CN101415838A - 用滚环扩增法扩增多核苷酸 - Google Patents
用滚环扩增法扩增多核苷酸 Download PDFInfo
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Abstract
利用滚环扩增来扩增和检测靶核酸分子,其通过在靶核酸分子上连接第一和/或第二接头核酸分子或第二接头核酸分子,然后环化靶核酸分子,再扩增该环化的核酸分子以产生重复的核酸序列。可利用此方法扩增核酸,特别是RNA,以进行检测和克隆。
Description
交叉参考相关申请
本申请要求发明人Youxiang Wang和Yaping Zong于2003年9月26日提交的标题为“滚环扩增法扩增多核苷酸序列”的美国专利申请No.60/506,218的优先权。
发明领域
本发明属于用滚环扩增法(RCA)扩增核酸的领域。
技术背景
在鉴定基因中,获得全长cDNA是关键但常常是困难的任务。构建cDNA文库的传统方法通常只能产生部分cDNA片断。cDNA末端的快速扩增(RACE)是为恢复全长编码序列而开发的一项技术,然而,RACE技术仍然复杂且效率不佳。我们的发明采用RT-RCA技术,其为制备全长cDNA提供了大为改进和简化的方法。
RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)是用于检测和定量mRNA的高灵敏技术。该技术由两部分组成:通过逆转录(RT)从RNA合成cDNA,和通过聚合酶链式反应(PCR)扩增特异性cDNA。我们的发明采用RT-PCR技术,其提供了用滚环扩增法使扩增和检测mRNA大为改进且更简单的方法。
已建立的核酸扩增方法包括以温度循环为基础的方法例如PCR、LCR和SPA,及采用等温扩增的方法例如NASBA、RCA、TMA、Qβ复制酶和SDA。最近,已开发了各种利用RCA的检测和扩增方法,参见例如美国专利No.5,871,921、5,648,245、5,866,377、5,854,033、6,287,824、6,323,009。
发明概述
本发明提供了利用滚环扩增检测和克隆核酸分子的方法。本发明提供了利用滚环扩增从复合混合物中扩增、检测和克隆靶核酸分子的方法。本发明的许多优点可见于各种实施方案中。
在一个实施方案中,本发明提供了用于环化整个靶核酸分子以进行扩增的方法。此方法能克隆大多数靶核酸的全长序列,如果需要的话,也能扩增和克隆整个基因组。
在另一个实施方案中,本发明提供利用滚环扩增来扩增和检测靶核酸分子所需区域的方法。
在另一个实施方案中,本发明提供利用发夹环以产生用于滚环扩增和检测的环形多核苷酸的方法,而不是使用锁式探针(padlock probe)或附加模板以连接形成环形核酸分子的方法。
在另一个实施方案中,本发明提供通过采用自身引发(self-priming)接着通过连接而闭合环来环化核酸分子的方法。
在另一个实施方案中,本发明提供的检测方法,利用靶序列本身产生游离3’端而引起环化核酸分子的滚环扩增,其中环化的核酸分子可包含用于基因特异性检测和扩增的全长基因序列,其中不需要加入引物。这使得检测扩增不需要连接,几乎不需要或不需要外部提供的引物,从而简化了整个反应。
在另一个实施方案中,本发明提供了基于靶核酸分子与所供给寡核苷酸或片段之间的相互作用,从所供给的片段或寡核苷酸而不是靶序列产生用于环化核酸分子滚环扩增的游离3’端的方法。
在另一个实施方案中,本发明提供多个方法来检测和扩增靶多核苷酸序列,其包包括用环化寡核苷酸分子进行突变检测。一方面,不必先经PCR扩增而环化靶核酸分子。靶核酸分子的环化可包括该靶核酸、其互补物的环化或二者均被环化。如果需要或者希望,可产生或提供游离的3’端。然后用滚环扩增法扩增该环化的核酸分子。
本发明的多个实施方案采用不同的方法来环化靶核酸分子(或其互补物)。通常靶核酸分子的环化可采用许多不同的方法,例如用酶(如T4DNA连接酶)或化学方法连接、光化学反应、用酶(如Cre-重组酶)进行位点特异性或同源性重组、以及各种形式的聚合酶延伸法。环化,例如采用酶(如Cre-重组酶)进行重组,可能需要将特异性序列结合到靶核酸分子(或其互补物)的一端或两端。此外,本发明的环化方法可能需要或可能不需要将特异性序列加到复合混合物中的靶核酸分子(或其互补物)的一端或两端。被加到靶核酸分子两端的特异性序列分别称为第一接头核酸分子和第二接头核酸分子。在一个实施方案中,将第一接头核酸分子连接于靶核酸分子。该第一接头核酸含有能使其与靶核酸分子连接的序列或部分。该第一接头核酸分子可可选择地包含可用于后面环化、克隆、检测、扩增或产生RNA的其它确定的序列。不限于上述概念,这种确定的序列包含有限制性内切核酸酶位点、Cre-lox交叉重叠位点、RNA聚合酶启动子位点、聚合酶终止位点、发夹环结构等。例如,该第一接头可含有限制性内切酶位点,借此可在靶核酸的一端或两端产生粘性末端。如果这两个粘性末端是互补的,或通过所提供的发夹环引物的两个粘性末端相连接,所得到的靶核酸可以被环化。
在另一个实施方案中,通过与靶核酸分子杂交或与靶核酸分子连接可以将第一接头核酸分子添加到靶核酸分子。在利用杂交的实施方案中,第一接头核酸分子在其3’端有一用于杂交的互补区。例如,该互补区可以是能与mRNA的聚A尾杂交的聚T序列。如果靶核酸的序列是已知的话,则另一个实施例是确定的序列。如果靶核酸的序列是未知的,那么该互补区可以是能随机杂交的随机短序列,例如六聚、七聚、八聚、九聚、十聚、十一聚或十二聚序列。在某些实施方案中,如果靶核酸是RNA,则可在与靶核酸分子杂交后通过加入聚合酶(如逆转录酶)来延伸该第一接头核酸,该第一接头核酸可含有靶的环化所需的发夹结构。在另一个实施方案中,一旦聚合酶抵达模板链的末端,即可将特定的核苷酸加到新生链的末端。例如,MMLV逆转录酶可将胞嘧啶核苷酸加到新生链的末端。可直接使用这种突出端,或将其用于延伸,例如将寡聚核苷酸转换而环化靶核酸以确保扩增全长靶核酸。例如,可将发夹环寡(核苷酸)转换引物直接连接于所加的胞嘧啶核苷酸,或作为模板进一步延伸所加的胞嘧啶核苷酸,然后与发夹环寡转换引物相连。在其它实施方案中,末端转移酶被用于产生这种突出端。在其它实施方案中,第一接头核酸分子可包含接头池,在其3’端具有随机序列,在其5’端具有可选择的预选任意序列,包括确定的结构序列。可以将这种第一接头核酸分子与单链或双链靶核酸分子一起使用。对于单链靶核酸分子,该第一接头核酸分子可具有发夹结构,可接连于两端,然后延伸并连接以进行环化。对于双链靶核酸分子,由于该双链靶核酸分子两端在“呼吸”时或通过双链的变性的随机解链,随机序列在双链靶核酸分子的两端发生杂交。该第一接头核酸分子作为模板,来延伸双链靶核酸分子的两端,以产生用于环化的突出端。此外,该第一接头核酸分子可具有发夹结构,可在环化延伸之前或之后或不延伸时,连接于双链靶核酸分子的两端。因此,这种接头核酸分子可用于环化未知或已知序列的整个靶核酸分子。
在某些实施方案中,在靶核酸(或其互补链)环化前或作为其环化的一部分,将第二接头核酸分子连接到靶核酸或靶核酸的互补链上。该第二接头核酸分子含有能使其连接到靶核酸分子上的序列或部分。该第二接头核酸可选择地还含有与第一核酸分子互补的区域,从而能通过重组如通过Cre-LoxP系统而环化。例如,利用含LoxP序列的polyT作为RT引物和含LoxP序列作为寡聚转换引物,将LoxP序列加到靶mRNA的两端。使用Cre-重组酶可以环化所得的两端含LoxP序列的RNA-DNA双链体。可用RNA酶H使RNA产生缺口从而作为进行滚环扩增的引物。在其它实施方案中,第二接头核酸分子可包含具有粘性末端的发夹结构,并可与靶核酸的粘性末端连接以形成环形结构。在另一个实施方案中,第二接头核酸分子可含有能与第一接头核酸分子杂交的区域,从而通过第一接头核酸分子与第二接头核酸分子的杂交而环化靶核酸分子。如同第一接头核酸分子,第二接头核酸分子还可含有其它有助于环化靶核酸分子的区域和确定的环结构,它们含有有用的序列,如限制性内切酶位点、聚合酶启动子位点、发夹环结构等。在另一个实施方案中,当靶核酸分子是mRNA时,可通过寡聚转换方法添加第二接头核酸分子。在这种情况下,该寡聚转换引物可以是发夹,并通过连接或延伸后连接而共价结合于cDNA的第一链。其优点是只扩增全长mRNA转录物。对于某些实施方案,可将3’端具有随机化序列的第二接头核酸分子,通过其与靶核酸分子的随机杂交然后用聚合酶延伸,而加到靶核酸的另一端。
在靶核酸分子是mRNA的一个方面,环化的核酸分子理论上包括全长的cDNA。可用使用提供的引物或作为引物的随机聚合物来扩增该环化的全长cDNA,以产生多拷贝的全长双链cDNA。所提供的随机聚合物在其5’端可含有T7启动子序列。指数扩增后,可用T7聚合酶对所得到的双链产物进一步扩增以产生RNA。另一方面,可用嵌合引物(例如5’端含有核糖核苷酸的引物)对环化的全长cDNA进行扩增。一旦引物与作为模板的环化cDNA杂交并延伸,RNA酶H将使5’端的核糖核苷酸序列产生缺口。然后另一引物取代原先的引物与之杂交而发生聚合和延伸,此过程将循环进行。在某些实施方案中,环化的核酸分子包含RNA聚合酶启动子序列,例如T7RNA聚合酶启动子。根据T7启动子的方向和位置,扩增的DNA可以用作模板来产生多拷贝反义RNA(aRNA)或mRNA。通过将RNA转录与滚环扩增相结合,使aRNA或mRNA的扩增效率与采用T7聚合酶而不扩增相比得到极大的增强。而且,本发明的方法可消除3’偏差和简化扩增RNA的过程。在其它实施方案中,可在靶核酸分子的两端提供RNA聚合酶启动子插入到环化核酸分子中,以产生双链RNA。所得双链RNA可被Dicer片段化以用于RNAi扩增。
本发明还提供利用滚环扩增以扩增和检测靶核酸分子所需区域的方法。可利用第一接头核酸分子或第二接头核酸分子或二者的组合,来确定拟采用与所需区域上靶核酸杂交或杂交连接的方法进行扩增的靶核酸分子的有关区域。第一和第二接头都含有发夹结构。该发夹结构可在它们与靶杂交之前或之后形成。如果存在靶(序列),第一和第二接头可通过连接、或它们与该靶(序列)相互作用后而环化。在连接形成环之前可能需要其它反应步骤,如聚合。而且,根据靶(序列)中是否存在突变,第一和第二接头的环化可与突变检测相结合。
靶核酸分子可通过许多方法环化,包括但不限于:平端连接、将互补的两端进行退火然后连接、互补区之间的重组或将引物与聚合酶延伸进行退火。环化作用可导致核酸的至少一条链被环化。可通过自身引发进行mRNA靶核酸分子的环化,即可通过逆转录酶合成cDNA的第二条链后自身连接闭合环。cDNA的第一条链5’端的发夹环结构将进一步协助该自身连接反应。第二条链的这种自身引发的合成产物是对应于mRNA的5’端被发夹环闭合的双链cDNA分子。同样,也可利用自身引发来环化单链DNA。
