JP2007525174A - 免疫増幅 - Google Patents
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Abstract
Description
以下に示したプローブ、プライマー、アダプターおよびレポーターのいくつかの配列は、図13で挙げられている。
RHP−1(右側のプローブ;太字の配列は下記のプライマーSRH−1と共通である):
5’ ATT CAC GCT TCC ATT CCA TGT CTC GGG TTT ACT TCA TCT GCA ACT GTA C
5’ ATT CAC GCT TCC ATT CCA TGT CTC GGG TTT ACT TCA TCT GCA ACT GTA CAT
5’ ATT CAC GCT TCC ATT CCA TGT CTC GGG TTT ACT TCA TCT GCA ACT GTA CAT CTG T
5’ ATT CAC GCT TCC ATT CCA TGT CTC GGG TTT ACT TCA TCT GCA ACT GTA CAT CTG TCT
5’ ATT CAC GCT TCC ATT CCA TGT CTC GGG TTT ACT TCA TCT GCA ACT GTA CAT CT
SRH−1(右側のプライマー;太字の配列はRHP−1と共通である):
ADR−2(下線の塩基はTBD10.2[D/R]の3’末端と同一である):
5’ ACG TTA GCC ACC ATA CGG ATA GTG ACG TGA TGA GCT AGA C
5’ ACG TTA GCC ACC ATA CGG ATG ATG AGC TAG AC
5’ ACG TTA GCC ACC ATA CGG ATG TGA CGT GAT GAG C
5’ ACG TTA GCC ACC ATA CGG ATG ATG AGC ATC TG
5’ AGC TAT CCG CCA TAA GCC AT AC TCA
GAG TGA TCA AGT
TBD10.2(D/R)(下線の塩基はADR−2およびADR−5の5’末端と同一である):
5’(dabcyl)−TAG CGC CCG AGC GCT ACG TT(rox)A GCC ACC ATA CGG AT
5’(fam)−AGT TGC CCC GAG GCA ACT(dabcyl)AGC TAT CCG CCA TAA GCC AT
RCP−1(テザーオリゴヌクレオチド;大文字の塩基はRHP−1の5’末端と相補的である):
5’ CCG AGA ACA GAC AAG ACA AGA CTG Gat at
5’ CGA GAC ATG GAA TGG AAG CGT GAA Ttt tt
5’t tta ttt tat CGA GAC ATG GAA TGG AAG CGT GAA T
RCP−13v1(捕捉オリゴヌクレオチド;大文字の塩基はRHP−3の5’末端近くの配列と相補的であり;下線の塩基はDO−13v1と相補的であり;X=テトラ−エチレングリコール;Z=ヘキサ−エチレングリコール;XはZにリン酸ジエステル部を介して連結しており;Zはオリゴヌクレオチドの5’末端にリン酸ジエステル部を介して連結している):
5’ CTT GTC TTG TCT GTT CTC GTG ATG CAT TAG GAT AGA AAC TCG TAC CAG G−[キャップ]3’
5’ビオチン−X−Z−t tta CAC TGA ATG CAT tCC
tAG AAC AGA CAA GAC AAG ACT ccg tgg cAg
cgt
5’ ACG CTG CCA CGG AGT CTT GTC TTG TCT GTT CTt GGA ATG CAT TCA GT−[キャップ]3’
(ブロッキングオリゴヌクレオチド([キャップ]=2’,3’ジデオキシシチジン))
5’ ACA GAT GTA CAG Taa ttt−[キャップ]3’
5’ cag ttc agc acA CTG TAC ATC TGT CTA GC aa−[キャップ]3’
5’ cag ttc agc acA CTG TAC ATC TGT CTA GCT CA aa−[キャップ]3’
5’ cag ttc agc acA CTG TAC ATC TG T CTA GCT CAT Cta−[キャップ]3’
5’ cag ttc agc ac aa GTA CAT CTG TCT
AGC TCA aac−[キャップ]3’
5’ cag ttc agc ac aa GTA CAT CTG T aac−[キャップ]3’
LTAR−1(Epoch Biosciences(ワシントン州Bothell)製のQCオリゴヌクレオチド;下線の塩基はIQS−1とは異なる):
5’ TTT TAC TTC ATC TGC AAC TGT ACA TCT GTC TAG CTC ATC ACG TCA CTG AAT GCA T
5’ TT TAC TTC ATC TGC AAC ACA TGA TCT
CAG ATG CTC ATC ACG TCA CTG AAT GCA TC
5’ TTA CTT CAT CTG CAA C at ctg tca ctt gat cac tct ga G TCA CTG AAT GCA TC
以下の一連の実験では、近接構成要素の分析物特異的結合性部はビオチン部であり、選択した試験分析物はストレプトアビジン(「SA」)であった。ビオチンは、オリゴヌクレオチド部P1(RHP−1)およびP2(LHP−1またはLHP−3)の5’末端に連結させた。(実施例1参照、上記)。P1およびP2はそれぞれ濃度1μMであり、10mMのTris−EDTA緩衝液およびウシ血清アルブミン(BSA)および任意選択的に0.25μMのSAと混合した。室温で10分後、最終的なプローブ濃度がpMの範囲になるように混合物を連続的に希釈した。次いで、希釈した混合物をSDAプライマー(SRH1、SLH2)、アダプター(ADR−5)およびレポータープローブ(TBD10.2)と混合し、混合物を72℃に10分間加熱した。試料を52℃に冷却し、dNTPを含むSDA成分の乾燥カクテルを含有する「増幅ウェル」に加えた。最終的なプローブ濃度は1fMまたは10fMのいずれかであり、最終的なSA濃度はゼロまたは各プローブ濃度の2分の1であった。次いで、BsoBI制限エンドヌクレアーゼおよびBstDNAポリメラーゼ(BD Diagnostic Systems、メリーランド州Baltimore)を混合物に加え、等温増幅を52℃で1時間実施した。特許文献17で記載の通りに、フルオレセイン標識レポータープローブ、TBD10.2の変換に伴う蛍光の増加を観察することによって増幅を監視した。
