CN106834330B

CN106834330B - 一种pCasSA质粒及其应用

Info

Publication number: CN106834330B
Application number: CN201611255504.3A
Authority: CN
Inventors: 季泉江; 陈未中
Original assignee: ShanghaiTech University
Current assignee: ShanghaiTech University
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN106834330A

Abstract

本发明提供了一种pCasSA质粒及其应用。所述的pCasSA质粒，其序列为SEQ ID NO：1。本发明能够(1)高效并且快速地编辑各种金黄色葡萄球菌菌株的基因组，其中包括基因敲除、单碱基突变和基因插入；(2)能够对目标基因表达起到高效转录抑制作用。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。

Description

一种pCasSA质粒及其应用

技术领域

本发明涉及一种pCasSA质粒及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种极为重要的阳性人类病原细菌。它几乎能够感染人体的任何部位，既能引起较为轻微的皮肤表面感染，也能引起致命的严重感染，例如毒素休克综合症、坏死性肺炎、心内膜炎等。金黄色葡萄球菌强大的感染和致病能力主要归因于其分泌的细胞毒素以及细胞表面多种多样的多功能免疫操纵蛋白，包括聚集因子、纤粘蛋白结合蛋白、胶原蛋白结合蛋白等。这些表面蛋白通过与人体细胞直接作用，起到规避宿主免疫反应、生物膜形成、细菌定植等多方面利于感染的功能。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)等耐药性细菌的大规模流行，更加增加治疗金黄色葡萄球菌感染的难度，因此寻求新型药物靶标和开发新型小分子药物迫在眉睫。

新型药物靶标的发现离不开基因组层面功能基因的筛选以及后续基因功能的确证。金黄色葡萄球菌中用于功能基因筛选的技术主要为基于转座子插入突变的方法。这种方法虽然能够在基因组层面实现基因功能的筛选，但筛选过程往往十分繁琐，并且需要大量的人力和物力。由于转座子插入位置的随机性，这种技术不能应用于限定的基因群，比如细胞表面蛋白功能的筛选。后续基因功能的确证离不开该基因敲除突变体的构建。金黄色葡萄球菌中用于突变体菌株的构建方法主要为经典的基于双交换同源重组的方法。由于这种方法存在操作繁琐，效率较低的问题，大大限制了高效的基因功能的研究。因此迫切需要开发金黄色葡萄球菌中高效的基因组编辑技术。

CRISPR/Cas9是一种近年来开发出来的新型基因组编辑技术。它极具革新生命体中基因组修饰与突变技术的潜力。此技术最初来源于微生物先天性免疫系统，是微生物对抗噬菌体入侵的一种极为有效的方法。它主要是由一种核酸内切酶Cas9和一种介导RNAsgRNA所构成。Cas9核酸内切酶能够与sgRNA特异性结合，通过sgRNA与基因组DNA碱基互补配对靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂。结合基因重组酶(DNArecombinase)，此技术能够极为快速方便并且准确的靶向修饰与突变基因组的任何部分。伴随着大规模DNA微阵列合成技术的突破性发展，此技术能够在基因组层面或特定基因群实现大规模转录抑制和激活，大大提高了功能基因筛选的效率。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术已经在哺乳动物细胞以及一些模式生物，例如大肠杆菌、酵母等，实现了高效的基因组编辑，但还没有在金黄色葡萄球菌中实现基因组编辑。因此通过工程化和改造CRISPR/Cas9体系，使其能够适用于金黄色葡萄球菌中基因组编辑，将极大简化金黄色葡萄球菌的遗传学操作，还将提升功能性基因的筛选效率，为后续基因生物学功能研究，药物靶标发现，新型药物设计以及基因治疗打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种pCasSA质粒及其应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种pCasSA质粒，其序列为SEQ ID NO：1。

本发明还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因敲除中的应用。优选地，所述的基因为agrA基因。

本发明还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的单碱基突变中的应用。优选地，所述的单碱基突变为agrA基因中94位的鸟嘌呤G突变成胸腺嘧啶T。

本发明还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因插入中的应用。

优选地，金黄色葡萄球菌株的agrA基因作为插入位点，以红色荧光蛋白的rfp基因为插入基因。

本发明还提供了上述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因转录抑制中的应用。

优选地，所述的基因为agrA基因和/或sasE基因。优选地，所述的金黄色葡萄球菌株为金黄色葡萄球菌RN4220，Newman或USA300。

本发明还提供了含有上述的pCasSA质粒的大肠杆菌DH10B菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC M 2016773。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明涉及在金黄色葡萄球菌中基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术形成的pCasSA质粒以及相关应用。本发明的质粒能够(1)高效并且快速地编辑各种金黄色葡萄球菌菌株的基因组，其中包括基因敲除、单碱基突变和基因插入；(2)能够对目标基因表达起到高效转录抑制作用。所述技术在金黄色葡萄球菌感染治疗、药物靶标发现、药物开发、金黄色葡萄球菌生理研究等方面具有广阔地应用前景。

含有pCasSA质粒的大肠杆菌DH10B菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2016.12.20，保藏号为：CCTCC M 2016773。

附图说明

附图1：编辑质粒pCasSA图谱；BsaI位点：用于Golden Gate Assembly技术插入spacer片段；XbaI和XhoI位点：用于Gibson Assembly技术插入目标基因的上下游修复模板；cap 1A promoter：sgRNA表达的启动子；rpsL promoter：Cas9蛋白基因表达的启动子；repF：金黄色葡萄球菌中温度敏感的质粒复制子，用于质粒消除；Cm：金黄色葡萄球菌中氯霉素抗性基因片段；KanR：大肠杆菌中卡那霉素抗性基因片段；ColE1：大肠杆菌中的质粒复制子。

附图2：pCasSA在金黄色葡萄球菌各种菌株中实现高效基因组编辑；图A.采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因敲除的示意图，和在Newman菌株中进行agrA基因敲除的PCR验证，溶血实验以及DNA测序结果。图B.采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因单碱基突变的示意图，和在Newman菌株中进行agrA基因单碱基突变的溶血实验和DNA测序结果。图C.采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因插入的示意图，和在Newman菌株中将rfp基因插入agrA基因位点的PCR验证和DNA测序结果。

附图3：基于pCasSA开发的转录抑制体系实现金黄色葡萄球菌中目标基因的高效转录抑制。图A.在金黄色葡萄球菌中使用pCasSA系统对目标基因进行高效转录抑制的过程示意图。图B.pCasSA系统能有效抑制金黄色葡萄球菌中目标基因的转录。实验选定Newman菌株中agrA和sasE两个基因，使用实时荧光定量PCR检测这两个目标基因的mRNA表达水平，可以看到采用pCasSA系统能显著降低目标基因的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

各实施例中使用的生物材料来源如下：

pCas9质粒(购自美国Addgene公司，货号：42876)；

pCRISPR质粒(购自美国Addgene公司，货号：42875)；

pKOR1质粒(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，货号：3497325)；

金黄色葡萄球菌RN4220菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：L2956)；

金黄色葡萄球菌Newman菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：L3963)；

金黄色葡萄球菌USA300菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCCBAA-1717)；

感受态大肠杆菌DH10B菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：CC0014)。

各实施例中使用的TSB液体培养基购自国药集团化学试剂有限公司，货号：69110963。TSB固体培养基由TSB液体培养基中加入琼脂粉(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A505255-0250)配制而成。每100ml TSB液体培养基中加入1.5g琼脂粉。LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507002-0250，LB固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507003-0250。

实施例一：pCasSA质粒构建：

pCasSA质粒的组成如附图1所示，其序列为SEQ ID NO：1。pCasSA质粒的具体构建方法如下：

(1)使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提金黄色葡萄球菌Newman菌株的基因组，具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。，以Newman菌株的基因组为模板PCR扩增得到rpsL基因的启动子；从pCas9质粒中PCR扩增得到Cas9蛋白基因；从pKOR1质粒中分别PCR扩增得到温度敏感的repF复制子和氯霉素抗性基因片段；从pCRISPR质粒中PCR扩增得到含有ColE1复制子和卡那霉素抗性基因的DNA片段。

