CN111876472A - 多种混合核酸中检测痕量核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明专利公开了一种核酸成环与选择性核酸破环的核酸分析技术，包括对待测基因片段进行成环处理和选择性对特定环形基因片段进行破环处理。通过成环和选择性破环处理使不同核酸待测分子分别表现为环形状态与线性状态而得以区分，可用于特定基因型核酸分子的识别。
Description
技术领域
本发明专利涉及生物医药领域，具体涉及一种核酸分析技术，特别涉及一种利用核酸 酶内切酶选择性破环特定环状核酸以达到对未被破环的核酸分子进行扩增和富集的技术。
背景技术
核酸分析和富集在基因突变的分析中意义重大。聚合酶链式反应PCR，连接酶链式反 应LCR和滚环扩增RCA等技术具有对特定区域的核酸选择性扩增的效果，也可用于全基因组扩增。但是，对体细胞突变的分析，由于大部分情况尤其是如血液，尿液，痰液等生 物标本中的体细胞突变，混合宿主和寄生微生物的复杂标本，和环境检测如水和空气特定 突变病原体的监控等情形，由于不需要分析的核酸成分所占比例太大，或突变核酸含量远 远低于野生基因的含量，选择性区分不同基因型的核酸分子和富集含量较低或含量极低的突变基因片段，具有一定实用价值。
多种生物技术可用于特定基因型的富集，如由耐外切酶消化的硫化修饰引物与高保真 DNA聚合酶组成的突变敏感性分子开关(1)，针对设计终止密码子的蓝白菌落富集技术(2)， 自杀基因与他杀基因联合构成的富集体系(3)，利用耐高温限制性内切酶与聚合酶偶联的 边消化边扩增技术(4-6)，均可以在一定条件下对特定性质的突变核酸进行富集。但更高富 集效率和具有更广泛应用范围的核酸富集技术，迄今仍是生物技术领域有待发展的实用技 术。(专利为6：ZL201510684160.7:一种变换核酸基因型的方法)
鉴于特定基因型的富集方法中，包括耐高温限制性内切酶的种类有限和去磷酸化处理 及菌落斑技术在通量上的局限和比较费时等不足或缺点，为解决上述本发明由此而来。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种从多种混合核酸中检测痕量核酸的核酸分析 技术，达到高效且既可以区分遗传性突变、也可以区分表观突变的目的。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：从多种混合核酸中检测痕量核酸的 方法，其包括如下步骤：
(1)对含有多种混合核酸的待测样本，进行线性核酸分子的环化，
(2)采用具有核酸内切功能的核酸酶对对环化后的核酸进行选择性破环，使待测样本 中不需要富集的核酸靶点从环形核酸变为线性核酸，
(3)对步骤(2)得到的核酸分子进行检测识别，检测存留形态是线性核酸还是环形核酸。
优选地，当需要识别与富集的核酸靶点为大量长度不一的未知情况时，在步骤(1)前， 先将待测样本中的线性核酸分子的末端填平补A，然后用核酸链接酶链接接头以形成环化核 酸。
优选地，当需要识别与富集的核酸为已知确定数量的靶点时，在步骤(1)前，先采用 5’末端带限制性内切酶位点的引物进行扩增，然后利用相应的内切酶处理扩增产物、核酸连 接酶使其形成环化核酸。
优选地，当需要富集的核酸为已知的一定数量的靶点时，在步骤(1)前，采用5’末端 带LoxP位点的引物进行扩增，然后利用cre重组酶的重组功能形成环化核酸。
优选地，在步骤(1)，用具有将线性核酸连接成环形的核酸酶，进行线性核酸分子进 行环化处理。更优选地，所述核酸酶为核酸连接酶。
优选地，在步骤(2)，所述具有核酸内切功能的核酸酶为天然核酸内切酶；本发明又 一优选技术方案中，所述具有核酸内切功能的核酸酶为基因工程核酸内切酶。
优选地，在步骤(3)中，对待测核酸分子进行识别的存留形态是线性还是环形的方法， 包括电泳方法、核酸外切酶外切法、PCR扩增法、滚环扩增法、飞行质谱、高压液相法、高分辨溶解曲线。
作为本发明的优选方案，对选择性破环后的待测样本进行滚环扩增。所述滚环扩增采 用单向滚环扩增或双向滚环扩增。优选地，滚环扩增采用随机引物或采用特异性引物。
核酸外切酶外切方法采用核酸外切酶V消化线性核酸、优选地，核酸外切酶V消化后 的标本采用PCR扩增。
本发明的方法可用于核酸定性和定量分析。
核酸的成环采用具有连接核酸分子能力的核酸酶。目前生物技术中使用最广泛的是T4 核酸连接酶。对具有耐高温的核酸连接酶本身，已在连接酶链式反应中用于核酸的分析。 但对于不耐高温的T4DNA连接酶，主要用于亚克隆，文库制备中测序接头的连接等。当接 头采用发夹结构时，双链线性核酸分子在连接上接头后，即形成单环结构。这种通过连接 接头的成环方式，可用于组学层面的基因突变分析。
