CN111575312B - 一种诱导小麦花粉败育的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导小麦花粉败育的方法。本发明是通过将构建的具有敲除DCL5基因功能的pBUE411‑DCL5双元载体转入小麦内，沉默小麦中DCL5基因的表达，从而获得花粉败育的小麦植株。通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平DCL5基因的沉默，可直接定向诱导小麦花粉败育。

Description

一种诱导小麦花粉败育的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导小麦花粉败育的方法，属于基因工程领域。

背景技术

花粉败育指花粉没有经过正常发育，不能起到生殖作用。花药成熟后，一般都能散放正常发育的花粉粒。由于种种内在 和外界因素的影响，有时散出的花粉没有经过正常的发育，不能起到生殖的作用，这一现象，称为花粉的败育。花粉败育的 原因是多方面的，一些情况是花粉母细胞不能正常进行减数分裂，如花粉母细胞互相粘连一起，成为细胞质块；有的出现多 极纺锤体或多核仁相连；也有产生的4个孢子大小不等，因而不能形成正常发育的花粉；有一种情况是减数分裂后花粉停留 在单核或双核阶段，不能产生精子细胞；也有因营养情况不良，以致花粉不能健全发育。绒毡层细胞的作用失常，失去应起 的作用时，也能造成花粉败育，如在花粉形成过程中，绒毡层细胞不仅没有解体，反而继续分裂，增大体积。

人工诱导花粉败育的方法通常是化学药剂诱导，但是诱导的结果并不可以明确进行控制，存在多种可能性，并不能定向 诱导。近年来，植物phasiRNA逐渐受到关注和研究，植物phasiRNA(phased,secondary,small interfering RNA)是一类内源性 的、起调控作用的非编码小RNA(s RNA)，它在植物的生长、发育、生殖以及抗病中发挥着重要作用。具有一定相位的phasiRNA (Phased small-interfering RNAs)，多数长21-nt或者24-nt。他们是由PHAS基因(phasiRNA producing genes)或者位点产生 的。在小麦幼穗和花药组织中存在大量的21-nt的phasiRNA，在不同发育时期的雄蕊组织中phasiRNA呈现动态的表达，表达高峰期出现在花粉母细胞减数分裂的前后(Zhang et al.2020)，利用相关特征我们可以开发一种新的诱导小麦花粉败育的 方法。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种诱导小麦花粉败育的方法。本发明是通过将构建的具有敲除DCL5基因 功能的pBUE411-DCL5双元载体转入小麦内，沉默小麦中DCL5基因的表达，从而获得花粉败育的小麦植株。

一种诱导小麦花粉败育的方法，具体为：降低或沉默小麦DCL5基因在小麦中的功能。

进一步的，上述方法中所述小麦TaDCL5基因在小麦中位于第二号染色体的1A，1B和1D上，分别命名为TaDCL5-1A、 TaDCL5-1B和TaDCL5-1D。

进一步的，上述TaDCL5-1A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TaDCL5-1B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示， TaDCL5-1D的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，上述方法，包括如下步骤：

1)构建具有敲除TaDCL5基因的表达载体pBUE411-DCL5；

2)用步骤1)中构建的表达载体通过农杆菌转化小麦材料，从而降低或沉默小麦TaDCL5基因在小麦中的功能，获得 花粉败育的小麦植株。

进一步的，上述步骤1)中所述的构建具有敲除TaDCL5基因的表达载体pBUE411-DCL5的方法，包括如下步骤：

S1设计靶向TaDCL5基因的sgRNA，sgRNA对应的引物对为DCL5-gR1-TaU3-F和DCL5-gR1-TaU3-R；

S2利用步骤S1中设计的引物对，合成sgRNA的2条oligo，经过磷酸化和退火形成双链；

S3利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收载体片段；

S4将步骤S3中回收的pBUE411载体片段和步骤S2获得的带有粘性末端的双链sgRNA通过T4连接酶进行连接反应， 获得最终的pBUE411-DCL5双元载体。

进一步的，上述方法中的步骤S1中所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的DCL5-gR1-TaU3-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述的DCL5-gR1-TaU3-R的序列如SEQ IDNO.6所示。

进一步的，上述方法中的步骤S3中所述的载体片段为启动子A、启动子B、终止子A、终止子B；

进一步的，上述启动子A的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；上述启动子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；上述 终止子A的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；上述终止子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

进一步的，上述方法中的步骤S4中所述的pBUE411-DCL5双元载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本申请构建具有敲除TaDCL5基因的表达载体pBUE411-DCL5，通过小麦基因转化过程在基因组水平突变DCL5基因。

本发明通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现TaDCL5基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦TaDCL5 基因。TaDCL5基因在小麦中位于第二号染色体的1A，1B和1D上，分别命名为TaDCL5-1A、TaDCL5-1B和TaDCL5-1D。 其基因组序列在1A、1B和1D上的全长分别为11900、5505和12092个碱基。TaDCL5-1A和TaDCL5-1D部分同源基因均 由26个外显子和25个内含子组成，TaDCL5-1B基因由13个外显子和12个内含子组成。TaDCL5-1A、TaDCL5-1B和 TaDCL5-1D分别含4884、3111和4887个碱基的开放阅读框，分别编码一段含1628、1037和1629个氨基酸残基的多肽链。 这三个部分同源基因之间编码区的相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述三个位点的TaDCL5基因提供 了理论依据

