CN106604633A - 作为禾本科植物和其他单子叶植物中雄性不育之决定子的调节性非编码rna - Google Patents

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Abstract

用于控制植物的雄性能育性的方法，其包括调节植物的雄性生殖器官中phasiRNA的生物活性。所述phasiRNA选自21‑nt phasiRNA和24‑nt phasiRNA。从而使植物的雄性能育性提高或降低。优选地，植物为单子叶植物并且变成雄性不育。还提供了所得的雄性不育植物及其用途。

Description

作为禾本科植物和其他单子叶植物中雄性不育之决定子的调 节性非编码RNA
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年10月11日提交的美国临时申请No.61/889,587的权益，其内容整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明一般性涉及植物遗传工程，特别是使用相位型小RNA(phased small RNA，phasiRNA)以控制植物的雄性能育性(male fertility)。
背景技术
多种小RNA存在于动物和植物的雄性生殖细胞中。在动物中，PIWI蛋白及其相互作用piRNA是精子发生所需的；PIWI编码基因缺陷的突变体无法产生成熟精子。虽然大多数果蝇(Drosophila)piRNA是重复衍生的并且使转座因子(TE)沉默，但是哺乳动物piRNA主要定位于独特的基因间区域，并且在生殖腺发育期间具有虽不明确但重要的作用。根据其表达时间、不同的大小和有区别的PIWI伴侣，哺乳动物piRNA进一步分为前粗线期(pre-pachytene)或粗线期。考虑到睾丸中发育阶段的连续体(continuum)，前粗线期类是无细胞已经到达粗线期的生殖腺的特征，而粗线期相关小RNA是大多数晚期种系细胞已经到达此减数分裂阶段的生殖腺的特征，并且生殖腺的更不成熟区中还存在所有先前的阶段。
在有花植物中，花药等同于哺乳动物的睾丸，其由支持减数分裂前、减数分裂和减数分裂后单倍体细胞所需的多种类型的体细胞所组成。然而，不同于哺乳动物生殖腺的连续体，完整的花药历经顺序的发育界标(developmental landmark)，并且在玉米中，器官内的减数分裂是同步的。植物与动物之间的第二主要差异是，植物的单倍体减数分裂产物为小孢子，其经过有丝分裂以产生三细胞配子体。配子体细胞中的两个是精子——后续参与双受精——而第三个细胞是具有代谢活性的单倍体营养细胞。与其哺乳动物对应物类似，植物种系也包含重复和不重复衍生的小RNA。在拟南芥(Arabidopsis)花粉中，在营养核中表达的TE衍生小干扰RNA(siRNA)转移至精子核后增强沉默。此外，稻花序则由非重复区产生21-和24-nt相位型次级siRNA(phasiRNA)。
通过22-nt微RNA(miRNA)切割其前体是产生许多植物次级siRNA的一个关键步骤。在禾本科植物(grass)phasiRNA的情况下，其mRNA前体——“PHAS”转录物——经由RNA聚合酶II转录、被加帽且聚腺苷酸化。这些长非编码前体转录物经内部切割，由22-nt miR2118指导产生21-nt phasiRNA，或者由miR2275指导产生24-nt phasiRNA(图1A)。RNA依赖的RNA聚合酶6(RDR6)识别这些转录物之经切割、未加帽的3’片段并合成第二链，从而形成双链RNA。后续通过Dicer-Like 4(DCL4)和Dicer-Like 5(DCL5)加工分别产生21-和24-ntphasiRNA。这两种dicer均表现出顺序剪接活性，在miRNA结合位点第11个核苷酸处精确地开始。这一活性产生来自各PHAS前体之规则间隔的相位型siRNA群。
尽管植物缺少结合piRNA的PIWI进化枝ARGONAUTE，但是植物Argonaute(AGO)家族具有广泛的多样化，并且存在植物特异性AGO蛋白质。Meiosis Arrested At Leptotene 1(MEL1)(拟南芥AGO5的稻同源物)主要定位于减数分裂前之细胞的细胞质。近来，MEL1示出选择性结合21-nt phasiRNA。mel1丧失功能突变体具有停滞在减数分裂早期的异常绒毡层和畸变花粉母细胞(PMC，减数分裂开始前的最终分化状态)，表明21-nt phasiRNA对雄性能育性至关重要。
雄性不育植物(male sterile plant)可用于产生期望的杂种种子(hybridseed)，以开发植物品种并且提高农作物产量。但仍需要有效地控制植物雄性能育性的方法。
发明内容
本发明提供了用于控制植物的雄性能育性的方法。所述方法包括调节植物的雄性生殖器官中phasiRNA的生物活性。所述phasiRNA选自21-nt phasiRNA和24-nt phasiRNA。从而使植物的雄性能育性提高或降低。所述植物优选地为单子叶植物，例如玉米。
所述方法还可包括调节雄性生殖器官的细胞中phasiRNA的表达。从而使所述phasiRNA的生物活性提高或降低。
所述方法还可包括调节雄性生殖器官的细胞中phasiRNA之mRNA前体(PHAS)的表达、能够切割PHAS以产生phasiRNA之22-nt微RNA(miRNA)的表达或者能够调节所述植物中phasiRNA表达之辅助蛋白(facilitating protein)的表达。从而使phasiRNA的表达提高或降低。
所述方法还可包括向雄性生殖器官的细胞中引入有效量的核酸分子，所述核酸分子对phasiRNA、mRNA前体(PHAS)或22-nt微RNA(miRNA)具有拮抗性。从而使phasiRNA、mRNA前体(PHAS)或22-nt微RNA(miRNA)的表达提高或降低。
所述方法还可包括调节雄性生殖器官的细胞中RNA依赖的RNA聚合酶6(RDR6)的表达。从而使mRNA前体(PHAS)的表达提高或降低。
