CN111424044B - 小麦TaDCL4基因及其在花粉育性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦TaDCL4基因及其在花粉育性中的应用。本发明是通过将构建的具有敲除DCL4基因功能的pBUE411‑DCL4双元载体转入小麦内，沉默小麦中DCL4基因的表达，可以获得花粉败育的小麦植株，验证小麦TaDCL4基因在花粉败育中的功能，了解小麦中DCL4基因在phasiRNA合成路径中是如何具体发挥作用和行使其生物学功能。

Description

小麦TaDCL4基因及其在花粉育性中的应用

技术领域

本发明涉及小麦TaDCL4基因及其在花粉育性中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

小麦在遇到温度过低、或者干旱等不良气象条件通常会导致花粉母细胞不能正常减数分裂，例如当花粉母细胞进行减数分裂时，如遇16℃以下低温或17℃持续一段时间，细胞分裂被抑制，就会产生大量败育花粉，以致形成大量的空壳和瘪粒。或者如果遇严重干旱，细胞质粘性增高，妨碍正常减数分裂的进行，也会产生大量的败育花粉。这些都会对小麦的产量产生不良影响。

对花粉败育在分子层面的研究有利于了解花粉败育的内在原因，从而减少其发生。在植物中phasiRNA主要参与植物的生长发育、生殖发育和抗逆反应等方面(Deng etal.2018)。在小麦幼穗和花药组织中存在大量的21-nt和24-nt的phasiRNA(phased,secondary,small interfering RNA)，在不同发育时期的雄蕊组织中phasiRNA呈现动态的表达，表达高峰期出现在花粉母细胞减数分裂的前后(Zhang et al.2020)。探究在phasiRNA合成路径中是具体发挥作用和行使其生物学功能的基因，可以帮助对花粉败育小麦植株的研究。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供小麦TaDCL4基因及其在花粉育性中的应用。本发明是通过将构建的具有敲除TaDCL4基因功能的pBUE411-DCL4双元载体转入小麦内，沉默小麦中TaDCL4基因的表达，可以获得花粉败育的小麦植株，验证小麦TaDCL4基因在花粉败育中的功能。

小麦TaDCL4基因在花粉育性中的应用。

进一步的，上述应用中所述的小麦TaDCL4基因在小麦中位于第二号染色体的2A，2B和2D上，分别命名为TaDCL4-2A、TaDCL4-2B和TaDCL4-2D；TaDCL4-2A的核苷酸序列如SEQID NO.1，上述TaDCL4-2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，上述TaDCL4-2D的核苷酸序列如SEQID NO.3。

进一步的，上述应用中所述花粉育性是使小麦花粉败育。

一种改变小麦育性的方法：降低或沉默小麦中小麦TaDCL4基因的表达，以获得育性改变的小麦植株。

进一步的，上述方法中所述降低或沉默小麦中小麦TaDCL4基因的表达：设计靶向TaDCL4基因的sgRNA，设计sgRNA的扩增引物进行PCR扩增，利用扩增产物和载体构建具有敲除TaDCL4基因功能的pBUE411-DCL4双元载体，利用农杆菌介导将上述双元载体转化入植物中，降低或沉默小麦TaDCL4基因的表达，即可改变小麦育性。

进一步的，上述方法中所述小麦TaDCL4基因在小麦中位于第二号染色体的2A，2B和2D上，分别命名为TaDCL4-2A、TaDCL4-2B和TaDCL4-2D；TaDCL4-2A的核苷酸序列如SEQ IDNO.1，上述TaDCL4-2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，上述TaDCL4-2D的核苷酸序列如SEQ IDNO.3。

进一步的，上述方法中所述小麦TaDCL4基因的sgRNA序列如序列SEQ ID NO.4所示。

进一步的，上述方法中所述的sgRNA的扩增引物为DCL4-gR1-TaU3-F和DCL4-gR1-TaU3-R，DCL4-gR1-TaU3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5，DCL4-gR1-TaU3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，上述方法中所述的载体指pBUE411载体。

进一步的，上述方法中所述的pBUE411-DCL4双元载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。

本发明通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现TaDCL4基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦TaDCL4基因。小麦TaDCL4基因在小麦中位于第二号染色体的2A，2B和2D上，分别命名为TaDCL4-2A、TaDCL4-2B和TaDCL4-2D。其基因组序列在2A、2B和2D上的全长分别为28817、31860和26787个碱基，这三个部分同源基因均由25个外显子和24个内含子组成。TaDCL4-2A、TaDCL4-2B和TaDCL4-2D分别含4872、5160和4878个碱基的开放阅读框，分别编码一段含1624、1720和1626个氨基酸残基的多肽链。这三个部分同源基因之间编码区的相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述三个位点的TaDCL4基因提供了理论依据。

小麦TaDCL4基因CRISPR/Cas9载体，可以对TaDCL4基因的2A、2B和2D基因组上的三个拷贝同时进行编辑，从而引起该基因发生移码突变，导致该基因部分或者全部功能的丧失。

有益效果：

在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平TaDCL4基因的沉默，是利用基因工程技术沉默TaDCL4基因的有力工具。通过沉默TaDCL4基因即可直接定向诱导小麦花粉败育。

附图说明

图1 pBUE411载体BsaI酶切电泳图。

图2 Bar试纸条检测转基因小麦植株。

图3 dcl4不育突变体和对照JW1的花药(A)、灌浆期籽粒(B)、部分小穗(C-D)和穗子(E-F)的表型。

图4 dcl4不育突变体(B)和对照JW1(A)的花粉颗粒表型。

图5中央胼胝体时期的花药。.

图6 dcl4不育突变体和对照材料JW 1的四分体时期幼穗中的小分子RNA长度分布。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PCR扩增所需的高保真酶、DNA片段连接所需的T4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411,含有小麦U3启动子TaU3，用以启动sgRNA，Cas9p模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物优化密码子基因。本实验室所用的大肠杆菌菌株是E.coli DH5α。

T4连接酶、DNA Marker DL2000等试剂购自Takara公司；FastPfu、2*Taq Mix、DH5α等购自北京全式金公司；限制性内切酶BsaI-HF购自NEB公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，序列如下：

表1本研究中使用的引物

小麦品种JW1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得。

质粒pBUE411(17430bp)由中国农业大学孙其信课题组提供；公众可从中国农业大学获得。

实验例1表达载体的构建

1.靶向DCL4的sgRNA的设计

小麦DCL4基因的序列如SEQ ID NO.1-3所示，靶向DCL4基因的sgRNA序列为GACGTGATGTCTGCATCTTC，该序列后三位的序列标记为PAM序列。通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在DCL4基因的编码区寻找1个适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，sgRNA序列选定为GACGTGATGTCTGCATCTTC。

2.sgRNA的退火及双链的形成

DCL4基因的sgRNA的2条oligo是由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，其中sgRNA的寡核苷酸对应的是DCL4-gR1-TaU3-F和DCL4-gR1-TaU3-R(表1)，引物中的下划线碱基部分是与pBUE411载体中的序列匹配。分别将sgRNA的2条oligo进行磷酸化，直接退火形成双链，体系为：DCL4-gR1-TaU3-F(10μM)：4μL,DCL4-gR1-TaU3-R(10uM)：4μL,10×T4 PNKbuffer:1.5μL,PNK:1μL,ATP:1μL,ddH₂O补足15μL。程序在PCR仪中按下列条件运行：37℃,30min；95℃,5min；ramp to 25℃at 5℃/min(0.08℃/s)。或者是沸水中煮5min，之后自然冷却至室温。

