JP2002510465A

JP2002510465A - 修飾核酸プローブおよびその使用

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Publication number: JP2002510465A
Application number: JP2000528713A
Authority: JP
Inventors: ウエストン，アンソニー; アッセンバーグ，レネ; マーシュ，ピーター; モック，グラハム・アンドリュー; レイ，トゥレボー・ダンカン; ワラム，スーザン・デボラ; カーディー，ドナルド・レオナルド・ニコラス
Original assignee: サイトセル・リミテッド
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1999-01-26
Publication date: 2002-04-09
Also published as: CA2319662A1; AU752220B2; AU2289299A; WO1999037806A2; CA2319662C; EP1051515A2; US6391593B1; WO1999037806A3; DE1051515T1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】試料を第１および第２のプローブと接触させること（ここに、第１のプローブは、関心のある配列に相補的であってそれゆえそれにハイブッド形成できる部分と、関心のある配列に非相補的である部分とを含み、また第２のプローブは、関心のある配列に相補的であってそれゆえそれにハイブリッド形成できる部分と、関心のある配列には非相補的であるが第１のプローブの関心のある配列に非相補的な部分には相補的である部分とを含み、第１および第２のプローブは、第１および第２のプローブの相補的部分が互いにハイブリッド形成できるように、隣接して、または実質的に隣接して、関心のある配列にハイブリッド形成できるようになっている）；第２のプローブを鋳型とし、核酸ポリメラーゼを使って第１のプローブの伸長を引き起こすこと；および関心のある配列の存在を示すために、第１のプローブの伸長を直接または間接的に検出することからなる、試料中の関心のある核酸配列を検出する方法であって、第１および／または第２のプローブが、相互のプローブと塩基対形成できずそのために関心のある配列の不在下での第１のプローブと第２のプローブのハイブリッド形成を妨げる不安定化部分を含むことを特徴とする方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、核酸増幅法を改良するためにオリゴヌクレオチドプローブに不安定
化部分を導入すること、そのようなオリゴヌクレオチドの使用を伴う方法、およ
び核酸増幅法を実施するためのキットであってそのようなオリゴヌクレオチドプ
ローブを含むものに関する。とりわけ本発明は、反応の感度と特異性が増すよう
な、ハイブリッド形成させた修飾核酸プローブの増幅に関する。

【０００２】

【発明の背景】

【０００３】本明細書で言及する刊行物はすべて参照により本明細書の一部を構成する。多くの核酸増幅法が文献に引用され、公開された欧州特許出願やPCT特許出願に開示されている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)として知られるそのような方法
の一つはＵＳ４,６８３,１９５とＵＳ４,６８３,２０２に開示されている。PCR 法はDNA二本鎖の相対する鎖にアニールする核酸プライマーからなり、これらのプライマーが耐熱性DNAポリメラーゼを使ってヌクレオチド三リン酸の存在下に伸長されて、元の核酸配列の二本鎖コピーを２つ与える。変性、アニーリングお
よび伸長のサイクルを連続して行なうことで、元の核酸配列のコピーがさらに増
幅される。この方法には、反復される熱サイクリングに関係して中間温度（例え
ば５０℃〜５５℃）と高温（９０℃〜９５℃）の間で反応温度を交互に調節する
必要があるなどの欠点がある。また、核酸配列の増幅を達成するために大きな温
度移行のサイクルを多数回行なうのに必要な時間尺度と、その核酸配列の増幅さ
れたコピーにおける配列エラーの発生は、長い配列区間の多重コピー中にエラー
が起こるので、重大な短所である。さらにまた、増幅された核酸配列の検出は、
一般的には、例えばアガロースゲル電気泳動などのさらなる処理を必要とする。

【０００４】これに代わる核酸増幅法はＷＯ８８/１０３１５（Siska Diagnostics社）、Ｅ
Ｐ３２９,８２２（Cangene社）およびＥＰ３７３,９６０（Siska Diagnostics社
）、ＵＳ５,５５４,５１６（GenProbe社）およびそれぞれBurgaらとGingerasらに譲渡されたＷＯ８９/１０５０とＷＯ８８/１０３１５に開示されている。これ
らの増幅法には、交互に行なわれるDNA合成とRNA合成からなるサイクリング反応
が記述されている。この交互RNA/DNA合成は主として、転写プロモーターを含むオリゴヌクレオチドを特定のDNA配列に隣接してアニーリングさせることによって行なわれる。そのように生成された特定配列のRNAコピー、あるいは特定のRNA
配列を含む投入試料（ＵＳ５,５５４,５１６）は、次に核酸プライマーを用いて
DNA鎖としてコピーされ、その結果生じるDNA：RNAハイブリッドからRNAが変性（
ＷＯ８８/１０３１５）によって除去されるか、RNアーゼH（ＥＰ３２９８２２、
ＥＰ３７３９６０およびＵＳ５５５４５１６）を使って除去される。次に、RNA 生成を繰返すために、転写プロモーターを形成するオリゴヌクレオチドのアリー
ニングが繰返される。

【０００５】このように増幅は主として、効率のよいRNAポリメラーゼを使ってDNA鋳型に対
して過剰のRNAコピーを生成させることによって達成される。RNアーゼ型のこの方法は、増幅を潜在的に単一の温度（すなわち等温で）達成できるという点で、
PCRに対して大きな利点を持つ。また、PCRよりはるかに高いレベルの増幅を達成
できる。すなわち、T７ RNAポリメラーゼを使うと１０〜１００個のRNAコピーが
生成するのに対して、PCRでは１サイクルにつきDNAコピー数が倍増するに過ぎな
い。ＥＰ３２９８２２に記載のDNA：RNAサイクリング法に伴う短所は、転写プロ
モーターを作るためのオリゴヌクレオチドのアニーリングに個別の末端を持つ試
験核酸を必要とする点である。これは例えば長いDNA分子中の特定遺伝子の検出を困難にする。この方法のさらなる短所は、DNA：RNAサイクリングを企てるのに
少なくとも３種類の酵素を必要とし、それが安定性、コストおよび再現性に有害
な結果をもたらす可能性があることと、増幅された核酸配列の検出には１つまた
はそれ以上のさらなる工程（例えばゲル電気泳動）がしばしば必要とされること
である。

【０００６】上述の方法はいずれも、特定の核酸領域が直接コピーされ、それらの核酸コピ
ーがさらにコピーされて増幅が達成される方法にあたる。様々な核酸配列間の多
様性ゆえに、同じ方法でも配列が異なると増幅速度はおそらく異なり、したがっ
て例えば、特定の核酸の元の量を定量する際などに問題が生じる。

【０００７】上に挙げた方法はそれらの標的核酸の増幅に関して多くの短所を持つ。そこで
、特定標的核酸配列の高感度検出に切望される事項の一覧を以下に略述する：ａ）その方法は好ましくは標的配列の複写を必要としないべきである；ｂ）その方法は好ましくは長い配列の区間の多重複写を伴わないべきである；ｃ）その方法は好ましくは個別の末端を持たない特定配列を含むDNA標的配列とR
NA標的配列のどちらにも広く応用できるべきである；ｄ）シグナルは、好ましくは、２つの異なるプローブまたはプローブの領域の、
標的配列への、独立したハイブリッド形成からもたらされるべきである；また、ｅ）その方法は、ハイブリッド形成させたプローブを何の追加処理も行なわずに
検出するためのオプションを含むべきである。

【０００８】上述の要求を満たす核酸増幅法はＷＯ９３/０６２４０（Cytocell社）に開示されている。２つの増幅法が記述されていて、一つは熱的方法であり、もう一つ
は等温法である。熱型と等温型はどちらも、標的核酸に相補的な領域を持つ２つ
の核酸プローブのハイブリッド形成に依存する。該プローブの一部分は、第１お
よび第２のプローブの相補的な「アーム」特異配列が相互にアニールした状態に
なることができるように、それらのプローブが互いに隣接または実質的に隣接す
るような形で、関心のある配列にハイブリッド形成する能力を持つ。アニーリン
グに続いて、プローブの一方の鎖の伸長が、他方のプローブの一部を鋳型として
達成される。

【０００９】増幅は２つの手段のうちの１つで達成される。熱サイクル型では、伸長された
第１のプローブの新しく合成された配列の一部に実質的に相補的な、さらなるプ
ローブのハイブリッド形成が可能になるように、伸長された第１のプローブの熱
分離が行なわれる。伸長された第１のプローブを鋳型とし、適切なポリメラーゼ
を用いて、そのさらなるプローブの伸長が達成される。伸長された第１のプロー
ブとさらなるプローブ産物の熱分離により、これらの分子はさらなる第１のプロ
ーブ分子を伸長させるための鋳型として作用でき、伸長された第１のプローブは
、他のさらなるプローブ分子を伸長させるための鋳型として作用できる。等温型
では、第１のプローブのプライマー伸長が、関連RNAポリメラーゼの存在下に多数コピーのRNAを転写する機能的RNAポリメラーゼプロモーターを生成させる。得
られたRNAは、さらなるRNAポリメラーゼプロモーター配列を含有する相補的DNA オリゴヌクレオチドの相互作用（その結果、そのDNAオリゴヌクレオチドへのRNA
のアニーリングと、それに続く伸長反応とが、さらにもう一巡のRNA合成をもたらす）の結果として、さらに増幅される。この循環的方法によって大収量のRNA が生成し、その検出はいくつかの手段で達成できる。本発明はこれらの方法に関
係し、それに改良を施すことを目的とする。

【００１０】

【発明の要約】

好ましい態様では、本発明も上述した要件の全てを満たす。これは、関心のあ
る標的配列の存在下にその標的と２つのプローブとが「三元接合部（three way
junction）」を形成するような、相補的標的特異領域と相補的アーム領域とを含
有する２つのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形成によって達成でき
る。オリゴヌクレオチドプローブの一方または両方の相補的アーム領域には、そ
れら２つのオリゴヌクレオチドプローブが標的核酸の不在下でも会合することを
防いでそれらのプローブの潜在的会合に由来するノイズを減少させる不安定化部
分が組み込まれる。

【００１１】第１の側面として本発明は、関心のある核酸標的配列を検出する方法で使用す
るための一対の核酸プローブであって、第１のプローブは、関心のある配列に相
補的でありそれゆえそれにハイブリッド形成できる部分と、関心のある配列に非
相補的である部分とを含み、また第２のプローブは、関心のある配列に相補的で
ありそれゆえそれにハイブリッド形成できる部分と、関心のある配列には非相補
的であるが第１のプローブの関心のある配列に非相補的な部分には相補的である
部分とを含み、第１および第２のプローブは、第１および第２のプローブの相補
的部分が互いにハイブリッド形成できるように、隣接して、または実質的に隣接
して、関心のある配列にハイブリッド形成できるようになっており、その第１お
よび／または第２のプローブが、そのプローブ対の相互の要素と塩基対形成でき
ずそのために関心のある配列の不在下での第１のプローブと第２のプローブのハ
イブリッド形成を妨げる不安定化部分を含むことを特徴とするものを提供する。

【００１２】標的鎖は、関心のある任意の核酸（RNA、またより好ましくはDNA）配列、例え
ば（その複合体を病原体の存在の検出に使用できるように）病原体由来の配列な
どからなってもよいし、あるいはヒトまたは動物の個体の遺伝子型を決定できる
ように、特定のヒト、動物または植物の対立遺伝子の配列であってもよい。少な
くとも、標的のうち、二本鎖プロモーターの第２の鎖の一部を含有する部分（通
例２〜４塩基）が、好ましくはDNAからなると好都合である（ただしその必要はない）。標的鎖はDNAおよび/またはRNAの両方からなりうる。

【００１３】第１および第２のプローブの相互のハイブリッド形成および関心のある配列と
のハイブリッド形成は、本発明者らが「三元接合部」と呼ぶ構造を形成する。第
１のプローブと第２のプローブは好ましくはDNA、PNA（ペプチド核酸）またはLN
A（「ロックド核酸（locked nucleic acid）」からなるが、RNAや、上述したものの任意の組み合わせからなってもよい。

【００１４】 PNAは、糖/リン酸エステル主鎖がペプチド結合鎖（通例、反復されたN−（２ −アミノエチル）グリシン単位の鎖）で置き換えられていて、そこにメチレンカ
ルボニル結合によって塩基がつながれている合成核酸類似体である。DNAでは著しく負に帯電したリン酸エステル主鎖が各鎖間の静電反発を引き起こすが、PNA の主鎖は帯電していないので、PNA/DNAハイブリッドは二本鎖DNA分子に比べて高
いTm値を持つ。PNAのもう一つの特徴は、一塩基ミスマッチが、ヘテロ二本鎖DNA
中の一塩基ミスマッチよりも、相対的に言って、不安定化性が強いことである。
したがって、PNAを本発明で使用されるプローブに含めると、得られるプローブはもっぱらDNAからなるプローブよりも高い特異性を持つので有利だろう。PNAの
合成と使用は、例えばOrumら（１９９３ Nucl.Acid Res.２１,５３３２）、Egho
lmら（１９９２ J.Am.Chem.Soc.１１４,１８９５）およびEgholmら（１９９３ N
ature ３６５,５６６）などに開示されている。

【００１５】 LNAは、「内部架橋された」ヌクレオシド類似体を組み込んだ合成核酸類似体である。LNAの合成とその特性は、次のように多くの著者によって記述されている：Nielsenら（１９９７ J.Chem.Sco.Perkin Trnas.１,３４２３）；Koshkinら
（１９９８ Tetrahedron Letters ３９,４３８１）；SinghおよびWengel (１９９８ Chem.Commun.１２４７）；Singhら（１９９８ Chem.Commn.４５５）。PNA の場合と同様に、LNAはDNAと組み合わせると、従来のDNA/DNAヘテロ二本鎖よりも高い熱安定性を示す。しかしLNAは従来の核酸合成機で合成でき、一方、PNAは
従来の核酸合成機では合成できない。一本鎖PNA/DNAキメラを形成させる場合、P
NAをDNAにつなぐには特殊なリンカーが必要になる。これに対し、LNAは、従来の
技術でDNA分子に簡単につなぐことができる。したがってLNAは、本発明のプロー
ブでの使用に関して、いくつかの点でPNAより好ましい。

