CN111712572A - 用于扩增mRNA的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于全长cDNA或cDNA片段的合成、扩增和体外转录的组合物和方法。提供了用于RNA的逆转录和体外转录的扩增的方法。还提供了用于向树突细胞加载所述RNA和同源裂解液用于免疫刺激的方法。

Description

用于扩增mRNA的方法和组合物

本申请要求2017年12月15日提交的美国临时专利申请号62/599,472的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

序列表的并入

序列表含于2018年12月11日创建的1KB(在Microsoft

中测量)的名称为“BACMP0006WO__ST25.txt”的文件中，通过电子提交与本文一同提交并且以引用的方式并入本文。

背景技术

1.发明领域

本发明总体上涉及分子生物学的领域。更具体地，它涉及mRNA的逆转录和那些产物的扩增。

2.相关技术说明

分子生物学中的重要工具是复制DNA和RNA的能力。DNA可以通过聚合酶链反应进行体外复制和扩增，其中引物与靶核酸的相反端和相反链杂交，并且引物通过DNA依赖性DNA聚合酶延伸。通常在体内短暂存在的RNA可以通过RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)进行逆转录，以便生成DNA拷贝，其比RNA稳定得多。由逆转录生成的DNA(被称为互补DNA或cDNA)然后可以进行扩增、测序、反转录为RNA、并入用于克隆的载体中或其任何组合。

目前存在各种方法和酶将RNA逆转录为DNA。通常，在由mRNA模板设计用于cDNA合成的引物时，研究者利用mRNA的3'端上存在的poly(A)尾部。这允许研究者使用在引物的3'端具有poly(T)序列的引物，并且使得从mRNA捕获3'序列信息非常容易。如在标准PCR中，对应于靶序列的5'端的第二引物包含随机或靶向序列。5'引物的第三选择是利用一些逆转录酶的固有的模板转换活性，并且使第二引物与通过逆转录酶生成的多核苷酸突出端杂交，并且继续合成与第二引物互补的链(参见例如美国专利号5,962,271)。然后可以使用标准PCR反应来拷贝互补DNA链以扩增序列。cDNA合成和扩增中使用的引物可以包含启动子，使得可以使用体外转录过程来转录cDNA，以生成大量靶mRNA。然后可以使用通过体外转录生成的RNA来诱导树突细胞上的抗原呈递。然而，逆转录和体外转录的方法在逆转录过程中存在高偏差并且体外转录效率低，从而证明了需要改进的方法和组合物来增强这些过程。

发明内容

在第一实施方案中，提供了一种寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:1的序列。在一些方面，所述寡核苷酸还被定义为引物。在某些方面，所述寡核苷酸包含少于40个核苷酸。在具体方面，所述寡核苷酸由SEQ ID NO:1组成。

在另一个实施方案中，提供了一种组合物，其包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列，并且其中所述第二引物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。在若干方面，所述组合物还被定义为核酸扩增反应混合物。在其他方面，所述组合物还包含第三引物，其中所述第三引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

在又一个实施方案中，提供了一种由模板mRNA合成第一cDNA链的方法，其包括以下步骤：a)使第一引物与模板mRNA杂交，其中所述第一引物包含SEQ ID NO:2的核酸序列；b)用具有末端转移酶和模板转换活性的逆转录酶延伸所述第一引物，以生成具有oligo(C)突出端的部分第一cDNA链；c)使第二引物与所述部分第一cDNA链的所述oligo(C)突出端杂交，其中所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列；以及d)使用所述第二引物作为模板来从所述oligo(C)突出端延伸所述部分第一cDNA链，从而生成第一cDNA链。在一些方面，所述方法还包括步骤e)分离所述模板mRNA链和第一cDNA链；f)使第三引物与所述第一cDNA链杂交；以及g)延伸所述第三引物以生成第二cDNA链，从而生成双链cDNA。在某些方面，所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在若干方面，所述第三引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在其他方面，所述模板mRNA从样品获得。在一些具体方面，所述样品是肿瘤样品。在某些具体方面，所述肿瘤样品在从受试者取出之后储存在RNA稳定溶液中。在又一些其他方面，所述RNA稳定溶液是

在另外的方面，所述方法还包括由所述双链cDNA合成RNA。在一些方面，所述由所述双链cDNA合成RNA包括体外转录。在更具体的方面，所述体外转录包括添加第四引物、第五引物和RNA聚合酶，以及用所述RNA聚合酶由所述双链cDNA合成RNA。在特定方面，所述第四引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在另一方面，所述第四引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在另一方面，所述方法还包括对所述RNA加帽。

在某些方面，所述方法还包括扩增所述双链cDNA。在一些方面，所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在其他方面，所述第三引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在特定方面，扩增所述双链cDNA包括添加DNA依赖性DNA聚合酶、第四引物和第五引物，以及通过聚合酶链反应扩增所述cDNA。在一些具体方面，所述第四引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在另一方面，所述第五引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

在其他方面，所述方法还包括体外转录所扩增的cDNA以生成有义链扩增的mRNA。在若干方面，所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。在某些方面，所述第三引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。在一些另外的方面，所述所扩增的cDNA的体外转录包括向所述所扩增的cDNA中添加具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的序列的引物，以及使所述引物与所述所扩增的cDNA杂交。在特定方面，所述所扩增的cDNA的体外转录包括向所述所扩增的cDNA中添加RNA聚合酶，以及延伸所杂交的引物以生成RNA。在另一方面，所述方法还包括对所扩增的RNA加帽。

本发明的另一个实施方案提供了一种用于转导树突细胞群体的方法，其包括使所述树突细胞群体与编码一种或多种抗原的核酸接触，其中所述核酸包括通过以上所述的任何方法和方面生成的RNA。在一些方面，所述方法还包括使所述树突细胞群体与肿瘤细胞裂解液接触。在另一方面，所述肿瘤细胞裂解液包含具有表位的肿瘤抗原，所述表位具有与所述编码一种或多种抗原的核酸的序列重叠最少5个氨基酸的序列。

在又一个实施方案中，提供了一种用于在具有患病细胞群体的受试者中提供免疫应答的方法，其包括：a)获得通过如权利要求36或37所述的方法产生的致敏树突细胞群体；以及b)向所述受试者施用有效量的所述致敏树突细胞群体。在某些方面，所述抗原致敏的树突细胞已经用与癌症、自身免疫疾病或感染性疾病相关联的抗原致敏。在若干方面，所述抗原致敏的树突细胞已经用至少一种肿瘤抗原致敏。在另外的方面，所述方法还包括施用免疫检查点抑制剂。在另一方面，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂。在某些方面，所述免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab)。

本发明的又一个实施方案提供了一种试剂盒，其包括如权利要求1所述的寡核苷酸引物、SEQ ID NO:2的寡核苷酸引物和/或SEQ ID NO:3的寡核苷酸引物。在一些方面，所述试剂盒还可以包括从癌细胞分离的核酸、DNA聚合酶和/或RNA稳定溶液。在特定方面，所述RNA稳定溶液是

在另一方面，所述试剂盒还被定义为cDNA合成试剂盒。在另外的方面，所述试剂盒还包括dNTP、MgCl₂、逆转录酶和/或RNA酶抑制剂。

如本文所用，就指定组分而言，在本文中使用“基本上不含”意指没有指定组分被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或痕量存在。由组合物的任何无意污染导致的指定组分的总量优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法检测不到指定组分的量的组合物。

如本说明书和权利要求书中所用，“一个/种(a/an)”可以意指一个/种或多个/种。如本说明书和权利要求书中所用，当与词语“包含”一起使用时，词语“一个/种(a/an)”可以意指一个/种或多于一个/种。如本说明书和权利要求书中所用，“另一个”或“另外一个”可以意指至少第二或更多个。

如本说明书和权利要求书中所用，术语“约”用于指示值包括用于确定该值所采用的装置、方法的固有误差变化或研究对象之间存在的变化。

通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优势将变得显而易见。然而，应理解，尽管指出本发明的某些实施方案，但是详细描述和特定实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括以进一步展现本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并且结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1：新鲜收获的肿瘤样品比冷冻存档的样品产生质量更好的RNA。如图所示，从冷冻或新鲜肿瘤组织分离的RNA在非变性1％琼脂糖凝胶上运行。从左至右：L：梯状条带(ladder)；1：冷冻的肿瘤样品RNA；2冷冻的肿瘤样品RNA；3：冷冻的肿瘤样品RNA；4：新鲜肿瘤样品RNA。

图2：两种不同的RNA分离方法的比较。如图所示，RNA样品在非变性1％琼脂糖凝胶上运行。泳道1：通过柱纯化从30mg肿瘤组织分离的RNA。泳道2：通过硫氰酸胍/苯酚/氯仿纯化从30mg肿瘤组织分离的RNA。

图3：示出在本发明中使用的逆转录过程的示意图，指示所使用的引物。VKWD引物具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。CDS64T+寡聚物引物具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。T7power switch引物具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

图4：逆转录之后进行体外转录的方法的比较。如图所示，使用4种不同方案来由相同的起始材料生成体外转录的RNA。泳道1，通过

法(

等人，2013)生成的未加帽的转录物。泳道2，通过

法(

等人，2013)生成的加帽的转录物。泳道3，通过本文所述的方法生成的未加帽的RNA。泳道4，通过本文所述的方法生成的加帽的RNA。

图5：通过两种不同的方法生成并加帽的mRNA的比较。5ug体外转录的mRNA在1％非变性琼脂糖凝胶上运行。泳道1，通过先前方法(

等人，2013)生成并在转录后加帽的mRNA。泳道2，通过本发明的方法生成并共转录加帽的mRNA。

图6：IFNγ产生通过与加载加帽的mRNA和裂解液的树突细胞共同培养的T细胞显著增强。图示的是，对于加载通过先前方法(Argos

)或本发明的方法(VKWD)生成的未加帽或加帽的mRNA和裂解液或加载错配mRNA和裂解液的细胞，通过ELISA测量的IFN-γ分泌的相对量。

图7：当与同源地加载加帽的mRNA和裂解液的树突细胞共同培养时，抗原特异性CD8⁺CD25⁺ T细胞的产生增强。图示的是，在用加载数据下方示出的mRNA的树突细胞重刺激之后，针对抗原特异性活化标记物对T细胞进行的流式细胞术分析。