3.pBUE411载体的线性化

用BsaI的内切酶酶切pBUE411载体3h如图1所示，1为pBUE411用BsaI酶切；2为DL2000 Marker；3为1kb Marker，电泳后回收线性载体片段，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；所述启动子A的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述启动子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述终止子A的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述终止子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.pBUE411载体与sgRNA的连接反应

连接反应体系为：5×ligation Buffer 2μL，annealed oligo duplex 4μL，pBUE411/BsaI 2ul(100ng)，T4 ligase 1μL，ddH₂O补足10μL，25℃30min进行连接反应。

5.转化验证

将连接产物转化大肠杆菌，重组质粒经转化到DH5α感受态细胞，之后于LB(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液PCR鉴定及测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。在靶序列上游检测到了TaU3启动子序列，说明sgRNA表达盒构建成功，并成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了TaDCL4的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。

实验例2基因编辑载体的转化普通小麦

1.培养基配制：见文献Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in Molecular Biology,vol.1223 DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,SpringScience+Businedd Media New York 2015

2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28度培养24小时，穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23度暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25度。将愈伤转移至筛选培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上。

用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。

糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。

封好培养皿，放到25度培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。

3.转基因苗的突变体检测

3.1 T0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选

由于此次转化所用载体上T-DNA区域有cas9、bar和gRNA三个表达框，其中bar基因的表达检测已经非常成熟，已经有商业化的检测试剂条，样品经过粗磨后用试剂条在10分钟内就可以判断是否带有bar基因，比PCR扩增快速高效。因此，我们以未转基因植株作为阴性对照，利用bar基因检测试剂盒quickstix^TM对转基因小麦T0植株进行检测，具体操作如下：

取转基因苗3-5cm,放入1.5m离心管中，用研磨棒研磨后加入Buffer 500μL，插入Bar试纸条，静置5min，根据试条显示带数纪录数据，2条带表示阳性，1条带代表阴性。上述试剂盒购自麦蒂森科技有限公司。

筛选阳性转基因苗子结果如图2所示，样品1-8为T0代再生苗，9为阴性对照，10为阳性对照，其中样品3-8出现两条带，与阳性对照10结果一致，为阳性苗；1-8分别代表DCL4-01，-02，-03，-04，-05，06，-07，-08。

3.2 T0代转基因植株DCL4基因的特异性扩增和突变体鉴定

目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用天津诺禾致源公司生产的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒。该试剂盒通过PCR法自动完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的Primer-F和Primer-R)对DCL4进行扩增，扩增产物建库后送到诺禾致源测序。目的基因小麦DCL4基因的野生型核苷酸序列(包括TaDCL4-2A、TaDCL4-2B和TaDCL4-2D)如SEQ IDNO.1-3所示，其推导的氨基酸序列如下所示：

>TaDCL4-2A-WT

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>TaDCL4-2D-WT

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检测出突变体的核苷酸序列，并推导其氨基酸序列如下所示：

>TaDCL4-2A-M

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>TaDCL4-2D-M

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经比对，DCL4-07在TaDCL4-2A的CDS序列的+207-208位缺失了两个碱基TG，造成CDS区从第7-354位的核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失3-118位氨基酸序列；DCL4-07在TaDCL4-2B的CDS序列的+495-496位缺失了两个碱基TG，造成CDS区从第4-354位的核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失2-348位氨基酸序列；DCL4-07在TaDCL4-2D的CDS序列的+213-214位缺失了两个碱基TG，造成CDS区从第4-357位的核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失2-119位氨基酸序列。

第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-DCL4基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL,Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。

之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。

4、dcl4基因编辑株系后代表型检测

4.1 dcl4基因编辑株系后代穗部表型检测

挑选dcl4基因编辑株系7和株系8的后代材料和未转基因株JW1材料，进行了温室种植。在dcl4基因编辑材料中，在T0代中没有观察到不育的表型。在T1代第7株系的11颗苗中，有3颗表现为完全不育，第8株系的23颗苗中，有5颗表现为完全不育。dcl4不育突变体的花药表型非常类似，与对照JW1相比，比较瘦小(图3中的A的右侧花药)，散粉后籽粒不发育(图3中的B的右侧)。dcl4不育突变体株系的穗子与对照JW1相比变短(图3中的E的右侧穗子)。除此之外，个别不育株系次孽的小穗发育异常，穗子明显变短(图3中的F右侧的穗子)，小穗数减少且颖壳褪化为芒状(图3中的C和D)。

4.2 dcl4基因编辑株系后代花粉表型检测

对照JW1的花粉，用碘化钾染色后，在显微镜下可观察到黑紫色的饱满的圆形颗粒(图4中的A)。与对照相比，dcl4不育突变体的花粉用碘化钾染色后，多数颗粒表面凹陷、不饱满，呈黄色(图4中的B)，这样的花粉没有受精能力，花粉表现为败育，导致籽粒灌浆不能进行。从花粉的数量上，dcl4不育突变体的花粉量明显的少于对照(图4中的A-B)。

4.3 dcl4基因编辑株系后代花药表型检测

对约1mm的dcl4不育突变体的花药进行电镜半薄切片的观察，取样时期大概在中央胼胝体时期，这个时期绒毡层细胞变大为明显的一层细胞。图5中的(A)为正常小麦花药(Browne et al 2018)，图5中的(B)dcl4不育突变体的花药。图5中的MMC指MicrosporeMother Cells；图5中的CC指Central Callose；图5中的SP指Sporogenous Tissue；图5中的StR为Stomium Region；图5中的V指Vascular Region；图5中的E指Epidermis；图5中的En为Endothecium；图5中的ML为Middle Layer；图5中的T指Tapetum。与正常小麦花药相比(图5中的A)，发现dcl4突变体的四个药室发育不一致，有一个药室发育明显比其它三个发育慢，并且有的药室的绒毡层细胞变的非常细瘦(图5中的B)。这说明TaDCL4基因可能影响到了药室的整体发育和绒毡层细胞的发育，从而造成后续花粉粒的败育。

4.4 dcl4基因编辑突变体影响到21-nt小分子RNA的合成

目前，dcl4不育突变体材料四分体时期的幼穗进行了小分子RNA测序。分析发现，突变体材料中21-nt小分子RNA在数量和占总小分子RNA的比例上都显著少于野生型JW1(图6)(Fisher’s exactly test,P-value<2.2e-16)。这说明DCL4基因在小麦中影响了21-nt小分子RNA的生物合成。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院作物研究所