【００１６】具体的に述べると、２つのプローブの標的特異領域はLNAおよび/またはPNAを含んでもよく、アーム領域はDNAからなって、それらプローブの一方または両方は不安定化部分を含む。PNAは既知のどの核酸ポリメラーゼによっても鋳型として認識されないので、PNAを含んでなるキメラプローブ分子は、キメラ鋳型のPNA
部分をコピーする必要がない態様でのみ有用である。

【００１７】第１のプローブと第２のプローブが、標的配列にハイブリッド形成させた時に
、互いに隣接または実質的に隣接することは、本発明の基本的特徴である。「隣
接する」という用語の使用は、ここでは、標的配列のうち、プローブの相補配列
と塩基対形成する部分の間に、塩基対形成しないで残される標的配列のヌクレオ
チドが存在しないことを意味するものとする。このプローブ間の接近は、プロー
ブの標的非相補配列がアニールすることを可能にする。当業者にはすぐ明らかに
なるように、標的配列からもっと離れたところで互いにアニールできるようにプ
ローブを設計することによって、プローブがハイブリッド形成する標的ヌクレオ
チド配列中の部位間にギャップを導入することができる。この状況では、標的配
列のうち、プローブに塩基対形成する部分の間に、塩基対形成しないで残される
標的配列のヌクレオチドがいくつか存在しうるので、それらのプローブは「実質
的に隣接する」といわれる。標的配列の介在不対ヌクレオチドの数が、プローブ
の設計次第で変化しうることは明らかである。したがって、第１のプローブと第
２のプローブは隣接するようにハイブリッド形成することが好ましいのであるが
、それらのプローブは、５ヌクレオチドまでの標的配列で分離されてもよく、「
実質的に隣接する」という用語は、そのような状況を指すものとする。

【００１８】第２の側面として、本発明は、関心のある核酸標的配列を検出する方法であっ
て、上述した第１の側面に従う一対のプローブを関心のある配列にハイブリッド
形成させ；新たに合成された核酸が形成されるように（例えばＷＯ９３/０６２４０またはＵＳ５,５４５,５１６（これらの内容は参照により本明細書の一部を
構成する）に記述されているように）そのプローブの一方を、他方のプローブを
鋳型として伸長させ；新たに合成された核酸を直接または間接的に検出すること
からなる方法を提供する。活性な核酸プロモーターが形成されて、例えば第２の
プローブの多数のRNAコピーの生成などによって増幅が起こりうるように、第２のプローブを鋳型として第１のプローブを伸長することが極めて好ましい。通例
、増幅が促進されるように、１つまたはそれ以上のさらなる核酸プローブが適切
なポリメラーゼの存在下に導入される。好ましい態様では、多重増幅をもたらす
サイクリング増幅が確立される。そのような増幅がどのようにして得られるかの
詳細については、下記の実施例とＷＯ９３/０６２４０に記載する。

【００１９】新たに合成された核酸は、第２のプローブの鋳型部分と共に、例えばT３、T７
またはSP６ RNAポリメラーゼによって、もしくは当業者に知られているそれらの
突然変異型のいずれかによって認識されるRNAポリメラーゼプロモーターを形成することが望ましい。RNAまたはDNAを合成でき、本発明方法を実施する際に役立
ちうる、突然変異型RNAポリメラーゼが知られている（Kostyukら,１９９５ FEBS
Letts.３６９,１６５−１６８）。

【００２０】したがって好ましい態様では、（不安定化部分を持つまたは持たない）第２の
プローブのアーム領域が、（不安定化部分を持つまたは持たない）第１のプロー
ブのアーム領域に相補的な配列と、選択されたユニーク配列（例えばRNAポリメラーゼプロモーター配列、転写の効率を向上させるための「＋１２領域」などだ
が、これらに限るわけではない）とを含み、これにプローブ検出および捕捉配列
が続く。

【００２１】説明のために、本発明者らは、RNAポリメラーゼプロモーターによるRNA合成の
開始の効率が、そのプロモーターに隣接して下流にある配列によって左右される
ことを見出した。具体的に述べると、最適なRNA転写には１２塩基の領域（「＋１２領域」）が必要である。したがって、第２のプローブの転写される鋳型部分
は、そのプロモーターを認識するポリメラーゼに適した＋１２領域を含むことが
好ましい。本発明者らはT７ポリメラーゼに関して最適な＋１２領域を解明した（以下に、より詳細に議論する）が、これが例えばT３ポリメラーゼやSP６ポリメラーゼにも最適であるかどうかは現時点ではわかっていない。SP６ポリメラー
ゼやT３ポリメラーゼは異なる最適＋１２領域を持つことも考えられるが、もしそうだとすれば、この開示を利用して試行錯誤により適切な配列を同定すること
は、当業者にとっては簡単なことだろう。

【００２２】プロモーター鎖の鋳型部分への包含に関して、好ましい＋１２領域の配列を、
下記の表１に示す。最も活性な＋１２領域（最大の転写を与えるもの）が一番上
にあり、他の配列は好ましさが減っていく順番に示してある。表１ T７ポリメラーゼ用の鋳型＋１〜＋１２配列の選択肢。転写効率が低下する順番に記載（それぞれ配列番号１〜１０）５' ATCGTCAGTCCC ３' ５' GCTCTCTCTCCC ３' ５' ATCCTCTCTCCC ３' ５' GTTCTCTCTCCC ３' ５' GATGTGTCTCCC ３' ５' GTTGTGTCTCCC ３' ５' ATCCTCGTGCCC ３' ５' GCTCTCGTGCCC ３' ５' GTTCTCGTGCCC ３' ５' GTTGTGGTGCCC ３' （５'塩基には＋１（プロモーター配列の末端から下流に１番目の塩基である）という番号を割り当て、３'塩基には＋１２を割り当てる。）さらにもう一つの態様として、複合体の鋳型部分（好ましくプロモーター鎖上
の鋳型部分）は、新規合成されたRNAコピーを同定、検出または増幅するために使用できる配列を含有できるだろう（例えばＷＯ９３/０６２４０、ＵＳ５,５５
４,５１６を参照されたい。あるいは、例えばTyagiおよびKramer １９９６ Natu
re Biotech １４, ３０３−３０８に開示されているような分子ビーコン配列を用いる）。これらの配列は（上述のように）＋１２領域に隣接してその下流に置
くと便利であり、次に挙げる配列の１つまたはそれ以上（ただしこれらに限らな
い）を含みうる：ユニークな「分子ビーコン」配列；捕捉配列；検出プローブ相
補配列；等温増幅サイクリング反応用の代替RNAプロモーター配列（下記参照）。本発明にとりわけ役立つ一つのユニーク配列は、Streptomyces brasiliensis 由来の１６SリボソームRNAの塩基７９１〜８２０（Stackebrandtら,１９９１ Ap
pl.Environ.Microbiol.５７,１４６８−１４７７）によって与えられ、その配列
は既知のヒトDNAまた既知のヒト病原体のDNAのいずれとも整合しない。

【００２３】リボヌクレオチド三リン酸類（RNAポリメラーゼによるRNAの合成用）とdNTP類
（DNAポリメラーゼによるDNAの合成用）の両方を含む混合物の使用が本発明に伴
う態様（例えばプライマー伸長に続いて等温増幅を行なう場合）では、過剰な濃
度のdNTP類はRNAポリメラーゼによって合成されるRNAの量を減少させることが本
発明者らによって見出されたので、混合物中のdNTP類の濃度は５０μMを超えない（好ましくは１０μmを超えない）ことが好ましいだろう。

【００２４】ある特定の態様として、本発明は、関心のある配列の存在と、密接に関係する
その変異種であって関心のある配列との相違点がわずかに１塩基（例えば点変異
）であってもよいものの存在とを識別する方法を提供する。適切なプローブ配列
を選択することにより、本発明方法の性能を、試料中に存在する配列が関心のあ
る配列であるかそれともその変異種であるかに依存して、極めて異なる結果をも
たらすようにすることができる。具体的に述べると、第１のプローブと標的の間
および/または第２のプローブと標的の間の不対塩基の存在は、活性なプロモーターから合成される核酸の量に驚くべき影響をもつことが見出された。

【００２５】一般に、関心のある配列と対を形成しない少数（例えば１〜３個）の塩基を導
入するような第１のプローブの設計が、そのプロモーターから合成される核酸の
量を減少させる傾向を持つことを見出した。逆に、全く予想外なことに、本発明
者らは、関心のある配列と対を形成しない少数（例えば１〜３個）の塩基の、第
２のプローブ中での存在は、そのプロモーターから合成される核酸の量を減少ま
たは増加させうることを見出した（不対塩基はプローブの「アーム」部分の近く
にあるので、いくつかの態様ではその不対塩基を標的非相補アームの続きと見る
ことができる）。第１のプローブと対を形成しない（核酸合成の減少を引き起こ
す傾向がある）か、第２のプローブと対を形成しない（逆の効果をもつ傾向があ
る）塩基が標的配列中にありうる場合にも、等価な状況が見られる。いくつかの
態様では、標的と、一方または両方のプローブとの両方が、不対塩基を含有しう
る。

【００２６】特定の理論に縛られることは望まないが、本発明者らの仮説の一つは、第２の
プローブ（通常これは不安定化部分も含む）と標的の間の不対塩基の存在は、あ
る状況では生成する複合体の柔軟性を増し、それによってかさ高いポリメラーゼ
分子のプロモーターへの接近が容易になり、結果としてシグナルを増加させうる
というものである。他の状況では、不対塩基の存在が第１および/または第２のプローブと標的の間の相互作用を不安定化することで、シグナルの量を減少させ
うる。

【００２７】したがって本発明者らは、最適な効果を得るには、第２のプローブと関心のあ
る配列の間にミスマッチが含まれる状態は、好ましくは不安定化部分に隣接また
は実質的に隣接する（すなわち、好ましくは不安定化部分の５塩基以内にある）
べきだと考える。

【００２８】第２のプローブは不安定化部分を含むが第１のプローブはそれを含まない特定
の態様（とりわけその不安定化部分が後述するようにHex二量体を含む場合）では、第２のプローブ中に２つの隣接する不対塩基が存在すると、そのプロモータ
ーから生成される核酸の量が増加するが、３つの不対塩基が存在すると、そのプ
ロモーターから合成される核酸の量が、さらに一層増加することを、本発明者ら
は見出した。

【００２９】これらの態様では、不対塩基が第２のプローブ中にあり、それに対応する不対
塩基が関心のある配列中にある（すなわち塩基ミスマッチがある）場合がある。
また塩基は、それらが関心のある配列のうちの（ループとして存在する）無関係
な塩基からなる部分と相対しているために、対になっていない場合もある。逆に
、不対塩基が関心のある配列中に存在して、第２のプローブが無関係な塩基のル
ープを含む場合もある。第２のプローブおよび/または標的配列中の不対塩基の数を左右する（増加または減少させる）関心のある配列からの変異は、理論的に
はいずれも検出できるだろう。ただし上述のように、変異型配列と関心のある配
列との相違が一塩基によるものである場合は、不対塩基の数の１から２への（逆
も同じ）または２から３への（逆も同じ）変化が、最も大きい区別を与えるよう
である。変異型塩基の数がさらに多い場合は、より容易に検出されるだろう。

【００３０】第３の側面として本発明は、第１の側面に従う一対のプローブと適当な包装手
段とを含んでなる、関心のある核酸標的配列の存在を検出するためのキットを提
供する。本キットは通例、本発明の第２の側面の方法を実施するために使用され
、その方法を実施するための説明書を含むと便利である。本キットは次の１つま
たはそれ以上を含むと好都合である：DNAおよび/またはRNAポリメラーゼ、標識用試薬類、ヌクレオチド三リン酸類（標識されたもの、またはそうでないもの）
、検出試薬類（例えば酵素、分子ビーコン）および緩衝液類。

【００３１】不安定化部分は、一般に、核酸の相補鎖がハイブリッド形成した状態になる時
に通常起こるような普通の様式では塩基対形成と水素結合を起こすことができな
い化学物質である。本発明では、その不安定化部分が、２つのプローブの会合に
よって形成されうる二本鎖の融解温度（Tm）を効果的に低下させて、第３の核酸
分子（標的）の存在下にそれらの分子が熱力学的にはるかに安定な三元接合部を
形成できるようにする。それゆえ、不安定化部分の存在は、比較的不安定なプロ
ーブ二本鎖よりも三元接合部の方を、熱力学的に有利にする。次に、会合したプ
ローブの増幅は、基本的にＷＯ９３/０６２４０（Cytocell社）に記述されているように達成できる。あらゆる種類の分子が不安定化部分としての使用に好適で
ありうるが、以下に説明するように一部の化合物はとりわけ好ましい。本明細書
を利用すれば、当業者は他の化合物を試験して、関心のある標的核酸の不在下で
のプローブのハイブリッド形成が防止されるように、適度な不安定化を与えるも
のを、容易に選択できるだろう。従来の自動固相核酸合成機を使った合成オリゴ
ヌクレオチドへの組み込みを容易にする形で（例えばホスホロアミダイトとして
）市販されているものが、便宜上とりわけ好ましい。

【００３２】オリゴヌクレオチドに非ヌクレオチドセグメントを導入するには、リンカーま
たはスペーサー分子が使用されてきた。これらの分子は、適当な結合が可能でな
い場合に折り目とヘアピンを形成させてオリゴヌクレオチドの断片を橋渡しする
ために、また単に標識をオリゴヌクレオチドからさらに遠くに離すためだけに使
用されてきた。種々のそのようなスペーサー分子が入手可能であり、それらの多
くは本発明での不安定化部分としての使用に好適かもしれない。当業者は、この
開示を利用して、そのような適性を容易に確認できるだろう。