图8：树突细胞裂解液的蛋白质印迹分析。泳道1：未加载的树突细胞。泳道2：加载使用

法生成的未加帽的mRNA的树突细胞。泳道3：加载使用

法生成的加帽的mRNA的树突细胞。泳道4：加载使用本文所述的方法生成的未加帽的mRNA的树突细胞。泳道5：加载使用本文所述的方法生成的加帽的mRNA的树突细胞。泳道6：加载错配mRNA和裂解液的树突细胞。泳道7：加载使用本文所述的方法生成并共转录加帽的mRNA的树突细胞。

图9：同源抗原加载体外转录并扩增的mRNA导致增强的CTLA4保留。图示的是，未加载或加载以下指定物质的树突细胞的流式细胞术分析：mRNA、裂解液、2x(mRNA和裂解液)和MM(错配mRNA和裂解液)。

图10：来自同源地加载的树突细胞的CTLA4的增强保留和减少释放。图示的是，检测树突细胞培养物的上清液或裂解液中的CTLA4的蛋白质印迹法。树突细胞未进行加载(UL)或加载mRNA、裂解液、两者或错配mRNA和裂解液。通过基于柱的方法或硫氰酸胍/苯酚/氯仿方法分离mRNA。

图11：IL-12转录物水平在同源地加载裂解液和体外转录的mRNA的树突细胞中升高。示出了通过ELISA检测的加载指定的RNA和/或裂解液的树突细胞的IL-12a和IL-12b水平。左轴表示归一化到未加载的对照DC并设定为1.0的任意转录单位。

图12：描述树突细胞疫苗的制备的流程图。

图13A-B：当与同源裂解液一起加载到DC中时，扩增的mRNA以与天然poly-A mRNA相同的效率在体外产生TH1免疫应答。(A)向单核细胞来源的人DC加载a)天然poly A肿瘤mRNA和同源/异源裂解液，或2)加帽的IVT扩增的mRNA和同源/异源裂解液。然后将DC与T细胞共同培养，并且通过流式分析活化的CD8+CD25+Ifng+细胞的百分比。与未加载的DC或加载未加帽的mRNA的DC共同培养的T细胞充当对照。(B)使加载poly A mRNA或IVT扩增的mRNA和同源或异源细胞裂解液的各种组合的DC成熟化48小时，并且通过流式细胞术分析细胞内CTLA4水平。单一加载和未加载的DC充当对照。细胞内CTLA-4的上调指示保留增加，并且因此指示分泌减少。UL-未加载的DC，未加帽的mRNA-加载未加帽的IVT mRNA的DC，mRNA-加载poly A mRNA的DC，裂解液-加载裂解液的DC，2x w/未加帽-加载未加帽的IVT mRNA和同源裂解液的DC，2x加帽-加载加帽的IVT mRNA和同源裂解液的DC，MM未加帽-加载未加帽的IVTmRNA和异源裂解液的DC，MM加帽-加载加帽的IVT mRNA和异源裂解液的DC。

具体实施方式

逆转录是其中RNA依赖性DNA聚合酶使用RNA作为模板合成DNA的过程，并且在分子生物学中作为用于理解基因表达和测序细胞RNA的工具变得越来越重要。使用体外转录并在逆转录之后扩增的过程允许由模板RNA产生大量RNA。然而，需要降低逆转录过程的偏差并增加其效率的方法。

因此，在某些实施方案中，本公开提供了用于降低逆转录过程的偏差的方法，并且提供了用于增加逆转录分子的扩增效率的方法。具体地，本研究发现引物的核苷酸组成和序列对于逆转录过程以及在引物中并入启动子序列对于有效的的体外转录是重要的。

具体地，一些实施方案提供了用于全长cDNA或cDNA片段的合成、扩增和体外转录的组合物和方法。所述方法可以包括使RNA与可以与mRNA的poly(A)尾部退火的引物、具有逆转录酶活性的合适的酶和模板转换寡核苷酸在足以允许作为与mRNA模板互补的cDNA的引物的模板依赖性延伸的条件下接触。模板转换寡核苷酸可以与逆转录酶生成的位于新生成的cDNA的3’端的突出端杂交，并且允许逆转录酶继续在cDNA的3’端合成模板转换寡核苷酸的互补序列。后续扩增可以引入启动子序列以用于体外转录。然后可以将体外转录的RNA与同源裂解液一起加载到树突细胞中以用于免疫刺激。因此，另外的实施方案提供了用于树突细胞的加载的方法和树突细胞疫苗用于治疗疾病诸如癌症的用途。

II.定义

如本文所用，“扩增”是指用于增加一个或多个核苷酸序列的拷贝数的体外过程。核酸扩增使得核苷酸并入DNA或RNA中。如本文所用，一个扩增反应可以由许多轮的DNA复制组成。例如，一个PCR反应可以由30-100个变性和复制“循环”组成。

“聚合酶链反应”或“PCR”意指用于通过同时引物延伸DNA的互补链进行特定DNA序列的体外扩增的反应。换言之，PCR是用于制备引物结合位点侧接的靶核酸的多个拷贝或复制的反应，这种反应包括以下步骤的一个或多个重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物与引物结合位点退火，以及(iii)在三磷酸核苷的存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，将反应循环通过热循环仪中针对每个步骤优化的不同温度。具体温度、每个步骤的持续时间和步骤之间的变化速率取决于本领域普通技术人员熟知的许多因素，例如，通过参考文献例示的：McPherson等人编,PCR:A Practical Approach和PCR2:A Practical Approach(IRLPress,Oxford,分别为1991年和1995年)。

“引物”意指天然或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体时能够充当核酸合成的起始点并且从其3′端沿模板延伸，使得形成延伸的双链体。在延伸过程期间添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。引物通常通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有与其在引物延伸产物的合成中的用途相容的长度，并且通常在8至100个核苷酸之间的长度范围内，诸如10至75、15至60、15至40、18至30、20至40、21至50、22至45、25至40等，更通常在18-40、20-35、21-30个核苷酸之间的长度范围内，以及所述范围之间的任何长度。典型的引物可以在10-50个核苷酸之间的长度范围内，诸如15-45、18-40、20-30、21-25等，以及所述范围之间的任何长度。在一些实施方案中，引物的长度通常不超过约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸。

如本文所用，“并入”意指成为核酸聚合物的一部分。

如本文所用，术语“在外源性操纵不存在的情况下”是指在不改变核酸分子在其中被修饰的溶液的情况下进行核酸分子的修饰。在具体实施方案中，它在人工操作不存在的情况下或在改变溶液条件(其还可以被称为缓冲液条件)的机器不存在的情况下发生。然而，温度变化可以在修饰期间发生。

“核苷”是碱基-糖组合，即缺乏磷酸盐的核苷酸。本领域应认识到，在使用术语核苷和核苷酸时存在一定的互换性。例如，核苷酸三磷酸脱氧尿苷dUTP是三磷酸脱氧核糖核苷。在并入DNA中之后，它充当DNA单体，形式上是脱氧尿苷酸，即dUMP或单磷酸脱氧尿苷。即使在所得的DNA中没有dUTP部分，也可以说将dUTP并入了DNA中。类似地，即使仅存在一部分底物分子，也可以说将脱氧尿苷并入了DNA中。

如本文所用，“核苷酸”是本领域的指代碱基-糖-磷酸盐组合的术语。核苷酸是核酸聚合物，即DNA和RNA的单体单元。所述术语包括三磷酸核糖核苷酸，诸如rATP、rCTP、rGTP或rUTP，以及三磷酸脱氧核糖核苷酸，诸如dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。

术语“核酸”或“多核苷酸”通常是指DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体或其衍生物或类似物的至少一个分子或一条链，其包含至少一个核碱基，例如像DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”和C)中天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”。如本文所用，“寡核苷酸”共同地且可互换地是指本领域的“寡核苷酸”和“多核苷酸”两个术语。应指出，虽然寡核苷酸和多核苷酸是本领域的不同术语，但是它们之间没有明确的分割线并且它们在本文中可互换使用。术语“衔接子”也可以与术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换使用。此外，术语“衔接子”可以指示线性衔接子(单链或双链)或茎环衔接子。这些定义通常是指至少一个单链分子，但是在具体实施方案中，还涵盖与至少一个单链分子部分、基本上或完全互补的至少另一条链。因此，核酸可以涵盖至少一个双链分子或至少一个三链分子，其包含构成所述分子的链的特定序列的一个或多个互补链或“互补序列”。如本文所用，单链核酸可以由前缀“ss”表示，并且双链核酸可以由前缀“ds”表示。

如本文所用，“寡核苷酸”共同地且可互换地是指本领域的“寡核苷酸”和“多核苷酸”两个术语。应指出，虽然寡核苷酸和多核苷酸是本领域的不同术语，但是它们之间没有明确的分割线并且它们在本文中可互换使用。术语“衔接子”也可以与术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换使用。