<120> 小麦TaDCL4基因及其在花粉育性中的应用

<130> 2020

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4872

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

atgggcgaca tctcgaccgc ggcggcgagc gcgggggagc gcaagcccaa ggacccgagg 60

acgatcgcgc gcaagtatca gctggatctc tgcaagaggg ctctcgagga gaacatcata 120

gtgtacctag gcacgggatg cgggaagacc catatagccg tgctgctcat ttacgaactt 180

ggccatctca ttcgcaaacc cagacgtgat gtctgcatct tcctcgcccc aacagtcccc 240

cttgttctcc agcaagcgac ggtgattgct aattccacca atttcagagt tcaaagttac 300

tatggggatg gtaaaaaccc aagaaatcat gaggactggg agacagagat gggggaatcc 360

gaggttcttg taatgactcc ccagattttg ttgcatagtt tgcggcattg tttcatcaag 420

atggactcaa ttgcacttct gatattcgat gaatgccatc acgcacaagc acacaagcgg 480

catccatatg cacaaattat gaaggaattc tacaataatg acatggtgaa gccccctcgc 540

atttttggca tgactgcttc accagtaatg ggaaaaggcg ggtctaacaa gcttaattac 600

accaaatgta tcaacagcct tgaagaatta ttgcatgcca aggtctgttc ggttgataat 660

gcagagctgg aaagtgtgct tgcttttcct gatatggagg tgtacactta tgtcccgctt 720

agtcactcta atcttactgt aacttacaac aaagaacttg atcgctcaaa gcttgagagt 780

gaacgcatac tacgcgagag cctatacgat ttcaaggatt ctcagaagaa actaaagtcc 840

ctggggaggt tgcatggaaa tttagtattc tgtttgcaag aacttggttc gtttggagct 900

ctgcaagctg caaaggcttt cctttcatct gatggtgatg ttttggacag aaaggagtct 960

gacatgaacg acaattctac cagatttaag catcattacc taaacaaagc aatttctgtt 1020

ctgaattgca acatattaga cggtacccat gatgattcat ttcatctaga gatgctagaa 1080

gaacctttct tctcaaataa aattgtggtt cttattaaaa ttctctcgag atacaggcta 1140

gaggaaaaca tgaagtgcat agttttcgtg aaaagaataa ctgttgcaag agcaatagca 1200

catatcctcc aaaatttgaa aggccttgat ctttggaaat gtgagttcct tgtgggacgc 1260

cactcgggac caaagaacat gtcaaggcag aagatggatg ctattgttga aaatttctct 1320

tctggcgagg tgaatctttt gattgctacc agtgtaggtg aagagggtct ggacattcag 1380

acttgttgcc tcgttgtgcg gtttgatctt ccagaaactg ttgccagttt tatccagtcg 1440

aggggacgtg ctcggatgac aaattctaaa tatgttgttc tcctggagag gggcaatcat 1500

tctcaagaaa agttgcttaa tgactatatt gatggtgaag gcattatgaa tggagagata 1560

gacttgagaa cttcaaatga tgtgtttgat cacctcgagg agaaaagtta tcgagtggaa 1620

aaaacgggtg cttccattag cactgcatgt agtgtatctc tactgcatcg ctactgctac 1680

aaccttccca aggacatgtt cttcaatcct tccccagcat tcatctacat tgatgacact 1740

gaggggataa tctgcagagt aattcttcca ccaaatgctg cttttcgtca agtggatggc 1800

caaccatgcc aatcaaatga cgaggctaag agggatgcat gcttagaggc atacgtgaaa 1860

ttgtatgaat tgggtgcttt gacagatttt cttctgcctg gttcaggttc aggaaagaac 1920

agggcatcaa caacaaacgg ttcagcaagc aacagtcatg atgatgaaag tctaagagaa 1980

gagcttcatg agatgttaat tcccacaatt ctcaaacctt caacatgcaa actggactgt 2040

ccattgaact tgcatttcta ctatattcaa ttctttccca taccagcaga tagacattat 2100

cggatatttg gtctttttgt gatcaactcc cttcctatgg aagctgaaaa gttggaggtt 2160

gatttgcatc tggctcgcgg caggattgtg aaagcaggaa tgaaacattt agggacgata 2220

tcatttgacg aagaacagat gatgctggca cgcaatttcc aagaaatgtt tctgaaggtt 2280

ctcctggaca gatctgagtt cactgtatct catgttatgt tgttgggcaa cagtgaaacg 2340

ctacagttta attcaacctt ttacctgctg cttccaatca agcaggaatt gtatggtgat 2400

atatttatga ttgactggca aacagttaag cgctgtttat catcaccggt ttttaaagat 2460

ccaactggtg tgtctgcgca tggatcatat ttgccagatg agtctttaag gcttcttgat 2520

aatatgtaca gtaaaactga tgtcgttggc agtctaatct ttgctcccca tattaagaca 2580

tttttcgtca ttgatgtcat tctgaatgaa ctaaatgcta gaagtgaata cgacggtgct 2640

acttatgaag atcattacaa ggaaaggttt ggtatcaaac tatcacatcc cgagcagcca 2700

cttctgcacg ctaagcagct ctgcaatctg cataatttgc ttcatgaccg attacgggag 2760

accacagaag aaggtcgtga attgatggag cactttgtgg agttgcctcc agagctatgt 2820

tctttgaaga taattgggtt ttcgaaggat atgtgtagct ccctgtcttt gttaccatcg 2880

ttgatgtgtc ggttggagaa tttgctggta gctattgagt tgaaggatgt catgttgtct 2940

tcattctcag aggcttctca aattagtgcc tctggtatcc ttgaagcact taccaccgaa 3000

aggtgtttgg agaggatttc tttggagcgc tttgaagtct taggtgatgc ttttttgaag 3060

tatgtagttg gacgtcacaa ctttcttaca tatgaaggac ttgatgaagg gcaattgacc 3120

agcagacgtt ctgctatagt gaataattca catttatatg agttatcaat caaaagaaat 3180

ttgcaggtgt acatacggga tcaacacttt gaaccgacac agttcattgc actgggaagg 3240