この実験では、5’ビオチンを担持するか、またはビオチンを担持せず5’アミノリンカーを担持するかの、いずれかのRHP−1はP1として働き、5’ビオチンを担持するか、またはビオチンを担持せず5’アミノリンカーを担持するかの、いずれかのLHP−1はP2として働いた。100nMのプローブをSAで被覆したビーズ(Promega、ウィスコンシン州Madison)と混合し、時々撹拌しながら室温で45分間インキュベートした。次いで、ビーズを管の脇に集め、溶液を除去した。ビーズを0.1mg/mLのBSAに再懸濁し、それらを管の脇に集め、溶液相を廃棄した。これらの洗浄ステップを4回繰り返し、最後にビーズをSDA反応緩衝液に再懸濁した。得られる懸濁液を、SDAプライマー(SLH−2、SRH−1)、アダプター(ADR−5)およびレポーター(TBD.10.2)を含有する混合物に加えた。これらの混合物中のビーズに結合したSAの最終濃度は40または400fMであった。次いで、上記の実施例2の記載の通りにSDAを実施した。
この実験では、非ビオチン化RHP−1(上記参照)はP1として、LHP−3(5’ビオチンを担持している)はP2として、RCP−1(3’ビオチンを担持している)はテザーオリゴ、TOとして働いた。プローブP1およびP2ならびにテザーオリゴTOを等モル比で混合し、SAを含有しているか欠いているかのいずれかの管に加えた。この管を短時間室温でインキュベートし、次いで管の内容物を連続的に希釈して、プローブの濃度をpM範囲にした。次いで、希釈した混合物を、SDAプライマー(SRH1、SLH2)、アダプター(ADR−5)およびレポータープローブ(TBB10.2)と混合して、SAの最終濃度を0または0.25fMのいずれかに、P1、P2およびTOのそれぞれの濃度を1fMとした。次いで、混合物を「熱スパイク」(72℃で10分間)にかけるか、52℃で10分間インキュベートした(「熱スパイクなし」)。推定Tm64℃を有するP1:TO二重鎖は52℃では安定で、72℃のインキュベーションで分裂すると予想される。分裂すると、P1:TO二重鎖は、極めて非常にゆっくりと(t1/2>100時間)、希釈した(1fM)プローブ濃度で再形成することとなる。BsoBI制限エンドヌクレアーゼ、BstDNAポリメラーゼおよびdNTPの乾燥カクテルを加えることによって試料をSDAにかけ、次いで52℃においてProbeTec(商標)ET装置でインキュベートした。プローブP1およびP2がそれぞれTOまたはビオチンを介して共通のSA分子に結合すると、それらの相補的な3’末端はハイブリッド形成し伸長して、SDAプライマー(SLH−2およびSRH−1)およびアダプターADR−5のためのハイブリッド形成部位を作製する。これにより、伸長したP1およびP2分子の同時の増幅および検出が可能になる。フルオレセイン標識レポータープローブ、TBD10.2の変換に伴うアダプターが介在する蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した(アダプター介在型レポータープローブ変換の詳細については特許文献17参照)。
試料中の標的分析物のレベルは、標的介在型プローブ伸長産物と共増幅された内部標準(例えば、実施例1のIQS−1)を入れることによって定量的に測定してもよい。内部標準および標的依存性プローブ伸長産物は、SDAプライマーの共通の対によって増幅されるが、それぞれの識別可能に標識されたレポータープローブ(例えば、実施例1のTBD10.2およびAltD6.9)により検出される。2つのレポータープローブの相対的なシグナルを比較することにより、内部標準の既知の量と相対的なプローブ特異的伸長産物の濃度を推定することができる。分析物の絶対濃度の測定では、バックグラウンド修正済み標的/対照シグナル対標的分析物シグナルの比の「標準曲線」を作製することが有利な場合がある。次いで、試験試料について観察したシグナル比を標準曲線と比較して、絶対分析物濃度を作製する。核酸標的レベルを定量する同様の方法が当技術分野で知られている(例えば、非特許文献8参照)。
この実験では、非ビオチン化RHP−1(上記参照)はP1として、非ビオチン化LHP−3はP2として、一方、RCP−1(3’ビオチンを担持している)およびLCP−4(5’ビオチンを担持している)はテザーオリゴヌクレオチドとして働いた。P1、P2およびテザーオリゴヌクレオチド間の相互作用を図3Hに図示する。プローブP1およびP2ならびにテザーオリゴヌクレオチドを等モル比(ここで、モル濃度は近接構成要素のテザーオリゴヌクレオチド部のみに関して測定された)で混合し、SAを含有しているか又は欠いているかのいずれかの管に加えた。72℃の「熱スパイク」実験を実施しなかった以外は、実施例4で記載の通りに反応を実施した。結果を表4に示す。SAを含有する試料は、強い蛍光の増加(平均MOTA値=136000)を示したが、SAを欠く試料は、ごくわずかな増加を示した(MOTA=533)。
ヒトIL−8を対象としたMAb G265−8(Ab1;BD Bioscience Pharmingen)をSAと共有結合させて、IgG当たり1つのSA1を含有する抗−IL−8 IgG−SA複合体(Ab1−SA)を得た。MAb G265−8とSAは当技術分野でよく知られた方法を使用して複合体形成させた。20nMの5’ビオチン標識プローブRHP−3(P1)、10nMのAb1−SA複合体、10nMのTris−EDTA緩衝液および0.1mg/mlのBSAを含有する混合物を調製し、一夜4℃でインキュベートしてビオチン化オリゴヌクレオチドをAb1−SA複合体に結合させて、Ab1−SA−P1を形成した。
