JP2019141058A - 核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
(相互参照による組み込み)
本明細書において言及される、全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるために、あたかも明確に、及び個々に参照により示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本発明の明確な開示の内容と参照により本明細書に組み込まれた文書の内容の間に矛盾がある場合には、本発明の明確な開示の内容が支配する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
ポリヌクレオチド・テンプレートをコピーする方法であり、前記方法は以下を含む方法:
第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物で、前記ポリヌクレオチド・テンプレートをインキュベートすることであって:
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的な配列を含み;
前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり;及び
前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマーとのインキュベーションの差異に、少なくとも1つのコンカテマー鎖が形成され、前記コンカテマー鎖は5’末端及び3’末端を含み、及び5’から3’方向の中に一般構造:C’−T−C’−T−X−C’を有するヌクレオチド配列を含み:C’は前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Tは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びXはヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
(項目2)
前記コンカテマー鎖が第一のコンカテマー鎖であり、及び前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマーとのインキュベーションすると、第二のコンカテマー鎖も形成され、前記第二のコンカテマー鎖は、5’末端及び3’末端を含み、及び5’から3’方向の中に一般構造:C−X’−T’−C−T’−Cを有する、ヌクレオチド配列を含み:Cは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、T’は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びX’は、前記Xのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、項目1に記載の方法。
(項目3)
Xが、5’から3’方向の中に一般構造[(C’−T)N]を有する配列を含み、C’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Tは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びNは0及〜1000の間の整数である、項目1に記載の方法。
(項目4)
Xが0個のヌクレオチドを表す、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記反応混合物が、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを更に含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記反応混合物が、更に逆転写酵素を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記ポリヌクレオチド・テンプレートがRNA分子である、項目1に記載の方法。
(項目8)
Tが、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのRNA配列に類似のDNA配列のヌクレオチド配列を表す、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、二本鎖の核酸テンプレートの一本の鎖を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記反応混合物のインキュベーションの間に、前記反応混合物の温度が、80Cを超えない項目1に記載の方法。
(項目11)
前記第一のプライマーの第一の領域が4〜25のヌクレオチドを含む、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が、同じ数のヌクレオチドを含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、10〜1000のヌクレオチドを含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記反応混合物が更に核酸染料を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記反応混合物中の、前記ポリヌクレオチド・テンプレートのコピー数が、前記方法の開始から60分以内に、少なくとも10倍増大される、項目1に記載の方法。
(項目16)
生物学的サンプル中の標的のポリヌクレオチド・テンプレートの検定のための方法であって、前記方法は以下を含む方法:
A)前記生物学的サンプル又はその一部分を、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む反応混合物中でインキュベートすることであって:
前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み;
前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第二の部分に相補的であり;及び
前記ポリヌクレオチド・テンプレートの前記第一のプライマー及び第二のプライマーとのインキュベーションすると、少なくとも1つのコンカテマー鎖が形成され、前記コンカテマー鎖は、5’末端及び3’末端を含み、及び5’から3’方向の中に一般構造:C’−T−C’−T−X−C’を有する、ヌクレオチド配列を含み:C’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Tは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びXはヌクレオチドの任意の数及び配列を表し;及び
B)A)の前記反応混合物の増幅された核酸を、A)のステップのインキュベーションの開始後の、1つ以上の点において測定すること。
(項目17)
前記反応混合物中の増幅された核酸の量を測定することが、前記反応混合物中の蛍光のレベルを定量することを含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記反応混合物の核酸増幅の変曲時間を決定することを更に含む、項目16に記載の方法。
(項目19)
前記生物学的サンプル又はその一部分が、ヒトからのものである、項目16に記載の方法。
(項目20)
二重鎖の核酸テンプレートの少なくとも2つのコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は、以下を含む方法:
反応混合物中で、少なくとも第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子をインキュベートすることであって:
前記第一のテンプレート分子は、第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み:
前記第一のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、5’から3’方向の中に一般構造:H’−S−Y1−H’を有するヌクレオチド配列を含み:H’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Sは、前記二重鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びY1はヌクレオチドの任意の数及び配列を表し;及び
