 액체와 건시약(dry reagents) 혼합 등을 수행할 수 있으며, 액체가 아닌 성분, 시약 또는 물질을 수집, 배달, 처리 및/또는 이동할 수도 있습니다. 유체는 시료, 시약, 희석제, 세척액, 염료, 기기에서 사용할 수 있는 기타 유체가 될 수 있으며, 이런 유체에는 균일한 유체, 서로 다른 액체, 에멀젼(emulsions), 현탁액 및 기타 유체가 포함되나 이런 것들에만 국한되지는 않습니다. 제한 없이 피펫을 포함하여, 유체 취급 시스템은 기기 주위에서 (유체가 들어 있거나 들어 있지 않은) 용기를 이동하는 데 사용할 수도 있습니다. 유체 취급 시스템은 유체를 흡인하거나 분배할 수도 있습니다. 시료에는 유체 내의 부유물(floating)인 하나 이상의 미립 조각(particulate) 또는 고체 물질이 포함될 수도 있습니다.

구현에서, 유체 취급 시스템에는 피펫, 피펫 팁, 주사기(syringe), 모세관 또는 기타 부품이 포함될 수도 있습니다. 유체 취급 시스템에는 내부 표면과 외부 표면 및 열린 말단이 있을 수 있습니다. 유체 취급 시스템에는 피펫이 있고, 피펫에는 피펫 몸체와 피펫 노즐이 있고 피펫 팁이 들어 있을 수도 있습니다. 피펫 팁은 피펫 노즐에서 분리 가능하거나 분리할 수 없을 수도 있습니다. 구현에서, 유체 취급 시스템은 피펫 팁과 결합된 피펫을 사용할 수도 있으며, 피펫 팁은 일회용일 수도 있습니다. 팁은 피펫과 결합될 때 유체를 밀봉하는 (유밀) 형태가 될 수도 있습니다. 피펫 팁은 한 번, 두 번 또는 여러 번 사용할 수도 있습니다. 구현에서, 유체 취급 시스템은 유체를 흡인, 분배, 혼합, 이동 또는 기타 방식으로 유체를 취급하기 위해, 피펫 팁이 있거나 없는, 피펫 또는 비슷한 기기를 사용할 수도 있습니다. 유체는 원할 때 유체 취급 시스템으로 분배할 수도 있습니다. 피펫 팁에 있는 구멍으로 유체를 분배하기 전에, 유체가 피펫 팁 내부에 들어 있을 수도 있습니다. 구현 또는 사용 예에서, 유체 전체를 분배할 수도 있습니다; 다른 구현 또는 사용 예에서, 팁에 들어 있는 유체의 일부분만 분배할 수도 있습니다. 피펫은 선택적으로 유체를 흡인할 수도 있습니다. 피펫은 선택한 양의 유체를 흡인할 수도 있습니다. 피펫은 팁 내에서 또는 용기 내에서 유체를 혼합하기 위해 휘젓기(교반) 작동을 수행할 수도 있습니다. 피펫은 유체가 아닌 물질 또는 시약을 혼합하고 포함시키기 위해 연속적은 흐름 루프를 형성하여 팁 또는 용기를 구체화 또는 구현합니다(incorporate). 피펫 팁은 또한 두(2) 부분으로 된 기질 반응(2-part substrate reactions)에서 다수의 유체를 동시에 또는 순차적으로 일정량씩 제공하여 혼합을 용이하게 할 수도 있습니다.

유체 취급 시스템에는 유체가 서로 단리되어 있거나 수압이 서로 독립적인 하나 이상의 독립된 유닛들이 있을 수도 있습니다. 예를 들어, 유체 취급 시스템에는 하나, 둘, 또는 그 이상의 피펫 팁이 포함되어 있을 수도 있습니다. 피펫 팁은 유체를 수용하고 담을 수 있도록 구성되어 있을 수도 있습니다. 팁들은 유체가 서로 단리되어 있거나 수압이 서로 독립적일 수도 있습니다. 각 팁에 들어 있는 유체는 다른 팁에 들어 있는 유체 또는 기기 내의 다른 유체와 단리되어 있거나 수압이 서로 독립적일 수도 있습니다. 유체 단리 또는 수압 독립 유닛은 기기의 다른 부분 및/또는 다른 기기에 대해 상대적으로 이동 가능할 수도 있습니다. 유체 단리 또는 수압 독립 유닛은 개별적으로 이동 가능할 수도 있습니다. 유체 취급 시스템에는 하나 이상의 바닥(base) 또는 지지대가 있을 수도 있습니다. 바닥 또는 지지대는 하나 이상의 피펫 또는 피펫 유닛을 지지할 수도 있습니다. 바닥 또는 지지대는 유체 취급 시스템의 하나 이상의 피펫들을 서로 연결할 수도 있습니다.

시료 처리 기기는 피험자로부터 확보한 시료에 대해 처리 단계 또는 작업을 수행하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리에는 시료 준비가 포함될 수 있으며, 시료 희석, 시료를 부분표본으로 분할, 추출, 시약과 접촉, 여과, 분리, 원심분리, 기타 준비, 처리 작업 또는 단계가 포함될 수 있습니다. 시료 처리 기기는 시료에 대해 하나 이상의 시료 준비 작업 또는 단계를 수행하도록 구성될 수도 있습니다. 선택적으로, 시료는 화학 반응 및/또는 물리적 처리 단계를 위해 준비될 수도 있습니다. 시료 준비 작업 또는 단계에는 다음 중 하나 또는 그 이상이 포함될 수 있습니다: 원심분리, 분리, 여과, 희석, 농축, 정제, 침전, 배양, 피펫 작업, 이송, 크로마토그래피, 세포 용해, 세포측정(cytometry), 분쇄, 빻기, 활성화, 초음파 처리(ultrasonication), 마이크로 컬럼 처리(micro column processing), 자기 비드로 처리, 나노입자로 처리, 또는 기타 시료 준비 작업 또는 단계. 예를 들어, 시료 준비에는 혈액을 혈청으로 또는 미립 조각으로 분리하거나 시료를 다양한 성분으로 분리하는, 하나 이상의 단계가 포함될 수 있습니다. 시료 준비에는 혈액 시료 또는 기타 생체 시료 같은 시료를 희석하거나 및/또는 농축하는, 하나 이상의 단계가 포함될 수 있습니다. 시료 준비에는 시료에 항응고제 또는 기타 성분을 추가하는 것이 포함될 수도 있습니다. 또한, 시료 준비는 시료를 정제하는 것이 포함될 수 있습니다. 구현에서, 모든 시료 처리, 준비, 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기에 의해 수행됩니다. 구현에서, 모든 시료 처리, 준비, 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기의 하우징 내에서 수행됩니다. 구현에서, 대부분의 시료 처리, 준비, 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기에 의해 수행되며, 단일 기기의 하우징 내에서 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 많은 수의 시료 처리, 준비, 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기에 의해 수행되며, 단일 기기의 하우징 내에서 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 시료 처리, 준비, 분석 검사 작업 또는 단계는 두 대 이상의 기기에 의해 수행될 수도 있습니다.

시료 처리 기기는 시료에 대해 하나 이상의 분석 검사를 수행하도록 구성되거나 시료에서 데이터를 확보하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 추가적인 분석 검사뿐만 아니라 본 문서에 제공된 방법을 수행할 수도 있습니다. 분석 검사에는 하나 이상의 물리적 또는 화학적 처리(treatments)가 포함될 수도 있고 하나 이상의 화학적 또는 물리적 반응이 포함될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 체액의 소량 시료에 대해 하나, 둘 이상의 분석 검사를 수행하도록 구성될 수도 있습니다. 본 문서의 다른 어느 곳에서 설명된 부피의 시료에 대해 하나 이상의 화학 반응이 일어날 수도 있습니다. 예를 들어, 펨토미터(femtoliter) 미만의 필(pill)에서 하나 이상의 화학 반응이 일어날 수도 있습니다. 한 예에서, 시료 수집 유닛은 한 방울 또는 그 미만의 혈액 또는 간질액에 해당하는 양의 체액을 받아 들이도록 구성될 수도 있습니다. 구현에서, 시료의 양(부피)은 소량이 될 수도 있으며, 소량은 약 1000 μL 미만, 또는 약 500 μL 미만, 또는 약 250 μL 미만, 또는 약 150 μL 미만, 또는 약 100 μL 미만, 또는 약 75 μL 미만, 또는 약 50 μL 미만, 또는 약 40 μL 미만, 또는 약 20 μL 미만, 또는 약 10 μL 미만, 또는 약 5 μL 미만, 또는 약 1 μL 미만, 또는 약 0.5 μL 미만, 또는 약 0.1 μL 미만, 또는 기타 소량이 될 수도 있습니다. 구현에서, 모든 시료 분석 검사 작업이나 단계는 단일 시료에 대해 수행합니다. 구현에서, 모든 시료 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기에 의해 수행됩니다. 구현에서, 모든 시료 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기의 하우징 내에서 수행됩니다. 구현에서, 대부분의 시료 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기에 의해 수행되며, 단일 기기의 하우징 내에서 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 많은 수의 시료 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기에 의해 수행되며, 단일 기기의 하우징 내에서 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 시료 처리, 준비, 분석 검사 작업 또는 단계는 두 대 이상의 기기에 의해 수행될 수도 있습니다.