用于PCR扩增的引物序列为：

扩增rpsL基因启动子5’引物序列(SEQ ID NO：2)：

5’-GACCAGAGGTCTCCACATACCCATGGTCTAGAATGCTCGAGTCAGAAAAATATACCTGTATCTTTTTTCAAAAGC-3’

扩增rpsL基因启动子3’引物序列(SEQ ID NO：3)：

5’-GACCAGAGGTCTCCGTGATATGTCCTCCTCTCTTC-3’

扩增Cas9蛋白基因5’引物序列(SEQ ID NO：4)：

5’-GACCAGAGGTCTCGTCACATGGATAAGAAATACTCAATAGGC-3’

扩增Cas9蛋白基因3’引物序列(SEQ ID NO：5)：

5’-GACCAGAGGTCTCGCGTCGGGAAAACTGTCCATACCCATGGGTATTTACCACAACAGTACGCCAACCAGCCATCAGTCACCTCCTAGCTGACTC-3’

扩增温度敏感的repF复制子5’引物序列(SEQ ID NO：6)：

5’-GACCAGAGGTCTCGGACGTCTAAGAAACCATTATTATCA-3’

扩增温度敏感的repF复制子3’引物序列(SEQ ID NO：7)：

5’-GACCAGAGGTCTCGGGTAACCAAGATAACAAAGAATACA-3’

扩增氯霉素抗性基因片段5’引物序列(SEQ ID NO：8)：

5’-GACCAGAGGTCTCGTACCCGTCTTCTTAATATGCGTAATTG-3’

扩增氯霉素抗性基因片段3’引物序列(SEQ ID NO：9)：

5’-GACCAGAGGTCTCGCGATATCCCCGTATAGTGAGTC-3’

扩增含有ColE1复制子和卡那霉素抗性基因的DNA片段的5’引物序列(SEQ ID NO：10)：

5’-GACCAGAGGTCTCCATCGTCGGAATTGCCAGCTGG-3’

扩增含有ColE1复制子和卡那霉素抗性基因的DNA片段的3’引物序列(SEQ ID NO：11)：

5’-GACCAGAGGTCTCCATGTCGACAACGCAGGAAAGAACATGTGAGC-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述五个DNA片段分别进行扩增，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μ15×PrimestarBuffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 4min，共30个循环；最后72℃ 10min。

使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行回收。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)将上述五个DNA片段组装成一个环形质粒。反应体系为：1μl 10×T4DNAligase Buffer，上述五个DNA片段各20fmol，0.5μl T4DNA ligase，0.5μlBsaI-HF，最后加入适量ddH₂O至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。在PCR仪中进行反应，循环如下：37℃ 2min；16℃ 5min，共25个循环；然后50℃ 5min，80℃ 15min。

将上述10μl反应产物转化到感受态大肠杆菌DH10B菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于30℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)在金唯智生物科技有限公司化学合成含有cap 1A启动子和sgRNA序列的DNA片段，其序列如下(SEQ ID NO：12)：

5’-CCTGCGTTGTCGACAGAGTTTGCAAAATATACAGGGGATTATATATAATGGAAACGAGACCATTGGTCTCAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgagatctgtccatacccatggTCTAGAATGCTCGAGTCAGAA-3’

其中加粗的大写部分为cap 1A启动子序列；小写部分为sgRNA序列；斜体的大写部分为两个BsaI酶切位点；上游的下划线部分为SalI酶切位点；下游的下划线部分为XhoI酶切位点。

(4)将上述步骤(2)的质粒和步骤(3)的DNA片段分别用SalI和XbaI进行酶切，其反应体系如下：5μl 10×CutSmart Buffer，2μg质粒或DNA片段，2μl SalI-HF，2μl XhoI，最后加入适量ddH₂O至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对双酶切产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(5)将回收的质粒和DNA片段用T4DNAligase进行连接，最终得到pCasSA质粒。其反应体系如下：1μl10×T4DNA ligase Buffer，100ng酶切后的质粒，50ng酶切后的DNA片段，0.5μl T4 DNA ligase，加入适量ddH₂O至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。

在室温下反应2～3个小时后，将10μl连接产物转化到感受态大肠杆菌DH10B菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于30℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pCasSA质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。含有正确pCasSA质粒的大肠杆菌DH10B菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M2016773。

该pCasSA质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌中为卡那霉素抗性，在金黄色葡萄球菌中为氯霉素抗性，能用于菌株筛选；在于该质粒能在金黄色葡萄球菌中稳定表达Cas9蛋白，进行基因组DNA编辑，实现基因敲除、单碱基突变、基因插入、基因转录抑制等功能；在于具有金黄色葡萄球菌中温度敏感的repF复制子，在42℃时不能复制，能够在菌株中完成质粒的消除；在于含有两个BsaI位点，能够用来插入spacer片段；在于含有XbaI和XhoI酶切位点，能够用来插入修复模板。

实施例二：pCasSA实现金黄色葡萄球菌各种菌株中高效基因敲除：

使用pCasSA质粒可以在金黄色葡萄球菌各种菌株中实现对不同基因的高效敲除。实验中选取agrA基因为例，在金黄色葡萄球菌RN4220，Newman和USA300菌株中进行基因敲除实验。附图2A为采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因敲除的示意图，和在Newman菌株中进行agrA基因敲除的PCR验证，溶血实验以及DNA测序结果。

(1)先在目标基因上选定某一NGG(N为任意碱基)序列前面20个碱基的DNA片段(这20个碱基被称为spacer，NGG不包含在其中，spacer的GC比例最好在40％-60％)。本步骤的特征在于：为使spacer片段能插入到pCasSA质粒中，需在该单链DNA序列的5’端加上GAAA。同时需合成spacer的反补序列，并在反补序列5’端加上AAAC。例如实验选定的agrA基因spacer的DNA序列(SEQ ID NO：13)为：5’-tgtctacaaagttgcagcga-3’，则具体序列设计如下：

5’-GAAAtgtctacaaagttgcagcga-3’(SEQ ID NO：14)

3’-acagatgtttcaacgtcgctCAAA-5’(SEQ ID NO：15)

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例七的步骤将spacer插入到实施例一中得到的pCasSA质粒中，得到pCasSA-agrA_spacer质粒。

(2)对pCasSA-agrA_spacer质粒使用XbaI和XhoI进行酶切反应。其反应体系如下：5μl 10×MBuffer，5μl 10×BSA，2μg pCasSA-agrA_spacer质粒，2μl XbaI，最后加入适量ddH₂O至总体积为50μl。在37℃下反应2小时。然后向反应体系中加入5μl 10×H Buffer，2μl XhoI，继续在37℃下反应2～3小时。该反应中所用buffer和酶均由Takara公司生产。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对双酶切质粒进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)扩增要敲除的目标基因上下游各～1kb的DNA片段。本步骤的特征在于：在目标基因上游的5’引物上需添加5’-TTTGAGATCTGTCCATACCCATGGTCTAGA-3’序列(SEQ ID NO：16)，而在目标基因下游的3’引物上需添加5’-AAGATACAGGTATATTTTTCTGACTCGAG-3’序列(SEQ ID NO：17)；同时扩增目标基因上游的3’引物与扩增下游的5’引物之间有30～40个碱基的重叠互补区域。以agrA基因为例，扩增其上下游片段所需的引物分别为：

agrA基因上游5’引物序列(SEQ ID NO：18)：5’-cacaaataaactcggatgaagc-3’

agrA基因上游3’引物序列(SEQ ID NO：19)：5’-ACATTCACATCCTTATGGCT-3’

agrA基因下游5’引物序列(SEQ ID NO：20)：5’-taagataataaagtcagttaacggc-3’

agrA基因下游3’引物序列(SEQ ID NO：21)：5’-ccattatgggataacgctgaa-3’

