CN101213310A - 用于产生寡核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用滚环复制来产生寡核苷酸，其中使用切刻盒(nicking cassette)将合成的多聚体寡核苷酸还原成单核苷酸。因此，本发明提供了用于产生寡核苷酸的方法，其使得能够有效扩增以高数量包含在切刻盒内的、长度高达至少1000个核苷酸的寡核苷酸。

Description

用于产生寡核苷酸的方法
发明领域
本发明呈现了用于产生寡核苷酸的改进方法。本发明还涉及在该方法中使用的探针。
发明背景
与基因组测序相组合，自动DNA合成仪已使得研究人员能够以相当低的成本作为寡核苷酸获得几乎任何遗传元件，并且至少对于短的寡核苷酸。两个目前的局限性涉及：I)高质量寡核苷酸的大量产生；和II)非常长的寡核苷酸(200-1000个核苷酸)的合成。关于前一个问题，寡核苷酸的质量可以受与化学合成方法有关的因素影响，包括脱嘌呤以及dG至dA的转换。合成的寡核苷酸的最大长度通常为大约150个核苷酸，而产量和质量随着长度增加而下降。
寡核苷酸目前的主要用途是作为引物用于聚合酶链式反应(PCR)、用于逆转录PCR(rtPCR)、用于测序，和作为底物用于不同的酶促反应。近年来，已出现了需要高质量、长度为70-100个核苷酸的、5′磷酸化的寡核苷酸(例如挂锁探针)的新技术。考虑到关于5′磷酸化(25-35$)和HPLC纯化(25-35$)的额外成本，此类探针的价值完全可能为100-200$。
这些寡核苷酸在某种程度上可以通过已知方法来酶促扩增，例如，克隆、PCR、滚环扩增或环-环扩增(Circle-to-circleamplification，C2CA)。然而，所有这些技术都具有局限性。
克隆
克隆是费时的技术，其中将双链DNA序列插入到质粒中，转化到合适的宿主生物例如细菌或酵母中，培养所述生物，并纯化DNA。这随后为通过限制性核酸内切酶来分离目的DNA片段。该技术是费力的，更适合于产生双链DNA，和同时共扩增许多无用的DNA，并且特别是用于产生较短的DNA区段，无用的(载体)DNA的产生将是占优势的。此外，需要分类用于基因修饰生物的实验室。
PCR
PCR基于通过使用耐热型DNA聚合酶以及与所述DNA片段互补的引物来扩增双链DNA片段。DNA片段的扩增通过交替加热和冷却来进行。这种技术更适合于产生双链DNA且需要关于每种扩增的DNA链的引物。此外，因为形成的产物用作下一轮扩增的模板，所以在该过程中早期错误掺入核苷酸将连同所需产物一起指数扩增。
滚环复制
体外滚环复制通常使用环状单链DNA寡核苷酸作为滚环模板和使用短寡核苷酸作为引物。加入DNA聚合酶和dNTPs开始了聚合。因为滚环模板是无末端的，所以产物将是由与滚环模板互补的串联重复序列组成的长的单链DNA分子。与PCR反应相反，错误掺入的核苷酸将不会进一步被扩增，因为该环状寡核苷酸是用于每轮扩增的模板。
US 2003/0087241描述了“滚环复制”方法，其中滚环产物可以以这样的方式设计，即使得允许其折叠成包含限制性核酸内切酶结合位点的不同发夹结构。因此，可以通过限制性核酸内切酶将滚环产物变成单体。这种技术的局限性包括，它并不扩增环状寡核苷酸，而是复制互补序列，并且它只提供一轮复制。
环-环扩增
环-环扩增(C2CA)是基于滚环DNA合成的连续轮回来扩增单链DNA序列的方法。使用用于连接的外部模板来环化所述DNA序列。在滚环DNA合成后，合成与起始DNA序列互补的长的串联重复序列。通过使寡核苷酸在包含限制性位点的位置上与滚环产物杂交，通过加入限制性核酸内切酶可以将该单链串联重复序列变成单体。在第二次环化，滚环DNA合成，新的寡核苷酸(与第一种互补的)杂交并用限制性核酸内切酶切割后，起始DNA序列的扩增已通过2轮滚环DNA合成而发生(Dahl F等人，Proc Natl Acad Sci USA.101(13)，4548-53(2004))。
这种技术要求另外产生寡核苷酸用于切割滚环产物，并且更加重要的是，它不提供待扩增DNA序列末端的自由设计，因为它们受到用于限制性核酸内切酶的结合/切割位点的存在限制。
总之，需要改进的技术用于产生大量高质量寡核苷酸，以消除与如上所述的现存技术有关的局限性。本文公开的本发明仅代表提供大量磷酸化的高质量寡核苷酸，例如，显示出对于环形成的更佳性能。
发明概述
在本发明的一个方面，本发明提供了用于产生寡核苷酸的方法，其使得能够有效扩增以高数量包含在切刻盒(nicking cassette)内的、长度高达至少1000个核苷酸的寡核苷酸。反应原理应用环-环扩增的交替链(alternating strand)方法，但向待扩增的寡核苷酸序列加入切刻盒。这种切刻盒能够形成包含一个或多个切刻位点(nicking site)的双链结构(发夹)。所述一个或多个切刻位点允许第一种滚环产物被切割成单体。
切刻盒的双链特征允许无需添加额外的寡核苷酸而产生切口，以形成用于切刻酶(nicking enzyme)的适合的双链底物。这种特征还使得能够让通过切刻酶而从滚环产物上释放出的单体环化，而无需添加外部连接模板。因此，该设计消除了环-环扩增技术所固有的对于寡核苷酸切割和连接的需要。随后，在第一轮扩增中产生的单体在环化后经历第二轮扩增。需要时，可以再次使用切刻酶并且重复扩增反应。因此，本发明的这个方面提供了包含在切刻盒内的、任何长度的(至少在10-1000个核苷酸范围内)寡核苷酸的产生，并且其数量在很大程度上受到连接、滚环复制和切刻的连续轮回数目的限制。
更详细地，该方法基于使用核酸探针(探针(A))，其包含待扩增的寡核苷酸的序列和切刻盒。切刻盒是这样的核酸序列，其包含使得切刻盒能够与其自身杂交的互补序列，且进一步包含用于切刻酶的位点。探针(探针(A))通过经由切刻盒的互补区域杂交的自我模板式连接(self-templated ligation)进行环化，或通过一种或多种寡核苷酸的外部模板式连接(externally templated ligation)进行环化。环化后，探针(探针(A))用作用于滚环复制的滚环模板，使用识别所述探针的一部分的引物。将包含多个拷贝的关于探针(A)的互补序列(探针(B))的滚环产物暴露于在该切刻盒内切割的切刻酶。这导致产生多个拷贝的探针(B)。
在产生切口后，通过经由切刻盒的互补区域杂交的自我模板式连接来介导探针(B)的环化。多个拷贝的环化的探针(B)用于滚环复制，使用具有与探针(B)的一部分互补的靶序列的引物。在下列步骤中，使用第二次切刻反应。以这种方式，本发明的方法提供了以高数量包含在切刻盒内的、长度高达至少1000个核苷酸的寡核苷酸的产生。
可以执行连接、滚环复制和切刻的连续轮回，从而进一步扩增探针(A)和探针(B)。应当理解，探针(A)和探针(B)的扩增产物都可以通过本发明的方法获得。
在本发明的第二个方面，本发明提供了用于产生寡核苷酸的方法，其使得能够以高达约1000个核苷酸的长度和高数量来有效扩增寡核苷酸。反应原理应用上文所述的交替链和自我模板式方法，但向切刻盒加入限制性位点。在下文部分中，包含一个或多个切刻位点以及一个或多个限制性位点的切刻盒将根据其用途而交替地称为切刻盒或自杀盒(suicide cassette)。
这种自杀盒能够形成包含一个或多个切刻位点以及一个或多个限制性位点的双链结构(发夹)。所述一个或多个切刻位点允许第一种以及任何后续的滚环产物如上所述切割成单体。
所述一个或多个限制性位点允许在自杀盒从寡核苷酸中释放的同时将滚环产物转化成多个拷贝的待扩增的寡核苷酸。因此，本发明的方法提供了任何长度的(至少在10-1000个核苷酸范围内)、含有可自由设计的5′-末端和3′-末端的寡核苷酸的产生，并且其数量在很大程度上受到连接、滚环复制和切刻的轮回数目的限制。
更详细地，该方法提供了如上所述的从探针(A)到探针(B)以及从探针(B)到探针(A)的交替扩增，另外的特征是任何滚环产物可以用限制性酶消化，以从寡核苷酸中释放自杀盒。
因此，在本发明的一个方面中，本发明涉及通过连接、滚环复制和切刻的连续轮回来扩增包含在切刻盒内的寡核苷酸的方法：
用于扩增一个或多个寡核苷酸的方法，其包括：
a)制备包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒的核酸探针(A)，和
b)使所述探针(A)环化，和
c)提供具有所述探针(A)的一部分中的靶序列的引物，和
d)实施所述探针(A)的滚环复制，和
e)在所述一个或多个切刻盒内对探针(A)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(A)互补的探针(B)，
f)使所述探针(B)环化，和
g)提供具有所述探针(B)的一部分中的靶序列的引物，和
h)实施所述探针(B)的滚环复制，和
i)在所述一个或多个切刻盒内对探针(B)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(B)互补的探针(A)。
本发明还涉及在上述方法中使用的探针。本发明的探针包含切刻盒，其中该切刻盒是包含互补序列的核酸序列，其使得切刻盒能够与其自身杂交并且结合所必需的修饰酶。
在本发明的第二个方面，本发明涉及用于扩增包含在自杀盒内的寡核苷酸，在扩增结束时从自杀盒中释放出寡核苷酸的方法。
该方面还涉及在上述方法中使用的探针。本发明的探针包含自杀盒，其中该自杀盒是包含互补序列的核酸序列，其使得自杀盒能够与其自身杂交，结合所必需的修饰酶，并且在反应结束时被切割出来。
总之，在一个方面中，本发明涉及用于扩增包含在切刻盒内的一个或多个寡核苷酸的方法，所述切刻盒包含用于切刻酶的一个或多个结合和切割位点。在第二个方面中，切刻盒进一步具备一个或多个限制性位点(产生所谓的自杀盒)，其允许在扩增后从所述一个或多个寡核苷酸中释放该盒。
发明详述
定义：
人工核苷酸：在自然界中未发现的核酸，例如但不限于，异-dCTP(iso-dCTP)或异-dGTP(iso-dGTP)，其含或不含修饰，例如但不限于生物素和荧光团，以及包含修饰例如但不限于生物素和荧光团的任何天然核酸。
生物素偶联的寡核苷酸：含例如与其5′-末端结合的生物素分子的寡核苷酸。
闭合环状结构：含无终止的糖-磷酸主链的核酸序列。
外部模板式连接：通过与模板杂交来连接同一或不同寡核苷酸的5′-末端和3′-末端，所述模板不是所述寡核苷酸的一部分。
发夹：在其自身上杂交从而形成单链核酸环和双链核酸区域的单链核酸序列部分。
连接模板：核酸序列，在其上一个寡核苷酸的5′-末端和同一个或另一个寡核苷酸的3′-末端可以进行杂交并且以允许这两个末端进行连接的方式排列。
LNA：锁定核酸。
Mly I：一种IIS型酶，其识别序列5′-GAGTCNNNNN-3′，且在最后一个N后切割双链DNA平末端，产生3′-羟基和5′-磷酸。
N：核苷酸G、C、A、T、I、U中的任何一种以及任何人工核苷酸。
N.Alw I(Nt.Alw I)：一种切刻酶，其识别序列5′-GGATCNNNNN-3′，且在最后2个N之间切刻该识别序列：5′-GGATCNNNN-切口-N。
天然核苷酸：核苷酸G、C、A、T、I、U中的任何一种。
切刻盒：包含环以及一个或多个互补序列的核酸序列，所述互补序列使得切刻盒的一部分能够与其自身的一部分杂交。切刻盒能够结合一种或多种修饰酶，优选切刻酶。如果切刻盒将从其所加入至的核酸序列中去除，那么将它设计为自杀盒。
切刻酶：一种酶，其识别双链核酸序列，并能够切割该双链核酸序列中的一条链且仅切割一条链，产生3′-羟基和5′-磷酸。
核酸序列：包含天然核苷酸，例如但不限于G、C、A、T、I、U，或任何人工核苷酸，例如但不限于异-dCTP、异-dGTP，或其混合物的任何序列。
核酸探针(A)：核酸序列，其包含待通过本发明方法进行扩增的所述一个或多个寡核苷酸的核酸序列以及一个或多个切刻盒的核酸序列。
核酸探针(B)：与核酸序列(A)互补的核酸序列。
核苷酸：任何天然、人工或修饰的核苷酸。
寡核苷酸：单链核酸序列，其长度为10-1000个核苷酸，例如10-800个核苷酸，或例如10-600个核苷酸，或例如10-500个核苷酸，或例如15-400个核苷酸，或例如15-300个核苷酸，或例如20-250个核苷酸，或例如20-200，或例如20-180，或例如20-160，或例如25-140个核苷酸，或例如30-130个核苷酸，或例如40-120个核苷酸，或例如50-110个核苷酸，或例如60-110个核苷酸，或例如70-100个核苷酸。
PNA：肽核酸。
滚环复制：使用环状单链寡核苷酸作为滚环模板和使用短核酸序列作为引物的核酸合成。加入DNA聚合酶和dNTPs开始了聚合。因为滚环模板是无末端的，所以产物将是由与滚环模板互补的串联重复序列组成的长的单核酸链。
滚环模板：聚合酶使用其作为用于滚环复制的模板的闭合环状核酸序列。
自我模板式连接：通过与模板杂交来连接同一或不同寡核苷酸的5′-末端和3′-末端，所述模板是所述寡核苷酸的一部分或所述寡核苷酸之一的一部分。
固体支持物：寡核苷酸可以与其附着或在其上合成的任何固体支持物，例如但不限于，PCR管、显微镜载玻片、ELISA平板、微芯片、塑料CDs(由mic公司生产)或珠。
自杀盒：包含一个或多个互补序列的核酸序列，所述互补序列使得自杀盒的部分能够与其自身的部分杂交。所述互补序列由环隔开。自杀盒能够结合一种或多种修饰酶，优选切刻酶和限制性酶。自杀盒可以通过限制性消化而从其所加入至的核酸序列中去除。自杀盒是进一步包含一个或多个限制性位点的切刻盒。
IIS型酶：识别不对称的核苷酸序列并且在识别位点外的特定位置处切割DNA的酶。
Z：待通过本发明扩增的所述一个或多个寡核苷酸，例如1-10个寡核苷酸，或例如1-5个寡核苷酸，或例如3个寡核苷酸，或例如2个寡核苷酸，或例如1个寡核苷酸。
发明描述
本发明提供了使用单链探针作为扩增反应的模板来扩增一个或多个寡核苷酸的方法。在该方法中使用的本发明探针由待扩增的所述一个或多个寡核苷酸以及一个或多个盒(切刻盒或自杀盒)组成。切刻盒和自杀盒的目的、组分和特征在下文详细描述。本发明探针中所述一个或多个切刻盒或者一个或多个自杀盒的存在使得能够通过本发明的方法扩增出包含至少10-1000个核苷酸的序列的任何寡核苷酸，而对寡核苷酸的核酸序列没有任何要求，例如限制性位点的存在。
因此，切刻盒和自杀盒之间的关系是：i)所有自杀盒也是切刻盒(且可以就这样使用)，因为它们是具有另外特征(设计为使得能够方便地去除它们的元件)的切刻盒。ii)因为切刻盒不被去除，所以它使合成产物具备切刻盒的功能性，即自我模板式连接成闭合环状结构以及使聚合体还原成单体的可能性。自杀特征不会使产物具备这种功能性，但使其具有可自由设计的5′-末端和3′-末端，例如在挂锁探针中需要的。因此，切刻盒服务于扩增目的并且给产物添加自我环化的特征，而自杀元件仅服务于纯化目的。