本发明包括在靶核酸分子被环化后的多种滚环扩增方法。在某些实施方案中,采用了能在适当的启动子序列部位诱导聚合的聚合酶。该启动子序列可以是已加到第一接头核酸、第二接头核酸或二者组合中的序列。某些实施方案中,聚合酶需要游离的3’端才能开始聚合。有许多方法可产生这种游离的3’端。在一个实施方案中,该3’端来自环化。在另一个实施方案中,在环化后,通过加入一个或多个能与环化核酸的某部分杂交的引物来产生3’端。在某些实施方案中,引物可以是RNA:DNA嵌合体。在某些实施方案中,可利用随机聚合物作为引物。在其它实施方案中,采用有限量的内切核酸酶使环化DNA随机产生缺口而导入该游离3’端。在扩增RNA的情况时,可用有限量的RNA酶H使RNA产生缺口,或用过量的RNA酶H完全去除RNA。在其它实施方案中,用限制性内切酶在半甲基化的限制位点切割导入该游离3’端。
在需要游离3’端的实施方案中,靶核酸可通过该游离3’端经滚环扩增进行扩增。某些实施方案包括通过加入RNA酶引发靶核酸分子中所加入的启动子进行转录来产生RNA转录物。在某些实施方案中,只采用一个能导致线性扩增的引发点。这可通过添加单一引物、采用一个聚合酶起点或只在环化核酸分子的一条链上产生游离3’端来实现。其它实施方案中,通过产生对应于两条链的游离3’端来实现指数扩增。实施例是加入一对引物,各自与环化核酸分子的不同链退火。
在另一个实施方案中,可将环化的全长靶多核苷酸序列构建为含有影响转录和翻译的调节元件以便可以利用它们在体内外表达蛋白质,和/或特定用途的标记序列,例如检测标记。这些方法消除了将双链cDNA插入到载体或质粒中的复杂性。
在本发明的另一方面,通过加入含有能与靶核酸分子杂交的第一区域的环形核酸分子,来检测和/或扩增靶核酸分子。靶核酸分子与该环形核酸分子杂交,在靶核酸分子的可延伸游离3’端启动滚环扩增。在靶核酸分子与环形核酸分子杂交之前或之后,可在该靶核酸分子中产生可延伸的游离3’端。当靶核酸分子是3’端具有聚A尾的mRNA时,这特别重要。杂交前或杂交后通过靶核酸分子的位点特异性切割或随机切割可产生游离的3’端。本领域技术人员知道有许多位点特异性切割方法,它们均包括在本发明中。实施例包括限制性内切酶,对于RNA,有核酶、RNAi Dicer等。随机切割可用化学试剂或非特异性核酸酶进行。
在本发明的一个实施方案中,可利用合成的寡核苷酸自连接而不是模板依赖性连接或通过锁式探针来构建环形核酸分子。此法是一种单分子反应或者分子间反应,比采用锁式探针或模板依赖的连接反应更有效和精确。
在本发明的另一个实施方案中,可利用已有的全长cDNA克隆文库进行PCR扩增,或从RNA来构建任何基因的全长环形核酸分子。所产生的全长环形核酸分子可用于特定基因和靶分子的扩增、检测和定量。
在本发明的另一个实施方案中,通过使用环形核酸分子探针检测和扩增靶核酸分子。该环形核酸分子能与靶杂交,可含有靶序列。可从提供的DNA片段、RNA片段、或RNA DNA嵌合片段选择性产生游离3’端。可利用靶分子与所加片段之间相互作用后的其它反应步骤,如RNA酶切割缺口、聚合酶反应或其它反应,来产生游离3’端。产生的游离3’端只用于以环形核酸分子作为模板的聚合和检测,仅仅当存在靶核酸分子时,无论靶核酸分子中是否存在突变。加入的片段可以是有或没有特殊结构的线性、发夹或环形片段。可能有一种以上的片段能同时与靶核酸分子相互作用。加入的片段与靶核酸分子之间相互作用的过程可以是环化,能重复产生用于滚环扩增的游离3’端。靶核酸分子可以是单链DNA、双链DNA或RNA。实施例见图5D、5E、5F。因此,可用此法来选择性扩增具有特定序列(例如突变或无突变的靶核酸分子),此法中只是在具有该特定序列的环化核酸分子上引发RCA。
一旦在某游离3’端处引发了滚环扩增,可利用加入的与新生链互补的引物进一步增强扩增。
在本发明的另一方面,可通过只在突变或非突变的靶核酸分子中选择性产生用于RCA的游离3’端,来检测靶核酸分子中的突变,例如单个核苷酸多态性。实施例包括靶向突变位点的核酶、使靶核酸分子与有或无突变的靶核酸分子相互补的核酸分子杂交,然后用能切割错配处的酶(如S1核酸酶)产生缺口。
在本发明的另一方面,靶分子可以是单链或双链DNA。在3’端延伸被阻断处可加入RNA片段。如果存在靶核酸分子,该RNA片段将与靶杂交,然后酶(如RNA酶H)将消化加入的RNA片段产生游离3’端。因此,加入的环形核酸分子将启动滚环扩增。所述RNA片段可含有发夹环以提高反应特异性。
可用诸如以下所述可用于检测核酸的任何方法来进行扩增产物的检测。
本发明的许多实施方案可在固相基质上进行。合适的固相基质包括所述序列(靶序列、探针、提供的片段等)可与之偶联或吸附的任何固体材料,包括例如丙烯酰胺、纤维素、硝酸纤维素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、玻璃、聚硅酸盐、聚碳酸酯、特氟隆、碳氟化合物、尼龙、硅橡胶、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚富马酸丙脂、胶原、葡胺聚糖和聚氨基酸。合适的固相基质可以是任何有用的形式,包括薄层/膜、珠、瓶、碟、玻片、纤维、纺织纤维、成型聚合物、颗粒和微粒。固相基质的优选形式是微量滴定平皿和载玻片,特别是微阵列载玻片,其上可附着多达256个形成小斑点阵列的不同靶样品。各点直径优选为0.1~2.5mm,最优选直径约2.5mm。这种微阵列可用熟知的光刻蚀法、接触沉积法和喷墨打印法等加以制作。
固定在固相基质上的序列可使形成定位于该固相基质上的靶特异性扩增的核酸。这种定位提供了两种便捷方法,包括洗去可能干扰后续检测步骤的反应成分及同时测定多个不同样品。在不同样品附着的各位点可独自形成扩增的核酸。可利用已发表的方法来固定靶序列或其它寡核苷酸分子以形成固相样品。
附图的简要说明
图1概括了用RCA扩增RNA的几种本发明实施方案。
图2和3概括了环化RNA和DNA模板的本发明实施方案。
图4概括了如何用RCA检测SNP和如何扩增特定基因片段。
图4概括了用RCA扩增DNA的方法。
图5概括了用环形探针检测RNA和DNA的方法。
发明详述
如本文所用的术语,“环形核酸分子”是具有至少一条不间断链的核酸分子。可利用该环形核酸分子来检测和扩增靶核酸分子。该环形核酸分子中可含有靶核酸分子的至少一部分,或靶核酸分子的至少一部分与该环形核酸分子的一部分相互补。该环形核酸分子可以是RNA、DNA、PNA或它们的任何组合。该环形核酸分子可含有天然或非天然碱基,也可含有丢失的碱基。该环形核酸分子可用合适的技术来产生包括但不限于合成和天然的方法。
如本文所用的术语,“环化的核酸分子”是其环形部分中含有靶核酸分子或与靶核酸分子相互补的核酸分子。该环化的核酸分子作为扩增和克隆过程的一部分而产生。该环化的核酸分子含有至少一条不间断链。该环化的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA或它们的任何组合。该环化的核酸分子可含有天然或非天然碱基也可含有丢失的碱基。
如本文所用的术语,“游离3’端”是退火为聚合酶可延伸的模板核酸链的核酸分子的3’端。
如本文所用的术语,“靶核酸分子”是拟通过滚环扩增来进行克隆、扩增或检测的核酸分子。靶核酸分子可获自任何来源。可以是mRNA、rRNA、RNAi、被加工的RNA、基因组DNA和cDNA等。
靶核酸的制备
本发明包括待扩增用于克隆、检测等的靶核酸分子。所公开的方法适合于任何感兴趣的核酸分子。该核酸分子可获自任何来源,包括但不限于:细胞或组织样品、文库中的核酸分子、化学合成的核酸分子、基因组核酸分子、克隆的核酸、这些核酸的混合物、信使RNA、包括它们的剪接变体和中间体。所述方法特别适合于产生mRNA混合物文库。唯一要求是该核酸能根据本发明的方法被环化,或具有确定的序列以用本发明方法检测。
用本领域技术人员可采用的各种方法可获得该核酸。许多这种方法的详细方案见例如:Ausubel等,Current Protocol in Molecular Biology(Supplemented through2000)Jone Wiley & Sons,New York;Sambrook等,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版),1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989;Berger和Kimmel,Guide toMolecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology第152卷,AcademicPress,Inc.,San Diego,CA。
一旦获得了感兴趣的核酸分子,可根据后面施用于该分子的方法对该分子进行进一步操作。例如,用环形核酸检测靶核酸分子时,该靶核酸可经预处理以产生不同的或额外的游离3’端。实施例包括用位点特异性核酶靶向切割,或与互补核酸序列杂交后用适当的核酸酶消化。对于mRNA,可用本领域普通技术人员知道的任何合适技术去除聚A尾。关于mRNA的一个实施例是加入单链polyT DNA和RNA酶H。此外,可切割较长的核酸分子产生较短的片段。这类切割的实施例包括用移液器或超声波物理性剪切DNA,用限制性内切酶消化等。
此外,为帮助环化,可用各种其它方法处理核酸,如用限制性酶产生的突出端充填、用多核苷酸激酶加入磷酸基团进行后续连接或用磷酸酶去除磷酸基团防止后面的连接。可将限制性内切酶产生的粘性末端退火连接而环化进行滚环扩增的核酸。如上所述,本领域技术人员可在文献中找到所有这些方法的详细方案。
靶核酸的环化
本发明包括通过连接、杂交连接、杂交聚合和连接、重组、化学反应和光反应来进行环化。为特定反应选择合适的连接酶是本领域常规的:如为DNA分子选择DNA连接酶和为RNA选择RNA连接酶等。合适的连接酶包括:用于环化单链DNA或RNA的T4RNA连接酶、T4DNA连接酶(Davis等,Advanced Bacterial Genetics-A Manual for Genetic Engineering(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1980)、大肠杆菌(E.Coli)DNA连接酶(Panasnko等,J.Biol.Chem.253:4590-4592,1978)、AMPLIGASE.RTM(Kalin等,Mutat Res.,283(2):119-123,1992;Winn-Deen等,Mol Cell Probes(England)7(3):179-186,1993)、Taq DNA连接酶(Barany,Proc.Natl.Acad Sci.USA 88:189-193,1991)、Termas Thermophilus DNA连接酶(Abbott Laboratories)、Thermus scotoductus DNA连接酶和Rhodothermusmarinus DNA连接酶(Thorbjarnardottir等,Gene.151:177-180,1995)。对于涉及RNA靶核酸分子的连接优选T4DNA连接酶,因为它能够连接DNA:RNA杂交体中的DNA端(Hsuih.等,用新的依赖连接的聚合酶链反应定量检测HCV RNA,American Association for the Study of Liver Diseases(Chicago IL,Nov.3-7,1995)。