本发明是根据TaDCL5-1A、TaDCL5-1B和TaDCL5-1D的cDNA保守序列设计一个长度为20bp的sgRNA，该sgRNA 位于TaDCL5的第二个外显子上。

有益效果：

在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平TaDCL5基因的沉默，是利用基因工程技术沉默TaDCL5 基因的有力工具。沉默该基因可以帮助研究人员进一步了解小麦中TaDCL5在phasiRNA合成路径中是如何具体发挥作用和 行使其生物学功能。

附图说明

图1pBUE411载体BsaI酶切电泳图。

图2Bar试纸条检测转基因小麦植株。

图3dcl5不育突变体和对照JW1的花药、灌浆期籽粒和穗子的表型

图4dcl5不育突变体(B)和对照JW1(A)的花粉颗粒表型。

图5dcl5不育突变体和对照JW1的株型表型。

图6dcl5不育突变体和对照材料JW1的四分体时期幼穗中的小分子RNA长度分布。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是 本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三 次重复实验，结果取平均值。PCR扩增所需的高保真酶、DNA片段连接所需的T4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收 试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团， 维生素和抗生素以及激素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411,含有小麦U3启动子TaU3，用以 启动sgRNA，Cas9p模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物优化密码子基因。本实验室所 用的大肠杆菌菌株是E.coli DH5α。

T4连接酶、DNA Marker DL2000等试剂购自Takara公司；FastPfu、2*Taq Mix、DH5α等购自北京全式金公司；限制性 内切酶BsaI-HF购自NEB公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，序列如下：

表1本研究中使用的引物

小麦品种JW1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研 究所获得。

质粒pBUE411(17430bp)由中国农业大学孙其信课题组提供；公众可从中国农业大学获得。

实验例1表达载体的构建

1.靶向TaDCL5的sgRNA的设计

在小麦TaDCL5的三个拷贝的编码区序列见图1所示，下划线部分的序列为靶向TaDCL5基因的sgRNA序列，下划 线部分前三位的序列标记为PAM序列。通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在TaDCL5基因的编码区寻找1个 适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，sgRNA序列选定为AACCAATATCTCTGCGGAGC(SEQ ID NO.2)。

2.sgRNA的退火及双链的形成

TaDCL5基因的sgRNA的2条oligo是由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，其中sgRNA的寡核苷酸对应的是 DCL5-gR1-TaU3-F和DCL5-gR1-TaU3-R(表1)，引物中的下划线碱基部分是与pBUE411载体中的序列匹配。分别将sgRNA 的2条oligo进行磷酸化，直接退火形成双链，体系为：DCL5-gR1-TaU3-F(10μM)：4μL,DCL5-gR1-TaU3-R(10uM)：4μL,10×T4PNK buffer:1.5μL,PNK:1μL,ATP:1μL,ddH₂O补足15μL。程序在PCR仪中按下列条件运行：37℃,30min；95℃,5min；ramp to 25℃at 5℃/min(0.08℃/s)。或者是沸水中煮5min，之后自然冷却至室温。

3.pBUE411载体的线性化

用BsaI的内切酶酶切pBUE411载体3h如图1所示，1为pBUE411用BsaI酶切；2为DL2000 Marker；3为1kb Marker， 电泳后回收线性载体片段，回收含有启动子A、终止子A、启动子B、终止子B的载体片段。

所述启动子A的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；上述启动子B的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；上述终止子A的 核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；上述终止子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.pBUE411载体与sgRNA的连接反应

连接反应体系为：5×ligation Buffer 2μL，annealed oligo duplex 4μL，pBUE411/BsaI 2ul(100ng)，T4 ligase 1μL，ddH₂O 补足10μL，25℃30min进行连接反应。

5.转化验证

将连接产物转化大肠杆菌，重组质粒经转化到DH5α感受态细胞，之后于LB(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克 隆进行菌液PCR鉴定及测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。在靶序列上游都检测到了TaU3启动子序列，说明sgRNA 表达盒构建成功，并成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了TaDCL5的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。

实验例2基因编辑载体的转化普通小麦

1.培养基配制：见文献Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in Molecular Biology,vol.1223 DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,SpringScience+Businedd Media New York 2015

2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28度培养24小时， 穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的 菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23度暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25度。将愈伤转移至筛选 培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上。

用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。 抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。

糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。 注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。

封好培养皿，放到25度培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。 待苗长到一定大小可以取样检测。

3.转基因苗的突变体检测

3.1 T0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选

由于此次转化所用载体上T-DNA区域有cas9、bar和gRNA三个表达框，其中bar基因的表达检测已经非常成熟，已经 有商业化的检测试剂条，样品经过粗磨后用试剂条在10分钟内就可以判断是否带有bar基因，比PCR扩增快速高效。因此， 我们以未转基因植株作为阴性对照，利用bar基因检测试剂盒quickstix^TM对转基因小麦T0植株进行检测，具体操作如下：

取转基因苗3-5cm,放入1.5m离心管中，用研磨棒研磨后加入Buffer 500μL，插入Bar试纸条，静置5min，根据试条 显示带数纪录数据，2条带表示阳性，1条带代表阴性。上述试剂盒购自麦蒂森科技有限公司。

筛选阳性转基因苗子结果如图2所示，样品1-10为T0代再生苗，11为阴性对照，12为阳性对照，其中样品1，3，4， 5，6，7，8，9，10出现两条带，与阳性对照9结果一致，为阳性苗；1-10分别代表DCL5-01，-02，-03，-04，-05，06， -07，-08，-09和-10。