【００３３】好ましい態様として、第１のプローブは、関心のある配列に相補的な部分（「
配列特異領域」または「脚（foot)」）が一般に１０塩基以上であり、関心のある配列に非相補的な部分（「アーム領域」）が一般に５塩基以上であるようなも
のである。一般に、第１のプローブの場合は、標的特異領域がアーム領域より長
いだろう。

【００３４】第２のプローブは、やはり≧１０塩基が好都合な標的特異的な脚領域と、≧２
０塩基が好都合なアーム領域とを持つ。一般に、第２のプローブのアーム領域は
、第２のプローブのアーム領域が「突出部」を形成して、それが、例えばＷＯ９
３/０６２４０に記述するように、リボ−またはデオキシリボ−ヌクレオチド三リン酸の存在下に、酵素による第１プローブの伸長のための鋳型として作用でき
るように、第１のプローブの相補的アーム領域より長いだろう。したがって好ま
しい態様として、第１のプローブのアーム領域の３'末端は望ましくは３'OHを持
ち、そこから第２のプローブのアーム領域を鋳型とする伸長を企てることができ
る。この伸長を実施するために使用されるポリメラーゼは、熱的反応を望むか等
温反応を望むかに依存するだろう。好ましくは、第２のプローブの３'末端は、それがDNAまたはRNAからなる場合は、鎖伸長を防止するためにブロックすべきで
ある。これがどのようにして達成できるかは、例えば３'−ホスフェート、３'−
プロピルまたは３'−ジデオキシヌクレオチドの使用など、当業者には明白だろう。不安定化部分は通例、標的特異領域とアーム領域の間に置かれ、第１のプロ
ーブおよび/または第２のプローブ中に存在しうる。望ましくは、不安定化部分は第２のプローブ中に存在する。一定の応用例では、不安定化配列が（上記に加
えて、またはその代わりに）第１のプローブのアーム中に存在することが望まし
いこともある。いくつかの態様では、一方のプローブにある不安定化部分が標的
分子の一部に部分的に相対して置かれてもよいが、通常、これは避けるべきある
。

【００３５】不安定化部分の効果には、（a）標的の不在下での伸長プライマーと鋳型プライマーの間のハイブリッド形成を不安定化することによるバックグラウンドの減
少；（b）改善されたバックグラウンドの抑制による標的依存性の増加；および（c）三元接合部での立体的圧迫の解除と、それによるポリメラーゼの接近の補助がある。塩基対形成はできないが、それでも柔軟な折り目および/またはヘアピン構造を形成できる不安定化部分はとりわけ好適である。そのような好ましい
不安定化部分の一つは、単独で、または最高n回（nは≧１の任意の数字をあらわ
しうるが、最大値は５であることが好都合である）まで直列に存在しうるヘキサ
エチレングリコール（ここでは「Hex」と略記する）（図２参照）からなる。特に好ましい態様では、第２のプローブのアーム領域が直列に並んだ２つのHex分子を含んでなり、第１のプローブのアーム領域中でその不安定化部分と相対する
塩基の数は６ないし８（最も好ましくは６）塩基が望ましく、その後ろに好まし
くは５〜１５塩基の相補領域が続く。これに代わるもう一つの好ましい不安定化
部分は、複数のアルキレン（とりわけメチレン）反復からなる。ペンタ−または
ヘキサ−メチレンスペーサーがとりわけ好ましい。

【００３６】これらに代えて他のそれほどには好ましくない不安定化部分も使用できる。そ
れらにはイノシン、VirazoleTM（N[１]−[１−β−D−リボフラノシル]−３−カ
ルボキサミド−１,２,４−トリアゾール）、NebularinTM（N[９]−[１−β−D−
リボフラノシル]−プリン）、ニトロピロール、リボース、プロピルまたは上記の組み合わせ、例えばプロピル−Hex−プロピル、プロピル−Hex−Hex−プロピルなどがあるが、これらに限るわけではない。プロピルは例えばエチル、ブチル
、ペンチル、ヘプチル、オクチルなどで置き換えてもよい。相互のプローブのア
ーム領域内でその不安定化部分と相対する塩基の数はx（ここにｘは≧１）であることが望ましい。塩基の正確な数は、もちろん、不安定化部分のサイズとnの値に依存するだろう。

【００３７】次の記述は指針として使用できる：不安定化部分中の各Hex分子については、それと相対するオリゴヌクレオチドは好ましくは３〜４（好ましくは３）塩基か
らなるべきである；不安定化部分に存在する上述の他の分子または基のそれぞれ
については、それと相対するオリゴヌクレオチドは、次の例外を除いて、好まし
くは一塩基からなるべきである：ブチル−２塩基、ペンチル−２塩基、ヘプチル
−３塩基およびオクチル−４塩基。

【００３８】不安定化部分として使用される上述の化学物質はすべて（例えば米国Glen Res
earch社から）市販されている。

【００３９】本発明のさらにもう一つの態様として、二本鎖DNA（ゲノムDNAなど）を含む混
合物中の関心のある配列を検出したい場合は、そのハイブリダイゼーション混合
物に、さらなるオリゴヌクレオチド（「ブロッキングオリゴヌクレオチド」）を
含めることが有利だろう。これらのブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１の
プローブに相補的な部分と第２のプローブに相補的な部分のそれぞれの側で、関
心のある配列にハイブリッド形成する。ブロッキングオリゴヌクレオチドはDNA 、PNA、LNA（またはそれらの組み合わせ）からなることが好ましく、それぞれ少
なくとも１０（より好ましくは少なくとも２０）ヌクレオチドからなることが有
利である。ブロッキングオリゴヌクレオチドの目的は、（使用するハイブリッド
形成条件下に）標的鎖のその相補鎖との再アニールを抑制することである。ブロ
ッキングオリゴヌクレオチドは第１および第２のプローブに実質的に隣接して標
的鎖にアニールしてもよいし、そこから少し（例えば５〜５０塩基）離れたとこ
ろにアニールしてもよい。

【００４０】ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１および/または第２のプローブが大きな標的相補「脚（feet）」領域を含有する場合には、ほとんど利点がないかも
しれない。

【００４１】上述のように、本発明による三元接合部の形成は、通例、核酸（通常はRNA)の
新規合成をもたらすだろう。新たに合成された核酸は、好ましくは増幅工程に続
いて、いくつかの技術のいずれでも直接または間接的に検出できる。好適な検出
および増幅工程をさらに詳しく以下に説明する。検出方法本発明の方法に従って三元接合部から生成された核酸は、好ましくは増幅（最
も好ましくは等温増幅段階を使った増幅）に続いて、いくつかの方法で検出でき
るだろう。例えば、新たに合成されたRNAは、合成中に標識塩基を組み込んで、または組み込まないで、従来の方法で（例えばゲル電気泳動によって）検出でき
るだろう。

【００４２】もう一つの選択肢として、例えば新たに合成されたRNAを固体表面（例えばビーズ上や、マイクロタイタープレート中）に捕捉し、捕捉された分子を標識核酸
プローブ（例えば放射標識したもの、またより好ましくは、酵素、発色団、蛍光
体などで標識したもの）とのハイブリッド形成で検出することができるだろう。

【００４３】一つの好ましい検出法では、分子ビーコンや、蛍光共鳴エネルギー移動（「FR
ET」）、遅延蛍光エネルギー移動（「DEFRET」）または均一時間分解蛍光（「HT
RF」）の技術を使用する。分子ビーコンは、その分子のコンフォメーションに依
存して蛍光シグナルを生成したり生成しなかったりする分子である。通例、その
分子の一部分が蛍光体を含み、その分子のもう一つの部分がその蛍光体から生じ
る蛍光を消光するための「消光体」を含む。したがって、その分子のコンフォメ
ーションが、蛍光体と消光体とが極めて接近するようなものである場合は、その
分子ビーコンは蛍光を発しないが、蛍光体と消光体が比較的遠く分離されている
場合は、その分子は蛍光を発する。分子ビーコンは適当な蛍光体と消光体で標識
された核酸分子からなることが好都合である。

【００４４】分子ビーコンのコンフォメーションを変化させる方法の一つは、核酸へのハイ
ブリッド形成によるものであり、例えば分子ビーコンの一部のルーピングアウト
を誘発することによる。もう一つの選択肢として、分子ビーコンが最初はヘアピ
ン型構造（自己相補的塩基対形成によって安定化されたもの）をとり、その構造
をハイブリッド形成によって、または酵素もしくはリボザイムによる切断によっ
て変化させてもよい。

【００４５】 FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）は蛍光供与体分子が無放射双極子−双極子相
互作用によって受容体分子にエネルギーを移動するときに起こる。供与体と受容
体間の距離R−６に依存するエネルギー移動が起こると、供与体の寿命と量子収率は低下し、受容体蛍光は増加または増感する。

【００４６】本発明者らは、核酸ハイブリッド形成アッセイでの供与体および受容体として
、FAM（６−カルボキシフルオレセイン）とTAMRA（N,N,N',N'−テトラメチル− ６−カルボキシローダミン）を使用した。このアッセイでは２つの色素標識DNA オリゴマー（１５マー）を使用した。FAMを一方のプローブの５'に連結し、TAMR
Aを他方の３'に連結した。標的核酸にハイブリッド形成すると、それらのプロー
ブは互いに隣接して配置され、FRETが起こりうる。本発明者らの実験により、最
大のシグナルを得るにはプローブの間に５塩基の間隔をおく必要があることが実
証された。DEFRETとHTRF（後述）に最適な間隔はこれとは異なりうる（これより
短いことが多い）。

【００４７】もう一つの方法（DEFRET、遅延蛍光エネルギー移動）は、励起状態に励起され
た時に効率のよい長寿命放射（λ(励起)＝３３７nm、λ(放射)＝６２０nm）を示
すことができる一定の金属イオン（ランタニド、例えばユウロピウム）のユニー
クな特性を利用している。そのような長寿命放射の利点は、放射の測定を初期中
断後に始めることにより、全てのバックグラウンド蛍光と光散乱を散逸させる時
間分解（TR）技術を使用できる点である。CY５（λ(励起）＝６２０nm、λ(放射
)＝６６５nm）はDEFRETパートナーとして使用できる。

【００４８】 HTRF（ＷＯ９２/０１２２４およびＵＳ５,５３４,６２２）は、供与体（ユウロピウム）を保護ケージ（クリプテート）に包接し、オリゴマーの５'末端に取り付けた場合に起こる。この系のために開発された受容体分子はXL６６５と呼ば
れるタンパク質蛍光体である。この分子を第２のプローブの３'末端に連結する。この系はPackardによって開発されたものである。

【００４９】もう一つの態様では、新たに合成されたRNAが、増幅前または増幅後に、特定の核酸基質配列の切断（例えば蛍光体/消光体標識オリゴヌクレオチドの切断）によって検出できるリボザイムの形成をもたらす。増幅技術本発明の好ましい態様では、標的依存的転写反応に由来するRNAが検出に先立って増幅され、その増幅段階には通例DNAオリゴヌクレオチドの導入が必要である。この増幅段階は等温的に（すなわちPCRを実施する際に必要な類の熱サイクリングを必要としないで）達成することが有利である。導入されるDNAオリゴヌクレオチドは、新たに合成されたRNAの３'領域に相補的であり、RNAポリメラーゼプロモーターの配列とユニークな転写可能配列（鋳型部分）も含有する。新た
に合成されたRNAをそのDNAオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させると、添
加したDNAポリメラーゼによって媒介されるそのRNAの３'末端からのプライマー伸長反応が、機能的な二本鎖RNAポリメラーゼプロモーターを生成させる。適切なRNAポリメラーゼの存在下で、多数コピーの第２のRNA種がそのDNAオリゴヌクレオチドのユニーク領域から合成される。次にこのRNAは、さらなるプライマー伸長とRNA合成にとってのプライマーとして作用できる。さらなるRNAの合成には
、第２のRNA種の３'領域に相補的なもう一つのDNAオリゴヌクレオチドの存在が必要である。このDNAオリゴヌクレオチドは、RNAポリメラーゼプロモーター要素
の配列と、転写された時に標的依存的な転写反応で生じるものと同じRNAを生成させる配列も含有する。このようにして合成されたRNAの３'末端は第１のDNAオリゴヌクレオチドに相補的であり、それゆえにサイクル型の増幅系が生成する。

【００５０】上述の態様の一変法では、導入されたDNAオリゴヌクレオチドが新規合成されたRNAにハイブリッド形成し、それぞれの配列は、新たなRNAポリメラーゼプロモ
ーターがDNAポリメラーゼによる伸長段階を必要としないで直接形成されるようになっている。次に、サイクリング反応は基本的に上述と同様に実施できて、一
つの反応で生じた転写物がDNAオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成して第２のRNAプロモーターを形成し、それが元の転写物と同じ配列を持つ転写物を生成させる。

【００５１】多くのRNAポリメラーゼは（比較的低い頻度で）一本鎖DNA配列のRNA転写物を生成させる傾向をもち、そのために例えば、適切な相補鎖が存在しなくても一本
鎖DNAオリゴヌクレオチドの転写がいくらか起こりうるので、上述の増幅法では、多少のバックグラウンド「ノイズ」が生成するかもしれない。この低レベルの
バックグラウンド転写は、転写の終結を引き起こす傾向がある配列をその３'末端近くに含むようにDNAオリゴヌクレオチドを設計することによって、低下させることが可能である。T７ポリメラーゼによる転写をとりわけ有効に終結させるそのような配列の一例は、Heら（１９９８ J.Biol.Chem.２７３,１８,８０２）によって開示されているように、AACAGAT（鋳型鎖）である。同じまたは類似の終結配列をDNA鋳型の５'末端に配置して、連続移動性を向上させることもできる
だろう。

