CN111534522B - 小麦TaRDR6基因及其在雄性不育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦TaRDR6基因及其在雄性不育中的应用。本发明是通过将构建的具有敲除TaRDR6基因功能的表达载体pBUE411‑RDR6转入小麦内，沉默小麦中TaRDR6基因的表达，可以获得花粉败育的小麦植株。通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平RDR6基因的沉默，是利用基因工程技术沉默RDR6基因的有力工具。沉默该基因可以帮助研究人员进一步了解小麦中RDR6在phasiRNA合成路径中是如何具体发挥作用和行使其生物学功能。

Description

小麦TaRDR6基因及其在雄性不育中的应用

技术领域

本发明涉及小麦TaRDR6基因及其在雄性不育中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

在古细菌和细菌原核生物中，CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)/(CRISPR-associated 9)系统是用来对抗外源的DNA如入侵的病毒等的一种适应性免疫防御机制。CRISPR/Cas9系统是由sgRNA(small guide RNA)和Cas9核酸酶两种元件组成。sgRNA通过碱基互补配对来识别基因组中相对应的靶位点序列，从而引导Cas9核酸酶对靶位点序列进行切割，造成DNA双链的断裂，生物体在通过同源或者非同源重组进行DNA修复，在修复过程中会引入DNA序列的定点突变。因此，该项技术已经被广泛的应用于疾病的基因治疗和农作物的基因改良。小麦是异源六倍体作物，由A、B和D三套基因组组成，这三套基因组的部分同源基因具有很高的部分同源性，这些部分同源基因只有同时发生突变，才能获得基因敲除的突变体。因此，在部分同源基因间的保守区域设计sgRNA，可以实现同时敲除所有部分同源基因。

PhasiRNA主要参与植物的生长发育、生殖发育和抗逆反应等方面(Deng etal.2018)。具有一定相位的phasiRNA(Phased small-interfering RNAs)，多数长21-nt或者24-nt。他们是由PHAS基因(phasiRNAproducing genes)或者位点产生的。在小麦幼穗和花药组织中存在大量的21-nt和24-nt的phasiRNA，在不同发育时期的雄蕊组织中phasiRNA呈现动态的表达，表达高峰期出现在花粉母细胞减数分裂的前后(Zhang et al.2020)。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供小麦TaRDR6基因及其应用。本发明是通过将构建的具有敲除TaRDR6基因功能的表达载体pBUE411-RDR6转入小麦内，沉默小麦中TaRDR6基因的表达，可以获得花粉败育的小麦植株。

小麦TaRDR6基因，位于第三号染色体的3B和3D上，分别命名为TaRDR6-3B和TaRDR6-3D，所述TaRDR6-3B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TaRDR6-3D的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种利用上述小麦TaRDR6基因构建雄性不育的小麦植株的方法，降低或沉默小麦中小麦TaRDR6基因的表达。

进一步的，上述方法中所述降低或沉默小麦中小麦TaRDR6基因的表达，具体包括如下步骤：

1)设计靶向TaRDR6基因的sgRNA；

2)根据步骤1)获得的sgRNA设计sgRNA的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

3)利用步骤2)获得的扩增产物和pBUE411载体构建具有敲除小麦TaRDR6基因功能的pBUE411-RDR6双元载体；

4)利用农杆菌介导将步骤3)获得的双元载体转化入植物中，降低或沉默小麦TaRDR6基因的表达，即可获得花粉败育的小麦植株。

进一步的，上述方法步骤1)中所述的TaRDR6基因的sgRNA的核苷酸序列SEQ IDNO.3所示。

进一步的，上述步骤3)中所述的具有敲除小麦TaRDR6基因功能的pBUE411-RDR6双元载体，包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A自上游至下游具体依次包括如下元件：所述来自小麦的TaU3启动子A，所述TaRDR6基因的sgRNA和终止子A；

所述表达盒B自上游至下游依次具体包括如下元件：所述启动子B、所述玉米Cas9编码序列、所述终止子B。

进一步的，上述玉米Cas9编码序列如SEQ ID NO.4所示；上述启动子A的序列如SEQID NO.5所示；上述启动子B序列如SEQ ID NO.6所示；上述终止子A序列如SEQ ID NO.7所示；上述终止子B序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步的，上述表达盒A位于上述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。

进一步的，所述pBUE411-RDR6双元载体还含有抗性标记基因，如bar基因；所述pBUE411-RDR6双元载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步的，上述步骤2)中所述的sgRNA的扩增引物为RDR6-gR1-TaU3-F和RDR6-gR1-TaU3-R，RDR6-gR1-TaU3-F序列如SEQ ID NO.10所示，RDR6-gR1-TaU3-R序列如SEQ IDNO.11所示。

TaRDR6基因参与21-nt和24-nt phasiRNA的生物合成过程，因此，TaRDR6基因的缺失可能会影响小麦花粉的育性。在小麦中TaRDR6基因有两个拷贝，位于3B和3D染色体上，分别命名为TaRDR6-3B和TaRDR6-3D。

本发明通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现TaRDR6基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦TaRDR6基因。TaRDR6基因在小麦中位于第三号染色体的3B和3D上，分别命名为TaRDR6-3B和TaRDR6-3D。其基因组序列在3B和3D上的全长分别为4697和4689个碱基，这两个部分同源基因均由2个外显子和1个内含子组成。TaRDR6-3B和TaRDR6-3D分别含3654和3639个碱基的开放阅读框，分别编码一段含1218和1213个氨基酸残基的多肽链。这两个部分同源基因之间编码区的相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述两个位点的TaRDR6基因提供了理论依据。

有益效果：

在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平TaRDR6基因的沉默，是利用基因工程技术沉默TaRDR6基因的有力工具。沉默该基因可以帮助研究人员进一步了解小麦中TaRDR6在phasiRNA合成路径中是如何具体发挥作用和行使其生物学功能。