“核酸分子”或“核酸靶分子”是指包含标准规范碱基、高度修饰碱基、非天然碱基或其任何碱基组合的任何单链或双链核酸分子。例如但不受限，核酸分子含有4个规范DNA碱基-腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，和/或4个规范RNA碱基-腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶。当核苷含有2′-脱氧核糖基团时，尿嘧啶可以替代胸腺嘧啶。核酸分子可以由RNA转化为DNA以及由DNA转化为RNA。例如但不受限，可以使用逆转录酶由mRNA产生互补DNA(cDNA)，并且可以使用RNA聚合酶由DNA产生RNA。核酸分子可以具有生物来源或合成来源。核酸分子的实例包括基因组DNA、cDNA、RNA、DNA/RNA杂交体、扩增的DNA、现有的核酸文库等。核酸可以从人样品，诸如血液、血清、血浆、脑脊髓液、颊刮取物、活检物、精液、尿液、粪便、唾液、汗液等获得。核酸分子可以进行各种处理，诸如修复处理和片段化处理。片段化处理包括机械、超声和流体动力剪切。修复处理包括通过延伸和/或连接进行的缺口修复、抛光以产生钝端、去除受损碱基，诸如脱氨基、衍生化、脱碱基或交联的核苷酸等。目标核酸分子还可以进行化学修饰(例如，亚硫酸氢盐转化、甲基化/去甲基化)、延伸、扩增(例如，PCR、等温等)等。

嘌呤和嘧啶的“类似物”形式是本领域熟知的，并且包括但不限于氮丙啶基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸和2,6-二氨基嘌呤。核酸分子还可以含有一个或多个高度修饰的碱基，例如但不限于5-羟甲基尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、α-腐胺基胸腺嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁴-甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、α-氨基甲酰基甲基腺嘌呤、N⁶-甲基腺嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和N⁷-甲基鸟嘌呤。核酸分子还可以含有一个或多个非天然碱基，例如但不限于7-脱氮-7-羟甲基腺嘌呤、7-脱氮-7-羟甲基鸟嘌呤、异胞嘧啶(isoC)、5-甲基异胞嘧啶和异鸟嘌呤(isoG)。仅含有规范的、高度修饰的、非天然碱基或其任何碱基组合的核酸分子还可以含有例如但不限于其中核苷酸残基之间的每个键联可以由标准磷酸二酯键组成，并且此外还可以含有一个或多个修饰的键联，例如但不限于非桥接氧原子被氮原子(即，氨基磷酸酯键)、硫原子(即，硫代磷酸酯键)或者烷基或芳基基团(例如，烷基或芳基膦酸酯)取代、桥接氧原子被硫原子(即硫代磷酸酯)取代、磷酸二酯键被肽键(即肽核酸或PNA)取代，或形成一个或多个另外的共价键(即锁核酸或LNA)，其在核糖的2′-氧与4′-碳之间具有另外的键。

“互补”的或作为“互补序列”的核酸是能够根据标准Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen结合互补性规则进行碱基配对的那些。如本文所用，术语“互补”或“互补序列”可以是指基本上互补的核酸，如可以通过以上列出的相同核苷酸比较评估。术语“基本上互补”可以是指包含连续核碱基或半连续核碱基(如果一个或多个核碱基部分不存在于分子中)的至少一个序列的核酸能够与至少一个核酸链或双链体杂交，即使并非所有的核碱基都不与对应核碱基进行碱基配对。在某些实施方案中，“基本上互补的”核酸含有至少一个序列，其中约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％至约100％及其之间的任何范围的核碱基序列能够在杂交期间与至少一个单链或双链核酸分子进行碱基配对。在某些实施方案中，术语“基本上互补”是指可以在严格条件下与至少一条核酸链或双链体杂交的至少一种核酸。在某些实施方案中，“部分互补的”核酸包含可以在低严格性条件下与至少一种单链或双链核酸杂交的至少一个序列，或者含有其中小于约70％的核碱基序列能够在杂交期间与至少一个单链或双链核酸分子进行碱基配对的至少一个序列。

术语“不互补”是指缺乏通过特定氢键形成至少一个Watson-Crick碱基对的能力的核酸序列。

如本文所用，术语“钝端”是指具有5′和3′端的dsDNA分子的端部，其中5′和3′端在相同核苷酸位置处终止。因此，钝端不包括5′或3′突出端。

如本文所用，术语“突出端”是指具有5′和3′端的dsDNA分子的端部，其中5′和3′端在不同核苷酸位置处终止，在5′和3′端的没有核苷酸进行氢结合的端部上留下至少一个核苷酸。

如本文所用，术语“帽”是通过5′-碳与三磷酸酯基团结合的鸟嘌呤核苷，所述三磷酸酯基团进而与初始mRNA转录物的最5′-核苷酸的5′-碳结合，并且在大多数真核生物中，帽核苷酸中鸟嘌呤的7位置处的氮被甲基化。大多数真核细胞mRNA转录物和大多数真核病毒mRNA转录物在其5′末端被封端或“加帽”。除了mRNA外，一些其他形式的真核生物RNA，诸如但不限于小核RNA(“snRNA”)和前体小RNA(即，“pre-miRNA”，加工成miRNA的初始转录物)也被加帽。真核细胞和病毒mRNA(和一些其他形式的RNA)的5′帽在RNA稳定性和加工中发挥重要作用。例如，不同程度地需要帽来用于细胞核中RNA转录物的加工和成熟化、mRNA从细胞核转运到细胞质中、mRNA稳定性以及mRNA到蛋白质的有效翻译。

“样品”意指从含有目标核酸的新鲜或保存的生物样品或合成产生的来源获得或分离的材料。在某些实施方案中，样品是含有针对其寻求数据或信息的一个或多个可变免疫区的生物材料。样品可以包括至少一种细胞、胎儿细胞、细胞培养物、组织样本、血液、血清、血浆、唾液、尿液、泪液、阴道分泌物、汗液、淋巴液、脑脊髓液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、粪便物质、身体渗出液、脐带血、绒毛、羊水、胚胎组织、多细胞胚胎、裂解液、提取物、溶液或疑似含有目标免疫核酸的反应混合物。样品还可以包括非人来源，诸如非人灵长类动物、啮齿类动物和其他哺乳动物、其他动物、植物、真菌、细菌和病毒。

如本文关于核苷酸序列所用，“基本上已知”是指具有足够的序列信息来允许制备核酸分子，包括其扩增。这通常是约100％，但是在一些实施方案中，衔接子序列的一些部分是随机的或简并的。因此，在具体实施方案中，基本上已知是指约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％或约99％至约100％。

III.实施方案的核酸

本公开的核酸可以包括扩增、逆转录和/或体外转录引物和寡核苷酸、肿瘤来源的核酸和/或编码一种或多种蛋白质或肽的重组核酸，诸如可以诱导有效对抗肿瘤或肿瘤细胞的免疫应答的那些。在一些实施方案中，可以诱导免疫应答的核酸的生成包括靶mRNA的逆转录以生成cDNA。逆转录的方法是本领域熟知的(美国专利号5,962,271和6,518,019，以引用的方式并入本文)。逆转录通过RNA依赖性DNA聚合酶(还被称为逆转录酶)来进行。逆转录酶结合至与靶mRNA的3’端杂交的引物，并且合成与mRNA互补的DNA。逆转录酶可以将若干非模板核苷酸添加到新合成的cDNA的3’端，诸如短poly(C)尾部。第二引物可以与新生cDNA的3’端杂交，并且逆转录酶可以使用其模板转换活性来使用第二引物作为模板而继续合成与引物互补的DNA。

逆转录或扩增中使用的引物或寡核苷酸可以允许在互补链合成期间将外源性DNA或RNA序列添加到靶序列的5’和3’端。用于引发逆转录或扩增反应的引物或寡核苷酸可以并入各种特征，包括但不限于转录启动子、核糖体结合位点或限制性内切核酸酶切割位点。在一些实施方案中，引物可以包含转录启动子序列。

通过逆转录制备的cDNA可以扩增或转录为RNA。cDNA可以通过PCR扩增以增加cDNA的浓度。逆转录的引物可以用作PCR的引物，或者可以添加单独的引物。PCR反应可以利用逆转录酶来扩增cDNA，或者可以添加DNA依赖性DNA聚合酶以增加DNA扩增的效率。逆转录或DNA扩增的引物可以包含转录启动子序列，诸如T7启动子序列。cDNA或扩增的cDNA可以在体外转录过程中转录，以使用任何可商购获得的RNA聚合酶或体外转录试剂盒(诸如AMPLISCRIBE^TMT7-FLASH^TM(

目录号ASF3257))来生成大量初始靶RNA。

在某些实施方案中，核酸组合物含有肿瘤来源的核酸群体和重组核酸组分两者。此组合核酸组合物增加某些已知的肿瘤抗原或编码增强本文所述的方法和组合物的有效性的蛋白质或肽的其他核酸的流行率。

“肿瘤来源的”核酸是指起源于肿瘤细胞的核酸，并且其包括对应于肿瘤抗原的RNA。包括编码肿瘤抗原的全部或一部分或先前鉴定的肿瘤抗原的RNA。这种核酸可以“体外转录”，例如逆转录以产生cDNA，其可以通过PCR扩增并随后在克隆或不克隆cDNA的情况下进行体外转录。还包括作为肿瘤细胞的分级制品提供的RNA。因为可以使用甚至未分级的RNA制品(例如，总RNA或总poly A RNA)，所以鉴定肿瘤抗原不是必须的。在一个实施方案中，针对细胞的非RNA组分对制品进行分级，以便降低非RNA组分(诸如蛋白质、脂质和/或DNA)的浓度并富集制剂的RNA。如果需要的话，还可以针对RNA对制品进行分级(例如，通过消减杂交)，使得产生“肿瘤特异性”或“病原体特异性”RNA。