【００５２】以下に、実施例を挙げ、添付の図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明す
る。

【００５３】図１では、第１のプローブ（４）と第２のプローブ（６）への標的配列（２）
のハイブリッド形成によって、三元接合部が形成される。第１のプローブ（４）
は、標的配列（２）に相補的な「標的特異領域」（８）と、「アーム領域」を構
成する標的配列に非相補的な部分（１０）とを含む。第２のプローブ（６）も、
標的の中の第１のプローブ（４）にハイブリッド形成する部分とは異なるがそれ
に実質的に隣接する標的（２）の一部に相補的な標的特異配列（１２）を含む。
第２のプローブはアーム領域（１４）を含む。アーム領域（１４）は、標的特異
領域（１２）とアーム領域（１４）の残りの部分の間に位置する不安定化部分（
参照番号（１６）で示す）を含む。アーム領域（１４）は、第１のプローブのア
ーム領域（１０）に相補的な領域（１８）（５〜１５塩基）も含む。領域（１８
）に隣接して５'突出領域（２０）があり、これはリボ−またはデオキシリボ− ヌクレオチド三リン酸と適当なポリメラーゼの存在下に、第１のプローブのアー
ム領域（１０）の３'末端の伸長にとっての鋳型として働きうる。「突出」または「鋳型」領域（２０）は任意の適当な配列からなりうる。

【００５４】例えば、増幅がPCRまたは熱サイクリングによって達成される場合、事実上どの配列でも好適でありうる。しかし、増幅が（一般に好ましいように）等温サイ
クリングで達成される場合は、鋳型領域が１つ以上のRNAポリメラーゼプロモーターの鋳型鎖を含み、さらに典型的にはその効率を最適化するためにそのプロモ
ーターに隣接した＋１２領域を含み、また転写された時にその転写物のさらなる
増幅、捕捉および/または検出を容易にする配列を含むことが好都合である。実施例実施例１この実施例では、B型肝炎ゲノムのある領域に特異的なプローブの相互作用の結果として起こる新規核酸の合成を実証する。標的（プローブ３）への第１およ
び第２のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形成は、三元接合部の形成
をもたらす。第１のプローブは２つの領域、すなわち標的特異領域とアーム領域
からなる。第２のプローブも２つの領域、すなわち標的のうちの第１のプローブ
の標的特異領域とは異なる部分に相補的な標的特異領域と、第１のプローブのア
ーム領域の一部に相補的なアーム領域からなる。第２のプローブのアーム領域は
、直列に組み込まれた２つのヘキサエチレングリコール（Hex）分子も含有する。第１プローブのアーム領域にはそれら２つのHex分子に相対する６つの塩基があり、それらはHexに相対して非相補ループを形成する。第１および第２のプローブのうち、互いに相補的であるが標的には相補的でない部分は、DNAポリメラーゼによって認識される９塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプロ
ーブ伸長を引き起こして、新たに合成された核酸を生成させる。そのアッセイ混
合物は、核酸合成を増幅し増進するために、さらなるプローブ（プローブ４）を
含有する。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドプローブは全て、Applied Biosystems社製３８０A合成機を製造者の指示に従って使用することにより、ホスホロアミダイト法によって合
成した。Hexの組み込みは、成長中の鎖の１８−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール，１−[(２−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]ホスホロアミダイトとの反応によって達成した。オリゴヌクレオチドプローブのビオチン
化は、ビオチンホスホロアミダイトの組み込みによって達成した。アルカリホス
ファターゼで官能化されたオリゴヌクレオチドは、製造者の特許方法（Oswel社）を使って調製した。オリゴヌクレオチドは全て標準的技術を使ってHPLC精製し
た。ハイブリッド形成され伸長されたオリゴヌクレオチドの増幅ハイブリッド形成は、２.５mM MgCl２、０.２mMの各dNTP（２'−デオキシアデ
ノシン５'−三リン酸（dATP）、２'−デオキシチミジン５'−三リン酸（dTTP）、２'−デオキシグアノシン５'−三リン酸（dGTP）および２'−デオキシシチジン５'−三リン酸（dCTP））を含む１６mM (NH４)２SO４、６７mM Tris−HCl pH
８.８および０.０１% Tween−２０中に２０.０pmolの第１プローブ、０.２pmol の第２プローブ、７.５pmolのプローブ３（B型肝炎標的）および１０.０pmolのプローブ４（増幅プローブ）を含有する５０μlのアッセイ混合物中で達成した。伸長と増幅は４単位のExo（−）PolythermaseTM（Bioline社）DNAポリメラーゼで行なった。ストレプトアビジン被覆プレートでの捕捉が可能なように、第１
のプローブまたはプローブ４をその５’末端でビオチン化した。そのアッセイ混
合物を９５℃に２分間加熱した後、９５℃で２０秒間、次いで４５℃で１５秒間
の熱サイクリングを、測定可能なシグナルを生成させるのに必要なサイクル数だ
け行なった。バックグランド値を標的プローブの不在下でのサイクリングについ
て決定した。増幅された伸長されたプローブの捕捉と検出アッセイ混合物の一部（１〜５０μl）を、１３０μlの５０mM Tris−HCl pH
８.０、１３８mM NaCl、２.７mM KCl＋０.１% BSAを含む９６穴ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Labsystems社）のウェルに移した。そのプ
レートを室温で最低３０分間振とうし、１３８mM NaCl、２.７mM KClを含む５０
mM Tris−HCl pH ８.０＋０.１% Tween−２０（TBS/Tween−２０）で１回洗浄し
た。次に、１８０μlの１５０mM NaOH/０.０５% Tween−２０をウェルに添加し、振とうしながら室温で５分間インキュベートした。そのウェルをTBS/Tween− ２０で４回洗浄した。５０mM Tris−HCl pH ８.０、１M NaCl、２０mM EDTA、０
.１% Tween−２０および０.１% BSAを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中
、アルカリホスファターゼ標識オリゴヌクレオチド（プローブ５）を、第１のプ
ローブまたはプローブ４より１.２倍高い濃度で加えた。そのプレートを振とうしながら室温で１時間インキュベートし、TBS/Tween−２０で４回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質緩衝液（Boehringer Mannheim社）で１回洗浄した。最後に、４−ニトロフェニルホスフェート（５mg/ml）を含有するアルカリホスファターゼ基質緩衝液を各ウェルに加え、Labsystems社製EIAプレートリーダー中、３７℃で３０分間インキュベートし、表示値を４０５nmで読み取った。

【００５５】その結果（簡略のためデータは省いた）は、標的の不在下では極めてわずかな
バックグランドシグナルが得られるが、標的配列が存在すると極めて強いシグナ
ルが得られることを示した。代替検出系もう一つの選択肢として、ユウロピウム標識プローブ５（EG&G Wallac社,英国
ミルトンキーンズ）を、励起フィルター（３４０nm）および放射フィルター（６
１５nm）とWallac Victor １４２０マルチラベルカウンターを用いる時間分解蛍
光検出に使用できるだろう。オリゴヌクレオチドの一覧（HはHexを表す）第１のプローブ５'GCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCGCCCACGCGGCGGAG３'（５'−ビオチン化される場
合がある）（配列番号１１）第２のプローブ５'GGATATCACCCGATGTGCGGCGCTCCGCCGCHHAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTT−リン
酸３'（配列番号１２）プローブ３（B型肝炎ゲノムの標的領域）５'AACTGAAAGCCAAACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA
GG３'（配列番号１３）プローブ４５'GGATATCACCCGATGTG３'（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号１４
）プローブ５５'TACTAGTGCCATTTG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたもの）（配列番号１５）実施例２今度はヒト４番および１８番染色体アルフォイド反復単位を標的として使用し
、プローブ配列をそれに応じて変更して、基本的に実施例１の方法を繰返した。
増幅段階は、９５℃で２０秒間の後５５℃で５秒間という条件を用いて熱サイク
リングを行なった点で、わずかに異なった。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'AAACAGAAGCATTCTCAGAAACTTCTCAGTGATGGCCCACGCGGCGGAG（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号１６）第２のプローブ５'GGATATCACCCGATGTGCGGCGCTCCGCCGCHHTTTGCATTCAGCTCATGGAGTTGAACACTTCC−リ
ン酸３'（配列番号１７）プローブ３（ヒト４番および１８番染色体アルフォイド反復単位の領域）５'CTATGAAAGGAAGTGTTCAACTCCATGAGCTGAATGCAAACATCACTGAGAAGTTTCTGAGAATGCTTC
TGTTTGATTTT３'（配列番号１８）プローブ４５'GGATATCACCCGATGTG３'（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号１４
）プローブ５５'AAACTTCTCAGTGAT３'（アルカリホスファターゼ標識されたもの）（配列番号１９）得られた結果を図３に示す。この図は、必要な試薬が全て存在している測定用
試料の（４０５nmでの）吸光度（左側）を、標的配列を欠く対照試料（中央）ま
たはブランク試料（右側）と比較して示した棒グラフである。実施例３今度はヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）配列を標的にし、
プローブ配列をそれに応じて変更して、基本的に実施例１の方法を繰返した。ハ
イブリッド形成条件は、５０μlのハイブリダイゼーション混合物が２.５pmolの
第１プローブ、１.０pmolの第２プローブ、７.５pmolのプローブ３（標的）およ
び２０pmolのプローブ４を含有する点で、わずかに変更された。増幅は９５℃で
２０秒間と６０℃で５秒間の熱サイクリング条件を用いて行なった。他の検出系ユウロピウム標識プローブ５（EG&G Wallac社）を、励起フィルター（３４０n
m）および放射フィルター（６１５nm）とWallac Victor １４２０マルチラベルカウンターを用いる時間分解蛍光検出に使用できるだろう。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'TGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGCCCACCCGGCGGAG３'（５'−ビオチン化される
場合がある）（配列番号２０）第２のプローブ５'GGATATCACCCGATGTGCGGCGCTCCGCCGGHHGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCG−
リン酸３'（配列番号２１）プローブ３（ヒトCFTR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４５'GGATATCACCCGATGTG３'（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号１４
）プローブ５５'TTAAAGAAAATATCA３'（アルカリフォスファターゼまたはユウロピウム標識されたもの）（配列番号２３）得られた結果を図４に示す。この図は、必要な試薬を全て含有する測定用試料
の４０５nmでの吸光度（左側）を、標的を欠く対照試料（中央）またはブランク
試料（右側）と比較して示した棒グラフである。実施例４基本的に実施例３の方法を繰返したが、この実施例では第２のプローブが、不
安定化部分として配列中に組み込まれた２つのプロピル基（Pr）、２つのヘキサ
エチレングリコール（Hex）分子および２つのさらなるプロピル基（Pr）を含有した。オリゴヌクレオチドの調製プロピルの組み込みはジメトキシトリチル化プロピルホスホロアミダイトを使
って行なった。その他の場合は、先の実施例に記述したようにプローブを合成し
、精製した。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'GATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGCCCACCCGGCGGAG３'（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号２４）第２のプローブ（H=Hex、P=プロピル）５'GGATATCACCCGATGTGCGGCGCTCCGCCGGPPHHPPGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAG
CG−リン酸３'（配列番号２５）プローブ３（ヒトCFTR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４５'GGATATCACCCGATGTG３'（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号１４
）プローブ５５'TTAAAGAAAATATCA３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたもの）（配列番号２３）ハイブリッド形成され伸長されたオリゴヌクレオチドの増幅ハイブリッド形成は実施例３に記述したような条件を用いて行なった。伸長と
増幅は先に記述したように、ただし９５℃で２０秒間の後６０℃で５秒間という
熱サイクリングで、行なった。

【００５６】増幅された伸長されたプローブの捕捉と検出は先の実施例に記述したように行
なった。

【００５７】得られた結果を図５に示す。この図は、必要な試薬が全て存在している測定用
試料の（４０５nmでの）吸光度（左側）を、標的配列を欠く対照試料（中央）ま
たはブランク試料（右側）と比較して示した棒グラフである。濃度既知の試料を
用いた結果から得られる標準曲線から、RNAの定量を達成できる。実施例５この実施例では、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子
用のプローブの相互作用の結果として起こる新規核酸の合成を実証する。

【００５８】この実施例では、標的への第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブのハ
イブリッド形成が、三元接合部の形成をもたらす。第１のプローブのアーム領域
は、不安定化部分として直列に組み込まれた２つのヘキサエチレングリコール（
Hex）分子を含有する。第２のプローブのアーム領域にはその２つのHex分子と相
対する６個の塩基があり、それらはHexに相対して非相補ループを形成する。第１と第２のプローブのうち、互いに相補的であるが標的には相補的でない部分は
、DNAポリメラーゼによって認識される１０塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプローブ伸長を引き起こす。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精
製した。ハイブリッド形成させ伸長させたオリゴヌクレオチドの増幅ハイブリッド形成は先の実施例に記述したように、ただし５.０pmolの第１プローブ、０.０５pmolの第２プローブおよび７.５pmolのプローブ３（標的）を使
用して達成した。伸長は４単位のExo（−）PolythermaseTM（Bioline社）DNAポリメラーゼで行なった。ストレプトアビジン被覆プレートでの捕捉が可能なよう
に、第１プローブをその５'末端でビオチン化した。そのアッセイ混合物を９５ ℃に２分間加熱した後、９５℃で２０秒間、次いで６０℃で５秒間の熱サイクリ
ングを、測定可能なシグナルを生成させるのに必要なサイクル数だけ行なった。
バックグランド値を標的プローブの不在下でのサイクリングについて決定した。伸長されたプローブの捕捉と検出アッセイ混合物のうち２０μlを、１３０μlの５０mM Tris−HCl pH ８.０、１３８mM NaCl、２.７mM KCl＋０.１% BSAを含んでいる９６穴ストレプトアビジ
ン被覆マイクロタイタープレート（Labsystems社）のウェルに移した。そのプレ
ートを室温で最低３０分間振とうした。次にそれらのウェルを、１３８mM NaCl 、２.７mM KClを含む５０mM Tris−HCl pH ８.０＋０.１% Tween−２０（TBS/Tw
een−２０）で４回洗浄した。抗Digフルオレセイン標識抗体（Sigma−Aldrich社
）を１×STM（２０×SSC、０.２５％ Tween−２０、２０%脱脂粉乳、０.１%アジ
化ナトリウム）に１：１０,０００希釈し、１５０μlの抗体コンジュゲートを各
ウェルに添加してから、３７℃で１５分間インキュベートした。それらのウェル
をTBS/Tween−２０で４回洗浄した。ヒツジ抗フルオレセインアルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim社）を１×STMに１：５,０００希釈し、１５０μl
を各ウェルに添加してから、３７℃で１５分間インキュベートした。次に、それ
らのウェルをTBS/Tween−２０で４回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質緩衝液（Boehringer Mannheim社）で１回洗浄した。最後に、４−ニトロフェニルホスフェート（５mg/ml）を含有するアルカリホスファターゼ基質緩衝液を各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次にそのプレートをLa
bsystems社製EIAプレートリーダー中、４０５nmで読み取った。