この実験は、標的分析物を伴わないP1とP2分子との塩基対形成から生じる標的非依存性増幅を抑制するためのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を説明する。この実験では、プローブP1は5’ビオチン化RHP−3であり、プローブP2は5’ビオチン化LHP−3である(上記参照)。P1およびP2の3’末端を含む10ヌクレオチド配列は、互いに相補的である。実施例2と同様に、標的分析物はSAであり、これは、その四量体に4つのビオチン結合性部位を含有する。ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、RHP−3の3’末端と相補的な18ヌクレオチド配列を含むRDB−3p8(実施例1)である。したがって、P1とハイブリッド形成ブロッカーRDB−3p8との間に形成された二重鎖は、P2と相補的なP1の3’末端での10ヌクレオチド、ならびにP2と相補的ではないP1のさらなる8ヌクレオチドを含む。さらに、RDB−3p8は、14ヌクレオチドの5’テール配列を含み(実施例1のRDP−3p8の下線の塩基の塩基5’)、これは、その上でRHP−3の3’末端が伸長することができる無能力化鋳型として働く(図4Cで示した)。本発明のハイブリッド形成ブロッカーの特徴は、近接構成要素のオリゴヌクレオチド部に共有結合的に付着しない、または連結しないということである。オリゴヌクレオチド部の3’末端の伸長に依拠して分析物特異的アンプリコンを産生する本発明の方法では、ハイブリッド形成ブロッカー−プローブ二本鎖が、3’末端の伸長を必要とし、二重鎖が不安定化する高温で一般に生じるポリメラーゼ触媒増幅方法(例えば、SDAおよびPCR)中で安定性を維持する必要がある。一般に、ポリメラーゼベースの増幅方法(例えば、PCRおよびSDA)で使用する高温は、プローブ−ブロッカーハイブリッドの拡がりを、誤ったプローブ変換の抑制の効力がなくなる点まで減少させることができる。本発明では、プローブ間で形成するハイブリッドよりも安定なプローブ−ブロッカーハイブリッドを形成することが可能なハイブリッド形成ブロッカーを選択することにより、かつ高温でプローブ−ブロッカー鋳型を安定化する無能力化鋳型を使用することにより、この困難を克服している。
抗体−プローブ複合体Ab1−SA−P1およびAb2−P2は、実施例7で記載の通りであった。10mMのTris−EDTA緩衝液、20pMのAb1−SA−P1、100pMのAb2−P2、1mg/mLのBSA、0.1mg/mLのマウスγグロブリン、50nMのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドRDB−3z8および0、0.005、0.010または0.025pMのIL−8を含有する試料50μLを調製した。室温で3時間インキュベートした後、各試料の分量5μLを1:10(v/v)に希釈して、0.1mg/mLのBSAを含有するTris−EDTA緩衝液とし、次いでさらに1:10(v/v)に希釈して、SDAプライマーSRH−1(100nM)およびSLH−2(500nM)、300nMのアダプタープライマーADR−8、500nMのレポータープローブTBD10.2(D/R)ならびに50nMのハイブリッド形成ブロッカーRDB−3z8を含有する溶液100μLとした。そのように希釈した4つの混合物は、最初の試料のそれぞれから調製された。次いで、希釈した混合物を37℃で約10分間インキュベートし、52℃に予め加温したSDA酵素溶液20μLを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量80μLを移した。このマイクロウェルを密封し、ProbeTec(商標)ET装置内に置き、52℃で1時間インキュベートした。参照により本明細書中に組み込まれる特許文献17で記載の通りに、フルオレセイン標識レポータープローブ、TBD10.2の変換に伴う蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。得られるMOTA値を表7に報告する。0.005pMと低いIL−8濃度を含有する結合性混合物の平均MOTA値は、IL−8ゼロの試料から得られる対応値よりも著しく高く、これは本発明の均一法が、未結合の抗体から結合抗体を分離せずに、低フェムトモル範囲の分析物濃度を検出できることを立証している。
実施例9のAb1−SA複合体10nMを、0.1mg/mLのBSAを含有する0.1MのTris−EDTA緩衝液中で20nMの3’−ビオチン標識RCP−1テザーオリゴヌクレオチド(TO)と混合した。この混合物を一晩4℃でインキュベートして、ビオチン化オリゴヌクレオチドをAb1−SA複合体に結合させてAb1−SA−TOを形成した。
MAb G265−8(実施例9参照)をペプシンで消化して、F(ab’)2断片およびFc領域の断片を得た。F(ab’)2を精製し、ジチオスレイトール(DTT)でさらに処理して、Fab’断片を連結しているジスルフィド架橋を減少させた。得られるFab’断片(Ab1)を2つのRHP−3オリゴヌクレオチド(P1)とカップリングさせて、Ab1−P1複合体を形成した。
この実施例で使用した緩衝液は以下の通りである:
・ TBS:25mMのTris(pH7.6)、150mMのNaCl;
・ 希釈液A:希釈液Bプラス0.01%Tween−20、800μMのD−ビオチンおよび5mMのEDTA;
・ 希釈液B:TBS、0.5%スキムミルクパウダー(Oxoid Ltd.、英国)、0.1mg/mLの分子生物学等級のDNA(Roche Molecular Systems、カリフォルニア州Pleasanton);
・ ブロッキング溶液:TBS、4.5%スキムミルクパウダー、1mg/mLの分子生物学等級のDNA、2mg/mLのアジ化ナトリウム、5mMのEDTA
・ 洗浄緩衝液:TBS、5mMのEDTA、0.05%Tween−20;