3.2T0代转基因植株TaDCL5基因的特异性扩增和突变体鉴定

目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用天津诺禾致源公司生产的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒。该 试剂盒通过PCR法自动完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列 两侧的特异性引物(表1中的Primer-F和Primer-R)对TaDCL5进行扩增，扩增产物建库后送到诺禾致源测序。

目的基因小麦TaDCL5基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，其推导的氨基酸序列如下所示：

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突变体的目的基因核苷酸序列发生改变，其推导的氨基酸序列如下所示：

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>TaDCL5-1D-M

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经比对，DCL5-07在TaDCL5-1A的CDS序列的+3071位插入了1个碱基A，造成CDS区从第3073-4881位的1692个 核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失1025-1627位的564个氨基酸序列；DCL5-07在TaDCL5-1B的CDS序列的+1301位插入了1个碱基A，造成CDS区从第4-1467位的1464个核酸序列不能翻译成氨基酸序 列，即与野生型序列相比，蛋白质序列缺失2-489位的488个氨基酸序列；DCL5-07在TaDCL5-1D的CDS序列的+3074位 插入了1个碱基A，造成CDS区从第3076-4884位的1668个核酸序列不能翻译成氨基酸序列，即与野生型序列相比，蛋白 质序列缺失1026-1628位的556个氨基酸序列。

第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-DCL5基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL, Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃变性2min； 94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。

之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补 足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延 伸5min。

4 dcl5基因编辑突变体的表型检测

4.1 dcl5基因编辑株系后代穗部表型检测

挑选dcl5基因编辑株系7后代材料和未转基因株JW1材料，进行了温室种植。在DCL5基因编辑材料中，在T0代中 没有观察到2株不育的表型。将T0代不育的株系进行杂交后，在T1代第7株系的8颗苗中，有两颗苗表现为完全不育。 图5中是不育突变体和对照植株的花药对比图(图3中A和B)以及突变体和对照植株穗子对比图(图3中C和D)，图3 中的A为dcl5不育突变体的花药表型与对照JW1(图3中的B)相比，比较瘦小，散粉后籽粒不发育。dcl5不育突变体株 系(图3中的C)的穗子与对照JW1(图3中的D)相比没有明显差异。

4.2 dcl5基因编辑株系后代花粉表型检测

对照JW1的花粉(图4中的A)，用碘化钾染色后，在显微镜下可观察到黑紫色的饱满的圆形颗粒。与对照相比，dcl5 不育突变体的花粉(图4中的B)用碘化钾染色后，多数颗粒表面凹陷、不饱满，呈黄色，这样的花粉没有受精能力，花粉表 现为败育，导致籽粒灌浆不能进行。从花粉的数量上，dcl5不育突变体的花粉量与野生型相当，没有表现出明显的增多或者 减少。

4.3dcl5基因编辑株系后代穗部表型检测

图5为dcl5不育突变体的整株表型与对照JW1相比(箭头处为不育的穗子)，并没有表现出明显的差异。因此，这个 基因可能可以用于利用基因编辑手段创造小麦雄性不育系种质资源。

4.4 dcl5基因编辑突变体影响到21-nt小分子RNA的合成

目前，dcl5不育突变体材料四分体时期的幼穗进行了小分子RNA测序。分析发现，而在dcl5不育突变体中，21-nt小 分子RNA在占总小分子RNA的比例上显著的多于野生型JW1(P-value<2.2e-16；图6)，但21-nt小分子RNA的数量或者 read数与野生型相当；而24-nt的小分子RNA在数量和占总小分子RNA的比例上都显著的少于野生型JW1(P-value<2.2e-16；图6)。这说明，DCL5基因的缺失可能影响到了小麦24-nt小分子RNA的生物合成。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院作物研究所

