CN117377775A - 用于核酸表征的扩增技术 - Google Patents

用于核酸表征的扩增技术 Download PDF

Info

Publication number
CN117377775A
CN117377775A CN202280031509.5A CN202280031509A CN117377775A CN 117377775 A CN117377775 A CN 117377775A CN 202280031509 A CN202280031509 A CN 202280031509A CN 117377775 A CN117377775 A CN 117377775A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
primer
target
region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280031509.5A
Other languages
English (en)
Inventor
N·A·戈姆利
C·L·王
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inmair Ltd
Original Assignee
Inmair Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inmair Ltd filed Critical Inmair Ltd
Publication of CN117377775A publication Critical patent/CN117377775A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/155—Modifications characterised by incorporating/generating a new priming site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/307—Circular oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/125—Rolling circle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/149—Sequential reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了核酸扩增技术。实施方案包括使用模板的滚环扩增生成连接的核酸，例如，从全长mRNA的cDNA或从合成模板开始，以及测序和/或检测该连接的核酸。在一些实施方案中，所公开的技术包括扩增反应，该扩增反应包括CRISPR‑Cas相互作用，其由于CRISPR‑Cas相互作用而生成引物，由此引物继而用作可检测扩增反应的一部分。所公开的扩增技术可以使用合成寡核苷酸或引物。