【００５９】得られた結果を図６に示す。この図は、必要な試薬が全て存在している測定用
試料の（４０５nmでの）吸光度（左側）を、標的配列を欠く対照試料（中央）ま
たはブランク試料（右側）と比較して示した棒グラフである。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTHHCCACCCGGCG３'（５'−ビオチン化される場合が
ある）（配列番号２６）第２のプローブ５'GGATATCACCCGGCGGTCGTTCGTGGTTTTGCGTGCGGCGCTCCGCCGGGTGGGCGGTGTTTCCTATGA
TGAATATAGATACAGAAGCG−リン酸３'（配列番号２７）プローブ３（ヒトCFTR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼ標識されたもの）（配列番号２８
）実施例６この実施例では、遺伝子用のPNA：DNAキメラプローブの相互作用の結果として
起こる新規リボ核酸の合成を実証する。

【００６０】標的（プローブ３）への第１および第２のプローブのハイブリッド形成は、三
元接合部の形成をもたらす。第１のプローブは２つの領域、すなわちPNAからなる標的特異領域とDNAアーム領域からなり、それらは適切なC５またはC６リンカー分子（この例では５または６個のメチレン反復）で隔てられている。このリン
カーは、このプローブのPNA部分とDNA部分の間の柔軟性を増大させるのに役立つ
。第２のプローブもC５またはC６リンカーで隔てられた２つの領域、すなわち標
的特異的なPNA領域と、第１のプローブのアーム領域に一部が相補的なアーム領域からなる。第２のプローブのアーム領域はT７ RNAポリメラーゼプロモーター配列と、生成物の捕捉および検出用の配列も含有する。第１および第２のプロー
ブのうち、互いに相補的であるが標的には相補的でない部分は、DNAポリメラーゼによって認識される７塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプロー
ブ伸長を引き起こす。伸長により、DNA依存性RNAポリメラーゼによって認識され
る二本鎖の機能的プロモーター配列が生成し、RNAの標的依存的合成が起こる。オリゴヌクレオチドの調製 PNAは、カルボキシおよびアミノ官能化された基を標準的条件でカップリングすることによって形成される。PNA：DNAキメラは、C５またはC６リンカー（メチレン残基の繰り返し単位からなる）を介して形成される。オリゴヌクレオチド
プローブのビオチン化は、ビオチンホスホロアミダイトの組み込みによって達成
される。その他の場合、プローブは先の実施例に記述したように合成し、精製し
た。ハイブリッド形成させたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成は、０.６pmolの第１プローブ、５０fmolの第２プローブおよび０.５pmolのプローブ３（CFTR遺伝子の標的）をT７ RNAポリメラーゼ緩衝液
（最終濃度で４０mM Tris−HCl、pH７.９、６mM MgCl２、２mMスペルミジン、１
０mM NaCl）と共に含むアッセイ混合物中で達成される。RNアーゼフリー蒸留水で反応液量を２０μlにする（後の酵素とNTP類の添加に備える）。対照反応は第
１および第２のプローブを含むが標的（プローブ３）を含まない。その混合物を
９０℃に３分間加熱して核酸を変性させ、氷上で冷却し、３７℃に平衡させた。
DNAポリメラーゼIのクレノウ断片（３'→５'exo（−）〜２.５単位）と１μlのd
NTP混合物（１０mMの各dNTP：２'−デオキシアデノシン５'−三リン酸（dATP）、２'−デオキシチミジン５'−三リン酸（dTTP）、２'−デオキシグアノシン５'
−三リン酸（dGTP）および２'−デオキシシチジン５'−三リン酸（dCTP））を加
え、その混合物を３７℃で３０分間インキュベートして、第１のプローブの伸長
によって機能的なT７ RNAポリメラーゼプロモーターを生成させる。T７ RNAポリ
メラーゼ（４０単位）と２μlのNTP混合物（２０mMの各NTP：アデノシン５'−三
リン酸（ATP）、グアノシン５'−三リン酸（GTP）、シチジン５'−三リン酸（CT
P）、ウリジン５'−三リン酸（UTP））を加え、その反応液を３７℃でさらに１８０分間インキュベートした後、転写されたRNAの検出を行なった。合成されたRNAの捕捉と検出 RNアーゼフリーDNアーゼ（アッセイ混合物１０μlにつき１.６単位のDNアーゼ
を添加し、３７℃で１５分間インキュベート）を使って、DNA（第１および第２のプローブの一部とプローブ３）をアッセイ混合物から除去する、処理したアッ
セイ試料の各５μlを１対ずつ、ストレプトアビジン被覆ウェル中の、０.９pmol
のプローブ４（特異的なビオチン化捕捉オリゴヌクレオチド）と１２pmolのプロ
ーブ５（特異的なアルカリホスファターゼ官能化オリゴヌクレオチド）とを含有
する１４５μlのハイブリダイゼーション緩衝液（５０mM Tris−HCl、pH８.０、
１M NaCl、２０mM EDTAおよび０.１%BSA）に加えた。インキュベーション（３０
０rpmで振とうしながら室温で６０分間）により、そのRNAを、ビオチン化捕捉プ
ローブを介してウェルに固定化させ、検出プローブにアニールさせる。TBS/０. １%Tween−２０で４回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質緩衝液（Boehri
nger Mannheim社）で１回洗浄することにより、未結合の物質を除去する。最後に、４−ニトロフェニルホスフェート（５mg/ml）を含有するアルカリホスファターゼ基質緩衝液を各ウェルに添加する。そのプレートを、Labsystems社製EIA プレートリーダー中、３７℃でインキュベートし、２分置きに４０５nmでの表示
値を読み取る。

【００６１】上述のように、代替検出系では、励起フィルター（３４０nm）および放射フィ
ルター（６１５nm）とWallac Victor １４２０マルチラベルカウンターを用いる
時間分解蛍光検出に、ユウロピウム標識プローブ５（EG&G Wallac社）を使用できるだろう。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ PNAは小文字で示し、DNAは大文字で示す。選択されたリンカー
（C５またはC６）を〜で示す。５'aaagaaaatatcatcttt〜CTGAAAT３' 第２のプローブ（PNAは小文字、DNAは大文字、〜＝リンカー）５'CCTTGTCTCCGTTCTGGATATCACCCGATGTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCAG〜 ggtg
tttcctatgatg３'（配列番号２９）プローブ３（ヒトCFTR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４（捕捉プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT３'（５'−ビオチン化されたもの）（配列番号３０）プローブ５（検出プローブ）５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたも
の）（配列番号２８）実施例７この実施例では標的を再びCFTR遺伝子とした。第１および第２のプローブはそ
れぞれのアーム部分に一つのHex残基を含有した。これらのプローブのうち、互いに相補的であるが標的には相補的でない部分は、DNAポリメラーゼによって認識される１０塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプローブの伸長を
引き起こす。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精
製した。ハイブリッド形成させ伸長させたオリゴヌクレオチドの増幅ハイブリッド形成は実施例５に記述したように行なったが、５.０pmolの第１プローブ、０.０５pmolの第２プローブおよび７.５pmolのプローブ３（標的）を
含有するハイブリダイゼーション混合物を使用した。伸長と増幅は実施例５に記
述したように行なった。伸長されたプローブの捕捉と検出も実質的に実施例５に
記述したように行なった。

【００６２】得られた結果を図７に示す。この図は、必要な試薬が全て存在している測定用
試料の（４０５nmでの）吸光度（左側）を、標的配列を欠く対照試料（中央）ま
たはブランク試料（右側）と比較して示した棒グラフである。これらの結果から
、ほとんど同じ量のシグナルが標的を含まない試料によって生成されることが明
らかであり、この例では、第１プローブと第２プローブの両方への不安定化部分
の包含が、一つのプローブへの不安定化部分の包含よりも好ましくないことが示
唆される。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTHCCACCCGGCG３'（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号３１）第２のプローブ５'GGATATCACCCGATGTGCGGCGCTCCGCCGGGTGGHTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCG −リン酸３'（配列番号３２）プローブ３（ヒトCFTR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼ標識されたもの）（配列番号２８
）実施例８この実施例での標的配列はCFTR遺伝子とした。配置は、第２のプローブの標的
非相補アームが、不安定化部分として直列に組み込まれた２つのヘキサエチレン
グリコール（Hex）分子を含むようなものとした。第１プローブのアームには、それらのHexに相対して非相補ループを形成する６つの塩基がある。また、プローブ３（標的）にも、三元接合部の「角」を回って続いているHex二量体からもたらされる２つの非相補塩基がある。第１および第２のプローブのうち、互いに
相補的であるが標的には相補的でない部分は、DNAポリメラーゼによって認識される９塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプローブの伸長を引き起
こす。このアッセイには、核酸合成を増幅し増進させるために、さらにもう一つ
のプローブ（プローブ４）を使用してもよい。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精
製した。ハイブリッド形成させ伸長させたオリゴヌクレオチドの増幅ハイブリッド形成、伸長および増幅は実施例３に記述した通りに行なった。増
幅された伸長されたプローブの捕捉と検出も実施例３に記述した通りに行なった
。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'TTAAAGAAAATATCATCTTTGCCCACCCGGCGGAG３'（５'−ビオチン化される場合があ
る）（配列番号３３）第２のプローブ５'GGATATCACCCGATGTGCGGCGCTCCGCCGGHHTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCG−リ
ン酸３'（配列番号３４）プローブ３（ヒトCTFR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４５'GGATATCACCCGATGTG３'（５'−ビオチン化される場合がある）（配列番号１４
）プローブ５５'TTAAAGAAAATATCA３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたもの）（配列番号２３）得られた結果を図８に示す。この図は、必要な試薬がすべて存在している測定
用試料の（４０５nmでの）吸光度（左側）を、標的配列を欠く対照試料（中央）
またはブランク試料（右側）と比較して示した棒グラフである。実施例９この実施例でも標的はCFTR遺伝子の配列に相当するオリゴヌクレオチドとした
。この実施例を図９に模式図的に図解する。図９に関して、第２のプローブ（６
）のアーム（１４）は、不安定化部分（１６）を構成する直列に組み込まれた２
つのヘキサエチレングリコール（Hex）分子、T７ RNAポリメラーゼプロモーター
配列（２２）（最適なプロモーター活性と連続移動性にとって欠かせない＋１２
塩基配列を伴っている；Milliganら,１９８７ Nucl.Acids Res.１５,８７８３−
８７９８）、生成物の捕捉（２６）および検出（２４）用の配列を含有した。第
１のプローブ（４）のアーム領域（１０）にはそれら２つのHex分子に相対する６個の塩基があり、それらはHexに相対して非相補ループを形成する。第１および第２のプローブのうち、互いに相補的であるが標的には相補的でない部分は、
DNAポリメラーゼによって認識される５塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプローブの伸長を引き起こす。伸長により、DNA依存性RNAポリメラーゼ
によって認識される二本鎖の機能的プロモーター配列が生成し、それがRNAの合成につながる。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精製
した。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成とRNA合成は実施例６に記述した通りに行なった。合成されたRNAの捕捉と検出も実施例６に記述した通りに行なった。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'GCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGCCCACGAAAT３'（配列番号３５）第２のプローブ５'CCTTGTCTCCGTTCTGGATATCACCCGATGTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCHHGGTGTTT
CCTATGATGAATATAGATACAGAAGCG−リン酸３'（配列番号３６）プローブ３（ヒトCFTR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４（捕捉プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT３'（５'−ビオチン化されたもの）（配列番号３０）プローブ５（検出プローブ）５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたも
の）（配列番号２８）得られた結果を図１０に示す。この図は、必要な試薬がすべて存在している測
定用試料の（４０５nmでの）吸光度（左側）を、標的配列を欠く対照試料（中央
）またはブランク試料（右側）と比較して示した棒グラフである。実施例１０標的中の欠失/挿入によって生じる第１プローブ中の不対塩基この実施例では、新規リボ核酸の合成が野生型標的と突然変異型標的の識別に
どのように利用できるかを示す。選択した標的は野生型CFTR遺伝子配列と、ΔF ５０８突然変異を持つ対応する配列である。２塩基挿入を持つもう一つの標的も
一覧に載せる。これらの突然変異は野生型標的で得られるものと比較したときの
シグナルの減少によって検出される。この実施例を図１１A〜１１Dに模式図的に
図解する。