靶核酸分子的环化可包括环化靶核酸(包括靶分子的所需区域或亚组)或其互补物,或靶核酸互补链的互补链,或靶核酸与其互补物的组合,或靶核酸互补链与靶核酸互补链的互补链的组合。
可采用特异性序列与靶核酸或靶核酸的互补链或靶核酸与其互补链的结合物的一端或两端结合来环化靶核酸。加在靶核酸两端的特异性序列被称为第一和第二接头核酸分子。将第一接头或第二接头连接于靶核酸后,可采用其它反应,如杂交、连接、聚合和连接、或限制性酶反应和连接来环化靶核酸。
使接头连接于靶核酸包括:使可选择的序列与确定的结构相连接,使反应性功能基团与靶核酸或其互补链的所需区域相连接,这样可用RCA环化和扩增整个靶核酸或其互补链,或它们的一部分。
可用本领域普通技术人员已知的许多技术将第一接头核酸分子连接于靶核酸分子。宜将第一接头核酸分子连接于靶核酸的一端。在某些实施方案中,可将第一接头核酸分子连接于靶核酸的两端。使第一接头与靶核酸连接的方法包括:连接、杂交连接、杂交后用聚合酶延伸、及诸如末端转移酶和连接酶的其它酶反应。优选的实施例是第一接头3’端含有针对mRNA靶核酸的聚-T序列。此外,该接头可含有一个或多个其它序列,可选择地具有能促进环化、检测等预先确定的特定结构。实施例包括RNA和/或DNA聚合酶启动子、位点特异性重组序列如loxP、一般性重组的同源性序列、限制性位点(包括半甲基化位点)、转录终止位点、核糖体结合位点、核酶结合位点、RNAi、复制起始点、基因,包括ORF、发夹结构等。可选择的,可用与这些相似的方法来连接第二接头。第二接头可含有可用于环化、检测等的一个或多个其它序列。此外,当靶核酸分子是mRNA时,第二接头可用CAP-切换(switch)方法连接(如美国专利5,962,271)。此外,第二接头可用寡-加帽(oligo-capping)方法连接(如美国专利5,597,713)。如Patel等,PNAS,93:2969-2974所述的,第二接头也可以利用CAP-切换的方式来杂交连接。CAP切换的模板或模板切换的寡核苷酸可具有发夹结构并被连接于靶核酸,或可具有限制性酶位点而产生环化所需的粘性末端。实施例见图2A。
在具体实施方案中,第一和/或第二接头具有发夹结构。凭借第一接头或第二接头中的发夹结构,在靶核酸所需区域中产生第二发夹并与第一发夹形成一个环而环化靶核酸。环化第一和第二发夹之间的靶序列的反应,包括杂交、聚合或连接步骤,或杂交、聚合与连接的组合。通过连接或杂交,或杂交与连接二者的组合,或自身引发,可产生第二发夹。实施例见图2A,2B。
在具体实施方案中,第一和/或第二接头含有一个或多个限制性酶位点。凭借第一和/或第二接头中的限制性酶位点,可在靶核酸的一端或两端产生粘性末端。通过与发夹片段的一个或两个粘性末端连接可环化靶核酸。或者,将靶核酸的两个粘性末端互补连接以形成环。实施例见图2C、3B。
在具体实施方案中,第一和/或第二接头含有同源序列。两端具有同源序列的靶核酸可用重组酶环化。实施例见图2D。
对于单链或双链核酸分子,如果靶序列未知,第一和可选择地第二接头核酸分子可含有随机序列;或如果靶序列已知,可在它们的3’端含有确定的序列,该序列可杂交连接于靶核酸分子,或杂交并通过加入适当的聚合酶而延伸连接。接头核酸分子可含有具有确定结构的额外序列,如用于环化的发夹。由于双链体的瞬间解链(breathing)或双链体的变性,造成两端的双螺旋发生随机解链(random unzipping),具有发夹结构的第一接头或可选择地第二接头将在双链核酸分子的两端发生杂交和连接。一旦此链打开,接头杂交或连接,聚合酶即可从游离3’端延伸。连接3’端与5’端而形成环。或者,由于双链体的瞬间解链(breathing)造成两端的双螺旋发生随机解链(random unzipping),含有限制性酶位点的第一接头或可选择地第二接头将在双链核酸分子的两个末端发生杂交。一旦打开此链并且接头被杂交或者连接,聚合酶即可从靶核酸分子的游离3’端延伸产生平末端。所产生的双链靶核酸分子然后可被环化和扩增。实施例见图3C、3D。
靶核酸分子可通过杂交环化。连接的第一接头可与靶核酸分子的另一端杂交,或可选择地连接的第二接头杂交。本领域技术人员明白,如果需要,本发明可以可选择地包括其它的间插接头。杂交后,应采用连接酶来产生至少一条链,该链连接于毗连分子。靶核酸分子也可用化学反应或光反应加以环化。实施例见图3A。
此外,mRNA靶核酸分子可通过自身引发的逆转录反应产生第二条DNA链而环化。一旦该链合成,可通过连接而闭环。在某些实施方案中,第一接头核酸具有发夹,可增强自身引发后的环化。发夹环可以是任何大小,可容纳可能需要的其它序列元件。在某些实施方案中,第一接头核酸也具有限制性酶位点。可在合成第二链DNA后产生粘性末端。然后与发夹片段的粘性末端连接而闭环。实施例见图2B、2C。
此外,从mRNA合成的cDNA的第一链可以不是全长的。此时,第一和可选择地第二接头核酸分子的3’端可含有随机序列,它们能与cDNA第一链的3’端杂交,并通过加入适当的聚合酶进行延伸。可用具有修饰的polyT或修饰的随机引物(含或不含发夹结构,或含或不含限制性酶位点)合成cDNA的第一链。接头核酸分子可含有环化所需的其它序列。
由于双链体的短暂解链(breathing)或双链体的变性,造成RNA:DNA双链体在第一链3’端的随机解链,随机序列凭借发夹结构可在第一链的3’端杂交。一旦链打开,接头杂交或连接,聚合酶可从游离3’端延伸,连接3’端与5’端而形成环。或者,由于双链体瞬间解链造成的两端双链体随机解链,含有限制性酶位点的第一接头或可选择地第二接头可在RNA-DNA双链体的两末端杂交。一旦链打开,接头杂交,聚合酶可从cDNA第一链游离3’端延伸产生平末端。然后所得双链靶核酸可被环化和扩增。实施例可见,例如我们先前的申请中的图14。
此外,靶核酸可通过重组而环化。可利用位点特异性重组酶,如Cre,或通过可将分子与同源区段重组的重组酶(如与LoxP-CreI重组,美国专利5,591,609)来实现这种重组。实施例见图2D。
在一个实施方案中,为了采用RCA来扩增和检测靶核酸的所需区域,可利用第一和/或第二接头,通过与靶核酸所需区域的杂交或杂交连接,来确定靶核酸中待扩增的区域。第一和/或第二接头中所含的发夹结构可在它们与靶核酸杂交之前或之后形成。如果存在靶核酸,第一和第二接头可与之连接而环化,或在它们与靶核酸相互作用后环化。杂交后连接成环前可采用其它反应步骤如聚合反应。此外,可根据靶核酸中是否存在突变,结合突变检测来环化第一和第二接头。实施例见图4A、4B、4C、4D。
第一和/或第二接头可与靶核酸杂交形成三螺旋体并连接形成环。RCA可释放靶核酸用于第二轮杂交、环化和扩增。
可切割连接的环形核酸分子形成线性产物,这些产物可用PCR扩增而不用滚环扩增。
游离3’端的产生
一旦靶核酸环化,需要游离3’端开始RCA,可能需要从靶核酸产生或提供此游离3’端。在靶核酸环化前或环化后从其产生游离3’端。对于涉及靶核酸环化的方法,环化本身可导致游离3’端的产生。如果需要,可用很多方法产生游离3’端。当靶核酸是RNA分子时,它可与互补DNA分子杂交,可用RNA酶H来完全消化此RNA分子,可用限量内切酶切割此RNA,产生游离3’端。此外,可用限量内切酶切割双链核酸分子产生缺口。控制该限制量使两条链不被切断,因为必须保留至少一条链完整,用于滚环扩增。类似地,可利用能切割DNA形成缺口的有限量化学物质来产生游离3’端。
此外,可用硫代磷酸化的或半甲基化的双链核酸来产生特异性游离3’端。某些限制性内切酶在限制性位点被硫代磷酰化或半甲基化时只切割一条链。这种半甲基化的DNA可用许多方法产生。例如,可用甲基化的核苷酸在关键部位化学合成核酸分子;可在体外用位点特异性DNA甲基化酶将核酸分子甲基化;或可从表达所需位点特异性DNA甲基化酶的生物体获得核酸分子。还有可采用天然只能切割双链体一条链的某些限制性内切酶,如N.AlwI、N.BstNBI(二者均可获自New England Biolabs)。
此外,可采用核酶或RNAi构建物如Dicer在特定位置切割核糖核酸,产生游离3’端。
产生游离3’端的另一种方法是通过提供寡核苷酸引物来完成的。优选的引物是链置换引物。一种形式的链置换引物是具有与环形核酸一条链互补序列的寡核苷酸。此序列称为链置换引物的匹配部分。链置换引物的匹配部分可与任何序列互补。然而,如果用于此目的,优选的是它不与任何其它链置换引物互补,这可防止引物之间彼此杂交。链置换引物的匹配部分可与插入的核酸分子的全部或一部分互补,虽然这不是优选的。链置换引物的匹配部分可以是能支持引物及其互补物之间特异和稳定杂交的任何长度。通常此长度是12-35个核苷酸,优选长度为18-25个核苷酸。
链置换引物的5’端最好还含有不与环形核酸一条链的任何部分相匹配的其它序列。此序列称为链置换引物的非匹配部分。链置换引物的非匹配部分如果存在的话,其作用是促进DNA复制时的链置换。链置换引物的非匹配部分可以是任何长度,但通常长度为1-100个核苷酸,优选长度为4-8个核苷酸。
链置换引物的5’端可选择地可含有其它RNA序列,该序列可与环形核酸一条链的任何部分匹配或不匹配。采用这种嵌合引物的实施例见美国专利No.6,251,639和美国专利申请No.2003/0087251。
可采用其它链置换引物来增强靶核酸的扩增。其它链置换引物可与第一链置换引物互补物的相同链相互补,以线性增强扩增,或具有与第一链置换引物互补物相同的序列而呈几何级数地增强扩增。还有,优选引物链置换引物不与其它任何链置换引物相互补,以防止引物彼此杂交。
链置换引物也可含有修饰的核苷酸以使它们能抵抗外切酶的消化。例如,引物在其5’端核苷酸之间可以有3个或4个硫代磷酸酯键。这种核酸酶抗性引物可选择性地降解过量的未连接的线性载体,否则这些载体可能干扰探针与引物杂交形成扩增的核酸。如下所述,链置换引物可用于链置换复制和链置换级联反应扩增。
此外,可通过加入随机序列的短寡核苷酸来提供游离3’端。优选的长度为六聚体。为帮助链置换,核苷酸的5’端可以是RNA。
滚环扩增
可用本发明的环化核酸分子和环形核酸分子进行滚环扩增。该反应需要两种成分:(a)游离3’端和(b)滚环聚合酶。此聚合酶在进行性滚环聚合反应中可催化引物延伸和链置换直到所需的程度,可产生多达100000个核苷酸的分子或更大的分子。该重复DNA序列DNA(R-DNA)由环形或环化核酸分子序列的长重复单元组成。许多参考文献公开了所用的引物、引物设计和扩增技术,包括美国专利No.5,871,921、No.5,648,245、No.5,866,377和No.5,854,033,也参见美国专利申请No.20030165948。