前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、5’から3’方向の中に一般構造:H−Y1’−S’−Hを有するヌクレオチド配列を含み:Hは、第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、前記第一の相同配列及び第二の相同配列は互いに相補的であり、Y1’は前記Y1のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びS’は、前記二重鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を表し、前記二重鎖の核酸テンプレートの第一の鎖及び第二の鎖は互いに相補的であり;及び
第二のテンプレート分子は第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み:
前記第二のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、5’から3’方向の中に一般構造:H’−S−Y2−H’を有するヌクレオチド配列を含み:H’は、前記第一の相同配列ヌクレオチド配列を表し、Sは、前記二重鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びY2は、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し;及び
前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、5’から3’方向の中に一般構造:H−Y2’−S’−Hを有する、ヌクレオチド配列を含み、:Hは、前記第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Y2’は、Y2のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びS’は、前記二重鎖の核酸テンプレート第二の鎖のヌクレオチド配列を表し;及び
前記第一のテンプレート分子と第二のテンプレート分子の前記反応混合物中でのインキュベーションすると、前記二重鎖の核酸テンプレートの少なくとも2つのコピーを含む少なくとも1つのコンカテマーが生成され、前記コンカテマーは、第一のコンカテマー鎖及び第二のコンカテマー鎖を含み、前記第一のコンカテマー鎖は、5’末端及び3’末端を含み、及び5’から3’方向の中に一般構造:H’−S−Y2−H’−S−Y1−H’を有するヌクレオチド配列を含み、H’、Y1、S、及びY2のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表し;及び第二のコンカテマー鎖は、5’末端及び3’末端を含み、及び5’から3’方向の中に一般構造:H−Y1’−S’−H−Y2’−S’−Hを有する配列を含み、H’、Y1、S、及びY2のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表す。
(項目21)
Y1及びY2の内の少なくとも1つが、0ヌクレオチドを表す項目20に記載の方法。
(項目22)
Y1及びY2の両方が0ヌクレオチドを表す項目20に記載の方法。
(項目23)
Y1が5’から3’方向の中に一般構造[(H’−S)N1]を有する配列を含み、H’は第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Sは、前記二重鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びN1は、0〜2000の間の任意の整数である、項目20に記載の方法。
(項目24)
Y1は、5’から3’方向の中に一般構造[(H’−S)N1]を有する配列を含み、H’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Sは、前記二重鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びN1は、0〜2000の間の任意の整数であり、及びY2がは、5’から3’方向の中に一般構造[(H’−S)N2]を有する配列を含み、H’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Sは、前記二重鎖の核酸テンプレート第一の鎖ヌクレオチド配列を表し、及びN2は0〜2000の間の任意の整数である、項目20に記載の方法。
(項目25)
N1及びN2が異なる整数である、項目24に記載の方法。
(項目26)
N1が0であり、及びN2が、1〜2000の間の整数である、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子の両方が二本鎖のDNA分子である項目20に記載の方法。
(項目28)
前記第一の相同配列が4〜25のヌクレオチドを含む、項目20に記載の方法。
(項目29)
二本鎖の核酸テンプレートの2つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法:
(A)二本鎖の核酸テンプレートを含む、一次二本鎖の核酸を、第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールされた、前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が合成される条件で処理することであって、
前記第一のプライマーは5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含み:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、
前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)前記5’末端ヌクレオチド及び前記最も内部の
ヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり
(c)前記3’末端ヌクレオチド及び前記最も内部の
ヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は、
前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールし、
(B)ステップ(A)の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ(A)前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物によりアニールされた、前記第二のプライマーの伸長された生成物が合成される条件下で、第二のプライマー及びポリメラーゼにより処理することであって、
前記第二のプライマーは、5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含み:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)1つ以上のヌクレオチドを含む、前記5’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり
(c)前記3’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ(A)の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールし、及び
前記第二のプライマーの伸長された生成物は、5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び前記3’末端ヌクレオチドを含む3’末端領域を含み、前記3’末端領域は、5’から3’方向に読んだ場合の前記第二のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記3’末端領域の最終的なヌクレオチドは、of第二のプライマーの伸長された生成物の前記3’末端ヌクレオチドであり、
