CN111996235B - 一种检测探针、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测探针、其制备方法及应用，属于生物领域；本发明方法通过使用minicircle质粒结合滚环扩增的方法扩增得到全长的探针片段，进一步通过超声打断制备得到不同长度需求的探针；本发明方法可用于生产DNA探针或者RNA探针，制备方法简单、产量大、成本低，可将制备周期缩短至1天。另外，本发明方法制备的探针长度不受限，可根据需要提供不同目标及不同长度的探针，均一性好、纯度高，大大地提高了探针的捕获性能，使得目标区域的测序均一性、深度更佳，更进一步降低实验成本。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种检测探针、其制备方法及应用。
背景技术
近十几年来，NGS(二代测序技术)的快速发展使得DNA测序成本大幅降低，然而就现阶段而言，全基因组重测序的成本依然很高，且得到的海量数据分析速度缓慢，无法大规模地应用。靶向测序技术可以将感兴趣的基因组区域富集出来测序，单个样本测序数据产出少且分析速度较快，因此更能经济高效地发挥NGS技术的优势，广泛应用到临床检测、健康筛查等众多领域。另外，靶向测序可以对目标区域进行深度测序，增加了目标区域内遗传变异的检测灵敏度和准确性。在技术原理上，靶向测序的方法主要分为两种：杂交捕获测序和多重扩增子测序。
液相捕获是重要的辅助检测手段。液相杂交捕获测序可适用于几kb到上百Mb的基因组目标区域的检测，可检测SNV，InDel，CNV，SV，基因融合等变异。目前常用的应用包括针对不同的肿瘤基因设计相应的panel、明确疾病的易感基因及致病基因、病毒检测、线粒体检测等，应用非常广泛。
用于捕获的探针即可为DNA探针，也可为RNA探针。DNA探针主要依赖于化学合成和光合成等方法。合成形式又包括单条引物形式和oligo pool形式。单条引物形式方法，虽然产量高，能做上万次反应，但是价格昂贵；oligo pool形式，一次性能合成数万条探针，但是合成的pool一般每条引物的量是0.2fmol，需要进一步进行PCR扩增来进行探针制备。但是在PCR过程中会产生偏差，并且为了减少偏差会尽可能的减少循环数，一般为20循环。因此最终得到的探针会很少，导致每个捕获反应的成本上调。而RNA探针一般是基于扩增的DNA探针的基础上，再进行体外转录，转录过程中加入biotin-NTP，从而制备出RNA探针，从PCR到体外转录的过程能将探针扩增数千倍，虽然产生的探针量大，但是面临操作过程中损失部分探针，导致实际捕获时，探针覆盖均一性的性能下降，另一方面，RNA探针不易保存，容易降解。目前液相杂交捕获的难点和痛点在于探针的合成，主要是成本昂贵、扩增偏差、覆盖均一性差等问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种制备简单，且适用性好的检测探针。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种检测探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)、片段化minicircle质粒，得到minicircle质粒片段，所述minicircle质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)、将步骤(1)中的目标基因片段与minicircle质粒片段连接，并将连接产物转化至菌中，挑取相应的含有所述质粒片段的转化菌，扩大培养并提取质粒；
(3)、使用带有纯化标签的原料，以步骤(2)得到质粒为模板进行滚环扩增；
(4)、纯化回收步骤(3)的扩增产物，进行超声。
本发明的minicircle质粒不含质粒原核元件的其余序列，因此不会影响捕获效率。滚环扩增是一种扩增效率高于PCR的高效扩增体系，扩增效率常达数千倍，通常1ng的DNA可以得到1-10μg的产物；并且扩增过程中几乎不会发生突变；避免了目前探针合成面临的累计错误率的问题，因此得到的探针的均一性非常高。
另外，目前探针的合成受技术的限制，一般合成的最长长度为150nt，合成越长，累计错误率越高。除去用于扩增探针的两端引物序列，一般有效探针长度为120nt。本发明方法制备的探针，原长度可达数十kb，进一步可通过超声打断的方法打断至任意所需长度。
作为本发明的优选实施方式，步骤(3)中所述带有纯化标签的原料为带有生物素标签的dNTP或生物素标签的NTP。
合成DNA探针的时候原料为dNTP，RNA探针的原料为NTP，含有生物素标记的核酸原料制备简单、安全、使用方便；扩增后的产物由于嵌入了带生物素标记的核酸，后续可通过链霉亲和素进行纯化。
作为本发明的优选实施方式，所述dNTP包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP，其中只有dUTP带生物素标签(biotin-dUTP)；所述NTP包括ATP、GTP、CTP、TTP、UTP，其中只有UTP带生物素纯化标签(biotin-UTP)。
更优选地，所述biotin-dUTP：dTTP的用量比为1:4～2:1；所述(biotin-dUTP+dTTP)：dATP：dGTP：dCTP的用量比为1:10:10:10；同理，所述所述biotin-UTP：TTP的用量比为1:4～2:1；所述(biotin-UTP+TTP)：ATP：GTP：CTP的用量比为1:10:10:10。
更优选地，所述biotin-dUTP：dTTP的用量比为1:2。
作为本发明的优选实施方式，若制备DNA探针，步骤(3)中所述滚环扩增使用Phi29DNA聚合酶；若制备RNA探针，步骤(3)中所述滚环扩增使用T7 RNA聚合酶。
作为本发明的优选实施方式，步骤(3)中所述滚环扩增的引物的序列为如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
该引物为minicircle中原有序列的引物，能够有效通过滚环扩增得到大量的产物。
作为本发明的优选实施方式，步骤(4)中所述超声为将扩增产物打断至100～300nt。
更优选地，步骤(4)中所述超声为将扩增产物打断至200nt。对制备的探针进行长度摸索，发现当探针长度为200nt时，捕获的敏感性及特异性达到最高。
进一步地，所述超声的参数设置为：超声30秒，停30s，共45个循环。