用环形核酸探针检测
本发明还包括用环形核酸分子作为探针,根据是否发生了RCA来检测靶核酸分子。该探针可包含整个靶序列或其一部分或其互补链,根据游离3,端的来源与探针杂交引发RCA。如果游离3’端产生自引发RCA的靶序列或其互补序列,这些探针包含整个靶序列或其互补序列的一部分,和/或能与之杂交。如果游离3’端不是产生自靶序列或其互补序列,该探针不必含有整个靶序列或其互补序列的一部分,和/或不必与之杂交。
该探针的第一部分含有能与感兴趣的靶核酸分子杂交的序列,其第二部分含有能检测扩增的环的序列。
本发明的一个方面,可利用自身连接从线性短寡核苷酸片段构建探针。这些线性短寡核苷酸片段可含有特定的发夹结构,使它们能自身连接形成环形核酸分子。这种方法与锁式探针和其它模板相比具有优点。连接效率高得多,能避免错误连接形成更大的线性链或更大的环形核酸分子。
本发明的另一个方面,可从市售全长cDNA克隆文库构建全长的环形cDNA核酸分子。用PCR选择性扩增特异性基因克隆,然后通过自身连接而环化。所得到的环形cDNA核酸分子可用于基因特异性检测和扩增,不需要采用TaqMan或RT-PCR。
一个实施方案中,探针可可选择地含有可用于后续无隆、检测、扩增或产生RNA的其它确定的序列。这种确定的序列包括:限制性内切酶位点、RNA聚合酶启动子位点、聚合酶终止位点、长度短的随机化序列,如六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体或十二聚体。
本发明包括以简化程序联合使用逆转录酶和等温链置换酶以逆转录酶滚环扩增(RT-RCA)方式扩增RNA的组合物和方法。用逆转录酶转录RNA产生cDNA。用等温链置换酶环化cDNA并扩增。如果存在T7启动子,可转录扩增产物产生RNA。这种RNA扩增方法结合了滚环扩增和T7扩增的扩增效力。因此本发明促进了核酸分子的快速有效扩增和RNA分子的检测与定量。本发明也可用于快速生产和扩增可用于各种产业、医学和法医学目的的cDNA(单链和双链)。
探针也可通过环化靶核酸分子来构建;本说明书中叙述可用于环化靶核酸分子的方法。
一旦靶核酸分子与环形核酸杂交,可利用靶核酸分子作为游离3’端启动滚环扩增。本说明书叙述从靶核酸产生游离3’端启动滚环扩增的合适方法。与上述采用依赖于连接形成环形核酸的滚环扩增来检测的方法相反。然而,在某些实施方案中,可利用直链进行需要连接以启动RCA的检测。此法可用于提高检测的灵敏度。本发明在加入样品前,利用已环化的核酸,而靶核酸本身可提供游离3’端。如果需要,可利用上述产生游离3’端的方法来产生一个或多个游离3’端。本领域技术人员知道可利用引物来提供游离3’端,只要设计这样的引物时注意到该引物不能与环形核酸杂交而直接参与RCA。因此,该引物的3’端可具有与环形核酸相同的序列。这种引物可充许阶乘(n!)扩增。引物较佳为不与靶核酸分子杂交。在一个实施方案中,环形核酸分子还含有聚-A部分。此实施方案可用于检测感兴趣的mRNA。一旦感兴趣的靶核酸结合于该环形核酸即开始滚环扩增,mRNA的聚-A尾将通过互补的聚-T部分结合新生的核酸。这样,在此实施方案中,不需加入任何引物即可实现阶乘(n!)扩增。
本发明的方法也可用于检测突变。可根据只扩增突变的靶核酸分子,或只扩增非突变的靶核酸分子来选择产生游离3’端的方法和反应条件。一个实施例是利用DNA发夹用RNA酶H靶向降解RNA。如果靶核酸分子只携带了一个核苷酸多形性,则该DNA中的发夹将不能退火,RNA酶H将不能消化该RNA产生游离3’端。因此突变的靶核酸分子不能启动RCA。
本发明提供了采用环形核酸分子探针检测和/或扩增靶核酸分子的另一种方法。所述探针可与靶核酸杂交,可含有靶核酸序列。可从提供的DNA片段、RNA片段、或靶核酸分子与上述片段之间相互作用所产生的RNA DNA嵌合性片段的非靶核酸序列,选择性产生游离3’端。靶核酸与提供的片段之间相互作用后,可采用其它步骤,如RNA酶H的切割缺口、聚合酶反应、转录、限制性酶切或其它反应,来产生游离3’端。当存在靶核酸时,或靶核酸分子中存在或不存在明确的突变时,产生的游离3’端可用于以环形核酸分子作为模板的聚合和检测。提供的片段可以是直线、发夹或环形,具有或没有确定的结构,可同时用多个片段与靶核酸相互作用。所提供的片段与靶核酸分子之间的相互作用过程可循环反复产生游离3’端用于滚环扩增。靶核酸分子可以是单链DNA、双链DNA或RNA。实施例见图5D、5E、5F。探针可可选择地含有可用于后续克隆、检测、扩增或产生RNA的其它确定的序列。这种确定的序列包括:限制性内切酶位点、RNA聚合酶启动子位点、聚合酶终止位点、长度短的随机化序列,如六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体或十二聚体。
用检测核酸的合适技术可进行扩增产物的检测。检测方法的一些实施例是染料,它们可直接地或通过额外的连接部分与核酸以共价键、嵌入、或某些其它形式的结合发生相互作用。也可采用放射性标记。
本发明的方法也可用于多重反应中,即同时检测一个样品中的两种或多种核酸。本领域技术人员可采用适合多重检测核酸的方法。通常滚环扩增的产物可能由于其中掺入了不同的标记、产物的长度不同或产物的序列不同而有所差别。掺入不同标记的方法有一个实施例是使用具有附着标记的不同次级引物。设计用于多重检测的环形核酸时,与靶核酸互补的区域以基本上不相同为宜,以限制非特异性引发滚环扩增反应。理想地,应设计任何环形核苷酸以限制可能存在于靶核酸混合物中的非靶核酸的非特异性引发。
检测产物
为了有助于采用克隆和检测核酸用的滚环扩增法对扩增的核酸进行检测和定量,可将检测标记直接掺入到扩增的核酸中,或可偶联于检测分子。如本文所用,检测标记是能与扩增的核酸直接或间接结合的一种分子,这种结合导致可直接或间接测量或检测的信号。许多这类可掺入核酸或偶联于核酸的标记或抗体探针是本领域技术人员知道的。适合用于滚环扩增的检测标记的实施例有:放射活性同位素、荧光分子、磷光分子、酶、抗体、核酸结合蛋白和配体。
合适的荧光标记实施例包括:荧光素(FITC)、5,6-羧甲基荧光素、德克萨斯红、硝基苯-2-氧杂-1,3二唑-4-基酯(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、4’,6-二脒基-2-phenylinodo-le(DAPI)、和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。优选的荧光标记有:荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)和罗丹明(5,6-四甲基罗丹明)。优选的组合性多色彩荧光标记有FITC和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。这些荧光染料的吸收和发射的最大值分别是:FITC(490nm;520nm),Cy3(554nm;568nm),Cy3.5(581nm;588nm),Cy5(652nm;672nm),Cy5.5(682nm;703nm)和Cy7(755nm;778nm),因而可同时检测它们。荧光标记可获自各种商业来源,包括Molecular Probes,Eugene,OR and Research Organics,Cleveland,Ohio。
标记的核苷酸是检测标记的较佳形式,因为它们可在合成时或合成后连接时直接掺入到滚环扩增产物中。可掺入扩增的核酸产物中的检测标记包括例如核苷酸类似物,如BrdUrd(Hoy和Schimke,Mutation Research.290:217-230,1993);BrUTP(Wansick等,J Cell Biology 122:283-293,1993)和生物素修饰的核苷酸(Langer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78:6633,1981)或含有合适的半抗原如洋地黄毒苷的核苷酸(Kerkhof,Anal.Biochem.205:359-364,1994)。合适的荧光素标记的核苷酸如异硫氰酸荧光素-dUTP、花青-3-dUTP和花青-5-dUTP(Yu等,Nucleic Acid Res.,22:3226-3233,1994)。DNA的优选核苷酸类似物检测标记是BrdUrd(三磷酸BUDR Sigma),RNA的优选核苷酸类似物检测标记是生物素-16-尿苷-5’-三磷酸(生物素-16-dUTP,Boehringher Mannheim)。荧光素、Cy3和Cy5可连接于dUTP进行直接标记。可购得Cy3.5和Cy7作为亲和素或抗洋地黄毒苷偶联物进行生物素-或洋地黄毒苷标记探针的次级检测。
然后可用本领域已知的灵敏方法检测掺入到扩增核酸中的检测标记如生物素。例如,可用能结合于生物素的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物(Tropix,Inc),然后用合适底物(如化学发光底物CSPD:3-(4-甲氧螺基(1,2-二氧杂环丁烷-3-2’-(5’-氯)三环(3.3-1.1.sup.3,7)癸烷)-4-基)磷酸苯酯;Tropix,Inc.)的化学发光来检测生物素。
用于检测扩增RNA的优选检测标记是吖啶酯标记的DNA探针(见GenProbe,Inc.Arnold等,Clinical Chemistry 35:1588-1594,1989中所述)。吖啶酯标记的检测探针可不用洗涤而检测扩增的RNA,因为可用碱破坏未杂交的探针(Arnold等,1989)。
也可考虑采用联合二种或多种这些检测标记的分子作为检测标记。可用任何已知的检测标记与公开的探针、标记和标记方法,以及用公开的方法检测扩增的核酸。检测和测定检测标记所产生信号的方法也是本领域技术人员知道的。例如,可用闪烁计数或直接观察检测放射活性同位素;可用荧光分光光度计检测荧光分子;可用分光光度计检测磷光分子;或用照相机直接观察;可检测或观察酶催化反应的产物来检测酶;可检测偶联于抗体的次级检测标记来检测抗体。可直接采用公开的扩增和检测方法中的这些方法。如本文所用,检测分子是能与扩增的核酸相互作用的分子,可将一种或多种检测标记偶联于该分子。
附图说明
本发明包括附图中说明的方法,包括环化靶mRNA用于扩增的方法,如图2中2A、2B、2D、图3中3B和图4中4B所示。这些方法包括采用自身引发和/或寡核苷酸转换模板环化mRNA(优选全长mRNA)的方法,和扩增一个或多个mRNA区段、混合的或单独的mRNA分子的方法。本发明也包括采用预先环化的核酸分子进行mRNA和DNA检测和扩增的方法,如图5中5A、5B、5F所示。所有的这些方法可与公开的多重检测和扩增方法一起联合实施。