【００６３】図１１Aと１１Bに関して、野生型標的（２）（プローブ３a）への第１および第２のプローブ（４、６）のハイブリッド形成は三元接合部の形成をもたらす。
第１のプローブ（４）の標的特異領域（８）はF５０８領域を覆っていて、プローブ（４）が欠失を持つ標的（プローブ３c）とハイブリッド形成した時に領域（８）がループを形成するようになっている（図１１C）。逆に、挿入を持つ突然変異型標的（プローブ３b）では、標的が三元接合点に２塩基ループを形成する（図１１D）。第２のプローブ（６）のアーム領域（１４）は、不安定化部分（１６）として直列に組み込まれた２つのヘキサエチレングリコール（Hex）分子、T７ RNAポリメラーゼプロモーター配列（２２）、生成物の捕捉（２６）および検出（２４）用の配列を含む。第１のプローブのアーム領域（１０）には、
それら２つのHex分子に相対する６個の塩基があり、それらはHexに相対して非相
補ループを形成する。第１および第２プローブのうち、互いに相補的であるが標
的には相補的でない部分は、DNAポリメラーゼによって認識される５塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプローブの伸長を引き起こす。伸長により
、DNA依存性RNAポリメラーゼによって認識される二本鎖の機能的プロモーター配
列が生成し、それがRNAの合成につながる。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精
製した。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成（野生型か突然変異型標的の一つを使用）とRNA合成は実施例６に記述した通りに行なった。合成されたRNAの捕捉と検出も実施例６に記述した通りに行なった。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'GCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGCCCACGAAAT３'（配列番号３５）第２のプローブ５'CCTTGTCTCCGTTCTGGATATCACCCGATGTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCHHGGTGTTT
CCTATGATGAATATAGATACAGAAGCG−リン酸３'（配列番号３６）プローブ３a（ヒトCFTR遺伝子の領域−野生型、５０８領域に下線）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ３b（ヒトCFTR遺伝子の領域−下線部の２塩基挿入を持つ）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCTTAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCA
GGCATAATCCAGG３'（配列番号３７）プローブ３c（ヒトCFTR遺伝子の領域−ΔF５０８突然変異を持つ）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGGCAT
AATCCAGG３'（配列番号３８）プローブ４（捕捉プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT３'（５'−ビオチン化されたもの）（配列番号３０）プローブ５（検出プローブ）５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたも
の）（配列番号２８）図１２は上記の実施例から得られた結果を示す棒グラフである。生成したシグ
ナルの量（４０５nmでの吸光度）は野生型標的配列（左端）が最も高く、２塩基
挿入突然変異体（中央左側）と３塩基欠失突然変異体（中央右側）で得られるシ
グナルの量はそれより少なかった。標的の不在下では極めてわずかなシグナル（
バックグラウンド）しか生成しなかった（右端）。実施例１１ヒトGP３aエキソン１０を用いた一塩基突然変異分析この実施例では、新規リボ核酸の合成が、野生型の標的と一塩基突然変異を持
つ標的との識別にどのように利用できるかを示す。この系はGP３aエキソン１０について３６３位でのGからAへの単突然変異を検出するように設計されたが、他
の標的配列中の一塩基突然変異を検出するように適合させることは容易にできる
だろう。この実施例を図１３A〜１３Cに模式図的に図解する。

【００６４】図１３Aに関して、標的（２）（プローブ３a）への第１および第２のオリゴヌ
クレオチドプローブ（４、５）のハイブリッド形成は三元接合部の形成をもたら
す。第２のプローブ（６）の標的特異領域（１２）は、GP３aエキソン１０の３６３突然変異部位を取り囲む領域にハイブリッド形成する。プローブ（６）のア
ーム領域（１４）は、不安定化部分（１６）として直列に組み込まれた２つのヘ
キサエチレングリコール（Hex）分子、T７ RNAポリメラーゼプロモーター配列（
２２）、生成物の捕捉（２６）および検出（２４）用の配列を含む。第１プロー
ブのアーム領域（１０）にはそれら２つのHex分子に相対する６個の塩基があり、それらはHexに相対して非相補ループを形成する。第１および第２のプローブ（４、６）のうち、互いに相補的であるが標的には相補的でない部分は、DNAポリメラーゼによって認識される５塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件で
のプローブの伸長を引き起こす。伸長によって二本鎖の機能的プロモーター配列
が生成し、次にそれがDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されて、RNAの合成をもたらす。

【００６５】識別は、野生型標的とハイブリッド形成した時に２塩基ループを形成するよう
に第２のプローブ（６）の標的特異領域を設計することによって達成される（図
１３B）。GからAへの一塩基変異は、突然変異型標的とのハイブリッド形成時に、より大きな３塩基ループアウトが形成されて、シグナルに変化が生じることを
意味する（図１３C）。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精
製した。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成（野生型か突然変異型標的配列を使用）とRNA合成は実施例６に記述した通りに行なった。合成されたRNAの捕捉と検出も実施例６に記述した通りに行なった。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ５'GGGCTGACCCTCCCGGGGGCTGCGCCCACGAAAT３'（配列番号３９）第２のプローブ５'CCTTGTCTCCGTTCTGGATATCACCCGATGTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCHHACTCTCG
TCCTGCTGGGAAGGGCGATAGT−リン酸３'（配列番号４０）プローブ３a（GP３aエキソン１０の領域−野生型、プローブ３bで変化させる塩基の位置に下線）５'TGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAGTGCAGCCCCCGGGAGGGTCAGCCCGT
CTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCT３'（配列番号４１）プローブ３b（GP３aエキソン１０の領域−GからAへの突然変異の位置に下線）５'TGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCCGGGAGGGTCAGCCCGT
CTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCT３'（配列番号４２）プローブ４（捕捉プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT３'（５'−ビオチン化されたもの）（配列番号３０）プローブ５（検出プローブ）５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたも
の）（配列番号２８）実施例１２標的中の欠失/挿入によって生じる第２プローブ中の不対塩基この実施例では、新規リボ核酸の合成が野生型標的と突然変異型標的の識別に
どのように利用できるかを示す。選択した標的は、種々の塩基の欠失または変異
を持つまたは持たない遺伝子である。この実施例では、それらの突然変異が、野
生型標的が与えるものと比較した場合の生成するシグナルの増加によって検出さ
れる。この実施例を図１４に模式図的に図解する。

【００６６】図１４Aに関して、標的（２）（プローブ３a）への第１および第２のオリゴヌ
クレオチドプローブ（４、６）のハイブリッド形成は、第２プローブの脚領域が
標的と完全な塩基対形成をしている三元接合部の形成をもたらす（図１４B）。第２のプローブ（６）の標的特異領域（１２）は、標的（２）の中の２または３
塩基欠失を含みうる領域を覆っている。したがってプローブ（６）は、突然変異
型標的とハイブリッド形成した時に、２または３塩基のループを形成する（図１
４C 、D）。プローブ（６）のアーム領域（１４）は、不安定化部分（１６）として直列に組み込まれた２つのヘキサエチレングリコール（Hex）分子、T７ RNA
ポリメラーゼプロモーター配列（２２）、生成物の捕捉（２６）および検出（２
４）用の配列を含む。第１のプローブのアーム領域（１０）にはそれら２つのHe
x分子に相対する６個の塩基があり、それらはHexに相対して非相補ループを形成
する。プローブ（４）と（６）のうち、互いに相補的であるが標的には相補的で
ない部分は、DNAポリメラーゼによって認識される５塩基対の領域を形成し、それがアッセイ条件でのプローブの伸長を引き起こす。伸長により、DNA依存性RNA
ポリメラーゼによって認識される二本鎖の機能的プロモーター配列が生成し、そ
れがRNAの合成につながる。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクレオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精
製した。ハイブリッド形成させたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成（野生型標的［プローブ３a］か突然変異型標的［プローブ３b〜３d］の一つを使用）とRNA合成は実施例６に記述した通りに行なった。合成されたRNAの捕捉と検出は実施例６に記述した通りに行なった。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ（伸長プローブ）５'GCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGCCCACGAAAT３'（配列番号３５）第２のプローブ（鋳型プローブ）５'CCTTGTCTCCGTTCTGGATATCACCCGATGTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCHHGGTGTTT
CCTATGATGAATATAGATACAGAAGCG−リン酸３'（配列番号３６）プローブ３a（ヒトCFTR遺伝子の領域−野生型、他のプローブで欠失または改変される塩基の領域に下線）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ３b（ヒトCFTR遺伝子の領域−↓で示した部位に３塩基欠失を持つ）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAA↓CAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGGC
ATAATCCAGG３'（配列番号４３）プローブ３c（↓で示した部位に２塩基欠失を持つヒトCFTR遺伝子の領域）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCAT↓AGGAAACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号４４）プローブ３d（ヒトCFTR遺伝子の領域、プローブ３cとの相違点は、↓で示すCからAへの一塩基変化）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGA↓AAACAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号４５）プローブ４（捕捉抗体）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT３'（５'−ビオチン化されたもの）（配列番号３０）プローブ５（検出抗体）５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたも
の）（配列番号２８）図１５は上記の実施例から得られた結果を示す棒グラフである。生成したシグ
ナルの量（４０５nmでの吸光度）は標的依存的であることが明らかになった。野
生型標的（左端）については、「標的なし」の対照（右端）に存在するバックグ
ラウンドシグナルより、はるかに大きいシグナルが得られた。しかし、標的への
ハイブリッド形成時に第２のプローブ中に２塩基ループの形成を引き起こす突然
変異が標的中に存在すると（中央右側）、予想外にも、シグナルの増加が起こっ
た。さらに一層意外なことに、第２のプローブ中に３塩基ループの形成を引き起
こす突然変異型標的の使用によって、シグナルの量はさらに増加した（中央左側
）。実施例１３：三元接合部からの転写によるリボザイムの形成この実施例ではヒトCFTR遺伝子に関するプローブの相互作用の結果として起こ
る新規リボ核酸の合成を実証する。生成するRNAは既知のリボザイム（Clouet−D
'OrvalおよびUhlenbeck １９９６, RNA ２:４８３−４９１）の配列を持ち、二重標識一本鎖オリゴヌクレオチドに結合して機能的リボザイムを形成できる。次
に、その標識オリゴヌクレオチド（分子ビーコン）の特定部位での切断がシグナ
ルを生成させることになる。

【００６７】標的（プローブ３）への２つのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリッド形
成は三元接合部の形成をもたらす。第１のプローブは２つの領域、すなわち標的
特異領域とアーム領域からなる。第２のプローブも同様に標的特異領域と、第１
のプローブのアーム領域に一部が相補的なアーム領域からなる。第２のプローブ
のアーム領域は、直列に組み込まれた２つのヘキサエチレングリコール（Hex）分子、T７ RNAポリメラーゼプロモーター配列、転写効率を最適化するための＋１２bp配列、シグナルの末端検出に備えたリボザイム生成用の配列も含有する。
第１のプローブにはそれら２つのHex分子に相対する６個の塩基があり、それらはHexに相対して非相補ループを形成する。

【００６８】第１および第２のプローブのうち、互いに相補的であるが標的には相補的でな
い部分は、DNAポリメラーゼによる認識に必要な８塩基対の重なりを形成し、それがアッセイ条件でのプローブの伸長を引き起こす。伸長により、DNA依存性RNA
ポリメラーゼによって認識される二本鎖の機能的プロモーター配列が生成し、リ
ボザイムの配列を持つRNAの合成（第２のプローブを鋳型とする）が起こる。次に、生成したRNAが、蛍光体と消光体で二重に標識されたRNAオリゴヌクレオチド
（プローブ４）にアニールする。リボザイム活性がプローブ４を切断し、蛍光体
を消光体から分離することで、シグナルを生成させる。オリゴヌクレオチドの調製オリゴヌクオチドプローブはすべて先の実施例に記述したように合成し、精製
した。蛍光体分子と消光体分子は製造者の特許方法（Oswel社）によってオリゴヌクレオチドに取り付ける。

【００６９】リボザイム基質RNAオリゴヌクレオチドは、適当なNTP類似体を組み込むことに
より、（臨床試料に存在しそうな）混入RNアーゼによる切断から保護してもよい
。オリゴヌクレオチドプローブのビオチン化はビオチンホスホロアミダイトの組
み込みによって達成される。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成は、０.２pmolの第１プローブ、５０fmolの第２プローブおよび０.５pmolのプローブ３（CFTR遺伝子の標的）をT７ RNAポリメラーゼ緩衝液
（最終濃度で４０mM Tris−HCl、pH７.９、６mM MgCl２、２mMスペルミジン、１
０mM NaCl）と共に含むアッセイ混合物中で達成される。RNアーゼフリー蒸留水で反応液量を２０μlにする（後の酵素とNTPの添加に備える）。対照反応は第１
および第２のプローブを含むが標的（プローブ３）を含まない。

【００７０】その混合物を９０℃に３分間加熱して核酸を変性させた後、１０℃まで（０. １℃/秒のランピングで）冷却する。BstDNAポリメラーゼ（〜８単位）、１μlの
dNTP混合物（０.１mMの各dNTP：２'−デオキシアデノシン５'−三リン酸（dATP ）、２'−デオキシチミジン５'−三リン酸（dTTP）、２'−デオキシグアノシン５'−三リン酸（dGTP）および２'−デオキシシチジン５'−三リン酸（dCTP））、T７ RNAポリメラーゼ（４０単位）および２μlのNTP混合物（２０mMの各NTP：
アデノシン５'−三リン酸（ATP）、グアノシン５'−三リン酸（GTP）、シチジン
５'−三リン酸（CTP）、ウリジン５'−三リン酸（UTP））を加え、その混合物を
３７℃で３時間インキュベートする。これにより、第１のプローブが伸長されて
、機能的なT７ RNAポリメラーゼプロモーターが生成する。このプロモーターはT
７ RNAポリメラーゼによって認識され、転写によってRNAが生成する。合成されたRNAの検出 RNアーゼフリーDNアーゼ（アッセイ混合物１０μlにつき１.６単位のDNアーゼ
を添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、９０℃で３分間加熱し、１５℃
に冷却）を使って、DNAをアッセイ混合物から除去する。処理したアッセイ試料の適当な希釈液各５μlを１対ずつ、１００μlの緩衝液（５０mM Tris−HCl、pH
７.５、２０mM MgCl２、１０%エタノール）に加え、次にリボザイム基質である１０pmolのプローブ４（二重標識RNA、５'−Tamra、３'−Fam）を加えた。三元接合部の標的依存的RNA産物は、対応する「ハンマーヘッド」リボザイムになるように設計される。プローブ４はそのRNA産物にアニールして機能的なリボザイムを生成させる。消光体を蛍光体から分離させる基質のリボザイム切断は、蛍光
検出（Famは４８５nmで励起、５３５nmで放射）によってモニターできる。もう一つの選択肢として、基質の切断は蛍光偏光法でも測定できるだろう。基質の回
転が可能なので（一つのリボザイムで５０基質分子を切断しうる）、この検出工
程中に、あるレベルの増幅が達成されうる。代替実時間検出系リボザイム基質分子が適当な緩衝液条件で伸長/転写反応混合物中に存在する場合は、実時間検出が可能だろう。代替検出系 RNA産物は、ビオチン化された捕捉プローブを介してストレプトアビジン被覆ウェルに捕捉されうるように、捕捉配列を含んでもよい。未結合の物質を除去す
るための洗浄段階の後、プローブ４を加えてリボザイム切断を上述のようにモニ
ターできるだろう。