(C)ステップ(B)の前記第二のプライマーの伸長された生成物及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を含む二次核酸第一のコピーを生成するために、ステップ(B)の前記第二のプライマーの伸長された生成物を、ステップ(B)前記第二のプライマーの伸長された生成物にアニールされた、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物が、合成される条件下で前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼで処理することであって、
前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び前記3’末端ヌクレオチドを含む3’末端領域を含み、前記3’末端領域は、5’から3’方向に読んだ場合の前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記3’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物前記3’末端のヌクレオチドであり、
(D)ステップ(C)の前記二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ(C)を1つ以上の追加的な回数繰り返すこと、
(E)前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピー第二のプライマーの伸長された生成物を含むクロスオーバー構造を生成するために、ステップ(C)の前記二次核酸の第一のコピー及びステップ(D)の前記二次核酸の第二のコピーを、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の3’末端領域が、前記二次核酸の第二のコピーの、第二のプライマーの伸長された生成物3’末端領域にアニールする条件下で処理すること、
(F)ステップ(A)の前記二本鎖の核酸テンプレートの2つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ(E)の前記クロスオーバー構造を、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び前記二次核酸の第二のコピーの、第二のプライマーの、伸長された生成物の、伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼにより処理することであって、前記コンカテマーは、前記二次核酸の、第一のコピーの、第一のプライマーの、第二のコピーの、伸長された生成物の、伸長された生成物、及び前記二次核酸の、第二のコピーの、第二のプライマーの、伸長された生成物の、伸長された生成物を含む。
(項目30)
ステップ(A)の前記核酸ポリメラーゼが、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼである、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記方法の全てのステップが、80C未満の温度で行われる、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記ステップの2つ以上が同時に生じる、項目29に記載の方法。
(項目33)
ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のを含むコンカテマーを生成するための方法であって、前記方法は以下を含む方法:
(A)前記ポリヌクレオチド・テンプレートを含む一次核酸を、前記ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールされた前記第一のプライマーの第一のコピーの合成された伸長された生成物が合成される条件下で第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより処理することであって、
前記第一のプライマーは5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり、
(c)1つ以上のヌクレオチドを含む、前記5’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、and
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり
(c)前記3’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチド、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は前記ポリヌクレオチド・テンプレートにアニールし、
(B)ステップ(A)の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ(A)前記第一のプライマーの第一のコピー伸長された生成物にアニールした前記第二のプライマーの伸長された生成物が、合成される条件下で第二のプライマー及びポリメラーゼと処理することであって、
前記第二のプライマーは、5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含み:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)1つ以上のヌクレオチドを含む、前記5’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり
(c)前記3’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーテール領域ヌクレオチド配列相補的なヌクレオチド配列を含み、
前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ(A)の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物にアニールし、及び
前記第二のプライマーの伸長された生成物は、5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び前記3’末端ヌクレオチドを含む3’末端領域を含み、前記3’末端領域は、5’から3’方向に読んだ場合の前記第二のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記3’末端領域の最終的なヌクレオチドは、前記第二のプライマーの伸長された生成物の3’末端ヌクレオチドであり、
(C)ステップ(B)の前記第二のプライマーの伸長された生成物、及び前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物を含む、二次核酸の第一のコピーを生成するために、ステップ(B)前記第二のプライマー伸長された生成物を、ステップ(B)前記第二のプライマー伸長された生成物にアニールした前記第一のプライマーの第二のコピー伸長された生成物が合成される条件下で、前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼと処理することであって、
前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び前記3’末端ヌクレオチドを含む3’末端領域を含み、前記3’末端領域は、5’から3’方向に読んだ場合の前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び前記3’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の3’末端ヌクレオチドであり、
(D)ステップ(B)の前記第二のプライマーの伸長された生成物及びステップ(C)の前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を含む前記二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ(C)を1つ以上の追加回数繰り返すこと、
(E)前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物を含むクロスオーバー構造を生成するために、ステップ(C)の前記二次核酸の第一のコピー及びステップ(D)の前記二次核酸の第二のコピーを、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の3’末端領域が、前記二次核酸第二のコピー第二のプライマー、伸長された生成物3’末端領域とアニールする条件下で勝利すること、