Description

用于核酸表征的扩增技术
背景技术
所公开的技术整体涉及核酸表征，例如检测和/或测序技术。在一些实施方案中，所公开的技术包括使用滚环扩增生成连接的核酸，例如，从全长mRNA的cDNA或从合成模板开始，以及测序和/或检测连接的核酸。在一些实施方案中，所公开的技术包括扩增反应，该扩增反应包括CRISPR-Cas相互作用，其由于CRISPR-Cas相互作用而生成引物，由此引物继而用作可检测扩增反应的一部分。所公开的扩增技术可以使用合成寡核苷酸或引物。
本部分中讨论的主题不应仅因为在本部分中有提及就被认为是现有技术。类似地，在本部分中提及的或与作为背景技术提供的主题相关联的问题不应被认为先前在现有技术中已被认识到。本部分中的主题仅表示不同的方法，这些方法本身也可对应于受权利要求书保护的技术的具体实施。
生物分子研究的进展部分地由用于表征分子或其生物反应的技术的改进引起。特别地，核酸DNA和RNA研究得益于对用于序列分析的技术的开发。用于对多核苷酸模板进行测序的方法可涉及分别使用DNA聚合酶或DNA连接酶进行多个延伸反应以连续地掺入与模板链互补的标记的核苷酸或多核苷酸。在此类合成测序反应中，通过连续掺入与模板链互补的核苷酸构建与模板链碱基配对的新核苷酸链。在某些情况下，可以使用合成测序技术来可靠地获得的序列数据的量可能是有限的。在一些情况下，测序运行可限于允许序列重新比对的多个碱基，例如掺入的约25-30个循环。然而，对于诸如例如SNP分析、变体分析和单体型分析之类的应用，在许多情况下能够可靠地获得相同模板分子的另外序列数据将是有利的。此外，当用于测序反应的起始材料为低浓度时，来自25-30个循环的测序数据可能不足以用于期望的分析。因此，存在对新方法的需要，该新方法促进低浓度起始材料的靶向下一代测序并且/或者可测序或检测SNP或其他变体序列，例如体细胞突变、病毒变体。
发明内容
在一个实施方案中，本公开提供了一种核酸组合物。核酸组合物包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸包含第一5'引物序列、第一3'引物序列以及设置在第一5'引物序列和第一3'引物序列之间的第一间插区，第二寡核苷酸包含第二5'引物序列、第二3'引物序列以及设置在第二5'引物序列和第二3'引物序列之间的第二间插区。核酸组合物还包含靶核酸，其中第一5'引物序列和第一3'引物序列与侧接靶核酸的第一靶序列的第一区域互补，并且其中第二5'引物序列和第二3'引物序列与侧接靶核酸的第二靶序列的第二区域互补，使得第一寡核苷酸在与靶核酸结合时在第一靶序列周围形成第一环状结构，并且第二寡核苷酸在与靶核酸结合时在第二靶序列周围形成第二环状结构。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于扩增靶序列的方法，包括以下步骤：使靶核酸与寡核苷酸接触，使得寡核苷酸与核酸上的间隔开的靶结合序列结合，以在靶核酸的靶序列周围形成环状结构；将寡核苷酸的3'末端朝向5'末端延伸并跨过靶序列；将寡核苷酸的延伸的3'末端连接到5'末端以形成闭环；以及使用闭环作为滚环扩增的模板以生成连接的单链核酸。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括以下步骤：提供具有第一成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)引导RNA和第一CRISPR相关(Cas)蛋白以及第二CRISPR引导RNA和第二Cas蛋白的系统，其中第一引导RNA包含与靶核酸的第一区域互补的靶特异性核苷酸区域，并且第二引导RNA包含与靶核酸的与第一区域间隔开的第二区域互补的靶特异性核苷酸区域；使靶核酸与系统接触以形成复合物，从而在第一区域和第二区域内切割以释放寡核苷酸，该寡核苷酸包含在第一区域和第二区域之间的间插核苷酸；将寡核苷酸退火到模板；以及使用退火的寡核苷酸作为引物扩增模板。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于检测靶核酸的方法，包括以下步骤：提供具有成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)引导RNA和CRISPR相关(Cas)蛋白的系统，其中引导RNA包含与靶核酸的区域互补的靶特异性核苷酸区域；提供多个环化寡核苷酸；使靶核酸与系统接触以形成复合物；使用复合物中的Cas蛋白将多个环化寡核苷酸线性化以生成引物；将引物中的一个或多个引物退火到模板；以及使用退火到模板的引物中的一个或多个引物扩增模板。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于扩增mRNA靶核酸的方法，包括以下步骤：提供用于逆转录酶反应的引物，该引物包含用于滚环扩增的引物结合序列以及磷酸化的5'末端；将引物退火到mRNA；使用逆转录酶延伸引物以生成包含引物的cDNA；将cDNA中的引物的磷酸化5'末端连接到3'末端以环化cDNA；将滚环扩增引物退火到所环化的cDNA的引物结合序列；以及使用退火到所环化的cDNA的滚环扩增引物来扩增所环化的cDNA以生成连接的单链核酸。
呈现前述描述以使得能够制造和使用所公开的技术。对所公开的具体实施的各种修改将是显而易见的，并且在不脱离所公开的技术的实质和范围的情况下，本文所定义的一般原理可应用于其他具体实施和应用。因此，所公开的技术并非旨在限于所示的具体实施，而是要符合与本文所公开的原理和特征一致的最广范围。所公开的技术的范围由所附权利要求限定。
附图说明
当参考附图阅读以下详细描述时将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中在整个附图中相同的字符表示相同的部件，其中：
图1是根据本公开的实施方案的用于核酸的基于滚环扩增的表征中的寡核苷酸的示意图。
图2是根据本公开的实施方案的核酸的基于滚环扩增的表征中的方案步骤的示意图。
图3是根据本公开的实施方案的核酸的基于多重滚环扩增的表征的示意图。
图4是根据本公开的实施方案的从cDNA开始并生成有义链扩增子和反义链扩增子的示例性方案的示意图。
图5是根据本公开的实施方案的用于核酸的表征的滚环扩增模板的CRISPR-Cas介导的生成的步骤的示例性方案的示意图。
图6是根据本公开的实施方案的用于核酸的表征的滚环扩增模板的CRISPR-Cas介导的生成的步骤的示例性方案的示意图。
图7是根据本公开的实施方案的用于核酸的表征的滚环扩增模板的CRISPR-Cas介导的生成的步骤的示例性方案的示意图。
图8是通过滚环扩增和第二链合成生成双链、连接的全长cDNA产物的方案的示意图；
图9是根据本技术配置为采集测序数据的测序装置的框图。
具体实施方式
呈现以下讨论以使得本领域的任何技术人员能够实现和使用所公开的技术，并且在特定应用及其要求的上下文中提供以下讨论。对所公开的具体实施的各种修改对于本领域的技术人员而言将是显而易见的，并且在不脱离所公开的技术的实质和范围的情况下，本文所定义的一般原理可应用于其他具体实施和应用。因此，所公开的技术并非旨在限于所示的具体实施，而是要符合与本文所公开的原理和特征一致的最广范围。
本文描述了允许表征核酸的多种方法和组合物。核酸表征可包括采集序列信息和/或序列检测数据，诸如来自聚合酶链反应(PCR)和扩增子检测、基于杂交的检测、基于阵列的检测等的数据。在某些实施方案中，所公开的技术提供用于靶核酸的测序和/或检测技术。在某些实施方案中，本文提供了作为扩增模板的非天然存在的核酸，例如重组和/或合成的寡核苷酸。在一个实施方案中，将非天然存在的核酸用作模板以经由滚环扩增生成扩增子。所生成的扩增子可被提供以用于测序和/或检测方案中的进一步处理以生成测序和/或检测输出。
本文公开的某些实施方案参考RNA靶核酸，例如单链RNA进行讨论。然而，应当理解，实施方案可以与单链或双链的DNA或RNA结合使用。在某些情况下，作为所公开的方案的一部分，双链核酸可以被变性以在适当的情况下生成单链核酸靶核酸。
图1示出根据所公开的实施方案的使用滚环扩增的核酸表征技术的组成部分的示意图。该技术包括示出为单链的靶核酸12。靶核酸可以是天然存在的单链分子，诸如mRNA或单链病毒，或者可以是变性的，使得靶核酸12还包括反向互补链。
尽管为了说明的目的将靶核酸12示出为单链，但应当理解靶核酸可包括彼此相同或不同的多个核酸链。例如，当靶核酸12是病毒时，靶核酸12可以在一条核酸链(或几条链)上包括病毒基因组。可以存在通常为相同序列的病毒基因组的多个拷贝，尽管靶核酸12的某些拷贝可以具有代表感染个体内的序列多样性的变异。此外，在样品是多重的情况下，靶核酸12还可以包括代表病毒序列的个体间变异的变异。当靶核酸12是较大的基因组时，靶核酸12可以被片段化，其中不同的链代表不同的基因组部分。当靶核酸12是转录组时，不同的链代表不同的mRNA转录物或其cDNA拷贝。在实施方案中，靶核酸可以是来自感染个体的病毒核酸，例如COVID-19RNA基因组，由此病毒核酸可以包括可通过所公开的技术检测(例如，测序)的个体内或个体间变体。在实施方案中，所公开的技术用作多重样品分析的一部分。