应当理解，探针(A)、探针(B)、包含在探针(A)内的寡核苷酸和包含在探针(B)内的寡核苷酸的扩增产物可以通过使用本发明来获得。
因此，在本发明的一个方面，本发明涉及通过连接、滚环复制和切刻的连续轮回来扩增包含在切刻盒内的寡核苷酸的方法。该方法包括
用于扩增一个或多个寡核苷酸的方法，其包括：
a)制备包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒的核酸探针(A)，和
b)使所述探针(A)环化，和
c)提供具有所述探针(A)的一部分中的靶序列的引物，和
d)实施所述探针(A)的滚环复制，和
e)在所述一个或多个切刻盒内对探针(A)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(A)互补的探针(B)，
f)使所述探针(B)环化，和
g)提供具有所述探针(B)的一部分中的靶序列的引物，和
h)实施所述探针(B)的滚环复制，和
i)在所述一个或多个切刻盒内对探针(B)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(B)互补的探针(A)。
为了增加产物的量，步骤b-i可以根据需要重复多次。
如果每轮例如扩增300x，那么2轮等于3002x扩增，3轮等于3003x扩增，和4轮等于3004x扩增。因此，4轮后，1ng探针(A)可以变成约8克探针(A)，足够用于数百万次单独的应用反应。明显地，寡核苷酸的较大产生在较后的循环中发生，因此对于大规模产生，反应循环超过一次。
在一个实施方案中，根据本发明的方法涉及其中步骤b)-i)执行一次或多次的方法，例如1-100次，或例如1-50次，或例如1-25次，或例如1-10次，或例如1-5次，或例如1-4次，或例如1-3次，或例如1-2次。在另一实施方案中，根据本发明的方法涉及其中步骤b)-i)执行一次或多次的方法，例如1次，或例如2次，或例如3次，或例如4次，或例如5次，或例如6次，或例如7次，或例如8次，或例如9次，或例如10次。
在第二个实施方案中，根据本发明的方法涉及其中探针(A)在步骤i)后获得的方法。
在第三个实施方案中，根据本发明的方法涉及其中探针(B)在步骤e)后获得的方法。
本发明的核酸探针包含待通过本发明方法扩增的所述一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒，其中所述切刻盒是包含一个或多个使得切刻盒的部分能够与其自身的部分杂交的互补序列的核酸序列。这使得本发明的探针能够通过自我模板式连接来进行环化。切刻盒进一步能够结合一种或多种修饰酶，优选切刻酶。这允许切刻盒和包含在其内的寡核苷酸通过连接、滚环复制和切刻的连续轮回进行扩增。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒是包含一个或多个互补序列以及一个或多个切刻位点的核酸序列。
切刻盒的目的和特征在下文详细描述。
切刻盒
本发明的切刻盒是核酸序列。切刻盒可以包含天然核苷酸例如但不限于G、C、A、T、I、U，或任何人工核苷酸例如但不限于异-dCTP、异-dGTP，或其混合物的任何序列。本发明的切刻盒具有20-200个核苷酸的线性长度。因此，在一个方面，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒的长度为20-200个核苷酸，例如20-150个核苷酸，或例如20-100个核苷酸，或例如20-80个核苷酸，或例如20-60个核苷酸，或例如20-40个核苷酸，或例如20-30个核苷酸的方法。
切刻盒的目的是使得能够通过应用基于滚环复制原理的本发明方法来扩增寡核苷酸。在滚环复制起始前，最方便地在探针(A)的初始合成过程中，将切刻盒加入至待扩增的寡核苷酸序列中。因此，在滚环复制步骤期间切刻盒附着至待扩增的寡核苷酸序列。
切刻盒具有几个特征：1)该盒包含一个或多个互补序列，使得该盒能够与其自身杂交，2)该盒包含用于切刻酶的一个或多个位点，和3)该盒包含环结构(图2)。
切刻盒的不同特征在下文描述：
切刻盒的环结构
切刻盒的环结构旨在连接两个互补序列的末端。该环包含3-100个核苷酸，或例如3-80个核苷酸，或例如3-60个核苷酸，或例如3-40个核苷酸，或例如3-20个核苷酸，或例如3-10个核苷酸，或例如3-9个核苷酸，或例如3-8个核苷酸，或例如3-7个核苷酸，或例如3-6个核苷酸，或例如3-5个核苷酸。优选地，该环序列的长度为3-7个核苷酸(图2)，例如3个核苷酸，或例如4个核苷酸，或例如5个核苷酸，或例如6个核苷酸，或例如7个核苷酸。环结构的例子包括但不限于：对于(+)-链的5′-AATAA-3′和对于(-)-链的5′-TTATT-3′，对于(+)-链的5′-GAA-3′和对于(-)-链的5′-TTC-3′，对于(+)-链的5′-GAAA-3’和对于(-)-链的5′-TTTC-3′，或对于(+)-链的5′-AAAA-3′和对于(-)-链的5′-TTTT-3′。(+)-链是探针(A)的环序列，而(-)-链是探针(B)的环序列。环结构可以选自但不限于AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT，对于(+)-链。因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含选自AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT的环结构的方法。这意味着，探针(A)中的切刻盒的序列选自但不限于AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT。如果在环结构中需要强的发夹，那么推荐在环中具有5′-GAAA-3′或5′-GAA-3′，因为这两个序列已知显著增加发夹的解链温度(Hirao I等人，NucleicAcids Res.17(6)，2223-31(1989)和Hirao I等人，Nucleic AcidsRes.22(4)，576-82(1994))。
切刻盒的互补序列
切刻盒的互补序列位于在切刻盒序列中的环序列的每一侧(图2)。所述互补序列包含10-100个核苷酸，例如10-80个核苷酸，例如10-60个核苷酸，例如10-30个核苷酸，或例如10-40个核苷酸。优选地，所述互补序列的长度为10-20个核苷酸，例如10-20个核苷酸，例如12-20个核苷酸，例如14-20个核苷酸，或例如15-20个核苷酸。互补序列的例子是但不限于：
5′-XXGCTGAGGXX-3′和5′-YYCCTCAGCYY-3′，和
5′-XXCCTCAGCXX-3′和5′-YYGCTGAGGYY-3′，和
5′-XXXXXXXGATCCXX-3′和5′-YYGGATCYYYYYYY-3′，和
5′-XXGAATGCXX-3′和5′-YYGCATTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在一个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列的方法：
5′-XXGCTGAGGXX-3′和5′-YYCCTCAGCYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在第二个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列的方法：
5′-XXCCTCAGCXX-3′和5′-YYGCTGAGGYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在第三个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列的方法：
5′-XXXXXXXGATCCXX-3′和5′-YYGGATCYYYYYYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在第四个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列的方法：
5′-XXGAATGCXX-3′和5′-YYGCATTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
切刻盒的互补序列的目的是形成用于切刻酶的结合位点。此外，互补序列使得探针(A)或(B)能够通过切刻盒中的互补序列的自我模板式杂交(self-templated hybridisation)而环化。
优选地，切刻盒的部分将在初始合成过程中加到待扩增的寡核苷酸序列的每个末端。优选地，能够提供自我模板式杂交的最少5个核苷酸位于所述寡核苷酸的每个末端处。备选地，切刻盒位于探针(A)的中央。在这种情况下，环化可以通过一个或多个寡核苷酸的外部模板式连接来进行。
在切刻盒中用于切刻酶的结合位点
切刻盒包含用于一种或多种切刻酶的识别位点。
如定义中概述的，切刻酶识别双链核酸序列，并切割该双链核酸序列中的一条链且仅切割一条链，产生3′-羟基和5′-磷酸。在本发明方法的步骤e)和步骤i)中使用切刻酶。在步骤e)中，将第一个扩增轮回的滚环产物暴露于切刻酶，该滚环产物包含多个拷贝的探针(A)的互补序列(探针(B))。扩增产物包含连续拷贝的探针(B)的多聚体。每个切刻盒序列形成发夹，因为切刻盒中的互补序列互相杂交。切刻酶识别在切刻盒的双链发夹区域中的切刻位点，并切割所述双链序列中的一条链。因此，切刻酶对于扩增产物的切割导致产生多个拷贝的探针(B)。由此，切刻酶制备了第一个扩增轮回的滚环产物，以用于第二轮连接、滚环复制和切刻。此外，在本发明方法的步骤i)中使用切刻酶。在步骤i)中，将第二个扩增轮回的滚环产物暴露于切刻酶，该滚环产物包含多个拷贝的探针(B)的互补序列(探针(A))。切刻酶对于第二个扩增轮回的扩增产物的切割导致产生多个拷贝的探针(A)。由此，切刻酶制备了第二个扩增轮回的滚环产物，以用于滚环复制的另外轮回(本发明方法的步骤b)至步骤i))。
在切刻盒的互补序列中用于切刻酶的结合位点的任一侧上可以包括额外的碱基对，以增加切刻酶的切割效率(图2)。优选地，在任一侧上插入2个碱基对，备选地在一侧或两侧上插入0-50个碱基对，例如在一侧或两侧上插入0-40个碱基对，或例如在一侧或两侧上插入0-30个碱基对，或例如在一侧或两侧上插入0-20个碱基对，或例如在一侧或两侧上插入0-10个碱基对，或例如在一侧或两侧上插入0-8个碱基对，或例如在一侧或两侧上插入0-6个碱基对，或例如在一侧或两侧上插入0-4个碱基对。
一般而言，可以自由选择所述额外的碱基对，只要它们不等同于已使用的酶结合位点，或形成另外的用于所使用的酶的结合位点。
现在，在市场上可获得的切刻酶的数目有限，因而只能设计少数切刻盒。将来，将极有可能开发出具有更高的切割效率和更窄的识别位点的切刻酶。这将允许切刻盒的新设计，可能限制切刻盒的大小和/或增加扩增效率。
切刻盒的详细结构可以改变，因为用于切刻酶的结合位点的位置、额外核苷酸的数目以及环的核苷酸组成都可以对于扩增反应中的最佳性能进行调整。用于切刻酶的结合位点的序列还取决于所使用的具体酶。
作为使用用于自我模板式连接的切刻盒的另一种选择，在步骤b)中探针(A)的环化可以通过一个或多个寡核苷酸的外部模板式连接来获得。
切刻盒的核酸序列的例子包括但不限于：
5′-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCTGAGGXX-3′(图2A)，
5′-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCXX-3′(图2B)，
5′-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXXXXGATCCXX-3′(图2C)，和
5′-YYGAATGCYYAATAAXXGCATTCXX-3′(图2D)，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在一个方面，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含选自下列的核酸序列的方法：
5′-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCTGAGGXX-3′，
5′-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCXX-3′，
5′-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXXXXGATCCXX-3′，和
5′-YYGAATGCYYAATAAXXGCATTCXX-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在下文中详细描述在本发明方法中的不同步骤：
待通过本发明方法扩增的所述一个或多个寡核苷酸可以包含至少10-1000个核苷酸的序列。因此，在一个方面，本发明涉及这样的方法，其中所述一个或多个寡核苷酸包含10-1000个核苷酸的序列，例如10-800个核苷酸，或例如10-600个核苷酸，或例如10-500个核苷酸，或例如15-400个核苷酸，或例如15-300个核苷酸，或例如20-250个核苷酸，或例如20-200个核苷酸，或例如20-180个核苷酸，或例如20-160个核苷酸，或例如25-140个核苷酸，或例如30-130个核苷酸，或例如40-120个核苷酸，或例如50-110个核苷酸，或例如60-110个核苷酸，或例如70-100个核苷酸。
在一个优选实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个寡核苷酸是DNA寡核苷酸的方法。
寡核苷酸可以包含由任何天然脱氧核糖核苷酸G、C、A、T，以及任何人工核苷酸异-dCTP、异-dGTP，或包含修饰的任何天然或人工核苷酸组成的任何核酸序列。优选地，本发明涉及其中所述一个或多个寡核苷酸是DNA序列的方法。
在人工碱基对例如异-dCTP、异-dGTP或两者被包含在待扩增的寡核苷酸中或在切刻盒中的情况下，遗传字母扩展至包含三种碱基配对组分：G-C、A-T和例如异G-异C(isoG-isoC)。
探针(A)的制备(步骤a)