上述超声参数可有效将产物打断，得到长度为200nt左右的产物。
本发明还要求保护所述方法制备的检测探针。
本发明还要求保护所述检测探针在测序中的用途。
进一步地，本发明提供了一种基因组测序的方法，方法如下：
(a)、基因组DNA超声打断，加入接头，构建相应的DNA文库；
(b)、扩增步骤(a)所述的DNA文库；
(c)、使用按所述方法制备的检测探针与步骤(b)中的文库进行杂交；
(d)、通过对应纯化标签的纯化方法进行杂交产物纯化；
(e)、扩增步骤(d)中的纯化产物并上机测序。
作为本发明的优选实施方式，所述探针含有生物素标签，步骤(d)中通过链霉亲和素进行纯化。
本发明方法可用于生产DNA探针或者RNA探针，制备方法简单、产量大、成本低，可将制备周期缩短至1天。另外，本发明方法制备的探针长度不受限，可根据需要提供不同目标及不同长度的探针，均一性好，相对于现有的探针合成方法，纯度更高，大大地提高了探针的捕获性能，使得目标区域的测序均一性、深度更佳，更进一步降低实验成本。
附图说明
图1为本发明实施例1DNA探针的制备原理示意图。
图2为本发明实施例1滚环扩增产物凝胶电泳结果。
图3为本发明实施例1探针超声打断后纯化产物凝胶电泳结果。
图4为本发明实施例2RNA探针的制备原理示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明方法制备DNA探针的一种实施例(DNA探针的制备原理示意图如图1)，制备方法如下：
1、含有目标片段的Minicircle质粒制备：
(1)、使用引物1：ccatgtaccaatgttgcagt(SEQ ID NO.3)和引物2:ggatcctttgccccagtgtt(SEQ ID NO.4)，通过PCR的方法，从pBR322-HPV16(购于ATCC，商品名：human papilloma virus type 16
45113TM)中克隆得到HPV16全长片段；PCR体系如表1。KAPA HiFi Hot Start Ready Mix购于Roche公司。
表1 HPV16全长片段扩增PCR体系
| 组分 | 用量 |
| pBR322-HPV16质粒 | 1μL |
| 引物1(10μM) | 1μL |
| 引物2(10μM) | 1μL |
| KAPAHiFi Hot Start Ready Mix(2×) | 25μL |
| 水 | 22μL |
| 总体积 | 50μL |
反应程序为：
反应产物通过PCR产物纯化试剂盒(购于全式金，型号
PCRPurification Kit)进行纯化，即得到pBR322-HPV16 PCR产物。
(2)、使用引物3:CCTCggaattccgcgcccgg(SEQ ID NO.5)和引物4:cccaactggggtaacctttgagt(SEQ ID NO.6)，通过对PCR的方法，扩增得到minicircle质粒片段；体系如表2(minicircle质粒购于System Biosciences)。
表2 minicircle质粒片段PCR体系
| 组分 | 用量 |
| minicircle质粒(SEQ ID NO.1) | 1μL |
| 引物3(10μM) | 1μL |
| 引物4(10μM) | 1μL |
| KAPAHiFi Hot Start Ready Mix(2×) | 25μL |
| 水 | 22μL |
| 总体积 | 50μL |
反应程序为：
反应产物通过PCR产物纯化试剂盒(购于全式金，型号
PCRPurification Kit)进行纯化，即得到minicircle质粒PCR产物。
(3)、取100ng步骤(1)纯化后的片段与600ng步骤(2)纯化后的片段通过Gibsonassembly的方法进行连接，配制体系如下：
表3 Gibson assembly体系
| 组分 | 用量 |
| pBR322-HPV16 PCR产物 | 100ng |
| minicircle质粒PCR产物 | 600ng |
| Gibson Assembly Master Mix(2×) | 10μL |
| 水 | 补足至20μL |
50℃，孵育60min。
(4)、将步骤(3)的连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中，通过卡那霉素抗性平板，培养过夜，挑取单克隆，并进行Sanger测序验证，得到含有目标片段的转化菌；
(5)、进一步扩大培养所述转化菌，提取质粒。
2、滚环扩增和纯化
按下表配制反应体系。(相关试剂购于诺唯赞，商品号Phi29 MAX DNAPolymerase)
表4 反应体系
| 组分 | 用量 |
| Phi29缓冲液(10×) | 1μL |
| RCA primer(SEQ ID NO.2) | 2.5μL |
| 待扩增样品 | 5ng |
| 无酶水 | 补水至6.25μL |
95℃孵育3min，冰上放置5min。
在上述反应体系中加入下表成分，得到总体积为10μL的混合物。相关试剂购于赛默飞，商品号Biotin-11-dUTP Solution(1mM)，dNTP Set(100mM)。
表5 其他成分
| 组分 | 用量 |
| 10mM dATP | 0.25μL |
| 10mM dGTP | 0.25μL |
| 10mM dCTP | 0.25μL |
| 1mM dTTP | 1.667μL |
| 1mM biotin-11-dUTP | 0.883μL |
| Phi29DNA聚合酶 | 0.5μL |
30℃孵育16h，65℃灭活10min，得到扩增产物。
纯化：14,000g离心20min，取上清转移至新管，即得到原始的全长探针。
取纯化后的部分产物进行凝胶电泳，结果如图2(第一道为marker，区域泳道为RCA产物胶图)。
3、超声打断
利用Biorupter超声打断仪进行探针打断，参数设置为：开启30s，停止30s，45个循环，通过QubitTM ssDNA Assay Kit(Thermo Fisher，货号Q10212)试剂检测探针浓度，并通过凝胶电泳确定探针长度(电泳结果如图3，第一泳道为marker，第二泳道为打断后的探针，打断后的探针长度约为200nt)。
实施例2本发明探针进行液相捕获的方法
一、样品准备阶段
基因组DNA打断