图1总结了本发明环化RNA模板的实施方案。在图1A中,RNA模板被转变成3’和5’端都含有发夹的单链cDNA。为形成环,通过聚合3’端发夹,然后将它与5’端发夹相连接合成cDNA的第二链,用RCA扩增所得环形cDNA。3’和5’端的发夹还可含有功能性序列,如检测序列、位点特异性重组序列、同源重组序列、限制性内切酶序列、启动子序列、转录终止序列、核糖体结合序列、核酶序列、复制起始序列、基因或编码序列、发夹环序列和随机序列。
在图1B中,RNA模板转变为一端含有闭环结构另一端为粘性末端的双链cDNA。为形成环,使含粘性末端的发夹与双链DNA相连接。得到的环形cDNA用RCA进行扩增。待连接于双链cDNA的发夹DNA还可含有功能性序列(同上)。
在图1C中,RNA模板转变为3’和5’两端都含有LoxP位点的RNA-DNA双链体。Cre-重组酶将环化此双链体;RNA酶H将切割缺口该双链体;利用RNA片段作为引物进行RCA。所得cDNA包含可进一步含有功能性序列(同上)的3’和5’端。
在图1D中,RNA模板转变为3’和5’两端都含有发夹的单链cDNA。两个发夹相毗邻并连接形成环。用RCA扩增所得环形cDNA。发夹可进一步含有功能性序列(同上)。
在图1E中,RNA模板转变为两端都为粘性末端的双链cDNA。连接3’和5’粘性末端形成双链环(图1F)。或者,可使含粘性末端的发夹与双链cDNA连接形成环(图1G)。用RCA扩增所得环形cDNA。图1E、1F和1G中那些与双链cDNA连接的发夹,以及双链cDNA的3’和5’两末端的发夹可进一步含有功能性序列(同上)。
图2显示用RCA环化和扩增RNA的几个本发明实施方案。图2A中,采用3’端含有聚-T的发夹引物合成cDNA的第一链。将寡核苷酸发夹引物通过连接、或聚合连接加到cDNA第一链的3’端。用RNA酶H消化RNA-DNA双链体。然后合成cDNA的第二链,连接形成环。该发夹引物可进一步含有功能性序列(同上)。
在图2B中,采用3’端含有聚-T的发夹引物合成cDNA的第一链。用自身引发合成cDNA的第二链。连接3’和5’端形成环。该发夹引物可进一步含有功能性序列(同上)。
在图2C中,采用含有限制性酶位点的聚-T引物合成cDNA的第一链,用自身引发合成cDNA的第二链。限制性酶切割双链cDNA产生粘性末端,然后使含粘性末端的发夹与双链cDNA连接形成环。待连接双链cDNA的聚-T引物或发夹可进一步含有功能性序列(同上)。
在图2D中,采用含有LoxP位点序列的聚-T引物和含有LoxP序列的寡核苷酸转换引物合成cDNA的第一链,得到的RNA DNA双链体用Cre-重组酶形成环。用RNA酶H切割缺口RNA,产生的RNA片段用作引物进行RCA。聚-T引物和寡核苷酸转换引物可进一步含有功能性序列(同上)。
图3显示用RCA环化和扩增RNA和DNA的本发明另一个实施方案。在图3A中,用于合成cDNA第一链的引物含有聚-T序列、5’端的发夹结构和其它与寡核苷酸转换引物某区段相同的序列。利用消化和纯化来消除RNA模板和未起反应的寡核苷酸转换引物。cDNA第一链的3’和5’端形成两个毗邻的发夹,它们可连接形成环。聚-T引物和寡核苷酸转换引物可进一步含有功能性序列(同上)。
在图3B中,合成cDNA第一链的引物含有聚-T引物和5’端的限制性位点。寡核苷酸转换引物同样含有限制性位点。用聚-T引物和寡核苷酸转换引物合成cDNA的第一链。所得RNA-DNA双链体用限制性酶切割,产生的粘性末端连接形成环。或者,环化前,可用RNA酶H消化去除RNA模板,用第二轮DNA聚合产生双链DNA,如上所述进行环化。聚-T引物和寡核苷酸转换引物可进一步含有功能性序列(同上)。
图3C中,为扩增单链或双链cDNA,在3’和5’端连接两个发夹。延伸3’端发夹并与5’端发夹连接产生环形DNA。用RCA扩增所产生的环形DNA。3’和5’端的发夹DNA可进一步含有功能性序列(同上)。
图3D中,为扩增双链DNA,通过加入两个短片段作为模板与用于聚合酶延伸的两端杂交进一步延伸该双链DNA的两端。延伸的3’端彼此互补;因此该双链DNA可环化。或者,可将具有粘性末端的两个发夹连接于延伸的双链DNA以产生环形DNA。可用RCA扩增所产生的环形DNA。
图4总结了本发明采用RCA进行SNP检测和扩增特定基因片段的实施方案。图4A显示RNA模板中的SNP位点,其前后具有区域A’和B。探针含有与区域A’互补的区域及与区域B相同的区域。其余是核苷酸任意序列。该探针3’端的碱基在SNP位置右侧,如果这最后的碱基与SNP相匹配,该探针可延伸产生与探针区域B相互补的序列区。利用终止寡核苷酸与靶RNA杂交产生RNA-DNA双链体,使延伸终止于所需区域。如果最后的碱基与SNP不匹配,探针不能延伸。将不会产生与探针区域B相互补的序列区。一旦探针延伸,即可产生发夹结构。可用诸如图2-3所示方法环化所得的cDNA。用RCA扩增该环形cDNA。如果探针不延伸或非特异性延伸,所得的cDNA不能环化,也不能用RCA扩增。
图4B显示靶RNA中有一个SNP位点,该SNP位点前后具有区域A’和B’,B’区域的下游还另有区域C’和D’。此靶RNA中区域B’和C’之间可有或无其它序列区域。探针含有与靶RNA区域A’互补的区域A,与靶RNA区域B’相同的区域B’,和其它预先选的任意序列。该探针的3’端是SNP位置右侧的碱基。如果此最后的碱基与SNP相匹配,则该探针将延伸产生与探针区域B’互补的序列区域。采用能与靶RNA杂交产生RNA DNA双链体的终止发夹寡核苷酸可将此延伸终止在所需区域。该终止发夹寡核苷酸含有相互补的区域D和D’、预选的任意核苷酸环形序列和另一区域C’。通过控制TM,该终止发夹寡核苷酸能与此靶RNA杂交。如果此探针最后的碱基与SNP不匹配,则该探针不能延伸,不能产生与探针区域B’相互补的序列区域。因此,此探针在靶RNA被消化后不产生发夹结构。一旦此探针正确延伸,在靶RNA被消化后将能产生发夹结构。延伸后形成的探针发夹具有与上述终止发夹寡核苷酸粘端相互补的粘性末端。因此形成的该探针发夹与终止发夹寡核苷酸能连接形成环。产生的环形核酸分子可进行RCA。如果此探针不能延伸或不能特异性延伸,则不能形成探针发夹而不能与终止发夹寡核苷酸环化,不能用RCA扩增。如果靶RNA的区域B’和C之间有一个或多个其它序列区域,在靶RNA被消化后需要终止发夹寡核苷酸延伸的C’端与形成的探针发夹寡核苷酸环化。
图4C显示靶RNA中有一个SNP位点,该SNP位点前后具有区域A’和B’,B’区域的下游还另有区域C’和D’。探针含有与靶RNA区域A’互补的区域A,与靶RNA区域B’相同的区域B’,与靶RNA区域C’相同的区域C’,及其它预选的任意序列。该探针的3’端是SNP位置右侧的碱基。如果此最后的碱基与SNP相匹配,则该探针将延伸产生与探针区域B’互补的序列区域。采用能与靶RNA杂交产生RNA DNA双链体的终止发夹寡核苷酸可将此延伸终止在所需区域。该终止发夹寡核苷酸含有相互补的区域D和D’、可选择的核苷酸环形序列和另一区域C。通过控制TM该终止发夹寡核苷酸能与此靶RNA杂交。如果此探针最后的碱基与SNP不匹配,则该探针不能延伸,不能产生与探针区域B’相互补的序列区域。并且,此探针在靶RNA被消化后不产生发夹结构。一旦此探针正确延伸,在靶RNA被消化后将能产生发夹结构。延伸后形成的探针发夹具有与上述终止发夹寡核苷酸粘端相互补的粘性末端。因此形成的该探针发夹与终止发夹寡核苷酸能连接形成环。产生的环形核酸分子可进行RCA。如果此探针不能延伸或不能特异性延伸,则不能形成探针发夹而不能与终止发夹寡核苷酸环化,不能用RCA扩增。
图4D显示SNP位点下游具有区域A的DNA模板。SNP探针的5’端含有与区域A相同的序列。SNP探针的3’端是SNP位置右侧的碱基。如果此最后的碱基与SNP相匹配,则该探针将延伸产生能与SNP序列的5’端杂交的互补序列形成发夹结构。如果此最后的碱基与SNP不匹配,该探针不能延伸,不能产生发夹结构。SNP探针上游的其它探针是链置换探针,可置换模板中的SNP探针。一旦延伸后模板中的SNP探针被置换,可用图4A所示方法将其环化。产生的环形DNA可用RCA扩增分化出SNP。
图5总结了用环形探针检测RNA和DNA。图5A中,从全长cDNA克隆文库或从RNA产生了单链全长的基因并环化。此环也可含有预选的任意核苷酸序列。产生的环形DNA可用作探针来检测复杂混合物中的靶RNA。待检测的RNA将与此环形DNA杂交和用RNA酶H切割缺口。带缺口的靶RNA片段可用作RCA的引物。为避免聚-A RNA尾起引物作用,此全长单链环形DNA可含有聚-A部分代替聚-T部分。一旦靶RNA结合此环形DNA即开始RCA,mRNA的聚-A尾将与含互补性聚-T部分的RCA产物结合,作为引物进一步扩增。此时,反应系统中不必加入任何引物即可达到指数扩增。
图5B中,全长环形基因可与cDNA的第一链杂交,cDNA的第一链用作RCA的引物。该全长环形DNA还可含有功能序列(同上)。
图5C中,环形DNA用作探针加入到RNA靶检测的复合混合物中。在与环形探针杂交之前或之后处理靶RNA产生3’端作为RCA的引物。例如,环形DNA可含有O-甲基-RNA的区段。一旦此O-甲基-RNA DNA环形探针与RNA靶杂交,靶向的RNA-DNA双链体而非此O-甲基-RNA-DNA双链体将被RNA酶H消化。带缺口的靶向RNA可用作RCA的引物。可加入其它引物进行指数扩增。环形DNA也可含有功能序列(同上)。
图5D显示用于DNA检测的环形DNA。RNA片段、DNA片段或嵌合性DNA-RNA片段探针作为引物要直到它们与靶DNA杂交被RNA酶H切割产生缺口才能与环形DNA杂交而启动RCA。一个实施方案中,一个探针是DNA发夹,另一个探针是RNA-DNA嵌合性发夹。一旦这两个发夹与靶向DNA在毗邻位置处杂交,将形成RNA-DNA双链体。RNA酶H将切割此双链体产生RCA的引物,表明存在靶DNA。一旦RNA DNA双链体被切割,其余的RNA-DNA嵌合性发夹片段将被新的RNA-DNA嵌合性发夹取代,形成新的RNA-DNA双链体。此过程循环进行,产生的扩增达到RNA扩增峰。此环形DNA也可含有功能序列(同上)。
图5E显示用于RNA检测的环形DNA。RNA片段、DNA片段或嵌合性DNA-RNA片段探针作为引物要直到它们与靶DNA杂交被RNA酶H切割产生缺口才能与环形DNA杂交而启动RCA。一个实施方案中,一个探针是具有DNA互补区域和环形RNA区域的发夹,另一个探针是具有互补性RNA区域、环形RNA区域和其它DNA片段的RNA DNA嵌合性发夹。一旦这两个发夹与靶向DNA在毗邻位置处杂交,将形成RNA DNA双链体。RNA酶H将切割此双链体产生RCA的引物,表明存在靶DNA。一旦RNA DNA双链体被切割,其余RNA DNA嵌合性发夹片段之一将被新的RNA DNA嵌合性发夹取代形成新的RNA DNA双链体。此过程循环进行,产生的扩增达到RCA扩增峰。此环形DNA也可含有功能序列(同上)。