在例示的实施方案中，靶核酸上的不同靶结合序列20、22沿着靶核酸12侧接不同的靶区域24。该技术包括向寡核苷酸16(例如，单链寡核苷酸16)提供针对不同靶区域24(例如，靶区域24a、24b、24c、24d)的两个引物30、32，使得当结合时，单独的寡核苷酸16在靶序列24周围形成环状结构(参见图2)。
每个单独的寡核苷酸16具有结合到第二靶结合序列20的第二靶特异性引物30以及结合到第一靶结合序列22的第一靶特异性引物32。第二靶特异性引物30是第一靶特异性引物32的5'，并且是第二靶结合序列20的反向互补序列。第一靶特异性引物32是第一靶结合序列22的反向互补序列。为了允许靶序列24的扩增以及在一些情况下保留靶核酸12上的变体信息，在与靶核酸接触并随后扩增之前，寡核苷酸16不包括与靶序列24互补的序列。在例示的实施方案中，第二靶特异性引物30在寡核苷酸的5’末端处或附近，并且第一靶特异性引物32在寡核苷酸16的3’末端处或附近。
为了实现在靶核酸12上的覆盖，可以提供多个寡核苷酸16，其具有相对于彼此可区分的靶特异性引物序列30、32，并且具有对不同靶结合序列20、22的结合特异性以扩增不同的靶区域24。即，第二靶特异性引物30a具有与第二靶特异性引物30b、第二靶特异性引物30c、第二靶特异性引物30d等不同的序列。此外，第一靶特异性引物32a具有与第一靶特异性引物32b、第一靶特异性引物32c、第一靶特异性引物32d等不同的序列。此外，靶特异性引物序列30、32可以彼此不同以促进定向环状结合，如图2所示。
虽然仅示出了几个寡核苷酸16，但是应当理解，一组寡核苷酸16可包括两个或更多个、五个或更多个、10个或更多个、100个或更多个、或1000个或更多个寡核苷酸16。不同的寡核苷酸16可以基于序列彼此区分。此外，寡核苷酸16可被设计成实现在靶核酸12上的完全覆盖，其中靶特异性引物序列30、32被设计用于不同的靶结合序列20、22。在实施方案中，寡核苷酸可被设计成使得靶区域24仅代表靶向测序反应中的靶核酸12的一部分。寡核苷酸16可以作为测序试剂盒的样品制备试剂的一部分提供。在实施方案中，所公开的实施方案可包括具有10-50、10-100或10-500个寡核苷酸16的反应混合物或试剂盒，该寡核苷酸各自具有引物30、32，该引物结合到测接不同靶区域24的不同靶结合序列20、22。此外，反应混合物可以包括对特定靶区域24(例如，靶区域24a、24b、24c、24d)具有特异性的一个或多个单独的寡核苷酸16的多个拷贝。不同的寡核苷酸靶区域24的数目可以基于期望的测定特征来选择。
在实施方案中，每个单独的寡核苷酸16的长度在实施方案中可以在约50-500个碱基的范围内(例如，长度为80-300个碱基)，并且靶特异性引物序列30、32的长度可以各自单独地在12-30个碱基之间。尽管每个寡核苷酸16包括一对靶特异性引物序列30、32，但靶特异性引物序列30、32之间的间插区(例如，50-120个碱基)也可包括功能序列，诸如一个或多个条形码或索引序列、测序引物、嵌合末端序列等。寡核苷酸16的长度可以根据靶序列24的长度而变化，较长的寡核苷酸16与相对较长的靶区域24一起使用。在实施方案中，靶序列24的长度在1-2500个碱基之间(例如，长度为50-350个碱基)。在实施方案中，靶序列24的长度在100-200个碱基之间，或者长度为约150个碱基，并且适于短读段测序。
图2示出单独寡核苷酸16结合到靶核酸12后的滚环扩增，作为表征一个或多个靶区域24的一部分。在第一步骤处，在将寡核苷酸16与靶核酸12结合后(参见图1)，单独寡核苷酸16经由靶特异性引物序列30、32的互补结合在靶核酸12上的单独靶序列24周围形成开环结构。在例示的实施方案中，寡核苷酸16设置有双索引序列i5和i7。
寡核苷酸16的靶特异性引物序列30、32之间的间插区36可以包括引物结合序列，通过示例显示为B15'、A14和嵌合末端(ME)序列。在实施方案中，寡核苷酸16的至少一个索引序列可以是单独的寡核苷酸16所特有的，并且可与跟靶核酸12接触的其他寡核苷酸16上的索引区分开。在双索引排列中，寡核苷酸可以包括两个独特且可区分的索引。在实施方案中，寡核苷酸16可包括反应共有的样品条形码并指示与靶核酸12的反应中的样品来源。一个或多个引物结合序列对于与靶核酸12的反应可以是通用的或共有的。在实施方案中，一个或多个引物结合序列在多重反应(参见图3)的不同样品之间可以是通用的或共有的以简化方案步骤。
在下一个步骤中，开环结构经由聚合酶延伸在3'末端处并朝向5'末端并且基于靶序列24延伸，使得添加的核苷酸形成靶序列24中核苷酸的反向互补序列。在实施方案中，靶核酸是RNA，并且延伸聚合酶是RT聚合酶。在实施方案中，靶核酸是DNA，并且延伸聚合酶是DNA聚合酶。延伸可以是等温反应。延伸的3’末端连接到5’末端(例如，经由连接酶)。寡核苷酸16的5’末端可以在结合到靶核酸12之前或之后被磷酸化以促进连接。切口连接闭合环，使得寡核苷酸16形成闭环结构40，该闭环结构经由靶序列24的反向互补序列42的掺入而被修饰。
闭环结构40经历滚环扩增反应，引发存在于闭环结构中的寡核苷酸16的序列。在实施方案中，闭环结构40可以在经由结合滚环扩增引物50开始滚环扩增之前与靶核酸12热分离。然而，在其他反应中，诸如一锅反应，滚环扩增引物50可在较早阶段结合寡核苷酸16。
滚环扩增引物50可基于对是不同靶区域24特异性的寡核苷酸16之间的公共序列来设计，使得单个通用引物50扩增反应中的所有闭环结构40。因此，在实施方案中，引物50对于间插区36中的序列是特异性的，而不是引物30、32。滚环扩增使用具有高持续合成能力和链置换活性的链置换聚合酶(诸如Phi29聚合酶)生成连接的单链核酸60。滚环扩增引物50可以是例如5-20个碱基。滚环扩增反应可以使用可商购获得的试剂盒，例如来自Amersham Biosciences的templiphi试剂盒(GE产品号25-6400-10)，并用基于寡核苷酸16的序列设计的定制引物50进行。
应当注意，如本文所公开的滚环扩增的连接的单链核酸60产物不是环，而是序列的长链，其中环形材料在线性链中被复制多次。因此，每个滚环扩增产物是含有模板的环形序列的多联体重复拷贝的长线性串，此处显示为闭环40。在实施方案中，滚环扩增运行至终点(例如，反应混合物中的dNTP试剂的耗尽)。连接的单链核酸60的重复单元62包括靶序列24。根据存在于间插区36中的序列，可以在重复单元62中的靶序列24的5'和/或3'掺入功能序列，诸如一个或两个索引序列、通用测序或引物结合序列、酶结合序列等。连接的单链核酸60可被合并并且进行PCR以添加包括一个或多个附加索引序列和/或衔接子序列(例如，P5和P7，Illumina,Inc.)的第二级索引，从而以用于特定测序平台(诸如Illumina测序平台)的标准格式生成测序文库的片段。例示的是引物64、66，其形成正向引物对和反向引物对，并且具有与重复单元62非互补但在扩增反应过程中掺入到扩增子中的附加5'序列。
在实施方案中，可以选择寡核苷酸16的间插区36的引物结合序列和索引序列，使得当经由滚环扩增进行拷贝时，掺入到重复单元中的互补序列可以直接进行测序，以与本文提供的测序方案一起工作。因此，衔接子序列(例如，P5和P7，Illumina,Inc.)以及任何其他相关序列可直接掺入到重复单元62中。在一个示例中，为了测序文库制备的目的，不同的片段化位点可以存在于重复单元中以促进连接的单链核酸60的片段化。
因此，在所公开的实施方案中，可以通过使用滚环扩增提供相对低浓度的靶核酸12作为表征的起始材料，该滚环扩增扩增感兴趣的靶序列同时保留变体信息。此外，所公开的合成寡核苷酸16可用于生成用于滚环扩增的大小受控的模板，其可有益于生成用于经由短读段测序技术表征的片段，该短读段测序技术产生约150个碱基的测序读段并且比使用较长读段的技术成本更低。
应当理解，在结合到靶核酸12之前，寡核苷酸16可以处于单链状态。然而，结合到靶核酸12导致形成寡核苷酸16和靶核酸12之间的至少部分双链结构。此外，在所公开的方案的一部分期间，闭环结构可以是至少部分单链的，但也与靶核酸12、滚环扩增引物50，并且在连接的单链核酸60的形成期间形成至少部分双链的结构。
图3示出在生成图2中的连接的单链核酸60之后发生的多重反应的示例性合并步骤。对结合到从第一样品70a(样品1)生成的靶核酸12a的寡核苷酸16a进行索引。索引经由样品1特异性索引72a(示出为i1)，经由滚环扩增跨闭环结构40a而发生，该闭环结构由结合到靶核酸12a的寡核苷酸16a生成。对结合到从第二样品70b(样品2)生成的靶核酸12b的寡核苷酸16b进行索引。索引经由样品2特异性索引72b(示出为i2)，经由滚环扩增跨闭环结构40b而发生，该闭环结构由结合到靶核酸12b的寡核苷酸16b生成。因此，基于样品1或样品2的索引序列的存在，合并的连接的单链核酸60a、60b是可区分的并且可归因于来源样品。虽然图示的示例示出了多重反应中的两个不同样品，但是应当理解，可以存在任何数量的样品，每个样品具有不同的独特样品特异性索引(i3、i4、i5…in)。来自不同样品的连接的单链核酸60可在第一级索引之后合并以经历用于第二级索引和/或衔接子掺入的PCR反应。