基因突变分析除组学层面的分析外，热点突变的组合突变分析，同样也有较广泛应用。 对于特定已知位点扩增的产物，通过在引物5末端引入限制性酶切位点，对扩增产物进行 限制性内切酶消化，扩增产物两端在限制性内切酶消化后形成可连接的末端，核酸连接酶 可使其形成双链环形核酸分子。
由于基因重组酶cre的效率高，使用简单，对多热点的组合文库制备，可以通过在序列 特异性引物的5端加上测序序列和LoxP位点，保证PCR扩增后的产物两端的两个LoxP位点是相同方向，这样加入cre酶后两个LoxP位点发生基因重组，形成环状结构。
在蓝白菌落富集突变研发中，发明人通过对PCR扩增的产物进行限制性内切酶消化并 进一步进行消化产物的去磷酸化，实质性提高了蓝白菌落技术对突变片段的富集(6)。鉴 于耐高温限制性内切酶的种类有限和去磷酸化处理及菌落斑技术在通量上的局限和比较费 时等局限，本发明技术采用全新的技术方案，先对待测核酸片段进行环化处理，然后选择 性破环特定类型的环状核酸，达到对待测分子的存在形式是环形还是线性而加以区别。这 一区别可以(1)直接通过核酸电泳的迁移速度加以确认；(2)可以进一步通过核酸外切酶 V消化线性核酸保留环形核酸的处理相对富集环形核酸分子；(3)可以对核酸外切酶V的 产物进行PCR扩增进行富集；(4)或者对破环之后的产物直接进行滚环扩增达到使破环后 仍保留为环形结构的基因型进行绝对拷贝数的放大和富集。
与现有的高通量测序文库制备技术比较，本发明具有应用范围广既可以用于遗传性突 变的富集也可用于甲基化突变的区分，和可用于区分后进一步富集的优势。在生物医学和 环境监控等多个领域具有一定实用价值。
核酸扩增可以有多种技术，其中滚环扩增和PCR扩增均得到广泛应用。
滚环扩增是天然滚环复制的体外应用性技术，作为PCR扩增技术之外的一种核酸扩增 技术，效率高，在全基因扩增领域应用较广。滚环扩增的主要用途不是突变富集。本发明 由核酸成环和破环相结合，为滚环扩增扩大了应用范围。成环与选择性破环是本发明的核 心，可以区分特定基因型的核酸分子，为PCR扩增和滚环扩增提供已经富集区分开来的模 板。在本发明中，成环是一个非选择性的过程，而破环则是一个选择性的过程。将环状核酸变为线性核酸只需对核酸环切开一个或一个以上的切口，与核酸外切酶不同，核酸内切酶都可以在核酸的非末端处对核酸进行剪切。破环的选择性一种方案是通过采用限制性核酸内切酶，如MseI、NciI。破环的选择性实施的另一种方案是采用本身没有序列特异性的核酸内切酶，如cas9，Agonaute,T7E1,UDG等，这些酶的选择性分别由选择性的指导 RNA小片段,选择性的指导DNA小片段，和将环形核酸上的未甲基化的胞嘧啶C转化而 来的尿嘧啶残基所决定。选择性破环后的标本可以优选地采用滚环扩增。
PCR扩增在核酸扩增领域应用最为广泛。本发明的成环和破环之后，待测标本通过核 酸外切酶对线性核酸与环形核酸的区分，如核酸外切酶V(endonuclease V),降解线性核酸， 保留环形核酸。线性核酸被降解后的待测标本可以优选地采用PCR扩增。
本发明通过耦合成环-破环，对拷贝数较高的待分析标本，直接利用电泳区分环形与线 性核酸进行区分。对拷贝数较低的有待富集的标本和靶点，通过选择性破环的处理，只有 在破环处理后仍然保留环状的那些靶点核酸分子，才能在破环后的扩增阶段得到大量的扩 增产物。从而达到对选择性富集特定分子的进一步扩增。本发明在动植物基因突变和表遗 传突变的分析中具有一定应用价值，在病原微生物的突变监测方面具有一定应用价值。
发明技术采用全新的技术方案，先对待测核酸片段进行环化处理，然后选择性破环特 定类型的环状核酸，达到对待测分子的存在形式属于环形还是线性从而加以区别。这一区 别可以直接通过核酸电泳的迁移速度加以确认；也可以进一步通过消化线性核酸、保留环 形核酸的核酸外切酶V的处理，相对富集环形核酸分子；或者通过滚环扩增对环形核酸分 子相对应的基因型进行绝对拷贝数的放大和富集。
与现有的高通量测序文库制备技术比较，本发明专利具有富集效率高、应用范围广， 既可以用于遗传性突变的富集、也可用于甲基化突变富集的优势，在生物医学和环境监控 等多个领域具有实用价值。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1A为本发明检测方法和其下游应用流程示意图。图1左边虚线方框内的环化和选择 性去环化是本发明的技术核心。该技术可以达到使待测标本核酸分子分别成为环形和线性 的不同状态。右边下游应用显示区分环形与线性核酸分子的多种应用情形。其中的其他技 术可以是飞行质谱，高压液相，高分辨溶解曲线等。
图1B为本发明检测方法又一流程示意图。显示了血液中的游离核酸分析时，通过成环 /破环与滚环扩增联合应用对特定基因型线性分子富集，滚环扩增后的产物可经一步进行测 序分析。