(F)ステップ(A)の前記ポリヌクレオチド・テンプレートの2つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ(E)の前記クロスオーバー構造を、前記二次核酸第一のコピー前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び前記二次核酸第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼと処理することであって、前記コンカテマーは、前記二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの、第二のコピーの伸長された生成物伸長された生成物、及び前記二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物を含む。
(項目34)
ステップ(A)前記核酸ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼである、項目33に記載の方法。
(項目35)
ステップ(A)の前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素である、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記方法の全てのステップが80C未満の温度で遂行される、項目33に記載の方法。
(項目37)
前記方ステップの2つ以上が同時に生じる、項目33に記載の方法。
(項目38)
二本鎖の核酸テンプレートの2つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法:
(A)以下を含む反応混合物を調製すること:
(i)前記二本鎖の核酸テンプレートを含む一次核酸、
(ii)単離された核酸ポリメラーゼ、
(iii)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第一のプライマー:
(a)以下を含むテール領域
(1)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり、
(3)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドとの間のヌクレオチドを1つ以上含む中間部分、及び
(b)以下を含むテンプレート結合領域
(1)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり、
(3)前記3’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的であり、
(iv)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第二のプライマー:
(a)以下を含むテール領域
(1)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり、
(3)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドとの間のヌクレオチドを1つ以上含む中間部分、及び
(b)以下を含むテンプレート結合領域
(1)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり、
(3)前記3’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレート第二の鎖に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、及び
(B)前記反応混合物を、少なくとも3分間、80C未満の温度でインキュベートすること。
(項目39)
ポリヌクレオチド・テンプレート2つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成する方法であって、前記方法は以下を含む方法:
(A)以下を含む反応混合物を調製すること:
(i)前記ポリヌクレオチド・テンプレートを含む核酸
(ii)単離された核酸ポリメラーゼ、
(iii)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第一のプライマー:
(a)以下を含むテール領域
(1)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(3)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
(b)以下を含むテンプレート結合領域
(1)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり、
(3)前記3’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の、1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的であり、
(iv)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第二のプライマー:
(a)以下を含むテール領域
(1)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(3)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内、及び
(b)以下を含むテンプレート結合領域
(1)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(2)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり
(3)前記3’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、及び
(B)前記反応混合物を、少なくとも3分間、80C未満の温度でインキュベートすること。
(項目40)
前記二本鎖の核酸テンプレート又はポリヌクレオチド・テンプレートが、前記方法の開始から60分以内で少なくとも10倍に増幅される、項目29〜39のいずれか1つに記載の方法。
(項目41)
前記第一のプライマーのテール領域が、4〜25のヌクレオチドを含む、項目29〜39のいずれか1つに記載の方法。
(項目42)
その中の流体連通に以下を含む容器:
第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、並びに前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み;
第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、並びに前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートの第二の部分に相補的であり;及び
少なくとも1つのコンカテマー鎖であって、前記コンカテマー鎖5’末端及び3’末端を含み、及び5’から3’方向の中に一般構造:C’−T−C’−T−X−C’を有するヌクレオチド配列を含み:C’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Trは、前記ポリヌクレオチド・テンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びXはヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
(項目43)
前記コンカテマー鎖が第一のコンカテマー鎖であり、及び前記容器が更に第二のコンカテマー鎖を含み、前記第二のコンカテマー鎖は、5’末端及び3’末端を含み、及び5’から3’方向の中に一般構造:C−X’−T’−C−T’−Cを有するヌクレオチド配列を含み:Cは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、T’は、前記ポリヌクレオチド・テンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びX’は前記Xのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す、項目42に記載の容器。