附图说明

图1 pBUE411载体BsaI酶切电泳图。

图2 Bar试纸条检测转基因小麦植株。

图3 rdr6不育突变体和对照JW1的花药、灌浆期籽粒和穗子的表型

图4 rdr6不育突变体(B)和对照JW1(A)的花粉颗粒表型。

图5 rdr6不育突变体和对照材料JW1的四分体时期幼穗中的小分子RNA长度分布。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PCR扩增所需的高保真酶、DNA片段连接所需的T4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411,含有小麦U3启动子TaU3，用以启动sgRNA，Cas9p模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物优化密码子基因。本实验室所用的大肠杆菌菌株是E.coli DH5α。

T4连接酶、DNA Marker DL2000等试剂购自Takara公司；FastPfu、2*Taq Mix、DH5α等购自北京全式金公司；限制性内切酶BsaI-HF购自NEB公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，序列如下：

表1本研究中使用的引物

小麦品种JW1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得。

质粒pBUE411(17430bp)由中国农业大学孙其信课题组提供；公众可从中国农业大学获得。

实验例1表达载体的构建

1.靶向TaRDR6的sgRNA的设计

通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在RDR6基因的编码区寻找1个适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，sgRNA序列选定为GGGATGACCATTCTGAGGTG。

2.sgRNA的退火及双链的形成

TaRDR6基因的sgRNA的2条oligo是由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，其中sgRNA的寡核苷酸对应的是RDR6-gR1-TaU3-F和RDR6-gR1-TaU3-R(表1)，引物中的下划线碱基部分是与pBUE411载体中的序列匹配。分别将sgRNA的2条oligo进行磷酸化，直接退火形成双链，体系为：RDR6-gR1-TaU3-F(10μM)：4μL,RDR6-gR1-TaU3-R(10uM)：4μL,10×T4 PNKbuffer:1.5μL,PNK:1μL,ATP:1μL,ddH₂O补足15μL。程序在PCR仪中按下列条件运行：37℃,30min；95℃,5min；ramp to 25℃at 5℃/min(0.08℃/s)。或者是沸水中煮5min，之后自然冷却至室温。

3.pBUE411载体的线性化

用BsaI的内切酶酶切pBUE411载体3h如图1所示，1为pBUE411用BsaI酶切；2为DL2000 Marker；3为1kb Marker，电泳后回收线性载体片段，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；。

4.pBUE411载体与sgRNA的连接反应

连接反应体系为：5×ligation Buffer 2μL，annealed oligo duplex 4μL，pBUE411/BsaI 2ul(100ng)，T4 ligase 1μL，ddH₂O补足10μL，25℃30min进行连接反应。

5.转化验证

将连接产物转化大肠杆菌，重组质粒经转化到DH5α感受态细胞，之后于LB(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液PCR鉴定及测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。在靶序列上游都检测到了TaU3启动子序列和sgRNA序列，说明sgRNA表达盒构建成功，并成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了TaRDR6的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。

实验例2基因编辑载体的转化普通小麦

1.培养基配制：见文献Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in Molecular Biology,vol.1223 DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,SpringScience+Businedd Media New York 2015

2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28度培养24小时，穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23度暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25度。将愈伤转移至筛选培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上。

用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。

糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。

封好培养皿，放到25度培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。

3.转基因苗的突变体检测

3.1 T0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选

由于此次转化所用载体上T-DNA区域有cas9、bar和sgRNA三个表达框，其中bar基因的表达检测已经非常成熟，已经有商业化的检测试剂条，样品经过粗磨后用试剂条在10分钟内就可以判断是否带有bar基因，比PCR扩增快速高效。因此，我们以未转基因植株作为阴性对照，利用bar基因检测试剂盒quickstix^TM对转基因小麦T0植株进行检测，具体操作如下：

取转基因苗3-5cm,放入1.5m离心管中，用研磨棒研磨后加入Buffer 500μL，插入Bar试纸条，静置5min，根据试条显示带数纪录数据，2条带表示阳性，1条带代表阴性。上述试剂盒购自麦蒂森科技有限公司。

筛选阳性转基因苗子结果如图2所示，样品1-9为T0代再生苗，10为阴性对照，11为阳性对照，其中样品1,2,3，4，6,7,8,9出现两条带，与阳性对照11结果一致，为阳性苗；1-9分别代表RDR6-01，-02，-03，-04，-05，06，-07，-08，-09。

3.2 T0代转基因植株TaRDR6基因的特异性扩增和突变体鉴定

目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用天津诺禾致源公司生产的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒。该试剂盒通过PCR法自动完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的Primer-F和Primer-R)对RDR6进行扩增，扩增产物建库后送到诺禾致源测序。目的基因小麦RDR6基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，其推导的氨基酸序列如下所示：