包含待扩增的一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒的起始核酸序列(探针(A))可以通过标准化学方法来合成，例如β-氰乙基亚磷酰胺化学。5′-磷酸可以在这个合成过程中加入，或备选地5′-磷酸可以通过例如使用T4多核苷酸激酶而酶促偶联至所述核酸序列的5′-末端。
长序列可以通过多个寡核苷酸的外部模板式连接来构建，例如当待扩增的寡核苷酸非常长，例如200-1000个核苷酸时。在这种情况下，探针(A)可以通过两个或更多个寡核苷酸的外部模板式连接来制备(图5)。在一个实施方案中，本发明涉及其中探针(A)通过连接一个或多个核酸序列来制备的方法，所述一个或多个核酸序列包含所述一个或多个寡核苷酸的一个或多个部分以及所述一个或多个切刻盒。
优选地，探针(A)将在该探针的每个末端中包含切刻盒的一部分。备选地，切刻盒位于所述寡核苷酸的中央。如果探针(A)通过几个合成序列的外部模板式连接来制备，那么切刻盒的一部分可以位于一个序列的3′-末端并且另一部分可以位于另一个序列的邻近5′-末端。备选地，该盒可以位于一个或多个所述合成序列的中央。起始核酸序列(探针(A))还可以包含在设计上可以是相同或不同的多于一个的切刻盒，即核酸组合物。
在一个方面，本发明涉及其中探针(A)包含选自下列的核酸序列的方法：
5′-P-GAGGXX-Z-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCT-3′，
5′-P-CAGCXX-Z-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCT-3′，
5′-P-XXGATCCXX-Z-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXX-3′，和
5′-P-TTCYY-Z-XXGAATGCYYAATAAXXGCA-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
探针(A)的环化(步骤b)
探针(A)的环化可以通过自我模板式连接或通过外部模板式连接或二者的组合来进行。在探针(A)在探针(A)的每个末端中包含切刻盒的一部分的情况下，连接可以通过自我模板式连接来进行(图5A)。如图5A中所示，通过元件1A-1B和元件2A-2B之间的杂交，核酸探针通过自我模板式杂交折叠成开放的环。如果切刻盒位于寡核苷酸的中央，那么连接可以通过一个或多个寡核苷酸的外部模板式连接来进行(图5B)。对于长的寡核苷酸，探针(A)可以例如通过连接多于一个的核酸序列来构建，例如通过自我模板式杂交和外部模板式杂交的组合(图5C)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中核酸探针(A)的闭合环状结构通过自我模板式连接来获得的方法。如上所述，探针(A)的环化可以通过如此来获得，即经由在探针(A)内的所述一个或多个切刻盒的互补区域的杂交来进行探针(A)的自我模板式杂交，以使得能够连接探针(A)的末端。
闭合环状结构可以通过应用适当的缓冲条件以及合适的能量来源(ATP或NAD+)和连接酶，经过对于外部模板式连接和自我模板式连接的标准酶促连接来制备。优选使用T4 DNA连接酶。ATP以0.001-10mM，优选0.1-1mM的浓度提供，T4 DNA连接酶以0.00025-0.1韦氏(Weiss)单位/μl，优选0.0025-0.05U/μl的终浓度提供。备选地，可以使用其他连接酶例如Tsc连接酶、Tth连接酶、Amp连接酶和Taq连接酶。还可以使用化学连接。包含一个或多个切刻盒的圆环通常将包含50-1000个核苷酸，优选50-500个核苷酸。
引物结构
对于标准DNA聚合酶，需要引物以开始滚环复制反应。一般地，引物由5-50个核苷酸组成，且优选地由7-15个核苷酸组成。引物必须与所述核酸探针的一部分互补，优选的与切刻盒外的一部分互补，备选地与切刻盒内的一部分互补。
优选地，所述引物与所述探针100％互补，备选地在所述引物5′-末端处的核苷酸与所述探针不互补，例如1个核苷酸、3个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、25个核苷酸或50个核苷酸。如果使用包含3′至5′核酸外切酶活性的聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶)，那么在所述引物3′-末端处可以存在非互补核苷酸，例如1个核苷酸、例如3个核苷酸、例如5个核苷酸、例如10个核苷酸、例如25个核苷酸或例如50个核苷酸。此外，所述引物中可以存在错配的核苷酸，例如1个核苷酸、例如3个核苷酸、例如5个核苷酸、例如10个核苷酸或例如25个核苷酸。
所述引物可以通过标准化学方法来合成(例如β-氰乙基亚磷酰胺化学)。引物还可以包含修饰，例如但不限于，链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素、32P和荧光团，或者它可以包含人工核苷酸，例如但不限于LNA、PNA、异-dCTP和异-dGTP。
为了圆环和引物之间的正确退火，混合的圆环和引物之间的摩尔比为0.1-100，优选0.8-1.2。
应当理解，本发明的方法还可以使用不需要引物的聚合酶。在这种情况下不需要引物来开始滚环复制。
对于生产目的，所述程序的改善可以通过下列方式来获得：使在本发明方法的步骤c和/或步骤g中的一种或多种反应物例如引物锚定至固体支持物，从而使滚环产物附着至表面。这将使得更容易改变缓冲条件，并改善不同步骤之间的洗涤，从而最小化背景。在一个例子中，引物可以在5′末端与固体支持物偶联——5′-生物素标记的引物可以例如偶联至经链霉抗生物素蛋白包被的固体支持物，包括但不限于PCR管、ELISA平板、珠、塑料CDs(由mic公司生产)和显微镜载玻片。引物与固体支持物偶联的引入允许在每轮滚环复制后的严格洗涤以去除滚环模板，从而只留下偶联的滚环产物。这将最小化在第二轮滚环复制中“错误”链的产生。微流体溶液提供一组平台，在其中可以锚定反应物并且可以在一次设计中改变所有条件。除了反应物(例如，引物、聚合酶)的物理锚定之外，微流体系统还提供将反应物永久或暂时地限制于指定区室的手段，而不将它们附着至支持物，即非物理锚定。引物、核酸圆环、聚合酶或核酸内切酶因此可以附着至固体支持物或以其他方式在空间上受到限制，而不会严重损害扩增反应的总效率。在圆环的情况下，所述圆环可以锁定在载体上的结构周围，从而允许圆环滚动但抑制圆环从表面上散开。
因此，在一个方面，本发明涉及其中在步骤c中的引物固定在固体支持物上的方法。
在另一方面，本发明涉及其中在步骤g中的引物固定在固体支持物上的方法。
在第三个方面，本发明涉及其中核酸圆环附着至固体支持物或以其他方式在空间上受到限制的方法。
在第四个方面，本发明涉及其中聚合酶附着至固体支持物或以其他方式在空间上受到限制的方法。
在第五个方面，本发明涉及其中核酸内切酶固定在固体支持物上或以其他方式在空间上受到限制的方法。
第一次滚环复制
当将聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)在适当的缓冲条件下和与引物(引物1)杂交的探针相组合时，可以发生滚环复制。聚合酶将使聚合从引物的3′-末端开始，使用环状探针作为滚环模板。因为环状探针是无末端的，所以滚环产物将包含与所述环状探针的序列互补的多聚体。优选地，聚合酶是Phi29DNA聚合酶。使用0.001-2单位的phi29聚合酶(Fermentas)的终浓度，优选使用0.05-1单位。使用0.005-10mM，优选0.1-1mM的最终dNTP浓度。备选地，可以使用其他聚合酶，例如T7DNA聚合酶、Sequenase Version 2.0T7DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶。在对于所选聚合酶的最佳温度上，孵育时间应当为10分钟-24小时，优选30分钟-5小时。对于某些聚合酶，单链结合蛋白(SSB)的添加强烈增加了滚环活性。因为Phi29DNA聚合酶不被SSB增强，所以优选使用0μg/μl SSB的浓度。备选地，可以使用0.001-0.2μg/μl的浓度。
滚环产物的长度优选为500-500,000个核苷酸。延伸的速度和持续时间可以通过改变dNTP、聚合酶、圆环、引物和SSB的浓度来控制。此外，温度和缓冲条件是可调整的。
对滚环产物进行切刻
包含多个拷贝的对于探针(A)的互补序列(称为探针(B))的滚环产物将折叠成不同的发夹，每个发夹由切刻盒组成。为了将多聚体变成单体而不损失核苷酸，使用切刻酶来切割多聚体。切刻酶的结合位点位于切刻盒内。优选的切刻酶是N.Alw I(Nt.Alw I)、N.BbvCIA(Nb.BbvC I)、N.BbvC IB(Nt.BbvC I)、Nt.BstNB I、Nb.Bpu10I和Nb.Bsm I。因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中切刻酶选自N.Alw I(Nt.Alw I)、N.BbvC IA(Nb.BbvC I)、N.BbvC IB(Nt.BbvCI)和Nb.Bsm I的方法。优选地，N.Alw I(Nt.Alw I)在本发明的方法中。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及其中切刻酶是N.AlwI(Nt.Alw I)的方法。优选地，调整缓冲混合物以供给不需纯化步骤的切刻条件，备选地，滚环产物通过已知方法(例如凝胶纯化或乙醇沉淀)来纯化，并且提供对于该切刻酶的最佳缓冲条件。优选地，使用0.3-1U/μl切刻酶，备选地使用0.05-3U/μl。孵育时间可以为30分钟-3天，优选3-20小时。
具有切口的滚环产物的纯化
具有切口的产物可以在切刻反应后通过标准纯化方法例如通过凝胶纯化、乙醇沉淀或HPLC纯化来获得。
第二次连接
为了将具有切口的产物变成闭合环状结构，可以执行通过加热和冷却的变性-复性步骤，这将促进单体(多个拷贝的探针(B))通过在切刻盒区域中的自我模板式杂交而折叠成开放环状结构(图1)。因此，探针(B)的环化可以通过探针(B)的分子内杂交来获得，这经由所述一个或多个切刻盒的互补区域的杂交，使得能够连接探针(B)的末端。因此，本发明的一个实施方案涉及其中探针(B)的环化通过自我模板式连接来获得的方法。
探针(B)的闭合环状结构可以通过标准酶促连接来产生。优选地，调整缓冲条件以改善连接而无需纯化步骤，备选地具有切口的产物在连接前通过已知方法(例如凝胶纯化或乙醇沉淀)来纯化。
第二次滚环复制
第二次滚环复制以类似于第一次滚环复制的方式来进行。优选地，引物(引物2)与在第一轮滚环复制中使用的引物互补，备选地，它与除引物1外的探针序列的另一部分杂交。
对第二轮的滚环产物进行切刻
这个反应步骤类似于对第一轮的滚环产物进行切刻。与第一轮切刻的不同之处在于，它现在是具有切口的探针(A)的串联重复序列而不是探针(B)的串联重复序列。
在用切刻酶进行切刻后，产物可以例如通过凝胶纯化、乙醇沉淀或HPLC纯化进行纯化。备选地，切刻产物通过如上所述的连接、滚环复制和切刻的连续轮回来进一步扩增。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中探针(A)通过连接、滚环复制和切刻的连续轮回来扩增的方法。
在另一实施方案中，本发明涉及其中探针(B)通过如上所述的连接、滚环复制和切刻的连续轮回来扩增的方法。
本发明的探针
本发明还涉及包含一个或多个切刻盒的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒是包含一个或多个互补序列以及一个或多个切刻位点的核酸序列。互补序列和切刻位点的细节如上所述。
此外，本发明的探针包含一个或多个寡核苷酸用于通过本发明方法进行扩增。因此，本发明涉及包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒是包含一个或多个互补序列以及一个或多个切刻位点的核酸序列。如上所述，用于通过本发明方法进行扩增的所述一个或多个寡核苷酸包含至少10-1000个核苷酸的序列。因此在一个方面，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个寡核苷酸包含10-1000个核苷酸的序列。
如所提及的，关于包含在本发明探针中的切刻盒的互补序列和切刻位点的细节如在本发明方法下所述的。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒具有20-200个核苷酸的长度。
在第二个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含选自AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT的环结构。
在第三个方面，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGCTGAGGXX-3′和5′-YYCCTCAGCYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另一实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXCCTCAGCXX-3′和5′-YYGCTGAGGYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另外一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXXXXXXGATCCXX-3′和5′-YYGGATCYYYYYYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在一个进一步的实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGAATGCYXX-3′和5′-YYGCATTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另外一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含选自下列的核酸序列：
5′-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCTGAGGXX-3′，