在一些实施方案中，所述phasiRNA为21-nt phasiRNA，所述22-nt miRNA为miR2118，并且所述辅助蛋白选自dicer蛋白和Argonaute(AGO)蛋白。所述dicer蛋白可为DICER-LIKE4(DCL4)。所述Argonaute(AGO)蛋白可为AGO5相关蛋白。例如，所述植物可为稻，并且所述AGO5相关蛋白可为Meiosis Arrested At Leptotene 1(MEL1)。
在另一些实施方案中，所述phasiRNA为24-nt phasiRNA，所述22-nt miRNA为miR2275，并且所述辅助蛋白选自dicer蛋白和Argonaute(AGO)蛋白。所述dicer蛋白可为DICER-LIKE5(DCL5)。所述Argonaute(AGO)蛋白可为AGO18蛋白。例如，所述植物可为玉米，并且所述AGO18蛋白可选自GRMZM2G105250和GRMZM2G457370。
在一些优选的实施方案中，所述植物是雄性不育的植物。还提供了根据本发明的方法所获得的雄性不育植物。还提供了从所述雄性不育植物获得的植物细胞或组织。
本发明还提供了用于产生杂种种子的方法。所述方法包括使本发明的雄性不育植物与其他植物杂交。从而产生杂种种子。还提供了根据该方法产生的杂种种子。
附图说明
图1A至B举例说明玉米中21-nt phasiRNA基因座和24-nt phasiRNA基因座的全基因组鉴定。(A)PhasiRNA生物发生途径，21-nt phasiRNA位于左侧而24-nt phasiRNA位于右侧，产生具有特征相位模式的基因座。(B)21-PHAS(染色体的左侧)基因座和24-PHAS(染色体的右侧)基因座在10条玉米染色体上的分布。500,000bp内的基因座簇集在一起；邻近各柱的数字表示该特定簇中基因座的数目。
图2A至C示出21-nt减数分裂前phasiRNA和24-nt减数分裂phasiRNA是受发育调节的。(A)分析处于十种不同长度(发育阶段)的花药和花粉。上方，花药单裂片中的细胞模式示意图；细胞类型以不同的灰色阴影表示。(B)热图描述处于各个阶段的来自463个基因座(左图)的21-nt减数分裂前phasiRNA，和来自176个基因座(右图)的24-nt减数分裂phasiRNA的丰度。根据表达模式的相似性进行层次聚类。左图：实心气泡表示phasiRNA的总丰度；饼图表示各个阶段的21-nt phasiRNA与所有21-nt sRNA的比例；条纹气泡表示miR2118丰度(减数分裂前phasiRNA的触发物)。右图：实心气泡和条纹气泡分别表示24-ntphasiRNA丰度和miR2275丰度；饼图表示来自所有24-nt sRNA的24-nt phasiRNA。处于最右端的对照：左侧表示TAS3衍生的ta-siRNA；而右侧表示所有TE相关的siRNA，其定位于玉米1号染色体的前100个Mb(作为整个染色体组的代表)。(C)通过RNA-seq量化21-PHAS和24-PHAS前体转录物。
图3A至D示出玉米雄性不育突变体对miRNA触发物、PHAS前体和phasiRNA之累积的影响。(A)0.7mm的能育花药裂片、ocl4花药裂片、msca1花药裂片、mac1花药裂片、ms23花药裂片及非减数分裂1(ameiotic1)花药裂片中的细胞层结构的图。颜色图例如图2A中所示。(B)能育突变体、ocl4突变体、msca1突变体、mac1突变体、ms23突变体及am1-489突变体中的21-phasiRNA和miR2118的量化；颜色如图2B中所示。将所有具有相同阴影的点归一化在一起(并且跨越基因型)，以便跨越所有时间点和基因型进行比较。(n/a，不可用。)(C)能育花药和突变花药中的24-phasiRNA触发物和miR2275触发物(trigger)的量化。(D)TAS3衍生的ta-siRNA和TE衍生的siRNA以对照sRNA示出。
图4示出玉米雄性不育突变体对通过RNA-seq确定序型的PHAS前体之累积的影响。能育、ocl4、mac1及ms23中的21-PHAS和24-PHAS的量化；21-和24-nt PHAS前体丰度依据图下的图例表示。
图5A至H示出phasiRNA生物发生组分在发育中的花药的定位。用A)miR2118、D)来自21-PHAS_NO142的减数分裂前phasiRNA、E)miR2275，和H)来自24-PHAS_NO132的减数分裂phasiRNA的探针进行小RNA原位杂交。用B)21-PHAS_NO142、C)DCL4、F)24-PHAS_NO132和G)DCL5的探针进行常规mRNA原位杂交。对于所有图像，比例尺＝20μm。
图6为提出的phasiRNA之移动的卡通图。减数分裂前phasiRNA在表皮中产生并且转移至表皮下细胞，(A)而减数分裂phasiRNA从绒毡层移动至PMC(B)以实现其功能。
图7A至B示出在玉米减数分裂期间，每1千万用于编码Argonaute(AGO)蛋白的基因之mRNA的转录物丰度。图A以数值列出这些丰度，阴影表示更高的丰度，而图B将这些值表示为线图。
具体实施方式
玉米花药是雄性生殖花器官，其表达两类相位型小RNA(phasiRNA)。phasiRNA前体通过RNA聚合酶II来转录，并且与哺乳动物睾丸中的piRNA类似，定位于低拷贝基因间区域。已经从分阶段玉米花药的十个顺序组群和成熟花粉中发现，来自463个基因座的21-nt相位型siRNA在生殖细胞命运特化和初始体细胞命运特化后突然出现，然后减少；而来自176个基因座的24-nt phasiRNA在减数分裂期间协调累积，并且当花药体细胞成熟及单倍体配子体分化为花粉时依然存在。在表皮信号传导方面存在缺陷的雄性不育ocl4花药缺少21-phasiRNA。具有表皮下缺陷的雄性不育突变体(mac1(过量性母细胞)、ms23(缺陷性前绒毡层细胞)和msca1(无正常体细胞或性母细胞))缺少24-phasiRNA。非减数分裂1突变体(正常体细胞，无减数分裂)累积21-和24-phasiRNA二者，排除减数分裂细胞作为phasiRNA生物发生的来源或调节物。通过原位杂交，21-phasiRNA生物发生的miR2118触发物定位于表皮，然而，21-PHAS前体和phasiRNA却富集在表皮下。miR2775触发物、24-PHAS前体和24-phasiRNA均优先累积于绒毡层中。已发现每种phasiRNA类型表现出独立的时空规则，21-ntphasiRNA依赖于表皮细胞分化，而24-phasiRNA依赖于绒毡层细胞分化。玉米phasiRNA和哺乳动物PIWI相互作用RNA(piRNA)阐明了小RNA用以支持雄性生殖的趋同进化。