>TaRDR6-3B-WT

MGPPRAGDLVTTQVSLGGFDAAVRARDLADFLELEAGPVWRCRVKTSTTPQDADPDFLLPAAAAAAALDPGQAQQRLVPVPPHAFVHFARPEAARRAADAAGRCELILSGKPLRAASAPDSALRASRRRGVAPFRFPGSRLEVGDLPAPDAFLAAWRCPGPDDGAGGLEFAVDPFDGSCRFVFARDTAFAFRELREAAVVMRCDVKLEFPVRDVAEVRVFKLDCSLLLRLSAAPLVYYRTADDDIYESVPFDLLDDDDPWIRTTDITPSGAIGRCGVYRITIPARFWSKMERALAYMKERRVTVVECGGGWGARRRGLTVRDEPEFGERMQDLFFCVQHAEGIKFPALFLVNALVHKGVINQHQLTPEFFGLLLGREEDVNVAALKEFWGIKFPVFDACRRLKNLQDRVARNPKLLNSKIGDDHSEVRRLVITPTRAYCLPPQVERSNRVVRHYCVVADRFLRVTFMDEGMQQLNSNVLNFSAAQIVKDLMSNSFLQHKTTVYKRVKTFLTEGFHMCGRKYSFLAFSSNQLRDRSAWFFAEDRTDRTRTVESIRKWMGRFTSKNVAKHTARMGQCFSSTYATVVMQPHEVNECLEDVERNGYVFSDGIGKITQELALEVAKKLQLTDNPPSAYQIRYAGFKGVIAVWEGENDGIQLSLRPSMHKFDSSHTVLEVVSWTKFQPGFLNRQIITLLSSLNVPDAIFSQMQKDMLSNLNNILTDTDVAFDVVTTSCADEGNTAALMLSAGISPGTEPHLKALLLAIRSSQLLGLLEKSRIFVPKGRWLMGCLDELGILEQGQCFIRASSPVLNNSLLKHAPRSSSENNNAETVIGTVVMAKNPCLHPGDVRILEAIDVPALHHLVDCLVFPKNGERPHANEASGSDLDGDLYFVTWDEKLIPPGKRSWNPMDYSPAEAKQLPRKVTQSDIVDFFLKNMVNEKLGPISNAHVVHADMSEYGAMDEKCIQLAELAAFAVDFPKTGKIVSMPPALRPKLYPDFMGKDDAISYKSEKILGRLYRSIQEASSSDLVPEETCTLNDLPYDTDMEVPGAADFLSSAWQCKCSYEAQLDALLKQYGVRTEAELVTEHIWSLPKYNSRKQGDIKERLKNAYSALRKEFRAIFESVEAGLDEDERNRVYEMKASAWYQVTYHPKWVQRSREALEPDREEEDAPARLSFAWIPVEHLARIKLRCRGGVKVGRRGPVERLAAYMSWSL*

>TaRDR6-3D-WT

MGAPRAGDLVTTQVSLGGFDAAVRARDLADFLEVEAGPVWRCRVKTSTTPQDADPDFLLPAAAAAAALDPGQAQQRLVPVPPHAFVHFARPEAARRAADAAGRCELILSGKPLRAASAPDSALRASRRRGVAPFRFPGSRLEVGDLPAPDAFLAAWRCPGPDDGAGGLEFAVDKFDGSCRLVFARDTAFAFRELREAAVVMRCDVKLEFPVRDVAEVRVFKLDCSLLLRLSAAPLVYYRTADDDIYESVPFDLLDDDDPWIRTTDITPSGAIGRCGVYRITFPARFWSKMERALAYMKERRVTVVECGGGWGARRGLTVRDEPEFGERMQDLFFCVQHAEGIKFPVLFLVNALVHKGVINQHQLTPEFYSLLQGREEDVNVAALKEFWGIKFPVFDACRSLKNLQDRVARNPKLLNSKIGDDHSEVRRLVITPTRAYCLPPQVERSNRVVRHYRVVADRFLRVTFMDEGMQQLNSNVLNFSAAQIVKDLMSNSFLQHKTTVYKRVKTFLTEGFHMCGRKYSFLAFSSNQLRDRSAWFFAEDRTDRTRTVESIRKWMGRFTSKNVAKHTARMGQCFSSTYATVVMQPHEVNECLEDVERNGYVFSDGIGKITRELALEVAKKLQLTDNPPSAYQIRYAGFKGVIAVWEGENDGIQLSLRPSMHKFDSSHTVLEVVSWTKFQPGFLNRQIITLLSSLNVPDAIFSQMQKDMLSNLNNILTDTDVAFDVVTTSCADEGNTAALMLSAGISPGTEPHLKALLLAIRSSQLLGLLEKSRIFVPKGRWLMGCLDELGILEQGQCFIRASSPVLNNSLLKHGPRSSSANNNAETVKGTVVMAKNPCLHPGDVRILEAIDVPALHHLVDCLVFPKNGERPHANEASGSDLDGDLYFVTWDEKLIPPGKRSWNPMDYSPAEAKQLPRKVTQSDIVDFFLKNMVNEKLGPISNAHVVHADMSEYGAMDEKCIQLAELAAFAVDFPKTGKIVSMPPALRPKLYPDFMGKDDAISYKSEKILGRLYRSIQEASSSDLVPEETCTLNDLPYDTDMEVPGAADFLSSAWQCKCSYEAQLDALLKQYGVRTEAELVTEHIWSLPKYNSRKQGDIKERLKNAYSALRKEFRAIFESIEAPGQTEAVLDDDERNRVYEMKASAWYQVTYHPKWVQRSREALEPDREEEDAPARLSFAWIPVEHLARIKLRCRGGVKVGRRRPVERLAAYMSGSL*

突变体测序后也可获得目的基因核苷酸序列，其推导的氨基酸序列如下所示：

>TaRDR6-3B-M

MTILRVRRLVITPTRAYCLPPQVERSNRVVRHYCVVADRFLRVTFMDEGMQQLNSNVLNFSAAQIVKDLMSNSFLQHKTTVYKRVKTFLTEGFHMCGRKYSFLAFSSNQLRDRSAWFFAEDRTDRTRTVESIRKWMGRFTSKNVAKHTARMGQCFSSTYATVVMQPHEVNECLEDVERNGYVFSDGIGKITQELALEVAKKLQLTDNPPSAYQIRYAGFKGVIAVWEGENDGIQLSLRPSMHKFDSSHTVLEVVSWTKFQPGFLNRQIITLLSSLNVPDAIFSQMQKDMLSNLNNILTDTDVAFDVVTTSCADEGNTAALMLSAGISPGTEPHLKALLLAIRSSQLLGLLEKSRIFVPKGRWLMGCLDELGILEQGQCFIRASSPVLNNSLLKHAPRSSSENNNAETVIGTVVMAKNPCLHPGDVRILEAIDVPALHHLVDCLVFPKNGERPHANEASGSDLDGDLYFVTWDEKLIPPGKRSWNPMDYSPAEAKQLPRKVTQSDIVDFFLKNMVNEKLGPISNAHVVHADMSEYGAMDEKCIQLAELAAFAVDFPKTGKIVSMPPALRPKLYPDFMGKDDAISYKSEKILGRLYRSIQEASSSDLVPEETCTLNDLPYDTDMEVPGAADFLSSAWQCKCSYEAQLDALLKQYGVRTEAELVTEHIWSLPKYNSRKQGDIKERLKNAYSALRKEFRAIFESVEAGLDEDERNRVYEMKASAWYQVTYHPKWVQRSREALEPDREEEDAPARLSFAWIPVEHLARIKLRCRGGVKVGRRGPVERLAAYMSWSLX