图2A甲基化与非甲基化人工合成模板的成环与破环识别。
图2B为甲基化与非甲基化人工合成片段经过成环与破环处理后的滚环扩增结果。
图3A为实施例二的含三末端突出A尾部的人工甲基化与非甲基化模板的成环。
图3B为实施例二的含三末端突出A尾部的人工甲基化与非甲基化模板的破环后的滚环 扩增。
图4为实施例三EGFR18碱基缺失突变的成环破环识别。
图5A为实施例四的滚环扩增电泳图。
图5B为实施例四的突变混合标本的PCR扩增产物测序图。
图6A为实施例五的滚环扩增电泳图。
图6B为实施例五的突变混合标本的PCR扩增产物测序图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具 体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。 但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背 本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术 人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的 实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的 所列项目的任意的和所有的组合。以下结合附图描述本发明具体实施方式。
实施例一：人工合成长度为53碱基的甲基化模板与非甲基化模板的成环破环识别和滚 环扩增
1.53bp甲基化和非甲基化片段由生工化学合成，其5’磷酸化修饰，合成片段的序列 如下：Septin9甲基化区域合成四条引物，5末端磷酸化，/imedc/标注为甲基化修饰
1.非甲基化模板
1a：GATGGGATCATTTCGGACGTATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTG (SEQ IDNo.1)
2b：AcgtCCGAAATGATCCCATCCAGCTGCGCGTTGACCGCGGGGTCCGACATGAT(SEQ ID No.2)
2.甲基化模板
3c：
GATGGGATCATTTCGGA/i5MedC/gtatcatgtcggaccc/i5MedC/G/i5MedC/GGTCAA/i5MedC/G/i5MedC/ GCAGCTG(SEQ ID No.3)
4d：
a/i5MedC/gtCCGAAATGATCCCATCCAGCTG/i5MedC/G/i5MedC/GTTGAC/i5MedC/G/i5MedC/GGG GTCCGACATGAT(SEQ ID No.4)
该人工模板的特点是含有两端均含有超过20个碱基的侧翼粘性末端，此设计的目的是 为了提高连接酶的成环效率，用以测试成环/破环的可行性。甲基化和非甲基化片段分别溶 解至去离子水中，终浓度为100μm,分别取2ul甲基化模板、2ul非甲基化模板以及一份含 有千分之一甲基化模板与千分之九百九十九非甲基化模板的混合模板进行连接反应，反应 体系如下：
反应条件：25℃，2h；然后70℃，20min，使T4 DNA连接酶失去活性。
2.加入1μl AciI限制性内切酶酶切连接产物，37℃，2h，70℃，20min，使AciI内切酶失去活性。
3.将消化后的酶切产物进行凝胶电泳鉴定，电泳条件为100V，30min，2％琼脂糖凝胶。电泳结果见图2A。
图2A甲基化与非甲基化人工合成模板的成环与破环识别。从左向右泳道1为核酸大 小标志，最小条带为100碱基。以100为单位递增，最亮条带为500碱基。泳道2，3为 甲基化膜版连接后的产物和AciI消化后的产物；泳道4，5为非甲基化模板连接后的产物和 AciI消化后的产物；泳道6，7为含有千分之一甲基化片段的混合模板在连接后和AciI消化 后的产物。合成片段为53个碱基，在连接酶作用下，形成以53为基本单位的单拷贝到多 拷贝的环形结构。环形核酸在本实验电泳条件下迁徙速度较线性核酸慢。AciI消化后，甲 基化的环形结构不受影响，非甲基化的环形结构降解为以53碱基，106碱基，159碱基 为主的线性结构。这些线性片段电泳场下迁徙较相应大小的环形结构要快。通过成环和破 环两个环节偶联，区分了甲基化和非甲基化核酸片段。
4.将上述酶切产物稀释1000倍，进行滚环扩增，扩增试剂盒购自新海基因公司(批号A3702)，体系如下：
反应程序：95℃，3min；25℃，5min；加入BSA与phi29，30℃，14h。
5.取5ul滚环扩增产物进行电泳鉴定，电泳条件为100V，30min，0.8％浓度琼脂糖凝 胶。电泳结果见图3B。