【００７１】代わりのラベルをリボザイム基質分子に取り付けることもできるだろう。オリゴヌクレオチドの一覧第１のプローブ（伸長プローブ）５'GCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGCCCACTTCGAAAT３'（配列番号４６）第２のプローブ（鋳型プローブ）５'GAATCTCATCAGTAGCGAGCTCTCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGAAHHGGTGTTTCCTAT
GATGAATATAGATACAGAAGCG−リン酸３'（配列番号４７）プローブ３５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４（リボザイム基質）５'Tamura−GAAUCGAAACGCGAAAGCGUCUAGCGU−Fam３'（配列番号４８）実施例１４：標的核酸中の欠失突然変異の検出この例では、野生型CFTR遺伝子と３塩基欠失を持つ標的（嚢胞性線維症の原因
となるΔ５０７）との識別が、PNA/DNAキメラであるプローブを用いてどのように達成できるかを示す。

【００７２】第１および第２プローブの標的相補部分はPNAからなり、標的非相補部分はDNA
からなる。各プローブのPNA部分とDNA部分はヘキサメチレンリンカー（第１のプ
ローブ）またはペンタメチレンリンカー（第２のプローブ）でつながれており、
それらのリンカーは本発明に従って不安定化部分として働く。第２のプローブの
DNAアームはT７ RNAポリメラーゼプロモーター配列、転写効率を最適化するため
の１２bp配列、生成物の捕捉および検出用の配列も含む。

【００７３】プローブ１および２のうち、互いに相補的であるが標的には相補的でない部分
は、DNAポリメラーゼによる認識に必要な７塩基対の重なりを形成し、それがアッセイ条件でのプローブ伸長を引き起こす。伸長により、T７ DNA依存性RNAポリ
メラーゼによって認識される二本鎖の機能的プロモーター配列が生成し、それが
RNAの合成をもたらす。

【００７４】第１および第２のプローブと標的との相互作用は、突然変異型標的（プローブ
４）では野生型（プローブ３）よりはるかに効率が悪いので、突然変異の識別が
達成される。オリゴヌクレオチドの調製 DNAオリゴヌクレオチドプローブは先に記述したように合成した。PNAオリゴヌ
クレオチドは、製造者の特許方法（PNA Diagnostics社、デンマーク・コペンハーゲン）を用いて調製した。キメラを形成させるために、PNAオリゴヌクレオチドとDNAオリゴヌクレオチドを、特許方法により、ペンタ−またはヘキサ−メチレンリンカーを介してつないだ。オリゴヌクレオチドプローブのビオチン化は、
ビオチンホスホロアミダイトの組み込みによって達成した。アルカリホスファタ
ーゼで官能化されたオリゴヌクレオチドは、製造者の特許方法（Oswel社）を使って調製した。オリゴヌクレオチドはすべて標準的技術を使ってHPLC精製した。ハイブリッド形成させたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成は、０.２pmolの第１プローブ、５０fmolの第２プローブおよび５０fmolのプローブ３またはプローブ４（標的）を含有するアッセイ混合物
中で、またその他の条件は実施例６に記述したようにして達成した。その混合物
を９０℃に３分間加熱して核酸を変性させ、ランピング（０.１℃/秒）によって
４７℃まで冷却した後、４７℃に維持した。４７℃にとどまっている試料に、Bs
tDNAポリメラーゼ（８単位）、１μlのdNTP混合物（１０mMの各dNTP：２'−デオ
キシアデノシン５'−三リン酸（dATP）、２'−デオキシチミジン５'−三リン酸（dTTP）、２'−デオキシグアノシン５'−三リン酸（dGTP）および２'−デオキシシチジン５'−三リン酸（dCTP））を加えた。その混合物を４７℃で３０分間インキュベートしてプローブ１を伸長させることにより、機能的なT７ RNAポリメラーゼプロモーターを生成させた。試料温度を３７℃に下げ、T７ RNAポリメラーゼ（４０単位）と２μlのNTP混合物（２０mMの各NTP：アデノシン５'−三リ
ン酸（ATP）、グアノシン５'−三リン酸（GTP）、シチジン５'−三リン酸（CTP ）、ウリジン５'−三リン酸（UTP））を加え、その反応液を３７℃でさらに１８
０分間インキュベートした後、転写されたRNAの検出を行なった。

【００７５】合成されたRNAの捕捉と検出は実施例６に記述したように行なった。得られた結果を図１６に示す。この図は、生成したRNAを野生型標的の存在下で生成した量に対する百分率で示す棒グラフである。野生型標的（左側）は定義
として１００%のRNAを生成させる。これに対し、突然変異型標的（中央）によっ
て生成するRNAまたは対照（標的なし、右側）で生成するRNAの量は約５%だった。オリゴヌクレオチドの一覧大文字はDNAを表し、小文字はPNAを表す。C６またはC５は、それら２つの領域
を結ぶヘキサ−またはペンタ−メチレンリンカーを示す。第１のプローブ（伸長プローブ） agaaaatatcatcttt−C６−５'CTGAAAT３' 第２のプローブ（鋳型プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCTGGATATCACCCGATGTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCAG３
'C５−ggtgtttcctatgatg（配列番号４９）プローブ３（標的−野生型）プローブ４から欠失させた３個の塩基を下線で示し
てある。５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４（標的−欠失突然変異体）嚢胞性線維症の原因となるΔ５０７突然変
異を模倣するために３つの塩基を（矢印で示す位置から）欠失させてあることを
除いて、配列はプローブ３と同じである。欠失させた領域は、三元接合部中の接
合部位から３塩基離れて、伸長オリゴヌクレオチド脚部の下にある。５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAA↓GATATTTTCTTTAATGGTGCCAGGC
ATAATCCAGG３'（配列番号５１）プローブ５（捕捉プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT３'（５'−ビオチン化されたもの）（配列番号３０）プローブ６（検出プローブ）５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたも
の）（配列番号２８）実施例１５：標的核酸中のSNPsの検出この実施例では、標的核酸中の一塩基置換同士を識別するためにキメラPNA/DN
Aプローブを使用する。先の実施例と同様に、第１および第２のプローブは、C６
またはC５リンカーで非標的相補DNA部分につながれた標的相補PNA部分を含有した。

【００７６】第２のプローブのDNAアームは、T７ RNAポリメラーゼプロモーター配列、転写
効率を最適化するための１２bp配列、生成物の捕捉および検出用の配列も含有し
た。第１および第２のプローブのうち、互いに相補的であるが標的には相補的で
ない部分は、DNAポリメラーゼによる認識に必要な７塩基対の重なりを形成し、それがアッセイ条件でのプローブの伸長を引き起こす。伸長により、T７ DNA依存性RNAポリメラーゼによって認識される二本鎖の機能的プロモーター配列が生成し、それがRNAの合成をもたらす。

【００７７】第１および第２のプローブと標的との相互作用は突然変異型標的（プローブ４
、５または６）では野生型標的（プローブ３）より効率がよくないので、突然変
異の識別が達成される。

【００７８】オリゴヌクレオチドはすべて先の実施例に記述したように調製した。ハイブリッド形成させたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成は、０.６pmolの第１プローブ、５０fmolの第２プローブおよび０.５pmolのプローブ３、４、５または６（標的）と、T７ RNAポリメラーゼ
緩衝液とを含むアッセイ混合物中で達成した。それ以降の処理（DNA伸長、転写、RNA産物の捕捉および検出）は実施例１４に記述したように行なった。オリゴヌクレオチドの一覧大文字はDNAを表し、小文字はPNAを表す。C６またはC５は、そのPNA/DNAをつなぐヘキサ−またはペンタ−メチレンリンカーを示す。第１のプローブ（伸長プローブ） gaaaatatcatcttt−C６−５'CTGAAAT３' 第２のプローブ（鋳型プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCTGGATATCACCCGATGTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCAG３
'−C５−ggtgtttcctatgatg（配列番号４９）プローブ３（標的−野生型）５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号２２）プローブ４（一塩基置換を持つ標的）一塩基が変化している（下線部）ことを除
いて、配列はプローブ３と同じである。この突然変異は、三元接合部中の接合部
位から１０塩基離れて、鋳型プローブ脚部の下にある。５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATCGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号５１）プローブ５（一塩基置換を持つ標的）一塩基が変化している（下線部）ことを除
いて、配列はプローブ３と同じである。この突然変異は、三元接合部中の接合部
位から８塩基離れて、伸長プローブ脚部の下にある。５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATAGGAAACACCAAAGATGCTATTTTCTTTAATGGTGCCAGG
CATAATCCAGG３'（配列番号５２）プローブ６（一塩基置換を持つ標的）プローブ４と５で変化させた２つの位置の
それぞれで一塩基が変化している（下線の位置）ことを除いて、配列はプローブ
３と同じである。５'GATGACGCTTCTGTATCTATATTCATCATCGGAAACACCAAAGATGCTATTTT
CTTTAATGGTGCCAGGCATAATCCAGG３'（配列番号５３）プローブ７（捕捉プローブ）５'TGCCTCCTTGTCTCCGTTCT３'（５'-ビオチン化されたもの）（配列番号３０）プローブ８（検出プローブ）５'GGATATCACCCG３'（アルカリホスファターゼまたはユウロピウム標識されたも
の）（配列番号２８）得られた結果を図１７に示す。この図は、生成したRNAを野生型標的の存在下で生成した量に対する％で示す棒グラフである。野生型標的（左側）は定義とし
て１００%のRNAを生成させる。これに対し、突然変異型標的（１、２および３と
記した部分）または対照（標的なし、右側）で生成するRNAは有意に少ない。実施例１６：三元接合部での最適化された伸長／転写この実施例はいくつかのアッセイ条件の最適化に関する。要するに、実施例９
を、その実施例で使用したものと同じプローブを使って繰返したが、アッセイ条
件は基本的に実施例１４に記述したとおりにした。ハイブリッド形成された鋳型
プローブ（第２のプローブ）の伸長を、以下に記述するように高または低濃度の
dNTP類を使って行なった。ハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドからのRNAの合成ハイブリッド形成は実施例１４に記述したように０.２pmolの第１プローブ、５０fmolの第２プローブおよび５０fmolのプローブ３（CFTR遺伝子の標的）を含
むアッセイ混合物中で行なった。しかし、BstDNAポリメラーゼ（８単位）による
伸長は、０.１mMまたは１０mM dNTP類のdNTP混合物１μlを使って行なった。転写は実施例１４に記述したように行なった。次に、合成されたRNAの捕捉と検出を、やはり実施例１４に記述したように行なった。典型的な結果を図１８に示す
。

【００７９】図１８は、高濃度（５００μM）（１と２）または低濃度（５μM）（３と４）
のdNTP類で、標的の存在下（１と３）または不在下に生成するRNAの量（単位fMo
l）を示す棒グラフである。標的の不在下では、事実上RNAは生成しないが、標的
の存在下ではどちらのdNTP濃度でもかなりの量が生成する。しかし生成するRNA は、低いdNTP濃度の方が有意に多い（２倍以上の増加）。dNTP類の濃度が高すぎ
るとRNAポリメラーゼが阻害されるようである。このタイプのアッセイではおそらく１〜１０μMぐらいの濃度がdNTP類に関してほぼ最適だろう。