시료 처리 기기는 단일 시료에 대해 다수의 분석 검사를 수행하도록 구성될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 시료 처리 기기는 본 문서에 제공된 방법과 하나, 둘, 또는 그 이상의 추가적인 분석 검사를 수행하도록 구성될 수도 있습니다. 구현에서, 시료 처리 기기는 단일 시료에 대해 다수의 분석 검사를 수행하도록 구성될 수도 있습니다. 구현에서, 시료 처리 기기는 단일 시료에 대해 다수의 분석 검사를 수행하도록 구성될 수도 있으며, 여기에서 시료는 소량의 시료입니다. 예를 들어, 소량의 시료는 시료 부피가 약 1000 μL 미만, 또는 약 500 μL 미만, 또는 약 250 μL 미만, 또는 약 150 μL 미만, 또는 약 100 μL 미만, 또는 약 75 μL 미만, 또는 약 50 μL 미만, 또는 약 40 μL 미만, 또는 약 20 μL 미만, 또는 약 10 μL 미만, 또는 약 5 μL 미만, 또는 약 1 μL 미만, 또는 약 0.5 μL 미만, 또는 약 0.1 μL 미만, 또는 기타 소량의 부피가 될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 단일 시료에 대해 다중(multiplexed) 분석 검사를 수행할 수도 있습니다. 다수의 분석 검사는 동시에 수행될 수도 있으며; 순차적으로 수행될 수도 있고; 또는 일부 분석 검사는 동시에 수행되고 다른 분석 검사는 순차적으로 수행될 수도 있습니다. 하나 이상의 통제 분석 검사(control assays) 및/또는 캘리브레이터(calibrators, 분석 검사/검사에 대해 캘리브레이터 통제가 있는 구성 포함)가 기기에 통합될 수도 있으며; 통제 분석 검사 및 캘리브레이터에 대한 분석 검사는 시료에 대한 분석 검사와 동시에 수행될 수도 있고, 시료에 대한 분석 검사 전에 또는 후에 수행될 수도 있으며, 이런 것들의 조합도 가능합니다. 구현에서, 모든 시료 분석 검사 작업 또는 단계는 단일 기기에 의해 수행됩니다. 구현에서, 다수의 분석 검사 작업 또는 단계 전체는 단일 기기의 하우징 내에서 수행됩니다. 구현에서, 다수의 분석 검사의 시료 분석 검사 작업 또는 단계 대부분은 단일 기기에 의해 수행되며, 단일 기기의 하우징 내에서 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 다수의 분석 검사의 시료 분석 검사 작업 또는 단계 상당수는 단일 기기에 의해 수행되며, 단일 기기의 하우징 내에서 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 시료 처리, 준비, 분석 검사 작업 또는 단계는 두 대 이상의 기기에 의해 수행될 수도 있습니다.

구현에서, 다수 분석 검사 전체는 짧은 기간 내에 수행될 수도 있습니다. 구현에서, 이런 짧은 기간은 약 세(3) 시간 미만, 또는 약 두(2) 시간 미만, 또는 약 한(1) 시간 미만, 또는 약 40 분 미만, 또는 약 30 분 미만, 또는 약 25 분 미만, 또는 약 20 분 미만, 또는 약 15 분 미만, 또는 약 10 분 미만, 또는 약 5 분 미만, 또는 약 4 분 미만, 또는 약 3 분 미만, 또는 약 2 분 미만, 또는 약 1 분 미만, 또는 기타 짧은 기간이 될 수도 있습니다.

시료 처리 기기는 시료와 관련된 하나 이상의 신호를 검출하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 시료의 하나 이상의 특성을 식별하도록 구성될 수도 있습니다. 예를 들어, 시료 처리 기기는 시료(예를 들어, 체액, 분비물, 조직 또는 기타 시료)에 들어 있는 하나의 피분석물(예를 들어, 표적 핵산) 또는 다수의 피분석물의 유무 또는 농도를 검출하거나 또는 질병 상태의 유무를 검출하도록 구성될 수도 있습니다. 그렇지 않은 경우, 시료 처리 기기는 시료에 들어 있는 하나 이상의 피분석물(질병 상태를 나타낼 수도 있음)의 유무 또는 농도, 또는 질병 상태를 유무를 검출하기 위해, 분석 가능한 신호 또는 신호들을 검출하도록 구성될 수도 있습니다. 신호는 기기 자체에서 분석되거나 다른 장소에서 분석될 수도 있습니다. 임상 검사의 수행에는 수집한 데이터에 대한 분석 또는 비교가 포함되거나 포함되지 않을 수도 있습니다.

시료를 사용하거나 사용하지 않고 화학 반응이나 기타 처리 단계를 수행할 수도 있습니다. 기기에서 수행할 수 있는 단계, 검사 또는 분석 검사의 예에는 면역 분석 검사, 핵산 분석 검사(예, 본 문서에 제공된 방법), 수용체 기반 분석 검사(receptor-based assay), 세포계산 분석 검사(cytometric assay), 색체 측정 분석 검사(colorimetric assay), 효소 분석 검사, 전기 이동 분석 검사(electrophoretic assay), 전기 화학 분석 검사(electrochemical assay), 분광 분석 검사(spectroscopic assay), 크로마토그래피 분석 검사(chromatographic assay), 현미경 분석 검사, 지형 분석 검사(topographic assay), 열량 측정 분석 검사(calorimetric assay), 비탁 분석 검사(turbidimetric assay), 응집 분석 검사(agglutination assay), 방사선동위원소 분석 검사(radioisotope assay), 점성도 분석 검사(viscometric assay), 응고 분석 검사(coagulation assay), 응고 시간 분석 검사(clotting time assay), 단백질 합성 분석 검사(protein synthesis assay), 조직학 분석 검사(histological assay), 배양 분석 검사(culture assay), 삼투성 분석 검사(osmolarity assay) 및/또는 기타 종류의 분석 검사, 원심분리, 분리, 여과, 희석, 농축, 정화, 침전, 분쇄, 배양, 피펫 작업, 이동, 세포 용해 또는 기타 세포 준비 작업 또는 단계, 또는 이런 것들의 조합이 포함될 수 있으나 이런 것들에만 국한되지는 않습니다. 기기를 사용하여 준비하거나 수행할 수 있는 단계, 검사 또는 분석 검사에는 이미징(imaging), 현미경법, 세포계산법(cytometry), 이미지를 준비 또는 이용하는 기타 기법이 포함됩니다. 기기를 사용하여 준비하거나 수행할 수 있는 단계, 검사 또는 분석 검사에는 조직학(histology), 형태학(morphology), 운동학(kinematics), 역학(dynamics) 등에 대한 평가, 및/또는 시료의 상태에 대한 평가가 포함될 수 있으며, 시료의 상태에 대한 평가에는 세포에 대한 이런 평가가 포함될 수도 있습니다.

기기는 짧은 시간 동안 모든 단계를 기기 내에서(예를 들어, 단일 기기에서 단계 또는 작업 수행)를 수행할 수도 있습니다. 기기는 짧은 시간 동안 단일 시료에 대해 모든 단계를 기기 내에서 수행할 수도 있습니다. 예를 들어, 피험자로부터 시료 수집에서부터 데이터 전송 및/또는 분석까지 약 3 시간 또는 미만, 2 시간 또는 미만, 1 시간 또는 미만, 50 분 또는 미만, 45 분 또는 미만, 40 분 또는 미만, 30 분 또는 미만, 20 분 또는 미만, 15 분 또는 미만, 10 분 또는 미만, 5 분 또는 미만, 4 분 또는 미만, 3 분 또는 미만, 2 분 또는 미만, 1 분 또는 미만 동안 수행할 수도 있습니다. 기기 내에서 시료를 받아 들이고 데이터를 전송할 때까지 및/또는 기기에서 이런 시료에 대해 분석할 때까지 걸리는 시간은 단계 및 검사의 종류와 개수, 시료에 대해 수행하는 분석 검사의 종류에 따라 달라집니다. 예를 들어, 기기 내에서 시료를 받아 들이고 데이터를 전송할 때까지 및/또는 기기에서 이런 시료에 대해 분석할 때까지 걸리는 시간은 약 3 시간 또는 미만, 2 시간 또는 미만, 1 시간 또는 미만, 50 분 또는 미만, 45 분 또는 미만, 40 분 또는 미만, 30 분 또는 미만, 20 분 또는 미만, 15 분 또는 미만, 10 분 또는 미만, 5 분 또는 미만, 4 분 또는 미만, 3 분 또는 미만, 2 분 또는 미만, 1 분 또는 미만 동안 수행할 수도 있습니다.