图2B：甲基化与非甲基化人工合成片段经过成环与破环处理后的滚环扩增结果。泳道 1为核酸大小参照物标记，最小条带为100碱基，最亮条带为500碱基。泳道2，3，4分 别为甲基化标本，非甲基化标本，和含有1/1000甲基化片段的混合标本的滚环扩增后的产物。与非甲基化标本比较，甲基化标本的扩增产物明显更多。混合标本的扩增产物(泳道4)也显著多于非甲基化标本(泳道3)的扩增产物。结果说明滚环扩增把成环与破环区别开来的线性与环形标本，进行了有区分的扩增，使选择性破环的限制性内切酶消化这一步骤转化为对特定基因型核酸分子拷贝数的放大。
实施例二：人工合成长度为34碱基的甲基化模板与非甲基化模板成环/破环后的滚环扩 增富集
分别取2μl甲基化模板、2μl非甲基化模板以及一份含有千分之一甲基化模板与千分之 九百九十九非甲基化模板的混合模板，与发夹接头进行连接反应。模板序列如下：
四条引物，5末端磷酸化，/imedc/标注为甲基化修饰
全甲1：Cac gtc/i5medc/gc gcc ggg cat aca tta tac gaa gtt a(SEQ IDNo.5)
全甲2:Aac ttc gta taa tgt atg ccc ggc g/i5medc/g gac gtg a(SEQ IDNo.6)
非甲3：Cac gtc cgc gcc ggg cat aca tta tac gaa gtt a(SEQ ID No.7)
非甲4：Aac ttc gta taa tgt atg ccc ggc gcg gac gtg a(SEQ ID No.8)
发夹接头序列如下：P-aaa aaa aaa aag/i5medc/a/i5medc/a/i5medc/i5medc/gta /i5medc/t/i5medc/a/i5medc/t/i5medc/i5medc/gag ttg gat g/i5medc/tgg atggtt ttt ttt ttt t (SEQ ID No.9)。在确认凝胶电泳可以观测成环和破环的变化之后，合成这套模板和发夹 接头，以模拟基因检测血中游离核酸时的实际情形。
1.连接反应体系如下：
反应条件：25℃，2h；然后70℃，20min，使T4 DNA连接酶失去活性。
2.加入1μl AciI限制性内切酶酶切连接产物，37℃，2h，70℃，20min，使AciI内切酶失去活性。
3.将消化后的酶切产物进行凝胶电泳鉴定，电泳条件为100V，30min，2％琼脂糖凝胶。电泳结果见图3A。
图3A：左边第一泳道是100碱基DNA大小标志，最亮的两条条带分别为500和1000碱基。泳道2，5，7为短模板与接头混合物；连接酶链接后线性模板与2个接头连接成环 形结构，位于100碱基参照物大小附近(泳道3，6，9)；中间一条条带为模板与一个接头 连接的发夹形产物，限制性内切酶AciI消化后，只有甲基化模板所形成的环形分子仍保持 环形结构(泳道4)。非甲基化短模板与接头形成的环状结构在AciI消化后重新变为线性， 且分子大小相差14个碱基的两个小片段，重叠同一凝胶条带中。连接酶连接后和AciI消化 后仍可见的最小条带为多余的接头分子。上述结果表明成环和破环过程可以区分甲基化与 非甲基化的核酸分子。
4.将上述酶切产物稀释1000倍，进行滚环扩增，扩增试剂盒购自新海基因公司(批号A3702)，体系如下：
反应程序：95℃，3min；25℃，5min；加入BSA与phi29，30℃，14h。
5.取5ul滚环扩增产物进行电泳鉴定，电泳条件为100V，30min，0.8％浓度琼脂糖凝 胶。电泳结果见图3B。
图3B为破环后的滚环扩增，含有千分之一甲基化模板的混合标本，得到可见的扩增产 物(泳道2)；纯甲基化标本扩增产物最多(泳道4)，纯非甲基化模板基本未见扩增产物(泳 道3)。
实施例三：EGFR18碱基缺失突变的识别。
1.待测模板的配置：配制野生型、突变型和50％比50％为测试标本。模板序列分别为:
EGFR-exon19-wt:atctcacaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAG GTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagct (SEQ ID No.10)(图中下划线标记部分为guide RNA的靶向序列)
EGFR-exon19-del18:
atctcacaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGA AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAT------------------CGAAAGCCAACAAGGAAAT CCTCGATgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagct(SEQ ID No.11)(图中缺失为18bp碱基的缺失)