・ SDA反応緩衝液(濃縮):90mMのビシン、60mMのKOH、12mMのリン酸カリウム、6.57%グリセロール、4.23%DMSO;
・ SDAプライマー混合物:7.5μMのSRH−1、37.5μMのSLH−2、300μMのADR−5、37.5μMのTBD10.2(水中);ならびに
・ SDA酵素混合物:75mMのビシン中18単位のBsoBI制限エンドヌクレアーゼおよび8単位のBstポリメラーゼ(BD Diagnostic Systems)、50mMの水酸化カリウム、10mMのリン酸カリウム(pH7.6)
選択した標的分析物はIL−8であり、MAb G265−5およびMab G265−8が分析物結合性部である。MAb G265−5はプローブLHP−3に複合体形成して、Ab1−P1を産生した。MAb G265−8はSAに複合体形成し、この複合体をAb分子1個当たりの2種のプローブの割合で5’ビオチン化プローブRHP−3と混合して、Ab2−P2を産生した。
この実施例で使用したMAb、分析物および緩衝液は実施例12で記載のものと同じである。ビオチン化RCP−9v2.2捕捉オリゴヌクレオチドは、実施例12で記載されたものと同じ方法で支持体に固定化された。Ab2−P2複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、実施例12で記載の通りに実施された。次いで、0または10pMのいずれかのIL−8を含有する100μLの希釈液Bを各マイクロウェルに加え、これを室温で1時間インキュベートした。次に、マイクロウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄した。次に、0.1nMのAb1−P1複合体および1μMのLBK−1ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する希釈液Aを各マイクロウェルに加え、そのマイクロウェルを室温で1時間インキュベートした。次いで、最後の2回の洗浄ステップがTBSではなく10mMのNaClを含有していたことを除き、実施例12で記載の通りにマイクロウェルを洗浄した。
MAb、分析物および緩衝液は実施例12に記載のものと同じである。ビオチン化RCP−9v2.2捕捉オリゴヌクレオチドは、実施例12に記載されたものと同じ方法で支持体に固定化された。Ab2−P2複合体の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、実施例12に記載の通りに実施された。次いで、0または10pMのいずれかのIL−8を含有する希釈液B100μLを各マイクロウェルに加え、これを室温で1時間インキュベートした。次に、マイクロウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄した。次に、0.1nMのAb1−P1複合体および1μMのLBK−1ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを含有する希釈液Aを各マイクロウェルに加え、そのマイクロウェルを室温で1時間インキュベートした。次いで、実施例12に記載の通りにマイクロウェルを洗浄した。
この実施例は、図14で示したプロセス、すなわち免疫増幅によって検出物を検出するための3’キャップした伸長不可能な近接プローブの使用の実験的証明を提供する。この実施例の標的分析物はSAである。3’キャップした近接プローブP1はLHP−3[キャップ]である(実施例1で示した)。LHP−3[キャップ]は、LHP−3[キャップ]が相補的な鋳型鎖P2とハイブリッド形成した場合にプローブの伸長を妨げる3’デオキシウリジン部を含む。この実施例では、分析物結合性部は、LHP−3[キャップ]の5’末端に付着したビオチン部である。近接対の第2のプローブ、P2は、5’ビオチン部および伸長可能な3’末端を含むRHP−3(実施例1で示した)である。キャップしていない対照プローブ、LHP−3は、5’ビオチン部および伸長可能な3’末端を含む。増幅プライマー、アダプターオリゴヌクレオチド、レポータープローブ、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドおよびその他の反応成分は実施例8と同じである。
この実施例は、近接構成要素のAb部同士の間の相互作用が標的非依存性増幅の一因となることを証明する。実施例9で記載の通り、以下に挙げた成分を10mMのTris−EDTA緩衝液および0.1mg/mLのBSAの溶液中に含有する4つの試験溶液を調製した。
・ 試験溶液1:1nMのAb1−P1および1nMのAb2−SA−P2;
・ 試験溶液2:1nMのAb1−P1、1nMの複合体形成していないAb2および2nMの複合体形成していないP2;
・ 試験溶液3:1nMの複合体形成していないAb1、2nMの複合体形成していないP1および1nMのAb2−P2;ならびに
・ 試験溶液4:2nMの複合体形成していないP1、2nMの複合体形成していないP2。
この実施例は、図1Jで示した概念の実験的証明を与える。抗体複合体Ab1−SAおよびAb2−P2は、実施例7に記載した通りである。Ab1−SAを、プローブRBD−3v3とプローブ:抗体比2:1で、4℃で一晩インキュベートしてAb1−SA−P1を形成した。実施例1で言及した通り、RBD−3v3はビオチン部をその3’末端の近くに含有している。10mMのTris−EDTA緩衝液、20pMのAb1−SA−P1、100pMのAb2−P2、1mg/mLのBSA、50nMのハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドRDB−3z8ならびに0、0.1、0.25、0.5および1.0pMのIL−8を含有する試料を調製した。室温で3時間インキュベートした後、各標準試料の分量を、BSA0.1mg/mLを含有するTris−EDTA緩衝液に1:10(v/v)に希釈し、さらに、SDAプライマー(SRH−1およびSLH−2)、アダプタープライマー(adr−8)、レポータープローブ(TBD10.2(D/R))およびハイブリッド形成ブロッカー(RDB−3z8)50nMを含有する溶液中に1:10(v/v)に希釈した。SDA反応では、プライマー、アダプターおよびレポーターの濃度は実施例18で記載の通りであり、ハイブリッド形成ブロッカーRDB−3z8の濃度は50nMであった。これらの希釈混合物の反復試験試料4点を、それぞれの最初の試料から調製した。次いで、希釈混合物を37℃で約10分間インキュベートし、52℃に予め加温したSDA酵素溶液20μLを含有する別個のマイクロウェルに各混合物の分量80μLを移した。このマイクロウェルを密封し、ProbeTec(商標)ET装置内に置き、52℃で1時間インキュベートした。実施例9に記載の通りに蛍光の増加を観察することによって増幅を観測した。