ccttgtaaag ttgtttgcaa tgctgacaca gaagtgaata tacacacaga tagtcgagaa 3300

aactgtaact tgaggtgtac aaagtcgcat cattggttgc ataggaagac tatagcggat 3360

gctgttgaat cgcttgtcgg agcatttctt gttgaaggtg gattcaaagc tgcatttgca 3420

ttccttcact gggtgggaat agatgttgat tttaaagatt catccctata tagagtatta 3480

gatgcaagct ccatcaattt atctctcacg aaccacaccg acgtcggtga gcttgaggaa 3540

ttaatcggtt acaatttcaa acacaagggt ctaattctcg aagcatttgt gcatccttca 3600

ttcaataaac attctggagg atgctaccag aaattggagt tccttggaga tgctgttttg 3660

gaatatttga taacctcgta cctctactca gcttatcctg atctaaagcc tggtcaaata 3720

accgatttaa aatcgttagc tgtcagtaat aattcgcttg catatgtggc agtccagaaa 3780

ggtatccata agtatcttat aaaggattca aattatcttt cgtcagcagt gaataagttt 3840

gagaattata ttagacttcc caattcagag aaagacttgg tagaagaacc agcatgccca 3900

aaggttcttg gtgatattgt cgaatcttgt gttgctgcag ttcttttaga ttcaggattc 3960

aacctgaact acgtttggac gctagtgctt atgcttctaa agccagtgtt gagcttctct 4020

gacatgcaca tgaatcccat gagagaaatt cgggaacttt gtcaatctca tgaacttgag 4080

ttaggccttc ccgaacctat gaaagccgat ggagagtacc acgtcaaagt ggaagttaac 4140

ataaacagcc aggtgataag ttctgccgct gcaaaccgga attcaaaagt tgctaggaag 4200

tttgctgcac aagaaacact ttctaaactg aagaattatg gatacacaca taaaaacaag 4260

tcactggaag agattttgcg agatgctagg aagaaagaac cagaactact aggttataat 4320

gaagaaccaa tcaaagtcga ggctgacata tctgcagaaa cgaataatct gaagataggt 4380

aaagaaaggg atgcaaacat ctctttccaa aatacagcaa tttctattcg tgggactctt 4440

agaacctcta gccaaagaac agcagggaat accatgtttt ccaaggatga tgtcagtatt 4500

gaaaggaata atcagctcaa ggttgcaaag cagaatgcct gtctgccgaa gggaacaact 4560

cagaaaaata ttagaaagga gtatcatggt gatatggtaa ataaaacagc aaagtctttc 4620

ctttttgaag tatgtgccgt aagttattgg ataccccctg aatttgaatt gtgcaaagaa 4680

gaagggccaa gccatctccg aagattcacg tacaaggtta cagttcagat caggggaccc 4740

tcggagacac tcttggagtg ctacagcgat gctcaactac ataagaaggc cgcacaagag 4800

catgccgcgc agggggctct gtggtatctc aggcaacatg ggtacctagc caaagatgaa 4860

gttcgtgtgt ag 4872

<210> 2

<211> 5160

<212> DNA

<213> 序列

<400> 2

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actcgacacg acccgctcgg cccccacttc ccttcccttc ccttcatcac catgtgcgct 120

tttcgcatct ccgtctcgcc gactgactcc tcgtcctccc cgagcagtcc tcccctcact 180

ttgcagcctc ctccgcggcg cccagcagtt gcgccccggg gcacacaaga gagagaaaga 240

ggagagggag agggagcccc gcttccgcgc gaagcttccg ccatgggcga catctcgacc 300

gcggcggcga gcgcggagga gcgcgagccc cagcccaagg acccgaggac gatcgcgcgc 360

aagtatcagt tggatctctg caagagggct ctcgaggaga acatcatagt gtacctaggc 420

acgggatgcg ggaagaccca tatagccgtg ttgctcatat acgagcttgg ccatctcatt 480

cgcaaaccca gacgtgatgt ctgcatcttc ctcgccccga cagtccccct tgttctccag 540

caagcaacgg tgattgctaa ttccaccaat ttcagagttc aaagttacta tggggatggt 600

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atgactcccc agattttgtt gcatagtttg cggcattgtt tcatcaagat ggactcaatt 720

gcacttctga tattcgatga atgccatcac gcacaagcac acaagcggca tccatatgca 780

caaattatga aggaattcta cgataatgac atggtgaagc cccctcgcat ttttggcatg 840

actgcttcac cagtaattgg aaaaggcggg tctaacaagc ttaattacac caaatgtatc 900

aacagccttg aagaattatt gcatgccaag gtctgttcgg ttgataatgc agagctggaa 960

agtgtgcttg cttttcctga tatggaggtg tacacgtatg tcccgcttag tcactctaat 1020

cttactgtaa cttacaacaa agaacttgat tgctcaaagc ttgagagtga acgcatacta 1080

cgcgagagcc tatacgattt caaggattct cagaagaaac taaagtccct ggggaggttg 1140

catggaaatt tagtattctg tttgcaagaa cttggttcgt ttggagctct gcaagctgca 1200

aaggctttcc tttcatttga tggtgatgtt ttggacagaa aggagtctga catgaacgac 1260

aattctacca gatttaagca tcactaccta aacaaagcaa tttctgttct gaattgcaac 1320

atattagacg gtacccatga tgattcattt cgtctagaga tgctagaaga acctttcttc 1380

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aatttgaaag gccttgatct ttggaaatgt gagttccttg tgggacgcca ctcgggacca 1560

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tccattagca ctgcatgtag tgtatctcta ctacatcgct actgctacaa ccttcccaag 1980

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tcgttagctg tcagtaataa ttcgcttgca tatgtggcag tccagaaagg tatccataag 4080