5′-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCXX-3′，
5′-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXXXXGATCCXX-3′，和
5′-YYGAATGCYYAATAAXXGCATTCXX-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另一方面，本发明涉及核酸探针，其中所述探针包含选自下列的核酸序列：
5′-P-GAGGXX-Z-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCT-3′，
5′-P-CAGCXX-Z-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCT-3′，
5′-P-XXGATCCXX-Z-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXX-3′，和
5′-P-TTCXX-Z-YYGAATGCYYAATAAXXGCA-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
为了生产目的，可能并不希望获得全部具有切口的产物，而留下一批用于进一步的扩增轮回。
本发明的核酸探针可以在用于不同目的的滚环复制中使用，例如作为探针用于原位检测核酸分子(体外诊断方法)。
在这种情况下，探针可以用于通过滚环复制来检测单个核酸分子。下文提及的探针可以用于体外诊断和用在诊断试剂盒中。
当在靶核酸分子上的连接效率很低时(例如在包含由于降解、制备或固定而产生的修饰的RNA靶或DNA靶上，例如，向核酸碱基添加单羟甲基(-CH2OH)，导致通过亚甲基桥接而产生腺嘌呤基团的二聚化)，使用可以通过自我模板式连接而变成闭合环状结构的探针可能是优选的。回复此类碱基修饰的操作程序已公开(Masuda N.等人，Nucleic Acids Res.15；27(22)4436-43(1999))，但它们只减少损害，因为所有修饰的完全去除是不可能的。所述探针的另一个优点是自我包含的连接模板是一段裸露的DNA，其与使用例如染色质DNA的外部模板式连接相比较，应当导致更高的连接效率。因此，在一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其进一步包含含有核酸残基序列的部分，所述核酸残基序列与靶核酸序列至少75％互补，例如75-100％互补，或例如80-100％互补，或例如85-100％互补，90-100％互补，或例如95-100％互补，或例如100％互补。这个部分可以例如是包含在切刻盒内的寡核苷酸的一部分。
由靶所引发的滚环反应从靶核酸分子的天然3′末端被引发。通过由靶所引发的滚环复制来检测核酸分子具有这样的优点，即由于靶所引发的反应而具有强的信号扩增和局部化的信号(WO 97/20948和Larsson C.等人，Nature Methods 1，227-32(2004))。因为这需要在RNA中在其中探针所杂交的区域处或附近存在3′-末端，所以靶RNA优选可以是非多腺苷酸化的RNA，例如但不限于，来自EB病毒的EBER1和EBER2、腺病毒编码的小RNA’s VA1和VA2、核糖体RNA’s、端粒酶复合物(hTERC)的RNA部分、小干扰RNA’s(siRNA’s)和微小RNA’s(miRNA’s)。
关于RNA靶，本发明的一个优选实施方案涉及包含一部分核酸残基的环状核酸探针，其中所述一部分包含核酸残基序列，所述核酸残基序列与靶RNA序列至少75％互补，例如75-100％互补，或例如80-100％互补，或例如85-100％互补，90-100％互补，或例如95-100％互补，或例如100％互补。这个部分可以例如是包含在切刻盒内的寡核苷酸的一部分。
包含与靶核酸序列互补的核酸序列的探针部分可以具有6-100的线性长度。因此，在一个实施方案中，本发明涉及环状核酸探针，其中该部分的长度为6-100个核苷酸，例如20-100个核苷酸，或例如20-80个核苷酸，或例如20-60个核苷酸，或例如20-40个核苷酸，或例如20-30个核苷酸。
为了标示探针或者区分不同的探针(如果反应中存在超过一种探针)，那么需要限定特定探针的元件——标示物(identifier)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及环状核酸探针，其进一步包含一个或多个限定特定探针的元件。
可以使用不同方法来标示特定探针，并且所述标示物元件将取决于所选择的方法而不同。
如果通过经标记的寡核苷酸与标示物元件杂交来获得检测，那么标示物需要具有一定长度，以对于靶序列来说特异，并允许在反应条件下杂交。理论上，标示物可以匹配探针的总长度，但在大多数情况下较短的标示物元件将是优选的。较短的标示物将具有较快的杂交动力学，且将使得探针能够包含超过一种的标示物。因此，在一个实施方案中，本发明涉及限定特定探针的元件，其是6-200个核苷酸的核苷酸序列，例如6-150个核苷酸，或例如6-150个核苷酸，或例如6-100个核苷酸，或例如6-80个核苷酸，或例如6-60个核苷酸，或例如6-50个核苷酸，或例如10-40个核苷酸，或例如10-30个核苷酸，或例如15-30个核苷酸。
然而，因为所述探针在滚环复制反应中用作滚环模板，所以检测还可以通过合成来获得。此类通过合成的检测可以以类似于已建立的线性PRINS反应的方式来进行。尽管经标记的(例如荧光团)A、T、G、C或U的掺入是显而易见的方法，但它将引起背景染色，因为这些核苷酸不仅可以掺入滚环复制产物中，而且还可以掺入样品中的其他地方。因此，可能优选的是，在复制时将一种或多种人工核苷酸例如isoC或isoG掺入探针序列中，并提供互补核苷酸作为经标记的核苷酸(例如荧光团)。因为此类人工核苷酸在自然界中未发现，所以异-dCTP和异-dGTP不会掺入样品中的其他地方，从而最小化了背景反应。这个方面使得利用偶联有荧光团的异-dCTP核苷酸或异-dGTP核苷酸是优选的。如果检测通过合成来获得，那么限定特定探针的标示物元件因此优选地可以是一种或多种人工核苷酸。因此，在另一实施方案中，本发明涉及限定特定探针的元件，其由一个或多个人工核苷酸组成，例如1-20个人工核苷酸，或例如1-10个人工核苷酸，或例如1-5个人工核苷酸，或例如4个人工核苷酸，或例如3个人工核苷酸，或例如2个人工核苷酸，或例如1个人工核苷酸。
探针的总长度可以依上文定义的每种元件的具体长度而变。还可以是有利的是，使用尽可能短的探针(无需明显地对杂交事件和滚环效率进行折衷)，因为圆环越短，每单位长度的合成的DNA中标示物元件将拷贝越多次，从而增加反应结束时的检测信号。因此，在一个实施方案中，本发明涉及环状核酸探针，其中探针总长度为30-200个核苷酸，例如30-150个核苷酸，或例如50-150个核苷酸，或例如70-150个核苷酸，或例如90-150个核苷酸，或例如70-130个核苷酸，或例如70-110个核苷酸。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含下列序列(SEQ ID NO：1)的探针：
5′-P-GTCGATCCCCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAAAACATGCGGACCACC-AGCTGGTACTTGACCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3′，
其中P是5′-磷酸。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及包含下列序列(SEQ ID NO：2)的探针：
5′-P-GTCGATCCCCTCAATGCACATGTTTGGCTCCAAAAATAGCGGACAAGCCGAATA-CCCTTCTCCCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3′，
其中P是5′-磷酸。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及包含下列序列(SEQ ID NO：3)的探针：
5′-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAAAACATGCGGACCACCAGC-TGGTACTTGACCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3′，
其中P是5′-磷酸。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及包含下列序列(SEQ ID NO：4)的探针：
5′-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACAAAAATAGCGGACAAGCC-GAATACCCTTCTCCCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3′，
其中P是5′-磷酸。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及包含下列序列(SEQ ID NO：5)的探针：
5′-P-GTCGATCCCCTCAATGCTGCTGCTGTACTACGCATGTGTGAGCCGAGTCC-TGGGTGCACGTCCCACAGCTCGGATCGACTCGGAATAACCGA-3′，
其中P是5′-磷酸。
因此，在一个实施方案中，该方法涉及用于滚环复制的核酸探针。
上文提及的探针可以使用切刻盒进行扩增。因为通过本发明方法扩增的探针的连接效率优于化学合成的寡核苷酸，所以本发明的探针适合于此类探针的产生。
优选地，根据本发明的核酸探针希望用于本发明的方法。
在本发明的第二个方面，本发明涉及用于扩增包含在含有自杀盒的探针内的寡核苷酸并进一步在扩增结束时将其从自杀盒中释放的方法。如上文提及的，自杀盒是进一步包含一个或多个限制性位点的切刻盒。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中切刻盒进一步包含一个或多个限制性位点的方法。应当理解，所有自杀盒可以通过使用上文所述方法而用作切刻盒。
使用自杀盒的方法包括：
用于扩增一个或多个寡核苷酸的方法，其包括：
a)制备包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒的核酸探针(A)，和
b)使所述探针(A)环化，和
c)提供具有所述探针(A)的一部分中的靶序列的引物，和
d)实施所述探针(A)的滚环复制，和
e)在所述一个或多个切刻盒内对探针(A)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(A)互补的探针(B)，
f)使所述探针(B)环化，和
g)提供具有所述探针(B)的一部分中的靶序列的引物，和
h)实施所述探针(B)的滚环复制，和
i)在所述一个或多个切刻盒内对探针(B)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(B)互补的探针(A)。
为了增加产物的量，步骤b-i可以根据需要重复多次。
如果每轮例如扩增300x，那么2轮等于3002x扩增，3轮等于3003x扩增，和4轮等于3004x扩增。因此，4轮后，1ng探针(A)可以变成约7克探针(A)，足够用于数百万次单独的应用反应。明显地，寡核苷酸的较大产生在较后的循环中发生，因此对于大规模产生，反应循环超过一次。
在一个实施方案中，根据本发明的方法涉及其中步骤b-i执行一次或多次的方法，例如1-100次，或例如1-50次，或例如1-25次，或例如1-10次，或例如1-5次，或例如1-4次，或例如1-3次，或例如1-2次。在另一实施方案中，根据本发明的方法涉及其中步骤b-i执行一次或多次的方法，例如1次，或例如2次，或例如3次，或例如4次，或例如5次，或例如6次，或例如7次，或例如8次，或例如9次，或例如10次。
本发明的核酸探针包含待通过本发明方法扩增的所述一个或多个寡核苷酸以及一个或多个自杀盒，其中所述自杀盒是包含一个或多个使得自杀盒的部分能够与其自身的部分杂交的互补序列的核酸序列。这使得本发明的探针能够通过自我模板式连接来进行环化。自杀盒进一步能够结合两种或更多种修饰酶，优选切刻酶和限制性酶。这允许自杀盒在反应结束时从探针中去除，从而释放出所述一种或多种经扩增的寡核苷酸。因此，本发明的方法提供了任何长度的(至少10-1000个核苷酸)、含有可自由设计的5′-末端和3′-末端的寡核苷酸的产生，并且其数量在很大程度上受到连接、滚环复制和切刻的轮回数目的限制。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含一个或多个自杀盒的核酸探针，其中所述一个或多个自杀盒是包含一个或多个互补序列、一个或多个切刻位点以及一个或多个限制性位点的核酸序列。
自杀盒的目的和特征在下文详细描述。
自杀盒
本发明的自杀盒是核酸序列。自杀盒可以包含天然核苷酸例如但不限于G、C、A、T、I、U，或任何人工核苷酸例如但不限于异-dCTP、异-dGTP，或其混合物的任何序列。
本发明的自杀盒具有20-200个核苷酸的单链长度。因此，在一个方面，本发明涉及其中所述一个或多个自杀盒的长度为20-200个核苷酸，例如20-150个核苷酸，或例如20-100个核苷酸，或例如20-80个核苷酸，或例如20-60个核苷酸，或例如20-40个核苷酸，或例如20-30个核苷酸的方法。
自杀盒的目的是使得能够通过应用基于滚环复制原理的本发明方法来扩增寡核苷酸。在滚环复制起始前，最方便地在探针(A)的初始合成过程中，将自杀盒加入至待扩增的寡核苷酸序列中。在反应结束时，自杀盒通过用限制性酶切割滚环产物而从扩增的寡核苷酸中释放。因此，在滚环复制步骤期间自杀盒附着至待扩增的寡核苷酸序列。在扩增反应结束时，自杀盒从寡核苷酸序列中去除。
自杀盒具有几个特征：1)该盒包含一个或多个互补序列，使得该盒能够与其自身杂交，2)该盒包含用于切刻酶的一个或多个位点，3)该盒包含用于限制性酶的一个或多个限制性位点，和4)该盒包含环结构(图3)。
自杀盒的不同特征在下文描述：
自杀盒的环结构