기기는 시료를 처리 또는 분석한 후에, 생체 시료 같은 시료를 폐기하기 위해 시료를 준비하거나 또는 시료를 폐기하도록 구성할 수도 있습니다.

구현에서, 시료 처리 기기는 시료에서 확보한 데이터를 전송하도록 구성될 수도 있습니다. 구현에서, 시료 처리 기기는 네트워크 상에서 통신하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기에는 네트워크에 연결할 수 있는 통신 모듈이 포함될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 유선 또는 무선으로 네트워크에 연결할 수도 있습니다. 네트워크는 근거리 통신망(LAN) 또는 인터넷 같은 광역 통신망(WAN)이 될 수도 있습니다. 일부 구현에서, 네트워크는 개인 지역 네트워크(personal area network)가 될 수도 있습니다. 네트워크에는 클라우드가 포함될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 중간 기기 없이 네트워크에 연결할 수도 있고, 시료 처리 기기를 네트워크에 연결하는 데 중간 기기(intermediary device)가 필요할 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 네트워크를 통해 다른 기기와 통신할 수도 있으며, 다른 기기는 다양한 네트워크 기기가 될 수 있으며 다음을 포함하나 이런 것들에만 국한되지는 않습니다: 개인용 컴퓨터, 서버 컴퓨터 또는 랩톱 컴퓨터; Palm 기반 기기 또는 Windows CE 기기 같은 개인용 디지털 단말기(PDA); 휴대 전화, 스마트폰(예, iPhone, Android, Blackberry 등) 또는 위치 인식 휴대 전화(예, GPS); 네트워크 접속 로밍 기기 같은 로밍 기기; 무선 이메일 기기 또는 컴퓨터 네트워크와 무선으로 통신할 수 있는 기타 기기 같은 무선 기기; 또는 네트워크에서 통신할 수 있고 전자 거래를 처리할 수 있는 기타 종류의 네트워크 기기. 이런 통신에는 다른 기기에서 액세스할 수도 있는 클라우드 컴퓨팅 인프라 또는 다른 종류의 데이터 저장 장치 인프라에 데이터를 제공하는 것이 포함될 수도 있습니다.

시료 처리 기기는 시료에 대한 데이터를, 예를 들어, 보건 전문가, 보건 전문가의 장소, 검사실 또는 검사실의 협력업체(기관)에 제공할 수도 있습니다. 하나 이상의 검사실, 보건 전문가 또는 피험자는 시료 처리 기기에서 제공된 데이터를 수신하거나 액세스할 수 있는 네트워크를 가지고 있을 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 시료에 대한 데이터를 데이터베이스에 제공하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 시료에 대한 데이터를 전자 의료 기록 시스템, 검사실 정보 시스템, 검사실 자동화 시스템, 다른 시스템 또는 소프트웨어에 제공하도록 구성될 수도 있습니다. 시료 처리 기기는 보고서 형식으로 데이터를 제공할 수도 있습니다.

검사실, 기기, 기타 독립체 또는 소프트웨어는 시료에 대한 데이터를 실시간으로 분석할 수도 있습니다. 소프트웨어 시스템은 화학적 분석 및/또는 병리학적 분석을 수행할 수도 있으며, 이런 분석들을 검사실, 임상 검사 담당자, 해당 전문가들 사이에 분산할 수도 있습니다. 분석에는 시료에 대한 정성적 및/또는 정량적 평가가 포함될 수도 있습니다. 데이터 분석에는 시료에 대한 차후 정성적 및/또는 정량적 평가가 포함될 수 있습니다. 선택적으로, 미가공 데이터, 선처리된 데이터 또는 분석된 데이터를 기반으로 보고서를 생성할 수도 있습니다. 이런 보고서는 시료에서 확보한 데이터, 시료를 제공한 피험자에 대한 신원과 기타 정보, 데이터에 대한 분석, 기타 기밀 정보의 기밀을 유지하는 방식으로 준비될 수도 있습니다. 보고서 및/또는 데이터는 보건 전문가에게 전송될 수도 있습니다. 시료 처리 기기로 확보한 데이터, 이런 데이터의 분석 또는 보고서는 데이터베이스, 전자 의료 기록 시스템, 검사실 정보 시스템, 검사실 자동화 시스템, 다른 시스템 또는 소프트웨어에 제공할 수도 있습니다.

본 문서에 공개된 방법, 구성물 또는 기타 시약에 대해 사용하거나 사용할 수 있는 시약, 분석 검사, 방법, 키트, 기기 및 시스템의 예에 대한 설명 및 공개는, 예를 들어, 미국 특허 8,088,593; 미국 특허 8,380,541; 미국 특허 출원 번호 13/769,798, 2013년 2월 18일 접수; 미국 특허 출원 번호 13/769,779, 2013년 2월 18일 접수; 미국 특허 출원 번호 13/244,947, 2011년 9월 26일 접수; PCT/US2012/57155, 2012년 9월 25일 접수; 미국 특허 출원 번호 13/244,946, 2011년 9월 26일 접수; 미국 특허 출원 번호 13/244,949, 2011년 9월 26일 접수; 및 미국 특허 출원 번호 61/673,245, 2011년 9월 26일 접수, 이런 특허 및 특허 출원의 공개는 그 자체로 참조에 의해 본 문서에 완전하게 통합되었습니다.

본 특허 출원은 미국 특허 가출원 번호 61/800,606(2013년 3월 15일 접수)에 대한 우선권과 이익을 주장하며, 본 공개는 모든 용도에 대해 그 자체로 참조에 의해 본 문서에 완전하게 통합되었습니다.

예

다음 예들은 설명하기 위한 용도이며 본 공개의 내용을 어떠한 방식으로도 제한하지 않음에 유의해야 합니다.

예 1 - 가변 꼬리 영역 길이가 있는 프라이머로 주형 핵산 증폭

본 문서에 공개된 방법은 표적 핵산을 증폭하는 데 사용합니다. 인플루엔자 A 바이러스 적혈구 응집소(hemagglutinin, HA3) 유전자(RNA 분자)의 464 뉴클레오티드 부분인, 표적 핵산 T124A1의 102 뉴클레오티드 부분에 대해 분석 검사하기 위해 반응이 준비되었습니다. T124A1의 뉴클레오티드 서열은 서열 ID 번호: 89에 제공되었습니다. 첫 번째 프라이머("P1")의 변종(variants) 12 개와 두 번째 프라이머("O2")의 변종 12 개를 준비했습니다. 모든 프라이머 변종의 서열은 도 2a에 표시되어 있습니다. 모든 프라이머들에는 길이가 12 개의 뉴클레오티드인 주형 결합 영역이 포함되어 있습니다. 첫 번째 프라이머의 모든 변종의 주형 결합 영역의 서열: CAAACCGTACCAACC (서열 ID 번호: 80) (5'-3' 방향). 두 번째 프라이머의 모든 변종의 주형 결합 영역의 서열: ATGCGGAATGTACC (서열 ID 번호: 81) (5'-3' 방향). 다른 프라이머 변종에는 뉴클레오티드 길이가 8 ~ 22 개 범위의 꼬리 영역, 특히, 뉴클레오티드 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 또는 22 개인 꼬리 영역이 포함되었습니다. 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 염기 서열: CGCCGGATGGCTCTTGGGAAAC (서열 ID 번호: 82) (5'-3' 방향). 염기 서열은 길이 22 개의 뉴클레오티드이고; 첫 번째 프라이머의 짧은 꼬리 영역에는 동일한 서열이 있고, 꼬리 영역의 5' 말단에서 적절한 개수의 뉴클레오티드를 뺀(minus) 길이 입니다(예를 들어, 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이가 18인 프라이머에는 염기 서열과 동일한 서열을 갖고 있지만, 염기 서열의 처음 4 개의 뉴클레오티드(CGCC)를 뺀 길이입니다). 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 염기 서열: GTTTCCCAAGAGCCATCCGGCG (서열 ID 번호: 83) (5'-3' 방향). 염기 서열은 길이 22 개의 뉴클레오티드이고; 첫 번째 프라이머의 짧은 꼬리 영역에는 동일한 서열이 있고, 꼬리 영역의 3' 말단에서 적절한 개수의 뉴클레오티드를 뺀(minus) 길이 입니다(예를 들어, 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이가 18인 프라이머에는 염기 서열과 동일한 서열을 갖고 있지만, 염기 서열의 마지막 4 개의 뉴클레오티드(GGCG)를 뺀 길이입니다).