>TaRDR6-3D-M

MSMWLHSRNSGGSNFRSLMRAGVSRICRTGLPETPNSLTARLGMTILRVRRLVITPTRAYCLPPQVERSNRVVRHYRVVADRFLRVTFMDEGMQQLNSNVLNFSAAQIVKDLMSNSFLQHKTTVYKRVKTFLTEGFHMCGRKYSFLAFSSNQLRDRSAWFFAEDRTDRTRTVESIRKWMGRFTSKNVAKHTARMGQCFSSTYATVVMQPHEVNECLEDVERNGYVFSDGIGKITRELALEVAKKLQLTDNPPSAYQIRYAGFKGVIAVWEGENDGIQLSLRPSMHKFDSSHTVLEVVSWTKFQPGFLNRQIITLLSSLNVPDAIFSQMQKDMLSNLNNILTDTDVAFDVVTTSCADEGNTAALMLSAGISPGTEPHLKALLLAIRSSQLLGLLEKSRIFVPKGRWLMGCLDELGILEQGQCFIRASSPVLNNSLLKHGPRSSSANNNAETVKGTVVMAKNPCLHPGDVRILEAIDVPALHHLVDCLVFPKNGERPHANEASGSDLDGDLYFVTWDEKLIPPGKRSWNPMDYSPAEAKQLPRKVTQSDIVDFFLKNMVNEKLGPISNAHVVHADMSEYGAMDEKCIQLAELAAFAVDFPKTGKIVSMPPALRPKLYPDFMGKDDAISYKSEKILGRLYRSIQEASSSDLVPEETCTLNDLPYDTDMEVPGAADFLSSAWQCKCSYEAQLDALLKQYGVRTEAELVTEHIWSLPKYNSRKQGDIKERLKNAYSALRKEFRAIFESIEAPGQTEAVLDDDERNRVYEMKASAWYQVTYHPKWVQRSREALEPDREEEDAPARLSFAWIPVEHLARIKLRCRGGVKVGRRRPVERLAAYMSGSLX

经比对，RDR6-07在TaRDR6-3B的CDS序列的+1279位插入了1个碱基G，造成CDS区从第4-1278位的1287个核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失2-426位的429个氨基酸序列；

RDR6-07在TaRDR6-3D的CDS序列的+1276位插入了1个碱基G，造成CDS区从第4-1275位的1131个核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失2-425位的377个氨基酸序列。

第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-RDR6基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL,Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。

之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。

4 rdr6基因编辑突变体的表型检测

4.1 rdr6基因编辑株系后代穗部表型检测

挑选rdr6基因编辑株系7后代材料和未转基因株JW1材料，进行了温室种植。在rdr6基因编辑材料中，在T0代中没有观察到不育的表型。在T1代第7株系的8颗苗中，均表现为不育或者半不育(部分分蘖可育，部分分蘖表现为完全不育)。rdr6不育突变体的花药表型与对照JW1相比，比较瘦小(图3中的A)，散粉后籽粒不发育(图3中的B)。rdr6不育突变体株系的穗子与对照JW1相比没有明显差异(图3中的C)。

4.2 TaRDR6基因编辑株系后代花粉表型检测

对照JW1的花粉(图4中的A)，用碘化钾染色后，在显微镜下可观察到黑紫色的饱满的圆形颗粒。与对照相比，rdr6不育突变体的花粉(图4中的B)用碘化钾染色后，多数颗粒表面凹陷、不饱满，呈黄色，这样的花粉没有受精能力，花粉表现为败育，导致籽粒灌浆不能进行。从花粉的数量上，rdr6不育突变体的花粉量明显的少于对照。

4.3 rdr6基因编辑突变体影响到21-nt小分子RNA的合成

目前，rdr6不育突变体材料四分体时期的幼穗进行了小分子RNA测序。分析发现，突变体材料中21-nt小分子RNA在数量和占总小分子RNA的比例上都显著少于野生型JW1(图5)(Fisher’s exactly test,P-value<2.2e-16)。这说明RDR6基因在小麦中影响了21-nt小分子RNA的生物合成。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院作物研究所