图5F显示用于RNA和DNA二者检测和扩增的环形DNA。将两个探针引入RNA DNA检测的复合混合物中。一个探针是预先环化的DNA,另一个探针是DNA发夹。该环形探针含有三个区域:第一区域与检测的靶互补,第二区域与发夹DNA探针的臂互补;第三区域是预选的任意核苷酸序列。该发夹DNA也含有三个区域:与毗邻于该环形探针靶区域的检测靶区域相互补的环形区域;与环形探针一部分互补的臂区域;可选择的第三区域是预选的任意核苷酸区域。如果不存在靶核酸,该环形探针不能与DNA发夹的臂杂交而启动RCA。然而,如果存在靶核酸,该环形探针和发夹探针二者将与毗邻位置的靶模板杂交。同时,发夹探针也与环形探针杂交成为引物而启动RCA。RCA反应将使环形探针从与靶杂交中脱落下来。如果采用其它引物进行RCA指数扩增,该引物将与扩增的RCA产物杂交使发夹探针从靶上脱落下来。因此释放的靶核酸可用于第二次和后一轮与环形和发夹探针杂交而启动RCA。此过程循环进行,产生指数扩增达到RNA扩增峰。
实施例
本说明书包含以下实施例以显示本发明的各种实施方案。本领域技术人员应理解,实施例中所揭示的技术是本发明的代表性实施方案,但本发明并不限于本说明书提供的实施例。本领域技术人员通过本说明书公开内容,可以知道,有许多可替代本说明书所述的实施方案也可产生相似的结果,但这仍属于本发明的思路和范围。
实施例1:利用互补的两末端合成cDNA
MMLV逆转录酶(RT)当到达mRNA模板的5’端时,能将胞嘧啶残基加到新合成的cDNA3’端上。通常可加2-4个胞嘧啶残基,这取决于反应条件。
用能预防RNA降解的标准方法纯化mRNA。采用低至皮克量的小量mRNA作为靶核酸分子。第一链合成引物的5’端含有聚(dT)和T7转录启动子,将引物1和MMLV逆转录酶加入mRNA样品中。使第一链合成引物的聚(dT)与mRNA的聚(A)尾退火,作为逆转录酶的引物来合成cDNA的第一链。同时,使用引物2与引物1退火。逆转录酶在cDNA第一链的3’端加上几个胞嘧啶残基。cDNA第一链的5’端有T7启动子后随聚(T)序列,当该序列用作第一链合成的引物时。T7启动子的取向是:一旦该分子环化,启动子即指导初始mRNA拷贝的转录。
引物1:5’-d(T7启动子序列)+d(T)15-3’
引物2:5’-d(T7启动子序列互补物)+d(G)4-3’
在5μl体积去离子水中,通过70℃加热混合物2分钟使10pmol的cDNA合成引物与1μg人胎盘聚(A)+RNA(Clontech)退火,然后冰上冷却2分钟。将退火的引物-RNA复合物与200单位M-MLV RNA酶H-逆转录酶(superScript II逆转录酶,Life Technology)在含50mM Tris-HCL(pH8.3、22℃);75mM KCL;6mM MgCl2;1mM DTT;dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1mM的终体积为10μl溶液中混合,来引发cDNA的第一链合成。
在上述反应液中加入1μl RNA酶H培育1.5小时。用Qiagen试剂盒纯化得到的溶液,然后用Nanodrop仪检测UV吸光度以测定cDNA的量。OD值表明获得约140ng的cDNA。所得核酸一端具有d(C)3’突出端,另一端具有d(G)3’突出端。此两端可退火,使模板转换产生环形分子。加入连接酶连接该分子的两端。
实施例2:合成含有LoxP重组位点的cDNA
可通过寡核苷酸转换技术加入LoxP重组位点。在cDNA的第一链合成介质中加入3’最远端具有聚(G)或聚(rG)序列的寡核苷酸。其末端3-4个G残基将与新合成cDNA的2-4个C残基碱基配对,作为RT(模板转换)的新模板。然后RT转换此模板和复制寡(G)寡核苷酸序列,包括新合成cDNA的3’端互补的CapFinder寡核苷酸序列。
引物3:5’-d(LoxP序列)+d(T)15-3’
引物4:(寡转换序列)5’-d(LoxP序列)r(GGGp)-3’
在5μl体积去离子水中,通过70℃加热混合物2分钟使10pmol的cDNA合成引物与1μg人胎盘聚(A)+RNA(Clontech)退火,然后冰上冷却2分钟。将退火的引物-RNA复合物与200单位M-MLV RNA酶H-逆转录酶(superScript II逆转录酶,Life Technology)在含50mM Tris-HCL(pH8.3、22℃);75mM KCL;6mM MgCl2;1mM DTT;dATP、dGTP、dCTP、dTTP各1mM的终体积为10μl溶液中混合,来引发cDNA的第一链合成。在空气培育箱中42℃培育cDNA的第一链-模板转换反应物1.5小时,然后置冰上冷却。
在上述反应液中加入1ul RNA酶H培育1.5小时。用Qiagen试剂盒纯化得到的溶液用Nanodrop仪作UV吸光度检测以测定cDNA的量。OD值表明获得约160ng的cDNA。
实施例3:另一种方法:用末端转移酶在cDNA第一链的3’端加上同源序列
用Qiagen试剂盒纯化合成的cDNA的第一链,然后将0.5μg的cDNA的第一链与0.5μM dCTP、1X末端转移酶反应缓冲液和1单位末端转移酶37℃混合1.5小时。用Qiagen试剂盒纯化所得溶液用Bioanalyer(Agilent)检测。最后用Nanodrop吸光度值定量,表明获得0.45μg cDNA。
实施例4:合成环形分子
可利用短的寡核苷酸作为桥梁连接环化cDNA第一链。合成cDNA第一链后,将含有与新合成cDNA的3’端和5’端序列互补的序列的寡核苷酸与T4连接酶在培养介质中培养。环化产生的cDNA。
引物5:5’-d(T7的互补序列)+dGdGdG-3’
将cDNA的第一链与T4DNA连接酶(Promega)在1×T4DNA连接缓冲液(Promega)、0.5mMATP和引物5中室温培育过夜。在上述溶液中加入0.5U内切酶V(Amersham)和0.5mM ATP,再培育1.5小时。消化所有线性DNA链。用Qiagen试剂盒纯化所得的环形cDNA,测定吸光值。产生0.5μg环形cDNA。
实施例5:通过随机杂交进行环化
本发明可用于扩增双链靶核酸分子。以下实施例说明了扩增整个靶分子而无需知道靶分子序列的方法。这样,本方法即适合于扩增整个基因组或双链核发酸分子的其它大样品。
在10mM Bis Tris丙烷-HCL、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇(pH7.0@25℃)、100μg/ml BSA、100μM dNTP中37℃培育1小时,用Pml I消化总基因组DNA。
在5’端具有CreI依赖性重组LoxP位点和3’端具有随机六聚序列的过量接头寡核苷酸混合液中,加入T4DNA聚合酶。反应物于37℃培育过夜。得到的产物是核酸任一末端具有LoxP位点的基因组片段。
然后在样本中加入CreI,37℃培育1小时。得到的产物是整个基因组的环化片段,适合滚环扩增。
实施例6:通过重组进行环化
可用Cre-重组酶环化cDNA的第一链。如实施例2所述,合成3’端和5’端都含有LoxP位点的cDNA第一链。将cDNA第一链与CreI重组酶在培养基中进行培育,使cDNA第一链环化。
将合成的3’端和5’端都含有LoxP序列的cDNA第一链与Cre重组酶37℃培育4小时。提高温度至75℃30分钟灭活此重组酶。然后在上述溶液中加入0.5U内切酶V(Amersham)和0.5mM ATP再培育1.5小时。用Qiagen试剂盒纯化环化的cDNA,测定吸光值(0.6μg)。
实施例7:扩增环形cDNA
将mRNA:cDNA第一链复合物进行限制性RNA酶H消化,用滚环扩增法扩增环化的cDNA。所产生的缺口mRNA可用作引物,凭借其游离3’端进行RCA扩增。此法只在一条链中产生RCA需要的游离3’端。
将具有RNA:DNA双链体的环化cDNA与0.5U RNA酶H,37℃培育30分钟。取4μl上述反应液,在含有20mM Tris-HCL(pH=8.8)、10mM KCL、2.7mM MgSO4、5%v/v DMSO、0.1%Triton X-100、各400μM dATP、dGTP、dCTP、dTTP及900nM引物5(指数扩增引物;见美国专利No.60/506218)的体积为35μl的反应液中培育。存在的噬菌体T4基因-32蛋白(Amersham)浓度为38μg/μl(约1085μM)。室温混合所有物质后,将反应物置于冰上,加入终浓度0.32单位/μl的Vent(外切)DNA聚合酶(New England Biolabs),75℃培育反应物3分钟,然后65.5℃ 90分钟。所得混合物作凝胶电泳。染色后在凝胶上部(不是整个凝胶)观察到滚环产物。
实施例8:用随机引物扩增cDNA
用随机六聚体作引物滚环扩增环化的cDNA。该随机六聚体只能扩增环形核酸分子。用RNA消化或加热变性使mRNA与环形cDNA的第一链解离。也可用加热变性解离用于扩增的制备中的dsDNA。然后可分离ssDNA,用作其它生物应用的试剂。在ssDNA中可加入随机六聚体与标准的置换性聚合酶,如噬菌体29、vent和BST。在该标准置换聚合酶适合的温度下将此混合物培育所需的一定时间。
取4μl单链环化DNA,在含有20mM Tris-HCL(pH=8.8)、10mM KCL、2.7mM MgSO4、5%v/v DMSO、0.1%Triton X-100、各400μM dATP、dGTP、dCTP、dTTP及900nM随机六聚体(Amersham)的35μl体积混合物中进行培育。存在的噬菌体T4基因-32蛋白(Amersham)浓度为38μg/μl(约1085μM)。室温混合所有物质后,将反应物置于冰上,加入终浓度0.32单位/μl的Vent(外切)DNA聚合酶(New England Biolabs),75℃培育反应物3分钟,然后65.5℃90分钟。所得混合物作凝胶电泳。染色后在凝胶上部(不是整个凝胶)观察到滚环产物。
实施例9:RNA体外转录
采用上述环形cDNA作为模板可进行RNA体外转录。加入T7聚合酶和rNTP,T7聚合酶将根据所选的T7启动子取向转录cDNA的有义或反义链。
用T7RNA聚合酶转录所生成的双链RCA扩增产物。各次反应可转录3ng的cDNA。反应条件是:40mM Tris(pH7.5),6mM MgCl2,10mM NaCl,2mM亚精胺,10mM DTT,各500μM ATP、GTP和UTP-cy3,12.5μM CTP,10单位RNA酶阻断剂和80单位T7RNA聚合酶,体积为20μl。将反应物37℃培育2小时。用Qiagen试剂盒纯化所得混合物。用乙醇洗脱合成的染料标记的aRNA,用Nanodrop测定。
实施例10:检测环的环化