150 마이크로리터의 반응 혼합물들이 준비되었으며, 각 혼합물에는 다음이 포함되어 있습니다: 50 mM 초산 칼륨, 20 mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM 초산 마그네슘, 1 mM DTT, 30 μg 소혈청알부민(BSA), 0.8 M 베타인, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각 1.4 mM, 2 uM SYTO ® 59 (Life Technologies), 0.8 units / μl Bst DNA 중합효소 (New England BioLabs), 0.016 units / μl AMV 역전사효소 (New England Biolabs), 1 unit / μl murine RNase 억제제 (New England Biolabs), 첫 번째 프라이머 변종 0.8 μM, 두 번째 프라이머 변종 0.8 μM, 마이크로리터 당 T124A1 주형 100,000 개의 복사본, 59 C에서 100 분 동안 CFX 96 Touch instrument (Bio-Rad) 속에서 배양. 도 2b에 표시된, 분석 검사에 대한 변곡점(inflection points)은 CFX Manager 소프트웨어 (Bio-Rad)로 단일 임계값 방법(single-threshold method)을 사용하여 결정되었습니다. X 축에는 반응에 사용된 첫 번째와 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이가 표시되어 있고, Y 축에는 분석 검사의 변곡 시간(단위: 분)이 표시되어 있습니다. 각 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이에 대해 두 개의 인접한 막대 그래프가 표시되어 있습니다: 왼쪽 막대는 주형이 들어 있는 반응의 변곡 시간이고, 오른쪽 막대는 주형이 없는 반응의 변곡 시간입니다[주형 컨트롤 없음("NTC")]. 90 분 이상의 변곡 시간에 대한 막대는 없습니다. 도 2b에 표시된 것처럼, 이런 반응 조건하에서, 뉴클레오티드 개수가 8-15 개인 꼬리 영역이 있는 프라이머, 보다 구체적으로, 8-11 개의 뉴클레오티드는 가장 빠른 변곡 시간을 지원했습니다. 주형 컨트롤이 없는 반응들도 결국 변곡 시간을 보여줍니다; 이것은 시간을 두고 형성된 배경 비특정적 결과물(background non-specific products)이 원인입니다.

예 2 - 가변 꼬리 영역 길이와 가변 주형 결합 영역 길이가 있는 프라이머를 사용한 주형 핵산의 증폭

본 문서에 공개된 방법은 표적 핵산을 증폭하는 데 사용합니다. 상기 예 1에서 설명된 표적 핵산 T124A1을 분석 검사하기 위해 반응이 준비되었습니다. 서로 다른 두 그룹의 첫 번째 프라이머 쌍 세트와 두 번째 프라이머 쌍 세트가 준비되었습니다. 프라이머 쌍의 첫 번째 그룹에서, 각각의 프라이머에는 20 개의 뉴클레오티드가 들어 있는 주형 결합 영역이 들어 있습니다("20 뉴클레오티드 주형 결합 영역" 그룹). 프라이머 쌍의 두 번째 그룹에서, 각각의 프라이머에는 16 개의 뉴클레오티드가 들어 있는 주형 결합 영역이 들어 있습니다("16 뉴클레오티드 주형 결합 영역" 그룹). 각 그룹 내에서 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 및 16 개의 뉴클레오티드가 들어 있는 8 개의 서로 다른 꼬리 영역이 있는 첫 번째 프라이머 세트와 두 번째 프라이머 세트를 준비했습니다. 도 3에는 16 뉴클레오티드 주형 결합 영역 그룹(도 3a)과 20 뉴클레오티드 주형 결합 영역 그룹(도 3b)에 대한 서로 다른 프라이머 쌍 세트의 뉴클레오티드 서열이 표시되어 있습니다. 도 3a와 3b에서, "꼬리" 서열은 꼬리 영역을 뜻하고, "프라이머" 영역은 프라이머의 주형 결합 영역을 뜻합니다. 프라이머 서열은 5'-3' 방향으로 표시되어 있습니다.

110 마이크로리터의 반응 혼합물들이 준비되었으며, 각 혼합물에는 다음이 포함되어 있습니다: 50 mM 초산 칼륨, 20 mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM 초산 마그네슘, 1 mM DTT, 30 μg 소혈청알부민(BSA), 0.8 M 베타인, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각 1.4 mM, 2 uM SYTO ® 59 (Life Technologies), 0.8 units / μl Bst DNA 중합효소 (New England BioLabs), 0.016 units / μl AMV 역전사효소 (New England Biolabs), 1 unit / μl murine RNase 억제제 (New England Biolabs), 첫 번째 프라이머 변종 0.8 μM, 두 번째 프라이머 변종 0.8 μM, 마이크로리터 당 T124A1 주형 100,000 개의 복사본, 56 C에서 100 분 동안 CFX 96 Touch instrument (Bio-Rad) 속에서 배양. 도 3c(20 뉴클레오티드 주형 결합 영역 그룹)와 도 3d(16 뉴클레오티드 주형 결합 영역 그룹)에는 분석 검사에 대한 변곡점이 표시되어 있습니다. 도 3c와 3d 모두에서, X 축에는 반응에 사용된 첫 번째와 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이가 표시되어 있고, Y 축에는 분석 검사의 변곡 시간(단위: 분)이 표시되어 있습니다. 각 꼬리 영역의 뉴클레오티드 길이에 대해 두 개의 인접한 막대 그래프가 표시되어 있습니다: 왼쪽 막대는 주형이 들어 있는 반응의 변곡 시간이고, 오른쪽 막대는 주형이 없는 반응의 변곡 시간입니다. 도 3에 표시된 것처럼, 이런 반응 조건하에서, 상대적으로 짧은 꼬리 영역의 프라이머가 들어 있는 반응은 주형이 들어 있는 반응의 변곡 시간과 주형이 없는 반응의 변곡 시간 사이에, 변곡 시간이 더 빠르고 분리가 더 컸습니다. 예를 들어, 16 bp와 20 bp 프라이머 모두에 대해, 7, 8 또는 9 개의 뉴클레오티드의 꼬리 영역의 프라이머가 들어 있는 반응은 12, 14 또는 16 개의 뉴클레오티드의 꼬리 영역의 프라이머가 들어 있는 반응 보다 변곡 시간이 더 빨랐습니다.

예 3 - 가변 온도에서 주형 핵산 증폭

본 문서에 공개된 방법은 표적 핵산을 증폭하는 데 사용합니다. 상기 예 1에서 설명된 표적 핵산 T124A1을 분석 검사하기 위해 반응이 준비되었습니다. T124A1을 증폭하기 위해 첫 번째 프라이머 "RLX0892" (서열: 5' TTGGGAAACCAAACCGTACCAACC 3')(서열 ID 번호: 20) 및 두 번째 프라이머 "RLX0893" (서열: 5' GTTTCCCAAATGCGGAATGTACC 3')(서열 ID 번호: 32)를 사용했습니다. 이들 프라이머 모두에는 9 뉴클레오티드 꼬리 영역이 있고, RLX0892에는 15 뉴클레오티드 주형 결합 영역이 있고 RLX0893에는 14 뉴클레오티드 주형 결합 영역이 있습니다. RLX0892의 꼬리 영역은 5' TTGGGAAAC 3' (서열 ID 번호: 84)이고 및 RLX0893의 꼬리 영역은 5' GTTTCCCAA 3' (서열 ID 번호: 85)입니다.

80 마이크로리터의 반응 혼합물들이 준비되었으며, 각 혼합물에는 다음이 포함되어 있습니다: 50 mM 초산 칼륨, 20 mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM 초산 마그네슘, 1 mM DTT, 20 μg 소혈청알부민(BSA), 0.8 M 베타딘, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각 1.4 mM, 2 uM SYTO ® 59 (Life Technologies), 0.8 units / μl Bst DNA 중합효소 (New England BioLabs), 0.016 units / μl AMV 역전사효소 (New England Biolabs), 1 unit / μl murine RNase 억제제 (New England Biolabs), 0.8 μM 첫 번째 프라이머 RLX0892, 0.8 μM 두 번째 프라이머 RLX0893, 마이크로리터 당 T124A1 주형 복사본 10,000, 1,000, 100 또는 0 개, 52, 52.7, 54, 55.9, 58.4, 60.3, 61.4 또는 62 C에서 100 분 동안 CFX 96 Touch 기기 (Bio-Rad) 속에서 3회 배양. 분석 검사에 대한 변곡점은 도 4에 표시되어 있습니다. X 축에는 반응의 배양 온도가 표시되어 있고 Y 축에는 분석 검사의 변곡 시간(단위: 분)이 표시되어 있습니다. 각 온도에 대해, 4 개의 인접한 막대 그래프가 왼쪽에서 오른쪽으로 표시되어 있습니다: 10,000 개의 주형 / 마이크로리터, 1000 개의 주형 / 마이크로리터, 100 개의 주형 / 마이크로리터, 또는 주형 컨트롤 없음. 도 4에 표시된 것처럼, 이런 반응 조건하에서, 분석 검사는 온도 52-62 C 전체 범위에서 마이크로리터 당 1000 개의 주형 복사본으로 주형을 효과적으로 증폭했으며, 일부 온도와 마이크로리터 당 100 개의 주형 복사본처럼 낮은 주형 농도에서도 효과적으로 증폭했습니다.