如本文所提供的，靶核酸12可以是双链或单链RNA或DNA分子。图4示出其中靶核酸12包括cDNA以允许生成有义链扩增子和反义链扩增子连接的单链核酸60的变异。在一个示例中，模板RNA链80用于生成互补cDNA链82，以经由逆转录形成双链产物83。在另一个示例中，双链产物83继而转化成完整的双链cDNA 86。在实施方案中，除了原始单链或双链RNA之外，这些中的一者或两者可以是靶核酸12。
双链产物83和/或完整cDNA 86的链80、82的序列可用于设计寡核苷酸16。在所描绘的实施方案中，寡核苷酸16可被设计成在相应链80、82和/或82、84上的非互补靶序列处结合。然而，应当理解，寡核苷酸可以附加地或另选地被设计成在相应链80、82和/或82、84上的互补位置处结合。扩增子连接的单链核酸60代表来自两条不同链的扩增子，并且可以如本文所公开进行索引，并且合并以用于后续处理(附加索引、测序)。在实施方案中，RCA扩增子可例如经由核酸外切酶与模板分离以消化掉模板。在RNA模板的情况下，核酸外切酶可以是RNA H。
图5至图7示出成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)相互作用的示例，该相互作用附加地或另选地可用于生成与模板分子的常规和/或滚环扩增结合使用的引物。如本文所提供的，CRISPR-Cas是指酶系统，该酶系统包括含有与靶区域互补或基本上互补的核苷酸序列的引导RNA序列以及具有核酸酶活性的蛋白质。CRISPR-Cas系统包括I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统以及它们的衍生物。CRISPR-Cas系统包括衍生自天然存在的CRISPR-cas系统的工程化和/或程序化的核酸酶系统。CRISPR-Cas系统可包含工程化和/或突变的Cas蛋白。CRISPR-Cas系统可包含工程化和/或程序化的引导RNA。引导RNA是指含有与靶互补或基本上互补的序列的RNA。引导RNA可包含除了与靶DNA序列的区域互补或基本上互补的区域之外的核苷酸序列。引导RNA可以是crRNA或其衍生物，例如，crRNA:tracrRNA嵌合体。在某些实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白、Cas3蛋白或Cas13蛋白。例如，在其中靶核酸是ssRNA的实施方案中，CRISPR-Cas包括切割ssRNA的Cas13蛋白。
在特定Cas蛋白功能对靶核酸12的形式(例如，单链与双链，RNA与DNA)特异时，应当理解靶核酸12可经历预处理步骤以将单链基底转化为双链基底，使单链基底变性，或合成靶核酸12的一条或两条链的互补DNA或RNA拷贝。因此，本文提供的反应混合物或试剂盒可包括作为此类预处理步骤的一部分的酶。
图5示出与靶核酸12的示例性CRISPR-Cas介导的反应。在例示的实施方案中，靶核酸12是单链RNA。然而，靶核酸12可以是DNA并且是双链或单链。CRISPR-Cas系统100包括第一Cas蛋白102a和相关联的引导RNA 104a。引导RNA 104a具有对靶核酸12的第一靶区域105a是特异性的引导靶特异性序列106a。CRISPR-Cas系统100还包括第二Cas蛋白102b和相关联的引导RNA 104b。引导RNA 104b具有对靶核酸12的第二靶区域105b是特异性的引导靶特异性序列106b。因此，相应引导序列106a、106b对靶特异性序列105是特异性的，该靶特异性序列示出为靶核酸12上的间隔开的靶区域105a、105b。在某些实施方案中，靶区域105a、105b在靶核酸12的相同链上或者可以在双链靶核酸12的不同链上，其中Cas蛋白引起双链断裂。在区域107a、107b内的相应Cas切割位点107a、107b处的Cas介导的切割从区域105a、105b之间切割出间插寡核苷酸108。
在实施方案中，引导靶特异性序列106a、106b的长度是17-20个碱基。因此，间插寡核苷酸108的大小可取决于引导RNA 104a、104b在靶核酸12上的排列。在某些实施方案中，靶核酸12可以是双链的，并且引导RNA 104a、104b可被设计成结合在分开的链上，而Cas蛋白102a、102b引起双链断裂。在实施方案中，引导序列106a、106b结合到相同的链。在实施方案中，在靶核酸12的相同链上的3'结合的引导靶特异性序列106b比多个5'结合的引导序列106a更短(例如，15-17个碱基)以允许更短的寡核苷酸108被释放。在实施方案中，寡核苷酸长度在12-30个碱基之间。靶区域105a、105b间隔开大约间插寡核苷酸108的长度。然而，在某些实施方案中，间插寡核苷酸108包括靶区域105a、105b的一些部分，其是第一或多个5'Cas蛋白102a的切割位点的3'和第二或多个3'Cas蛋白102b的切割位点的5'。因此，第一靶区域105a的3'末端和第二靶特异性序列105b的5'末端之间的碱基长度可以小于间插寡核苷酸108的长度。
寡核苷酸108一旦从靶核酸12释放，就自由地用作环化合成报告子模板110的滚环扩增引物。环化合成报告子模板110包括与寡核苷酸108互补的序列112。环化合成报告子模板110可包括附加功能序列114，诸如衔接子序列、测序引物结合位点、一个或多个条形码或索引等。所生成的连接的单链核酸120可以根据本文讨论的技术进行检测/表征。
在实施方案中，环化合成报告子模板110可以是由如图1至图4中公开的寡核苷酸16生成的闭环结构40，并且其通过将寡核苷酸16的引物30、32结合到靶结合序列20、22以及环的随后闭合而生成。在实施方案中，环化合成报告子模板110可以预先形成并作为反应混合物的试剂提供。因此，在实施方案中，可作为试剂盒提供的反应混合物试剂可包括具有设计的引导序列106a、106b的CRISPR-Cas系统100、环化合成报告子模板110以及用于滚环扩增的试剂，其还可包括检测试剂。
在一个实施方案中，靶核酸的变体(诸如COVID-19序列变体或其他病原体变体)可通过提供具有引物结合序列的不同的独特索引的环化合成报告子模板110而在靶核酸12的样品中鉴定，该引物结合序列代表感兴趣的不同变体的相应互补序列。释放的寡核苷酸108将优先结合到包括与寡核苷酸108互补的序列112的环化合成报告子模板110，包括释放的寡核苷酸108中存在的任何变体，并且将减少与其他环化合成报告子模板110的结合，该模板的引物结合序列不与释放的寡核苷酸108互补。因此，在检测阶段处，存在于所生成的连接的单链核酸120中的一个或多个索引可以进行短的索引读段(这比较长的测序读段成本更低)，以生成与特定的相关变体相关联的索引序列信息，该特定的相关变体的环化合成报告子模板110包括互补序列。因此，反应混合物或试剂盒可包括多个环化合成报告子模板110，其具有模板110的子集，该模板具有代表寡核苷酸108中观察到的不同变体的相应不同的序列112。此外，虽然显示了寡核苷酸108的示例性反应，但是应当理解，在反应中可以包括靶核酸12的多个位点以在不同位置并行释放多个不同的寡核苷酸108。因此，作为反应混合物的一部分提供的环化合成报告子模板110可包括基于不同释放的寡核苷酸108的序列的不同序列112。
虽然图5的实施方案示出基于滚环扩增的技术，但CRISPR-Cas系统100也可用于生成常规双引物扩增的一个或两个引物。在一个实施方案中，第二引物作为反应混合物的一部分提供并且与寡核苷酸108一起工作以扩增合成模板，该合成模板可以是线性合成模板，该线性合成模板通常可以包括环化合成报告子模板110的特征，但以线性形式排列。
图6示出另选的CRISPR-Cas介导的反应，其中利用CRISPR-Cas系统100的旁系切割活性来生成用于扩增的引物。CRISPR-Cas系统100被示出为结合到靶核酸12，该靶核酸包括具有感兴趣序列的靶区域105。系统100经由结合到靶区域105的引导RNA 104的靶特异性序列106来结合到靶核酸12。因此，系统100经由靶特异性序列106与靶区域105的互补性的结合是基于靶区域105的特定序列的存在。靶特异性序列106可以基于感兴趣的特定序列来设计。通过结合激活的Cas蛋白102(例如，Cas13、Cas12a)的旁系单链切割酶活性可用作存在靶区域105的特定序列的代理指示物的一部分。在例示的实施方案中，旁系单链切割活性由通过引导RNA的靶特异性序列106特异性结合到靶区域105而触发。这样的切割可以线性化单链环形RNA模板140、144以生成线性化引物150、152。