tatcttataa aggattcaaa ttatctttcg acagcagtga ataagtttga gaattatatt 4140

agacttccca attcagagaa agacttggta gaagaaccag catgcccaaa ggttcttggt 4200

gatattgtcg aatcttgtgt tgctgcagtt cttttagatt caggattcaa cctgaactac 4260

gtttggacac tagtgcttat gcttctaaag ccagtgttga gcttctctga catgcacatg 4320

aatcccatga gagaaattcg ggaactttgt caatgtcatg aacttgagtt aggccttccc 4380

gaacctatga aagctgatgg agagtaccac gtcaaagtgg aagttaacat aaacagccag 4440

gtgataagtt ctgccgctgc aaaccggaat tcaaaagttg ctaggaagtt tgctgcacaa 4500

gaaacacttt ctaaactgaa gaattatgga tacacacata aaaacaagtc actggaagag 4560

attttgcgag atgctaggaa gaaagaacca gaactactag gttataatga agaaccaatc 4620

aaagtcgagg cggacatatc tgcagaaatg aataatctga agataggtaa agaaagggat 4680

gcaaacatct ctttccaaaa tacggaaatt tctattcgtg ggactcttag aacctctagc 4740

caaagaacgg cagggaatac catgttttcc aaggatgatg tcagtattga aaggaataat 4800

cagctcaagg ttgcaaagca gaatgcctgt ctgccgaagg gaacaactca gaaaaatatt 4860

agaaaggagt atcatggtga tatggtaaat aaaacagcaa agtctttcct ttttgaagta 4920

tgtgccgtaa gttattggaa accccctgaa tttgaattgt gcaaagaaga agggccaagc 4980

cacctccgaa gattcacgta caaggttaca gttcagatca ggggaccctc ggagacactc 5040

ttggagtgct acagcgatgc tcaactacag aagaaggccg cacaagagca tgccgcgcag 5100

ggggctctgt ggtatctcag gcaacatggg tacctaccca aagatgaagt ttgtgtgtag 5160

<210> 3

<211> 4878

<212> DNA

<213> 序列

<400> 3

atgggcgaca tctcgaccgc ggcggcgagc gcggggaagc gcgagcccca gcccaaggac 60

ccgaggacga tcgcgcgcaa gtatcagttg gatctctgca agagggctct cgaggagaac 120

atcatagtgt acctaggcac aggatgcggg aagacccata tagccgtgtt gctcatatac 180

gaacttggcc atctcattcg caaacccaga cgtgatgtct gcatcttcct cgccccaaca 240

gtcccccttg ttctccagca agcgacggtg attgcaaatt ccaccaattt cagagttcaa 300

agttactacg gggatggtaa aaccccaaga gatcatgaga actgggagac agagatggcg 360

gaatctgagg ttcttgtaat gactccccag attttgttgc atagtttgca gcattgtttc 420

atcaagatgg actcaattgc acttctgata ttcgatgaat gccatcacgc acaagtgcat 480

aagcggcacc catatgcaca aattatgaag ggattctaca ataatgacat ggtgaagccc 540

cctcgcattt ttggcatgac tgcttcacca gtaatgggaa aaggcgggtc taacaagctt 600

aattacacca aatgtatcaa tagccttgaa gaattattgc atgccaaggt ctgttcggtt 660

gataatgcag aactggaaag tgtgcttgct tttcctgata tggaggtaca cacgtatgtc 720

ccgcttagtc agtctaatct tactgtaact tacaacaaag aacttgatcg ctcaaagctt 780

gagagtgaac gcatactacg cgagagccta tacgatttca aggattctca gaagaaacta 840

aagtccctgg ggaggttgca tggaaattta gtattctgtt tgcaagaact tggttcgttt 900

ggagctctgc aagctgcaaa ggctttcctc ctttcatttg atggtgatgt tttggacaga 960

aaggagtctg acatgaacga caattctacc agatttaagc atcactacct aaacaaagca 1020

atttctgttc tgagtagcaa catattagac ggtacccatg atgattcatt tgatctggag 1080

atggtagaac ctttcttctc aaataaaatt atggttctta ttaatattct ctcgagatac 1140

aggctagagg aaaacatgaa gtgcatagtt ttcgtgaaaa gaataactgt tgcaagagca 1200

atagcacata tcctccaaaa tttgaaaggc cttgatcttt ggaaatgtga gttccttgtg 1260

ggacgccact cgggaccaaa gaatatgtca aggcagaaga tggatgctat tgttgaaaat 1320

ttctcttctg gcgaggtgaa tcttttgatt gctaccagtg taggtgaaga gggtctggac 1380

attcagactt gttgccttgt tgtgcggttt gatcttccag aaactgttgc cagttttatc 1440

cagtccaggg gacgtgctcg gatgacaaat tctaaatatg ttgttctcct ggagagggga 1500

aatcattctg aagaaaagtt gcttaatgac tatattgatg gtgaaggcat tatgaatgga 1560

gagatagact tgagaacttc aaatgatgtg tttgatcacc tcgaggagaa aagttatcaa 1620

gtggaaaaaa cgggtgcttc cattagcacc gcatgtagtg tatctctact acatcgctac 1680

tgctacaacc ttcccaagga catgttcttt aatccttccc cggcattcat ctacattgat 1740

gacactgagg ggataatctg cagagtaatt cttccaccaa atgctgcttt tcgtcaagtg 1800

gatggccaac catgccaatc aaatgacgag gctaagaggg atgcatgctt agaggcattg 1860

gtgaaattgt atgaattggg tgctttgaca gattttcttc tgcctggttc aggttcaaga 1920

aagaacaagg catcaacaac aaacggttca gcaagcaaca gtcatgatga tgaaagtcta 1980

agagaagagc ttcatgagat gttaattccc acaattctca aaccttcaac atgcaaactg 2040

gactgtccat tgaacttgca tttctactat attcaattct ttcccatacc agcagacaga 2100

cattatcgga tatttggtct ttttgtgatc aacccccttc ctatggaagc tgaaaagttg 2160

gaggttgatt tgcatctggc tcgtggcagg attgtgaaag caggaatgaa acatttagga 2220

acgatatcat ttgacgaaga acagatgatg cttgcacgca atttccaaga aatgtttctg 2280

aaggttctcc tggacagatc tgagttcact gtatctcatg ttatgttgtt gggcaacagt 2340

gaaacactac agtttaattc aaccttttac ctgctgcttc caatcaagca ggaattgtat 2400

ggtgatatat ttatgattga ctggccaaca gttaagcgct gtttatcatc accggttttt 2460

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aagacatttt tcgtcattga tgtcattctg aacgaactaa atgctagaag tgaatacgat 2640

ggtgctactt atgaagatca ttacaaggaa aggtttggta tcaaactatc acatcccgag 2700

cagccacttc tgcacgctaa gcagctcttc aatctgcata atttgcttca tgaccgatta 2760

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ctatgctctt tgaagataat tgggttttca aaggatatgt gtagctccct gtctttgtta 2880

ccatcgttga tgtgtcggtt ggagaatttg ctggtagcta ttgagttgaa ggatgtcatg 2940

ttgtcttcat tctcagaggc ttctcaaatt agtgcttctg gtatccttga agcacttacc 3000

accgaaaggt gtttggagag gatttctttg gagcgctttg aagtcttagg tgatgctttt 3060

ttgaagtatg tggttggacg tcacaacttt cttacatatg aaggacttga tgaagggcaa 3120

ttgaccagca gacgttctgc tatagtgaat aattcacatt tatatgagtt atcaatcaaa 3180

agaaatttgc aggtgtacat acgggatcaa cactttgaac cgacacagtt cattgcactg 3240

ggaaggcctt gtaaagttgt ttgcagtgct gacacagaag tgaatataca cacagatagc 3300

cgagaaaact gtaacttgag gtgtacaaag tcgcatcatt ggttgcatag gaagactata 3360

gcggatgctg ttgaatcgct tgtcggagca tttcttgttg aaggtggatt caaagctgca 3420

tttgcattcc ttcactgggt gggaatagat gttgatttca aagattcatc tctatataga 3480

gtattagatg caagctccat caatttatct ctcacgaacc acaccgacgt cgatgagctt 3540

gaggaattaa tcggttacaa tttcaaacat aagggtctaa ttctcgaagc atttgtgcat 3600

ccttcattca ataaacattc tggaggatgc taccagaaat tggagttcct tggagatgct 3660

gttttggaat atttgataac ctcatacctc tactcagctt atcctgatct aaagcctggt 3720

caaataaccg atttaaaatc gttagctgtc agtaataatt cgcttgcata tgtggcagtc 3780

cagaaaggta tccataagta tcttataaag gattcaaatt atctttcaac agcagtgaat 3840

aagtttgaga attatattag acttcccaat tcagaaaaag acttggtaga agaaccagca 3900

tgcccaaagg ttcttggtga tattgtcgaa tcttgtgttg ctgcagttct tttagattca 3960

ggattcaacc tgaactacgt ttggacgcta gtgcttatgc ttctagagcc agtgttgagc 4020

ttctctgaca tgcacatgaa tcccatgaga gaaattcggg aactttgtca atgtcatgaa 4080

cttgagttgg gccttcccga acctatgaaa gccgatggag agtaccacgt caaagtggaa 4140

gttaacataa acagccaggt gataagttct gccgctgcaa atcggaattc aaaagttgct 4200

aggaagtttg ctgcacaaga aacactttct aaactgaaga attatggata cacacataaa 4260

aacaagtcac tggaagagat tttgcgagat gctaggaaga aagaaccaga actactaggt 4320

tataatgaag aaccaatcaa agtcgaggct gacatatctg cagaaatgaa taatctgaag 4380

ataggtaaag aaagggatgc aaacatctct ttccaaaata cggaaatttc tattcgtggg 4440

actcttagaa cctctagcca aagaacagca gggaatacca tgttttccaa ggatgatgtc 4500

agtattgaaa ggaataatca gctcaaggtt gcaaagcaga atgcctgtct gccgaaggga 4560

acaactcaga aaaatattag aaaggagtat catggtgata tggtaaataa aacagcaaag 4620

tctttccttt ttgaagtatg tgccgtaagt tattggaaac cccctgaatt tgaattgtgc 4680

aaagaagaag ggccaagcca cctccgaaga ttcacgtaca aggttacagt tcagatcagg 4740

ggaccctcgg agacactctt ggagtgctac agcgatgctc aactacagaa gaaggccgca 4800

caagagcatg ccgcgcaggg ggctctgtgg tatctcaggc aacatgggta cctacccaaa 4860

gatgaagttc gtgtgtag 4878

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 4

gacgtgatgt ctgcatcttc 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcggacgtg atgtctgcat cttc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacgaagatgc agacatca cgtc 24