この実施例は、核酸対照およびそれぞれ分析物に結合した近接構成要素から産生された標的アンプリコンの共増幅から得られる2つの蛍光シグナルの比を使用する試験試料中の標的分析物(この場合、IL−8)の絶対定量を説明する。本発明によれば、複数の標準試料および少なくとも1つの試験試料が最初に形成される。複数の標準試料はそれぞれ、既知の開始量の核酸対照配列、既知の開始量の標的分析物およびある量の本発明の近接対を含有する。通常、複数の標準試料の異なる構成要素は、既知の量の標的分析物を有することとなる。試験試料は、既知の開始量の核酸対照配列、未知の量の非核酸標的分析物およびある量の近接対を含有する。絶対定量法で測定されるのは、この未知の量の標的分析物である。
Claims (114)
- 増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
(i)(a)分析物と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(c)分析物と複合体を形成することができて、且つ第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素であって、第2のオリゴヌクレオチド部が第1のオリゴヌクレオチドの第1の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第2の近接構成要素と;
(d)第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成することが可能な部分を含むハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと;
を組み合わせるステップ;
(ii)第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分と第2のオリゴヌクレオチド部の部分とを含み、且つ第1または第2のオリゴヌクレオチド部の3’末端を含むハイブリッドを形成するステップ;
(iii)3’末端を伸長してアンプリコンを産生するステップ;
(iv)アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ;および
(v)増幅産物を検出するステップ;
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部と相補的ではない3’配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部と相補的ではない5’配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部と相補的ではない3’配列および5’配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによる第1のオリゴヌクレオチド部の3’伸長を妨げる3’キャップを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分のすべての塩基を含むハイブリッドを形成することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分は長さ約10塩基であり、ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは長さ約18塩基であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分は、およそ第1のオリゴヌクレオチド部全体の長さであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分のすべての塩基よりも少ない塩基を含むハイブリッドを形成することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリッドの存在を減少させることができるデブロッカーオリゴヌクレオチドを組み合わせるステップをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- デブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できるハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの部分とハイブリッドを形成できる第1の部分を含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- デブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部とハイブリッドを形成しないハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの部分とともにハイブリッドを形成できる第2の部分を含むことを特徴とする請求項11に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できるハイブリッド形成ブロッカーの部分の3’である二本鎖部分を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、デブロッカーオリゴヌクレオチドの前に組み合わされることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