自杀盒的环结构旨在连接两个互补序列的末端。该环包含3-100个核苷酸，或例如3-80个核苷酸，或例如3-60个核苷酸，或例如3-40个核苷酸，或例如3-20个核苷酸，或例如3-10个核苷酸，或例如3-9个核苷酸，或例如3-8个核苷酸，或例如3-7个核苷酸，或例如3-6个核苷酸，或例如3-5个核苷酸。优选地，该环序列的长度为3-7个核苷酸(图3)，例如3个核苷酸，或例如4个核苷酸，或例如5个核苷酸，或例如6个核苷酸，或例如7个核苷酸。环结构的例子包括但不限于：对于(+)-链的5′-AATAA-3′和对于(-)-链的5′-TTATT-3′，对于(+)-链的5′-GAA-3′和对于(-)-链的5′-TTC-3′，对于(+)-链的5′-GAAA-3’和对于(-)-链的5′-TTTC-3′，或对于(+)-链的5′-AAAA-3′和对于(-)-链的5′-TTTT-3′。(+)-链是探针(A)的环序列，而(-)-链是探针(B)的环序列。环结构可以选自但不限于AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT，对于(+)-链。因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个自杀盒包含选自AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT的环结构的方法。这意味着，探针(A)中的自杀盒的序列选自但不限于AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT。如果在环结构中需要强的发夹，那么推荐在环中具有5′-GAAA-3′或5′-GAA-3′，因为这两个序列已知显著增加发夹的解链温度(Hirao I等人，NucleicAcids Res.17(6)，2223-31(1989)和Hirao I等人，Nucleic AcidsRes.22(4)，576-82(1994))。
自杀盒的互补序列
自杀盒的互补序列位于在自杀盒序列中的环序列的每一侧(图3)。所述互补序列包含10-100个核苷酸，例如10-80个核苷酸，10-60个核苷酸，13-30个核苷酸，或13-40个核苷酸。优选地，所述互补序列的长度为12-20个核苷酸，例如12-20个核苷酸，例如13-20个核苷酸，例如14-20个核苷酸，或例如15-20个核苷酸。互补序列的例子是但不限于：
5′-XXCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGYY-3′，
5′-XCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGY-3′，和
5′-XXGAGTCGATCC-3′和5′-GGATCGACTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在一个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列的方法：
5′-XXCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在第二个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列的方法：
5′-XCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在第三个实施方案中，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列的方法：
5′-XXGAGTCGATCC-3′和5′-GGATCGACTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
自杀盒的互补序列的目的是形成用于切刻酶和限制性酶的结合位点。此外，互补序列使得探针(A)或(B)能够通过自杀盒中的互补序列的自我模板式杂交而环化。
优选地，自杀盒的部分将在初始合成过程中加到待扩增的寡核苷酸序列的每个末端。优选地，能够提供自我模板式杂交的最少5个核苷酸位于所述寡核苷酸的每个末端处。备选地，自杀盒位于探针(A)的中央。在这种情况下，环化可以通过外部模板式连接来进行。
在自杀盒中用于切刻酶和限制性酶的结合位点
自杀盒包含用于切刻酶的识别位点和用于限制性酶的识别位点。
如定义中概述的，切刻酶识别双链核酸序列，并切割该双链核酸序列中的一条链且仅切割一条链，产生3′-羟基和5′-磷酸。在本发明方法的步骤e)和步骤i)中使用切刻酶。在步骤e)中，将第一个扩增轮回的滚环产物暴露于切刻酶，该滚环产物包含多个拷贝的探针(A)的互补序列(探针(B))。扩增产物包含连续拷贝的探针(B)的多聚体和自杀盒。每个自杀盒序列形成发夹，因为自杀盒中的互补序列互相杂交。切刻酶识别在自杀盒的双链发夹区域中的切刻位点，并切割所述双链序列中的一条链。因此，切刻酶对于扩增产物的切割导致产生多个拷贝的探针(B)。由此，切刻酶制备了第一个扩增轮回的滚环产物，以用于第二轮连接、滚环复制和切割/切刻。在步骤i)中，将第二个扩增轮回的滚环产物暴露于切刻酶，该滚环产物包含多个拷贝的探针(B)的互补序列(探针(A))。切刻酶对于第二个扩增轮回的扩增产物的切割导致产生多个拷贝的探针(A)。由此，切刻酶制备了第二个扩增轮回的滚环产物，以用于滚环复制的另外轮回(本发明方法的步骤b)至步骤i))。
限制性酶识别双链核酸序列并切割双链核酸序列中的两条链。限制性酶可以在本发明方法的步骤d)或h)后使用。在这些步骤后，滚环产物包含多个拷贝的探针(A)或探针(B)。如上所述，在扩增产物中的每个自杀盒形成发夹，因为自杀盒中的互补序列互相杂交。限制性酶识别发夹内的限制性位点，并在特定位置上切割DNA，从而从自杀盒中释放包含在探针(A)或探针(B)内的寡核苷酸。由此，获得多个拷贝的包含在探针(A)或探针(B)内的寡核苷酸。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中探针(A)在步骤h)后通过用限制性酶切割探针(B)的滚环产物而获得。
在第二个实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中探针(B)在步骤d)后通过用限制性酶切割探针(A)的滚环产物而获得。
优选地，用于限制性酶的结合位点定位在最靠近自杀盒的环处，并且用于切刻酶的结合位点离环最远(图3，A-B)。备选地，用于切刻酶的结合位点最靠近环(图3，C-D)，或这两个结合位点重叠。
可以包括紧邻环结构的另外碱基对以增加酶的切割效率(图3)。优选地，插入2个碱基对，备选地插入0-50个碱基对，例如0-40个碱基对，或例如0-30个碱基对，或例如0-20个碱基对，或例如0-10个碱基对，或例如0-8个碱基对，或例如0-6个碱基对，或例如0-4个碱基对。
备选地，0-50个碱基对可以位于所述两个结合位点之间。如果用于IIS型限制性酶Mly I的识别位点位于离环结构最远，那么需要另外5个碱基对用于待扩增寡核苷酸的5′-末端和3′-末端的无限制设计(图3，C-D)。
一般而言，可以自由选择所述额外的碱基对，只要它们不等同于已使用的酶结合位点，或形成另外的用于所使用的酶的结合位点。
现在，在市场上可获得的切刻酶和在其识别序列外切割平末端的限制性酶的数目有限，因而只能设计少数自杀盒。将来，将极有可能开发出具有更高的切割效率和更窄的识别位点的切刻酶，以及进一步的在识别位点外切割平末端的限制性酶(IIS型)。这将允许自杀盒的新设计，可能限制自杀盒的大小和/或增加扩增效率。
自杀盒的详细结构可以改变，因为用于切刻酶的结合位点的位置、用于限制性酶的结合位点的位置、额外核苷酸的数目以及环的核苷酸组成都可以对于扩增反应中的最佳性能进行调整。用于限制性酶和切刻酶的结合位点的序列还取决于所使用的具体酶。
作为使用用于自我模板式连接的自杀盒的另一种选择，在步骤b)中探针(A)的环化可以通过一个或多个寡核苷酸的外部模板式连接来获得。
自杀盒的核酸序列的例子包括但不限于：
5′-GGATCGACTCYYAATAAXXGAGTCGATCC-3′(图3B)，
5′-GGATCGACTCAAAATAATTGAGTCGATCC-3′(SEQ ID NO：6)(图3A)，
5′-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCGAGTCGATCC-3′(图3D)，和
5′-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAGCGAGTCGATCC-3′(SEQ IDNO：7)(图3C)，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在一个方面，本发明涉及其中所述一个或多个切刻盒包含选自下列的核酸序列的方法：
5′-GGATCGACTCYYAATAAXXGAGTCGATCC-3′，
5′-GGATCGACTCAAAATAATTGAGTCGATCC-3′，(SEQ ID NO：6)
5′-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCGAGTCGATCC-3′，和
5′-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAGCGAGTCGATCC-3′(SEQ IDNO：7)，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在下文中详细描述在本发明方法中的不同步骤：
待通过本发明方法扩增的所述一个或多个寡核苷酸可以是包含至少10-1000个核苷酸的序列的任何核酸序列。因此，在一个方面，本发明涉及这样的方法，其中所述一个或多个寡核苷酸包含10-1000个核苷酸的序列，例如10-800个核苷酸，或例如10-600个核苷酸，或例如10-500个核苷酸，或例如15-400个核苷酸，或例如15-300个核苷酸，或例如20-250个核苷酸，或例如20-200个核苷酸，或例如20-180个核苷酸，或例如20-160个核苷酸，或例如25-140个核苷酸，或例如30-130个核苷酸，或例如40-120个核苷酸，或例如50-110个核苷酸，或例如60-110个核苷酸，或例如70-100个核苷酸。
寡核苷酸可以包含由任何天然脱氧核糖核苷酸G、C、A、T、I、U，以及任何人工核苷酸异-dCTP、异-dGTP，或包含修饰的任何天然或人工核苷酸组成的任何核酸序列。优选地，本发明涉及其中所述一个或多个寡核苷酸是DNA序列的方法。
在人工碱基对例如异-dCTP、异-dGTP或两者被包含在待扩增的寡核苷酸中或在切刻盒中的情况下，遗传字母扩展至包含三种碱基配对组分：G-C、A-T和例如异G-异C(isoG-isoC)。
探针(A)的制备(步骤a)
包含待扩增的一个或多个寡核苷酸以及一个或多个自杀盒的起始核酸序列(探针(A))可以通过标准化学方法来合成，例如β-氰乙基亚磷酰胺化学。5′-磷酸可以在这个合成过程中加入，备选地5′-磷酸可以通过例如使用T4多核苷酸激酶而酶促偶联至所述核酸序列的5′-末端。
在一个实施方案中，本发明涉及其中探针(A)包含下列核酸序列(SEQ ID NO：8)的方法：
5′-P-GTCGATCCCTGCCATCTTAACAAACCCTCGACCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC-TCTTATGCGATTACCGGGCTGGATCGACTCGGAATTTCTTCCGA-3′，
其中P是5′-磷酸。
长序列可以通过几个合成序列的外部模板式连接来构建，例如当待扩增的寡核苷酸非常长，例如200-1000个核苷酸时。在这种情况下，探针(A)可以通过两个或更多个寡核苷酸的外部模板式连接来制备(图5)。在一个实施方案中，本发明涉及其中探针(A)通过连接一个或多个核酸序列来制备的方法，所述一个或多个核酸序列包含所述一个或多个寡核苷酸的一个或多个部分以及所述一个或多个自杀盒。
优选地，探针(A)将在该探针的每个末端中包含自杀盒的一部分。备选地，自杀盒位于所述寡核苷酸的中央。如果探针(A)通过几个合成序列的外部模板式连接来制备，那么自杀盒的一部分可以位于一个序列的3′-末端并且另一部分可以位于另一个序列的邻近5′-末端。备选地，该盒可以位于一个或多个所述合成序列的中央。起始核酸序列(探针(A))还可以包含在设计上可以是相同或不同的多于一个的自杀盒，即核酸组合物。
在一个方面，本发明涉及其中探针(A)包含选自下列的核酸序列的方法：
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCYYAATAAXXGAG-3′，
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCAAAATAATTGAG-3′，
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAG-3′，和
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAG-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
探针(A)的环化(步骤b)
探针(A)的环化可以通过自我模板式连接，通过外部模板式连接，或通过二者的组合来进行。在探针(A)在探针(A)的每个末端中包含自杀盒的一部分的情况下，连接可以通过自我模板式连接来进行(图5A)。如图5A中所示，通过元件1A-1B和元件2A-2B之间的杂交，核酸探针通过自我模板式杂交折叠成开放的环。如果自杀盒位于寡核苷酸的中央，那么连接可以通过一个或多个寡核苷酸的外部模板式连接来进行(图5B)。对于长的寡核苷酸，探针(A)可以通过连接多于一个的核酸序列来构建，例如通过自我模板式杂交和外部模板式杂交的组合(图5C)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中核酸探针(A)的闭合环状结构通过自我模板式连接来获得的方法。如上所述，探针(A)的环化可以通过如此来获得，即经由在探针(A)内的所述一个或多个自杀盒的互补区域的杂交来进行探针(A)的自我模板式折叠，以使得能够连接探针(A)的末端。
闭合环状结构可以通过应用适当的缓冲条件以及合适的能量来源(ATP或NAD+)和连接酶，经过对于外部模板式连接和自我模板式连接的标准酶促连接来制备。优选使用T4 DNA连接酶。ATP以0.001-10mM，优选0.1-1mM的浓度提供，T4 DNA连接酶以0.00025-0.1韦氏(Weiss)单位/μl，优选0.0025-0.05U/μl的终浓度提供。备选地，可以使用其他连接酶例如Tsc连接酶、Tth连接酶、Amp连接酶和Taq连接酶。还可以使用化学连接。包含一个或多个自杀盒的圆环通常将包含50-1000个核苷酸，优选50-500个核苷酸。