因此，与其中引物直接从靶核酸12(例如，病毒RNA)释放的图5的实施例相反，图6示出Cas的旁系活性可用于从环形模板140、144释放引物150、152。释放的引物然后可以参与在报告子模板154上的扩增反应。尽管例示的实施方案显示模板140、144代表正向引物对和反向引物对，但正向引物或反向引物中的仅一者可以作为环形模板提供，而另一个引物已经以线性形式掺入。报告子模板154可以包括功能序列，诸如允许合并扩增子的条形码或索引，和/或与下游测序反应相容的衔接子序列。
因此，在实施方案中，可作为试剂盒提供的反应混合物试剂可包括CRISPR-Cas系统100，其具有设计的引导序列106、代表正向引物对和反向引物对中的一者或两者的一个或多个环形模板(例如，环形模板140、144)、引物对对其具有特异性的报告子模板154、以及在单引物实施方案中线性形式的引物对中的另一引物。
图7是实施方案的示意图，其中Cas蛋白的旁系活性从哑铃释放引物。如图6所示，CRISPR-Cas系统100被示出为结合到靶核酸12，该靶核酸包括具有感兴趣序列的靶区域105。系统100经由结合到靶区域105的引导RNA 104的靶特异性序列106来结合到靶核酸12，这触发Cas蛋白102的旁系活性。旁系活性引起单链哑铃核酸结构160的切割，该单链哑铃核酸结构包括第一环形区域161和第二环形区域162。Cas蛋白102在间隔开的切割位点164处的切割释放寡核苷酸168，该寡核苷酸是第二环形区域162中的序列172的反向互补序列。
因此，寡核苷酸168可以用作用于另一单链哑铃核酸结构160的滚环扩增的引物，该另一单链哑铃核酸结构在那些位点处尚未经历切割并且保留第一环形区域161和第二环形区域162。在实施方案中，生成连接的单链核酸扩增产物180，其可经由掺入可检测标记物182来检测。然而，设想到如本文所提供的附加或另选检测方法。此外，连接的单链核酸扩增产物180是旁系Cas活性的靶标，其继而经由切割生成更多引物。通过完整单链哑铃核酸结构160在指数扩增中的滚环扩增，引物继而可生成更多的连接的单链核酸扩增产物180。因此，单链哑铃核酸结构160和CRISPR-Cas系统100的比率可被选择为使得即使在非常低的靶核酸浓度下，指数扩增也产生连接的单链核酸扩增产物180的稳健的可检测结果。
图8示出示例性滚环扩增技术，其允许经由短读段进行外显子组测序，但保留变体的相位信息以允许单体型分析。高通量、短读段DNA测序是以低错误率对外显子组进行测序的有成本效益的方式。然而，因为读段的长度通常短于mRNA的全长，所以短读段技术通常不能产生具有全长mRNA序列的外显子组。这种不足意味着当处理来自cDNA的短读段时，(1)mRNA同种型(即，剪接变体)不能被完全分析(即，具有长读段技术可以提供的置信度)，以及(2)存在于外显子组中的变体不能根据单体型分析定相。此外，mRNA序列中的单体型定相变体是最有可能被解释和临床上可操作的单体型定相变体。因此，在外显子组测序中保留变体的相信息将提供优于常规短读段测序技术的益处。
尽管某些测序技术诸如保留邻接性的转座(CPT)技术(即，Illumina空间条形码或序列条形码技术)保留了相信息，但使用CPT不能有效地对从mRNA生成的全长cDNA进行测序。在片段标签化后，从cDNA生成的链接读段通常仅包含约10％的全序列。即，CPT在将cDNA的不同部分相互关联方面效率很低。所公开的技术涉及生成滚环扩增的cDNA基底。基底是从cDNA生成的连接的核酸，其在与CPT和短读段技术结合使用时允许生成cDNA的全长外显子组。
图8示出连接全长cDNA 200以生成双链DNA的长分子的方案的示意图。首先，为了生成cDNA(即，cDNA的非连接的单拷贝)，使用逆转录酶和5'-磷酸化寡-dT引物204复制全长mRNA 202。该DNA寡核苷酸引物204含有引物结合位点(PBS)206以及任选的独特分子标识符(UMI)208。在随后的步骤中，5'磷酸化引物能够在5'磷酸化末端210处连接。在例示的实施方案中，寡-dT引物具有任选的3'V(A、G或C)。
在逆转录后，使用RNA酶H来降解mRNA 202，并且使用单链DNA连接酶(例如，环化连接酶(CircLigase))来环化剩余的cDNA 200。然后使用DNA寡核苷酸引物220在PBS序列206处引发DNA合成。通过使用高度进化性且能够链置换的DNA聚合酶(例如，Phi29)，通过滚环扩增(RCA)生成cDNA 200的连接的拷贝224。然后使用具有PBS序列206的5'-磷酸化DNA寡核苷酸引物230来引发互补第二链的合成。没有链置换活性的DNA聚合酶(例如，大肠杆菌连接酶、Phusion)和DNA切口连接酶(例如，T4连接酶、Taq连接酶)用于完成互补链236。
使用双链DNA产物240作为测定基底，可使用保留邻接性的转座(CPT)测序技术来生成链接的Illumina短读段文库。CPT技术可以如在美国专利号10,557,133中一般公开的那样进行，该专利出于所有目的全文以引用方式并入本文。该文库的测序和分析产生全长外显子组。连接的核酸可用于生成双链DNA基底，其具有可能大于100个拷贝的端对端连接的cDNA(即，可能>100kb基底)。因为现在如此多的cDNA拷贝被接合在长的DNA链上，即使当CPT技术仅链接来自该基底链的小部分读段时，连接的基底中的序列冗余现在使得来自相同单体型的剪接点和外显子组变体能够被有效地链接和分析。
在一些实施方案中，所公开的技术用于从如本文提供的扩增产物生成核酸测序文库或DNA片段文库。在一个示例中，通过添加功能序列(诸如作为本文提供的扩增技术的一部分的索引序列和引物结合序列)从核酸生成文库。因此，可以通过在测序反应中对所产生的文库进行测序以生成测序数据来检测扩增产物。在实施方案中，生物样品是来自被病毒感染(例如，COVID-19)或具有特定临床病症的患者的样品，并且测序数据包括使用所公开的扩增技术中的一者或多者在样品中检测到的变体的读数。在一个示例中，扩增技术扩增和测序代理模板，诸如合成模板，而不是样品本身。因此，读数可以包括感兴趣的变体的是/否指示。测序数据可以仅包括较短的索引/条形码读段，由此链接到特定第一索引的特定读段的存在将该读段与多重样品中的特定患者联系起来，并且特定第二索引或UMI的存在将该读段与特定变体联系起来。只有当与靶核酸中的特定序列联系起来的上游反应释放引物以允许合成模板的扩增时，某些合成模板才可以被扩增。在附加示例中，合成模板可以与释放的引物互补，因此，合成模板序列可以提供变体信息。
图9是测序装置260的示意图，该测序装置可以结合所公开的实施方案使用，用于从如本文提供的核酸采集测序数据(例如，测序读段、读段1、读段2、索引读段、索引读段1、索引读段2、多样品测序数据)。测序装置260可以根据任何测序技术来实现，诸如结合了美国专利公开号2007/0166705、2006/0188901、2006/0240439、2006/0281109、2005/0100900、美国专利号7,057,026、WO 05/065814、WO 06/064199、WO 07/010,251中所述的边合成边测序的方法的测序技术，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。另选地，可以在测序装置260中使用边连接边测序技术。此类技术使用DNA连接酶掺入寡核苷酸并且识别此类寡核苷酸的掺入，并且描述于美国专利号6,969,488；美国专利号6,172,218；和美国专利号6,306,597；这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。一些实施方案可以利用纳米孔测序，由此样品核酸链或从样品核酸外切移除的核苷酸穿过纳米孔。随着样品核酸或核苷酸穿过纳米孔，可通过测量孔的电导率的波动来识别每种类型的碱基(美国专利号7,001,792，Soni&Meller,Clin.Chem.53,1996–2001(2007)；Healy，Nanomed.2,459–481(2007)；以及Cockroft等人，J.Am.Chem.Soc.130,818–820(2008)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。又一些实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物时释放的质子。例如，基于释放质子的检测的测序可使用可从Ion Torrent公司(Guilford,CT，Life Technologies子公司)商购获得的电检测器和相关技术或在US2009/0026082 A1、US2009/0127589 A1、US2010/0137143A1或US2010/0282617 A1中所述的测序方法和系统，这些文献中的每一篇均以引用方式全文并入本文。特定实施方案可利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。可以通过带有荧光团的聚合酶与γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用或者利用零模式波导来检测核苷酸掺入，如例如以下文献中所述：Levene等人，Science 299,682–686(2003)；Lundquist等人，Opt.Lett.33,1026–1028(2008)；Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181(2008)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文。其他合适的替代技术包括例如荧光原位测序(FISSEQ)和大规模并行签名测序(MPSS)。在特定实施方案中，测序装置260可以是来自Illumina,La Jolla,CA的iSeq。在其他实施方案中，测序装置260可以被配置为使用CMOS传感器操作，该CMOS传感器具有在光电二极管上制造的纳米阱，使得DNA沉积与每个光电二极管一对一地对准。