那么在实验中具体设计时，引物的实际序列为：

agrA基因上游5’引物序列(SEQ ID NO：22)：

5’-TTTGAGATCTGTCCATACCCATGGTCTAGAcacaaataaactcggatgaagc-3’

agrA基因上游3’引物序列(SEQ ID NO：23)：

5’-gttaactgactttattatcttaACATTCACATCCTTATGGCT-3’

agrA基因下游5’引物序列(SEQ ID NO：24)：

5’-AGCCATAAGGATGTGAATGTtaagataataaagtcagttaacggc-3’

agrA基因下游3’引物序列(SEQ ID NO：25)：

5’-AAGATACAGGTATATTTTTCTGACTCGAGccattatgggataacgctgaa-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对agrA基因上下游片段分别进行扩增，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。

其中模板DNA为准备进行基因敲除的金黄色葡萄球菌菌株中的基因组DNA。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒从菌株中抽提基因组DNA。基因组DNA抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃ 10min。

使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(4)将上述步骤(3)得到的agrA基因上下游片段插入到步骤(2)酶切后的pCasSA-agrA_spacer质粒的XbaI/XhoI位点中，得到pCasSA-agrA质粒。具体的反应体系为：10μlGibson Assembly Master Mix(NEB公司)，20fmol agrA基因上游片段，20fmol agrA基因下游片段，20fmol酶切后的pCasSA-agrA_spacer质粒，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到感受态大肠杆菌DH10B菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于30℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pCasSA-agrA质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(5)将构建的pCasSA-agrA质粒按实施例九的操作步骤转入金黄色葡萄球菌RN4220菌株中。挑取单克隆菌落，接种到3ml TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)液体培养基中，在30℃摇床中振摇过夜。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒从菌株中抽提基因组DNA。以抽提的基因组DNA为模板PCR扩增agrA基因部分。反应体系为34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl基因组DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳。成功进行基因敲除的菌株单克隆，其PCR产物会比正常菌株的PCR产物长度短，因此可以通过琼脂糖凝胶上DNA片段的大小来判断基因敲除是否成功。

本步骤的特征在于进行PCR验证的引物位于agrA基因上下游的外侧，不在pCasSA-agrA质粒中，这样就避免了pCasSA-agrA质粒对PCR结果的干扰。

agrA基因敲除的PCR验证引物序列为：

5’Primer：5’-ATGTTTGATAGCGCGTCCTT-3’(SEQ ID NO：26)

3’Primer：5’-AGTCCGATGAGAGATGCACA-3’(SEQ ID NO：27)

使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化回收。将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-GGTGAAGGTCGTGGTTTAGG-3’(SEQ ID NO：28)。

实验结果发现，在选取的12个菌落中，有6个基因敲除成功。

(6)使用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒从已经确认基因敲除成功的RN4220菌株中抽提pCasSA-agrA质粒。质粒抽提时，向试剂盒中的Buffer P1中加入生工生物工程(上海)股份有限公司生产的溶葡球菌酶(溶葡球菌酶终浓度为100ng/ml)以帮助裂解RN4220细菌。质粒抽提的其他步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(7)将从RN4220菌株中抽提的pCasSA-agrA质粒按实施例九的操作步骤转入金黄色葡萄球菌Newman菌株中。PCR验证的过程和使用引物与步骤(5)中RN4220菌株相同。

实验结果发现，在选取的10个单克隆菌落中，有5个基因敲除成功。

(8)金黄色葡萄球菌Newman菌株中的agrA基因与细菌的溶血能力相关。当agrA基因失去功能时，会使菌株失去溶血能力。按实施例十的操作步骤，将步骤(7)中选取的10个单克隆菌落进行溶血实验，其结果与步骤(7)PCR结果一致，五个基因敲除成功的菌落失去溶血能力，而另外5个菌落则与野生型菌株(对照组)的溶血能力相同。

(9)实验同时也对金黄色葡萄球菌USA300菌株进行了agrA基因的敲除。其实验过程与步骤(7)和(8)相同。

实验结果发现，在选取的10个单克隆菌落中，全部基因敲除成功。

(10)对已经确认基因敲除成功的金黄色葡萄球菌各菌株，按实施例六的操作过程消除菌株中的质粒。

实施例三：pCasSA实现金黄色葡萄球菌各种菌株中高效单碱基突变：

使用pCasSA质粒可以对金黄色葡萄球菌各种菌株中不同基因进行高效单碱基突变。实验中选取agrA基因为例，在金黄色葡萄球菌RN4220和Newman菌株中进行基因单碱基突变实验。附图2B为采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因单碱基突变的示意图，和在Newman菌株中进行agrA基因单碱基突变的溶血实验和DNA测序结果。

(1)选定目标基因的spacer，并设计引物构建质粒。实验中选定agrA基因中94位的鸟嘌呤G，将其突变成胸腺嘧啶T。突变后原来agrA基因上的TGG变成了TGT，Cas9蛋白不能识别突变后的位点，从而不能将其切割。这样就能得到单碱基突变的菌株。选定agrA基因要进行突变的TGG前面20个碱基的spacer序列，按实施例二步骤(1)相同的设计原则设计引物序列。具体序列设计如下：

agrA基因单碱基突变Spacer 5’primer(SEQ ID NO：29)：

5’-GAAAaatgatagaagaaaagccta-3’

agrA基因单碱基突变Spacer 3’primer(SEQ ID NO：30)：

5’-AAACtaggcttttcttctatcatt-3’

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例七的步骤将spacer插入到实施例一中得到的pCasSA质粒中，得到pCasSA-agrAm_spacer质粒。

(2)使用XbaI和XhoI对pCasSA-agrAm_spacer质粒进行酶切，并纯化酶切产物。其步骤与实施例二步骤(2)相同。

(3)扩增目标基因突变位点上下游各～1kb的DNA片段。其引物设计原则与实施例二步骤(3)相同。

在本步骤中，引物的具体序列为：

agrA基因单碱基突变位点上游5’引物序列(SEQ ID NO：22)：

5’-TTTGAGATCTGTCCATACCCATGGTCTAGAcacaaataaactcggatgaagc-3’

agrA基因单碱基突变位点上游3’引物序列(SEQ ID NO：31)：

5’-GATTATCAGTTGCGAGGGCAATTTACATAGGCTTTTCTTCTATCATTATATAATTTTTA-3’

agrA基因单碱基突变位点下游5’引物序列(SEQ ID NO：32)：

5’-TAAAAATTATATAATGATAGAAGAAAAGCCTATGTAAATTGCCCTCGCAACTGATAATC-3’

agrA基因单碱基突变位点下游3’引物序列(SEQ ID NO：25)：

5’-AAGATACAGGTATATTTTTCTGACTCGAGccattatgggataacgctgaa-3’

使用金黄色葡萄球菌Newman基因组作为模板DNA扩增并纯化agrA基因突变位点上下游片段。其实验过程与实施例二步骤(3)相同。

(4)将上述纯化得到的agrA基因上下游片段插入到步骤(2)酶切后的pCasSA-agrAm_spacer质粒XbaI/XhoI位点中，得到pCasSA-agrAm质粒。实验过程与实施例二步骤(4)相同。

(5)将构建的pCasSA-agrAm质粒按实施例九的操作步骤转入金黄色葡萄球菌RN4220菌株中。按实施例二步骤(5)相同的步骤抽提单克隆菌落基因组并用相同的引物和方法PCR扩增agrA基因片段。

使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化回收。将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-GGTGAAGGTCGTGGTTTAGG-3’(SEQ ID NO：28)

实验结果发现，在选取的12个菌落中，全部单碱基突变成功。

(6)按实施例二步骤(6)相同的步骤抽提单碱基突变成功的RN4220菌株中的pCasSA-agrAm质粒。

(7)将从RN4220菌株中抽提的pCasSA-agrAm质粒按实施例九的操作步骤转入金黄色葡萄球菌Newman菌株中。PCR验证的过程和使用引物与步骤(5)中RN4220菌株相同。