<120> 一种诱导小麦花粉败育的方法

<130> 2020

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4884

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

atggccatgg ccgacgacga cgacggcccc ctgcccccgc ctccgccgcc gccgccgcct 60

cgccgtcccc acaggcagct ccagccgagg aggtaccagg tggaggtgtt cgaggcggcg 120

ctgcagggga acaccatcgc ggtgctcgac accggctccg ggaagaccat ggtcgccgtc 180

ctgctcgcgc gccaccacgt gggccgcgtg cgcgccgggg aggtgccccg ccggatcgtc 240

ttcttcctcg cgcccaccgt gcacctcgtc caccagcaat tcgaggtgat tcgggagtac 300

acagacctcg acgccgcgga gtgctacgga gcttcggggg tcggcgactg gagtacagac 360

cgctggaaca aggaagttgg gagcaaggag attgctgtta tgacgcccca gatattgttg 420

gatgccctga ggcatgcctt tgtaacaatg agtgcagtga gcctgctaat atttgatgaa 480

tgccatcgtg cctgtggaaa ccacccatat acacgaataa tgaaggaatt ttaccttggt 540

tctcagtgga ggccagctgt atttggaatg acagcatctc ctgttgctac taaaggcact 600

tgcacggtac aagattgtga agcacacatt ggtcaacttg aacttacatt ggatgcaaag 660

gtatatatca taaaagatcg tagtgaactt gagagctttt cccctcctgc aacaattgtg 720

cacgaatact atgatgctta ctcgattgat ttcgaagatc tgaaatcgaa gctccagata 780

ttgtatgaag agtatgatgc tttgttggct agtctgcaag aatcgtcacc aaataaattt 840

gaagacacga ataacatatt agagacatca agaaagacct tgttcagata ccatgagaag 900

atattttatg gcctaaatta tcttggtcca atcatcaccg ctgaggtagt gaagatatat 960

aatgaaagca ttaagacact gggtgattct gaagattgtc tcttctcgaa agctagcttc 1020

agcctgcatg tagcttattt taaagaagct ttagatttaa ttgaggaagt attgccacat 1080

ggttatggtg aactaatgaa atcagaatct ggttctgcgg aattaattaa aagggggtat 1140

atttcttcaa aagtggatgc tctaatcaac atttttaaat catttgggtc atcaaacgaa 1200

gtgctttgcc taatttttgt agatagaatt atgacagcta aagctgttga gaggttcatg 1260

agaggaattg ttagtttctc tagtttttca atttcttact tgactggagg gagtacatca 1320

aaagattctc tgagcccagc agtgcagaga tatactttag acttgttccg atctggaaag 1380

gtgaacttgc ttttcaccac agatgtaact gaagagggta ttgatgtacc taactgttct 1440

tgtgtcatac gcttcgacct gcccagaact gtttgtagct acgttcaatc tcgtggtcgt 1500

gccagaagga gcagctcaaa ttatgttctt atgattgaga ggggaaacat ggatcagcag 1560

gaacacatat tccgcataat acggactgag tactatatta aacacttcgc tctgtatagg 1620

cacaaaaacc ccaatgtttc atcctctgag tggcctatgc aagataagta tgcatactat 1680

gttgattcaa caggagcaac tataactgca gactgctgtg ttgatctgat ccgtaaatat 1740

tgtgagaaac ttcctaaaga taggtattac atgccaaagc cttcctttgc ggtggctatc 1800

gaagatggat cataccaatg caccttgact ttgcctccaa atgcggcgtt tcaaaggata 1860

gttggccctt tatgcagtac aagtaattta gccaagcagc ttgtatccct agatgcgtgc 1920

aagaaattgc atcagctagg agaactcaat gatcatcttc tacccttcac cgaagaacct 1980

attgaaattg atgttgcttt aagagatggg aaattccttt ctggaccagg aacgactaaa 2040

agaaaggagc tccatggaac aagaaatgtt cttgccctgt caggatcgtg gattcatgaa 2100

agtgaaagtg tcacattgaa tgcttataga ttcgattttc tttgtgacca agagggtgaa 2160

aactatgctg ggtttgttct cttaatggaa tcagcacttg atgatgatgt agcttgttct 2220

aaaatggatc tattcctgat ccctaataaa atggtgtaca ccaccgtaac tccgtgtgga 2280

aaagttcaac tggacaaaaa acagctacgt gacgggaagt tgttccaaga attctttttc 2340

aatggaatat ttggtagatt atttcatgga tctcgaacaa gtggagtgca aagggaattt 2400

cttttcagaa aaggtcatga aatacaatgg agctcagaga gcatgtactt acttttacct 2460

ttgaggcatt caccacacat ccagcaagat ttaaacatat actgggaggc agttgaatcc 2520

tgcacccagg cggtggagca gttgagaaat ttgtatctgg aagatgaaaa tatccgtgca 2580

aattttattc aacatagaag tatcaaggag aaagacatta ttcatctggc caacaaatct 2640

cttcattttt ctagcatcaa agattcagtt gtgctatcgc ttcatactgg aaggatatac 2700

tctgttcttg acttgatcta tgacacaact gctgaagact cgtttgaaga gatgtataat 2760

ggaaaagctt caccgttttc ttcattcatg gactactacc gtgaaaagta tggtattgtt 2820

attcaacatc caaagcaacc gttgttgctg ttaaagcaaa gccacaatgc acacaatctt 2880

cttttttcaa aatcgaagta catagatggt tctacgggtg atcctttgct catggaaaaa 2940

gagcaaatac acgcccgggt cccacctgaa ttgttaatcc acattgatgt gacaattgaa 3000

gttctcaaat ctttttattt attgccttct gtaatgcatc gacttcagtc tctcatgcta 3060

gccagccagc tccgcagaga tattggttac actcaacata taccaagtta cctgattttg 3120

gaagctatca caactttaag gtgctgcgaa acattttccc tggagcgttt agaattattg 3180

ggagactcag tactaaaata tgtgatagga tgtgacctgt ttttaaggta tcctatgaaa 3240

catgaaggtc atctttctga tatgagatca aatgctgtct gcaatgctac gcttcataag 3300

cacggaatct ggcgatcctt gcagggttac gtgcgggata gtgcatttga cccacggcgt 3360

tgggttgctc ctgggcagat atctttgcgc ccttttcctt gtaactgcgg aattgagact 3420

gcatttgttc caactaatgg aaggtatatc agcgacgacc catcttttgt cgttggaaaa 3480

ccatgtgata gagctcacag atggatgtgc tcgaaagcaa tatctgattg tgttgaagcc 3540

ctagttggag catattatgt cggtggtggc atagttgctg cactttgggt tatgaagtgg 3600

ttcggtattg aaataaaatg cgataggaag ttggtacagg aagtaaagct caacgcatct 3660

tatatatgct acttacctaa aataagtgtt attgaggagt tggaagcaaa actgaagtac 3720