引物结构
对于标准DNA聚合酶，需要引物以开始滚环复制反应。一般地，引物由5-50个核苷酸组成，且优选地由7-15个核苷酸组成。引物必须与所述核酸探针的一部分互补，优选的与自杀盒外的一部分互补，备选地与自杀盒内的一部分互补。
优选地，所述引物与所述探针100％互补，备选地在所述引物5′-末端处的核苷酸与所述探针不互补，例如1个核苷酸、3个核苷酸、5个核苷酸、10个核苷酸、25个核苷酸或50个核苷酸。如果使用包含3′至5′核酸外切酶活性的聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶)，那么在所述引物3′-末端处可以存在非互补核苷酸，例如1个核苷酸、例如3个核苷酸、例如5个核苷酸、例如10个核苷酸、例如25个核苷酸或例如50个核苷酸。此外，所述引物中可以存在错配的核苷酸，例如1个核苷酸、例如3个核苷酸、例如5个核苷酸、例如10个核苷酸或25个核苷酸。
所述引物可以通过标准化学方法来合成(例如β-氰乙基亚磷酰胺化学)。引物还可以包含修饰，例如但不限于，链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素、32P和荧光团，或者它可以包含人工核苷酸，例如但不限于LNA、PNA、异-dCTP和异-dGTP。
为了圆环和引物之间的正确退火，混合的圆环和引物之间的摩尔比为0.1-100，优选0.8-1.2。应当理解，本发明的方法还可以使用不需要引物的聚合酶。在这种情况下不需要引物来开始滚环复制。
在一个实施方案中，本发明涉及其中引物包含下列核酸序列(SEQID NO：9)的方法：
5′-GTAGTACAGCAGCAGCATTGAGG-3′。
在第二个实施方案中，本发明涉及其中引物包含下列核酸序列(SEQ ID NO：10)的方法：
5′-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC-3′。
对于生产目的，所述程序的改善可以通过下列方式来获得：使在本发明方法的步骤c和/或步骤g中的一种或多种反应物例如引物锚定至固体支持物，从而使滚环产物附着至表面。这将使得更容易改变缓冲条件，并改善不同步骤之间的洗涤，从而最小化背景。在一个例子中，引物可以在5′末端与固体支持物偶联——5′-生物素标记的引物可以例如偶联至经链霉抗生物素蛋白包被的固体支持物，包括但不限于PCR管、ELISA平板、珠、塑料CDs(由mic公司生产)和显微镜载玻片。引物与固体支持物偶联的引入允许在每轮滚环复制后的严格洗涤以去除滚环模板，从而只留下偶联的滚环产物。这将最小化在第二轮滚环复制中“错误”链的产生。微流体溶液提供一组平台，在其中可以锚定反应物并且可以在一次设计中改变所有条件。除了反应物(例如，引物、聚合酶)的物理锚定之外，微流体系统还提供将反应物永久或暂时地限制于指定区室的手段，而不将它们附着至支持物，即非物理锚定。引物、核酸圆环、聚合酶或核酸内切酶因此可以附着至固体支持物或以其他方式在空间上受到限制，而不会严重损害扩增反应的总效率。在圆环的情况下，所述圆环可以锁定在载体上的结构周围，从而允许圆环滚动但抑制圆环从表面上散开。
因此，在一个方面，本发明涉及其中在步骤c中的引物固定在固体支持物上的方法。
在另一方面，本发明涉及其中在步骤g中的引物固定在固体支持物上的方法。
在第三个方面，本发明涉及其中核酸圆环附着至固体支持物或以其他方式在空间上受到限制的方法。
在第四个方面，本发明涉及其中聚合酶附着至固体支持物或以其他方式在空间上受到限制的方法。
在第五个方面，本发明涉及其中核酸内切酶固定在固体支持物上或以其他方式在空间上受到限制的方法。
第一次滚环复制
当将聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)在适当的缓冲条件下和与引物(引物1)杂交的探针相组合时，可以发生滚环复制。聚合酶将使聚合从引物的3′-末端开始，使用环状探针作为滚环模板。因为环状探针是无末端的，所以滚环产物将包含与所述环状探针的序列互补的多聚体。优选地，聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。使用0.001-2单位的phi29聚合酶(Fermentas)的终浓度，优选使用0.05-1单位。使用0.005-10mM，优选0.1-1mM的最终dNTP浓度。备选地，可以使用其他聚合酶，例如T7 DNA聚合酶、Sequenase Version 2.0 T7DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶。在对于所选聚合酶的最佳温度上，孵育时间应当为10分钟-24小时，优选30分钟-5小时。对于某些聚合酶，单链结合蛋白(SSB)的添加强烈增加了滚环活性。因为Phi29DNA聚合酶不被SSB增强，所以优选使用0μg/μl SSB的浓度。备选地，可以使用0.001-0.2μg/μl的浓度。
滚环产物的长度优选为500-500,000个核苷酸。延伸的速度和持续时间可以通过改变dNTP、聚合酶、圆环、引物和SSB的浓度来控制。此外，温度和缓冲条件是可调整的。
对滚环产物进行切刻
包含多个拷贝的对于探针(A)的互补序列(称为探针(B))的滚环产物将折叠成由自杀盒组成的不同的发夹。为了将多聚体变成单体而不损失核苷酸，使用切刻酶来切割多聚体。切刻酶的结合位点位于自杀盒内。可以使用下列切刻酶：N.Alw I(Nt.Alw I)、N.BbvC IA(Nb.BbvC I)、N.BbvC IB(Nt.BbvC I)、Nt.BstNB I、Nb.Bpu10I或Nb.Bsm I。因此，在一个实施方案中，本发明涉及其中切刻酶选自N.Alw I(Nt.Alw I)、N.BbvC IA(Nb.BbvC I)、N.BbvC IB(Nt.BbvCI)、Nt.BstNB I、Nb.Bpu10I和Nb.Bsm I的方法。优选地，N.Alw I(Nt.Alw I)在本发明的方法中。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及其中切刻酶是N.Alw I(Nt.Alw I)的方法。优选地，调整缓冲混合物以供给不需纯化步骤的切刻条件，备选地，滚环产物通过已知方法(例如凝胶纯化或乙醇沉淀)来纯化，并且提供对于切刻酶的最佳缓冲条件。优选地，使用0.3-1U/μl切刻酶，备选地使用0.05-3U/μl。孵育时间可以为30分钟-3天，优选3-20小时。
第二次连接
为了将具有切口的产物变成闭合环状结构，可以执行通过加热和冷却的变性-复性步骤，这将促进单体(多个拷贝的探针(B))通过在自杀盒区域中的自我模板式杂交而折叠成开放环状结构(图1)。因此，探针(B)的环化可以通过探针(B)的分子内杂交来获得，这经由所述一个或多个自杀盒的互补区域的杂交，使得能够连接探针(B)的末端。因此，本发明的一个实施方案涉及其中探针(B)的环化通过自我模板式连接来获得的方法。
探针(B)的闭合圆环结构可以通过标准酶促连接来产生。优选地，调整缓冲条件以改善连接而无需纯化步骤，备选地具有切口的产物在连接前通过已知方法(例如凝胶纯化或乙醇沉淀)来纯化。
第二次滚环复制
第二次滚环复制以类似于第一次滚环复制的方式来进行。优选地，引物(引物2)与在第一轮滚环中使用的引物互补，备选地，它与除引物1外的探针序列的另一部分杂交。
任选地对第二轮的滚环产物进行切刻
可以执行另外一轮的切刻(nicking)以进一步扩增寡核苷酸。与第一轮切刻的不同之处在于它现在是具有切口的探针(A)的串联重复序列而不是探针(B)的串联重复序列。因此，探针(A)和探针(B)可以在去除自杀盒之前通过连接、滚环复制和切刻的连续轮回进一步扩增。
去除自杀盒
自杀盒使得能够通过(+)和(-)链合成而连续拷贝核酸序列，例如DNA。然而，一旦合成的核酸序列例如DNA将用于其他目的，例如作为杂交探针，那么就可能希望去除自杀盒。
滚环反应的产物将折叠成由自杀盒形成的不同发夹。为了将多聚体变成单体，并且同时去除自杀盒，用IIS型限制性酶切割该多聚体。结合位点位于自杀盒中。该酶在自杀盒中或在自杀盒和寡核苷酸的边界处进行切割，从而从自杀盒中释放寡核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中限制性酶识别在所述一个或多个切刻盒中的限制性位点，所述限制性酶在所述一个或多个切刻盒中或在所述一个或多个切刻盒与所述一个或多个寡核苷酸的边界处进行切割。
在一个实施方案中，本发明涉及其中限制性酶是IIS型酶的方法。优选地，限制性酶是Mly I，备选地可以使用另一种限制性酶。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及其中限制性酶是Mly I的方法。优选地，调整缓冲混合物以改善切割条件而不需纯化步骤。备选地，滚环产物在限制性切割之前通过已知方法(例如凝胶纯化或乙醇沉淀)来纯化，并且提供对于该限制性酶的最佳缓冲条件。孵育时间可以为30分钟-3天，优选3-20小时。必要时，可以将酶进行热灭活。在限制性切割后，最终产物例如通过凝胶纯化、乙醇沉淀或HPLC纯化来进行纯化。
本发明的探针
本发明还涉及包含一个或多个自杀盒的核酸探针，其中所述一个或多个自杀盒是包含一个或多个互补序列、一个或多个切刻位点以及一个或多个限制性位点的核酸序列。如上所述，自杀盒是进一步包含限制性位点的切刻盒。因此，在一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中自杀盒进一步包含一个或多个限制性位点。互补序列、切刻位点和限制性位点的细节如上所述。
此外，本发明的探针包含一个或多个寡核苷酸用于通过本发明方法进行扩增。因此，本发明涉及包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个自杀盒的核酸探针。如上所述，用于通过本发明方法进行扩增的所述一个或多个寡核苷酸包含至少10-1000个核苷酸的序列。因此在一个方面，本发明涉及核酸探针，其中所述一个或多个寡核苷酸包含至少10-1000个核苷酸的序列。
如所提及的，关于包含在本发明探针中的切刻盒的互补序列、切刻位点和限制性位点的细节如在本发明方法下所述的。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述自杀盒具有20-200个核苷酸的长度，以其单链形式。
在第二个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中所述自杀盒包含选自AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT的环结构。
在第三个方面，本发明涉及核酸探针，其中所述自杀盒包含下列互补序列：
5′-XXCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另一实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中自杀盒包含下列互补序列：
5′-XCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另外一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中自杀盒包含下列互补序列：
5′-XXGAGTCGATCC-3′和5′-GGATCGACTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另外一个实施方案中，本发明涉及核酸探针，其中自杀盒包含选自下列的核酸序列：
5′-GGATCGACTCYYAATAAXXGAGTCGATCC-3′，
5′-GGATCGACTCAAAATAATTGAGTCGATCC-3′，(SEQ ID NO：6)
5′-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCGAGTCGATCC-3′，和
5′-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAGCGAGTCGATCC-3′(SEQ IDNO：7)，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
在另一方面，本发明涉及核酸探针，其中探针包含选自下列的核酸序列：
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCYYAATAAXXGAG-3′，
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCAAAATAATTGAG-3′，
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAG-3′，和
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAG-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
本发明的核酸探针可以在用于不同目的的滚环复制中。
为了生产目的，可能并不希望获得全部通过用Mly I进行限制性切割而得到的滚环产物，而留下一批用于进一步的连接-滚环复制-切刻的轮回。
因为本发明的方法提供了含有可自由设计的5′-末端和3′-末端的5-磷酸化的寡核苷酸的扩增，所以显而易见的生产靶可以是挂锁探针，其中由本发明方法产生的探针的连接效率优于化学合成的寡核苷酸。
因此，在一个实施方案中，该方法涉及用于在滚环复制中使用的核酸探针，例如挂锁探针。
另一个显而易见的生产靶可以是长的寡核苷酸(至少1000个核苷酸)。因为化学合成具有在150个核苷酸范围内的局限，所以本发明的方法允许在以前不可能的长度上产生含有可自由设计的5′-末端和3′-末端的寡核苷酸。此类长寡核苷酸可以用于例如酶促反应的底物，用于原位杂交等。
自杀/切刻盒还可以连接至PCR产物、其中末端已用限制性酶修饰的PCR产物、或从生物中纯化的经限制性切割的DNA的两个末端。以这种方式，所述一种或多种靶可以变成闭合环状结构。闭合环状结构随后可以通过上述方法用于扩增包含在所述一个或多个盒内的DNA。