测序装置260可以是“单通道”检测装置，其中对于任何给定图像仅四个核苷酸中的两个被标记并且是可检测的。例如，胸腺嘧啶可以具有永久的荧光标记，而腺嘌呤以可分离的形式使用相同的荧光标记。鸟嘌呤可以是永久黑暗的，并且胞嘧啶可以最初是黑暗的，但能够在循环期间具有添加的标记。因此，每个循环可以涉及初始图像和第二图像，其中染料从任何腺嘌呤裂解并且添加到任何胞嘧啶，使得在初始图像中仅胸腺嘧啶和腺嘌呤是可检测的，但在第二图像中仅胸腺嘧啶和胞嘧啶是可检测的。通过两个图像为黑暗的任何碱基是鸟嘌呤，并且通过两个图像可检测的任何碱基是胸腺嘧啶。在第一图像中可检测但在第二图像中不可检测的碱基是腺嘌呤，并且在第一图像中不可检测但在第二图像中可检测的碱基是胞嘧啶。通过组合来自初始图像和第二图像的信息，能够使用单通道来区分所有四种碱基。在其他实施方案中，测序装置260可以是“双通道”检测装置。
在所描绘的实施方案中，测序装置260包括单独的样品基底262，例如流通池或测序盒，以及相关联的计算机264。然而，如上所述，这些可以实现为单个装置。在所描绘的实施方案中，可以将生物样品装载到基底262中，该基底被成像以生成序列数据。例如，与生物样品相互作用的试剂响应于由成像模块272生成的激发束而以特定波长发荧光，并且由此返回辐射用于成像。例如，荧光组分可由荧光标记的核酸生成，该荧光标记的核酸与组分的互补分子或与使用聚合酶掺入寡核苷酸中的荧光标记的核苷酸杂交。如本领域技术人员将理解的，激发样品的染料的波长和其发荧光的波长将取决于特定染料的吸收和发射光谱。此类返回的辐射可以通过引导光学器件传播回来。该向后束通常可被导向成像模块272的检测光学器件，其可以是相机或其他光学检测器。
成像模块检测光学器件可以基于任何合适的技术，并且可以是例如带电耦合装置(CCD)传感器，其基于影响装置中的位置的光子生成像素化图像数据。然而，应理解，也可以使用各种其他检测器中的任一种，包括但不限于被配置用于时间延迟积分(TDI)操作的检测器阵列、互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器、雪崩光电二极管(APD)检测器、Geiger模式光子计数器或任何其他合适的检测器。TDI模式检测可以与线扫描耦合，如美国专利号7,329,860中所述，该专利以引用方式并入本文。其他可用的检测器在例如本文先前在各种核酸测序方法的上下文中提供的参考文献中有所描述。
成像模块272可以处于处理器控制下(例如，经由处理器274)，并且还可以包括I/O控件276、内部总线278、非易失性存储器280、RAM 282和使得存储器能够存储可执行指令的任何其他存储器结构，以及可以类似于关于图10所描述的那些的其他合适的硬件部件。此外，相关联的计算机264还可以包括处理器184、I/O控件286、通信模块284和包括RAM 288和非易失性存储器290的存储器架构，使得存储器架构能够存储可执行指令292。硬件部件可以由内部总线294链接，该内部总线也可以链接到显示器296。在测序装置260被实现为一体装置的实施方案中，可以消除某些冗余硬件元件。
处理器284可以被编程为根据本文提供的技术基于一个或多个相关联索引序列将单独的测序读段分配给样品。在特定实施方案中，测序装置260可以被配置成基于由成像模块272采集的图像数据，生成包括单独簇的序列读段的测序数据，其中每个序列读段与基底270上的特定位置相关联。每个序列读段可以来自包含插件的片段。测序数据包括测序读段的每个碱基的碱基调用。此外，基于图像数据，即使对于串联执行的测序读段，单独读段也可经由图像数据链接到相同位置，并且因此链接到相同的模板链。以此方式，索引测序读段可以在分配给原始样品之前与插入序列的测序读段相关联。处理器284还可以被编程为在将测序读段分配给样品之后对对应于特定样品的插入物的序列执行下游分析。
虽然所公开的扩增产物可通过例如经由测序装置260生成如本文所提供的测序数据来检测，但也考虑到附加检测方法。可以使用滚环扩增(RCA)或常规扩增在所公开的实施方案的检测方法中检测靶序列或扩增产物。这可以以多种方式实现；例如，引物(例如，滚环扩增引物)可以被标记，或者聚合酶可以掺入标记的核苷酸和标记的产物，其通过检测阵列中的捕获探针检测。滚环扩增可在诸如以下文献中通常描述的那些条件之类的条件下进行：Baner等人，(1998)Nuc.Acids Res，26:5073-5078；Barany,F.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193；以及Lizardi等人，(1998)Nat Genet.19:225-232。此外，滚环扩增产物通过与固相形式(例如，珠阵列)的探针杂交而容易地检测。RCA的附加优点是它提供了多重分析的能力，使得可以并行分析大量序列。此外，还可以想到阵列上基于杂交的检测和/或基于定量PCR的检测技术。
所公开的技术可用于表征靶核酸(例如，靶核酸12)。“靶核酸”或样品核酸可源于任何体内或体外来源，包括源于一种或多种细胞、组织、器官或生物体(无论是活体还是非活体)或源于任何生物或环境来源(例如，水、空气、土壤)。例如，在一些实施方案中，样品核酸包括真核和/或原核dsDNA或由其组成，其来源于或源于人、动物、植物、真菌(例如，霉菌或酵母)、细菌、病毒、类病毒、支原体或其他微生物。在一些实施方案中，样品核酸包括基因组DNA、亚基因组DNA、染色体DNA(例如，来自分离的染色体或染色体的一部分，例如，来自染色体的一个或多个基因或基因座)、线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒或其他附加体衍生的DNA(或其中包含的重组DNA)或双链cDNA或由这些组成，该双链cDNA通过使用RNA依赖性DNA聚合酶或逆转录酶逆转录RNA以生成第一链cDNA，然后延伸与第一链cDNA退火的引物以生成dsDNA来制备。在一些实施方案中，样品核酸包括在核酸分子中或由核酸分子制备的多个dsDNA分子(例如，在基因组DNA或cDNA中或由基因组DNA或cDNA制备的多个dsDNA分子，该基因组DNA或cDNA由在生物来源(例如，细胞、组织、器官、生物体)或环境来源(例如，水、空气、土壤、唾液、痰、尿液、粪便)中或来自该生物来源或环境来源的RNA制备)。在一些实施方案中，样品核酸来自体外来源。例如，在一些实施方案中，样品核酸包括dsDNA或由其组成，该dsDNA由单链DNA(ssDNA)或由单链或双链RNA在体外制备(例如，使用本领域已知的方法，诸如使用合适的DNA依赖性和/或RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)进行引物延伸)。在一些实施方案中，样品核酸包括dsDNA或由其组成，该dsDNA是使用本领域已知的任何方法由一个或多个双链或单链DNA或RNA分子的全部或一部分制备的，方法包括用于如下操作的方法：DNA或RNA扩增(例如，PCR或逆转录酶-PCR(RT-PCR)、转录介导的扩增方法，其中对一个或多个核酸分子的全部或一部分进行扩增)；将一个或多个核酸分子的全部或一部分分子克隆到随后在合适的宿主细胞中复制的质粒、F黏粒、BAC或其他载体中；或通过杂交捕获一个或多个核酸分子，诸如通过与阵列或微阵列上的DNA探针杂交。
所公开的连接的核酸、CRISPR修饰的序列和/或引物排列可包括非天然存在的核酸序列或合成核酸序列。
该书面描述使用示例作为本公开的一部分，以使得本领域的任何技术人员能够实践所公开的实施方案，包括制造和使用任何装置或系统以及执行任何结合的方法。可取得专利的范围由权利要求限定，并且可以包括本领域的技术人员想到的其他示例。如果此类其他示例具有与权利要求的字面语言无差异的结构元件，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构元件，则这些其他示例旨在落入权利要求的范围内。