、デブロッカーオリゴヌクレオチドの後に組み合わされることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、デブロッカーオリゴヌクレオチドと同時に組み合わされることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、分析物ならびに第1および第2の近接構成要素の前に組み合わされることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、分析物ならびに第1および第2の近接構成要素の後に組み合わされることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できる第2のオリゴヌクレオチド部の部分とハイブリッド形成できる第2のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドを組み合わせるステップをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、好熱性鎖置換増幅、自己保持配列複製、核酸配列に基づく増幅、Qβレプリカーゼシステム、リガーゼ連鎖反応および転写介在増幅からなる群から選択される方法によるものであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ブロッカーは、分析物非依存性のアンプリコンの形成を少なくとも100分の1に減少させることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- ブロッカーは、分析物非依存性のアンプリコンの形成を少なくとも1000分の1に減少させることを特徴とする請求項22に記載の方法。
- 分析物を、少なくとも約1pMの濃度で検出できることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 分析物を、少なくとも約0.1pMの濃度で検出できることを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 分析物を、少なくとも約0.01pMの濃度で検出できることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 検出は定量的であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 第1または第2の分析物特異的結合単位は、タンパク質複合体であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- タンパク質複合体は、オリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1のタンパク質と、分析物と複合体を形成できる第2のタンパク質とを含むことを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 第1のタンパク質は、プロテインAおよびプロテインGからなる群から選択されることを特徴とする請求項29に記載の方法。
- 増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
(i)(a)分析物と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分および第2の部分を含む第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(c)分析物と複合体を形成することができて、且つ第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素であって、第2のオリゴヌクレオチド部は第1のオリゴヌクレオチドの第1の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第2の近接構成要素と;
(d)第1のオリゴヌクレオチド部の第2の部分とハイブリッド形成できる捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体と;
を組み合わせるステップ;
(ii)第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分と第2のオリゴヌクレオチド部の部分とを含むハイブリッドを形成するステップ;
(iii)3’末端を伸長してアンプリコンを産生するステップ;
(iv)アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ;および
(v)増幅産物を検出するステップ;
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - 第1のオリゴヌクレオチドの第1および第2の部分はオーバーラップする塩基を含まないことを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチドの第1および第2の部分は共に隣接した塩基を含むことを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチドの第1および第2の部分は同じ塩基配列であることを特徴とする請求項31に記載の方法。
- ハイブリッドは第1または第2のオリゴヌクレオチド部の3’末端を含み、前記アンプリコンを産生するステップは3’末端を伸長することを含むことを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 前記組み合わせるステップの後に、捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間にハイブリッドを形成するステップを含むことを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 前記捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間にハイブリッドを形成するステップの後に、支持体を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 前記支持体を洗浄するステップの後に、支持体から第1の近接構成要素を放出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項38に記載の方法。