实验结果发现，在选取的10个单克隆菌落中，有9个单碱基突变成功。

(8)金黄色葡萄球菌菌株中的agrA基因与细菌的溶血能力相关。当agrA基因失去功能时，会使菌株失去溶血能力。在本实施例中，agrA基因单碱基突变后会提前引入一个终止子TAA，从而使agrA基因失去作用。按实施例十的操作步骤，将步骤(7)中选取的10个单克隆菌落进行溶血实验，其结果与步骤(7)PCR结果一致，9个单碱基突变成功的菌落失去溶血能力，而另一个菌落则与野生型菌株(对照组)的溶血能力相同。

(9)对已经确认基因单碱基突变成功的金黄色葡萄球菌各菌株，按实施例六的操作过程消除菌株中的质粒。

实施例四：pCasSA实现金黄色葡萄球菌各种菌株中高效基因插入：

使用pCasSA质粒可以在金黄色葡萄球菌各种菌株中实现对不同基因的高效插入。实验中选取agrA基因作为插入位点，以红色荧光蛋白(RFP)的rfp基因为插入基因，在金黄色葡萄球菌RN4220和Newman菌株中进行基因插入实验。附图2C为采用pCasSA系统在金黄色葡萄球菌中进行基因插入的示意图，和在Newman菌株中将rfp基因插入agrA基因位点的PCR验证和DNA测序结果。

(1)用于agrA基因插入的spacer片段序列和实施例二步骤(1)相同，并按实施例七的操作步骤将spacer片段插入实施例一得到的pCasSA质粒中，构建得到pCasSA-agrA_spacer质粒。

(2)使用XbaI和XhoI对pCasSA-agrA_spacer质粒进行酶切反应，并纯化酶切产物。其步骤与实施例二步骤(2)相同。

(3)扩增要插入的目标基因上下游各～1kb的DNA片段，并扩增RFP蛋白基因。与实施例二步骤(3)相比，本步骤的特征在于：增加了RFP蛋白基因片段，而且扩增RFP蛋白基因的5’引物和3’引物分别与扩增目标基因上游的3’引物和扩增目标基因下游的5’引物之间有30～40个碱基的重叠互补区域。以agrA基因为例，在实验设计时，引物的具体序列为：

agrA基因上游5’引物序列(SEQ ID NO：22)：

5’-TTTGAGATCTGTCCATACCCATGGTCTAGAcacaaataaactcggatgaagc-3’

agrA基因上游3’引物序列(SEQ ID NO：33)：

5’-aacgtcttcgctactcgccatACATTCACATCCTTATGGCT-3’

RFP蛋白基因5’引物序列(SEQ ID NO：34)：

5’-AGCCATAAGGATGTGAATGTatggcgagtagcgaagacgtt-3’

RFP蛋白基因3’引物序列(SEQ ID NO：35)：

5’-GCCGTTAACTGACTTTATTATCTTAttaagcaccggtggagtgacgaccttc-3’

agrA基因下游5’引物序列(SEQ ID NO：36)：

5’-gaaggtcgtcactccaccggtgcttaaTAAGATAATAAAGTCAGTTAACGGC-3’

agrA基因下游3’引物序列(SEQ ID NO：25)：

5’-AAGATACAGGTATATTTTTCTGACTCGAGccattatgggataacgctgaa-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对agrA基因上下游片段以及RFP蛋白基因分别进行扩增，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。

其中扩增agrA基因上下游片段的模板DNA为准备进行基因插入的金黄色葡萄球菌菌株中的基因组DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司生产Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒从相应菌株中抽提得到。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。而扩增RFP蛋白基因的模板则是在生工生物工程(上海)股份有限公司通过全基因合成得到，其碱基序列如SEQ IDNO：37所示。

(4)将上述纯化得到的agrA基因上下游片段以及RFP蛋白基因插入到步骤(2)酶切后的pCasSA-agrA_spacer质粒XbaI/XhoI位点中，得到pCasSA-agrA-RFP质粒。具体的反应体系为：10μl Gibson Assembly Master Mix(NEB公司)，20fmol agrA基因上游片段，20fmol agrA基因下游片段，20fmol RFP蛋白基因片段，20fmol酶切后的pCasSA-agrA_spacer质粒，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到感受态大肠杆菌DH10B菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于30℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pCasSA-agrA-RFP质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

(5)将构建的pCasSA-agrA-RFP质粒按实施例九的操作步骤转入金黄色葡萄球菌RN4220菌株中。按实施例二步骤(5)相同的步骤抽提单克隆菌落基因组并用PCR扩增agrA-RFP基因片段。本步骤的不同之处在于使用了不同的验证引物，其中5’引物位于RFP蛋白基因上，而3’引物则位于agrA基因下游的外侧。这样成功进行基因插入的菌株能够得到PCR扩增条带，而没有发生基因插入的菌株则不能得到PCR扩增条带。该引物设计同时也避免了pCasSA-agrA-RFP质粒对PCR结果的干扰。

agrA-RFP基因插入的PCR验证引物序列为：

5’Primer：5’-actgcgtggtaccaacttcc-3’(SEQ ID NO：38)

3’Primer：5’-AGTCCGATGAGAGATGCACA-3’(SEQ ID NO：27)

此外，按实施例二步骤(5)相同的引物和方法PCR扩增agrA基因片段，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化回收。将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-GGTGAAGGTCGTGGTTTAGG-3’(SEQ ID NO：28)和5’-AAAATTGCGCCATAGGATTG-3’(SEQ ID NO：39)。

实验结果发现，在选取的10个菌落中，有5个基因插入成功。

(6)按实施例二步骤(6)相同的步骤抽提基因插入成功的RN4220菌株中的pCasSA-agrA-RFP质粒。

(7)将从RN4220菌株中抽提的pCasSA-agrA-RFP质粒按实施例九的操作步骤转入金黄色葡萄球菌Newman菌株中。PCR验证的过程和使用引物与步骤(5)中RN4220菌株相同。

实验结果发现，在选取的12个单克隆菌落中，有6个基因插入成功。

实施例五：基于pCasSA开发的转录抑制系统实现金黄色葡萄球菌各种菌株中高效转录抑制：

之前的研究发现，将Cas9蛋白上10号位的天冬氨酸和840号位的组氨酸突变成丙氨酸，会使Cas9蛋白失去了切割DNA的功能，只具有结合到目标DNA位点的功能。将该突变的Cas9蛋白作用到目标基因及其启动子位点上，能有效抑制目标基因的表达。根据这一发现，对pCasSA质粒上Cas9蛋白基因位点进行上述突变，得到pCasiSA质粒。

具体步骤如下：

将pCasSA质粒分成三段，其中两个突变位点正好位于断点上。设计含有突变位点的引物，并且各引物之间分别有20-30个碱基的重叠互补部分。具体引物序列如下(带下划线的部分为突变位点)：

pCasiSA片段一5’引物(SEQ ID NO：40)：

5’-CATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAgctATCGGCACAAATAGCGTCGG-3’

pCasiSA片段一3’引物(SEQ ID NO：41)：

5’-GTCTTTAAGGAAACTTTGTGGAACAATggcATCGACATCATAATCACTTAAACG-3’

pCasiSA片段二5’引物(SEQ ID NO：42)：

5’-CGTTTAAGTGATTATGATGTCGATgccATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGAC-3’

pCasiSA片段二3’引物(SEQ ID NO：43)：

5’-cgattatgtcttttgcgcagtc-3’

pCasiSA片段三5’引物(SEQ ID NO：44)：

5’-cgcaccagcgaaaactggt-3’

pCasiSA片段三3’引物(SEQ ID NO：45)：

5’-CCGACGCTATTTGTGCCGATagcTAAGCCTATTGAGTATTTCTTATCCATG-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对三个片段分别进行扩增，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl pCasSA质粒(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。

体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃ 30s；之后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 5min，共30个循环；最后72℃ 10min。