本发明以发现短或长非编码RNA在植物的雄性生殖器官之发育中的作用和用途为基础。特别地，已发现两类相位型次级小干扰RNA(phasiRNA)在雄性生殖中的新功能，并且这些phasiRNA的功能或生物发生的改变导致雄性能育性的变化，甚至雄性不育。此雄性不育可用作遗传工具来促进植物(例如禾本科或非禾本科单子叶植物)中的异型杂交(outcrossing)。这种异型杂交是杂种种子的生殖基础，其常表现出杂种优势。
本发明的目的包括提供控制雄性能育性和雄性不育，以及促进杂种种子产生的遗传机制。可能存在提高不利环境条件下之雄性能育性的次要作用。此外，可以使用外源施加的因子靶向这些RNA以使用非遗传方法触发雄性不育。这可以包括对非编码RNA具有拮抗性的RNA分子或DNA分子，或者使用包括真菌的微生物来递送蛋白质、RNA或DNA以中断或增强phasiRNA产生途径。
本发明提供了用于控制植物的雄性能育性的方法。所述方法包括调节植物的雄性生殖器官中phasiRNA的生物活性。使植物的雄性能育性提高或降低。
本文中所使用的术语“雄性能育性”指植物无法产生功能性花药、花粉或雄性配子。本文中所使用的术语“雄性生殖器官”指雄性生殖花器官，例如玉米花药。植物雄性能育性可提高或降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。植物雄性能育性可通过本领域中已知的常规技术来确定。
本文中所使用的术语“相位型小RNA”或““phasiRNA”指来自真核细胞的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其干扰具有与该dsRNA的一条链互补的核苷酸序列之特定基因的表达。phasiRNA可以作为tasiRNA以反式作用或者作为casiRNA以顺式作用，其中反式表示phasiRNA的靶标由与phasiRNA不同的基因的mRNA产生，而顺式表示phasiRNA的靶标为产生phasiRNA的相同基因的mRNA。phasiRNA的长度可为20个至25个核苷酸(nt)，优选21nt或24nt。phasiRNA可为天然存在的phasiRNA，或者人工合成的与天然存在的phasiRNA具有至少约70％、80％、90％、95％或99％，优选至少80％，更优选约100％同一性的序列。phasiRNA可由mRNA前体(PHAS)产生。表1提供了玉米基因组序列(“形式2”)中产生21-和24-phasiRNA的基因座的位置和坐标，其从最大至最小的丰度排序。这些基因座中的每一个均可产生超过20个phasiRNA。″100,000″的单位为每1千万读出的转录物，此表中的丰度为来自每个基因座的所有phasiRNA(21或24nt)的丰度之和。phasiRNA可以从这些基因座内以21nt或24nt的单位产生。phasiRNA可具有与任意这些基因座内21nt或24nt的一段至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，优选至少约80％，更优选至少95％，最优选地至少约100％同一性的序列。
本文中所使用的术语“生物活性”指与植物雄性能育性相关的phasiRNA的任何活性。例如，21-nt phasiRNA的生物活性可与RNA靶标的转录后控制相关。示例性RNA靶标包括所有亲代mRNA集，或者其子集。24-nt phasiRNA的生物活性可与指导染色质在其靶位点的修饰相关。例如，靶位点可为染色体上的DNA序列，或者可为通过RNA聚合酶II、IV或V转录的RNA。
植物可为单子叶植物。单子叶植物可为禾本科植物或非禾本科植物。禾本科植物的实例包括玉米、稻、小麦、大麦、高粱、柳枝稷和甘蔗。非禾本科植物的实例包括芦笋、香蕉和棕榈。优选地，所述植物为稻或玉米。更优选地，所述植物为玉米。
所述方法还可包括调节雄性生殖器官的细胞中之phasiRNA的表达。从而使phasiRNA的生物活性提高或降低，例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。phasiRNA的表达可通过本领域中已知的常规技术来检测，并且可以在雄性生殖器官的一些或所有细胞中上调或下调。
所述方法还可包括调节雄性生殖器官的细胞中phasiRNA之mRNA前体(PHAS)的表达、能够切割PHAS以产生phasiRNA之22-nt微RNA(miRNA)的表达、或者能够调节phasiRNA表达之辅助蛋白的表达。从而使phasiRNA的表达提高或降低，例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。PHAS、22-nt miRNA或者辅助蛋白的表达可通过本领域中已知的常规技术来检测，并且可以在雄性生殖器官的一些或所有细胞中上调或下调。
所述方法还可包括向雄性生殖器官的细胞中引入有效量的核酸分子，所述核酸分子对phasiRNA、mRNA前体(PHAS)或22-nt微RNA(miRNA)具有拮抗性。从而使phasiRNA、mRNA前体(PHAS)或22-nt微RNA(miRNA)的表达提高或降低。可使用本领域中已知的常规技术将所述核酸分子引入细胞中。所述引入可为瞬时的或永久的，优选永久的。核酸分子可被引入细胞中数小时、数天、数周或数月的时段。其也可被引入一次、两次或更多次。核酸分子的有效量可根据多种因素变化，例如，核酸分子的序列，细胞的物理特征，phasiRNA、PHAS或22-nt miRNA 的序列，以及将核酸分子引入细胞中的方式。待引入的核酸分子的特定量可通过使用本领域中已知的常规技术来确定。