以类似方式，单链序列例如cDNA可以通过将切刻/自杀盒连接至该序列的末端而变成环状结构。闭合环状结构随后可以通过上述方法用于扩增包含在所述盒内的DNA。
优选地，根据本发明的核酸探针希望用于本发明的方法中。
与相关申请的交叉参考
本申请要求于2005年4月12日提交的DK PA 2005 00521的优先权。
在本文中引用的这些申请、专利中的每一个和每个文件，以及在这些申请、专利和文件(“申请所引用的文件”)中的每一个中引用的每个文件，以及(在申请及其专利的文本中或在其申请过程中)申请所引用的文件中参考或引用的每个文件，以及在其申请过程中提出的支持可专利性的所有论点，在此引入本文作为参考。
另外，单数参考不排除复数。因此，提及“a”、“an”、“第一个(种)”、“第二个(种)”等时，并不排除复数。
在整个本说明书中，术语“包含”，或变化形式“包括”或“含有”，应当理解为意味着包括所述的元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。
如将是显而易见的，本发明的一个方面的优选特征和特点可以应用于本发明的其他方面。
等价形式
本发明还可以其他具体形式体现而不背离其精神或基本特征。因此，前述实施方案在所有方面应被视为对于本文描述的发明是举例说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述描述指明，并且希望通过其中的参考而包括在权利要求书的等价性的含义和范围内的所有变化。
在下文中，本发明将借助于下列非限制性附图和实施例来进行描述。
实施例
实施例1
通过使用自杀盒来扩增66个核苷酸的寡核苷酸SF86-SC
通过使用本发明，我们能够将寡核苷酸扩增大约100,000倍。本发明使用自杀盒作为工具来扩增特定寡核苷酸。自杀盒是包含用于切刻酶和限制性酶的结合位点的发夹结构；在这个实施例中，切刻酶和限制性酶分别为N.Alw I(Nt.Alw I)和Mly I(图3，A-B)。通过使自杀盒位于最初合成的寡核苷酸的每个末端处，通过自我模板式连接可以将线性DNA序列变成闭合环状序列。通过滚环复制、切刻和连接的连续轮回，可以以任一极性(polarity)扩增寡核苷酸。在最后一个步骤中，可以通过用Mly I进行限制性切割来将自杀盒与寡核苷酸分开(图1)。
待扩增的寡核苷酸+自杀盒(SF86)(SEQ ID NO：8)：
5′-P-GTCGATCCCTGCCATCTTAACAAACCCTCGACCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC-TCTTATGCGATTACCGGGCTGGATCGACTCGGAATTTCTTCCGA-3′
有下划线的：作为自杀盒的一部分的核苷酸
无下划线的：待扩增的核酸序列。
不含自杀盒的待扩增的寡核苷酸(SF86-SC)(SEQ ID NO：11)：
5′-P-CTGCCATCTTAACAAACCCTCGACCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC-TCTTATGCGATTACCGGGCT-3′
用于第一轮滚环复制的引物((+)-引物)(SEQ ID NO：9)：
5′-GTAGTACAGCAGCAGCATTGAGG-3′
用于第二轮滚环复制的引物((-)-引物)(SEQ ID NO：10)：
5′-CCTCAATGCTGCTGCTGTACTAC-3′
关于Bcc I的切割寡核苷酸(Bcc I(+)-oligo)(SEQ ID NO：12)
5′-GTTTGTTAAGATGGCAG-3′
关于Bcc I的切割寡核苷酸(Bcc I(-)-oligo)(SEQ ID NO：13)
5′-CTGCCATCTTAACAAAC-3′
步骤1，连接1。在推荐的缓冲液中于37℃，使用1.5μM SF86和0.0125U/μl T4 DNA连接酶(Fermentas)进行自我模板式连接30分钟(图1A-1B以及图4泳道1-2)。
步骤2，滚环复制1。在推荐的缓冲液中于37℃，在包含250pM连接产物、250pμ(+)-引物、0.25μM dNTP和0.25U/μl Phi29 DNA聚合酶(Fermentas)的混合物中起始滚环复制16小时(图1C以及图4泳道3)。产物是与该DNA圆环互补的多聚DNA序列，其充当滚环模板。
步骤3，对RC-产物进行切刻1。加入包含1U/μl N.Alw I(Nt.AlwI)的1体积的1x NEB-缓冲液2，并于37℃孵育16小时以对RC-产物进行切刻。通过加入N.Alw I(Nt.Alw I)，可以将RC-产物变成单体(图1D以及图4泳道4和7)。
步骤4，连接2。通过进行热变性-复性步骤，单体将大部分折叠成开环结构，准备用于第二轮连接(图1F)。通过加入T4 DNA连接酶和ATP至0.05U/μl和0.5μM的终浓度，进行第二轮连接(图1G以及图4泳道8)。这个反应将单体变成包含发夹的单链DNA圆环。该圆环与步骤1中制备的圆环互补。
步骤5，滚环复制2。将连接产物稀释100x，并加入等浓度的(-)-引物(与步骤2中使用的引物互补)。在推荐的缓冲液中于37℃，在0.25μM dNTP和0.25U/μl Phi29 DNA聚合酶(Fermentas)的混合物中进行第二次滚环复制16小时。(图1H以及图4泳道9)。产物是等同于SF86的多聚DNA序列。
步骤6A，用Mly I切割。可以通过用Mly I进行切割而将SF86-SC寡核苷酸与自杀盒分开(图1I)。该反应包括加入包含1U/μl Mly I的1体积的1x NEB-缓冲液4，并于37℃孵育16小时。产物在10％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，从而将5′-磷酸化的SF86-SC与自杀盒分开(图4泳道11)。
步骤6B，用N.Alw I(Nt.Alw I)进行切刻2。备选地，可以进行几轮的切刻、连接和滚环复制，从而更进一步地扩增寡核苷酸(图1J以及图4泳道10)。
为了评估RC-产物的纯度，将Bcc I(+)-oligo和Bcc I(-)-oligo与第一轮和第二轮的RC-产物杂交。杂交序列包含用于限制性酶Bcc I(NEB)的结合位点，该酶识别非回文序列。在第一轮RC后，切割条带只出现在其中与RC-产物的预期序列的部分互补的Bcc I(-)-oligo进行了杂交的泳道中(图4泳道15)。相反地，在其中Bcc I(+)-oligo进行了杂交的泳道中，或在其中没有添加的泳道中，没有出现切割条带(图4泳道14和16)。这显示第一次滚环复制反应的产物是纯的且具有一个极性。
在第二轮滚环复制后，具有预期大小的条带出现在包含Bcc I(+)-oligo、Bcc I(-)-oligo并且无切割寡核苷酸的泳道中(图4泳道17-19)。在包含Bcc I(+)-oligo的泳道中的切割条带比其他两个泳道显著得多，并在且凝胶孔中留下的滚环产物的量少得多，者显示出占优势的产物是所需寡核苷酸。在泳道18和19中可见的背景扩增可以如此来解释，即在第一轮滚环复制后未进行纯化，从而留下来自第一次RC-反应的环状探针。在第二轮扩增中，具有两个极性的滚环产物因此将被扩增。这些产物能够互相杂交，从而导致在其中Bcc I(+)-oligo和Bcc I(-)-oligo都没有进行杂交的泳道中形成条带。这种共扩增最可能是在图4泳道17-19中可见的未预料到的条带的原因。该反应通过加入包含1U/μl Bcc I以及1μM Bcc I(+)-oligo或Bcc I(-)-oligo的1体积的NEB-缓冲液1来进行。
图例
图1
通过使用切刻盒来进行寡核苷酸的滚环复制，所述切刻盒是自杀盒。
A)(+)探针可以通过自我模板式杂交折叠成开环结构。B)(+)探针可以通过自我模板式连接变成闭环结构。C)第一次滚环复制反应通过加入引物和聚合酶来开始。滚环产物将是与(+)探针互补的重复序列。D)如果使用自杀盒，那么任选地可以用Ml y I切割(-)探针的多聚体，从而从所述一个或多个寡核苷酸中释放出自杀盒。
E)通过施加结合并对自杀/切刻盒进行切刻的切刻酶，多聚体变成(-)探针的单体。F)(-)探针可以通过自我模板式杂交折叠成开环结构。(-)探针单体将在快速热变性-复性步骤后优先折叠成开环结构。G)(-)探针可以通过自我模板式连接变成闭合环状结构。H)第二次滚环复制反应通过加入引物和聚合酶来开始。滚环产物将是与(-)探针互补的重复序列。I)如果使用自杀盒，那么任选地可以用Mly I切割(+)探针的多聚体，从而从所述一个或多个寡核苷酸中释放出自杀盒。
J)如果需要更高水平的扩增，那么可以进行切刻-连接-滚环复制的进一步轮回，从而回到步骤A)。
(+)指有义链，  (-)指反义链。序列的细线指自杀盒，和序列的宽线指待扩增的寡核苷酸。应当理解，含或不含所附着的盒的(+)链和(-)链的产物可以使用作为自杀盒或作为切刻盒的构建体来进行扩增。
图2
切刻盒的核苷酸序列的例子。
切刻盒由下列元件组成：用于切刻酶的结合位点、环和另外的碱基对。A：包含用于N.BbvC IA(Nb.BbvC I)的结合和切割位点的切刻盒。顶部：线性序列。底部：序列的结构。B：包含用于N.BbvC IB(Nt.BbvC I)的结合和切割位点的切刻盒。顶部：线性序列。底部：序列的结构。C：包含用于N.Alw I(Nt.Alw I)的结合和切割位点的切刻盒。顶部：线性序列。底部：序列的结构。D：包含用于Nb.Bsm I的结合和切割位点的切刻盒。顶部：线性序列。底部：序列的结构。在例子A-D中，使用由5′-AATAA组成的环。(N)n指待扩增的寡核苷酸，(↑)或(↓)指用于所述切刻酶的切割位点。(|)指碱基配对。X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
图3
自杀盒的核苷酸序列的例子。
自杀盒由下列元件组成：用于切刻酶的结合位点、用于限制性酶的结合位点、环和另外的碱基对。A：用于Mly I的结合位点位于最靠近环处，而用于N.Alw I(Nt.Alw I)的结合位点位于更远处。插入2个另外的碱基对。顶部：线性序列。底部：序列的结构。B：用于MlyI的结合位点位于最靠近环处，而用于N.Alw I(Nt.Alw I)的结合位点位于更远处。插入2个另外的任意碱基对。顶部：线性序列。底部：序列的结构。C：用于N.BbvC IA(Nb.BbvC I)的结合位点位于最靠近环处，而用于Mly I的结合位点位于更远处。插入7个另外的碱基对。顶部：线性序列。底部：序列的结构。D：用于N.BbvC IA(Nb.BbvCI)的结合位点位于最靠近环处，而用于Mly I的结合位点位于更远处。插入7个另外的任意碱基对。顶部：线性序列。底部：序列的结构。
在A-D中，使用由5′-AATAA组成的环。(N)n指待扩增的寡核苷酸，(↑)和(↓)指用于限制性酶和切刻酶的切割位点。(|)指碱基配对。X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
图4
凝胶图像，其显示了通过使用自杀盒的寡核苷酸SF86-SC的扩增。
泳道2)：寡核苷酸SF86通过自我模板式连接而环化。泳道3)：经稀释的来自泳道2的圆环的滚环产物，使用(+)-引物。泳道4和7)：用N.Alw I(Nt.Alw I)对来自泳道3的RC-产物进行切刻。泳道5)：用Mly I对来自泳道3的RC-产物进行限制性切割。泳道8)：通过自我模板式连接来连接来自泳道7的具有切口的产物。泳道9)：经稀释的来自泳道8的环的滚环产物，使用(-)-引物。泳道10)：用N.AlwI(Nt.Alw I)对来自泳道9的RC-产物进行切刻。泳道11)：用MlyI对来自泳道9的RC-产物进行限制性切割。泳道14)：Bcc I(+)-oligo与来自泳道3的RC-产物杂交，并用Bcc I进行限制性切割。泳道15)：Bcc I(+)-oligo与来自泳道3的RC-产物杂交，并用Bcc I进行限制性切割。泳道16)：用BccI对来自泳道3的RC-产物进行限制性切割。泳道17)Bcc I(+)-oligo与来自泳道9的RC-产物杂交，并用Bcc I进行限制性切割。泳道18)：Bcc I(-)-oligo与来自泳道9的RC-产物杂交，并用Bcc I进行限制性切割。泳道19)：用Bcc I对来自泳道9的RC-产物进行限制性切割。泳道1、13和20)：98个核苷酸的标记。泳道6和12)：66个核苷酸的标记。RC-1：第一轮滚环复制。RC-2：第二轮滚环复制。RC：滚环。10％变性聚丙烯酰胺凝胶，用SYBR Gold染色。
图5
制备包含自杀盒或切刻盒的环状探针的不同方法
A)自我模板式杂交。元件1A至1B与元件2A至2B杂交诱导了核酸序列的开环构象。B)外部模板式杂交。C)自我模板式杂交和外部模板式杂交的组合。A-C)，在杂交步骤后，核酸序列在待连接的位置处，从而变成闭合环状结构。(|)指碱基配对。
参考文献
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Claims (53)

1.用于扩增一个或多个寡核苷酸的方法，其包括：
a)制备包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒的核酸探针(A)，和
b)使所述探针(A)环化，和
c)提供具有所述探针(A)的一部分中的靶序列的引物，和
d)实施所述探针(A)的滚环复制，和
e)在所述一个或多个切刻盒内对探针(A)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(A)互补的探针(B)，
f)使所述探针(B)环化，和
g)提供具有所述探针(B)的一部分中的靶序列的引物，和
h)实施所述探针(B)的滚环复制，和
i)在所述一个或多个切刻盒内对探针(B)的滚环产物进行切刻，获得多个拷贝的与所述探针(B)互补的探针(A)。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤b)至i)执行一次或多次。
3.根据权利要求1或2的方法，其中探针(A)在步骤i)后获得。
4.根据权利要求1或2的方法，其中探针(B)在步骤e)后获得。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中探针(A)的环化通过自我模板式连接获得。