1)将基因组DNA按照以上体系转移至0.6mLMaxyClear Snap lockMicrocentrifuge Tube内，充分混匀，短暂离心后置于冰上待用；
2)提前打开超声打断仪Bioruptor Pico，待冷循环仪温度降至4℃后，设置参数ON30s，OFF30s为1个循环，每10cycles为一轮，共进行3轮，每轮结束后将样品置于振荡器上充分混匀，短暂离心后进行下一轮打断(混匀越充分，打断样品片段大小越集中)；打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。
二、文库构建阶段
1、末端修复、3’端加“A”
将打断后的样品完全转移至PCR管中，按如下表格配置反应体系(此操作需在冰盒上进行，相关试剂购于艾吉泰康，商品号AI-HPV-Cap Enrichment Kit)：
表6 末端修复、3’端加“A”体系
将配好混合物置于PCR仪中，设置PCR程序如下(盖温85℃)：
4℃ 1min，
20℃ 30min，
65℃ 30min，
4℃∞。
2、接头连接
在上述step2反应的PCR管中，按如下表格配置反应体系(相关试剂购于艾吉泰康，商品号AI-HPV-Cap Enrichment Kit)。
表7 连接体系
| 组分 | 用量 |
| 步骤1的产物 | 50μL |
| Adapter(15μM) | 5μL |
| Nuclease-free water | 15μL |
| 5×Ligation Buffer | 20μL |
| Ligase | 15μL |
| 总体积 | 100μL |
20℃连接15min，4℃保存。
3、连接后纯化
1)将诺维赞纯化磁珠提前半小时拿至室温，震荡混匀备用；
2)将0.8×体积的纯化磁珠混合加入至将步骤2的PCR中，并混合均匀；
3)室温静置孵育5～15min，置于磁力架上3min使溶液澄清；移除上清，将PCR管继续放置在磁力架上，并加入200μL80％乙醇溶液，静置30s后移除上清；
4)重复步骤3)；
5)尽量去除乙醇，室温静置3～5min，使残留乙醇彻底挥发；
6)加入22μL的Nuclease-free water，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置5～10min；
7)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清；
8)用移液器吸取20μL上清液，转移到新的PCR管中，4℃保存。
4、Pre-PCR反应
参照下表配制体系(此操作需在冰盒上进行)(相关试剂购于艾吉泰康，商品号AI-HPV-Cap Enrichment Kit)。
表8 Pre-PCR体系
| 组分 | 体积 |
| 步骤3的连接产物 | 20μL |
| PCR Master Mix | 25μL |
| PCR primer mix | 5μL |
| 总体积 | 50μL |
将样品置于PCR仪上，反应程序如下(盖温105℃)：
反应结束后加入1×磁珠，参考步骤4方法进行纯化(乙醇洗涤晾干后一般用30μL无酶水进行核酸重溶)，即得样品文库。样品文库通过
3.0Fluorometer(QubitdsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度，如下游进行液相捕获，则需文库浓度>25ng/uL；并使用Qsep100进行片段长度测定，测得文库长度约在270bp-320bp间。
三、捕获实验操作流程
1、样品、探针杂交
文库准备(相关试剂购于艾吉泰康，商品号AI-HPV-Cap Enrichment Kit)
先将2×的HybBuffer(buffer A)置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃恒温混匀仪内预热，完全溶解(无沉淀及浑浊物)。加等体积的无酶水稀释至1×备用
1)按照下面所对应的体系进行配制杂交体系：(探针为根据本发明的方法制备)
表9 杂交体系
| 组分 | 用量 |
| 样品文库 | 750ng |
| human block cot-1(1μg/μL) | 5μL |
| Blocker1(200μM) | 3μL |
| Blocker2(200μM) | 1μL |
| 探针 | 500ng |
反应结束后加入2×磁珠，参考步骤4方法进行纯化，乙醇洗涤晾干后一般用12μLHybBuffer(buffer A，目前配置的为2x，需提前稀释)进行核酸重溶。将纯化后的产物置于PCR仪上，95℃孵育10min，60℃孵育16h(盖温105℃)。
2、捕获磁珠平衡(相关试剂购于赛默飞，商品号Dynabeads MyOne StreptavidinT1)
1)将T1磁珠(DynabeadsMyOne Streptavidin T1磁珠)从4℃取出，涡旋震荡重悬，室温平衡30min；
2)取50μL磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清；
3)从磁力架上取下PCR管，加入200μL Binding Buffer轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠；
4)置磁力架上1min，移除上清；
5)重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次；
6)从磁力架上取下PCR管，加入10μL1×的HybBuffer(buffer A)轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
3、捕获目标区域DNA文库(相关试剂购于艾吉泰康，商品号AI-HPV-CapEnrichment Kit)
1)保持杂交产物在PCR仪上，将前述重悬后的10μL捕获磁珠加入到杂交产物中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；
2)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液；
3)向杂交产物内加入200μL的WashBuffer1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，使溶液澄清，移除上清；
4)加入200μL的65℃预热的WashBuffer2，轻轻吸打6次混匀，置于恒温振荡混匀仪上65℃孵育10min，800转/min进行清洗；