Claims (36)

1.一种核酸组合物，包含：
第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一5'引物序列、第一3'引物序列以及设置在所述第一5'引物序列和所述第一3'引物序列之间的第一间插区；
第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二5'引物序列、第二3'引物序列以及设置在所述第二5'引物序列和所述第二3'引物序列之间的第二间插区；以及
靶核酸，其中所述第一5'引物序列和所述第一3'引物序列与侧接所述靶核酸的第一靶序列的第一区域互补，并且其中所述第二5'引物序列和所述第二3'引物序列与侧接所述靶核酸的第二靶序列的第二区域互补，使得所述第一寡核苷酸在与所述靶核酸结合时在所述第一靶序列周围形成第一环状结构，并且所述第二寡核苷酸在与所述靶核酸结合时在所述第二靶序列周围形成第二环状结构。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一靶序列和所述第二靶序列的长度在50-350个碱基之间。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶核酸是单链RNA。
4.根据权利要求1所述的组合物，包含聚合酶，所述聚合酶能够延伸所述第一5'引物序列和所述第一3'引物序列之间的所述第一环状结构，并且延伸所述第二5'引物序列和所述第二3'引物序列之间的所述第二环状结构。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述聚合酶是RT聚合酶。
6.根据权利要求4所述的组合物，包含连接酶，所述连接酶能够通过将延伸的第一3'末端连接到所述第一5'引物序列而闭合所述第一环状结构，并且能够通过将延伸的第二3'末端连接到所述第二5'引物序列而闭合所述第二环状结构。
7.根据权利要求1所述的组合物，包含对所述第一间插区和所述第二间插区中的公共序列是特异性的滚环扩增引物。
8.根据权利要求1所述的组合物，包含第一连接的单链核酸，所述第一连接的单链核酸包含重复单元，所述重复单元包含所述第一靶序列以及所述第一5'引物序列、所述第一3'引物序列和所述第一间插区的互补序列。
9.根据权利要求8所述的组合物，包含第二连接的单链核酸，所述第二连接的单链核酸包含重复单元，所述重复单元包含所述第二靶序列以及所述第二5'引物序列、所述第二3'引物序列和所述第二间插区的互补序列。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一间插区和所述第二间插区具有相同序列。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一间插区和所述第二间插区包含索引序列。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一5'引物序列结合所述第一靶序列的所述靶核酸5'，并且其中所述第一3'引物序列结合所述第一靶序列的3'。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二5'引物序列结合所述第二靶序列的所述靶核酸5'，并且其中所述第二3'引物序列结合所述第二靶序列的3'。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一靶序列和所述第二靶序列在所述靶核酸上间隔开。
15.一种用于扩增靶序列的方法，包括：
使靶核酸与寡核苷酸接触，使得所述寡核苷酸与所述核酸上的间隔开的靶结合序列结合，以在所述靶核酸的靶序列周围形成环状结构；
将所述寡核苷酸的3'末端朝向5'末端延伸并跨过所述靶序列；
将所述寡核苷酸的所延伸的3'末端连接到所述5'末端以形成闭环；以及
使用所述闭环作为滚环扩增的模板以生成连接的单链核酸。
16.根据权利要求15所述的方法，包括检测所连接的单链核酸以检测所述靶序列。
17.根据权利要求15所述的方法，包括对所连接的单链核酸进行测序以检测所述靶序列。
18.根据权利要求15所述的方法，包括将所连接的单链核酸与其他连接的单链核酸合并，所连接的单链核酸包含在所述其他连接的单链核酸中不存在的独特的索引序列。
19.根据权利要求18所述的方法，包括扩增所合并的连接的单链核酸以引入一个或多个附加索引序列。
20.一种用于检测靶核酸的方法，包括：
提供具有第一成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)引导RNA和第一CRISPR相关(Cas)蛋白以及第二CRISPR引导RNA和第二Cas蛋白的系统，其中所述第一引导RNA包含与靶核酸的第一区域互补的靶特异性核苷酸区域，并且所述第二引导RNA包含与靶核酸的与所述第一区域间隔开的第二区域互补的靶特异性核苷酸区域；
使所述靶核酸与所述系统接触以形成复合物，从而在所述第一区域和所述第二区域内切割以释放寡核苷酸，所述寡核苷酸包含在所述第一区域和所述第二区域之间的间插核苷酸；
将所述寡核苷酸退火到模板；以及
使用所退火的寡核苷酸作为引物扩增所述模板。
21.根据权利要求20所述的方法，包括检测所扩增的模板以检测所述寡核苷酸。
22.根据权利要求20所述的方法，包括对所扩增的模板进行测序以检测所述寡核苷酸。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述模板被环化，并且其中所述扩增包括通过使用所述寡核苷酸作为所述引物经由滚环扩增来扩增所述模板而生成连接的单链核酸。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述扩增包括提供正向引物对和反向引物对中的另一引物，所述正向引物对和反向引物对包含所述引物。
25.一种用于检测靶核酸的方法，包括：
提供具有成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)引导RNA和CRISPR相关(Cas)蛋白的系统，其中所述引导RNA包含与靶核酸的区域互补的靶特异性核苷酸区域；
提供多个环化寡核苷酸；
使所述靶核酸与所述系统接触以形成复合物；
使用所述复合物中的所述Cas蛋白将所述多个环化寡核苷酸线性化以生成引物；
将所述引物中的一个或多个引物退火到模板；以及
使用退火到所述模板的所述引物中的所述一个或多个引物扩增所述模板。
26.根据权利要求25所述的方法，包括基于所扩增的模板检测所述靶核酸的所述区域。
27.根据权利要求25所述的方法，包括基于所扩增的模板的测序检测所述靶核酸的所述区域。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述引物中的所述一个或多个引物包括正向引物对和反向引物对。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述扩增包括提供正向引物对和反向引物对中的另一引物，所述正向引物对和反向引物对包含所述引物。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述多个环化寡核苷酸包含具有链接到第二环形区域的第一环形区域的哑铃结构，并且其中使所述多个环化寡核苷酸线性化以生成引物包括仅使所述第一环形区域线性化而不使所述第二环形部分线性化，并且其中所述模板包含所述第二环形区域。
31.根据权利要求25所述的方法，其中扩增所述模板包括使用所述引物中的所述一个或多个引物作为用于滚环扩增的引物来扩增所述第二环形区域以生成连接的单链核酸。
32.一种用于扩增mRNA靶核酸的方法，包括：
提供用于逆转录酶反应的引物，所述引物包含用于滚环扩增的引物结合序列以及磷酸化的5'末端；
将所述引物退火到mRNA；
使用逆转录酶延伸所述引物以生成包含所述引物的cDNA；
将所述cDNA中的所述引物的所述磷酸化5'末端连接到3'末端以环化所述cDNA；
将滚环扩增引物退火到所环化的cDNA的所述引物结合序列；以及
使用退火到所环化的cDNA的所述滚环扩增引物来扩增所环化的cDNA以生成连接的单链核酸。
33.根据权利要求32所述的方法，包括将第二链引物退火到所述连接的单链核酸的重复单元，并延伸所退火的第二链引物以合成所连接的单链核酸的第二链。
34.根据权利要求32所述的方法，包括对所连接的单链核酸进行测序以生成所述mRNA的序列信息。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述测序包括将所连接的单链核酸片段化以生成测序文库的片段并对所述片段进行测序。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述片段化包括片段标签化反应。
CN202280031509.5A 2021-04-29 2022-04-28 用于核酸表征的扩增技术 Pending CN117377775A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163181769P 2021-04-29 2021-04-29
US63/181769 2021-04-29
PCT/US2022/026777 WO2022232425A2 (en) 2021-04-29 2022-04-28 Amplification techniques for nucleic acid characterization