<120> 小麦TaRDR6基因及其在雄性不育中的应用

<130> 2020

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3639

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

atggggccgc cgcgcgccgg cgacctggtg accacgcagg tcagcctggg cgggttcgac 60

gccgccgtcc gggcgcgcga cctcgccgac ttcctcgagc tcgaggcggg ccccgtctgg 120

cgctgccgcg tcaagacctc cacgaccccg caggacgcgg accccgactt cctcctcccc 180

gccgccgccg ccgccgccgc cctcgacccc ggccaggcgc agcagcggct cgtccccgtg 240

ccgccgcacg ccttcgtcca cttcgcgcgc ccggaggcgg cccgccgcgc cgccgacgcc 300

gccggccgct gcgagctcat cctctccggg aagccgctcc gcgccgcctc cgcgcccgac 360

agcgcgctcc gggcctcccg ccgccgcggc gtcgcgccgt tccgcttccc cgggtcccgc 420

ctcgaggtcg gcgacctccc cgcccccgac gccttcctcg ccgcctggcg ctgccccggc 480

ccggacgacg gcgccggcgg gctcgagttc gccgtcgacc cgttcgacgg ctcctgccgc 540

ttcgtcttcg cccgcgacac cgccttcgcg ttcagggaac tccgcgaggc cgccgtcgtc 600

atgcgctgcg acgtcaagct cgagttcccc gtccgcgacg tcgccgaggt cagggtgttc 660

aagctcgact gctcgctgct gctccggctc tcggcggcgc cgctcgtcta ctaccgcacg 720

gcggacgacg acatctacga gtccgtgccg ttcgacctgc tcgacgacga cgacccgtgg 780

atccggacca ccgacatcac ccccagcggt gccatcgggc ggtgcggcgt ttacaggatc 840

acaatcccgg cgcggttctg gtccaagatg gagcgcgcgc tggcctacat gaaggagagg 900

agggtgaccg tcgtcgagtg cggcggtggg tggggggcca ggaggagggg gctcaccgtg 960

cgtgacgagc ccgagtttgg ggagcggatg caggacctct tcttctgcgt gcagcacgcc 1020

gaggggatca agtttccggc gctgttcctc gtgaacgcgc tggtgcacaa gggagtgatc 1080

aatcagcacc agctcacgcc tgaattcttc ggtttgctcc tggggaggga ggaggatgtc 1140

aatgtggctg cactcaagga attctggggg atcaaattcc cggtcttcga tgcgtgccgg 1200

aggctgaaga atctgcagga cagggttgcc agaaacccca aactccttaa cagcaagatt 1260

ggggatgacc attctgaggt gaggaggctg gtgatcacgc ccaccagggc gtattgcctg 1320

ccgccgcaag tggagcgctc taaccgtgtt gtccggcatt attgcgtagt cgcggacagg 1380

ttcctcaggg taacttttat ggatgagggc atgcagcaac tcaacagcaa tgtgctgaat 1440

ttctctgctg ctcagatcgt caaggatttg atgtcaaact cgttcctgca gcataagaca 1500

acagtgtaca agcgtgttaa gacatttttg acagaaggtt tccacatgtg tggccggaaa 1560

tactcgtttc ttgcattctc atcaaaccag ctgagggaca gatctgcctg gttctttgca 1620

gaggacagaa cggacagaac gagaactgta gaaagcatca ggaaatggat gggccggttc 1680

acaagtaaga atgtagcaaa gcatactgct cggatggggc agtgcttctc atcgacatat 1740

gcaacggtgg tgatgcagcc acatgaggtc aatgagtgtc ttgaggatgt tgaacgtaat 1800

gggtacgttt tctctgatgg aatcggcaag attacccagg aacttgcact ggaagtcgct 1860

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agcatgcaca agtttgactc ttcccacact gtgttagagg tggtctcatg gacaaagttt 2040

cagccaggat tcttaaaccg tcagatcatt acattactct cctccttgaa tgtcccggat 2100

gctatctttt cacaaatgca gaaagacatg ctgtctaatc tcaacaatat tttgactgac 2160

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<210> 2

<211> 3654

<212> DNA

<213> 序列

<400> 2

atgggggcgc cgcgcgccgg cgacctggtg accacgcagg tcagcctggg cgggttcgac 60

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ctcagagtaa cttttatgga tgagggtatg cagcaactca acagcaatgt gctgaatttc 1440

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gtgtacaagc gtgtcaagac atttttgaca gagggtttcc acatgtgcgg ccgtaaatac 1560

tcgtttcttg cattctcatc aaaccagctg agggacagat ctgcctggtt ctttgcagag 1620

gacagaacgg acagaacgag aacggtcgaa agcattagga aatggatggg ccggttcaca 1680

agtaagaatg tagcaaagca tactgctcgg atggggcagt gcttctcatc gacatatgca 1740

acggtggtga tgcagccaca tgaggtcaat gagtgtcttg aggatgttga gcgtaatggg 1800

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agggaggcgc tggagcctga ccgcgaggag gaggacgcgc cggcgaggct tagctttgcg 3540

tggatcccgg tggagcacct ggcgcggatc aagttacggt gccgtggggg agtgaaggtg 3600

ggccgccgga ggcccgtcga gaggctcgct gcctacatgt ctgggagcct gtga 3654

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 4107

<212> DNA

<213> 序列

<400> 4

atggacaaga agtactcgat cggcctcgat attgggacta actctgttgg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gccctcaaag aagttcaagg tcctgggcaa caccgatcgg 120

cattccatca agaagaatct cattggcgct ctcctgttcg acagcggcga gacggctgag 180

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gttaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aagattgagt gcttcgattc ggtcgagatc 1740

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gcccgcaaga aggactggga tccgaagaag tacggcgggt tcgacagccc cactgtggcc 3420

tactcggtcc tggttgtggc gaaggttgag aagggcaagt ccaagaagct caagagcgtg 3480

aaggagctgc tggggatcac gattatggag cgctccagct tcgagaagaa cccgatcgat 3540

ttcctggagg cgaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcattaa gctccccaag 3600

tactcactct tcgagctgga gaacggcagg aagcggatgc tggcttccgc tggcgagctg 3660

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<212> DNA

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tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

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cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840

ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 900

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ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020

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tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380

agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440

gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1500

ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1560

gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1620

aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680

catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1740

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gcacacacca gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg 180

taccatttgt tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt 240

gaaatggaaa tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa 300

ttaatattat ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata 360

tgcaaacatt ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta 420

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caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 180

ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 240

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttcatgaa tccaaaccac acggagttca 300