所述方法还可包括调节雄性生殖器官的细胞中RNA依赖的RNA聚合酶6(RDR6)的表达。从而使PHAS的表达提高或降低，例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。RDR6的表达可通过本领域中已知的常规技术来检测，并且可以在雄性生殖器官的一些或所有细胞中上调或下调。
在一些实施方案中，phasiRNA为21-nt phasiRNA，22-nt miRNA为miR2118，并且辅助蛋白选自dicer蛋白和Argonaute(AGO)蛋白。所述dicer蛋白可为DICER-LIKE4(DCL4)。所述AGO蛋白可为AGO5相关蛋白。所述AGO5相关蛋白可为Meiosis Arrested At Leptotene 1(MEL1)。
在另一些实施方案中，phasiRNA为24-nt phasiRNA，22-nt miRNA为miR2275，并且辅助蛋白选自dicer蛋白和Argonaute(AGO)蛋白。所述dicer蛋白可为DICER-LIKE5(DCL5)，也称作DCL3b。所述AGO蛋白可为AGO18蛋白。在玉米中，所述AGO18蛋白可选自GRMZM2G105250和GRMZM2G457370。
在一些优选的实施方案中，所述植物变为雄性不育。还提供了所得雄性不育植物及其细胞或组织。
根据本发明的另一个方面，提供了用于产生杂种种子的方法。所述方法包括使本发明的雄性不育植物与其他植物杂交，其优选地与所述雄性不育植物属于相同属，更优选地属于相同物种。例如，所述雄性不育植物以及与所述雄性不育植物杂交的植物均为稻或玉米。还提供了所得的杂种种子。
当涉及可测量的值(例如量、百分比等)时，本文中所使用的术语“约”意指涵盖偏离特定值±20％或±10％，优选±5％，更优选±1％的变化，只要这些变化适于进行所公开的方法即可。
提供以下实施例以更详细地描述本发明的示例方面。它们旨在说举例明而非限制本发明。
实施例1
作为具有大组群同步发育花的雌雄同株植物，玉米(Zea mays)特别可用于研究雄性生殖；容易使用长度作为发育事件的代表对花药进行解剖和分阶段(图2A)。我们利用这一发育规律来表征phasiRNA累积的时空模式。将小RNA-seq和RNA-seq施加于11个连续野生型(能育)阶段，范围从花药原基中细胞命运特化的初始步骤至产生花粉。我们证明了phasiRNA及其前体转录物均示出显著的时空规则。
结果
减数分裂前phasiRNA和减数分裂phasiRNA的时序调节
为了探究玉米的雄性生殖器官中小RNA群的动力学，对来自W23能育花药的11个连续阶段的32个小RNA(sRNA)文库进行深度测序，以允许准确且灵敏的phasiRNA鉴定。然后通过计算机全基因组扫描将phasiRNA定位于基因组，鉴定了463个21-PHAS基因座和176个24-PHAS基因座；这两类基因座均分布在所有10条玉米染色体上(图1B)。这些基因座对应于独特的或低拷贝基因组区域。这将24-nt phasiRNA和主要衍生自重复元件(主要是TE)之依赖于植物DCL3的24-nt异染色质siRNA(hc-siRNA)区别开。
21-nt和24-nt phasiRNA二者均表现出不同于TAS3衍生的21-nt反式作用siRNA(ta-siRNA)或TE衍生的24-nt hc-siRNA(图2B)之时间的显著时序调节(图2B)。在从多能干细胞开始生殖细胞和初始体细胞命运设置(fate-setting)时，在0.2mm很少观察到phasiRNA。24小时后，在减数分裂前孢原(AR)和三种体细胞类型(表皮、内皮、双潜能次生周缘层(secondary parietal layer，SPL))存在时，在0.4mm阶段，21-nt phasiRNA的量和多样性达到峰值，包含60％的所有21-nt RNA(图2B)。大多数21-nt phasiRNA存在约一周(0.4mm至2.0mm阶段)，但是在所有SPL细胞已经分裂时从0.7mm稳定地下降，产生中层和绒毡层子细胞。相比之下，当所有细胞类型特化并且有丝分裂后AR作为PMC开始减数分裂准备时，直到1.0mm大多数24-nt phasiRNA才可检测(图2B)。从1.5mm至2.0mm，24-nt phasiRNA出现峰值，其与从分裂前期I至分裂中期I的减数分裂进程一致，此时体细胞继续分化以用于减数分裂后的支持作用；在此峰值下，24-nt phasiRNA达到所有24-nt RNA的64％(图2B)。大多数24-nt phasiRNA在减数分裂结束(2.5mm)时存在，然后丰度下降，但两周后在成熟花粉中仍可检测到。用三次生物重复以及通过RNA杂交来验证phasiRNA动力学。根据其表达时间，我们将这两种大小类别命名为减数分裂前(21-nt)phasiRNA和减数分裂(24-nt)phasiRNA以突出与哺乳动物生殖腺piRNA的平行。
PhasiRNA合成需要miRNA和PHAS前体二者(图1A)。miR2118家族成员在0.2mm时丰富，在0.4mm时达到峰值，然后在0.7mm时消失。相比之下，miR2275家族成员在1.0mm时达到峰值(图2B)。这两个miRNA家族均在其对应phasiRNA突现(burst)之前累积至其峰值。来自所有十一个花药阶段的RNA-seq证明了21-PHAS前体转录物从0.4mm至1.0mm高度表达，而24-PHAS转录物在1.5mm花药中达到峰值(图2C)。总而言之，所有三种组分均在发育中的花粉表现出严格时间：miRNA触发物先于PHA前体及其phasiRNA产物的协调部署。
表皮对减数分裂前phasiRNA生物发生是必要且充分的