将上述纯化得到的三个片段组装成pCasiSA质粒。具体的反应体系为：10μlGibson Assembly Master Mix(NEB公司)，三个纯化片段各20fmol，加入适量ddH₂O至总体积为20μl。在50℃下反应1小时。将20μl反应产物转化到感受态大肠杆菌DH10B菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于30℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pCasiSA质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。

pCasiSA质粒可用于金黄色葡萄球菌各菌株中不同基因的转录抑制。实验选定agrA基因和sasE基因进行测试，其spacer片段序列设计原则与实施例二步骤(1)相同。具体spacer序列如下：

agrA转录抑制Spacer 5’primer(SEQ ID NO：14)：

5’-GAAAtgtctacaaagttgcagcga-3’

agrA转录抑制Spacer 3’primer(SEQ ID NO：15)：

5’-AAACtcgctgcaactttgtagaca-3’

sasE转录抑制Spacer 5’primer(SEQ ID NO：46)：

5’-GAAAgtcatgttgttttcctccta-3’

sasE转录抑制Spacer 3’primer(SEQ ID NO：47)：

5’-AAACtaggaggaaaacaacatgac-3’

按实施例七的操作步骤将spacer片段插入上述的pCasiSA质粒中，构建得到pCasiSA-agrA质粒和pCasiSA-sasE质粒。

将构建的pCasiSA，pCasiSA-agrA质粒和pCasiSA-sasE质粒按实施例九的操作步骤转入金黄色葡萄球菌RN4220菌株中。

按实施例二步骤(6)相同的步骤，将pCasiSA，pCasiSA-agrA质粒和pCasiSA-sasE质粒从RN4220菌株中抽提出来。

按实施例九的操作步骤将来自RN4220菌株的pCasiSA，pCasiSA-agrA质粒和pCasiSA-sasE质粒转入金黄色葡萄球菌Newman菌株中。

按实施例十一的操作步骤用实时荧光定量PCR检测分别转入pCasiSA，pCasiSA-agrA质粒和pCasiSA-sasE质粒的Newman菌株中agrA基因与sasE基因的表达水平。同时检测个菌株中核糖体16S rRNA(参照基因)的表达水平。其中转入pCasiSA的Newman菌株是对照组。

实时荧光定量PCR所用的引物为：

核糖体16S rRNA 5’引物(SEQ ID NO：48)：5’-acgtggataacctacctataagactgggat-3’

核糖体16S rRNA3’引物(SEQ ID NO：49)：5’-taccttaccaactagctaatgcagcg-3’

检测agrA基因表达水平5’引物(SEQ ID NO：50)：5’-tcacagactcattgcccatt-3’

检测agrA基因表达水平3’引物(SEQ ID NO：51)：5’-caccgatgcatagcagtgtt-3’

检测sasE基因表达水平5’引物(SEQ ID NO：52)：5’-gcagacagccaacaagtcaa-3’检测sasE基因表达水平3’引物(SEQ ID NO：53)：5’-gcattgtttaacacggtttgg-3’

实验发现使用pCasSA体系能有效降低金黄色葡萄球菌中目标基因的表达水平，其中agrA基因表达水平降低了98％，sasE基因降低了94％(附图3)。

实施例六：金黄色葡萄球菌中pCasSA质粒的消除：

从含有pCasSA质粒的金黄色葡萄球菌中挑取一个单克隆，接种到3ml TSB液体培养基中，在30℃下振摇过夜。第二天，取3μl菌液，以1∶1000比例稀释到新鲜的TSB液体培养基中，在42℃下振摇直至菌液浑浊。用接种环取适量菌液，在TSB固体培养基上划线，并在37℃培养箱中倒置培养过夜。由于pCasSA质粒中含有温度敏感的repF复制子，使得该质粒在42℃下无法复制，从而在细菌中消除。从TSB固体培养基上挑取单克隆菌落，接种在10μlTSB液体培养基中，分别在TSB固体培养基和含有5μg/ml氯霉素的TSB固体培养基上划线。能在TSB固体培养基生长，但是不能在含有5μg/ml氯霉素的TSB固体培养基上生长的菌落，即为消除了pCasSA质粒的菌落，对其进行培养与保种。

实施例七：将spacer片段插入pCasSA质粒：

首先将设计合成的两个spacer引物进行磷酸化，具体反应体系如下：5μl 10×T4DNA ligase Buffer(NEB公司)，2μl spacer 5’primer(50μM)，2μl spacer3’primer(50μM)，1μlT4 polynucleotide kinase(Takara公司)，40μl ddH₂O。在37℃下反应1小时。

向反应产物中加入2.5μl 1M NaCl，在95℃加热5min，然后在1～2小时内缓慢地降低到室温，使磷酸化的两条单链引物通过碱基配对形成双链DNA。然后用ddH₂O将得到的产物稀释20倍。

将上述得到的双链DNA插入pCasSA质粒的BsaI位点，反应体系为：1μl 10×T4DNAligase Buffer，1μl上述20倍稀释的磷酸化双链DNA，20fmol实施例一中得到的pCasSA质粒，0.5μl T4 DNA ligase，0.5μl BsaI-HF，最后加入适量ddH₂O至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。在PCR仪中进行反应，循环如下：37℃ 2min；16℃ 5min，共25个循环；然后50℃ 5min，80℃ 15min。

将该10μl反应产物转化到感受态大肠杆菌DH10B菌株中，并平铺在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于30℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，同时抽提质粒并送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

实施例八：制备金黄色葡萄球菌电转感受态细菌

将保种的金黄色葡萄球菌菌株在TSB固体培养基上划线，于30℃培养箱倒置培养过夜。挑取培养基上长出的一个单克隆菌落，接种到3ml TSB液体培养基中，在30℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取其中1ml菌液接种到100ml新鲜的TSB培养基中，在30℃摇床中继续振摇。当菌液的OD₆₀₀达到0.3～0.4时，将菌液放在冰上冷却十分钟。在4℃离心机中以5000rpm转速离心5分钟收菌，弃去培养基上清，将底部的细菌沉淀用20ml 0.5M蔗糖溶液(以0.22μm滤膜过滤除菌，并在冰上预冷)重悬。以同样的转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀用10ml 0.5M蔗糖溶液重悬。以同样的转速再一次离心，弃去上清后用1ml 0.5M蔗糖溶液重悬底部的细菌沉淀。将得到的细菌溶液分装到EP管中，每管50μl菌液。将分装的菌液先在液氮中快速冷却，然后放入-80℃冰箱中保存。需要注意的是，在重悬时动作要轻柔，可以使用移液枪轻轻吹打使细菌沉淀重悬起来。

实施例九：将质粒通过电转转入金黄色葡萄球菌感受态细菌中

取一管实施例八中制备的金黄色葡萄球菌感受态细菌，在冰上放置5～10分钟后，加入1～2μg质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(Bio-Rad公司)，室温下在GenePulser Xcell电击仪(Bio-Rad公司)中进行电击。电击参数为：21kV/cm，100Ω，25μF。电击后立即加入1mlTSB培养液，混合均匀后转入干净的EP管中，在30℃摇床中振摇1.5个小时。将EP管以4500rpm转速在室温下离心1.5分钟，弃去～900μl上清，将剩余的菌液(～150μl)混合均匀后平铺在含有氯霉素的TSB固体培养基上(对于RN4220菌株，氯霉素浓度为5μg/ml；对于Newman和USA300菌株，氯霉素浓度为10μg/ml)。待菌液被固体培养基吸收后，于30℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。

实施例十：金黄色葡萄球菌菌株在血平板上的溶血实验

将不同金黄色葡萄球菌菌株在TSB液体培养基中培养过夜，取1μl菌液点在血平板上。待菌液被血平板吸收后，于30℃培养箱倒置培养过夜。第二天观察各菌株在血平板上的溶血情况，并拍照记录。

血平板的配制方法如下：将TSB固体培养基用微波炉加热溶解，然后放置在室温下缓慢冷却至50-60℃。取19mlTSB固体培养基，加入1ml无菌脱纤维素绵羊血，混合均匀后倒入无菌培养皿中。在超净台中于室温下缓慢冷却，即得到血平板。