<210> 7

<211> 527

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catgaatcca aaccacacgg agttcaaatt cccacagatt aaggctcgtc cgtcgcacaa 60

ggtaatgtgt gaatattata tctgtcgtgc aaaattgcct ggcctgcaca attgctgtta 120

tagttggcgg cagggagagt tttaacattg actagcgtgc tgataatttg tgagaaataa 180

taattgacaa gtagatactg acatttgaga agagcttctg aactgttatt agtaacaaaa 240

atggaaagct gatgcacgga aaaaggaaag aaaaagccat actttttttt aggtaggaaa 300

agaaaaagcc atacgagact gatgtctctc agatgggccg ggatctgtct atctagcagg 360

cagcagccca ccaacctcac gggccagcaa ttacgagtcc ttctaaaagc tcccgccgag 420

gggcgctggc gctgctgtgc agcagcacgt ctaacattag tcccacctcg ccagtttaca 480

gggagcagaa ccagcttata agcggaggcg cggcaccaag aagcggc 527

<210> 8

<211> 1992

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840

ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 900

tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960

ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020

tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1080

tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1140

tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1200

atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1260

gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1320

tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380

agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440

gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1500

ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1560

gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1620

aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680

catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1740

ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 1800

ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1860

gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1920

atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 1980

ttacttctgc ag 1992

<210> 9

<211> 291

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttttttttt cgttttgcat tgagttttct ccgtcgcatg tttgcagttt tattttccgt 60

tttgcattga aatttctccg tctcatgttt gcagcgtgtt caaaaagtac gcagctgtat 120

ttcacttatt tacggcgcca cattttcatg ccgtttgtgc caactatccc gagctagtga 180

atacagcttg gcttcacaca acactggtga cccgctgacc tgctcgtacc tcgtaccgtc 240

gtacggcaca gcatttggaa ttaaagggtg tgatcgatac tgcttgctgc t 291

<210> 10

<211> 571

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagcggccag cggcgacgaa gaaggcgggg caggcgaaga agaagaagtg agctcagagc 60

tttcgttcgt atcatcggtt tcgacaacgt tcgtcaagtt caatgcatca gtttcattgc 120

gcacacacca gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg 180

taccatttgt tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt 240

gaaatggaaa tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa 300

ttaatattat ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata 360

tgcaaacatt ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta 420

atatgaggag taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat 480

attttcagac ctagaaaagc tgcaaatgtt actgaataca agtatgtcct cttgtgtttt 540

agacatttat gaactttcct ttatgtaatt t 571

<210> 11

<211> 16231

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtaaacgctc ttttctctta ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt 60

aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc caagctcaag ctgctctagc attcgccatt 120

caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 180

ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 240

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttcatgaa tccaaaccac acggagttca 300

aattcccaca gattaaggct cgtccgtcgc acaaggtaat gtgtgaatat tatatctgtc 360

gtgcaaaatt gcctggcctg cacaattgct gttatagttg gcggcaggga gagttttaac 420

attgactagc gtgctgataa tttgtgagaa ataataattg acaagtagat actgacattt 480

gagaagagct tctgaactgt tattagtaac aaaaatggaa agctgatgca cggaaaaagg 540

aaagaaaaag ccatactttt ttttaggtag gaaaagaaaa agccatacga gactgatgtc 600

tctcagatgg gccgggatct gtctatctag caggcagcag cccaccaacc tcacgggcca 660

gcaattacga gtccttctaa aagctcccgc cgaggggcgc tggcgctgct gtgcagcagc 720

acgtctaaca ttagtcccac ctcgccagtt tacagggagc agaaccagct tataagcgga 780

ggcgcggcac caagaagcgg cgacggagcc gacgacgtgg aaggttttag agctagaaat 840

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 900

tttttttttc gttttgcatt gagttttctc cgtcgcatgt ttgcagtttt attttccgtt 960

ttgcattgaa atttctccgt ctcatgtttg cagcgtgttc aaaaagtacg cagctgtatt 1020

tcacttattt acggcgccac attttcatgc cgtttgtgcc aactatcccg agctagtgaa 1080

tacagcttgg cttcacacaa cactggtgac ccgctgacct gctcgtacct cgtaccgtcg 1140

tacggcacag catttggaat taaagggtgt gatcgatact gcttgctgct aagcttgcat 1200

gcctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc 1260

taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc 1320

tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat 1380

aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt 1440

gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt 1500

ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta 1560

gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt 1620

ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga 1680

tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa 1740

aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc 1800

gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca 1860

gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt 1920

ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc 1980

acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg cacggcagct acgggggatt cctttcccac 2040

cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc 2100

tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc 2160

acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac 2220

cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 2280

tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 2340

cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 2400

ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 2460

tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 2520

catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 2580

ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 2640

atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc 2700

taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 2760

tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 2820

agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 2880

tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 2940

tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 3000

ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc 3060

ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 3120

tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 3180

tgttacttct gcagccctag gcctactaga tggattacaa ggaccacgac ggggattaca 3240

aggaccacga cattgattac aaggatgatg atgacaagat ggctccgaag aagaagagga 3300

aggttggcat ccacggggtg ccagctgctg acaagaagta ctcgatcggc ctcgatattg 3360

ggactaactc tgttggctgg gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccc tcaaagaagt 3420

tcaaggtcct gggcaacacc gatcggcatt ccatcaagaa gaatctcatt ggcgctctcc 3480

tgttcgacag cggcgagacg gctgaggcta cgcggctcaa gcgcaccgcc cgcaggcggt 3540

acacgcgcag gaagaatcgc atctgctacc tgcaggagat tttctccaac gagatggcga 3600

aggttgacga ttctttcttc cacaggctgg aggagtcatt cctcgtggag gaggataaga 3660

agcacgagcg gcatccaatc ttcggcaaca ttgtcgacga ggttgcctac cacgagaagt 3720

accctacgat ctaccatctg cggaagaagc tcgtggactc cacagataag gcggacctcc 3780

gcctgatcta cctcgctctg gcccacatga ttaagttcag gggccatttc ctgatcgagg 3840

gggatctcaa cccggacaat agcgatgttg acaagctgtt catccagctc gtgcagacgt 3900

acaaccagct cttcgaggag aaccccatta atgcgtcagg cgtcgacgcg aaggctatcc 3960

tgtccgctag gctctcgaag tctcggcgcc tcgagaacct gatcgcccag ctgccgggcg 4020

agaagaagaa cggcctgttc gggaatctca ttgcgctcag cctggggctc acgcccaact 4080

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acgatgacct ggataacctc ctggcccaga tcggcgatca gtacgcggac ctgttcctcg 4200

ctgccaagaa tctgtcggac gccatcctcc tgtctgatat tctcagggtg aacaccgaga 4260

ttacgaaggc tccgctctca gcctccatga tcaagcgcta cgacgagcac catcaggatc 4320

tgaccctcct gaaggcgctg gtcaggcagc agctccccga gaagtacaag gagatcttct 4380

tcgatcagtc gaagaacggc tacgctgggt acattgacgg cggggcctct caggaggagt 4440

tctacaagtt catcaagccg attctggaga agatggacgg cacggaggag ctgctggtga 4500

agctcaatcg cgaggacctc ctgaggaagc agcggacatt cgataacggc agcatcccac 4560

accagattca tctcggggag ctgcacgcta tcctgaggag gcaggaggac ttctaccctt 4620

tcctcaagga taaccgcgag aagatcgaga agattctgac tttcaggatc ccgtactacg 4680

tcggcccact cgctaggggc aactcccgct tcgcttggat gacccgcaag tcagaggaga 4740

cgatcacgcc gtggaacttc gaggaggtgg tcgacaaggg cgctagcgct cagtcgttca 4800

tcgagaggat gacgaatttc gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctc cctaagcact 4860