为了增加对于细胞类型对产生phasiRNA之贡献的理解，分析来自在特定花药细胞类型中存在缺陷的发育突变体的RNA(图3A)。OCL4为抑制邻近表皮下内皮细胞中平周分裂的表皮特异性转录因子，假定通过移动信号。尽管包含降低但稳健水平的miR2118触发物，ocl4花药缺少所有21-nt减数分裂前phasiRNA(图3B)。因为ocl4累积其他RDR6/DCL4产物(例如TAS3ta-siRNA)(图3D)，所以缺陷可能存在于21-PHAS前体的产生中。实际上，0.4mm至2.0mm花药的RNA-seq示出ocl4缺少21-PHAS转录物(图4)。ocl4具有接近正常的miR2275、24-PHAS前体和24-nt减数分裂phasiRNA的时间和丰度(图3C和4)，表明其独立于表皮调节和减数分裂前phasiRNA途径二者。此外，在msca1中，其中突变体器官保持花药形状但除表皮外无花药裂片细胞类型，存在接近正常的减数分裂前phasiRNA水平，以及延长的、提高的miR2118水平(图3B)。根据ocl4和msca1分析，我们推断分化的花药表皮对减数分裂前phasiRNA生物发生是必要和充分的。
绒毡层，但非性母细胞，是产生减数分裂phasiRNA所需的
为了进一步探究细胞要求，分析了其他雄性不育突变体。mac1突变体具有成熟和开始减数分裂的过量AR细胞，但通常地，突变花药只具有单一的未分化表皮下细胞群；ms23突变体具有正常的内皮和中层，但前绒毡层细胞平周地分裂，形成异常未分化双层(图3A)。mac1和ms23花药以及msca1缺少减数分裂phasiRNA(图3C)，表明特定绒毡层是减数分裂phasiRNA所需的。有趣地，尽管mac1缺少miR2275和24-PHAS转录物二者，而ms23保持接近正常的miR2275水平但缺少24-PHAS前体(图4)。结合来自ocl4分析的结论，这些数据表明，在减数分裂前和减数分裂phasiRNA途径中，miRNA触发物和PHAS前体的产生均被独立地调节。
为了检验正常性母细胞是否是产生phasiRNA所需的，我们对来自非减数分裂1(am1)的花药sRNA进行测序，其中体裂片细胞(somatic lobe cell)正常但是PMC或性母细胞缺陷。两种am1等位基因am1-489(PMC进行有丝分裂而不是减数分裂)和am1-praI(性母细胞停滞在分裂前期I)，具有减数分裂前phasiRNA和减数分裂phasiRNA(图3B-C)。此外，RDR6转录物(这两种phasiRNA类型共享的生物发生因子)未通过原位杂交在能育的生殖细胞中检测到。因此，产生phasiRNA不需要正常分化的生殖细胞。
phasiRNA途径组分的空间分布
为了进一步检测phasiRNA的空间分布，在能育的花药上进行原位定位。在0.4mm时miR2118在末梢表皮弧(distal epidermal arc)中累积(图5A)，恰好OCL4转录因子在那里表达。21-PHAS前体和DCL4转录物在AR细胞中稍微富集，而21-nt减数分裂前phasiRNA定位在表皮下细胞(图5B-D)。24-nt减数分裂phasiRNA的关键生物发生组分富集在绒毡层中，并且比减数分裂前AR、PMC和性母细胞的程度轻(图5E-5H)。因此，原位结果进一步支持表皮和绒毡层在phasiRNA生物发生中的不同生态位(niche)。此外，减数分裂前phasiRNA生物发生所需的组分的分离表明一种或更多种因子的移动。后续出现的减数分裂phasiRNA需要生物发生组分共同定位的绒毡层分化。绒毡层细胞对花药功能至关重要；它们分泌营养物以支持减数分裂，并且后续构造花粉外被。因为AR和PMC包含减数分裂phasiRNA，我们推测这些RNA可能是绒毡层细胞提供给发育性母细胞的其他类型的“货物(cargo)”。
PhasiRNA缺少与TE的序列互补性
植物miRNA和ta-siRNA触发物靶向mRNA切割；这些切割位点可以使用RNA末端平行分析(Parallel Analysis of RNA Ends，PARE)来大量验证。为了研究phasiRNA的可能靶标，我们由若干花药阶段和成熟花粉构建了PARE文库。测序证实21-和24-PHAS前体分别通过miR2118和miR2275进行切割。在1,000种最丰富的减数分裂前phasiRNA的～900万种预测的phasiRNA靶标对中，不到1％示出PARE信号。这些结果与21-nt减数分裂前phasiRNA缺少明显的靶标的来自稻的更早结论一致。此外，ocl4、mac1和ms23中不存在减数分裂前phasiRNA或减数分裂phasiRNA并不导致TE转录物累积。phasiRNA的大量复杂性和缺少明显的靶标或与转座子的关联表明，phasiRNA发挥不同于miRNA、ta-siRNA或hc-siRNA的作用。
讨论
使用小RNA-seq和RNA-seq，我们证明了减数分裂前phasiRNA和减数分裂phasiRNA在玉米花药中累积至高水平。它们的累积在时间上与前体转录物的表达相协调，并且在相应miRNA触发物的累积之后。在花药发育中存在缺陷的五种雄性不育突变体的分析示出，两种类型的phasiRNA被独立地调节。正常的表皮对减数分裂前phasiRNA生物发生是必要且充分的，而减数分裂phasiRNA需要形成正常的绒毡层。原位杂交鉴定了PHAS前体、miRNA触发物和phasiRNA的定位，并且确认了表皮在产生减数分裂前phasiRNA以及绒毡层在产生减数分裂phasiRNA中的重要性。
phasiRNA的结合伴侣
尽管植物缺少结合piRNA的PIWI进化枝ARGONAUTE，然而植物AGO家族具有广泛多样化，拟南芥中具有10个AGO成员，玉米中具有17个AGO成员，以及稻中具有19个AGO成员。一些AGO成员在花中特异性表达，并且在花药的体细胞或生殖细胞中进一步富集。推测，这种AGO扩增反映了植物小RNA针对花药发育阶段和细胞类型之作用的功能多样化。