예 4 - 인간 게놈 DNA가 있을 때 주형 핵산 증폭

본 문서에 공개된 방법은 표적 핵산을 증폭하는 데 사용합니다. 인간 DNA가 있을 때 표적 핵산 T124A1(상기됨)을 분석 검사하기 위해 반응이 준비되었습니다. T124A1을 증폭하기 위해 첫 번째 프라이머 "RLX0892"(상기됨)와 두 번째 프라이머 "RLX0893"(상기됨)을 사용했습니다.

160 마이크로리터의 반응 혼합물들이 준비되었으며, 각 혼합물에는 다음이 포함되어 있습니다: 50 mM 초산 칼륨, 20 mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM 초산 마그네슘, 1 mM DTT, 20 μg 소혈청알부민(BSA), 0.8 M 베타딘, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각 1.4 mM, 0.4 x SYTO ® 59 (Life Technologies), 0.8 units / μl Bst DNA 중합효소 (New England BioLabs), 0.016 units / μl AMV 역전사효소 (New England Biolabs), 1 unit / μl murine RNase 억제제 (New England Biolabs), 0.8 μM 첫 번째 프라이머 RLX0892, 0.8 μM 두 번째 프라이머 RLX0893, 마이크로리터 당 T124A1 주형 복사본 1,000, 100 또는 0 개, 0, 1, 2.5, 5 또는 10 나노그램의 인간 게놈 DNA, 56 C에서 100 분 동안 CFX 96 Touch 기기(Bio-Rad)에서 배양. 분석 검사에 대한 변곡점은 도 5에 표시되어 있습니다. X 축에는 반응에 들어 있는 인간 게놈 DNA("hDNA")의 양이 표시되어 있고, Y 축에는 분석 검사의 변곡 시간(단위: 분)이 표시되어 있습니다. hDNA의 각 양(quantity)에 대해, 3 개의 인접한 막대 그래프가 왼쪽에서 오른쪽으로 표시되어 있습니다: 1000 개의 주형 / 마이크로리터, 100 개의 주형 / 마이크로리터, 또는 주형 컨트롤 없음. 도 5에 표시된 것처럼, 이런 반응 조건하에서, 분석 검사는 적어도 10 ng hDNA가 있는 상태에서 마이크로리터 당 1000 개의 주형 복사본을 효과적으로 증폭했습니다. 또한, hDNA를 추가하면, 반응은 5 또는 10 ng hDNA의 농도에서 조차도 NTC 변곡 시간을 상대적으로 적은 양만 감소시킵니다.

예 5 - 바이러스 용해질 용출액에서 주형 핵산 증폭

본 문서에 제공된 방법을 사용하여 표적이 들어 있는 서로 다른 시료의 표적 핵산을 증폭했습니다. 표적 핵산 T124A1을 두 가지 시료에 대해 준비했습니다: 1) 단리된 T124A1 RNA 분자가 들어 있는 시료(예 1에서 처럼) 및 2) 인플루엔자 A H3N2 바이러스 시료의 단리된 핵산이 들어 있는 시료. T124A1은 HA3 유전자의 일부이므로, 인플루엔자 A H3N2 바이러스의 단리된 핵산의 시료에 들어 있을 것으로 예상됩니다. 인플루엔자 A 바이러스 용해질은 제조사의 지시에 따라 Chemagic 바이러스 DNA/RNA 키트(PerkinElmer)를 사용하여 준비되었습니다. 서로 다른 두 시료에 들어 있는 T124A1의 농도는 qPCR로 정량화했고, 시료에 들어 있는 T124A1의 농도를 표준화(normalize)하기 위해 시료를 희석했습니다. T124A1을 증폭하기 위해 첫 번째 프라이머 "RLX0892"와 두 번째 프라이머 "RLX0893"를 사용했습니다.

25 마이크로리터의 반응 혼합물들이 준비되었으며, 각 혼합물에는 다음이 포함되어 있습니다: 50 mM 초산 칼륨, 20 mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM 초산 마그네슘, 1 mM DTT, 20 μg 소혈청알부민(BSA), 0.8 M 베타인, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각 1.4 mM, 2 uM SYTO ® 59 (Life Technologies), 0.8 units / μl Bst DNA 중합효소 (New England BioLabs), 0.016 units / μl AMV 역전사효소 (New England Biolabs), 1 unit / μl murine RNase 억제제 (New England Biolabs), 0.8 μM 첫 번째 프라이머 RLX0892, 0.8 μM 두 번째 프라이머 RLX0893, 마이크로리터 당 T124A1 주형 복사본 10,000, 1000 또는 0 개, 56 C에서 100 분 동안 CFX 96 Touch 기기(Bio-Rad) 속에서 배양.분석 검사에 대한 변곡점은 도 6에 표시되어 있습니다. X 축에는 반응에 들어 있는 마이크로리터 당 주형 복사본 개수가 표시되어 있고, Y 축에는 분석 검사의 변곡 시간(단위: 분)이 표시되어 있습니다. 마이크로리터 당 주형 복사본의 각 개수에 대해, 왼쪽에서 오른쪽으로 두 개의 인접한 막대 그래프가 표시되어 있습니다: 단리된 T124A1 및 인플루엔자 A 바이러스 용해질. NTC에 대한 변곡점도 표시되어 있습니다. 도 6에 표시된 것처럼, 이런 반응 조건하에서, 분석 검사는 단리된 T124A1 주형과 인플루엔자 A 바이러스 용해질에 들어 있는 T124A1 주형 모두를 효과적으로 증폭했습니다.

예 6 - 주형 핵산 증폭

본 문서에 공개된 방법은 표적 핵산을 증폭하는 데 사용합니다. 인플루엔자 B 바이러스 적혈구 응집소(hemagglutinin, HA) 유전자(RNA 분자)의 298 뉴클레오티드 부분인, T129D1의 54 뉴클레오티드 부분에 대해 분석 검사하기 위해 반응이 준비되었습니다. T129D1의 뉴클레오티드 서열은 서열 ID 번호: 90에 제공되었습니다. T129D1을 증폭하기 위해, 첫 번째 프라이머 "A8" (뉴클레오티드 서열: 5' TCTTGAGAGAACCCACTAAC 3') (서열 ID 번호: 86) 및 두 번째 프라이머 "B8" (뉴클레오티드 서열: 5' TCTCAAGAATTTGGTCTTCC 3') (서열 ID 번호: 87)을 사용했습니다. 이런 프라이머들 모두에서, 첫 번째 8개의 뉴클레오티드(5' 말단부터)는 꼬리 영역이고, 마지막 12 개의 뉴클레오티드는 주형 결합 영역입니다. 이런 프라이머들은 함께 T129D1의 54 뉴클레오티드 부분을 표적으로 합니다.

100 마이크로리터의 반응 혼합물들이 준비되었으며, 다음이 포함되어 있습니다: 50 mM 초산 칼륨, 20 mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM 초산 마그네슘, 1 mM DTT, 20 μg 소혈청알부민(BSA), 0.8 M 베타인, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각 1.4 mM, 0.4 x SYTO ® 59 (Life Technologies), 0.8 units / μl Bst DNA 중합효소 (New England BioLabs), 0.016 units / μl AMV 역전사효소 (New England Biolabs), 1 unit / μl murine RNase 억제제 (New England Biolabs), 0.8 μM 첫 번째 프라이머 A8, 0.8 μM 두 번째 프라이머 B8, 마이크로리터 당 T129D1 주형 복사본 100,000 개, 58 C에서 100 분 동안 CFX 96 Touch 기기(Bio-Rad) 속에서 배양.100 분 후에 시료를 반응에서 꺼내 클로닝 벡터(cloning vectors)로 결찰(ligated)했습니다. 반응 결과물이 들어 있는 벡터는 클로닝 부위(cloning site)로 향하는 벡터 특정적인 프라이머를 사용하여 서열화되었습니다. 다수 예 서열화 반응의 결과물의 일부분은 도 7에 표시되어 있습니다. 서열화 결과는 기대 구조가 있는 연쇄동일서열이 성형된 것을 보여줍니다. 구체적으로, 이런 예에서, 반응 결과물의 단일 가닥에서, T129D1 유전자의 표적 54 뉴클레오티드 서열의 다수 복사본이 있으며, A8 프라이머 (5' TCTTGAGA 3') (서열 ID 번호: 88)의 꼬리 영역의 서열에 의해 분리되어 있습니다. 도 7에서, T129D1의 두 번째(왼쪽에서 오른쪽으로) 발생의 일부분만 표시되어 있고; 서열은 도면에 표시된 뉴클레오티드 이상으로 계속됩니다.

본 문서에 제공된 뉴클레오티드와 아미노산은 별도로 언급하지 않은 경우 인공적인 서열(artificial sequences)입니다.