(項目44)
Xが、5’から3’方向の中に一般構造[(C’−T)N]を有する配列を含み、C’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Tは、前記ポは0〜1000の間の任意の整数である、項目42に記載の容器。
(項目45)
Xが0個のヌクレオチドを表す、項目42に記載の容器。
(項目46)
その中の流体連通の中に以下を含む容器:
(A)単離された核酸ポリメラーゼ、
(B)少なくとも第一の鎖を含む核酸テンプレート、
(C)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第一のプライマー:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチド前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり
(c)3’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的であり、及び
(D)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第二のプライマー:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、3’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)前記3’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレート第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び
前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
(項目47)
前記容器が、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含む、項目42〜46のいずれか1つに記載の方法。
(項目48)
前記容器が更に逆転写酵素を含む、項目47に記載の容器。
(項目49)
前記ポリヌクレオチド・テンプレートがRNA分子である、項目47に記載の容器。
(項目50)
前記Tが、前記ポリヌクレオチド・テンプレートRNA配列に類似の、DNA配列のヌクレオチド配列を表す、項目49に記載の容器。
(項目51)
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、DNA分子である、項目42に記載の容器。
(項目52)
前記ポリヌクレオチド・テンプレートが、二本鎖の核酸テンプレートの1つの鎖を含む、項目51に記載の容器。
(項目53)
前記第一のプライマーの第一の領域が4〜25のヌクレオチドを含む、項目42に記載の容器。
(項目54)
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が、同じ数のヌクレオチドを含む、項目42に記載の容器。
(項目55)
前記第一のプライマーのテール領域が4〜25のヌクレオチドを含む、項目46に記載の容器。
(項目56)
前記第一のプライマーのテール領域及び前記第二のプライマーの第一の領域が同じ数のヌクレオチドを含む、項目46に記載の容器。
(項目57)
前記容器が更に核酸染料を含む、項目42〜56のいずれか1つに記載の容器。
(項目58)
前記容器が、更にヌクレオチド及び緩衝液を含む、項目42〜57のいずれか1つに記載の容器。
(項目59)
前記容器が、更に被験者からの生物学的サンプルの少なくとも一部分を含む、項目42〜58のいずれか1つに記載の容器。
(項目60)
前記被験者がヒトである、項目59に記載の容器。
(項目61)
2つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであって、前記コンテナは集合的に以下を含むキット:
第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチド・テンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み;
第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチド・テンプレート第二の部分に相補的であり;及び
単離されたDNAポリメラーゼは鎖置換活性を
有し:
前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域は相補的である。
(項目62)
少なくとも第一の鎖を含む標的の目的の核酸を検出するためのキットであって、前記キットは2つ以上の流体的に分離された容器を含み、前記コンテナは集合的に以下を含む:
(A)単離された鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ、
(B)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第一のプライマー:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり
(c)前記3’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、
前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的であり、及び
(C)5’末端ヌクレオチド、3’末端ヌクレオチド、及び2つの領域を含む第二のプライマー:
(i)以下を含むテール領域
(a)前記プライマーの5’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記5’末端ヌクレオチドから下流にあり
(c)前記5’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
(ii)以下を含むテンプレート結合領域
(a)前記プライマーの3’末端ヌクレオチド
(b)最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記3’末端ヌクレオチドから上流にあり、
(c)前記3’末端ヌクレオチド及び前記
最も内部のヌクレオチドの間の1つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び
前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び前記第二のプライマーのテール領域は前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列の相補的なヌクレオチド配列を含む。
(項目63)
更に逆転写酵素を含む、項目61又は62に記載のキット。
(項目64)
前記第一のプライマーの第一の領域が、4〜25のヌクレオチドを含む、項目61に記載のキット。
(項目65)
前記第一のプライマーのテール領域が、4〜25のヌクレオチドを含む、項目62に記載のキット。
(項目66)
前記標的の目的の核酸のヌクレオチド配列を含む核酸を更に含む、項目61〜65のいずれか1つに記載のキット。
ウム、ジヒドロエチジウム、BlueViewTM、TOTO(R)染料、TO−PRO(R)染料、POPO(R)染料、YOYO(R)染料、BOBO(R)染料、JOJO(R)染料、LOLO(R)染料、SYTOX(R)染料、SYTO(R)染料、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、メチレンブルー、DAPI、アクリジン・オレンジ、キナクリン、アクリジン二量体、9−アミノ−6−クロロ−2−メトキシアクリジン、ビスベンズイミド染料、ヘキスト(Hoechst)染料、7−アミノアクチノマイシンD、アクチノマイシンD、ヒドロキシスチルバミジン、ピロニンY、DiamondTM染料、GelRedTM、GelGreenTM及びLDS751が挙げられる。
以下の実施例は、説明的な目的のみに提供され、本開示をいかなる方法によっても制限することを意図されていない。
配列のリスト
Claims (1)
- 本明細書に記載の発明。
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