6.根据权利要求1-4的方法，其中探针(B)的所述环化通过自我模板式连接获得。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一个或多个寡核苷酸是DNA寡核苷酸。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述切刻酶选自N.AlwI(Nt.Alw I)、N.BbvC IA(Nb.BbvC I)、N.BbvC IB(Nt.BbvC I)和Nb.Bsm I。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述切刻酶是N.Alw I(Nt.Alw I)。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c中的引物固定在固体支持物上。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤g中的引物固定在固体支持物上。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一个或多个寡核苷酸包含10-1000个核苷酸的序列。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一个或多个切刻盒具有20-200个核苷酸的长度。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含选自AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT的环结构。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGCTGAGGXX-3′和5′-YYCCTCAGCYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸。
16.根据权利要求1-14的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXCCTCAGCXX-3′和5′-YYGCTGAGGYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
17.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXXXXXXGATCCXX-3′和5′-YYGGATCYYYYYYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
18.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGAATGCXX-3′和5′-YYGCATTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
19.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含选自下列的核酸序列：
5′-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCTGAGGXX-3′，
5′-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCXX-3′，
5′-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXXXXGATCCXX-3′，和
5′-YYGAATGCYYAATAAXXGCATTCXX-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
20.根据权利要求1-14或19中任一项的方法，其中所述探针(A)包含选自下列的核酸序列：
5′-P-GAGGXX-Z-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCT-3′，
5′-P-CAGCXX-Z-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCT-3′，
5′-P-XXGATCCXX-Z-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXX-3′，和
5′-P-TTCYY-Z-XXGAATGCYYAATAAXXGCA-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述探针(A)通过连接一个或多个核酸序列和所述一个或多个切刻盒来进行制备，所述一个或多个核酸序列包含所述一个或多个寡核苷酸的一个或多个部分。
22.核酸探针，其包含一个或多个寡核苷酸以及一个或多个切刻盒，其中所述一个或多个切刻盒是包含一个或多个互补序列以及一个或多个切刻位点的核酸序列。
23.根据权利要求22的核酸探针，其中所述一个或多个寡核苷酸包含10-1000个核苷酸的序列。
24.根据权利要求22-23的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒具有20-200个核苷酸的长度。
25.根据权利要求22-24中任一项的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含选自AATAA、GAA、GAA、AAAA和TTTT的环结构。
26.根据权利要求22-25中任一项的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGCTGAGGXX-3′和5′-YYCCTCAGCYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
27.根据权利要求22-25中任一项的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXCCTCAGCXX-3′和5′-YYGCTGAGGYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
28.根据权利要求22-25中任一项的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXXXXXXGATCCXX-3′和5′-YYGGATCYYYYYYY-3′，并且
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
29.根据权利要求22-25中任一项的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGAATGCXX-3′和5′-YYGCATTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
30.根据权利要求22-25中任一项的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含选自下列的核酸序列：
5′-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCTGAGGXX-3′，
5′-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCXX-3′，
5′-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXXXXGATCCXX-3′，和
5′-YYGAATGCYYAATAAXXGCATTCXX-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
31.根据权利要求22-25或权利要求30中任一项的核酸探针，其中所述探针包含选自下列的核酸序列：
5′-P-GAGGXX-Z-YYCCTCAGCYYAATAAXXGCT-3′，
5′-P-CAGCXX-Z-YYGCTGAGGYYAATAAXXCCT-3′，
5′-P-XXGATCCXX-Z-YYGGATCYYYYYYYAATAAXXXXX-3′，和
5′-P-TTCYY-Z-XXGAATGCYYAATAAXXGCA-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
32.根据权利要求22-31中任一项的核酸探针，其用于滚环复制。
33.根据权利要求22-32中任一项的核酸探针，其用于权利要求1-21中所述的方法中。
34.根据权利要求1-21中任一项的方法，其中所述一个或多个切刻盒进一步包含一个或多个限制性位点。
35.根据权利要求34的方法，其中步骤b)至i)执行一次或多次。
36.根据权利要求34或35的方法，其中探针(A)在步骤h)后通过用限制性酶切割探针(B)的滚环产物而获得。
37.根据权利要求34或35的方法，其中探针(B)在步骤d)后通过用限制性酶切割探针(A)的滚环产物而获得。
38.根据权利要求36-37的方法，其中所述限制性酶识别在所述一个或多个切刻盒中的所述限制性位点，所述限制性酶在所述一个或多个切刻盒中或者在所述一个或多个切刻盒与所述一个或多个寡核苷酸的边界处进行切割。
39.根据权利要求36-38的方法，其中所述限制性酶是IIS型酶。
40.根据权利要求36-39的方法，其中所述限制性酶是Mly I。
41.根据权利要求34-40的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸。
42.根据权利要求34-40的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
43.根据权利要求34-40的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGAGTCGATCC-3′和5′-GGATCGACTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
44.根据权利要求34-40的方法，其中所述一个或多个切刻盒包含选自下列的核酸序列：
5′-GGATCGACTCYYAATAAXXGAGTCGATCC-3′，
5′-GGATCGACTCAAAATAATTGAGTCGATCC-3′(SEQ ID NO：6)，
5′GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCGAGTCGATCC-3′，和
5′-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAGCGAGTCGATCC-3′(SEQ IDNO：7)，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
45.根据权利要求34-40或权利要求44的方法，其中所述探针(A)包含选自下列的核酸序列：
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCYYAATAAXXGAG-3′，
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCAAAATAATTGAG-3′，
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAG-3′，和
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAG-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
46.根据权利要求22-23中任一项的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒进一步包含一个或多个限制性位点。
47.根据权利要求46的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
48.根据权利要求46的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XCCTCAGCGAGTCXXXXX-3′和5′-YYYYYGACTCGCTGAGGY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
49.根据权利要求46的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含下列互补序列：
5′-XXGAGTCGATCC-3′和5′-GGATCGACTCYY-3′，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
50.根据权利要求46的核酸探针，其中所述一个或多个切刻盒包含选自下列的核酸序列：
5′-GGATCGACTCYYAATAAXXGAGTCGATCC-3′，
5′-GGATCGACTCAAAATAATTGAGTCGATCC-3′(SEQ ID NO：6)，
5′-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAGCGAGTCGATCC-3′，和
5′-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAGCGAGTCGATCC-3′(SEQ IDNO：7)，
其中X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对。
51.根据权利要求46或50的核酸探针，其中所述探针包含选自下列的核酸序列：
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCYYAATAAXXGAG-3′，
5′-P-TCGATCC-Z-GGATCGACTCAAAATAATTGAG-3′，
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGYYAATAAXXCCTCAG-3′，
5′-P-CGAGTCGATCC-Z-GGATCGACTCGCTGAGGAAAATAATTCCTCAG-3′，
其中
Z是待扩增的所述一个或多个寡核苷酸，
X和Y是能够互相杂交的任何天然或人工核苷酸对，
P是5′-磷酸。
52.根据权利要求46-51中任一项的核酸探针，其用于滚环复制。
53.根据权利要求46-52中任一项的核酸探针，其用于权利要求34-45中所述的方法中。
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