用模板序列,如美国专利No.60/506218所述,环化5’端磷酰化的全长线性GAPDH(Integrated DNA Technologies,Skokie,IL)。待扩增和检测GAPDH的核酸序列见本申请人的美国专利No.60/506218。环化反应物包括50μM环形前体、50μM模板、100mM NiCl2、200咪唑-HCL(pH=7.0)和125mM BrCN,反应于23℃进行10小时。透析和冻干后,产物用制备级变性20%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,切割分离产物条带,研碎,洗脱到0.2NaCl中。用双蒸去离子水透析除盐,测260nm吸光值进行定量,用最近邻域计算法计算出摩尔消光系数。
实施例11:mRNA扩增和检测
从Clontech获得总RNA。总RNA是预先经核酶切割GAPDH mRNA的3’端序列加工而成,见美国专利No.60/506218中所述。取0.5μg经加工的总RNA,与实施例9制备的环形寡核苷酸在含有20mM Tris-HCL(pH=8.8)、10mM KCL、2.7mM MgSO4、5%v/v DMSO、0.1%Triton X-100、各400μMdATP、dGTP、dCTP和dTTP的溶液中混合。75℃加热该混合物5分钟。将此混合物缓慢冷却至室温。在上述反应物中加入1U噬菌体29(Amersham),1U RNA酶H和浓度为38μg/μl的噬菌体T4基因-32蛋白(Amersham),所得混合物于37℃培育4小时。然后95℃培育该反应混合物10分钟灭活所有酶。用酚氯仿沉淀双链cDNA。取沉淀的DNA作凝胶电泳和染色。凝胶染色显示长的双链cDNA位于孔上部。用本领域技术人员所知的方法进行检测。为增强扩增,可将扩增引物(美国专利No.60/506218中所述)加入上述反应物中,加入此引物将导致阶乘(n!)扩增。
实施例12:多重检测反应
为在一个试管中检测多个基因,在同一反应物中混合多个基因特异性或mRNA特异性环形模板,进行实施例11所述的相同反应。
本发明可提供方法和方案,也提供用于实施所述方法的含有所述试剂和组分的试剂盒,商业措施包括实施、销售、示教、展览和/或营销上述方法和组分。
应理解,本说明书描述的实施例和实施方案仅仅为了说明的目的,本领域技术人员可据此作出各种修饰和变化,但都包括在本申请的思路范围内。为此目的将本说明书引用的所有出版物、专利和专利申请的内容整体纳入本文作参考,如同各出版物、专利和专利申请各自单独纳入作参考那样。
Claims (110)
1.一种扩增和检测靶核酸分子的方法,该方法包括:
a)在靶核酸分子上连接第一接头核酸分子或第二接头核酸分子或第一接头和第二接头核酸分子的组合;
b)环化靶核酸分子;
c)扩增该环化的核酸分子产生重复的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述环化用选自以下组的方法进行:平端连接、退火相互补的两端然后连接、互补区域之间的连接、自身引发连接、化学反应和光反应。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述靶核酸分子选自:mRNA,rRNA,RNAi,异核RNA,基因组DNA和cDNA。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一接头核酸分子用选自以下组的方法进行连接:连接、杂交连接、杂交然后聚合酶延伸、酶反应、化学反应和光反应。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一接头核酸分子还含有选自以下组的序列:检测序列、位点特异性重组序列、同源重组序列、限制性内切酶序列、启动子序列、转录终止序列、核糖体结合序列、核酶序列、复制起始序列、基因序列和发夹环序列。
6.根据权利要求1所述的方法,还包括在环化前连接第二接头核酸分子。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第二接头核酸分子用选自以下组的方法进行连接:连接、杂交连接、杂交然后聚合酶延伸、酶反应、化学反应和光反应。
8.根据权利要求6所述的方法,其中,所述第二接头核酸分子还含有选自以下组的序列:检测序列、位点特异性重组序列、同源重组序列、限制性内切酶序列、启动子序列、转录终止序列、核糖体结合序列、核酶序列、复制起始序列、基因序列和发夹环序列。
9.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一接头或第二接头核酸分子通过核酸的随机杂交和短暂延伸而连接。
10.根据权利要求1所述的方法,其中,所述扩增包括加入至少一种引物。
11.根据权利要求1所述的方法,其中,所述扩增是在不加入引物的情况下进行的。
12.根据权利要求10所述的方法,其中,所述引物在其3’端还包含随机序列。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述引物还包含启动子序列。
14.根据权利要求10所述的方法,其中,所述引物是RNA:DNA嵌合体。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,所述引物还包含启动子序列。
16.根据权利要求1所述的方法,其中,所述环化的靶核酸分子包含蛋白质表达序列。
17.一种检测靶核酸分子的方法,该方法包括:
a)在样品中加入环形核酸分子,其中所述环形核酸分子包含能与该靶核酸分子至少一部分杂交的第一核酸序列;
b)使环形核酸分子与靶核酸分子的该部分杂交;和
c)通过与所述靶核酸分子中至少一个游离3’端聚合合成至少一种新的核酸,其至少与环形核酸的第二部分相互补,其中,所述至少一个游离3’端产生在靶核酸分子上能与第一核酸序列杂交的部分。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述靶核酸分子选自:mRNA、rRNA、RNAi、异核RNA、基因组DNA和cDNA。
19.根据权利要求17所述的方法,其中,所述游离3’端在引物与靶核酸杂交之前产生。
20.根据权利要求17所述的方法,其中,所述游离3’端在引物与靶核酸杂交之后产生。
21.根据权利要求17所述的方法,其中,所述游离3’端用选自以下组的方法产生:用RNA酶H切割产生缺口、用RNA酶H总体消化、用核酶切割、用RNA dicer切割、用限制性酶消化半甲基化限制位点、用限制性酶切割产生缺口、用化学试剂切割产生缺口。
22.根据权利要求17所述的方法,其中,所述游离3’端只产生在含有突变或不含有突变的靶核酸中。
23.根据权利要求17所述的方法,其中,所述环形核酸还含有用于(n!)阶乘扩增的第二核酸序列,其中所述引物具有与扩增步骤所含第二核酸序列相同的序列。
24.根据权利要求17所述的方法,其中,所述环形核酸分子通过自身连接进行构建。
25.根据权利要求17所述的方法,其中,所述环形核酸分子含有随机序列。
26.根据权利要求17所述的方法,其中,所述环形核酸分子是全长cDNA。
27.根据权利要求26所述的方法,其中,所述环形全长cDNA构建自全长cDNA克隆文库。
28.根据权利要求17所述的方法,其中,所述环形核酸分子还含有选自以下组的序列:检测序列、位点特异性重组序列、同源重组序列、限制性内切酶序列、启动子序列、转录终止序列、核糖体结合序列、核酶序列、复制起始序列、基因序列和发夹环序列。
29.根据权利要求26所述的方法,其中,所述全长cDNA含有体内和体外蛋白质表达所需组分。
30.根据权利要求17所述的方法,其中,所述环形核酸分子含有用于多重反应和检测的特异性标签。
31.一种扩增RNA分子的方法,该方法包括:
a)在RNA分子上连接第一接头核酸分子以产生第一构建物,其中所述第一接头核酸分子含有RNA聚合酶启动位点;
b)环化第一构建物产生环化的核酸分子;
c)通过滚环复制扩增该环形核酸分子形成串联序列DNA,和
d)加入能在RNA聚合酶启动位点启动转录的RNA聚合酶来扩增此RNA分子。
32.根据权利要求31所述的方法,其中,所述第一接头核酸分子还包含能与聚-A尾杂交的3’端。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述步骤a)是通过如下进行连接的:使第一接头核酸分子与RNA分子杂交并用聚合酶从3’端延伸该第一接头核酸分子。
34.根据权利要求33所述的方法,其中,所述聚合酶能将至少两个核苷酸通过末端转移酶作用连接到该链的新末端上。
35.根据权利要求34所述的方法,其中,所述第一接头核酸分子还含有能够与至少两个核苷酸杂交的单链序列。
36.根据权利要求31所述的方法,其中,在环化前,将所述第二接头核酸分子连接到第一构建物中。
37.根据权利要求36所述的方法,其中,所述第一接头核酸分子还含有与第二接头核酸分子中第二区域同源的第一区域。
38.根据权利要求37所述的方法,其中,所述环化通过上述第一区域与第二区域之间的同源重组而进行。
39.根据权利要求37所述的方法,其中,所述环化的进行是通过使上述第一区域与第二区域退火,并将第一接头核酸分子连接于第二接头核酸分子而进行的。
40.一种检测样品中RNA分子的方法,该方法包括:
a)在样品中加入环形核酸分子,其中所述环形核酸分子包含能与该RNA分子至少一部分杂交的第一核酸序列;
b)使环形核酸分子与RNA分子的该部分杂交;和
c)通过与所述RNA分子中的至少一个游离3’端聚合,合成至少一种新的核酸,其至少与环形核酸的第二部分相互补,其中,所述至少一个游离3’端产生在RNA分子上能与第一核酸序列杂交的部分。
41.根据权利要求40所述的方法,其中,所述至少一个游离3’端产生在步骤a)之前。
42.根据权利要求40所述的方法,其中,所述至少一个游离3’端产生在步骤a)之后。
43.根据权利要求42所述的方法,其中,所述至少一个游离3’端产生在步骤b)之后。
44.根据权利要求40所述的方法,其中,所述至少一个游离3’端由RNA酶H、核酶或切割RNA产生缺口的化学试剂所产生。
45.根据权利要求40所述的方法,其中,所述环形核酸分子含有用于多重反应和检测的特异性标记。
46.一种检测样品中DNA分子的方法,该方法包括:
a)在样品中加入短的多核苷酸片段,该多核苷酸片段能与DNA靶核酸的至少一部分杂交,并且该多核苷酸的3’端被封闭;
b)用酶切割上述混合物中的多核苷酸片段产生游离3’端;
c)在样品中加入环形核酸分子,该环形核酸分子含有能与带切口的多核苷酸的至少一部分杂交的第一核酸序列;和
d)通过与所述多核苷酸中的至少一个游离3’端聚合,合成至少一种新的核酸,其至少与该环形核酸的第二部分相互补,其中所述至少一个游离3’端产生在多核苷酸上能与第一核酸序列杂交的部分。
47.根据权利要求46所述的方法,其中,所述至少一个3’端产生在步骤a)之前。