현 발명의 선호되는 구현이 본 문서에 표시 및 설명되었지만, 이 분야의 지식을 갖춘 인간들은 이런 구현이 예시(example)라는 것을 분명하게 알 수 있습니다. 상기 설명은 빠뜨림이 없는 완전한 것은 아니고 본 발명을 공개된 정확한 구현으로 제한하는 것이 아니며, 본 발명에서 벗어나지 않으면서 상기 설명 내용의 관점에서 기타 수정과 변형이 가능합니다. 모든 기능(또는 장치)은, 선호 여부에 관계 없이, 다른 모든 기능(또는 장치)과, 선호 여부와 관계 없이, 결합할 수 있습니다. 본 문서에 제공된 발명은 편의성을 위해 제한된 수의 용어와 문구로 설명되었지만, 본 발명은 본 문서에는 제공되지 않은 다른 용어와 문구를 사용하여 정확하게 설명할 수도 있습니다. 첨부된 청구항(claims)은, “뜻 합니다 또는 의미합니다(means for)”라는 문구를 사용하여 주어진 청구항에서 이런 제한사항을 명시적으로 기재하지 않은 경우, 기능식 청구항(Means-Plus-Function) 제한사항을 포함하는 것으로 해석하면 안 됩니다. 상세 설명(명세서)과 첨부된 주장에 사용된 단수형은 문맥상 별도로 명시하지 않은 경우, 복수에도 해당됩니다. 예를 들어, "분석 검사(an assay)"에 대한 참조는 단일 분석 검사 또는 다수의 분석 검사를 뜻할 수도 있습니다. 또한, 본 문서에 사용되었으며 청구항(claims) 전체에서 사용된 “내에서, 속에서, ~의(in)”라는 의미는, 문맥상 별도로 명시하지 않는 한, “~위에, ~상에, ~에 대해(on)”라는 뜻으로도 사용됩니다. 본 문서의 설명과 아래에 있는 청구항 전체에 대해 사용된 것처럼, 두 번째 물체의 "적어도 일부분"이 들어 있는 것으로 설명된 첫 번째 물체에는 두 번째 물체의 전체 양(full amount) / 두 번째 물체 전체가 포함될 수도 있습니다. 본 문서의 설명과 아래에 있는 청구항 전반에 대해 사용된 것처럼, "구성하다(comprise)", "포함하다(include)" 및 "들어 있다(contain)" 및 관련된 시제는 포괄적(inclusive) 및 확장 가능한(open-ended) 것이며, 추가적이고, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않습니다. 또한, "하나 또는 그 이상", "적어도", "제한 없이" 또는 일부 예에서 이와 유사한 문구는 이런 넓은 문구가 없는 예에서 좁은 의미(경우)로 의도된 것이 아닙니다. 마지막으로, 본 문서에 사용되었으며 청구항 전체에서 사용된 "또는"의 의미는 문맥상 별도로 명시하지 않는 한 연결형(conjunctive) 및 비연결형(disjunctive) 모두의 의미로 사용됩니다. 그러므로, "또는" 이라는 용어에는 별도로 명시하지 않는 한 "및/또는"의 의미가 포함됩니다.

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서열 ID 번호: 4: CCATAACG

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서열 ID 번호: 6: CCATAACGGTTGCTCCCAT

서열 ID 번호: 7: ATGGGAGCAACCGTTATGG

서열 ID 번호: 8: CCATAACGGTTGCTCCCATAACGGTTGCTCCCAT

서열 ID 번호: 9: ATGGGAGCAACCGTTATGGGAGCAACCGTTATGG

서열 ID 번호: 10: CGCCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC

서열 ID 번호: 11: CCGGATGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC

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서열 ID 번호: 14: TGGCTCTTGGGAAACCAAACCGTACCAACC

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서열 ID 번호: 24: GTTTCCCAAGAGCCATCCATGCGGAATGTACC

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서열 ID 번호: 46: TGGGAAACTGAAACCGTACCAACC

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서열 ID 번호: 48: GGGAAACTGAAACCGTACCAACC

서열 ID 번호: 49: GTTTCCCGGATGCGGAATGTACC

서열 ID 번호: 50: ATGGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC

서열 ID 번호: 51: GTTTCCCAAGAGCCATACAGGGATGCGGAATGTACC

서열 ID 번호: 52: GGCTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC

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서열 ID 번호: 54: CTCTTGGGAAACTGCCTGAAACCGTACCAACC

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220 Asp Ser Lys Ala Pro Asn Ala Ser Asn Leu Lys Ile Val Arg Met Asp 225 230 235 240 Arg Thr Ala Gly Cys Val Thr Gly Gly Glu Glu Ile Tyr Leu Leu Cys 245 250 255 Asp Lys Val Gln Lys Asp Asp Ile Gln Ile Arg Phe Tyr Glu Glu Glu 260 265 270 Glu Asn Gly Gly Val Trp Glu Gly Phe Gly Asp Phe Ser Pro Thr Asp 275 280 285 Val His Arg Gln Phe Ala Ile Val Phe Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Asp 290 295 300 Ile Asn Ile Thr Lys Pro Ala Ser Val Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys 305 310 315 320 Ser Asp Leu Glu Thr Ser Glu Pro Lys Pro Phe Leu Tyr Tyr Pro Glu 325 330 335 Ile Lys Asp Lys Glu Glu Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Gly Ser Ser 340 345 350 Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Met Thr Leu Glu Glu Ala 355 360 365 Arg Lys Arg Val Asn Glu Leu Arg Asp Leu Ile Arg Tyr His Asn Tyr 370 375 380 Arg Tyr Tyr Val Leu Ala Asp Pro Glu Ile Ser Asp Ala Glu Tyr Asp 385 390 395 400 Arg Leu Leu Arg Glu Leu Lys Glu Leu Glu Glu Arg Phe Pro Glu Leu 405 410 415 Lys Ser Pro Asp Ser Pro Thr Leu Gln Val Gly Ala Arg Pro Leu Glu 420 425 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 caaaccgtac caacc 15 <210> 81 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 atgcggaatg tacc 14 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 cgccggatgg ctcttgggaa ac 22 <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 gtttcccaag agccatccgg cg 22 <210> 84 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 ttgggaaac 9 <210> 85 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 gtttcccaa 9 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 tcttgagaga acccactaac 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> 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auggcuuggg cugucccaaa ggacaacaac aaaaaugcaa cgaacccacu aacaguagaa 120 guaccauaca uuuguacaga aggggaagac caaaucacug uuuggggguu ccauucagau 180 gacaaaaccc aaaugaagaa ccucuaugga gacucaaauc cucaaaaguu caccucaucu 240 gcuaaugguu uugccgacug aagggacacc cccagggucc uugggggcag ucagggag 298 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 10xHis tag <400> 91 His His His His His His His His His His 1 5 10