cgctcctgta cgagtacttc acagtctaca acgagctgac taaggtgaag tatgtgaccg 4920

agggcatgag gaagccggct ttcctgtctg gggagcagaa gaaggccatc gtggacctcc 4980

tgttcaagac caaccggaag gtcacggtta agcagctcaa ggaggactac ttcaagaaga 5040

ttgagtgctt cgattcggtc gagatctctg gcgttgagga ccgcttcaac gcctccctgg 5100

ggacctacca cgatctcctg aagatcatta aggataagga cttcctggac aacgaggaga 5160

atgaggatat cctcgaggac attgtgctga cactcactct gttcgaggac cgggagatga 5220

tcgaggagcg cctgaagact tacgcccatc tcttcgatga caaggtcatg aagcagctca 5280

agaggaggag gtacaccggc tgggggaggc tgagcaggaa gctcatcaac ggcattcggg 5340

acaagcagtc cgggaagacg atcctcgact tcctgaagag cgatggcttc gcgaaccgca 5400

atttcatgca gctgattcac gatgacagcc tcacattcaa ggaggatatc cagaaggctc 5460

aggtgagcgg ccagggggac tcgctgcacg agcatatcgc gaacctcgct ggctcgccag 5520

ctatcaagaa ggggattctg cagaccgtga aggttgtgga cgagctggtg aaggtcatgg 5580

gcaggcacaa gcctgagaac atcgtcattg agatggcccg ggagaatcag accacgcaga 5640

agggccagaa gaactcacgc gagaggatga agaggatcga ggagggcatt aaggagctgg 5700

ggtcccagat cctcaaggag cacccggtgg agaacacgca gctgcagaat gagaagctct 5760

acctgtacta cctccagaat ggccgcgata tgtatgtgga ccaggagctg gatattaaca 5820

ggctcagcga ttacgacgtc gatcatatcg ttccacagtc attcctgaag gatgactcca 5880

ttgacaacaa ggtcctcacc aggtcggaca agaaccgggg caagtctgat aatgttcctt 5940

cagaggaggt cgttaagaag atgaagaact actggcgcca gctcctgaat gccaagctga 6000

tcacgcagcg gaagttcgat aacctcacaa aggctgagag gggcgggctc tctgagctgg 6060

acaaggcggg cttcatcaag aggcagctgg tcgagacacg gcagatcact aagcacgttg 6120

cgcagattct cgactcacgg atgaacacta agtacgatga gaatgacaag ctgatccgcg 6180

aggtgaaggt catcaccctg aagtcaaagc tcgtctccga cttcaggaag gatttccagt 6240

tctacaaggt tcgggagatc aacaattacc accatgccca tgacgcgtac ctgaacgcgg 6300

tggtcggcac agctctgatc aagaagtacc caaagctcga gagcgagttc gtgtacgggg 6360

actacaaggt ttacgatgtg aggaagatga tcgccaagtc ggagcaggag attggcaagg 6420

ctaccgccaa gtacttcttc tactctaaca ttatgaattt cttcaagaca gagatcactc 6480

tggccaatgg cgagatccgg aagcgccccc tcatcgagac gaacggcgag acgggggaga 6540

tcgtgtggga caagggcagg gatttcgcga ccgtcaggaa ggttctctcc atgccacaag 6600

tgaatatcgt caagaagaca gaggtccaga ctggcgggtt ctctaaggag tcaattctgc 6660

ctaagcggaa cagcgacaag ctcatcgccc gcaagaagga ctgggatccg aagaagtacg 6720

gcgggttcga cagccccact gtggcctact cggtcctggt tgtggcgaag gttgagaagg 6780

gcaagtccaa gaagctcaag agcgtgaagg agctgctggg gatcacgatt atggagcgct 6840

ccagcttcga gaagaacccg atcgatttcc tggaggcgaa gggctacaag gaggtgaaga 6900

aggacctgat cattaagctc cccaagtact cactcttcga gctggagaac ggcaggaagc 6960

ggatgctggc ttccgctggc gagctgcaga aggggaacga gctggctctg ccgtccaagt 7020

atgtgaactt cctctacctg gcctcccact acgagaagct caagggcagc cccgaggaca 7080

acgagcagaa gcagctgttc gtcgagcagc acaagcatta cctcgacgag atcattgagc 7140

agatttccga gttctccaag cgcgtgatcc tggccgacgc gaatctggat aaggtcctct 7200

ccgcgtacaa caagcaccgc gacaagccaa tcagggagca ggctgagaat atcattcatc 7260

tcttcaccct gacgaacctc ggcgcccctg ctgctttcaa gtacttcgac acaactatcg 7320

atcgcaagag gtacacaagc actaaggagg tcctggacgc gaccctcatc caccagtcga 7380

ttaccggcct ctacgagacg cgcatcgacc tgtctcagct cgggggcgac aagcggccag 7440

cggcgacgaa gaaggcgggg caggcgaaga agaagaagtg agctcagagc tttcgttcgt 7500

atcatcggtt tcgacaacgt tcgtcaagtt caatgcatca gtttcattgc gcacacacca 7560

gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg taccatttgt 7620

tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt gaaatggaaa 7680

tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa ttaatattat 7740

ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata tgcaaacatt 7800

ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta atatgaggag 7860

taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat attttcagac 7920

ctagaaaagc tgcaaatgtt actgaataca agtatgtcct cttgtgtttt agacatttat 7980

gaactttcct ttatgtaatt ttccagaatc cttgtcagat tctaatcatt gctttataat 8040

tatagttata ctcatggatt tgtagttgag tatgaaaata ttttttaatg cattttatga 8100

cttgccaatt gattgacaac gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 8160

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 8220

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 8280

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 8340

ttgcgtattg gctagagcag cttgccaaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca 8400

agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg 8460

taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga 8520

cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg 8580

ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg 8640

tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg 8700

tggagcacga cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 8760

gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa cctcctcgga ttccattgcc 8820

cagctatctg tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga aggtggcacc tacaaatgcc 8880

atcattgcga taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 8940

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 9000

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 9060

cttcgcaaga ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaaa 9120

tcaccagtct ctctctacaa atctatctct ctcgagtcta ccatgagccc agaacgacgc 9180

ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac 9240

cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc gcaggagtgg 9300

acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga ggtggacggc 9360

gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg 9420

gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc caccagcgga cgggactggg ctccacgctc 9480

tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc 9540

gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc cccccgcggc 9600

atgctgcggg cggccggctt caagcacggg aactggcatg acgtgggttt ctggcagctg 9660

gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg gtcctgcccg tcaccgagat ttgactcgag 9720

tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt 9780

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 9840

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcccccg 9900

aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct 9960

aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga 10020

ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagtcc gggacggcgt 10080

cagcgggaga gccgttgtaa ggcggcagac tttgctcatg ttaccgatgc tattcggaag 10140

aacggcaact aagctgccgg gtttgaaaca cggatgatct cgcggagggt agcatgttga 10200

ttgtaacgat gacagagcgt tgctgcctgt gatcaccgcg gtttcaaaat cggctccgtc 10260

gatactatgt tatacgccaa ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta 10320