- 捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、且つ前記放出するステップは同源の制限エンドヌクレアーゼでその部位を開裂することを含むことを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドをポリメラーゼ触媒伸長して制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成するステップをさらに含み、前記放出するステップは同源の制限エンドヌクレアーゼでその部位を開裂することを含むことを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 放出するステップは、捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドの物理的解離によるものであることを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 放出するステップは、物理的、化学的または酵素的開裂であることを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 放出するステップは、捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分を伸長して、捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドから第1のオリゴヌクレオチド部を置換することを含むことを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 放出するステップは、第1のオリゴヌクレオチド部の二本鎖部分を伸長して、捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドから捕捉オリゴヌクレオチドを置換することを含むことを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項46に記載の方法。
- 捕捉オリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチド部との間のハイブリッドの一本鎖または二本鎖はRNAを含み、且つ放出するステップは前記一本鎖または二本鎖をRNアーゼで分解することを含むことを特徴とする請求項39に記載の方法。
- 前記増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、好熱性鎖置換増幅、自己保持配列複製、核酸配列に基づく増幅、Qβレプリカーゼシステム、リガーゼ連鎖反応および転写介在増幅からなる群から選択される方法によるものであることを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 検出は定量的であることを特徴とする請求項31に記載の方法。
- 増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
(i)(a)分析物と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分および第2の部分を含むテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(c)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含むオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素と;
(d)(i)オリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第1の部分および(ii)テザーオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第2の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドと;
を組み合わせるステップ;
(ii)(a)オリゴヌクレオチド部の第1の部分、スプリントオリゴヌクレオチドの第1の部分、および、オリゴヌクレオチド部またはスプリントオリゴヌクレオチドのいずれかの伸長可能な末端を含む第1のハイブリッドと;および
(b)テザーオリゴヌクレオチドの第1の部分およびテザーオリゴヌクレオチドの第2の部分を含む第2のハイブリッドと;
を形成するステップ;
(iii)伸長可能な末端を伸長することによってアンプリコンを産生するステップ;
(iv)アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ;
(v)増幅産物を検出するステップ;
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - オリゴヌクレオチド部が伸長可能な末端を含むことを特徴とする請求項51に記載の方法。
- スプリントオリゴヌクレオチドが伸長可能な末端を含むことを特徴とする請求項51に記載の方法。
- 前記伸長可能な末端を伸長するステップは、テザーオリゴヌクレオチドを第2のハイブリッドから置換することを特徴とする請求項51に記載の方法。
- テザーオリゴヌクレオチドは、鎖置換により置換されることを特徴とする請求項54に記載の方法。
- テザーオリゴヌクレオチドは、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで触媒された加水分解で置換されることを特徴とする請求項54に記載の方法。