实施例十一：实时定量荧光PCR实验

挑取实验的金黄色葡萄球菌菌株单克隆，在TSB液体培养基中30℃培养过夜。第二天以1∶100的比例将40μl菌液稀释到4ml新鲜的TSB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀达到1.0。以10000rpm转速离心1分钟收菌，弃去上清。细菌沉淀用1ml RNAiso Plus(Takara公司)重悬后，转入带有Lysing Matrix B的蓝盖管(MP Biomedicals公司)中，并在FastPrep珠磨器(MP Biomedicals公司)中以6.0m/sec的速率高速振摇40s，将细菌裂解。在4℃下以13500×g转速离心10min，将上清转移到新的EP管中。加入150μl氯仿混合均匀，在室温静置5min后，在4℃下以13500×g转速离心10min。小心地将上清转移到新的EP管中，加入750μl异丙醇。混合均匀后在4℃静置10min。在4℃下以13500×g转速离心10min，弃去上清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀中的RNA。在4℃下以13500×g转速离心5min，弃去上清，打开EP管盖在空气中静置，直到管中残留的乙醇挥发完全。用50μl RNase-free水溶解得到的RNA，并用Nanodrop2000(Thermo Fisher Scientific公司)测定浓度。

取1μgRNA，使用Takara公司的PrimeScript^TM RT reagent kit试剂盒将其逆转录成cDNA。具体的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。使用Takara公司生产的SYBR PremixEx Taq IIkit试剂盒进行实时荧光定量PCR实验。反应体系为：10μl SYBR Premix EX TaqII，0.8μl PCR 5’Primer(10μM)，0.8μl PCR 3’Primer(10μM)，2μl cDNA(50ng/μl)，6.4μlddH₂O。体系配好后在LightCycler 96System实时荧光定量PCR仪(Roche公司)进行反应，并实时检测荧光信号。反应循环如下：95℃ 30s；之后95℃ 5s，60℃ 30s，共40个循环；最后融解曲线分析，95℃ 0s；65℃ 15s；0.1℃/s升温至95℃。使用仪器自带的软件进行数据分析。