aacttctcag tcaagggcct tctactggaa gccataactc atccatctct gcaggaatta 3780

ggggttgact actgttacca gcgtctggaa tttctgggtg attctgtgct ggatctacta 3840

attacacgct atctctatgt tacccatact gatgttgatc ctggagaatt gacagactta 3900

cgttccgctt tggttagtaa tgagaatttt gcagaagtag ttttaagaaa taacattcac 3960

agtcatctac agcatgggtc tggaatactt ttggagcaaa tcacagaata tgttagatcc 4020

aatttggagt gccaagggaa ggttaataaa ttccttcaac atgctacatg taaagtacct 4080

aaggtgcttg gagacattat ggaaagcatt gccggtgcaa tatttgtaga cacagatttt 4140

aatgttgatg tggtttggaa gattgttgaa ccgttgcttt ccccaatgat aacccctgat 4200

aatcttgcat tgccacctta tcgggagttg ttagagctgt gtagtcacct tggttatttc 4260

ataaattcaa aatgcagtag taaaggagaa gaagtaagta tagagatgtc agtgcaatta 4320

cgagatgaac tgctgatagc gcaaggacaa gacagaaata agaagagtgc aaaggcaaaa 4380

gcagcagctc gtatattggc agatctgaag aaaagaggcc tttcaatgaa acaatgtcct 4440

tctaaagcta agcagtcggg tattatatct tcggaccagc agtatccttt ggcaagtttg 4500

gaatcaccac ttgattattg tcaggtgaat gtcaatccta gcctaggagg ccttccctca 4560

ctgaaagaag cagttgttct tcggctcaaa atggacaaag gtggaccacg aagtgctctt 4620

tttaagctat gcaagaggtt gcagtggcca atgccagaat tcgaatttgt ggaacaaagg 4680

ttcaggactc ctattgttct ggacggggta accacaacga acttcaatag cttcgtgtca 4740

accatcacct tgcacatacc tgatgtagca gccattacac ttcaaggtga gcggcgaact 4800

gacaaaaaga gttcccagga ttcagcatcg ctgacaatgc tccacaagct tcaagagctc 4860

aaggtctgta tatgcaagac ttag 4884

<210> 2

<211> 3111

<212> DNA

<213> 序列

<400> 2

atgccaaagc cttcctttgc ggtggctatc gaagatggat cataccaatg caccttgact 60

ttgcctccaa atgcggcgtt tcaaaggata gttggccctt tatgcagtac aagtaattta 120

gccaagcagc ttgtatccct agatgcgtgc aagaaattgc atcatctagg agaactcaat 180

gatcatcttc tacccttcac cgaagaacct attgatattg atgttgcttt aagagatggg 240

aaattccttt ctggaccagg aacgactaaa agaaaggagc tccatggaac aagaaatgtt 300

cttgccctgt caggatcgtg gattcatgaa agtggaagtg tcacattgaa tgcttataga 360

ttcggttttc tttgtgacca agagggtgaa aactatgctg ggtttgttct cttaatggaa 420

tcagcacttg atgatgatgt agcttattca aaaatggatc tattcctgat ccctaataaa 480

atggtctaca ccaccgtaac tccgtgtgga aaagttcaac tggacaaaaa acagctacgt 540

gacgggaagt tgtttcaaga attctttttc aatggaatat ttggtagatt atttcatgga 600

tctcgaacaa gtggagtgca aagggaattt cttttcagaa aaggtcatga aatacaatgg 660

agctcagaga gcatgtactt acttttacct ttgaggcatt caccacacat ccagcaagat 720

ttaaacatat actgggaggc agttgaatcc tgcacccagg cggtggagcg gttgagaaat 780

ttgtatctgg aagaggaaaa tatccgtgca aattttattc aacatagaag tatcaaggag 840

aaagacatta ttcatctggc caacaaatct cttcattttt ctagcatcaa agattcagtt 900

gtgctatcgc ttcatactgg aaggatatac tctgttcttg acttgatcta tgacataact 960

gctgaagacg cgtttgaaga gatgtataat ggaaaagctt caccgttttc ttcattcgtg 1020

gactactatc gtgaaaagta tggtattgtt attcaacatc caaaacaacc gttgttgctg 1080

ttaaagcaaa gccacaatgc acacaatctt cttttttcaa aatcgaagta catagatggt 1140

tctacgggcg atcctttgct tatggaaaaa gagcaaatac acgcccgggt cccacctgaa 1200

ttgttaatcc acattgatgt gacaattgaa gttctcaaat ctttttactt attgccttct 1260

gtaatgcatc gacttcagtc tctcatgcta gccagccagc tccgcagaga tattggttac 1320

actcaacata taccaagtta cctgattttg gaagctatca caactttaag gtgctgtgaa 1380

acattttccc tggagcgttt agaactattg ggagactcag tactaaaata tgtgatagga 1440

tgtgacctgt ttttaaggta tcctatgaaa catgaaggtc atctttctga tatgagatca 1500

aatgctgtct gcaatgctac acttcataag cacggaatct ggcgatcctt gcagggttac 1560

gtgcgggata gtgcatttga cccacggcgt tgggttgctc ctgggcagat atctttgcgc 1620

ccttttcctt gtaactgcgg aattgagact gcatttgttc caactaatgg aaggtatatc 1680

agcgacgacc catcttttgt agttggaaaa ccatgtgata gagctcacag atggatgtgc 1740

tcgaaagcaa tatctgattg tgttgaagcc ctagttggag catattatgt tggtggtggc 1800

atagttgctg cactttgggt tatgaagtgg ttcggtattg aaataaaatg cgataggacg 1860

ttggtacagg aagtaaagct caatgcatct tatatatgct acttacctaa aataagtgtt 1920

attgaggagt tggaagcaaa actgaagtac aacttctcgg tcaagggcct tctactggaa 1980

gccataactc atccatctct gcaggaatta ggggttgact actgttacca gcgtctggaa 2040

tttctgggtg attctgtgct ggatctacta attacacgct atctctatgt tacccatact 2100

gatgttgatc ctggagaatt gacagactta cgttccgctt tggttagtaa cgagaatttt 2160

gcagaagtag ttttaagaaa caacattcac agtcatctac agcatgggtc tggaatactt 2220

ttggagcaaa tcacagaata tgttagatcc aatttggagt gccaagggaa ggttaataaa 2280

ttccttcaac atgctacatg taaagcacct aaggtacttg gtgacattat ggaaagcatt 2340

gccggtgcaa tatttgttga cgcagatttt aatgttgatg tggtttggaa gattgttgaa 2400

ccgttgcttt ccccaatgat aacccctgat aatcttgcat tgccacctta tcgggagttg 2460

ttagagctgt gtagtcacct tggttatttc ataaattcaa aatgcagtag taaaggagaa 2520

gaattaagta tagagatgtc agtgcaatta cgagatgaac tgttgatagc gcaaggacaa 2580