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117377775A true CN117377775A (zh) 2024-01-09

Family

ID=81748790

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280031509.5A Pending CN117377775A (zh) 2021-04-29 2022-04-28 用于核酸表征的扩增技术

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240218436A1 (zh)
EP (1) EP4330430A2 (zh)
JP (1) JP2024522025A (zh)
KR (1) KR20240004473A (zh)
CN (1) CN117377775A (zh)
AU (1) AU2022264021A1 (zh)
CA (1) CA3217131A1 (zh)
IL (1) IL308031A (zh)
MX (1) MX2023012627A (zh)
WO (1) WO2022232425A2 (zh)

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
ATE545710T1 (de) 1997-04-01 2012-03-15 Illumina Cambridge Ltd Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäuren
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US6911307B1 (en) * 1998-12-08 2005-06-28 Proteus S.A. Method of detection in vitro of a target substance in a sample comprising the labelling of said substance with a reporter gene and with the sequences necessary for the expression of said reporter gene in vitro
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
WO2004018497A2 (en) 2002-08-23 2004-03-04 Solexa Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
US20050069939A1 (en) * 2003-09-26 2005-03-31 Youxiang Wang Amplification of polynucleotides by rolling circle amplification
EP2789383B1 (en) 2004-01-07 2023-05-03 Illumina Cambridge Limited Molecular arrays
WO2006064199A1 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
EP1888743B1 (en) 2005-05-10 2011-08-03 Illumina Cambridge Limited Improved polymerases
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
US7329860B2 (en) 2005-11-23 2008-02-12 Illumina, Inc. Confocal imaging methods and apparatus
GB2457851B (en) 2006-12-14 2011-01-05 Ion Torrent Systems Inc Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
WO2014030066A2 (en) * 2012-08-22 2014-02-27 Bernitz Mats Nilsson Methods for identifying nucleic acid sequences
EP3919617A1 (en) 2013-03-13 2021-12-08 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US10023905B2 (en) * 2013-03-15 2018-07-17 Georgetown University Polymerase driven NESA
GB201320145D0 (en) * 2013-11-14 2014-01-01 Olink Ab Localised RCA-based amplification method using a padlock-probe
GB2520763A (en) * 2013-12-02 2015-06-03 Vanadis Diagnostics Ab Nucleic acid probe and method of detecting genomic fragments
RU2019143806A (ru) * 2017-05-29 2021-06-30 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Способ амплификации транскриптома отдельных клеток
CA3085420A1 (en) * 2017-12-11 2019-06-20 Umc Utrecht Holding B.V. Methods for preparing nucleic acid molecules for sequencing
AU2020275301A1 (en) * 2019-05-13 2022-01-20 Lgc Genomics Llc Capture and analysis of target genomic regions
EP4034675A4 (en) * 2019-09-26 2023-10-04 Jumpcode Genomics, Inc. METHOD AND SYSTEM FOR TARGETED NUCLEIC ACID SEQUENCING

Also Published As

Publication number Publication date
CA3217131A1 (en) 2022-11-03
IL308031A (en) 2023-12-01
JP2024522025A (ja) 2024-06-10
MX2023012627A (es) 2024-01-19
US20240218436A1 (en) 2024-07-04
AU2022264021A1 (en) 2023-11-09
WO2022232425A2 (en) 2022-11-03
WO2022232425A3 (en) 2022-12-01
EP4330430A2 (en) 2024-03-06
KR20240004473A (ko) 2024-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11708607B2 (en) Compositions containing identifier sequences on solid supports for nucleic acid sequence analysis
JP7256748B2 (ja) エラーが訂正された核酸配列決定への適用を伴う標的化核酸配列濃縮のための方法
KR102643955B1 (ko) 근접 보존 전위
EP2619329B1 (en) Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
KR102295723B1 (ko) 서열분석 기술의 표적외 포획 감소
US20110003701A1 (en) System and method for improved processing of nucleic acids for production of sequencable libraries
EP3612641A1 (en) Compositions and methods for library construction and sequence analysis
JP7539770B2 (ja) ゲノム再編成検出のための配列決定方法
JP2017508471A (ja) 次世代シークエンシングにおける稀な遺伝子変異の正確な検出
KR20240069835A (ko) 대규모 병렬 서열분석을 위한 dna 라이브러리를 생성하기 위한 개선된 방법 및 키트
CN117377775A (zh) 用于核酸表征的扩增技术

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40105241

Country of ref document: HK