SEQUENCE LISTING

<110>上海科技大学

<120>一种pCasSA质粒及其应用

<160> 53

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10241

<212> DNA

<213>人工序列 pCasSA质粒

<400> 1

agagtttgca aaatatacag gggattatat ataatggaaa cgagaccatt ggtctcagtt 60

ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 120

accgagtcgg tgcttttttt gagatctgtc catacccatg gtctagaatg ctcgagtcag 180

aaaaatatac ctgtatcttt tttcaaaagc aaacatgctt tgggtaaaca tgtaggtatt 240

aacgtcaatg cgacaatagt agcattgatt aaatgagaat tagtaagtgt tttacttact 300

aaattttatt taacctaaaa atgaaccacc tggatgtgtg ggattaaaaa gtgaagagag 360

gaggacatat cacatggata agaaatactc aataggctta gatatcggca caaatagcgt 420

cggatgggcg gtgatcactg atgaatataa ggttccgtct aaaaagttca aggttctggg 480

aaatacagac cgccacagta tcaaaaaaaa tcttataggg gctcttttat ttgacagtgg 540

agagacagcg gaagcgactc gtctcaaacg gacagctcgt agaaggtata cacgtcggaa 600

gaatcgtatt tgttatctac aggagatttt ttcaaatgag atggcgaaag tagatgatag 660

tttctttcat cgacttgaag agtctttttt ggtggaagaa gacaagaagc atgaacgtca 720

tcctattttt ggaaatatag tagatgaagt tgcttatcat gagaaatatc caactatcta 780

tcatctgcga aaaaaattgg tagattctac tgataaagcg gatttgcgct taatctattt 840

ggccttagcg catatgatta agtttcgtgg tcattttttg attgagggag atttaaatcc 900

tgataatagt gatgtggaca aactatttat ccagttggta caaacctaca atcaattatt 960

tgaagaaaac cctattaacg caagtggagt agatgctaaa gcgattcttt ctgcacgatt 1020

gagtaaatca agacgattag aaaatctcat tgctcagctc cccggtgaga agaaaaatgg 1080

cttatttggg aatctcattg ctttgtcatt gggtttgacc cctaatttta aatcaaattt 1140

tgatttggca gaagatgcta aattacagct ttcaaaagat acttacgatg atgatttaga 1200

taatttattg gcgcaaattg gagatcaata tgctgatttg tttttggcag ctaagaattt 1260

atcagatgct attttacttt cagatatcct aagagtaaat actgaaataa ctaaggctcc 1320

cctatcagct tcaatgatta aacgctacga tgaacatcat caagacttga ctcttttaaa 1380

agctttagtt cgacaacaac ttccagaaaa gtataaagaa atcttttttg atcaatcaaa 1440

aaacggatat gcaggttata ttgatggggg agctagccaa gaagaatttt ataaatttat 1500

caaaccaatt ttagaaaaaa tggatggtac tgaggaatta ttggtgaaac taaatcgtga 1560

agatttgctg cgcaagcaac ggacctttga caacggctct attccccatc aaattcactt 1620

gggtgagctg catgctattt tgagaagaca agaagacttt tatccatttt taaaagacaa 1680

tcgtgagaag attgaaaaaa tcttgacttt tcgaattcct tattatgttg gtccattggc 1740

gcgtggcaat agtcgttttg catggatgac tcggaagtct gaagaaacaa ttaccccatg 1800

gaattttgaa gaagttgtcg ataaaggtgc ttcagctcaa tcatttattg aacgcatgac 1860

aaactttgat aaaaatcttc caaatgaaaa agtactacca aaacatagtt tgctttatga 1920

gtattttacg gtttataacg aattgacaaa ggtcaaatat gttactgaag gaatgcgaaa 1980

accagcattt ctttcaggtg aacagaagaa agccattgtt gatttactct tcaaaacaaa 2040

tcgaaaagta accgttaagc aattaaaaga agattatttc aaaaaaatag aatgttttga 2100

tagtgttgaa atttcaggag ttgaagatag atttaatgct tcattaggta cctaccatga 2160

tttgctaaaa attattaaag ataaagattt tttggataat gaagaaaatg aagatatctt 2220

agaggatatt gttttaacat tgaccttatt tgaagatagg gagatgattg aggaaagact 2280

taaaacatat gctcacctct ttgatgataa ggtgatgaaa cagcttaaac gtcgccgtta 2340

tactggttgg ggacgtttgt ctcgaaaatt gattaatggt attagggata agcaatctgg 2400

caaaacaata ttagattttt tgaaatcaga tggttttgcc aatcgcaatt ttatgcagct 2460

gatccatgat gatagtttga catttaaaga agacattcaa aaagcacaag tgtctggaca 2520

aggcgatagt ttacatgaac atattgcaaa tttagctggt agccctgcta ttaaaaaagg 2580

tattttacag actgtaaaag ttgttgatga attggtcaaa gtaatggggc ggcataagcc 2640

agaaaatatc gttattgaaa tggcacgtga aaatcagaca actcaaaagg gccagaaaaa 2700

ttcgcgagag cgtatgaaac gaatcgaaga aggtatcaaa gaattaggaa gtcagattct 2760

taaagagcat cctgttgaaa atactcaatt gcaaaatgaa aagctctatc tctattatct 2820

ccaaaatgga agagacatgt atgtggacca agaattagat attaatcgtt taagtgatta 2880

tgatgtcgat cacattgttc cacaaagttt ccttaaagac gattcaatag acaataaggt 2940

cttaacgcgt tctgataaaa atcgtggtaa atcggataac gttccaagtg aagaagtagt 3000

caaaaagatg aaaaactatt ggagacaact tctaaacgcc aagttaatca ctcaacgtaa 3060

gtttgataat ttaacgaaag ctgaacgtgg aggtttgagt gaacttgata aagctggttt 3120

tatcaaacgc caattggttg aaactcgcca aatcactaag catgtggcac aaattttgga 3180

tagtcgcatg aatactaaat acgatgaaaa tgataaactt attcgagagg ttaaagtgat 3240

taccttaaaa tctaaattag tttctgactt ccgaaaagat ttccaattct ataaagtacg 3300

tgagattaac aattaccatc atgcccatga tgcgtatcta aatgccgtcg ttggaactgc 3360

tttgattaag aaatatccaa aacttgaatc ggagtttgtc tatggtgatt ataaagttta 3420

tgatgttcgt aaaatgattg ctaagtctga gcaagaaata ggcaaagcaa ccgcaaaata 3480

tttcttttac tctaatatca tgaacttctt caaaacagaa attacacttg caaatggaga 3540

gattcgcaaa cgccctctaa tcgaaactaa tggggaaact ggagaaattg tctgggataa 3600

agggcgagat tttgccacag tgcgcaaagt attgtccatg ccccaagtca atattgtcaa 3660

gaaaacagaa gtacagacag gcggattctc caaggagtca attttaccaa aaagaaattc 3720

ggacaagctt attgctcgta aaaaagactg ggatccaaaa aaatatggtg gttttgatag 3780

tccaacggta gcttattcag tcctagtggt tgctaaggtg gaaaaaggga aatcgaagaa 3840

gttaaaatcc gttaaagagt tactagggat cacaattatg gaaagaagtt cctttgaaaa 3900

aaatccgatt gactttttag aagctaaagg atataaggaa gttaaaaaag acttaatcat 3960

taaactacct aaatatagtc tttttgagtt agaaaacggt cgtaaacgga tgctggctag 4020

tgccggagaa ttacaaaaag gaaatgagct ggctctgcca agcaaatatg tgaatttttt 4080

atatttagct agtcattatg aaaagttgaa gggtagtcca gaagataacg aacaaaaaca 4140

attgtttgtg gagcagcata agcattattt agatgagatt attgagcaaa tcagtgaatt 4200

ttctaagcgt gttattttag cagatgccaa tttagataaa gttcttagtg catataacaa 4260

acatagagac aaaccaatac gtgaacaagc agaaaatatt attcatttat ttacgttgac 4320

gaatcttgga gctcccgctg cttttaaata ttttgataca acaattgatc gtaaacgata 4380

tacgtctaca aaagaagttt tagatgccac tcttatccat caatccatca ctggtcttta 4440

tgaaacacgc attgatttga gtcagctagg aggtgactga tggctggttg gcgtactgtt 4500

gtggtaaata cccatgggta tggacagttt tcccgacgtc taagaaacca ttattatcat 4560

gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 4620

tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 4680

ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 4740

ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 4800

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 4860

gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 4920

agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 4980

ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc atgcctgcag aacggattgt tgatgattac 5040

gaaaatatta agagcacaga ctattacaca gaaaatcaag aattaaaaaa acgtagagag 5100

agtttgaaag aagtagtgaa tacatggaaa gaggggtatc acgaaaaaag taaagaggtt 5160

aataaattaa agcgagagaa tgatagtttg aatgagcagt tgaatgtatc agagaaattt 5220

caagctagta cagtgacttt atatcgtgct gcgagggcga atttccctgg gtttgagaaa 5280

gggtttaata ggcttaaaga gaaattcttt aatgattcca aatttgagcg tgtgggacag 5340

tttatggatg ttgtacagga taatgtccag aaggtcgata gaaagcgtga gaaacagcgt 5400

acagacgatt tagagatgta gaggtacttt tatgccgaga aaactttttg cgtgtgacag 5460

tccttaaaat atacttagag cgtaagcgaa agtagtagcg acagctatta actttcggtt 5520

gcaaagctct aggattttta atggacgcag cgcatcacac gcaaaaagga aattggaata 5580

aatgcgaaat ttgagatgtt aattaaagac ctttttgagg tctttttttc ttagattttt 5640

ggggttattt aggggagaaa acataggggg gtactacgac ctccccccta ggtgtccatt 5700

gtccattgtc caaacaaata aataaatatt gggtttttaa tgttaaaagg ttgtttttta 5760

tgttaaagtg aaaaaaacag atgttgggag gtacagtgat agttgtagat agaaaagaag 5820

agaaaaaagt tgctgttact ttaagactta caacagaaga aaatgagata ttaaatagaa 5880

tcaaagaaaa atataatatt agcaaatcag atgcaaccgg tattctaata aaaaaatatg 5940

caaaggagga atacggtgca ttttaaacaa aaaaagatag acagcactgg catgctgcct 6000

atctatgact aaattttgtt aaatgtatta gcaccgttat tatatcatga gcgaaaatgt 6060

aataaaagaa actgaaaaca agaaaaattc aagaggacgt aattggacat ttgttttata 6120

tccagaatca gcaaaagccg agtggttaga gtatttaaaa gagttacaca ttcaatttgt 6180

agtgtctcca ttacatgata gggatactga tacagaagat aggatgaaaa aagagcatta 6240

tcatattcta gtgatgtatg agggtaataa atcttatgaa cagataaaaa taattaacag 6300

aagaattgaa tgcgactatt ccgcagattg caggaagtgt gaaaggtctt gtgagatata 6360

tgcttcacat ggacgatcct aataaattta aatatcaaaa agaagatatg atagtttatg 6420

gcggtgtaga tgttgatgaa ttattaaaga aaacaacaac agatagatat aaattaatta 6480

aagaaatgat tgagtttatt gatgaacaag gaatcgtaga atttaagagt ttaatggatt 6540

atgcaatgaa gtttaaattt gatgattggt tcccgctttt atgtgataac tcggcgtatg 6600

ttattcaaga atatataaaa tcaaatcggt ataaatctga ccgatagatt ttgaatttaa 6660

gagtgtcaca agacactctt ttttcgcacc agcgaaaact ggtttaagcc gactgcgcaa 6720

aagacataat cgattcacaa aaaataggca cacgaaaaac aagttaaggg atgcagttta 6780

tgcatccctt aacttactta ttaaataatt tatagctatt gaaaagagat aagaattgtt 6840

caaagctaat attgtttaaa tcgtcaattc ctgcatgttt taaggaattg ttaaattgat 6900

tttttgtaaa tattttcttg tattctttgt tatcttggtt acccgtcttc ttaatatgcg 6960

taattgcatc tactctaaat ccatcaatgc ctttatcaaa ccaccagttc atcatttcaa 7020

atacagcatc tctaacttcc ggattacccc aattcaaatc aggttgtttt ttactgaata 7080

aatggaaata atattgctca gtattagcat catattcccg cgcgccaatt gagctcccct 7140

ttctatgtat gttttttact agtcatttaa aacgatacat taataggtac gaaaaagcaa 7200

ctttttttgc gcttaaaacc agtcatacca ataacttaag ggtaactagc ctcgccggca 7260

atagttaccc ttattatcaa gataagaaag aaaaggattt ttcgctacgc tcaaatcctt 7320

taaaaaaaca caaaagacca cattttttaa tgtggtcttt tattcttcaa ctaaagcacc 7380

cattagttca acaaacgaaa attggataaa gtgggatatt tttaaaatat atatttatgt 7440

tacagtaata ttgactttta aaaaaggatt gattctaatg aagaaagcag acaagtaagc 7500

ctcctaaatt cactttagat aaaaatttag gaggcatatc aaatgaaatt taataaaatt 7560

gatttagaca attggaagag aaaagagata tttaatcatt atttgaacca acaaacgact 7620

tttagtataa ccacagaaat tgatattagt gttttatacc gaaacataaa acaagaagga 7680

tataaatttt accctgcatt tattttctta gtgacaaggg tgataaactc aaatacagct 7740

tttagaactg gttacaatag cgacggagag ttaggttatt gggataagtt agagccactt 7800

tatacaattt ttgatggtgt atctaaaaca ttctctggta tttggactcc tgtaaagaat 7860

gacttcaaag agttttatga tttatacctt tctgatgtag agaaatataa tggttcgggg 7920

aaattgtttc ccaaaacacc tatacctgaa aatgcttttt ctctttctat tattccatgg 7980

acttcattta ctgggtttaa cttaaatatc aataataata gtaattacct tctacccatt 8040

attacagcag gaaaattcat taataaaggt aattcaatat atttaccgct atctttacag 8100

gtacatcatt ctgtttgtga tggttatcat gcaggattgt ttatgaactc tattcaggaa 8160

ttgtcagata ggcctaatga ctggctttta taatatgaga taatgccgac tgtacttttt 8220

acagtcggtt ttctaatgtc actaacctgc cccgttagtt gaagaaggtt tttatattac 8280

agctccagat ccatatcctt ctttttctga accgacttct cctttttcgc ttctttattc 8340

caattgcttt attgacgttg agcctcggaa ccggtaccca ggaaacagct atgaccatgt 8400

aatacgactc actatacggg gatatcgtcg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 8460

gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 8520

aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 8580

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 8640

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 8700

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg 8760

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 8820

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 8880

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 8940

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 9000

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 9060

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc 9120

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 9180

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 9240

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 9300

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 9360

gcgggactct ggggttcgag agctcgcttg gactcctgtt gatagatcca gtaatgacct 9420

cagaactcca tctggatttg ttcagaacgc tcggttgccg ccgggcgttt tttattggtg 9480

agaatccaag cactagtcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 9540

tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 9600

tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 9660

ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 9720

cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 9780

ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 9840

gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 9900

tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 9960

gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 10020

ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 10080

tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 10140

ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 10200

tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttgtcga c 10241

<210> 2

<211> 75

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 2

gaccagaggt ctccacatac ccatggtcta gaatgctcga gtcagaaaaa tatacctgta 60

tcttttttca aaagc 75

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 3

gaccagaggt ctccgtgata tgtcctcctc tcttc 35

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 4

gaccagaggt ctcgtcacat ggataagaaa tactcaatag gc 42

<210> 5

<211> 94

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 5

gaccagaggt ctcgcgtcgg gaaaactgtc catacccatg ggtatttacc acaacagtac 60

gccaaccagc catcagtcac ctcctagctg actc 94

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 6

gaccagaggt ctcggacgtc taagaaacca ttattatca 39

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 7

gaccagaggt ctcgggtaac caagataaca aagaataca 39

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 8

gaccagaggt ctcgtacccg tcttcttaat atgcgtaatt g 41

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 9

gaccagaggt ctcgcgatat ccccgtatag tgagtc 36

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 10

gaccagaggt ctccatcgtc ggaattgcca gctgg 35

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 11

gaccagaggt ctccatgtcg acaacgcagg aaagaacatg tgagc 45

<210> 12

<211> 196

<212> DNA

<213>全合成DNA

<400> 12

cctgcgttgt cgacagagtt tgcaaaatat acaggggatt atatataatg gaaacgagac 60

cattggtctc agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa 120

cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttgagatc tgtccatacc catggtctag 180

aatgctcgag tcagaa 196

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

tgtctacaaa gttgcagcga 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 14

gaaatgtcta caaagttgca gcga 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 15

aaactcgctg caactttgta gaca 24

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 16

tttgagatct gtccataccc atggtctaga 30

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 17

aagatacagg tatatttttc tgactcgag 29

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 18

cacaaataaa ctcggatgaa gc 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 19

acattcacat ccttatggct 20

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 20

taagataata aagtcagtta acggc 25

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 21

ccattatggg ataacgctga a 21

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 22

tttgagatct gtccataccc atggtctaga cacaaataaa ctcggatgaa gc 52

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 23

gttaactgac tttattatct taacattcac atccttatgg ct 42

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 24

agccataagg atgtgaatgt taagataata aagtcagtta acggc 45

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 25

aagatacagg tatatttttc tgactcgagc cattatggga taacgctgaa 50

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 26

atgtttgata gcgcgtcctt 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 27

agtccgatga gagatgcaca 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 28

ggtgaaggtc gtggtttagg 20

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 29

gaaaaatgat agaagaaaag ccta 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 30

aaactaggct tttcttctat catt 24

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 31

gattatcagt tgcgagggca atttacatag gcttttcttc tatcattata taattttta 59

<210> 32

<211> 59

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 32

taaaaattat ataatgatag aagaaaagcc tatgtaaatt gccctcgcaa ctgataatc 59

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 33

aacgtcttcg ctactcgcca tacattcaca tccttatggc t 41

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 34

agccataagg atgtgaatgt atggcgagta gcgaagacgt t 41

<210> 35

<211> 52

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 35

gccgttaact gactttatta tcttattaag caccggtgga gtgacgacct tc 52

<210> 36

<211> 52

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 36

gaaggtcgtc actccaccgg tgcttaataa gataataaag tcagttaacg gc 52

<210> 37

<211> 678

<212> DNA

<213>全基因合成RFP蛋白基因序列

<400> 37

atggcgagta gcgaagacgt tatcaaagag ttcatgcgtt tcaaagttcg tatggaaggt 60

tccgttaacg gtcacgagtt cgaaatcgaa ggtgaaggtg aaggtcgtcc gtacgaaggt 120

acccagaccg ctaaactgaa agttaccaaa ggtggtccgc tgccgttcgc ttgggacatc 180

ctgtccccgc agttccagta cggttccaaa gcttacgtta aacacccggc tgacatcccg 240

gactacctga aactgtcctt cccggaaggt ttcaaatggg aacgtgttat gaacttcgaa 300

gacggtggtg ttgttaccgt tacccaggac tcctccctgc aagacggtga gttcatctac 360

aaagttaaac tgcgtggtac caacttcccg tccgacggtc cggttatgca gaaaaaaacc 420

atgggttggg aagcttccac cgaacgtatg tacccggaag acggtgctct gaaaggtgaa 480

atcaaaatgc gtctgaaact gaaagacggt ggtcactacg acgctgaagt taaaaccacc 540

tacatggcta aaaaaccggt tcagctgccg ggtgcttaca aaaccgacat caaactggac 600

atcacctccc acaacgaaga ctacaccatc gttgaacagt acgaacgtgc tgaaggtcgt 660

cactccaccg gtgcttaa 678

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 38

actgcgtggt accaacttcc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 39

aaaattgcgc cataggattg 20

<210> 40

<211> 51

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 40

catggataag aaatactcaa taggcttagc tatcggcaca aatagcgtcg g 51

<210> 41

<211> 54

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 41

gtctttaagg aaactttgtg gaacaatggc atcgacatca taatcactta aacg 54

<210> 42

<211> 54

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 42

cgtttaagtg attatgatgt cgatgccatt gttccacaaa gtttccttaa agac 54

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 43

cgattatgtc ttttgcgcag tc 22

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 44

cgcaccagcg aaaactggt 19

<210> 45

<211> 51

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 45

ccgacgctat ttgtgccgat agctaagcct attgagtatt tcttatccat g 51

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 46

gaaagtcatg ttgttttcct ccta 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 47

aaactaggag gaaaacaaca tgac 24

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 48

acgtggataa cctacctata agactgggat 30

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 49

taccttacca actagctaat gcagcg 26

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 50

tcacagactc attgcccatt 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 51

caccgatgca tagcagtgtt 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 52

gcagacagcc aacaagtcaa 20

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213>人工合成引物

<400> 53

gcattgttta acacggtttg g 21

Claims

1.一种pCasSA质粒，其序列为SEQ ID NO：1。

2.权利要求1所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因敲除中的应用。

3.如权利要求2所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因敲除中的应用，其特征在于，所述的基因为agrA基因。

4.权利要求1所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的单碱基突变中的应用。

5.如权利要求4所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的单碱基突变中的应用，其特征在于，所述的单碱基突变为agrA基因中94位的鸟嘌呤G突变成胸腺嘧啶T。

6.权利要求1所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因插入中的应用。

7.如权利要求6所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因插入中的应用，其特征在于，金黄色葡萄球菌株的agrA基因作为插入位点，以红色荧光蛋白的rfp基因为插入基因。

8.权利要求1所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因转录抑制中的应用。

9.如权利要求8所述的pCasSA质粒在实现金黄色葡萄球菌株的基因转录抑制中的应用，其特征在于，所述的基因为agrA基因和/或sasE基因。

10.含有权利要求1所述的pCasSA质粒的大肠杆菌DH10B菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC M2016773。