aattcccaca gattaaggct cgtccgtcgc acaaggtaat gtgtgaatat tatatctgtc 360

gtgcaaaatt gcctggcctg cacaattgct gttatagttg gcggcaggga gagttttaac 420

attgactagc gtgctgataa tttgtgagaa ataataattg acaagtagat actgacattt 480

gagaagagct tctgaactgt tattagtaac aaaaatggaa agctgatgca cggaaaaagg 540

aaagaaaaag ccatactttt ttttaggtag gaaaagaaaa agccatacga gactgatgtc 600

tctcagatgg gccgggatct gtctatctag caggcagcag cccaccaacc tcacgggcca 660

gcaattacga gtccttctaa aagctcccgc cgaggggcgc tggcgctgct gtgcagcagc 720

acgtctaaca ttagtcccac ctcgccagtt tacagggagc agaaccagct tataagcgga 780

ggcgcggcac caagaagcgg cgacggagcc gacgacgtgg aaggttttag agctagaaat 840

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 900

tttttttttc gttttgcatt gagttttctc cgtcgcatgt ttgcagtttt attttccgtt 960

ttgcattgaa atttctccgt ctcatgtttg cagcgtgttc aaaaagtacg cagctgtatt 1020

tcacttattt acggcgccac attttcatgc cgtttgtgcc aactatcccg agctagtgaa 1080

tacagcttgg cttcacacaa cactggtgac ccgctgacct gctcgtacct cgtaccgtcg 1140

tacggcacag catttggaat taaagggtgt gatcgatact gcttgctgct aagcttgcat 1200

gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc 1260

taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc 1320

tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat 1380

aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt 1440

gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt 1500

ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta 1560

gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt 1620

ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga 1680

tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa 1740

aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc 1800

gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca 1860

gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt 1920

ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc 1980

acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg cacggcagct acgggggatt cctttcccac 2040

cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc 2100

tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc 2160

acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac 2220

cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 2280

tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 2340

cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 2400

ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 2460

tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 2520

catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 2580

ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 2640

atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc 2700

taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 2760

tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 2820

agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 2880

tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 2940

tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 3000

ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc 3060

ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 3120

tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 3180

tgttacttct gcagccctag gcctactaga tggattacaa ggaccacgac ggggattaca 3240

aggaccacga cattgattac aaggatgatg atgacaagat ggctccgaag aagaagagga 3300

aggttggcat ccacggggtg ccagctgctg acaagaagta ctcgatcggc ctcgatattg 3360

ggactaactc tgttggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccc tcaaagaagt 3420

tcaaggtcct gggcaacacc gatcggcatt ccatcaagaa gaatctcatt ggcgctctcc 3480

tgttcgacag cggcgagacg gctgaggcta cgcggctcaa gcgcaccgcc cgcaggcggt 3540

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aggttgacga ttctttcttc cacaggctgg aggagtcatt cctcgtggag gaggataaga 3660

agcacgagcg gcatccaatc ttcggcaaca ttgtcgacga ggttgcctac cacgagaagt 3720

accctacgat ctaccatctg cggaagaagc tcgtggactc cacagataag gcggacctcc 3780

gcctgatcta cctcgctctg gcccacatga ttaagttcag gggccatttc ctgatcgagg 3840

gggatctcaa cccggacaat agcgatgttg acaagctgtt catccagctc gtgcagacgt 3900

acaaccagct cttcgaggag aaccccatta atgcgtcagg cgtcgacgcg aaggctatcc 3960

tgtccgctag gctctcgaag tctcggcgcc tcgagaacct gatcgcccag ctgccgggcg 4020

agaagaagaa cggcctgttc gggaatctca ttgcgctcag cctggggctc acgcccaact 4080

tcaagtcgaa tttcgatctc gctgaggacg ccaagctgca gctctccaag gacacatacg 4140

acgatgacct ggataacctc ctggcccaga tcggcgatca gtacgcggac ctgttcctcg 4200

ctgccaagaa tctgtcggac gccatcctcc tgtctgatat tctcagggtg aacaccgaga 4260

ttacgaaggc tccgctctca gcctccatga tcaagcgcta cgacgagcac catcaggatc 4320

tgaccctcct gaaggcgctg gtcaggcagc agctccccga gaagtacaag gagatcttct 4380

tcgatcagtc gaagaacggc tacgctgggt acattgacgg cggggcctct caggaggagt 4440

tctacaagtt catcaagccg attctggaga agatggacgg cacggaggag ctgctggtga 4500

agctcaatcg cgaggacctc ctgaggaagc agcggacatt cgataacggc agcatcccac 4560

accagattca tctcggggag ctgcacgcta tcctgaggag gcaggaggac ttctaccctt 4620

tcctcaagga taaccgcgag aagatcgaga agattctgac tttcaggatc ccgtactacg 4680

tcggcccact cgctaggggc aactcccgct tcgcttggat gacccgcaag tcagaggaga 4740

cgatcacgcc gtggaacttc gaggaggtgg tcgacaaggg cgctagcgct cagtcgttca 4800

tcgagaggat gacgaatttc gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctc cctaagcact 4860