“肿瘤特异性”RNA意指相对于未分级的肿瘤来源的RNA，具有高含量的与非肿瘤细胞相比优先存在于肿瘤细胞中的RNA的RNA样品。例如，肿瘤特异性RNA包括存在于肿瘤细胞中但不存在于非肿瘤细胞中的RNA。此定义还涵盖RNA样品，所述RNA样品包含存在于肿瘤和非肿瘤细胞两者中，但在肿瘤细胞中的存在水平高于在非肿瘤细胞中的存在水平的RNA。此定义还包括编码先前鉴定的肿瘤抗原并且例如由质粒或通过PCR在体外产生的RNA。替代地，肿瘤特异性RNA可以通过以下方式来制备：对RNA样品进行分级，使得相对于未分级的肿瘤来源的RNA对应于肿瘤抗原的RNA的百分比增加。例如，肿瘤特异性RNA可以通过使用针对来自非肿瘤细胞的RNA的常规消减杂交技术对肿瘤来源的RNA进行分级来制备。

本文提供了适于产生肿瘤来源的核酸或RNA的方法。这些核酸可以用于使树突细胞致敏以及用于制备成熟树突细胞。不需要向DC提供纯化形式的核酸。优选地，RNA样品(即，分级的肿瘤制品)为至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％RNA(重量/体积)。

本领域已知的转染方法适于将肿瘤来源的核酸引入树突细胞中。例如，可以将在500μl Opti-MEM中的5-50μg RNA在10至100μg的浓度下与阳离子脂质混合，并且在室温下温育20至30分钟。其他合适的脂质包括LIPOFECTIN^TM(1:1(w/w)DOTMA:DOPE)、LIPOFECTAMINE^TM(3:1(w/w)DOSPA:DOPE)、DODAC:DOPE(1:1)、CHOL:DOPE(1:1)、DMEDA、CHOL、DDAB、DMEDA、DODAC、DOPE、DORI、DORIE、DOSPA、DOTAP和DOTMA。然后将所得RNA-脂质复合物添加到总体积约为2ml(例如，在Opti-MEM中)的1-3×106个细胞，优选2×106个抗原呈递细胞中，并在37℃下温育2至4小时。替代地，可以通过采用常规技术，诸如使用1-5×106个细胞和5至50μg RNA进行的电穿孔或磷酸钙转染来将RNA引入抗原呈递细胞中。通常，通常使用5-20μg poly A RNA或25-50μg总RNA。

当RNA作为肿瘤制品提供时，通常对所述制品进行分级或其他处理以降低制品中蛋白质、脂质和/或DNA的浓度并富集制品的RNA。例如，可以使用本领域已知的RNA纯化方法来由肿瘤细胞或病原体至少部分纯化RNA。用蛋白酶或不含RNA酶的DNA酶处理RNA制品也是可接受的。

IV.实施方案的树突细胞群体

用于分离培养和致敏树突细胞的方法是本领域熟知的。例如，以引用的方式整体并入本文的美国专利8,728,806提供了用于提供可以在实施方案的组合物和方法中使用的抗原致敏树突细胞的详细方法。在某些方面，根据实施方案使用的树突细胞从待通过实施方案的方法治疗的受试者分离。在其他方面，树突细胞可以来自不同的受试者，诸如HLA匹配的供体。在某些方面，树突细胞来自具有限定的HLA分型的树突细胞库。在优选的方面，根据实施方案使用的致敏树突细胞同源地加载如本文和美国专利8,728,806中详述的抗原。

用于从各种来源(包括血液和骨髓)分离富集树突细胞前体和未成熟树突细胞的细胞群体的方法是本领域已知的。例如，树突细胞前体和未成熟树突细胞可以通过以下方式来分离：采集肝素化血液、单采血液成分术或白细胞去除术、制备血沉棕黄层、玫瑰花结法(rosetting)、离心、密度梯度离心(例如，使用Ficoll(诸如FICOLL-

)、

(涂覆不可渗析的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的胶态二氧化硅颗粒(15-30mm直径))、蔗糖等)、细胞的差异裂解、过滤等。在某些实施方案中，可以通过例如像从受试者采集血液、脱纤维(defribrinating)以去除血小板和裂解红细胞来制备白细胞群体。树突细胞前体和未成熟树突细胞可以任选地例如通过

梯度离心来富集单核树突细胞前体。在其他方面，树突细胞前体可以使用G-CSF动员的外周血的CD14选择来选择。

树突细胞前体和未成熟树突细胞任选地可以在封闭的无菌系统中来制备。如本文所用，术语“封闭的无菌系统”或“封闭系统”是指最小化或消除对于非灭菌、环境或循环空气或其他非灭菌条件的暴露的系统。用于分离树突细胞前体和未成熟树突细胞的封闭系统通常排除在顶部开口管中的密度梯度离心、细胞的开放空气转移、在组织培养板或未密封的烧瓶中培养细胞等。在典型的实施方案中，封闭系统允许树突细胞前体和未成熟树突细胞从初始采集容器无菌转移到可密封的组织培养容器中而不暴露于非灭菌空气。

在某些实施方案中，单核树突细胞前体通过附着到单核细胞结合基底来分离。例如，白细胞群体(例如，通过白细胞去除术分离)可以与单核树突细胞前体附着基底接触。当白细胞群体与基底接触时，白细胞群体中的单核树突细胞前体优先附着到基底。其他白细胞(包括其他潜在树突细胞前体)表现出降低的与基底的结合亲和力，从而允许单核树突细胞前体优先富集在基底的表面上。

合适的基底包括例如具有较大的表面积与体积比的那些。此类基底可以是例如颗粒或纤维基底。合适的颗粒基底包括例如玻璃颗粒、塑料颗粒、玻璃涂覆的塑料颗粒、玻璃涂覆的聚苯乙烯颗粒和适于蛋白质吸收的其他珠粒。合适的纤维基底包括微毛细管和微绒毛膜。颗粒或纤维基底通常允许洗脱附着的单核树突细胞前体而不明显降低附着细胞的活力。颗粒或纤维基底可以是基本上无孔的，以有利于单核树突细胞前体或树突细胞从基底洗脱。“基本上无孔的”基底是其中基底中存在的至少大部分孔小于细胞以使将细胞捕获在基底中最小化的基底。

单核树突细胞前体附着到基底可以任选地通过添加结合介质来增强。合适的结合介质包括单核树突细胞前体培养基(例如，

RPMI 1640、DMEM、X-VIVO

等)，其个别地或以任何组合补充有例如细胞因子(例如，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)或白细胞介素13(IL-13))、血浆、血清(例如人血清，诸如自体或同种异体血清)、纯化的蛋白质诸如血清白蛋白、二价阳离子(例如钙和/或镁离子)和其他有助于单核树突细胞前体对基底的特异性附着或防止非单核树突细胞前体附着到基底的分子。在某些实施方案中，血浆或血清可以加热灭活。加热灭活的血浆对于白细胞可以是自体的或异种的。

在单核树突细胞前体附着到基底之后，将未附着的白细胞与单核树突细胞前体/基底复合物分离。可以使用任何合适的手段来分离未附着的细胞与复合物。例如，可以允许未附着的白细胞和复合物的混合物沉降，并且滗析或排出未附着的白细胞和培养基。替代地，可以离心混合物，并且从沉淀的复合物滗析或排出含有未附着的白细胞的上清液。

可以离体培养分离的树突细胞前体以用于分化、成熟化和/或扩展。(如本文所用，分离的未成熟树突细胞、树突细胞前体、T细胞和其他细胞是指通过人工操作远离其天然环境存在并且因此不是天然产物的细胞。分离的细胞可以呈纯化形式、半纯化形式或在非天然环境中存在。)简而言之，离体分化通常涉及在一种或多种分化剂的存在下培养树突细胞前体或具有树突细胞前体的细胞群体。合适的分化剂可以是例如细胞生长因子(例如细胞因子诸如(GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素13(IL-13)和/或其组合)。在某些实施方案中，单核树突细胞前体进行分化以形成单核细胞来源的未成熟树突细胞。

可以在合适的培养条件中培养并分化树突细胞前体。合适的组织培养基包括

RPMI 1640、DMEM、X-VIVO

等。组织培养基可以补充有血清、氨基酸、维生素、细胞因子诸如GM-CSF和/或IL-4、二价阳离子等，以促进细胞分化。在某些实施方案中，可以在无血清培养基中培养树突细胞前体。此类培养条件可以任选地不包括任何动物来源的产物。典型的树突细胞培养基中的典型细胞因子组合是约500个单位/ml的GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(10ng/ml)中的每个。当分化以形成未成熟树突细胞时，树突细胞前体与皮肤朗格汉斯细胞(Langerhans cell)在表型上相似。未成熟树突细胞通常是CD14-和CD11c+，表达低水平的CD86和CD83，并且能够通过专门的胞吞作用捕获可溶性抗原。未成熟DC表达非常高水平的CD86。另外，就CD14和CD11C而言，群体是混合的。虽然大多数是CD11c+，但是存在为CD11c-和CD14+的不同亚群。

未成熟树突细胞成熟化而形成成熟树突细胞。成熟DC丧失摄取抗原并展示共刺激细胞表面分子和各种细胞因子的上调表达的能力。具体地，成熟DC比未成熟树突细胞表达更高水平的MHC I类和II类抗原，并且成熟树突细胞通常被鉴定为CD80+、CD83+、CD86+和CD14-。更高的MHC表达导致DC表面上抗原密度增加，同时共刺激分子CD80和CD86的上调通过共刺激分子的对应物(诸如T细胞上的CD28)增强T细胞活化信号。