gacagaaaca agaagagtgc aaaggcaaaa gcagcagctc gtatattggc agatctgaag 2640

aaaagaggcc tttcaatgaa acaatgttct tctaaagcta agcagttgga tattatatca 2700

tcggagcagt atcctttggc aagtttggaa tcaccacttg attattgtca cgtgaatgcc 2760

aatcctagcc taggaggcct tccctcactg aaagaagcag ttgttcttcg gcttaaaatg 2820

gacaaaggtg gaccacgaag tgctcttttt aagctatgca agaggttgcc gtggccaatg 2880

ccagaattcg aatttgttga acaaaggttc aggactccta ttgttctgga cggggtaacc 2940

acaacgaact tcaatagctt cgtgtcaacc atcaccttgc acatacctga tgtaacagcc 3000

attacacttc aaggcgagcg gcggactgac aaaaggagtt cccaggattc agcatcgctg 3060

gcaatgctcc acaagcttca agagctcaag gtctgtatat gcaagactta g 3111

<210> 3

<211> 4887

<212> DNA

<213> 序列

<400> 3

atggccatgg ccatggccga cgacgacggc cccatccccc cgcctccgcc gccgccgccg 60

cctcgccgcc cccacaggca gctccagccg aggaggtacc aggtggaggt gttcgaggcg 120

gcgctgcagg ggaacaccat cgcggtgctc gacaccggct ccggaaagac catggtcgcc 180

gtcctgctcg cgcgccacca cgtgggccgc gtgcgcgccg gggaggtgcc ccgccggatc 240

gtcgtcttcc tcgcgcccac cgtgcacctc gtccaccagc aattcgaggt gattcgggag 300

tacacggacc tcgacgccgc tgagtgctac ggagcttcgg gggtcggcga ctggagtacc 360

gaccgctgga acaaggaagt tgggagcaag gagattgctg ttatgacgcc ccagatattg 420

ttggatgccc tgaggcatgc ctttgtaaca atgagtgcag tgagcctgct aatatttgat 480

gaatgccatc gtgcctgtgg aaaccaccca tatacacgaa taatgaagga attttacctt 540

ggctctcagt ggaggccagc tgtatttgga atgacagcat ctcctgttgc tactaaaggc 600

acttgcacgg tacaagattg tgaagcacac attggtcaac ttgaacttac attggatgcg 660

aaggtatata tcataaaaga tcgtagtgaa cttgagagct tttcccctcc tgcaacaatt 720

gtgaacaaat actatgatgc ttactcgatt gatttcgaag atctgaaatc gaagctccag 780

atattgtatg aagagtatga tgctttgttg gctagtctgc aagaatcgtc accaaataaa 840

tttgaagaca cgaataacat attagagaca tcaagaaaga ccttgttcag ataccatgag 900

aagatatttt atggcctaaa ttatcttggt ccaatcatca ccgctgaggt agtgaagata 960

tataatgaaa gcattaagac actgggtgat tctgaagatt gcctcttctc gaaagctagc 1020

ttcagcctgc atgtagctta ttttaaagaa gctttagatt tagttgagga agtattgcca 1080

catggttatg gtgaactaat gaaatcagaa tctggttctg cggaattaat taaaagcggg 1140

tatatttctt caaaagtgga tgctctaatc aacattttta aatcatttgg gtcatcaaac 1200

gaagtgcttt gcctaatttt tgtagaaaga attatgacag ctaaagctgt tgagaggttc 1260

atgagaggaa ttgttaattt ctctagtttt tcaatttctt acttgactgg agggagtaca 1320

tcaaaagatt ctctgagccc agcagtgcag agatatactt tggacttgtt ccgatctgga 1380

aaggtgaact tgcttttcac cacagatgta actgaagagg gtattgatgt acctaactgt 1440

tcttgtgtca tacgcttcga cctgcccaga actgtttgta gctacgttca atctcgtggt 1500

cgtgccagaa ggagcagctc aaattatgtt cttatgattg agaggggaaa catggatcag 1560

caggaacaca tattccgcat aatacagact gagtactata ttaaacactt cgctctgtat 1620

aggcacagaa accccaatgt ttcatcctct gagtggccta tgcaagataa gtatgcatac 1680

catgttgatt caacaggagc aactataact gcagactgct gtgttgatct gatccgtaaa 1740

tattgtgaga aacttcctaa agataggtat tacattccaa agccttcctt tgcggtggct 1800

atcgaagatg gatcatacca atgcaccttg actttgcctc caaatgcggc gtttcaaagg 1860

atagttggcc ctttatgcag tacaagtaat ttagccaagc agcttgtatc cctagatgcg 1920

tgcaagaaat tgcatcagct aggagaactc aatgatcatc ttctaccctt caccgaagaa 1980

cctattgata ttgatgttgc tttaagagat gggaaattcc tttctggacc aggaacgact 2040

aaaagaaagg agctccatgg aacaagaaat gttcttgccc tgtcaggatc gtggattcat 2100

gaaagtgaaa gtgtcacatt gaatgcttat agattcgatt ttctttgtga ccaagagggt 2160

gaaaactatg ctgggtttgt tctcttaatg gaatcagcac ttgatgatga tgtagcttgt 2220

tcaaaaatgg atctattcct gatccctaat aaaatggtct acaccaccgt aactccgtgt 2280

ggaaaagttc aactggacaa aaaacagcta cgtgacggga agttgttcca agaattcttt 2340

ttcaatggaa tatttggtag attatttcat ggatctcgaa caagtggagt gcaaagggaa 2400

tttcttttca gaaaaggtca tgaaatacaa tggagctcac agagcatgta cttactttta 2460

cctttgaggc attcaccaca catccagcaa gatttaaaca tatactggga ggcagttgaa 2520

tcctgcaccc aggcggtgga gcagttgaga aatttgtatc tggaagatga aaatatccgt 2580

gcaaatttta ttcaacatag aagtatcaag gagaaagaca ttattcatct ggccaacaaa 2640

tctcttcatt tttctagcat caaagattca gttgtgctat cgcttcatac tggaaggata 2700

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caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 11640

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 11700

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 11760

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 11820

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 11880

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 11940

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 12000

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 12060

aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 12120

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata 12180

cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc 12240

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 12300

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg 12360

tgccttgatg tgggcgccgg cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta 12420

gattgcctgg ccgtaggcca gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg 12480

aagcggcggg gcgtagggag cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg 12540

ctgtgcgctg gccagacagt tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt 12600

ttaaagagtt ttaggcggaa aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt 12660

gtgaccggtt cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt 12720

acggctttgg gttcccaatg tacgtgctat ccacaggaaa cagacctttt cgaccttttt 12780

cccctgctag ggcaatttgc cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt 12840

cgccctcgat caggttgcgg tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct 12900

ccttcaaatc gtactccggc aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga 12960

acttcttgaa ctctccggcg ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg 13020

cttctgcctt gcctgcggcg cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat 13080

cgatcaaaaa gtaatcgggg tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct 13140

cgcggtacat ccaatcagct agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct 13200

ttacgatctt gtagcggcta atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt 13260

tcttggcctt cttcgtacgc tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt 13320

ctaccaggtc gtctttctgc tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg 13380

caacgtgtgg acggaacacg cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca 13440

tggattcggt tagatgggaa accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca 13500

tgccggccgg ccctgcggaa acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct 13560

cgccagctcg tcggtcacgc ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac 13620

tatcgcgggt gcccacgtca tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct 13680

tgggcggctt cctaatcgac ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga 13740

ttcgatcagc ggccgcttgc cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc 13800

gctgggcggc ctgcgcggcc ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga 13860

tttgtaccgg gccggatggt ttgcgaccgc tcacgccgat tcctcgggct tgggggttcc 13920

agtgccattg cagggccggc agacaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc 13980

tccacacatg gggcattcca cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc 14040

tcctttagcc gctaaaattc atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct 14100

gcgcgatgta ttcagatagc agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct 14160

tcagcttggt gtgatcctcc gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt 14220

ctgccaggct ggccaacgtt gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta 14280

gcgtgtttgt gcttttgctc attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt 14340

aatttcagcg gccagcgcct ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag 14400

aacggttgtg ccggcggcgg cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc 14460

aagaatgggc agctcgtacc cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc 14520

tttgatcgcc cgcgacacga caaaggccgc ttgtagcctt ccatccgtga cctcaatgcg 14580

ctgcttaacc agctccacca ggtcggcggt ggcccatatg tcgtaagggc ttggctgcac 14640

cggaatcagc acgaagtcgg ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg 14700

cgctccgtcg atcactacga agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt 14760

cgggcggtcg atgccgacaa cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg 14820

ggcactgccc tggggatcgg aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc 14880

gcgggctaga tgggttgcga tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc 14940

gataaccttc atgcgttccc cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca 15000

gcgaccgcat gacgcaagct gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc 15060

tcggtttctt cagcggccaa gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg 15120

gccaggattt catgcagccg cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg 15180

gccgcgatca tctccgcctc gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc 15240

tggtgcggtt tcatgcttgt tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg 15300

cctcggtcaa tgcgtcctca cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt 15360

cctcgctgcg ctcaagtgcg cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg 15420

cctctttcac ggtgcggcct tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg 15480