Claims

첫 번째 프라이머와 두 번째 프라이머를 포함하는 반응 혼합물에서 폴리뉴클레오티드 주형을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서
첫 번째 프라이머는 첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역은 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
두 번째 프라이머는 첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 두 번째 프라이머의 두 번째 영역은 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적이고;
첫 번째 프라이머 및 두 번째 프라이머와 함께 폴리뉴클레오티드 주형을 배양하면, 적어도 하나의 연쇄동일서열(concatemer) 가닥이 형성되고, 여기서 연쇄동일서열 가닥은 5' 말단과 3' 말단이 포함되고, 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, X는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내는 것인, 폴리뉴클레오티드 주형을 복사하는 방법
제1항에 있어서, 연쇄동일서열 가닥이 첫 번째 연쇄동일서열 가닥이고, 첫 번째 프라이머 및 두 번째 프라이머와 함께 폴리뉴클레오티드 주형을 배양하면, 두 번째 연쇄동일서열 가닥도 형성되고, 두 번째 연쇄동일서열 가닥은 5' 말단과 3' 말단을 포함하고, 5'에서 3' 방향으로 C-X'-T'-C-T'-C의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 C는 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T'은 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고, X'은 X의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것인, 방법
제1항에 있어서, X가 5'에서 3' 방향으로 [(C'-T)_N]의 일반 구조를 갖는 서열을 포함할 수 있고, 여기서 C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, N은 0 ~ 1000 사이의 임의의 정수인, 방법.
제1항에 있어서, X가 영(0) 개의 뉴클레오티드를 나타내는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 반응 혼합물이 가닥 치환 활성(strand-displacement activity)을 갖는 DNA 중합효소를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 반응 혼합물이 역전사효소(reverse transcriptase)를 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 RNA 분자인, 방법.
제7항에 있어서, T가 폴리뉴클레오티드 주형의 RNA 서열과 유사한 DNA 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 2중가닥 핵산 주형의 한쪽 가닥을 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 반응 혼합물을 배양하는 동안, 반응 혼합물의 온도가 80℃를 초과하지 않는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역이 4 ~ 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역과 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역이 동일한 개수의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 10 ~ 1000개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 반응 혼합물이 핵산 염료(nucleic acid dye)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 반응 혼합물에 들어 있는 폴리뉴클레오티드 주형의 복사본 개수는 방법을 시작한 후 60분 내에 적어도 10배로 증가하는 것인, 방법.
A) 생체 시료 또는 그의 일부분을 첫 번째 프라이머 및 두 번째 프라이머를 포함하는 반응 혼합물에서 배양하는 단계이며, 여기서
첫 번째 프라이머는 첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 첫 번째 프라이머의 두 번째 영역은 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
두 번째 프라이머는 첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 두 번째 프라이머의 두 번째 영역은 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적이고; 및
첫 번째 프라이머 및 두 번째 프라이머와 함께 폴리뉴클레오티드 주형을 배양하면, 적어도 하나의 연쇄동일서열 가닥이 형성되고, 여기서 연쇄동일서열 가닥은 5' 말단과 3' 말단을 포함하고, 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, X는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내는 것인 단계; 및
B) 단계 A)의 배양을 시작한 후에 하나 이상의 시점에서, 단계 A)의 반응 혼합물에서 증폭된 핵산의 양을 측정하는 단계
를 포함하는, 생체 시료에 들어 있는 표적 폴리뉴클레오티드 주형에 대한 분석 검사 방법.
제16항에 있어서, 반응 혼합물에 들어 있는 증폭된 핵산의 양을 측정하는 단계가 반응 혼합물의 형광 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인, 방법.
제16항에 있어서, 반응 혼합물에서 핵산 증폭의 변곡 시간(inflection time)을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 생체 시료 또는 그의 일부분이 인간으로부터의 것인 방법.
적어도 첫 번째 주형 분자와 두 번째 주형 분자를 반응 혼합물에서 배양하는 단계를 포함하고, 여기서
첫 번째 주형 분자는 첫 번째 핵산 가닥과 두 번째 핵산 가닥을 포함하고, 여기서
첫 번째 주형 분자의 첫 번째 핵산 가닥은 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₁-H'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 H'은 첫 번째 상동 서열(homology sequence)의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, Y₁은 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내며;
첫 번째 주형 분자의 두 번째 핵산 가닥은 5'에서 3' 방향으로 H-Y₁'-S'-H의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 H는 두 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 첫 번째 상동 서열과 두 번째 상동 서열은 서로 상보적이고, Y₁'은 Y₁의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고 , S'은 2중가닥 핵산 주형의 두 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 여기서, 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥은 서로 상보적이고;
두 번째 주형 분자는 첫 번째 핵산 가닥과 두 번째 핵산 가닥을 포함하고, 여기서
두 번째 주형 분자의 첫 번째 핵산 가닥은 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₂-H'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 H'은 첫 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, Y₂는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내며;
첫 번째 주형 분자의 두 번째 핵산 가닥은 5'에서 3' 방향으로 H-Y₂'-S'-H의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 H는 두 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, Y₂'은 Y₂의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S'은 2중가닥 핵산 주형의 두 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내며;
반응 혼합물에서 두 번째 주형 분자와 함께 첫 번째 주형 분자를 배양하면, 2중가닥 핵산 주형의 적어도 두 복사본을 포함하는 적어도 하나의 연쇄동일서열이 형성되고, 여기서 연쇄동일서열은 첫 번째 연쇄동일서열 가닥과 두 번째 연쇄동일서열 가닥을 포함하고, 여기서 첫 번째 연쇄동일서열 가닥은 5' 말단과 3' 말단을 포함하고, 5'에서 3' 방향으로 H'-S-Y₂-H'-S-Y₁-H'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 각각의 H', Y₁, S 및 Y₂는 상기한 뉴클레오티드 서열을 나타내며; 두 번째 연쇄동일서열 가닥은 5' 말단과 3' 말단을 포함하고, 5'에서 3' 방향으로 H-Y₁'-S'-H-Y₂'-S'-H의 일반 구조를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 H', Y₁, S 및 Y₂ 각각은 상기한 바의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것인,
2중가닥 핵산 주형의 적어도 두 개의 복사본을 포함하는 연쇄동일서열을 생성하는 방법
제20항에 있어서, Y₁과 Y₂ 중 적어도 하나는 0개의 뉴클레오티드를 나타내는 것인 방법.
제21항에 있어서, Y₁과 Y₂ 모두가 0개의 뉴클레오티드를 나타내는 것인 방법.
제20항에 있어서, Y₁이 5'에서 3' 방향으로 [(H'-S)_N1]의 일반 구조를 갖는 서열을 포함하고, H'은 첫 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, N1은 0 ~ 2000 사이의 임의 정수인 방법.
제20항에 있어서, Y₁이 5'에서 3' 방향으로 [(H'-S)_N1]의 일반 구조를 갖는 서열을 포함하고, H'은 첫 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, N1은 0 ~ 2000 사이의 임의의 정수이고, 여기서 Y₂는 5'에서 3' 방향으로 [(H'-S)_N2]의 일반 구조를 갖는 서열을 포함하고, H'은 첫 번째 상동 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, S는 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, N2은 0 ~ 2000 사이의 임의 정수인 방법.
제24항에 있어서, N1과 N2가 서로 다른 정수인 방법.
제25항에 있어서, N1이 0이고, N2가 1 ~ 2000 사이의 정수인 방법.
제20항에 있어서, 첫 번째 주형 분자와 두 번째 주형 분자가 모두 2중가닥 DNA 분자인 방법.
제20항에 있어서, 첫 번째 상동 서열이 4 ~ 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
(A) 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되어 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 2중가닥 핵산 주형을 포함하는 1차 2중가닥 핵산을 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본과 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서
　　　첫 번째 프라이머는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류(downstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류(upstream)에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하며,
　　　첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 주형 결합 영역은 2중가닥 핵산 주형의 첫 번째 가닥과 서냉결합하는 것인 단계,
(B) 두 번째 프라이머의 연장 결과물이 합성되어 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 두 번째 프라이머와 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서
　　　두 번째 프라이머는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
　　　을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고,
두 번째 프라이머의 꼬리 영역은 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
　　　두 번째 프라이머의 주형 결합 영역은 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물과 서냉결합하고,
　　　두 번째 프라이머의 연장 결과물은 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단 영역을 포함하고, 여기서 3' 말단 영역은 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계,
(C) 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되어 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물을 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본과 중합효소로 처리하여 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 포함하는 2차 핵산의 첫 번째 복사본을 생성하는 단계이며, 여기서
　　　첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물은 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단 영역을 포함하고, 여기서 3' 말단 영역은 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계,
(D) 적어도 단계 (C)를 한 번 이상 반복하여 단계 (C)의 2차 핵산의 적어도 두 번째 복사본을 생성하는 단계,
(E) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (C)의 2차 핵산의 첫 번째 복사본과 단계 (D)의 2차 핵산의 두 번째 복사본을 처리하여 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물과 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물을 포함하는 교차 구조를 생성하는 단계,
(F) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되고 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되도록 하는 조건 하에서 단계 (E)의 교차 구조를 중합효소로 처리하여 단계 (A)의 2중가닥 핵산 주형의 복사본 두 개를 포함하는 연쇄동일서열을 생성하는 단계이며, 여기서 연쇄동일서열이 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물 및 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물을 포함하는 것인 단계
를 포함하는, 2중가닥 핵산 주형의 둘 이상의 복사본을 포함하는 연쇄동일서열을 생성하는 방법.
제29항에 있어서, 단계 (A)의 핵산 중합효소가 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소인 방법.
제29항에 있어서, 모든 단계들이 80℃ 이하의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제29항에 있어서, 둘 이상의 단계들이 동시에 발생하는 것인 방법.
(A) 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되어 폴리뉴클레오티드 주형에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드 주형을 포함하는 1차 핵산을 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본과 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서
　　　첫 번째 프라이머는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하며,
첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 주형 결합 영역은 폴리뉴클레오티드 주형으로 서냉결합되는 것인 단계,
(B) 두 번째 프라이머의 연장 결과물이 합성되어 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물을 두 번째 프라이머와 중합효소로 처리하는 단계이며, 여기서
　　　두 번째 프라이머는 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하며,
　　　두 번째 프라이머의 꼬리 영역은 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