aggttttaga atgcaaggaa cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg 10380

ggtatcttta aatactgtag aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat 10440

caccggaatt gaaaaaactg atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt 10500

ctcctgctaa ggtatataag ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg 10560

acagccggta taaagggacc acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc 10620

tggaaggaaa gctgcctgtt ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca 10680

atctgctcat gagtgaggcc gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa 10740

gccctgaaaa gattatcgag ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca 10800

tatcggattg tccctatacg aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac 10860

tgaataacga tctggccgat gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag 10920

atccgcgcga gctgtatgat tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt 10980

cccacggcga cctgggagac agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta 11040

ttgatcttgg gagaagcggc agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt 11100

cgatcaggga ggatatcggg gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga 11160

tcaagcctga ttgggagaaa ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc 11220

tagaatgcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 11280

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 11340

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 11400

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 11460

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 11520

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 11580

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 11640

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 11700

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 11760

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 11820

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 11880

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 11940

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 12000

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 12060

aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 12120

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata 12180

cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc 12240

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 12300

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg 12360

tgccttgatg tgggcgccgg cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta 12420

gattgcctgg ccgtaggcca gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg 12480

aagcggcggg gcgtagggag cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg 12540

ctgtgcgctg gccagacagt tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt 12600

ttaaagagtt ttaggcggaa aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt 12660

gtgaccggtt cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt 12720

acggctttgg gttcccaatg tacgtgctat ccacaggaaa cagacctttt cgaccttttt 12780

cccctgctag ggcaatttgc cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt 12840

cgccctcgat caggttgcgg tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct 12900

ccttcaaatc gtactccggc aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga 12960

acttcttgaa ctctccggcg ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg 13020

cttctgcctt gcctgcggcg cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat 13080

cgatcaaaaa gtaatcgggg tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct 13140

cgcggtacat ccaatcagct agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct 13200

ttacgatctt gtagcggcta atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt 13260

tcttggcctt cttcgtacgc tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt 13320

ctaccaggtc gtctttctgc tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg 13380

caacgtgtgg acggaacacg cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca 13440

tggattcggt tagatgggaa accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca 13500

tgccggccgg ccctgcggaa acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct 13560

cgccagctcg tcggtcacgc ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac 13620

tatcgcgggt gcccacgtca tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct 13680

tgggcggctt cctaatcgac ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga 13740

ttcgatcagc ggccgcttgc cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc 13800

gctgggcggc ctgcgcggcc ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga 13860

tttgtaccgg gccggatggt ttgcgaccgc tcacgccgat tcctcgggct tgggggttcc 13920

agtgccattg cagggccggc agacaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc 13980

tccacacatg gggcattcca cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc 14040

tcctttagcc gctaaaattc atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct 14100

gcgcgatgta ttcagatagc agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct 14160

tcagcttggt gtgatcctcc gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt 14220

ctgccaggct ggccaacgtt gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta 14280

gcgtgtttgt gcttttgctc attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt 14340

aatttcagcg gccagcgcct ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag 14400

aacggttgtg ccggcggcgg cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc 14460

aagaatgggc agctcgtacc cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc 14520

tttgatcgcc cgcgacacga caaaggccgc ttgtagcctt ccatccgtga cctcaatgcg 14580

ctgcttaacc agctccacca ggtcggcggt ggcccatatg tcgtaagggc ttggctgcac 14640

cggaatcagc acgaagtcgg ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg 14700

cgctccgtcg atcactacga agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt 14760

cgggcggtcg atgccgacaa cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg 14820

ggcactgccc tggggatcgg aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc 14880

gcgggctaga tgggttgcga tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc 14940

gataaccttc atgcgttccc cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca 15000

gcgaccgcat gacgcaagct gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc 15060

tcggtttctt cagcggccaa gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg 15120

gccaggattt catgcagccg cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg 15180

gccgcgatca tctccgcctc gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc 15240

tggtgcggtt tcatgcttgt tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg 15300

cctcggtcaa tgcgtcctca cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt 15360

cctcgctgcg ctcaagtgcg cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg 15420

cctctttcac ggtgcggcct tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg 15480

gggtgagggt agggcggggg ccaaacttca cgcctcgggc cttggcggcc tcgcgcccgc 15540

tccgggtgcg gtcgatgatt agggaacgct cgaactcggc aatgccggcg aacacggtca 15600

acaccatgcg gccggccggc gtggtggtgt cggcccacgg ctctgccagg ctacgcaggc 15660

ccgcgccggc ctcctggatg cgctcggcaa tgtccagtag gtcgcgggtg ctgcgggcca 15720

ggcggtctag cctggtcact gtcacaacgt cgccagggcg taggtggtca agcatcctgg 15780

ccagctccgg gcggtcgcgc ctggtgccgg tgatcttctc ggaaaacagc ttggtgcagc 15840

cggccgcgtg cagttcggcc cgttggttgg tcaagtcctg gtcgtcggtg ctgacgcggg 15900

catagcccag caggccagcg gcggcgctct tgttcatggc gtaatgtctc cggttctagt 15960

cgcaagtatt ctactttatg cgactaaaac acgcgacaag aaaacgccag gaaaagggca 16020

gggcggcagc ctgtcgcgta acttaggact tgtgcgacat gtcgttttca gaagacggct 16080

gcactgaacg tcagaagccg actgcactat agcagcggag gggttggatc aaagtacttt 16140

gatcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 16200

ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta a 16231

Claims (5)

1.小麦TaDCL4基因在小麦花粉败育中的应用，其特征在于，降低或沉默小麦中小麦TaDCL4-2A、TaDCL4-2B和TaDCL4-2D基因的表达， 上述TaDCL4-2A的核苷酸序列如SEQ IDNO.1，上述TaDCL4-2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，上述TaDCL4-2D的核苷酸序列如SEQ IDNO.3。

2.一种改变小麦育性的方法，其特征在于，降低或沉默小麦中小麦TaDCL4基因的表达，以获得花粉败育的小麦植株；所述小麦TaDCL4基因在小麦中位于第二号染色体的2A，2B和2D上，分别命名为TaDCL4-2A、TaDCL4-2B和TaDCL4-2D；TaDCL4-2A的核苷酸序列如SEQ IDNO.1，上述TaDCL4-2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，上述TaDCL4-2D的核苷酸序列如SEQ IDNO.3；

所述降低或沉默小麦中小麦TaDCL4基因的表达指：设计靶向TaDCL4基因的sgRNA，所述TaDCL4基因的sgRNA序列如序列SEQ ID NO.4所示；

设计sgRNA的扩增引物进行PCR扩增，利用扩增产物和载体构建具有敲除TaDCL4基因功能的pBUE411-DCL4双元载体，利用农杆菌介导将上述双元载体转化入植物中，降低或沉默小麦TaDCL4基因的表达，即可改变小麦育性。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA的扩增引物为DCL4-gR1-TaU3-F和DCL4-gR1-TaU3-R，DCL4-gR1-TaU3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5，DCL4-gR1-TaU3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的载体指pBUE411载体。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的pBUE411-DCL4双元载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

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