近来已示出稻Argonaute MEL1结合21-nt phasiRNA。MEL1在玉米中的最近同源物为AGO5c。在减数分裂前phasiRNA峰后，玉米AGO5c在0.7mm花药中高度表达。因此，AGO5c可能是玉米中减数分裂前phasiRNA的结合伴侣。减数分裂phasiRNA的结合伴侣尚未见报道。根据不同花药阶段的激光显微解剖细胞类型的转录分析，加上RNA-seq及微阵列谱，我们发现玉米AGO18b的表达谱匹配减数分裂phasiRNA的表达时间。AGO18b转录物和蛋白质二者均在绒毡层细胞和减数分裂细胞中富集。因为其反映减数分裂phasiRNA的分布和时间等，为双子叶植物中不存在的最近进化的基因，所以强烈地暗示AGO18b为减数分裂phasiRNA的伴侣。
提出的phasiRNA的功能
尽管phasiRNA缺少与TE的序列互补性，但是它们可能具有对生殖体细胞转录物和/或生殖细胞转录物的基因组监督能力，这与对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)piRNA(也称作21U-RNA)的报道类似。在有花植物中，TE沉默途径对确保基因组完整性是严重冗余的。例如，即使在缺少24-nt hc-siRNA的玉米rdr2/mop1突变体中，TE表达仅存在适度变化。考虑到其包含许多重复元件的大基因组，禾本科植物可能具有进化的通过phasiRNA来操作以调节TE其他途径。还可能的是，phasiRNA保护花药体细胞基因组和生殖细胞基因组免受病原体(如病毒、真菌或卵菌)的攻击，或者甚至保护免于其核酸(如TE)的水平转移或反转录转座(retropositioning)。
或者，phasiRNA可充当协调花药发育的移动信号。与枝和根的分生组织区相比，花药缺少组织中心。分生组织组织从干细胞群移出的发育阶段的连续体，而花药“自组织”组织层和经过发育的完整器官作为具有高保真性和时序调节的一个单元。phasiRNA从生物发生位点至邻近细胞层的潜在移动(图6)令人联想到拟南芥花粉中的TE衍生的siRNA，其产生于营养核中并且转运进精子核中。不参与TE沉默，然而，phasiRNA可通过至今未知的途径协调细胞类型特异性表达。RDR6负责稻中21-nt phasiRNA和24-nt phasiRNA二者的产生。有趣地，拟南芥中依赖于RDR6的反式作用siRNA示出相对高移动性，进一步支持减数分裂前phasiRNA和减数分裂phasiRNA二者均可充当发育花药内之移动信号的概念。
尽管miR2275和减数分裂phasiRNA二者均只已经在禾本科植物物种中报道，但是miR2118存在于双子叶植物中。双子叶植物中的初级miR2118靶标为NB-LRR病原体防御基因；由NB-LRR mRNA产生的21-nt phasiRNA以反式和顺式作用，并且其被组成性地表达。因此，miR2118和21-nt phasiRNA触发物在双子叶植物和禾本科植物谱系中具有进化的独特功能，代表在植物miRNA中新功能化的第一种情况。NB-LRR基因家族的两个主要亚组之一，TIR-NB-LRR未在禾本科植物基因组中发现，或许暗示miR2118靶向之21-PHAS前体的来源。虽然miR2275的来源未知，但是DCL5与DCL3最相似，并且早先被命名为DCL3b。miR2275和DCL5二者均不存在于双子叶植物基因组，表明它们近来在禾本科植物或相关单子叶植物内衍生。
禾本科植物phasiRNA和哺乳动物piRNA的趋同进化
哺乳动物中雄性生殖的特征还在于，累积模式受特定细胞类型和发育阶段严格限制之高丰度的两类小RNA。这些小RNA被称作PIWI相互作用RNA或piRNA。我们已经描述的玉米phasiRNA和更一般地禾本科植物phasiRNA与哺乳动物piRNA享有明显的相似性(表2)，其为用以在雄性生殖细胞和体细胞组织中产生新种类小RNA之趋同进化的诱人情况。PhasiRNA和哺乳动物piRNA二者均存在于两种大小种类中；更短的大小种类在减数分裂前出现，而更长的大小在减数分裂期间累积。至今，禾本科植物phasiRNA和大多数哺乳动物piRNA都不具有明确的作用。作为禾本科植物中miR2275、DCL5和减数分裂phasiRNA的来源，该平行进化是一个进化谜题。
用于雄性生殖的小RNA之意外的趋同进化令人联想到在有花植物和胎盘哺乳动物二者中的印记(imprinting)的独立进化。印记通过亲代来源有差别地标记配子中的等位基因以设置受精后的表达。尽管在两界中涉及完全不同的组织，但是印记实现了保证雄性配子和雌性配子的结合以产生下一代的相同目的。
哺乳动物和有花植物所共有的是对其子代的高投入。受精胚保留在母体内，并且由在之前的分类单元中不存在的营养附属器官(胎盘或胚乳)支持。我们认为，很可能哺乳动物的piRNA和禾本科植物的phasiRNA是在生殖、健康精子中雄性贡献质量的贡献者。尽管哺乳动物睾丸和禾本科植物花药之间存在根本差异，但是在两类piRNA和phasiRNA的进化、减数分裂前和减数分裂期间的发育时间、非常高的丰度、大量基因座及缺少明显的mRNA靶标中的平行表明，对于在雄性生殖期间产生小RNA的这些系统，各界中都存在相当多的进化优点。
实验过程
植物材料
W23近交系、渐渗五次进入W23的mac1和msca1、在A188近交背景中的ocl4、在ND101背景中的ms23、非减数分裂1-489(50％B73+25％A619+25％混合的其他或未知)和am1-praI等位基因(75％A619+25％混合的其他或未知)的可育花药在斯坦福CA、温室条件下生长。如前所述解剖花药并且使用测微计测量(Kelliher和Walbot(2011).Dev Biol 350，32-49)。
RNA分离、文库构建及Illumina测序