5)短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用WashBuffer2清洗2次，共计3次。最后一次彻底移除WashBuffer2(可用10μL移液器移除残留)；
6)保持样品在磁力架上，向PCR管内加入200ul 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液(可用10μL移液器移除残留)，室温晾干；
7)向PCR管加入30μLNuclease-free water，从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
4、Post-PCR反应
1.实验前准备(相关试剂购于艾吉泰康，商品号AI-HPV-Cap Enrichment Kit)
预先从-20℃保存的试剂盒中取出PCR Master Mix和MGIAd_PCR primer mix，放置冰上溶解，溶解混匀后置于冰上待用。捕获后需要对DNA文库进行富集，根据下表配制反应体系：
表10 Post-PCR体系
将配好的体系立即置于PCR仪上，设置程序如下(盖温105℃)：
反应结束后加入55μL磁珠，参考步骤4方法进行纯化，乙醇洗涤晾干后一般用25μLNuclease-free water进行核酸重溶。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-10ng/μL，使用Qsep100进行片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间。使用华大高通量测序平台进行测序。
实施例3
本发明方法制备RNA探针的一种实施例(RNA探针的制备原理示意图如图1)，除滚环扩增和纯化部分，其余过程与实施例1相同(注意：RCT后的产物为RNA，所有实验过程中使用的耗材，包括枪头、离心管、打断管等都需要保持无RNA酶。操作过程中勤换手套，避免RNA酶污染。)。
滚环扩增和纯化：
按下表配制反应体系(相关试剂购于NEB，商品号T7 RNA聚合酶)。
表11 反应体系
| 组分 | 用量 |
| 10×T7 RNA聚合酶缓冲液 | 2μL |
| RCA primer | 2.5μL |
| 待扩增样品 | 5ng |
| 无酶水 | 补水至14.2μL |
95.C孵育3min，冰上放置5min。
在上述反应体系中加入下表成分(相关试剂购于赛默飞，商品号Biotin-11-dUTPSolution(1mM)，dNTP Set(100mM))，得到总体积为20μL的混合物。
表12 其他成分
| 组分 | 用量 |
| 10mM ATP | 0.25μL |
| 10mM GTP | 0.25μL |
| 10mM CTP | 0.25μL |
| 1mM TTP | 1.667μL |
| 1mM biotin-UTP | 0.883μL |
| T7 RNA聚合酶 | 2μL |
| RNA酶抑制剂 | 0.5μL |
30℃孵育4h，65℃灭活10min，得到扩增产物。
14,000g离心20min，取上清转移至新管，即得到原始的全长探针。
实施例3
本发明方法制备不同长度的探针杂交测试，根据实施例1的方法，通过调节超声的参数，得到不同长度的探针。根据实施例2的方法，使用不同长度的探针对同一基因组进行测序，数据分析结果如下表13。
表13 不同探针的测序结果比较
其中，组1～10为本发明方法制备探针，组11、12为商品化产品，分别为艾吉泰康HPV捕获试剂盒和联川捕获试剂盒，按照相关说明书使用。
由表13可得，本发明制备的探针能较好地捕获目标序列，测序的效果较佳，且当探针长度为200bp时效果最好。
实施例4
本发明方法制备HBV探针的测序结果。其中，HBV片段的制备方法为基因合成得到，探针制备方法参考实施例1，制备得到长度为200bp的探针。
参考实施例2的方法，使用该探针对HBV type C阳性的HepG2.2.15细胞进行检测，测序结果如下表14。
表14 不同探针检测HBV的测序结果比较
由表14可得，本发明制备的探针能较好地捕获HBV序列，捕获的均一性最好、捕获效率最高，最重要的是HBV的断点数量也是最多的。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州鼓润医疗科技有限公司
<120> 一种检测探针、其制备方法及应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4128
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccaactggg gtaacctttg agttctctca gttgggggta atcagcatca tgatgtggta 60
ccacatcatg atgctgatta taagaatgcg gccgccacac tctagtggat ctcgagttaa 120
taattcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg 180
cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat 240
cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga 300
tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg 360
tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc tcgccttgag cctggcgaac agttcggctg 420
gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc 480
gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat 540
caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa 600
ggtgtagatg acatggagat cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc 660
cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga 720
tagccgcgct gcctcgtctt gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa 780
aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt 840
ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg 900
caatccatct tgttcaatca tgcgaaacga tcctcatcct gtctcttgat cagagcttga 960
tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcga gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt 1020
cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg caattccggt tcgcttgctg tccataaaac 1080
cgcccagtct agctatcgcc atgtaagccc actgcaagct acctgctttc tctttgcgct 1140
tgcgttttcc cttgtccaga tagcccagta gctgacattc atccggggtc agcaccgttt 1200
ctgcggactg gctttctacg tgctcgaggg gggccaaacg gtctccagct tggctgtttt 1260
ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg 1320
ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac 1380
tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg 1440
aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 1500
ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa 1560
cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca 1620
tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac aaactctttt 1680
gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 1740
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 1800
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 1860
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 1920
cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 1980
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 2040
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 2100
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 2160
aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 2220
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 2280
ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 2340
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 2400
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 2460
ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 2520
gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt 2580
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct 2640
gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 2700
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 2760
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 2820
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagca gatcaattcg cgcgcgaagg cgaagcggca 2880
tgcataatgt gcctgtcaaa tggacgaagc agggattctg caaaccctat gctactccgt 2940
caagccgtca attgtctgat tcgttaccaa ttatgacaac ttgacggcta catcattcac 3000
tttttcttca caaccggcac ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac 3060
ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat 3120
ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa 3180
gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac 3240
atgctgtgcg acgctggcga ttcttctctc atccgccaaa acagccaagc tggagaccgt 3300
ttgacattac cctgttatcc ctagatacat taccctgtta tcccagatga cataccctgt 3360
tatccctaga tgacattacc ctgttatccc agatgacatt accctgttat ccctagatac 3420
attaccctgt tatcccagat gacataccct gttatcccta gatgacatta ccctgttatc 3480
ccagatgaca ttaccctgtt atccctagat acattaccct gttatcccag atgacatacc 3540
ctgttatccc tagatgacat taccctgtta tcccagatga cattaccctg ttatccctag 3600
atacattacc ctgttatccc agatgacata ccctgttatc cctagatgac attaccctgt 3660
tatcccagat gacattaccc tgttatccct agatacatta ccctgttatc ccagatgaca 3720
taccctgtta tccctagatg acattaccct gttatcccag atgacattac cctgttatcc 3780
ctagatacat taccctgtta tcccagatga cataccctgt tatccctaga tgacattacc 3840
ctgttatccc agatgacatt accctgttat ccctagatac attaccctgt tatcccagat 3900
gacataccct gttatcccta gatgacatta ccctgttatc ccagatgaca ttaccctgtt 3960
atccctagat acattaccct gttatcccag atgacatacc ctgttatccc tagatgacat 4020
taccctgtta tcccagataa actcaatgat gatgatgatg atggtcgaga ctcagcggcc 4080
gcggtgccag ggcgtgccct tgggctcccc gggcgcggaa ttccgagg 4128
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctagcataa agccaagaaa tcgaaatact ttcaagttac g 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccatgtacca atgttgcagt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggatcctttg ccccagtgtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctcggaatt ccgcgcccgg 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccaactggg gtaacctttg agt 23
Claims (10)
1.一种检测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、克隆目标基因片段，片段化minicircle质粒，得到minicircle质粒片段，所述minicircle质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述片段化的步骤包括：使用如核苷酸系列为SEQ ID NO.5~6的引物序列对minicircle质粒进行PCR扩增，扩增得到的片段为minicircle质粒片段；
（2）、将步骤（1）中的目标基因片段与minicircle质粒片段连接，并将连接产物转化至菌中，挑取相应的含有所述质粒片段的转化菌，扩大培养并提取质粒；
（3）、使用带有纯化标签的原料，以步骤（2）得到质粒为模板进行滚环扩增；
（4）、纯化回收步骤（3）的扩增产物，进行超声。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述带有纯化标签的原料为带有生物素标签的dNTP或生物素标签的NTP。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，若制备DNA探针，步骤（3）中所述滚环扩增使用Phi29DNA聚合酶；若制备RNA探针，步骤（3）中所述滚环扩增使用T7 RNA聚合酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述滚环扩增的引物的序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述超声为将扩增产物打断至100-300bp。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述超声的参数设置为：超声30秒，停30s，共45个循环。
7.如权利要求1~6任一项所述方法制备的检测探针。
8.如权利要求7所述检测探针在制备液相捕获试剂盒中的用途。
9.一种非诊断和治疗目的的液相捕获试剂盒的使用方法，其特征在于，方法如下：
（a）、基因组DNA超声打断，加入接头，构建相应的DNA文库；
（b）、扩增步骤（a）所述的DNA文库；
（c）、使用如权利要求7所述检测探针与步骤（b）中的文库进行杂交；
（d）、通过对应纯化标签的纯化方法进行杂交产物纯化；
（e）、扩增步骤（d）中的纯化产物并上机测序。
10.如权利要求9所述的非诊断和治疗目的的液相捕获试剂盒的使用方法，其特征在于，所述探针含有生物素标签，所述纯化方法为通过链霉亲和素进行纯化。
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