48.根据权利要求46所述的方法,其中,所述至少一个3’端产生在步骤a)之后。
49.根据权利要求40所述的方法,其中,所述至少一个3’端产生在步骤b)之后。
50.根据权利要求46所述的方法,其中,所述至少一个3’端由RHA酶H、核酶、或切割RNA产生缺口的化学试剂所产生。
51.根据权利要求46所述的方法,其中,所述多核苷酸片段是RNA。
52.根据权利要求46所述的方法,其中,所述多核苷酸片段是DNA-RNA嵌合物。
53.根据权利要求46所述的方法,其中,所述环形核酸分子含有用于多重反应和检测的特异性标记。
54.一种扩增多核苷酸的方法,该方法包括:
a)形成具有3’和5’端发夹的线性多核苷酸;
b)连接该线性靶分子的3’和5’端形成环化的多核苷酸;和
c)通过滚环扩增法扩增此环化的多核苷酸。
55.根据权利要求83所述的方法,还包括在该形成步骤之前:
a)使第一发夹与靶核酸的3’端部分杂交;然后
b)利用此靶分子作为模板,从第一发夹的3’端聚合DNA拷贝;和
c)将第二发夹连接到该靶分子的5’端部分或DNA拷贝的3’端部分形成线性多核苷酸。
56.根据权利要求55所述的方法,其中,所述连接步骤通过自身引发进行。
57.根据权利要求56所述的方法,其中,采用模板转换寡核苷酸自身引发进行所述连接步骤而延伸该靶核酸。
58.根据权利要求57所述的方法,其中,所述模板转换寡核苷酸包含一限制性位点,通过在限制性位点切割靶DNA的双链DNA和模板转换寡核苷酸形成切口端,此切口端连接于一发夹的相应切口端,形成第一发夹。
59.根据权利要求83所述的制备环形DNA拷贝的方法,其特征在于包括:
a)使第一引物与靶链模板区的3’部分杂交;
b)从该引物聚合模板区第一拷贝DNA;
c)从模板区置换第一拷贝DNA;
d)在第一拷贝DNA的3’部分形成发夹第二引物;
e)从该发夹引物聚合第一拷贝DNA一部分的第二拷贝DNA;和
f)连接第一拷贝DNA的5’端与第二拷贝的3’端形成环形拷贝DNA。
60.根据权利要求59所述的方法,其中,所述置换步骤用核酸酶、碱基或链置换进行。
61.一种扩增DNA的方法,该方法包括:
a)聚合DNA靶分子模板区的DNA拷贝,以形成在第一和第二末端分别具有第一和第二发夹双链DNA;
b)以单分子反应连接该双链DNA,形成环化的DNA;和
c)通过滚环扩增法扩增此环化的DNA。
62.根据权利要求61所述的方法,其中,所述靶分子转录自mRNA。
63.根据权利要求61所述的方法,其中,所述靶分子转录自mRNA,所述第一发夹通过靶分子的自身引发而形成。
64.根据权利要求61所述的方法,其中,所述靶分子转录自具有至少一个模板转换发夹寡核苷酸的mRNA,通过使所述模板转换发夹寡核苷酸与该靶分子的3’端共价结合形成第一发夹,可选择地以模板转换发夹寡核苷酸作为靶分子3’端延伸的模板。
65.根据权利要求61所述的方法,其中,所述靶分子转录自mRNA,通过引发所述靶分子与发夹引物的聚合形成第二发夹,其中发夹形成于靶分子聚合之前或之后。
66.根据权利要求61所述的方法,其中,用含有限制性位点的引物启动靶分子的聚合从mRNA形成此靶分子,通过在该限制性位点切割双链DNA形成切端,并将此切端与发夹的相应切端连接形成第二发夹。
67.根据权利要求61所述的方法,其中,所述靶分子是基因组DNA,通过将该基因组DNA的第一和第二末端与相应发夹的相应两个切端连接形成所述第一和第二发夹。
68.根据权利要求61所述的方法,其中,所述靶分子是基因组DNA或cDNA文库拷贝的单链DNA,或转录自mRNA,通过该靶DNA相邻位置的3’和5’两端的自身杂交形成第一和第二发夹,所述连接步骤包括共价连接此3’端和5’端形成环化的DNA。
69.根据权利要求61所述的方法,其中,所述靶分子转录自含有模板转换寡核苷酸的mRNA,该寡核苷酸的3’端含有至少一个与RNA-DNA中间体靶链的3’端核苷酸碱基配对的核苷酸,该中间体含有mRNA和靶链,其中所述模板转换寡核苷酸作为靶链延伸的模板,其5’端含有预选的任意核苷酸序列,延伸靶链的3’端可产生与该mRNA分子和模板转换寡核苷酸相互补的DNA。
70.一种扩增线性靶核酸的方法,包括以下步骤:
a)将含有发夹的第一寡核苷酸接头连接到靶核酸的一端;
b)在靶核酸的另一端形成一发夹;
b)环化靶核酸;
c)在靶核酸上产生游离3’端;
d)通过滚环扩增从此游离3’端扩增靶核酸。
71.根据权利要求70所述的方法,其中,所述环化步骤用以下方法进行:退火互补的二末端然后连接、或自身引发然后连接。
72.根据权利要求70所述的方法,其中,所述靶核酸分子是cDNA的第一链。
73.根据权利要求70所述的方法,其中,通过杂交连接、杂交然后聚合酶延伸、酶反应、化学反应和光反应连接第一接头。
74.根据权利要求70所述的方法,其中还包括在环化前连接第二接头。
75.根据权利要求74所述的方法,其中,所述连接第二接头的方法选自:杂交连接、杂交然后聚合酶延伸、自身引发连接、酶反应、化学反应和光反应。
76.根据权利要求70所述的方法,其中,通过随机杂交和从核酸短暂延伸连接第一接头。
77.根据权利要求70所述的方法,其中,所述产生步骤包括加入一种或多种含有游离3’端的引物。
78.根据权利要求70所述的方法,其中,所述产生步骤包括切割靶核酸的一条链,其中所述靶核酸是双链。
79.根据权利要求77所述的方法,其中,所述一种或多种引物的3’端还含有随机序列。
80.根据权利要求77所述的方法,其中,所述一种或多种引物还含有启动子序列。
81.根据权利要求77所述的方法,其中,所述一种或多种引物是RNA:DNA嵌合体。
82.根据权利要求70所述的方法,其中,所述环化靶核酸含有体内外表达蛋白质的序列。
83.一种检测样品中靶核酸的方法,包括以下步骤:
a)将环形核酸探针与样品混合,混合在该探针的第一部分可与靶核酸的第一部分杂交的条件下进行;
b)在靶核酸的第一部分产生游离3’端;
c)用滚环扩增法从该游离3’端合成与该探针第二部分互补的新核酸;
d)检测该新核酸作为靶核酸存在的指标。
84.根据权利要求83所述的方法,其中,所述靶核酸选自:mRNA,rRNA,RNAi,异核RNA,基因组DNA和cDNA。
85.根据权利要求83所述的方法,其中,在所述探针的第一部分与靶核酸的第一部分杂交之前产生所述游离3’端。
86.根据权利要求83所述的方法,其中,在所述探针的第一部分与靶核酸的第一部分杂交之后产生所述游离3’端。
87.根据权利要求83所述的方法,其中,所述产生步骤包括选自以下组的方法:杂交、转录、聚合、用RNA酶H切割缺口、用RNA酶H总体消化、用核酶切割、用RNA dicer切割、用限制性酶消化半甲基化的限制位点、用限制性酶切割缺口和用化学试剂切割缺口。
59.根据权利要求83所述的方法,其中,所述游离3’端选择性产生在含有突变的靶核酸中。
88.根据权利要求83所述的方法,其中,所述游离3’端选择性地产生在不含有突变的靶核酸中。
89.根据权利要求83所述的方法,其中,所述探针还含有用于(n!)阶乘扩增的第三部分,合成步骤中包含具有与探针第三部分相同的序列的引物。
90.根据权利要求83所述的方法,其中,还包括在混合步骤之前通过自身连接构建探针的步骤。
91.根据权利要求83所述的方法,其中,所述探针还包含随机序列。
92.根据权利要求83所述的方法,其中,所述探针还包含从全长cDNA文库构建全长cDNA。
93.根据权利要求83所述的方法,其中,所述探针包含选自以下组的序列:检测序列、位点特异性重组序列、同源重组序列、限制性内切酶序列、启动子序列、转录终止序列、核糖体结合序列、核酶序列、复制起始序列、基因序列和发夹环序列。
94.根据权利要求83所述的方法,其中,所述探针还包含蛋白质体内外表达所需的序列。
95.根据权利要求83所述的方法,其中,所述探针包含多重反应和检测用的标记序列。
96.一种制备RNA的方法,包括以下步骤:
a)将含有RNA聚合酶启动子的环形核酸探针与含有靶核酸的样品混合,混合在该探针的第一部分可与靶核酸的第一部分杂交的条件下进行;
b)在靶核酸的第一部分中产生游离3’端;
c)通过滚环扩增从该游离3’端合成与探针第二部分互补并含有启动子的DNA;
d)用RNA聚合酶从该启动子转录此DNA制得RNA。
97.根据权利要求96所述的方法,其中,所述RNA酶是T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶。
98.根据权利要求96所述的方法,其中,所述探针和产生的DNA拷贝还含有限制性酶识别序列,以及在转录前用相应的限制性酶处理DNA拷贝。
99.根据权利要求96所述的方法,其中,所述探针和产生的DNA拷贝还含有RNA聚合酶终止序列。
100.根据权利要求96所述的方法,其中,所述转录步骤d)还包括用一种或多种直接或间接可检测的核苷酸同类物标记该RNA。
根据权利要求96所述的方法,其中,采用微阵列检测所述新的核酸。
一种制备RNA的方法,包括以下步骤:
a)将核酸片段与含有靶核酸的样品混合,其中所述片段的第一部分可与靶核酸的第一部分杂交;
b)在该片段中产生游离3’端;
c)使靶-杂交片段与含有RNA聚合酶启动子序列的环形核酸探针在该探针的第一部分可与所述片段的第二部分杂交的条件下接触;
d)通过滚环扩增从游离3’端合成与探针第二部分互补并含有启动子的DNA;和
e)用RNA聚合酶从该启动子转录此DNA制得RNA。
根据权利要求102所述的方法,其中,所述转录步骤d)还包括用一种或多种直接或间接可检测的核苷酸同类物标记该RNA。
根据权利要求102所述的方法,其中,所述产生步骤依赖于所述靶核酸是否含有预先确定的突变。
一种检测样品中靶核酸的方法,包括以下步骤:
a)将含有可选择地被封闭的3’端、能与靶核酸第一部分杂交的核酸片段与样品混合;
b)在该片段中产生游离3’端;
c)将环形核酸探针与样品在该探针的第一部分可与所述片段的第一部分杂交的条件下混合;
d)从该游离3’端合成与该探针第二部分互补的新核酸,和
e)检测该新核酸作为靶核酸存在的指标。
根据权利要求105所述的方法,其中,所述靶核酸选自mRNA,rRNA,RNAi,异核RNA,基因组DNA和cDNA。
根据权利要求105所述的方法,其中,在该片段与靶核酸的第一部分杂交之前或之后产生所述游离3’端。
根据权利要求105所述的方法,其中,所述产生步骤的方法选自:杂交、转录、聚合、用RNA酶H切割缺口、用RNA酶H总体消化、用核酶切割、用RNA dicer切割、用限制性酶消化半甲基化的限制位点、用限制性酶切割缺口和用化学试剂切割缺口。
根据权利要求105所述的方法,其中,所述片段是RNA或DNA-RNA嵌合体。
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Open date: 20090422 |