guide RNA转录模板：
GAATTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTAAGAGCTATGC TGGAAACAGC(SEQ ID No.12)
采用5’带有EcoRI酶切位点的引物对待测模板进行PCR反应。引物序列分别为：
正向引物:ggaggaaTTCGGAGTGAGTACGGTGTGC CCCAGAAGGTGAGAAAGTT(SEQ IDNo.13)(图中下划线标记为EcoRI限制性酶切位点)；
反向引物:ggaggaaTTC GAGTTGGATGCTGGATGG agaaa ctc acat cgagg atttc(SEQID No.14)(图中下划线标记为EcoRI限制性酶切位点)。
2.PCR反应条件如下：
PCR反应程序为：98℃，30s；98℃，10s，60℃，15s，72℃，10s；72℃，3分钟； 循环数为35次。
取纯化后的PCR反应产物加入限制性内切酶EcoRI消化，消化条件如下：
反应条件：37℃，1h
3.将EcoRI消化后的产物70℃，20分钟处理，使EcoRI失去活性。
4.预先制备guide RNA：使用体外转录试剂盒转化guide RNA的DNA模板，纯化后分装保存在-80℃。进行Cas9核酸酶体外酶切反应：在上述消化体系中加入250ng guideRNA和100ng Cas9蛋白(Cas9核酸酶，S.pyogenes，NEB#M0386M)，37℃，2小时, 接着70℃，20分钟，使Cas9蛋白失去活性。
5.对上述各步骤后的DNA产物进行凝胶电泳，电泳条件为100V,30min，2％琼脂糖凝胶。电泳结果见图4。
图4为EGFR18碱基缺失突变的成环破环识别。泳道1为核酸大小标志物。泳道2，5，8为线性状态的PCR产物。泳道3，6，9为连接酶链接后的环形DNA，条带滞后于线性 DNA泳道4，7，10为cas9消化后的产物，突变产物不被cas9消化(泳道4)；野生产物 被cas9消化由环状变为线性(泳道7)；野生突变各一半的模板得到的产物部分环形DNA 变为线性，显示为两条核酸条带(泳道10)。核酸成环/破环对EGFR18碱基突变与野生片 段可以进行区分。
实施例四：EGFR18碱基缺失突变分析，cas9消化，含千分之一突变，滚环扩增一代测序
1.配制EGFR-19号外显子野生型(1pg)，突变型(1pg)，和0.1％突变型PCR产物为测试标本。模板序列为：
EGFR-exon19-wt:atctcacaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCC AGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACA TCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctg aacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagct(SEQ ID No.10)(图中下划线标记部分为guide RNA的靶向序列)
EGFR-exon19-del18:
atctcacaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGA AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAAT------------------CGAAAGCCAACAAGGAAAT CCTCGATgtgagtttctgctttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttctcatgtctggcagct(SEQ ID No.11)(图中缺失部分为18bp碱基的缺失)
guide RNA转录模板：GAATTCTAATACGACTCACTATAGCTTAATTCCTTGATAGCGAGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGC(SEQ ID No.12)
2.采用5’带有EcoRI酶切位点的引物对待测模板进行PCR反应。引物序列分别 为：
正向引物:ggaggaaTTC GGAGTGAGTACGGTGTGC CCCAGAAGGTGAGAAAGTT (SEQ IDNo.13)(图中下划线标注为EcoRI限制性酶切位点)；