gggtgagggt agggcggggg ccaaacttca cgcctcgggc cttggcggcc tcgcgcccgc 15540

tccgggtgcg gtcgatgatt agggaacgct cgaactcggc aatgccggcg aacacggtca 15600

acaccatgcg gccggccggc gtggtggtgt cggcccacgg ctctgccagg ctacgcaggc 15660

ccgcgccggc ctcctggatg cgctcggcaa tgtccagtag gtcgcgggtg ctgcgggcca 15720

ggcggtctag cctggtcact gtcacaacgt cgccagggcg taggtggtca agcatcctgg 15780

ccagctccgg gcggtcgcgc ctggtgccgg tgatcttctc ggaaaacagc ttggtgcagc 15840

cggccgcgtg cagttcggcc cgttggttgg tcaagtcctg gtcgtcggtg ctgacgcggg 15900

catagcccag caggccagcg gcggcgctct tgttcatggc gtaatgtctc cggttctagt 15960

cgcaagtatt ctactttatg cgactaaaac acgcgacaag aaaacgccag gaaaagggca 16020

gggcggcagc ctgtcgcgta acttaggact tgtgcgacat gtcgttttca gaagacggct 16080

gcactgaacg tcagaagccg actgcactat agcagcggag gggttggatc aaagtacttt 16140

gatcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 16200

ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta a 16231

<210> 8

<211> 527

<212> DNA

<213> 序列

<400> 8

catgaatcca aaccacacgg agttcaaatt cccacagatt aaggctcgtc cgtcgcacaa 60

ggtaatgtgt gaatattata tctgtcgtgc aaaattgcct ggcctgcaca attgctgtta 120

tagttggcgg cagggagagt tttaacattg actagcgtgc tgataatttg tgagaaataa 180

taattgacaa gtagatactg acatttgaga agagcttctg aactgttatt agtaacaaaa 240

atggaaagct gatgcacgga aaaaggaaag aaaaagccat actttttttt aggtaggaaa 300

agaaaaagcc atacgagact gatgtctctc agatgggccg ggatctgtct atctagcagg 360

cagcagccca ccaacctcac gggccagcaa ttacgagtcc ttctaaaagc tcccgccgag 420

gggcgctggc gctgctgtgc agcagcacgt ctaacattag tcccacctcg ccagtttaca 480

gggagcagaa ccagcttata agcggaggcg cggcaccaag aagcggc 527

<210> 9

<211> 1992

<212> DNA

<213> 序列

<400> 9

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540

aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660

cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720

acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780

ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 840

ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 900

tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 960

ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 1020

tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1080

tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1140

tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1200

atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1260

gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1320

tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1380

agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1440

gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1500

ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1560

gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1620

aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1680

catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1740

ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 1800

ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1860

gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1920

atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 1980

ttacttctgc ag 1992

<210> 10

<211> 291

<212> DNA

<213> 序列

<400> 10

tttttttttt cgttttgcat tgagttttct ccgtcgcatg tttgcagttt tattttccgt 60

tttgcattga aatttctccg tctcatgttt gcagcgtgtt caaaaagtac gcagctgtat 120

ttcacttatt tacggcgcca cattttcatg ccgtttgtgc caactatccc gagctagtga 180

atacagcttg gcttcacaca acactggtga cccgctgacc tgctcgtacc tcgtaccgtc 240

gtacggcaca gcatttggaa ttaaagggtg tgatcgatac tgcttgctgc t 291

<210> 11

<211> 571

<212> DNA

<213> 序列

<400> 11

aagcggccag cggcgacgaa gaaggcgggg caggcgaaga agaagaagtg agctcagagc 60

tttcgttcgt atcatcggtt tcgacaacgt tcgtcaagtt caatgcatca gtttcattgc 120

gcacacacca gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg 180

taccatttgt tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt 240

gaaatggaaa tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa 300

ttaatattat ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata 360

tgcaaacatt ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta 420

atatgaggag taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat 480

attttcagac ctagaaaagc tgcaaatgtt actgaataca agtatgtcct cttgtgtttt 540

agacatttat gaactttcct ttatgtaatt t 571

Claims (6)

1.一种诱导小麦花粉败育的方法，其特征在于，降低或沉默小麦TaDCL5-1A、TaDCL5-1B和TaDCL5-1D基因在小麦中的表达；所述TaDCL5-1A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TaDCL5-1B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，TaDCL5-1D的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）构建具有敲除TaDCL5基因的表达载体pBUE411-DCL5；

2）用步骤1）中构建的表达载体通过农杆菌转化小麦材料，从而降低或沉默小麦TaDCL5基因在小麦中的功能，获得花粉败育的小麦植株。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中所述的构建具有敲除TaDCL5基因的表达载体pBUE411-DCL5的方法，包括如下步骤：

S1设计靶向TaDCL5基因的sgRNA，sgRNA对应的引物对为DCL5-gR1-TaU3-F和DCL5-gR1-TaU3-R；

S2利用步骤S1中设计的引物对，合成sgRNA的2条oligo，经过磷酸化和退火形成双链；

S3利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收载体片段；

S4将步骤S3中回收的pBUE411载体片段和步骤S2获得的带有粘性末端的双链sgRNA通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的pBUE411-DCL5双元载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的DCL5-gR1-TaU3-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述的DCL5-gR1-TaU3-R的序列如SEQ ID NO.6所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述的载体片段包括启动子A、启动子B、终止子A、终止子B；所述启动子A的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述启动子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述终止子A的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述终止子B的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述的pBUE411-DCL5双元载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

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