使用Tri试剂(Molecular Research Center，Cincinnati，OH)或植物RNA试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)分离总RNA。使用TruSeqTM小RNA样品Prep试剂盒和TruSeqTMRNA样品Prep试剂盒(Illumina，San Diego，CA)构建小RNA和RNA-seq文库。如前所述构建PARE文库(Zhai等(2014).Methods 67，84-90)。在Delaware Biotechnology Institute，Newark，DE，于Illumina Hi-Seq 2000仪器上对所有文库进行测序。
数据处理和生物信息学
使用输入材料和产生读数计数(read count)构建九十六个小RNA文库并测序。在移除衔接子和低质量读数后，获得约二十亿个长度在18nt至34nt之间的小RNA序列。排除与结构RNA(tRNA或rRNA基因座)匹配的那些之后，～15亿小RNA标签极佳地(无错配)定位回玉米的参照基因组，版本AGPv2。使用Bowtie(Langmead等，2009)进行定位。任何和基因组具有多于50个完全匹配(“命中”)的读数不做进一步分析。根据该文库中基因组匹配读数的总计数，将各文库中小RNA的丰度归一化为“TP10M”(每1千万的转录物)。
如前所述进行全基因组相位分析(Zhai等(2011).Genes Dev 25，2540-2553)。为了达到最大灵敏度，组合所有小RNA文库以创造用于检测小RNA的相位分布的联合组。以19nt至25nt的固定间隔进行相位分析。只有21nt和24nt间隔产生了明显高于背景的结果。作为高于或等于25的相位分数的基因座的最终检查，对来自各高得分基因座之小RNA的分数和丰度作图，并且目视检查以移除假阳性(例如miRNA或未滤过的t/rRNA基因座)。这样产生了产生21-nt减数分裂前phasiRNA的463个基因座，和产生24-nt减数分裂phasiRNA的176个基因座。
在使用TopHat将修整的RNA-seq读数定位至参照基因组后，由W23(野生型)、ocl4和mac1的0.4mm和0.7mm花药构建四十四个RNA-seq文库。根据该文库的总基因组匹配读数，将各文库中RNA-seq读数的丰度归一化为TP10M。
构建五个PARE文库。如前所述进行数据分析和靶标验证。简言之，我们定义了各预测的靶位点侧翼的两个窗口：(1)5nt小窗口“WS”(切割位点±2nt)；和(2)31nt大窗口“WL”(切割位点±15nt)。过滤切割位点以只保留PARE文库中WS/WL≥0.5的那些以便移除噪音信号。使用CleaveLand2进行靶标预测和评分。
原位杂交
使用由Exiqon(Woburn，MA)合成的锁核酸(LNA)探针检测小RNA。使用4％多聚甲醛真空固定样品，并且提交至位于A.I.DuPont Hospital for Children(Wilmington，DE)的组织学实验室以进行石蜡包埋。我们遵循用于杂交前、杂交、杂交后和检测步骤的公开方案。
如前所述对PHAS基因座和基因转录物进行原位杂交(Kelliher和Walbot(2014).Plant J 77，639-652)。使用DIG RNA标记试剂盒(T7/SP6)(Roche，Basel，Switzerland)在转录前由扩增自基因组的PCR片段合成探针。
共焦显微术
在Delaware Biotechnology Institute，Newark，DE，用Zeiss LSM780使用C-复消色差40X(NA＝1.3)油浸物镜得到共焦图像。使切片在458nm处激发，并且使用578nm至674nm带通的检测器检测自体荧光。我们还对使用微分干涉差显(DIC)的原位杂交使用相同激光。
用夹板连接介导的miRNA检测来检测小RNA
如前所述使用USB miRNAtect-It miRNA标记和检测试剂盒(Affymetrix，SantaClara CA)检测miRNA和phasiRNA(Jeong和Green(2012).Methods 58，135-143；Jeong等(2011).Plant Cell 23，4185-4207)。每个实验使用10μg总RNA。进行分析。
系统发生分析
从NCBI下载玉米中的17个AGO、稻中的19个AGO和拟南芥中的10个AGO的蛋白质序列并且使用MEGA6比对。通过MEGA6使用邻接法推断进化历史，并且通过Figtree构建(http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)。
实施例2
使用突变体分析和特定地靶向基因组工程来证明phasiRNA在禾本科植物生殖生物学中的作用。编码Argonaute蛋白和dicer蛋白之基因的mRNA转录数据的分析已经证明富含这些家族的至少一些成员，例如：在减数分裂期间高度丰富的AGO18b(用于结合24-ntphasiRNA的候选)、AGO5c和AGO5b(图7)。
对于玉米和稻二者，使用CRISPR来特异性敲除AGO18b，以严格地评估以下假设：其为24-nt phasiRNA的直接结合伴侣，并且结合phasiRNA的AGO18b蛋白在禾本科植物的雄性能育性中具有重要的功能作用。使用Iowa State University transformation center，100棵以上的植物在靶向AGO18b的CRISPR短指导RNA的情况下生长。CRISPR系统的效率很高，并且将对这些植物中的等位基因进行表征。在初始转化的代中，两种杂合子(能育或部分雄性不育)均是预期的；后者将证明在遗传缺陷等位基因的花粉粒中的作用)，或者“二对等位基因”完全AGO18b缺陷系，其中二者的拷贝已经独立地敲除，导致没有功能性的等位基因和雄性不育。
除分析AGO18b外，再生了用靶向DCL5、miR2275a、miR2275b、miR2275的“a”和“b”拷贝二者一起的CRISPR构建体转化的植物。将靶向24-nt phasiRNA生物发生途径中若干点的这些基因和AGO18b一起敲除，提供了24-nt phasiRNA生物发生的缺陷之影响的多方面观点。认为所有这些株系将为雄性不育或部分雄性不育的。基于以上表达谱，认为通过只结合miR2275和使24-nt phasiRNA前体沉默，AGO1d可为24-nt phasiRNA的特异性触发因子。这将在下一步用靶向AGO1d的CRISPR构建体进行测试。