反向引物:ggaggaaTTC GAGTTGGATGCTGGATGG agaaa ctc acat cgagg atttc(SEQ ID No.14)(图中下划线标注为EcoRI限制性酶切位点)。
PCR反应条件如下：
PCR反应程序为：98℃，30s；98℃，10s，60℃，15s，72℃，10s；72℃，3分钟； 循环数为35次。
3.取纯化后的PCR反应产物加入限制性内切酶EcoRI消化，消化条件如下：
反应条件：37℃，1小时。
4.将EcoRI消化后的产物摄氏80度20分钟处理，使EcoRI失去活性。
5.预先制备guide RNA：使用体外转录试剂盒转化guide RNA的DNA模板，纯化后分装保存在-80℃。进行Cas9核酸酶体外酶切反应：在上述消化体系中加入250ng guide RNA和100ng Cas9蛋白(Cas9核酸酶，S.pyogenes，NEB #M0386M)，37℃，2小时,接 着70℃，20分钟，使Cas9蛋白失去活性。
6.将上述酶切产物稀释1000倍，进行滚环扩增，扩增试剂盒购自新海基因公司(批号A3702)，体系如下：
反应程序：95℃，3min；25℃，5min；加入BSA与phi29，30℃，14h。
7.取5μl滚环扩增产物进行电泳鉴定，电泳条件为100V，30min，0.8％浓度琼脂糖凝 胶。电泳结果见图5A。从图5A可见，滚环扩增后可以明显区分野生，突变，和含有少量 突变的混合标本。扩增产物突变标本最多(泳道2)，混合标本有明显的扩增长片段条带产 物(泳道4)，野生标本仅见极微量的长片段扩增产物和少许超长扩增产物滞留在上样孔内(泳道3)。
将含千分之一突变混合标本的最后一步PCR扩增产物送公司进行一代测序，测序结果 见图5B测序图：一代测序结果显示含有千分之一突变模板的标本，滚环扩增的产物表现为 突变序列的单一峰。说明成环/破环/滚环扩增三步骤之后，突变片段得到了富集。
实施例五：EGFRT790M 2369C>T热点突变分析
1.配制EGFR790野生型(1pg)，突变型(1pg)，和0.1％突变型的PCR产物为测试标本。模板序列分别为:
EGFR790-wt:
TCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTG GGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACT ATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAA AG(SEQ ID No.15)(图中带下划线为突变的碱基)
EGFR790-mut:
TCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTG GGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACT ATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAA AG(SEQ ID No.16)(图中带下划线为突变的碱基)
2.采用5’带有EcoRI酶切位点的引物对待测模板进行PCR反应。引物序列分别为：
正向引物:GGAGGAATTCGTTATCAGTTATCTCCACCGTGCAGCTCATCC(SEQ ID No.17) (图中标注为EcoRI限制性酶切位点，C为引入的突变碱基)；和
反向引物:GGAGGAATTCGTTATCAGTTATAGCCGAAGGGCATGAGCTCC(SEQ ID No.18) (图中标注为EcoRI限制性酶切位点，C为引入的突变碱基)。
PCR反应条件如下：
PCR反应程序为：预变性：95℃，3min；95℃，20s，58℃，20s，72℃，20s；72℃， 3min；循环数为35次。
3.纯化PCR反应产物，使用限制性内切酶EcoRI消化，消化条件如下：
反应条件：37℃，1小时
4.将EcoRI消化后的产物摄氏80度20分钟处理，使EcoRI失去活性。
5.将上述内切酶消化产物进行环化处理；环化反应条件如下：
加入终浓度为1mM的ATP与0.4μl T4 DNA连接酶，25℃，1小时，接着70℃，20min 处理，使T4 DNA连接酶失去活性。
6.环化处理后的产物采用限制性内切酶NciI消化，消化条件如下：
加入0.4ul NciI限制性内切酶，37℃，1h,70℃，20分钟处理，使NciI失去活性。
7.取0.1ul消化后产物进行滚环扩增，扩增条件如下：
反应程序：95℃，3分钟；25℃，5分钟；加入BSA与phi29，30℃，14小时。