【００８０】配列表（１）一般情報（ｉ）出願人（Ａ）名称：サイトセル・リミテッド（Ｂ）ストリート：トリニティ・ウェイ、ソマービル・コート、ユニット・
６（Ｃ）シティ：バンベリー、アダーベリー（Ｅ）国籍：イギリス（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０Ｘ１７３ＳＮ（Ｇ）電話番号：（０１２９５）８１０９１０（Ｈ）ファクシミリ番号：（０１２９５）８１２３３３（ｉｉ）発明の名称：修飾核酸プローブおよびその使用（ｉｉｉ）配列の総数：５３（ｉｖ）コンピュータで読取可能な形式（Ａ）媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパティブル（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩＮＲｅｌｅａｓｅ♯１．０、Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ♯１．３０（ＥＰＯ）（２）配列番号１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１ ATCGTCAGTC CC 12 （２）配列番号２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２ GCTCTCTCTC CC 12 （２）配列番号３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３ ATCCTCTCTC CC 12 （２）配列番号４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４ GTTCTCTCTC CC 12 （２）配列番号５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号５ GATGTGTCTC CC 12 （２）配列番号６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号６ GTTGTGTCTC CC 12 （２）配列番号７の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号７ ATCCTCGTGC CC 12 （２）配列番号８の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号８ GCTCTCGTGC CC 12 （２）配列番号９の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号９ GTTCTCGTGC CC 12 （２）配列番号１０の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１０ GTTGTGGTGC CC 12 （２）配列番号１１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１１ GCTCAGTTTA CTAGTGCCAT TTGTTCGCCC ACGCGGCGGA G 41 （２）配列番号１２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６３塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１２ GGATATCACC CGATGTGCGG CGCTCCGCCG CNNAGTGGTT CGTAGGGCTT TCCCCCACTG 60 TTT 63 （２）配列番号１３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：７１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１３ AACTGAAAGC CAAACAGTGG GGGAAAGCCC TACGAACCAC TGAACAAATG GCACTAGTAA 60 ACTGAGCCAG G 71 （２）配列番号１４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１４ GGATATCACC CGATGTG 17 （２）配列番号１５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１５ TACTAGTGCC ATTTG 15 （２）配列番号１６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４９塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１６ AAACAGAAGC ATTCTCAGAA ACTTCTCAGT GATGGCCCAC GCGGCGGAG 49 （２）配列番号１７の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１７ GGATATCACC CGATGTGCGG CGCTCCGCCG CNNTTTGCAT TCAGCTCATG GAGTTGAACA 60 CTTCC 65 （２）配列番号１８の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１８ CTATGAAAGG AAGTGTTCAA CTCCATGAGC TGAATGCAAA CATCACTGAG AAGTTTCTGA 60 GAATGCTTCT GTTTGATTTT 80 （２）配列番号１９の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号１９ AAACTTCTCA GTGAT 15 （２）配列番号２０の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４３塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２０ TGGCACCATT AAAGAAAATA TCATCTTTGC CCACCCGGCG GAG 43 （２）配列番号２１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２１ GGATATCACC CGATGTGCGG CGCTCCGCCG GNNGGTGTTT CCTATGATGA ATATAGATAC 60 AGAAGCG 67 （２）配列番号２２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２２ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACACCA AAGATGATAT TTTCTTTAAT 60 GGTGCCAGGC ATAATCCAGG 80 （２）配列番号２３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２３ TTAAAGAAAA TATCA 15 （２）配列番号２４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：５２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２４ GATTATGCCT GGCACCATTA AAGAAAATAT CATCTTTGCC CACCCGGCGG AG 52 （２）配列番号２５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：７１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２５ GGATATCACC CGATGTGCGG CGCTCCGCCG GNNNNNNGGT GTTTCCTATG ATGAATATAG 60 ATACAGAAGC G 71 （２）配列番号２６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：３７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２６ GGCACCATTA AAGAAAATAT CATCTNNCCA CCCGGCG 37 （２）配列番号２７の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８９塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２７ GGATATCACC CGGCGGTCGT TCGTGGTTTT GCGTGCGGCG CTCCGCCGGG TGGGCGGTGT 60 TTCCTATGAT GAATATAGAT ACAGAAGCG 89 （２）配列番号２８の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２８ GGATATCACC CG 12 （２）配列番号２９の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号２９ CCTTGTCTCC GTTCTGGATA TCACCCGATG TGTCTCCCTA TAGTGAGTCG TATTAATTTC 60 AG 62 （２）配列番号３０の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：２０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３０ TGCCTCCTTG TCTCCGTTCT 20 （２）配列番号３１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：３６塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３１ GGCACCATTA AAGAAAATAT CATCTNCCAC CCGGCG 36 （２）配列番号３２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３２ GGATATCACC CGATGTGCGG CGCTCCGCCG GGTGGNTGTT TCCTATGATG AATATAGATA 60 CAGAAGCG 68 （２）配列番号３３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：３５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３３ TTAAAGAAAA TATCATCTTT GCCCACCCGG CGGAG 35 （２）配列番号３４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３４ GGATATCACC CGATGTGCGG CGCTCCGCCG GNNTGTTTCC TATGATGAAT ATAGATACAG 60 AAGCG 65 （２）配列番号３５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３５ GCCTGGCACC ATTAAAGAAA ATATCATCTT TGCCCACGAA AT 42 （２）配列番号３６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：９６塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３６ CCTTGTCTCC GTTCTGGATA TCACCCGATG TGTCTCCCTA TAGTGAGTCG TATTAATTTC 60 NNGGTGTTTC CTATGATGAA TATAGATACA GAAGCG 96 （２）配列番号３７の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３７ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACACCT TAAAGATGAT ATTTTCTTTA 60 ATGGTGCCAG GCATAATCCA GG 82 （２）配列番号３８の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：７７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３８ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACACCG ATGATATTTT CTTTAATGGT 60 GCCAGGCATA ATCCAGG 77 （２）配列番号３９の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：３４塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号３９ GGGCTGACCC TCCCGGGGGC TGCGCCCACG AAAT 34 （２）配列番号４０の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：９１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４０ CCTTGTCTCC GTTCTGGATA TCACCCGATG TGTCTCCCTA TAGTGAGTCG TATTAATTTC 60 NNACTCTCGT CCTGCTGGGA AGGGCGATAG T 91 （２）配列番号４１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：９５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４１ TGAGTGCTCA GAGGAGGACT ATCGCCCTTC CCAGCAGGAC GAGTGCAGCC CCCGGGAGGG 60 TCAGCCCGTC TGCAGCCAGC GGGGCGAGTG CCTCT 95 （２）配列番号４２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：９５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４２ TGAGTGCTCA GAGGAGGACT ATCGCCCTTC CCAGCAGGAC GAATGCAGCC CCCGGGAGGG 60 TCAGCCCGTC TGCAGCCAGC GGGGCGAGTG CCTCT 95 （２）配列番号４３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：７７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４３ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACAAAG ATGATATTTT CTTTAATGGT 60 GCCAGGCATA ATCCAGG 77 （２）配列番号４４の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：７８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４４ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACCAAA GATGATATTT TCTTTAATGG 60 TGCCAGGCAT AATCCAGG 78 （２）配列番号４５の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：７８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４５ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAAACAAA GATGATATTT TCTTTAATGG 60 TGCCAGGCAT AATCCAGG 78 （２）配列番号４６の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４６ GCCTGGCACC ATTAAAGAAA ATATCATCTT TGCCCACTTC GAAAT 45 （２）配列番号４７の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：９１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４７ GAATCTCATC AGTAGCGAGC TCTCTCTCCC TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGAANNGGT 60 GTTTCCTATG ATGAATATAG ATACAGAAGC G 91 （２）配列番号４８の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：２７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４８ GAAUCGAAAC GCGAAAGCGU CUAGCGU 27 （２）配列番号４９の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：６７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号４９ TGCCTCCTTG TCTCCGTTCT GGATATCACC CGATGTGTCT CCCTATAGTG AGTCGTATTA 60 ATTTCAG 67 （２）配列番号５０の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：７７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号５０ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACACCA AAGATATTTT CTTTAATGGT 60 GCCAGGCATA ATCCAGG 77 （２）配列番号５１の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号５１ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATC GGAAACACCA AAGATGATAT TTTCTTTAAT 60 GGTGCCAGGC ATAATCCAGG 80 （２）配列番号５２の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号５２ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATA GGAAACACCA AAGATGCTAT TTTCTTTAAT 60 GGTGCCAGGC ATAATCCAGG 80 （２）配列番号５３の情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：８０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列の記載：配列番号５３ GATGACGCTT CTGTATCTAT ATTCATCATC GGAAACACCA AAGATGCTAT TTTCTTTAAT 60 GGTGCCAGGC ATAATCCAGG 80

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】不安定化部分が「鋳型」第２プローブ中に存在する三元接合部を
示す。

【図２】 Hex二量体からなる不安定化部分の化学構造を示す。

【図３】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果を
示す棒グラフである。

【図４】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果を
示す棒グラフである。

【図５】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果を
示す棒グラフである。

【図６】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果を
示す棒グラフである。

【図７】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果を
示す棒グラフである。

【図８】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果を
示す棒グラフである。

【図９】不安定化部分が「鋳型」第２プローブ中に存在する三元接合部を
示す。

【図１０】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果
を示す棒グラフである。

【図１１】Ａ〜Ｄは、本発明に従って実施したアッセイ方法の略図である
。

【図１２】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果
を示す棒グラフである。

【図１３】Ａ〜Ｃは、本発明に従って実施したアッセイ方法の略図である
。

【図１４】Ａ〜Ｄは、本発明に従って実施したアッセイ方法の略図である
。

【図１５】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果
を示す棒グラフである。

【図１６】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果
を示す棒グラフである。

【図１７】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果
を示す棒グラフである。

【図１８】本発明に従って実施した種々のアッセイ方法から得られた結果
を示す棒グラフである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月２１日（２０００．３．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アッセンバーグ，レネイギリス、オー・エックス・16 ８・ビィ・ゼットオックスフォードシャー、バンベリー、マルボロー・ロード、１ (72)発明者マーシュ，ピーターイギリス、シィ・ブイ・31 ２・エイ・ジィウォーウィックシャー、リーミングトン・スパ、イーグル・ストリート、４ (72)発明者モック，グラハム・アンドリューイギリス、オー・エックス・９３・ダブリュ・キューオックスフォードシャー、テイム、リー・パーク・エステイト、アストリー・ロード、２ (72)発明者レイ，トゥレボー・ダンカンイギリス、オー・エックス・14 ５・ジェイ・エイチオックスフォードシャー、アビングドン、ゲインズボロー・グリーン、 15 (72)発明者ワラム，スーザン・デボライギリス、シィ・ブイ・４８・エフ・ピィコベントリー、フリーバーン・コウズウェイ、37 (72)発明者カーディー，ドナルド・レオナルド・ニコラスイギリス、エヌ・エヌ・11 ６・ユー・エヌノーザンプトンシャー、アストン・ル・ウォールズ、ブラックスミスズ・レーン、トゥリンラン（番地なし) Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA09 HA11 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR55 QR62 QS02 QS25 QS34 【要約の続き】第１のプローブと第２のプローブのハイブリッド形成を妨げる不安定化部分を含むことを特徴とする方法が開示される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）試料を第１および第２のプローブと接触させること（
ここで、第１のプローブは、関心のある配列に相補的であってそれゆえそれにハ
イブッド形成できる部分と、関心のある配列に非相補的である部分とを含み、ま
た第２のプローブは、関心のある配列に相補的であってそれゆえそれにハイブリ
ッド形成できる部分と、関心のある配列には非相補的であるが第１のプローブの
関心のある配列に非相補的な部分には相補的である部分とを含み、第１および第
２のプローブは、第１および第２のプローブの相補的部分が互いにハイブリッド
形成できるように、隣接して、または実質的に隣接して、関心のある配列にハイ
ブリッド形成できるようになっている）、（ｂ）第２のプローブを鋳型とし、核
酸ポリメラーゼを使って第１のプローブの伸長を引き起こすこと、および（ｃ）
関心のある配列の存在を示すために、第１のプローブの伸長を直接または間接的
に検出することからなる、試料中の関心のある核酸配列を検出する方法であって
、第１および／または第２のプローブが、相互のプローブと塩基対形成できずそ
のために関心のある配列の不在下での第１のプローブと第２のプローブのハイブ
リッド形成を妨げる不安定化部分を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】第１および第２のプローブがDNA、RNA、PNA、LNA、またはそ
れらの組み合わせからなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】不安定化部分がヘキサエチレングリコール、ペンタメチレン
またはヘキサメチレンからなる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】不安定化部分が第２のプローブ中に存在する請求項１、２ま
たは３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】第１または第２のプローブが、関心のある配列へのハイブリ
ッド形成によって第１または第２のプローブ中および／または関心のある配列中
に不対核酸塩基のループが形成されるようになっている請求項１〜４のいずれか
一つに記載の方法。
【請求項６】関心のある配列への第１または第２のプローブのハイブリッ
ド形成によって第１または第２のプローブ中および／または関心のある配列中に
２または３不対核酸塩基のループが形成される請求項５に記載の方法。
【請求項７】第１および第２のプローブを既知の核酸配列を持つ対照核酸
と接触させる対照反応を含む請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】第１のプローブの伸長が活性な核酸プロモーターの形成をも
たらす請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】第１のプローブの伸長がT３、T７またはSP６ RNAポリメラー
ゼプロモーターの形成をもたらし、それが第２のプローブの少なくとも一部の多
数のRNAコピーの転写を可能にする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】活性な核酸プロモーターから合成された核酸の検出が第１
のプローブの伸長の間接的検出を可能にする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】活性な核酸プロモーターによって引き起こされる転写がリ
ボザイム活性を持つ核酸配列の合成をもたらす請求項８、９または１０のいずれ
か一つに記載の方法。
【請求項１２】核酸が検出に先立って増幅工程にかけられる請求項１〜１
１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】第１のプローブの伸長の直接的または間接的結果として合
成された核酸がさらなる核酸プローブとのハイブリッド形成によって検出される
請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】さらなる核酸プローブが分子ビーコンを構成する請求項１
３に記載の方法。
【請求項１５】第１のプローブの伸長の直接的または間接的結果として合
成された核酸が固体表面で捕捉される請求項１〜１４のいずれか一つに記載の方
法。
【請求項１６】関心のある核酸配列を検出する方法で使用するための一対
の核酸プローブであって、その対の第１のプローブは、関心のある配列に相補的
でありそれゆえそれにハイブリッド形成できる部分と、関心のある配列に非相補
的である部分とを含み、またその対の第２のプローブは、関心のある配列に相補
的でありそれゆえそれにハイブリッド形成できる部分と、関心のある配列には非
相補的であるが第１のプローブの関心のある配列に非相補的な部分には相補的で
ある部分とを含み、第１および第２のプローブは、第１および第２のプローブの
相補的部分が互いにハイブリッド形成できるように、隣接して、または実質的に
隣接して、関心のある配列にハイブリッド形成できるようになっており、その第
１および／または第２のプローブが、そのプローブの対の相互の要素と塩基対形
成できずそのために関心のある配列の不在下での第１のプローブと第２のプロー
ブのハイブリッド形成を妨げる不安定化部分を含むことを特徴とする一対の核酸
プローブ。
【請求項１７】請求項１〜１５のいずれか一つに記載の方法で使用するた
めの請求項１６に記載の一対のプローブ。
【請求項１８】請求項１６に記載の一対のプローブと適当な包装手段とを
含む、試料中の関心のある核酸配列の存在を検出する際に使用するためのキット
。
【請求項１９】請求項１〜１５の何れか一つの方法を実施する際に使用す
るための請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】下記の１つ以上をさらに含む請求項１８または１９に記載
のキット：DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、リボ−またはデオキシリボ−ヌ
クレオチド三リン酸類（標識されたもの、または標識されていないもの）、標識
試薬類、検出試薬類、緩衝剤類。