此外，回到2012年开始，为了准备材料及开始指定在花药发育中的作用，已经发现了许多AGO、dicer、RNA聚合酶亚基以及其他在花药中高度富集或甚至花药特异性的sRNA生物发生因子。例如，UniformMu或RescueMu插入突变存在于59个株系中示出的这些靶标中的30个中，每个靶基因有1至7个突变。这些株系在2012年夏季生长，对其进行基因分型以发现载体，并且进行杂交以恢复用于纯合“敲除(KO)”突变体的家族隔离。在2013年冬季开始对纯合KO是否缺少正常基因转录物及是否为雄性不育(ms)进行评分并且仍在继续。雄性不育鉴定了对正常花药发育是不可或缺的因子。通过共焦显微术和分析，每种ms情况的细胞失败(扩增或表达缺陷，可能为细胞类型特异性)的时间和范围将得以精确指出。假定一些21nt phasiRNA和24nt phasiRNA是细胞类型特异性的，因此其产生中的缺陷可以导致非常特定或不寻常的不育表型。还使用来自在台湾和韩国开发之大T-DNA群的突变体在稻中进行平行分析。
本发明不限于以上所述和所示例的实施方案，但是能够在所附权利要求的等同方案的范围内进行改变和修改。
表1.基于总结的phasiRNA丰度，176个产生24-phasiRNA的基因座的坐标和丰度
表2.禾本科植物phasiRNA和哺乳动物piRNA之间的平行性
＊phasiRNA的性质来自本研究和现有报道。
哺乳动物piRNA已经得到广泛表征。
提出的结合伴侣。

Claims (20)

1.用于控制植物的雄性能育性的方法，所述方法包括调节所述植物的雄性生殖器官中phasiRNA的生物活性，其中所述phasiRNA选自21-nt phasiRNA和24-nt phasiRNA，从而使所述植物的雄性能育性提高或降低。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括调节所述雄性生殖器官的细胞中所述phasiRNA的表达，从而使所述phasiRNA的生物活性提高或降低。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法还包括调节所述雄性生殖器官的细胞中所述phasiRNA之mRNA前体(PHAS)的表达、能够切割PHAS以产生所述phasiRNA之22-nt微RNA(miRNA)的表达或者能够调节所述植物中所述phasiRNA表达之辅助蛋白的表达，从而使所述phasiRNA的表达提高或降低。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括向所述雄性生殖器官的细胞中引入有效量的核酸分子，所述核酸分子对所述phasiRNA、所述mRNA前体(PHAS)或所述22-nt微RNA(miRNA)具有拮抗性，从而使所述phasiRNA、所述mRNA前体(PHAS)或所述22-nt微RNA(miRNA)的表达提高或降低。
5.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括调节所述雄性生殖器官的细胞中RNA依赖的RNA聚合酶6(RDR6)的表达，从而使所述mRNA前体(PHAS)的表达提高或降低。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述phasiRNA为21-nt phasiRNA，所述22-ntmiRNA为miR2118，并且所述辅助蛋白选自dicer蛋白和Argonaute(AGO)蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述dicer蛋白为DICER-LIKE4(DCL4)。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述Argonaute(AGO)蛋白为AGO5相关蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述植物为稻，并且所述AGO5相关蛋白为MeiosisArrested At Leptotene 1(MEL1)。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述phasiRNA为24-nt phasiRNA，所述22-ntmiRNA为miR2275，并且所述辅助蛋白选自dicer蛋白和Argonaute(AGO)蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述dicer蛋白为DICER-LIKE5(DCL5)。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述Argonaute(AGO)蛋白为AGO18蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述植物为玉米，并且所述AGO18蛋白选自GRMZM2G105250和GRMZM2G457370。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为玉米。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为雄性不育的植物。
17.根据权利要求16获得的雄性不育植物。
18.从权利要求17所述的雄性不育植物获得的植物细胞或组织。
19.用于产生杂种种子的方法，所述方法包括使权利要求17所述的雄性不育植物与其他植物杂交，从而产生杂种种子。
20.根据权利要求19产生的杂种种子。
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