对滚环扩增产物电泳，电泳条件为100V,30分钟，0.8％琼脂糖凝胶。凝胶电泳结果见 图6A：泳道2是含千分之一突变的混合模板，泳道3是突变模板，泳道4是野生模板。野 生模板扩增产物最少。左侧第一泳道为kb大小的DNA标志。在滚环扩增中后，含有千分 之一突变混合模板(泳道2)和突变模板(泳道3)的滚环扩增产物显著多于野生标本(泳 道4)。滚环扩增后产物的量三个标本之间差异明显。
将含千分之一突变混合标本的滚环扩增产物进行一代测序，测序结果见图6B。
图6B：含有0.1％突变模板混合标本的滚环扩增产物经测序，确认为来自于突变模板 且未显示混合的套峰，表明扩增产物中突变分子的含量得到了富集。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员 应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进 都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界 定。
序列表
<110> 李凯
<120> 多种混合核酸中检测痕量核酸的方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgggatca tttcggacgt atcatgtcgg accccgcggt caacgcgcag ctg 53
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgtccgaaa tgatcccatc cagctgcgcg ttgaccgcgg ggtccgacat gat 53
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatgggatca tttcggacgt atcatgtcgg accccgcggt caacgcgcag ctg 53
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgtccgaaa tgatcccatc cagctgcgcg ttgaccgcgg ggtccgacat gat 53
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacgtccgcg ccgggcatac attatacgaa gtta 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacttcgtat aatgtatgcc cggcgcggac gtga 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacgtccgcg ccgggcatac attatacgaa gtta 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacttcgtat aatgtatgcc cggcgcggac gtga 34
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaaaaaaa agcacaccgt actcactccg agttggatgc tggatggttt ttttttttt 59
<210> 10
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atctcacaat tgccagttaa cgtcttcctt ctctctctgt catagggact ctggatccca 60
gaaggtgaga aagttaaaat tcccgtcgct atcaaggaat taagagaagc aacatctccg 120
aaagccaaca aggaaatcct cgatgtgagt ttctgctttg ctgtgtgggg gtccatggct 180
ctgaacctca ggcccacctt ttctcatgtc tggcagct 218
<210> 11
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atctcacaat tgccagttaa cgtcttcctt ctctctctgt catagggact ctggatccca 60
gaaggtgaga aagttaaaat tcccgtcgct atcaaggaat cgaaagccaa caaggaaatc 120
ctcgatgtga gtttctgctt tgctgtgtgg gggtccatgg ctctgaacct caggcccacc 180
ttttctcatg tctggcagct 200
<210> 12