本发明的成熟树突细胞可以通过使未成熟树突细胞与有效量或浓度的核酸组合物和肿瘤抗原组合物接触来制备(即成熟化)。有效量的核酸组合物的范围通常是每培养皿或每个细胞至多、至少或约0.01、0.1、1、5、10至10、15、20、50、100ng或mg的核酸，包括之间的所有值和范围。有效量的肿瘤抗原组合物的范围通常是每培养皿或每个细胞至多、至少或约0.01、0.1、1、5、10至10、15、20、50、100ng或mg的蛋白质。在某些方面，可以使用0.001ng肿瘤抗原/细胞至1μg肿瘤抗原/百万个细胞)。肿瘤抗原组合物可以任选地在与树突细胞接触之前进行热灭活或处理(例如，暴露于蛋白酶)。用核酸组合物和肿瘤抗原组合物使未成熟树突细胞成熟化使成熟树突细胞对于1型(Th-1)应答敏感。

未成熟DC通常与有效量的核酸组合物和肿瘤抗原组合物接触至多、至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24分钟、小时或天。可以在合适的成熟化培养条件中对未成熟树突细胞进行培养和成熟化。合适的组织培养基包括

RPMI 1640、DMEM、X-VIVO

等。组织培养基可以补充有氨基酸、维生素、细胞因子诸如GM-CSF和/或IL-4、二价阳离子等，以促进细胞成熟化。

可以通过本领域已知的方法来监测树突细胞的成熟化。可以在本领域熟悉的测定中检测细胞表面标记物，诸如流式细胞术、免疫组织化学等。还可以监测细胞的细胞因子产生(例如，通过ELISA、FACS或其他免疫测定)。可以将用抗原致敏或未致敏的树突细胞前体、未成熟树突细胞和成熟树突细胞冷冻保存以在随后使用。冷冻保存的方法是本领域熟知的。例如，美国专利号5,788,963，其以引用的方式整体并入本文。

核酸或核酸致敏的树突细胞是用RNA(例如，来源于肿瘤或肿瘤细胞的RNA)温育或转染的树突细胞。这种RNA可以使用常规核酸转染方法进行转染，诸如脂质介导的转染、电穿孔和磷酸钙转染。例如，可以通过在37℃下将DC与RNA(或提取物)一起温育1至24小时(例如，2小时)来将RNA引入DC中。

本公开的核酸加载的抗原呈递细胞可以用于体内或离体刺激CTL增殖。核酸加载的树突细胞刺激CTL应答的能力可以通过测定效应细胞裂解靶细胞的能力来测量。例如，可以使用常用的铕释放测定。通常，在4℃下将5-10×106个靶细胞用二亚乙基三胺五乙酸铕标记20分钟。在若干次洗涤之后，将在50:1至6.25:1范围内的效应子:靶比率下的104个铕标记的靶细胞和系列稀释的效应细胞在96孔板中在具有10％热灭活的胎牛血清的200μlRPMI 1640中温育。将板在500×g下离心3分钟，并在37℃下在5％CO2中温育4小时。采集50μl等分试样的上清液，并且通过时间分辨荧光测量铕释放(Volgmann等人，J.Immunol.Methods 119:45-51,1989)。

A.遗传修饰的树突细胞

实施方案的某些方面涉及已经遗传修饰的树突细胞。在一些方面，遗传修饰包括在细胞中引入外源性转基因，诸如抑制性核酸。在其他方面，转基因可以是在诱导型启动子的控制下的自杀基因，诸如编码胸苷激酶的基因。因此，在一些方面，在刺激免疫应答之后，可以通过诱导控制自杀基因的表达的启动子来杀伤所施用的树突细胞。

在其他方面，遗传修饰包括细胞群体中的基因组缺失或插入。例如，可以破坏一个或多个HLA基因以使树突细胞成为待治疗的受试者的有效HLA匹配。

实施方案的其他方面涉及已经遗传修饰以便减少CTLA-4的表达的树突细胞。在一些方面，遗传修饰包括引入对CTLA-4具有特异性的外源性抑制性核酸。在某些方面，抑制性核酸是RNA，诸如在树突细胞中由DNA载体表达的RNA。在其他方面，抑制性核酸可以是引入树突细胞中的siRNA、dsRNA、miRNA或shRNA。以上提供了此类RNA的详细公开内容。

在其他方面，遗传修饰包括细胞群体中的减少CTLA-4的基因组缺失或插入。在其他方面，树突细胞包含CTLA-4基因内的半合子或纯合子缺失。例如，在一些方面，树突细胞的CTLA-4基因的一个或两个拷贝可以完全或部分缺失，使得CTLA-4多肽的表达被抑制。在一些方面，使得细胞不表达一种或多种CTLA-4基因的对细胞的修饰可以包括将特异性靶向CTLA-4基因座的人工核酸酶引入细胞中。在各个方面，人工核酸酶可以是锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas9。在各个方面，将人工核酸酶引入细胞中可以包括将编码人工核酸酶的mRNA引入细胞中。

V.组合疗法

为了增加包括用通过实施方案生成的核酸转化的树突细胞的树突细胞疗法的有效性，可能希望将这些组合物与有效治疗目标疾病的其他剂组合。

作为非限制性实例，癌症治疗可以使用本发明的实施方案的致敏树突细胞组合物以及其他抗癌剂实施。“抗癌”剂能够例如通过以下方式来负面地影响受试者的癌症：杀伤癌细胞、诱导癌细胞的细胞凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发病率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少向肿瘤或癌细胞的供血、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症进展或延长患有癌症的受试者的寿命。更通常，这些其他组合物以有效地杀伤或抑制细胞增殖的组合量提供。此方法可以涉及使细胞与抗癌肽或纳米颗粒复合物和剂或多种因子同时接触。这可以通过以下实现：使细胞与包含两种剂的单一组合物或药理学制剂接触，或使细胞与两种不同组合物或制剂同时接触，其中一种组合物包含树突细胞组合物并且另一种组合物包含第二剂。

用树突细胞组合物进行的治疗可以在另一种剂治疗之前或之后进行，间隔范围是数分钟至数周。在其中将另一种剂和树突细胞组合物单独地向受试者施加的实施方案中，通常确保在每一次递送的时间之间不会断开相当长的时间段，使得所述剂和树突细胞组合物仍然能够对细胞产生有利的组合效果。在此类情况下，设想可以在彼此的约12-24小时内并且更优选地在彼此的约6-12小时内使细胞与两种形式接触。在一些情况下，可能希望显著延长治疗时间段，其中各次施用之间经过数天(例如2、3、4、5、6或7天)至数周(例如1、2、3、4、5、6、7或8周)。

可以采用各种组合，其中树突细胞疗法是“A”，并且第二剂，诸如放疗、化疗或抗炎剂是“B”：

在某些实施方案中，将载体的毒性(如果有的话)考虑在内，向患者施用本发明的实施方案的树突细胞疗法将遵循施用化疗剂的一般方案。预期治疗循环将根据需要重复。还设想各种标准疗法以及手术干预可以与所述的过度增殖性细胞疗法组合施加。

A.化疗

癌症疗法还包括各种组合疗法。在一些方面，实施方案的树突细胞组合物结合化疗剂施用(或配制)。例如，在一些方面，化疗剂是蛋白质激酶抑制剂，诸如EGFR、VEGFR、AKT、Erb1、Erb2、ErbB、Syk、Bcr-Abl、JAK、Src、GSK-3、PI3K、Ras、Raf、MAPK、MAPKK、mTOR、c-Kit、eph受体或BRAF抑制剂。蛋白质激酶抑制剂的非限制性实例包括阿法替尼(Afatinib)、阿西替尼(Axitinib)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、博苏替尼(Bosutinib)、西妥昔单抗(Cetuximab)、克唑替尼(Crizotinib)、达沙替尼(Dasatinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、福坦替尼(Fostamatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、伊马替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、木利替尼(Mubritinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕唑帕尼(Pazopanib)、培加他尼(Pegaptanib)、兰尼单抗(Ranibizumab)、鲁索替尼(Ruxolitinib)、塞卡替尼(Saracatinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、凡德他尼(Vandetanib)、AP23451、维罗非尼(Vemurafenib)、MK-2206、GSK690693、A-443654、VQD-002、米替福新(Miltefosine)、哌立福新(Perifosine)、CAL101、PX-866、LY294002、雷帕霉素(rapamycin)、坦罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、利罗莫司(ridaforolimus)、阿沃西地(Alvocidib)、染料木素(Genistein)、司美替尼(Selumetinib)、AZD-6244、瓦他拉尼(Vatalanib)、P1446A-05、AG-024322、ZD1839、P276-00、GW572016或其混合物。

又一组合化疗包括例如烷基化剂，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；凯利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；潘卡他汀(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐(bisphosphonate)，诸如氯屈膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authrarnycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基多柔比星、氰基吗啉基多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍曲布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；洛尼代宁(lonidamine)；类美登素，诸如美登素和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇和多西他塞(docetaxel)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)、卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨(gemcitabien)、长春瑞滨(navelbine)、法尼基蛋白质转移酶抑制剂(farnesyl-protein tansferase inhibitor)、反铂，以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，本文提供的组合物可以与吉非替尼组合使用。在其他实施方案中，本发明的实施方案可以与格列卫(Gleevac)组合实践(例如，可以向患者施用约400至约800mg/天格列卫)。在某些实施方案中，一种或多种化疗剂可以与本文提供的组合物组合使用。

B.放疗

引起DNA损伤并且已被广泛使用的其他因素包括通常所知的γ-射线、X-射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的直接递送。还设想其他形式的DNA损伤因素，诸如微波和UV-辐射。最可能的是所有这些因素都对DNA、对DNA的前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的组装和维持造成广泛的损伤。X-射线的剂量范围为持续长时间段(3至4周)的50至200伦琴的日剂量至2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化宽广，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射强度和类型以及被赘生性细胞的摄取。