　　　두 번째 프라이머의 주형 결합 영역은 단계 (A)의 첫 번째 프라이머의 첫 번째 복사본의 연장 결과물에 서냉결합하고,
　　　두 번째 프라이머의 연장 결과물은 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단 영역을 포함하고, 여기서 3' 말단 영역은 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 두 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계,
(C) 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물이 합성되어 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물을 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본과 중합효소로 처리하여 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 포함하는 2차 핵산의 첫 번째 복사본을 생성하는 단계이며, 여기서
　　첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물은 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드, 및 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단 영역을 포함하고, 여기서 3' 말단 영역은 5'에서 3' 방향으로 읽을 때 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 3' 말단 영역의 최종 뉴클레오티드는 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 뉴클레오티드인 단계,
(D) 적어도 단계 (C)를 한 번 이상 추가 반복하여 단계 (B)의 두 번째 프라이머의 연장 결과물과 단계 (C)의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물을 포함하는 두 번째 핵산의 두 번째 복사본을 적어도 생성하는 단계,
(E) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 3' 말단 영역이 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 3' 말단 영역에 서냉결합되도록 하는 조건 하에서 단계 (C)의 2차 핵산의 첫 번째 복사본과 단계 (D)의 2차 핵산의 두 번째 복사본을 처리하여 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물과 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물을 포함하는 교차 구조를 생성하는 단계,
(F) 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되고 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물이 합성되도록 하는 조건 하에서 단계 (E)의 교차 구조를 중합효소로 처리하여 단계 (A)의 폴리뉴클레오티드 주형의 복사본 두 개를 포함하는 연쇄동일서열을 생성하는 단계이며, 여기서 연쇄동일서열은 2차 핵산의 첫 번째 복사본의 첫 번째 프라이머의 두 번째 복사본의 연장 결과물의 연장 결과물 및 2차 핵산의 두 번째 복사본의 두 번째 프라이머의 연장 결과물의 연장 결과물을 포함하는 것인 단계
를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 주형 또는 그와 유사한 서열의 둘 이상의 복사본을 포함하는 연쇄동일서열을 생성하는 방법.
제33항에 있어서, 단계 (A)의 핵산 중합효소가 DNA 중합효소인 방법.
제33항에 있어서, 단계 (A)의 핵산 중합효소가 역전사효소인 방법.
제33항에 있어서, 모든 단계들이 80℃ 이하의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 둘 이상의 단계들이 동시에 발생하는 것인 방법.
(A) 하기 (i) 내지 (iv)를 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계이며:
(i) 2중가닥 핵산 주형을 포함하는 1차 핵산,
(ii) 단리된 핵산 중합효소,
(iii) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (a) 및 (b)의 두 개의 영역:
　　　(a) (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(b) (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고, 여기서 주형 결합 영역은 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 대해 상보적인 것인, 첫 번째 프라이머,
　　　(iv) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (a) 및 (b)의 두 개의 영역:
　　　(a) (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
(2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(b) (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고, 여기서 주형 결합 영역은 핵산 주형의 두 번째 가닥에 대해 상보적인 것인, 두 번째 프라이머,
여기서 두 번째 프라이머의 꼬리 영역은 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는것인, 단계
(B) 반응 혼합물을 80℃ 이하의 온도에서 적어도 3분 동안 배양하는 단계
를 포함하는, 2중가닥 핵산 주형의 둘 이상의 복사본을 포함하는 연쇄동일서열을 생성하는 방법.
(A) 하기 (i) 내지 (iv)를 포함하는 반응 혼합물을 준비하는 단계이며:
(i) 폴리뉴클레오티드 주형을 포함하는 핵산
(ii) 단리된 핵산 중합효소,
(iii) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (a) 및 (b)의 두 개의 영역:
　　　(a) (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　(3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(b) (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하며, 여기서 주형 결합 영역은 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 상보적인 것인, 첫 번째 프라이머,
　　　(iv) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (a) 및 (b)의 두 개의 영역:
　　　(a) (1) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (2) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(b) (1) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(2) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(3) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고, 여기서 주형 결합 영역은 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 것인, 두 번째 프라이머,
여기서 두 번째 프라이머의 꼬리 영역은 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 단계
(B) 반응 혼합물을 80℃ 이하의 온도에서 적어도 3분 동안 배양하는 단계
를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 주형의 둘 이상의 복사본을 포함하는 연쇄동일서열을 생성하는 방법.
제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 2중가닥 핵산 주형 또는 폴리뉴클레오티드 주형이 방법 시작 후 60분 내에 적어도 10배 증폭되는 것인 방법.
제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역이 4 ~ 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
용기 내에서 유체 소통하는,
　　　첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 여기서 두 번째 영역은 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 첫 번째 프라이머;
　　　첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 여기서 두 번째 영역은 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적인, 두 번째 프라이머; 및
　　　5' 말단과 3' 말단을 포함하고, 5'에서 3' 방향으로 C'-T-C'-T-X-C'의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 C'은 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, X는 임의의 개수 및 서열의 뉴클레오티드를 나타내는 것인, 적어도 하나의 연쇄동일서열 가닥
을 포함하는, 용기
제42항에 있어서, 연쇄동일서열 가닥이 첫 번째 연쇄동일서열 가닥이고, 용기가 두 번째 연쇄동일서열 가닥을 추가로 포함하고, 여기서 두 번째 연쇄동일서열 가닥은 5' 말단과 3' 말단을 포함하고, 5'에서 3' 방향으로 C-X'-T'-C-T'-C의 일반 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 C는 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, T'은 폴리뉴클레오티드 주형에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내고, X'은 X의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것인 용기.
제42항에 있어서, X가 5'에서 3' 방향으로 [(C'-T)_N]의 일반 구조를 갖는 서열을 포함하고, 여기서 C'는 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역의 뉴클레이티드 서열을 나타내고, T는 폴리뉴클레오티드 주형의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 유사한 서열을 나타내고, N은 0 ~ 1000 사이의 임의의 정수인 용기.
제42항에 있어서, X가 0개의 뉴클레오티드를 나타내는 것인 용기.
용기 내에서 유체 소통하는,
(A) 단리된 핵산 중합효소,
(B) 적어도 첫 번째 가닥을 포함하는 핵산 주형,
(C) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고, 여기서 주형 결합 영역은 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 대해 상보적인 것인, 첫 번째 프라이머, 및
　　　(D) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고, 여기서 주형 결합 영역은 핵산 주형의 첫 번째 가닥에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이며, 꼬리 영역은 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 두 번째 프라이머
를 포함하는 용기
제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소를 포함하는 용기.
제47항에 있어서, 역전사효소를 추가로 포함하는 용기.
제42항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 RNA 분자인 용기.
제49항에 있어서, T가 폴리뉴클레오티드 주형의 RNA 서열과 유사한 DNA 서열의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것인 용기.
제42항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 DNA 분자인 용기.
제51항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 주형이 2중가닥 핵산 주형의 한쪽 가닥을 포함하는 것인 용기.
제42항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역이 4 ~ 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 용기.
제42항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역과 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역이 동일한 개수의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 용기.
제46항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역이 4 ~ 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 용기.
제46항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역과 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역이 동일한 개수의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 용기.
제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 염료를 추가로 포함하는 용기.
제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드와 완충제를 추가로 포함하는 용기.
제42항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 피험자로부터 확보한 생체 시료의 적어도 일부분을 추가로 포함하는 용기.
제59항에 있어서, 피험자가 인간인 용기.
유체상으로 단리되어 있는 두 개 이상의 용기를 포함하며, 이 용기들은 종합적으로:
첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 여기서 두 번째 영역은 폴리뉴클레오티드 주형의 첫 번째 부분에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 첫 번째 프라이머;
첫 번째 영역과 두 번째 영역을 포함하고, 여기서 두 번째 영역은 파트너 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 파트너 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 주형의 두 번째 부분에 대해 상보적인 것인, 두 번째 프라이머; 및
가닥 치환 활성을 갖는 단리된 DNA 중합효소
를 포함하고; 여기서
첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역과 두 번째 프라이머의 첫 번째 영역이 상보적인 것인, 키트.
유체적으로 단리된 둘 이상의 용기를 포함하고, 이 용기들은 종합적으로:
　　　(A) 가닥 치환 활성을 갖는 단리된 DNA 중합효소,
　　　(B) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고, 여기서 주형 결합 영역은 표적 핵산의 첫 번째 가닥에 대해 상보적인 것인, 첫 번째 프라이머, 및
　　　(C) 5' 말단 뉴클레오티드, 3' 말단 뉴클레오티드 및 하기 (i) 및 (ii)의 두 개의 영역:
　　　(i) (a) 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드
　　　 (b) 5' 말단 뉴클레오티드의 하류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
　　　 (c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 5' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 꼬리 영역, 및
　　　(ii) (a) 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드
(b) 3' 말단 뉴클레오티드의 상류에 있는 가장 안쪽 뉴클레오티드
(c) 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는, 3' 말단 뉴클레오티드와 가장 안쪽 뉴클레오티드 사이의 중간 영역
을 포함하는 주형 결합 영역
을 포함하고, 여기서 주형 결합 영역은 표적 핵산의 첫 번째 가닥에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적이고, 꼬리 영역은 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 두 번째 프라이머
를 포함하는, 적어도 첫 번째 가닥을 포함하는 관심 표적 핵산을 검출하기 위한 키트.
제61항 또는 제62항에 있어서, 역전사효소를 추가로 포함하는 키트.
제61항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 첫 번째 영역이 4 ~ 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 키트.
제62항에 있어서, 첫 번째 프라이머의 꼬리 영역이 4 ~ 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 키트.
제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 추가로 포함하는 키트.