cgctcctgta cgagtacttc acagtctaca acgagctgac taaggtgaag tatgtgaccg 4920

agggcatgag gaagccggct ttcctgtctg gggagcagaa gaaggccatc gtggacctcc 4980

tgttcaagac caaccggaag gtcacggtta agcagctcaa ggaggactac ttcaagaaga 5040

ttgagtgctt cgattcggtc gagatctctg gcgttgagga ccgcttcaac gcctccctgg 5100

ggacctacca cgatctcctg aagatcatta aggataagga cttcctggac aacgaggaga 5160

atgaggatat cctcgaggac attgtgctga cactcactct gttcgaggac cgggagatga 5220

tcgaggagcg cctgaagact tacgcccatc tcttcgatga caaggtcatg aagcagctca 5280

agaggaggag gtacaccggc tgggggaggc tgagcaggaa gctcatcaac ggcattcggg 5340

acaagcagtc cgggaagacg atcctcgact tcctgaagag cgatggcttc gcgaaccgca 5400

atttcatgca gctgattcac gatgacagcc tcacattcaa ggaggatatc cagaaggctc 5460

aggtgagcgg ccagggggac tcgctgcacg agcatatcgc gaacctcgct ggctcgccag 5520

ctatcaagaa ggggattctg cagaccgtga aggttgtgga cgagctggtg aaggtcatgg 5580

gcaggcacaa gcctgagaac atcgtcattg agatggcccg ggagaatcag accacgcaga 5640

agggccagaa gaactcacgc gagaggatga agaggatcga ggagggcatt aaggagctgg 5700

ggtcccagat cctcaaggag cacccggtgg agaacacgca gctgcagaat gagaagctct 5760

acctgtacta cctccagaat ggccgcgata tgtatgtgga ccaggagctg gatattaaca 5820

ggctcagcga ttacgacgtc gatcatatcg ttccacagtc attcctgaag gatgactcca 5880

ttgacaacaa ggtcctcacc aggtcggaca agaaccgggg caagtctgat aatgttcctt 5940

cagaggaggt cgttaagaag atgaagaact actggcgcca gctcctgaat gccaagctga 6000

tcacgcagcg gaagttcgat aacctcacaa aggctgagag gggcgggctc tctgagctgg 6060

acaaggcggg cttcatcaag aggcagctgg tcgagacacg gcagatcact aagcacgttg 6120

cgcagattct cgactcacgg atgaacacta agtacgatga gaatgacaag ctgatccgcg 6180

aggtgaaggt catcaccctg aagtcaaagc tcgtctccga cttcaggaag gatttccagt 6240

tctacaaggt tcgggagatc aacaattacc accatgccca tgacgcgtac ctgaacgcgg 6300

tggtcggcac agctctgatc aagaagtacc caaagctcga gagcgagttc gtgtacgggg 6360

actacaaggt ttacgatgtg aggaagatga tcgccaagtc ggagcaggag attggcaagg 6420

ctaccgccaa gtacttcttc tactctaaca ttatgaattt cttcaagaca gagatcactc 6480

tggccaatgg cgagatccgg aagcgccccc tcatcgagac gaacggcgag acgggggaga 6540

tcgtgtggga caagggcagg gatttcgcga ccgtcaggaa ggttctctcc atgccacaag 6600

tgaatatcgt caagaagaca gaggtccaga ctggcgggtt ctctaaggag tcaattctgc 6660

ctaagcggaa cagcgacaag ctcatcgccc gcaagaagga ctgggatccg aagaagtacg 6720

gcgggttcga cagccccact gtggcctact cggtcctggt tgtggcgaag gttgagaagg 6780

gcaagtccaa gaagctcaag agcgtgaagg agctgctggg gatcacgatt atggagcgct 6840

ccagcttcga gaagaacccg atcgatttcc tggaggcgaa gggctacaag gaggtgaaga 6900

aggacctgat cattaagctc cccaagtact cactcttcga gctggagaac ggcaggaagc 6960

ggatgctggc ttccgctggc gagctgcaga aggggaacga gctggctctg ccgtccaagt 7020

atgtgaactt cctctacctg gcctcccact acgagaagct caagggcagc cccgaggaca 7080

acgagcagaa gcagctgttc gtcgagcagc acaagcatta cctcgacgag atcattgagc 7140

agatttccga gttctccaag cgcgtgatcc tggccgacgc gaatctggat aaggtcctct 7200

ccgcgtacaa caagcaccgc gacaagccaa tcagggagca ggctgagaat atcattcatc 7260

tcttcaccct gacgaacctc ggcgcccctg ctgctttcaa gtacttcgac acaactatcg 7320

atcgcaagag gtacacaagc actaaggagg tcctggacgc gaccctcatc caccagtcga 7380

ttaccggcct ctacgagacg cgcatcgacc tgtctcagct cgggggcgac aagcggccag 7440

cggcgacgaa gaaggcgggg caggcgaaga agaagaagtg agctcagagc tttcgttcgt 7500

atcatcggtt tcgacaacgt tcgtcaagtt caatgcatca gtttcattgc gcacacacca 7560

gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg taccatttgt 7620

tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt gaaatggaaa 7680

tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa ttaatattat 7740

ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata tgcaaacatt 7800

ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta atatgaggag 7860

taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat attttcagac 7920

ctagaaaagc tgcaaatgtt actgaataca agtatgtcct cttgtgtttt agacatttat 7980

gaactttcct ttatgtaatt ttccagaatc cttgtcagat tctaatcatt gctttataat 8040

tatagttata ctcatggatt tgtagttgag tatgaaaata ttttttaatg cattttatga 8100

cttgccaatt gattgacaac gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 8160

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 8220

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 8280

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 8340

ttgcgtattg gctagagcag cttgccaaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca 8400

agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg 8460

taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga 8520

cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg 8580

ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg 8640

tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg 8700

tggagcacga cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 8760

gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa cctcctcgga ttccattgcc 8820

cagctatctg tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga aggtggcacc tacaaatgcc 8880

atcattgcga taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 8940

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 9000

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 9060

cttcgcaaga ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaaa 9120

tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctcgagtcta ccatgagccc agaacgacgc 9180

ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac 9240

cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc gcaggagtgg 9300

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gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg 9420

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tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc 9540

gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc cccccgcggc 9600

atgctgcggg cggccggctt caagcacggg aactggcatg acgtgggttt ctggcagctg 9660

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tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt 9780

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 9840

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcccccg 9900

aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct 9960

aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga 10020

ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagtcc gggacggcgt 10080

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ttgtaacgat gacagagcgt tgctgcctgt gatcaccgcg gtttcaaaat cggctccgtc 10260

gatactatgt tatacgccaa ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta 10320

aggttttaga atgcaaggaa cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg 10380

ggtatcttta aatactgtag aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat 10440

caccggaatt gaaaaaactg atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt 10500

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tggaaggaaa gctgcctgtt ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca 10680

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tatcggattg tccctatacg aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac 10860

tgaataacga tctggccgat gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag 10920

atccgcgcga gctgtatgat tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt 10980

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ttgatcttgg gagaagcggc agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt 11100

cgatcaggga ggatatcggg gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga 11160

tcaagcctga ttgggagaaa ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc 11220

tagaatgcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 11280

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 11340

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 11400

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 11460

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 11520

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 11580

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 11640

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 11700

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gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 11940