术语“接触的”和“暴露的”，当用于细胞时，在本文中用于描述籍以将治疗性组合物和化疗剂或放疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置放置的过程。为了实现细胞杀伤或停滞，将两种剂以有效地杀伤细胞或阻止其分裂的组合量递送至细胞。

C.基因疗法

在又一个实施方案中，第二治疗是基因疗法，其中治疗性多核苷酸在治疗性组合物之前、之后或与其同时施用。表达基因产物的病毒载体是本领域熟知的，并且包括真核表达系统诸如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒包括痘苗病毒以及乳头瘤病毒包括SV40。替代地，表达构建体的施用可以使用基于脂质的载体诸如脂质体或DOTAP:胆固醇囊泡来实现。所有这些方法是本领域熟知的(参见例如Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1998；Ausubel，1996)。

D.手术

大约60％的患有癌症的人将经历某种类型的手术，所述手术包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和缓解性手术。治愈性手术是可以与其他疗法结合使用的癌症治疗，所述其他疗法诸如本文提供的治疗、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代性疗法。

治愈性手术包括物理地去除、切除和/或破坏癌组织的全部或一部分的切除术。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理去除。除了肿瘤切除外，利用手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和用显微镜控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。还设想，本发明的实施方案可以结合表面癌、初癌或偶发量的正常组织的去除结合使用。在一些方面，在肿瘤切除之后，向排出先前位点肿瘤的淋巴组织施用实施方案的树突细胞组合物。

VI.试剂盒

本文的技术包括用于由样品中的mRNA生成cDNA以及所述cDNA的体外转录的试剂盒。“试剂盒”是指物理元件的组合。例如，试剂盒可以包括例如一种或多种组分，包括但不限于特定引物、酶、反应缓冲液、说明书和其他可用于实践本文所述的技术的元件。这些物理元件可以任何适于实施本发明的方式布置。

试剂盒还可以包括DNA聚合酶，包括例如Φ29聚合酶、Bst聚合酶、Taq聚合酶、Vent聚合酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、9°Nm聚合酶、T4聚合酶、T7DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、

聚合酶(New England Biolabs)或RNA聚合酶，以及逆转录酶。缺乏3′-5′外切核酸酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶的突变体形式或其混合物。

试剂盒还可以包括用于体外转录的RNA聚合酶，包括例如大肠杆菌RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、T7RNA聚合酶或其突变体。

试剂盒的组分可以包装在含水介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他可以放置且优选地适当地等份分装(例如，等份分装到微滴定板的孔中)组分的容器装置。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还容纳可以单独放置额外组分的第二、第三或其他额外的容器。然而，组分的各种组合可以包括在单一小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳核酸的装置以及用于商业销售的密闭封闭的任何其他试剂容器。此类容器可以包括所需小瓶保持在其中的注塑或吹塑的塑料容器。

试剂盒还包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包括的任何其他试剂的说明书。说明书可以包括可以实现的变化。设想此类试剂是本发明的试剂盒的实施方案。然而，此类试剂盒不限于以上鉴定的特定物品，并且可以包括用于基因甲基化的操纵或表征的任何试剂。

试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶或其他可以放置且优选地适当地等份分装组分的容器装置。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还容纳可以单独放置额外组分的额外容器。然而，组分的各种组合可以包括在一个容器中。本发明的试剂盒通常还包括用于密闭封闭地包装组分容器用于商业销售的装置。这种包装可以包括所需组分容器保持在其中的注塑或吹塑的塑料容器。

IV.实施例

包括以下实施例以示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术代表了由本发明人发现在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1-材料和方法

新鲜组织处理-在手术去除肿瘤之后，对肿瘤组织进行称重并切成小片(约20mg/片或更小)。将所有片置于具有1mL RNA稳定溶液(RNALATER^TM,Invitrogen)的1.5mL冷冻小瓶中。然后将含有RNALATER^TM和切除肿瘤的冷冻小瓶在4℃下放置过夜以阻止RNA酶活性。在4℃下过夜温育之后，将含有在RNALATER^TM溶液中的组织的冷冻小瓶在4℃下在10,000RPM下离心1min。在离心之后，通过移液去除上清液，并且对切除的组织片进行称重。10％的组织用于随后的总RNA制备，而剩下90％用于随后的抗原裂解液制备。

抗原裂解液的制备-将切除的肿瘤组织添加到15mL锥形管中并在灭菌PBS中稀释至100mg/mL。然后使用手持式组织均化器制备在PBS中的组织的均质悬浮液。然后将含有均质悬浮液的管浸没在液氮或干冰/乙醇浴中以冷冻悬浮液。在冷冻之后，然后将细胞悬浮液在55℃水浴中温育，直至其完全解冻。再重复两次冻融循环。在最终解冻之后，为了确保灭菌性和完全细胞死亡，通过铯辐射仪用>2500Gy辐射对细胞悬浮液进行γ辐射。然后将裂解液储存在-20℃下，直至进一步使用。

抗原mRNA的制备-使用

小试剂盒(Qiagen目录号74104)或

(Roche)方法从用RNALATER^TM试剂稳定的组织中分离总RNA，所述小试剂盒利用旋转柱，所述方法利用硫氰酸胍和苯酚混合物，各自根据制造商的说明书。

RNeasy总RNA制备-将600μL缓冲液RLT添加到30mg组织中，并且使用手持式组织均化器对所得混合物进行均化。将600μL 70％乙醇添加到裂解液中，并且通过移液混合。将700μL样品转移到RNeasy旋转柱中，并且置于2mL采集管中。将样品在8,000×g下离心1min。在离心之后，弃去流出液(flow-through)。将剩余的裂解液添加到旋转柱中，并再次离心。在离心之后，弃去流出液。将350μL缓冲液RW1添加到柱中并离心。通过将10μL DNA酶I储备溶液添加到70μL缓冲液RDD中接着轻轻混合来制备DNA酶I溶液。然后将80μL DNA酶I溶液添加到柱中并在室温下温育15min。在DNA酶I温育之后，将350μL缓冲液RW1添加到柱中，并且将柱在8000×g下离心1min。在离心之后，弃去流出液。然后通过添加另外700μL缓冲液RW1并在8000×g下再离心1min，接着用缓冲液RPE进行两次500μl洗涤并在8000×g下两次离心来洗涤膜。然后通过离心2min将膜干燥。通过将50μl预温热的不含核酸酶的水直接添加到柱中的膜，温育1分钟并在8000×g下离心1分钟来将RNA洗脱到新柱中。为了浓缩RNA，使用洗脱液进行第二次洗脱。然后对总RNA进行定量。将总RNA储存在-80℃下以长期储存。

硫氰酸胍/苯酚/氯仿RNA分离-对每50mg肿瘤组织添加1mL硫氰酸胍和苯酚试剂(来自Roche的TRIpure^TM试剂，目录号11 667 157 001)，并且使用手持式组织均化器对所得混合物进行均化。然后将均化的混合物在4℃下在13,000RPM下离心5min以使均化物透明。将来自均化物的上清液转移到新的不含RNA酶的管中。为了使上清液透明，添加400uL氯仿，并且通过倒置使混合物完全混合。然后将上清液/氯仿混合物在室温下温育5-10min。然后将混合物在4℃下在4500RPM下离心45min或在12,000×g下离心15min，以便使其透明。在离心之后，所得混合物存在于3个相中：有机相、界面和含水相。通过移液采集含水相，并直接转移到预冷却管中。每1mL起始硫氰酸胍和苯酚试剂添加0.5mL异丙醇。将异丙醇/上清液混合物轻轻混合并在室温下温育10min。在温育之后，通过在4℃下在4500RPM下离心45min或在12000×G下离心15min来使RNA沉淀。将沉淀的RNA用1mL 70％乙醇洗涤并再次离心。通过移液去除上清液，并且将沉淀在冰上风干5-10分钟。然后将沉淀溶解在100uL不含RNA酶的水中，并在55℃下温育5min。然后测量总RNA的浓度。将总RNA储存在-80℃下以长期储存。在进行第一链合成之前，通过以下对使用硫氰酸胍方法分离的总RNA进行DNA酶处理：将1uL扩增级DNA酶(Invitrogen目录号18068-015)添加到在10X缓冲液中稀释至1X的4ug总RNA中。使DNA酶反应进行15分钟，并且通过添加1uL EDTA来停止。

cDNA合成-对于每个样品和对照，在灭菌的0.2mL PCR管中制备以下RNA/引物退火混合物：4uL的SEQ ID NO:1的10uM溶液(VKWD寡聚物)，4uL的SEQ ID NO:2的10uM溶液(CDS64T+寡聚物)，4ug的样品RNA以及水，达到19uL的总反应体积。将溶液混合，并在微量离心机中短暂旋转以将溶液浓缩到管的底部。然后将溶液在72℃下在预加热的热循环仪中温育2min，然后冷却至4℃。然后将样品储存在冰上，同时制备第一链合成主混合物。

针对每个反应加一个无模板对照制备第一链合成主混合物，并且由

第一链合成试剂盒(Invitrogen目录号11904-018)中的试剂制备。对于每个样品，主混合物含有：4uL 10X第一链缓冲液，4uL DTT(100mM)，1uL RNA酶抑制剂(RNase Out^TM)，4uL MgCl₂(25mM)，4uL dNTP混合物(10mM，dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的每一个)和4uL

II逆转录酶，每个样品21uL总体积。

将21uL第一链合成主混合物添加到含有19ul RNA/引物退火混合物的每个管中。将包含NTC的每个反应在42℃下温育1小时，以合成cDNA的第一链。然后通过在微量离心机中短暂离心来采集第一链合成反应，并在第二链cDNA合成之前在冰上冷却。