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaattctaat acgactcact atagcttaat tccttgatag cgagtttaag agctatgctg 60
gaaacagc 68
<210> 13
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggaggaattc ggagtgagta cggtgtgccc cagaaggtga gaaagtt 47
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaggaattc gagttggatg ctggatggag aaactcacat cgaggatttc 50
<210> 15
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctccctccc tccaggaagc ctacgtgatg gccagcgtgg acaaccccca cgtgtgccgc 60
ctgctgggca tctgcctcac ctccaccgtg cagctcatca cgcagctcat gcccttcggc 120
tgcctcctgg actatgtccg ggaacacaaa gacaatattg gctcccagta cctgctcaac 180
tggtgtgtgc agatcgcaaa g 201
<210> 16
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctccctccc tccaggaagc ctacgtgatg gccagcgtgg acaaccccca cgtgtgccgc 60
ctgctgggca tctgcctcac ctccaccgtg cagctcatca tgcagctcat gcccttcggc 120
tgcctcctgg actatgtccg ggaacacaaa gacaatattg gctcccagta cctgctcaac 180
tggtgtgtgc agatcgcaaa g 201
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggaggaattc gttatcagtt atctccaccg tgcagctcat cc 42
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggaggaattc gttatcagtt atagccgaag ggcatgagct cc 42
Claims (7)
1.多种混合核酸中检测痕量核酸的方法，其包括如下步骤：
(1)对含有多种混合核酸的待测样本，进行线性核酸分子的环化，
(2)采用具有核酸内切功能的核酸酶对对环化后的核酸进行选择性破环，使待测样本中不需要富集的核酸靶点从环形核酸变为线性核酸，
(3)对步骤(2)得到的核酸分子进行检测识别，检测存留形态是线性核酸还是环形核酸。
2.根据权利要求1所述的检测痕量核酸的方法，其特征在于，当需要识别与富集的核酸靶点为大量长度不一的未知情况时，在步骤(1)前，先将待测样本中的线性核酸分子的末端填平补A，然后用核酸连接酶链接接头以形成环化核酸。
3.根据权利要求1所述的检测痕量核酸的方法，其特征在于，当需要识别与富集的核酸为已知确定数量的靶点时，在步骤(1)前，先采用5’末端带限制性内切酶位点的引物进行扩增，然后利用相应的内切酶处理扩增产物、然后采用核酸连接酶使其形成环化核酸。
4.根据权利要求1所述的检测痕量核酸的方法，其特征在于，当需要富集的核酸为已知的一定数量的靶点时，在步骤(1)前，采用5’末端带LoxP位点的引物进行扩增，然后利用cre重组酶的重组功能形成环化核酸。
5.根据权利要求1所述的检测痕量核酸的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述具有核酸内切功能的核酸酶为天然核酸内切酶或基因工程核酸内切酶。
6.根据权利要求1所述的检测痕量核酸的方法，其特征在于，在步骤(3)中，对待测核酸分子进行识别的存留形态是线性还是环形的方法，包括电泳方法、核酸外切酶外切法、PCR扩增法、滚环扩增法、飞行质谱、高压液相法、高分辨溶解曲线。
7.根据权利要求1所述的检测痕量核酸的方法，其特征在于，对选择性破环后的待测样本进行滚环扩增。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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