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 12000

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 12060

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accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata 12180

cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc 12240

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 12300

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg 12360

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gattgcctgg ccgtaggcca gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg 12480

aagcggcggg gcgtagggag cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg 12540

ctgtgcgctg gccagacagt tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt 12600

ttaaagagtt ttaggcggaa aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt 12660

gtgaccggtt cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt 12720

acggctttgg gttcccaatg tacgtgctat ccacaggaaa cagacctttt cgaccttttt 12780

cccctgctag ggcaatttgc cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt 12840

cgccctcgat caggttgcgg tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct 12900

ccttcaaatc gtactccggc aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga 12960

acttcttgaa ctctccggcg ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg 13020

cttctgcctt gcctgcggcg cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat 13080

cgatcaaaaa gtaatcgggg tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct 13140

cgcggtacat ccaatcagct agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct 13200

ttacgatctt gtagcggcta atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt 13260

tcttggcctt cttcgtacgc tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt 13320

ctaccaggtc gtctttctgc tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg 13380

caacgtgtgg acggaacacg cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca 13440

tggattcggt tagatgggaa accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca 13500

tgccggccgg ccctgcggaa acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct 13560

cgccagctcg tcggtcacgc ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac 13620

tatcgcgggt gcccacgtca tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct 13680

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gctgggcggc ctgcgcggcc ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga 13860

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agtgccattg cagggccggc agacaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc 13980

tccacacatg gggcattcca cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc 14040

tcctttagcc gctaaaattc atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct 14100

gcgcgatgta ttcagatagc agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct 14160

tcagcttggt gtgatcctcc gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt 14220

ctgccaggct ggccaacgtt gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta 14280

gcgtgtttgt gcttttgctc attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt 14340

aatttcagcg gccagcgcct ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag 14400

aacggttgtg ccggcggcgg cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc 14460

aagaatgggc agctcgtacc cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc 14520

tttgatcgcc cgcgacacga caaaggccgc ttgtagcctt ccatccgtga cctcaatgcg 14580

ctgcttaacc agctccacca ggtcggcggt ggcccatatg tcgtaagggc ttggctgcac 14640

cggaatcagc acgaagtcgg ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg 14700

cgctccgtcg atcactacga agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt 14760

cgggcggtcg atgccgacaa cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg 14820

ggcactgccc tggggatcgg aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc 14880

gcgggctaga tgggttgcga tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc 14940

gataaccttc atgcgttccc cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca 15000

gcgaccgcat gacgcaagct gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc 15060

tcggtttctt cagcggccaa gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg 15120

gccaggattt catgcagccg cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg 15180

gccgcgatca tctccgcctc gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc 15240

tggtgcggtt tcatgcttgt tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg 15300

cctcggtcaa tgcgtcctca cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt 15360

cctcgctgcg ctcaagtgcg cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg 15420

cctctttcac ggtgcggcct tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg 15480

gggtgagggt agggcggggg ccaaacttca cgcctcgggc cttggcggcc tcgcgcccgc 15540

tccgggtgcg gtcgatgatt agggaacgct cgaactcggc aatgccggcg aacacggtca 15600

acaccatgcg gccggccggc gtggtggtgt cggcccacgg ctctgccagg ctacgcaggc 15660

ccgcgccggc ctcctggatg cgctcggcaa tgtccagtag gtcgcgggtg ctgcgggcca 15720

ggcggtctag cctggtcact gtcacaacgt cgccagggcg taggtggtca agcatcctgg 15780

ccagctccgg gcggtcgcgc ctggtgccgg tgatcttctc ggaaaacagc ttggtgcagc 15840

cggccgcgtg cagttcggcc cgttggttgg tcaagtcctg gtcgtcggtg ctgacgcggg 15900

catagcccag caggccagcg gcggcgctct tgttcatggc gtaatgtctc cggttctagt 15960

cgcaagtatt ctactttatg cgactaaaac acgcgacaag aaaacgccag gaaaagggca 16020

gggcggcagc ctgtcgcgta acttaggact tgtgcgacat gtcgttttca gaagacggct 16080

gcactgaacg tcagaagccg actgcactat agcagcggag gggttggatc aaagtacttt 16140

gatcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 16200

ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta a 16231

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcggggatg accattctga ggtg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaaccacctc agaatggtca tccc 24

Claims (4)

1.一种利用小麦TaRDR6基因构建雄性不育的小麦植株的方法，其特征在于，降低或沉默小麦中小麦TaRDR6基因的表达；所述小麦TaRDR6基因位于第三号染色体的3B和3D上，分别命名为TaRDR6-3B和TaRDR6-3D，所述TaRDR6-3B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述TaRDR6-3D的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述降低或沉默小麦中小麦TaRDR6基因的表达，具体包括如下步骤：

1）设计靶向TaRDR6基因的sgRNA；所述的TaRDR6基因的sgRNA的核苷酸序列SEQ IDNO.3所示；

2）根据步骤1）获得的sgRNA设计sgRNA的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

3）利用步骤2）获得的扩增产物和pBUE411载体构建具有敲除小麦TaRDR6基因功能的pBUE411-RDR6双元载体；

所述的具有敲除小麦TaRDR6基因功能的pBUE411-RDR6双元载体，包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A自上游至下游具体依次包括如下元件：来自小麦的TaU3启动子A、所述TaRDR6基因的sgRNA和终止子A；所述启动子A的序列如SEQ ID NO.5所示；所述终止子A序列如SEQ ID NO.7所示；

所述表达盒B自上游至下游依次具体包括如下元件：启动子B、玉米Cas9编码序列和终止子B；所述启动子B序列如SEQ ID NO.6所示；所述玉米Cas9编码序列如SEQ ID NO.4所示；所述终止子B序列如SEQ ID NO.8所示；

4）利用农杆菌介导将步骤3）获得的双元载体转化入植物中，降低或沉默小麦TaRDR6基因的表达，即可获得花粉败育的小麦植株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达盒A位于所述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pBUE411-RDR6双元载体还含有抗性标记基因；所述pBUE411- RDR6双元载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述的sgRNA的扩增引物为RDR6-gR1-TaU3-F和RDR6-gR1-TaU3-R，RDR6-gR1-TaU3-F序列如SEQ ID NO.10所示，RDR6-gR1-TaU3-R序列如SEQ ID NO.11所示。

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