通过以下制备第二链合成主混合物：添加100uL具有MgCl2的FastStart^TM高保真度反应缓冲液，40uL 10μmol/L CDS 64T+寡聚物(SEQ ID NO:2)，20uL 20μmol/LPowerswitch T7引物(SEQ ID NO:3)，20uL dNTP混合物(各自10mM，dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，20uL FastStart高保真度酶和780uL水，每个样品总计980uL。将20uL第一链合成反应添加到第二链合成主混合物中。然后将所得混合物分成100uL的10个相等体积，各自在0.2mL PCR管中。然后使用以下程序将这些反应中的每一个经受热循环：

1x 95℃，持续5min

11x 95℃，持续30s

65℃，持续30s

67℃，持续6min

9x 95℃，持续35s

65℃，持续35s

67℃，持续6分钟5秒

对于每个额外循环，67℃延伸增加额外5秒，例如循环1＝6:05，循环2＝6:10，循环3＝6:15等。

1x 67℃，持续7min

保持 4℃

然后使用盐-乙醇沉淀法对双链cDNA进行纯化。将乙酸钠(3M)以1:10的体积:体积比添加到样品中，接着以2:1的体积:体积比添加冷却的100％乙醇。将样品轻轻混合，然后在-20℃下温育1小时。然后将混合物在13,000RPM下离心20min以使DNA沉淀。将上清液从沉淀的DNA小心地用移液管移除。然后通过添加100uL冷却的70％乙醇来洗涤所得沉淀，并重悬浮。然后将溶液在13,000RPM下离心10min，并用移液管移除上清液。然后将沉淀风干10分钟，之后溶解在20uL不含核酸酶的水中。通过nanodrop测量cDNA的浓度。

体外转录-使用AMPLISCRIBE^TMT7-FLASH^TM体外扩增试剂盒(LUCIGEN^TM目录号ASF3257)进行体外转录。通过按以下顺序添加以下物质来制备20uL反应体积：X uL不含RNA酶的水(X是达到20uL反应体积所需的水的量)；1ug cDNA模板；2uL AMPLISCRIBE^TM T7-FLASH^TM 10X反应缓冲液；1.8uL 100mM ATP、CTP、GTP和UTP中的每一个；2uL DTT；0.5uLRIBOGUARD^TM RNA酶抑制剂；以及2uL AMPLISCRIBE^TM T7-FLASH^TM酶溶液。然后将反应在42℃下在热循环仪中温育1小时。在温育之后，添加1uL不含RNA酶的DNA酶I，并将反应在37℃下温育15min。通过添加29uL不含RNA酶的水来使DNA酶处理的体外转录反应达到50uL。然后通过盐和乙醇沉淀和纯化来使体外转录反应纯化。将50uL 5M乙酸铵和100uL冰冷的100％乙醇添加到体外转录反应中，并混合。然后将所得混合物在-20℃下温育1小时。在温育之后，将混合物在4℃下在10,000×g下离心15min。通过移液将上清液从沉淀移除。然后将沉淀用100uL冷70％乙醇洗涤，并在4℃下在10,000×g下再次离心15min。通过移液来移除上清液，并风干沉淀，之后重悬浮在50uL不含RNA酶的水中。

对未加帽的体外转录生成的RNA进行加帽-根据制造商的说明书，使用SCRIPTCAP^TMm7G加帽系统和SCRIPTCAP^TM2'-O-甲基转移酶试剂盒(CELLSCRIPT^TM目录号C-SCCE0625和C-SCMT0625)进行通过体外转录生成的RNA生成的RNA的加帽。简而言之，将50-60ug体外转录的未加帽的RNA添加到不含RNA酶的水中，达到67uL的总体积。然后将稀释的RNA在65℃下温育10min以变性，随后在冰上储存。通过每个样品添加10uL 10X SCRIPTCAP^TM加帽缓冲液、10uL 10mM GTP、2.5uL 20mM S-腺苷甲硫氨酸、2.5uL SCRIPTGUARD^TM RNA抑制剂和4uLSCRIPTCAP^TM 2′-O-甲基转移酶来制备加帽主混合物。通过将4uL SCRIPTCAP^TM加帽酶添加到29uL加帽主混合物中，并且将此混合物添加到热变性的RNA中来组装加帽反应。使加帽反应在37℃下进行30min。通过如上所述的盐和乙醇沉淀和纯化来使加帽的RNA纯化，并且重悬浮在50uL不含RNA酶的水中。为了评估加帽的mRNA的质量，在50mL 1％琼脂糖非变性凝胶上运行1ug加帽的mRNA。将加帽的mRNA储存在-80℃下。

抗原裂解液制备-为了生成MHC II类决定簇，将1mL PBS/100mg组织添加到分离的组织级分中，并且使用

PT1200E组织均化器(Kinematica,Inc.,Bohemia,New York)破坏组织。然后将均化的组织级分经受三个重复冻融循环，使均化的混合物在液氮与55℃水浴之间循环，并且在-20℃下储存。

如上所述制备、加载人(Decker等人,2006；Decker等人，2009)和野生型小鼠(Konduri等人，2013)树突细胞并使其成熟化。如先前所述进行体外共同培养(Decker等人，2006；Decker等人，2009；Konduri等人，2013)。

通过与加载加帽的mRNA的树突细胞共同培养的T细胞进行的IFNγ产生。将共同培养的总PBMC用10μg/ml布雷非德菌素A(brefeldin A，eBioscience)处理5小时。将细胞用抗CD3、抗CD8和抗CD25抗体对表面标记物进行染色，然后根据制造商的说明书使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)针对IFN-γ的细胞内染色进行固定/透化。

同源抗原加载导致增强的AIMp1产生和CTLA-4保留。通过蛋白质印迹法证明增强的AIMp1产生。通过细胞培养上清液的CTLA-4蛋白质印迹法(以确定释放)和细胞内流式细胞术以确定保留的CTLA-4含量来证明增强的CTLA-4保留。在CD11c+CD80+CD83+CD86+细胞群体上对细胞内CTLA-4的直方图分析进行门控。

蛋白质印迹分析全细胞裂解液的制备：每10-15分钟通过涡旋在冰上在含有蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物2和磷酸酶抑制剂混合物3(全部购自Sigma-Aldrich)的1％NP-40裂解缓冲液中对细胞进行裂解。将细胞裂解液在14,000×g下离心15分钟，并且用含有5％β-巯基乙醇(Bio-Rad)的laemmli缓冲液(Bio-Rad)对透明化的裂解液进行变性10分钟。将变性的全细胞裂解液样品储存在-20℃下以用于进一步分析。电泳和印迹：通过SDS-凝胶电泳(Invitrogen)来分离蛋白质样品，随后转移到0.45μm硝化纤维素膜(Bio-Rad)以用于抗体探测。在1×TBST缓冲液(0.05％Tween-20)中的5％BSA(RPI,Grainger)中实施所有的封端和抗体染色步骤。使用

West Femto最大灵敏度底物(ThermoFisher Scientific)，使用由ImageLab软件2.0.1版(Bio-Rad)支持的

XRS数字成像系统来检测蛋白质印迹化学发光信号。使用Image Lab软件进行密度测定。

实施例2-结果

从新鲜组织分离RNA产生高质量RNA-为了确定新鲜或冷冻的组织是否产生更高质量的RNA以用于下游加工，从30mg 3种不同冷冻的肿瘤组织或单一新鲜肿瘤分离总RNA。如可以在图1中所见，从三种冷冻组织分离的RNA表现出显著的降解，在泳道中可见大的拖尾(smear)。泳道4具有两个清楚界定的带，从而指示RNA的完整度较高。

商业RNA分离方法的比较-使用

小试剂盒(Qiagen)或使用

RNA分离试剂(Roche，其为基于硫氰酸胍/苯酚/氯仿的方法)从30mg肿瘤组织分离总RNA。如图2中可见，两种方法均产生高质量RNA，但是

方法由相同的输入量产生为

试剂盒4.4倍的RNA。

由从肿瘤细胞分离的mRNA体外转录的RNA–图3描绘了用于根据本发明的方法(参见实施例1)从肿瘤细胞分离的mRNA的逆转录以及随后cDNA的体外转录的方法的示意图，包括引物。比较两种不同的逆转录和体外转录方法(图4)。泳道1和2描绘了如通过

法(

等人，2013)制备的未加帽的RNA和加帽的NRA。泳道3和4示出了通过本文所述的方法制备的未加帽的RNA或RNA。先前的方法示出了非常小的转录物的富集，而本文所述的方法产生较大分子量的RNA拖尾。

通过共转录加帽进行的小转录物的富集。为了确保所有转录物的准确表示，针对体外转录的mRNA的加帽测试两种方法。图5描绘了通过每种方法生成的加帽的RNA的琼脂糖凝胶。泳道1示出了转录后加帽的NRA，而泳道2示出了共转录加帽的RNA。清楚的是，泳道2中的转录物拖尾明显得多，其中RNA通过本发明的方法产生并且共转录加帽。表1和2示出了通过

法(

等人，2013)生成的产物的浓度、体积和产量。Konduri/Decker杂交体制备是根据本发明的方法进行的。

表1.由

分离的总RNA制备的体外转录的RNA。

表2.由TRIPURE^TM分离的总RNA制备的体外转录的RNA。

IFNγ产生通过与加载的DC共同培养而增强–将树突细胞同源地加载抗原裂解液和通过本文所述的方法制备的mRNA，或异源地加载前列腺mRNA和胰腺肿瘤裂解液(错配)。图6示出了通过与指定的树突细胞共同培养的T细胞产生的相对IFNγ水平。加载加帽的RNA和抗原裂解液的树突细胞明显刺激IFNγ产生，并且比加载未加帽的RNA的树突细胞或未成熟的或未加载的树突细胞在这方面做得更好。

与同源地加载的树突细胞共同培养增强抗原特异性CD8⁺CD25⁺T细胞–图7示出了在与同源地加载通过本文所述的方法产生的未加帽或加帽的mRNA和裂解液或加载前列腺mRNA和胰腺肿瘤裂解液(错配)的树突细胞共同培养之后，针对IFNγ水平分选的CD8⁺CD25⁺细胞的流式细胞术分析的结果。同源地加载裂解液和通过本文所述的方法产生的mRNA显著增强抗原特异性CD8⁺CD25⁺ T细胞的水平。

同源抗原加载增强AIMp1的产生和CTLA4的保留–在同源抗原加载或异源抗原加载(错配)之后针对AIMp1产生和CTLA4保留评估树突细胞。图8示出了裂解液中AIMp1和CTLA-4的蛋白质印迹，其中β-肌动蛋白作为对照提供。如可以在泳道5中所见，同源抗原加载通过本文提供的方法制备的加帽的mRNA具有增加量的AIMpl和大量的细胞内CTLA-4。为了证实此结果，对未加载、仅加载mRNA、仅加载裂解液、加载两者或加载错配抗原的树突细胞进行流式细胞术。图9示出了CTLA4保留在加载mRNA和同源抗原裂解液两者的CD11c+CD80+CD83+CD86+细胞中显著增强。为了进一步证实通过同源地加载抗原裂解液和通过本文提供的方法生成的mRNA的细胞实现的增强的CTLA4保留，通过蛋白质印迹法针对CLTA4探测树突细胞裂解液和上清液(图10)。加载抗原裂解液和通过任一方法制备的mRNA降低上清液中存在的CTLA4的量，从而指示保留增强。

同源抗原加载增加树突细胞中的IL-12转录物–通过RT-qPCR针对IL-12a和IL-12b产生评估树突细胞。如可以在图11中所见，抗原加载裂解液和通过本文提供的方法生成的mRNA(TRIpure-IVT)两者比仅加载裂解液、mRNA或异源加载更好地增加IL-12转录物，并且比加载通过先前方法制备的mRNA(柱-IVT)更好地增加IL-12转录物产生。

实施例3-用扩增的mRNA进行的额外研究

进行额外的研究，从而证明当与同源裂解液一起加载到DC中时，扩增的mRNA以与天然poly-A mRNA相同的效率在体外产生TH1免疫应答。例如，图13A中所示的结果显示，加载a)天然poly A肿瘤mRNA和同源/异源裂解液，或2)加帽的IVT扩增的mRNA和同源/异源裂解液的单核细胞来源的人DC。然后将DC与T细胞共同培养，并且通过流式分析活化的CD8+CD25+Ifng+细胞的百分比。与未加载的DC或加载未加帽的mRNA的DC共同培养的T细胞充当对照。图13B示出了结果，其中使加载poly A mRNA或IVT扩增的mRNA和同源或异源细胞裂解液的各种组合的DC成熟化48小时，并且通过流式细胞术分析细胞内CTLA4水平。单一加载和未加载的DC充当对照。细胞内CTLA-4的上调指示保留增加，并且因此指示分泌减少。UL-未加载的DC，未加帽的mRNA-加载未加帽的IVT mRNA的DC，mRNA-加载poly A mRNA的DC，裂解液-加载裂解液的DC，2x w/未加帽-加载未加帽的IVT mRNA和同源裂解液的DC，2x加帽-加载加帽的IVT mRNA和同源裂解液的DC，MM未加帽-加载未加帽的IVT mRNA和异源裂解液的DC，MM加帽-加载加帽的IVT mRNA和异源裂解液的DC。

实施方案的方法能够由非常少量的起始组织扩增足够量的用于刺激免疫应答的mRNA。下表3中呈现的结果示出可以由各种起始样品生成的RNA的量。

表3.通过实施方案的方法由肿瘤组织额外制备核酸。

***

本文公开的并且要求保护的所有方法可以根据本公开在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是，可以使本文所述的方法和本文所述方法的步骤或步骤的顺序发生变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更确切地说，显而易见的是，化学和生理学相关的某些剂可以替代本文所述的剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这样类似的替代和修改都被认为是在由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

以下参考文献以引用方式特别并入本文，在某种程度上，它们提供示例性程序或对本文所阐述的那些进行补充的其他细节。

等人,“Evaluation of RNA Amplification Methods to ImproveDC Immunotherapy Antigen Presentation and Immune Response,”Mol Ther NucleicAcids,2(5):e91,2013。

序列表

<110> 贝勒医学院(BAYLOR COLLEGE OF MEDICINE)

<120> 用于扩增mRNA的方法和组合物

<130> BACM.P0006WO

<150> US 62/599,472

<151> 2017-12-15

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 1

aagcagtggt aacaacgcag agtggccatt acggccggga aa 42

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 2

cgataaaagc tccggggata acagatttcc c 31

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 3

gaatttaata cgactcacta taggtaggaa gcagtggtaa caacgagag 49

Claims (51)

1.一种寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:1的序列。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸还被定义为引物。

3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含少于40个核苷酸。

4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由SEQ ID NO:1组成。

5.一种组合物，其包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列，并且其中所述第二引物包含SEQ ID NO:2的核酸序列。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述组合物还被定义为核酸扩增反应混合物。

7.如权利要求5或6所述的组合物，其还包含第三引物，其中所述第三引物包含SEQ IDNO:3的核酸序列。

8.如权利要求7所述的组合物，其还包含核酸。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述核酸是RNA。

10.一种由模板mRNA合成第一cDNA链的方法，其包括以下步骤：

a)使第一引物与所述模板mRNA杂交，其中所述第一引物包含SEQ ID NO:2的核酸序列；

b)用具有末端转移酶和模板转换活性的逆转录酶延伸所述第一引物，以生成具有oligo(C)突出端的部分第一cDNA链；

c)使第二引物与所述部分第一cDNA链的所述oligo(C)突出端杂交，其中所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列；以及

d)使用所述第二引物作为模板来从所述oligo(C)突出端延伸所述部分第一cDNA链，从而生成第一cDNA链。

11.如权利要求10所述的方法，其还包括：

e)分离所述模板mRNA和第一cDNA链；

f)使第三引物与所述第一cDNA链杂交；以及

g)延伸所述第三引物以生成第二cDNA链，从而生成双链cDNA。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述第三引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述模板mRNA从样品获得。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述样品是肿瘤样品。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述肿瘤样品在从受试者取出之后储存在RNA稳定溶液中。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述RNA稳定溶液是

18.如权利要求11所述的方法，其还包括由所述双链cDNA合成RNA。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述由所述双链cDNA合成RNA包括体外转录。

20.如权利要求19所述的方法，其中体外转录包括添加第四引物、第五引物和RNA聚合酶，以及用所述RNA聚合酶由所述双链cDNA合成RNA。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述第四引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述第四引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

23.如权利要求20所述的方法，其中所述方法还包括对所述RNA加帽。

24.如权利要求11所述的方法，其还包括扩增所述双链cDNA。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述第三引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

27.如权利要求24所述的方法，其中扩增所述双链cDNA包括添加DNA依赖性DNA聚合酶、第四引物和第五引物，以及通过聚合酶链反应扩增所述cDNA。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述第四引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述第五引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

30.如权利要求24所述的方法，其还包括体外转录所扩增的cDNA以生成有义链扩增的mRNA。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述第二引物包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述第三引物包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述所扩增的cDNA的体外转录包括向所述所扩增的cDNA中添加具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的序列的引物，以及使所述引物与所述所扩增的cDNA杂交。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述所扩增的cDNA的体外转录包括向所述所扩增的cDNA中添加RNA聚合酶，以及延伸所杂交的引物以生成RNA。

35.如权利要求30所述的方法，其还包括对所扩增的RNA加帽。

36.一种用于转导树突细胞群体的方法，其包括使所述树突细胞群体与编码一种或多种抗原的核酸接触，其中所述核酸包括通过如权利要求18-35中任一项所述的方法生成的RNA。

37.如权利要求36所述的方法，其还包括使所述树突细胞群体与肿瘤细胞裂解液接触。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述肿瘤细胞裂解液包含具有表位的肿瘤抗原，所述表位具有与所述编码一种或多种抗原的核酸的序列重叠最少5个氨基酸的序列。

39.一种用于在具有患病细胞群体的受试者中提供免疫应答的方法，其包括：

a)获得通过如权利要求36或37所述的方法产生的致敏树突细胞群体；以及

b)向所述受试者施用有效量的所述致敏树突细胞群体。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述抗原致敏的树突细胞已经用与癌症、自身免疫疾病或感染性疾病相关联的抗原致敏。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述抗原致敏的树突细胞已经用至少一种肿瘤抗原致敏。

42.如权利要求41所述的方法，其还包括施用免疫检查点抑制剂。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂。

44.如权利要求42所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是伊匹单抗、派姆单抗或纳武单抗。

45.一种试剂盒，其包括如权利要求1所述的寡核苷酸引物、SEQ ID NO:2的寡核苷酸引物和/或SEQ ID NO:3的寡核苷酸引物。

46.如权利要求45所述的试剂盒，其还包括从癌细胞分离的核酸。

47.如权利要求45所述的试剂盒，其还包括DNA聚合酶。

48.如权利要求45所述的试剂盒，其还包括RNA稳定溶液。

49.如权利要求48所述的试剂盒，其中所述RNA稳定溶液是

50.如权利要求45所述的试剂盒，其中所述试剂盒还被定义为cDNA合成试剂盒。

51.如权利要求50所述的试剂盒，其还包括dNTP、MgCl₂、逆转录酶和/或RNA酶抑制剂。

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