- 前記増幅するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、好熱性鎖置換増幅、自己保持配列複製、核酸配列に基づく増幅、Qβレプリカーゼシステム、リガーゼ連鎖反応および転写介在増幅からなる群から選択される方法によるものであることを特徴とする請求項51に記載の方法。
- スプリントオリゴヌクレオチドは、第2の部分の3’に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位ならびに制限エンドヌクレアーゼ認識部位の3’および第1の部分の5’に位置する第1のプライマー結合性部位をさらに含み、オリゴヌクレオチド部はオリゴヌクレオチド部の第1の部分の5’に位置する第2のプライマー結合性部位を含むことを特徴とする請求項51に記載の方法。
- 前記増幅するステップは、それぞれ第1および第2のプライマー結合性部位とハイブリッド形成する第1および第2のプライマーならびにその同源の認識部位にニック形成する制限エンドヌクレアーゼを使用することを含む鎖置換増幅によるものであることを特徴とする請求項58に記載の方法。
- 検出は定量的であることを特徴とする請求項51に記載の方法。
- 前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項51に記載の方法。
- 増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
(i)(a)分析物と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第1のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(c)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第2のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素と;
(d)(i)第1のテザーオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第1の部分および(ii)第2のスプリントオリゴヌクレオチドの第2の部分とハイブリッド形成できる第2の部分を含む第1のスプリントオリゴヌクレオチドと;
(e)(i)第2のテザーオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第1の部分および(ii)第1のスプリントオリゴヌクレオチドの第2の部分とハイブリッド形成できる第2の部分を含む第2のスプリントオリゴヌクレオチドと;
を組み合わせるステップ;
(ii)(a)第1のテザーオリゴヌクレオチド部の第1の部分および第1のスプリントオリゴヌクレオチドの第1の部分を含む第1のハイブリッドと;
(b)第2のテザーオリゴヌクレオチドの第1の部分および第2のスプリントオリゴヌクレオチドの第1の部分を含む第2のハイブリッドと;
(c)第1および第2のスプリントオリゴヌクレオチドの第2の部分、第1のスプリントオリゴヌクレオチドの3’末端、ならびに第2のスプリントオリゴヌクレオチドの3’末端を含む第3のハイブリッドと;
を形成するステップ;
(iii)第3のハイブリッドの3’末端を伸長することによってアンプリコンを産生するステップ;
(iv)アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ;および
(v)増幅産物を検出するステップ;
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - 第1のテザーオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端は第1の分析物特異的結合単位に複合体形成し、第2のテザーオリゴヌクレオチドの3’末端は第2の分析物特異的結合単位に複合体形成することを特徴とする請求項62に記載の方法。
- 前記アンプリコンを産生するステップは、第1および第2のテザーオリゴヌクレオチドを第1および第2のハイブリッドから置換することを特徴とする請求項62に記載の方法。
- 第1および第2のテザーオリゴヌクレオチドは、鎖置換により置換されることを特徴とする請求項62に記載の方法。
- 第1および第2のテザーオリゴヌクレオチドは、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで触媒された加水分解で置換されることを特徴とする請求項62に記載の方法。
- 前記伸長するステップの後で且つ前記増幅するステップの前に、第1および第2の近接構成要素からアンプリコンを実質的に除去する洗浄ステップをさらに含むことを特徴とする請求項62に記載の方法。
- 検出は定量的であることを特徴とする請求項62に記載の方法。
- 前記アンプリコンを産生するステップは、連結ステップを含むことを特徴とする請求項62に記載の方法。
- 増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
(i)(a)分析物と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素であって、第1のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位、DNAポリメラーゼによる第1のオリゴヌクレオチド部の3’伸長を妨げる3’キャップ、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の3’である第1の部分を含む第1の近接構成要素と;
(c)分析物と複合体を形成することができて、且つ第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素であって、第2のオリゴヌクレオチド部は第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できる第1の部分を含む第2の近接構成要素と;
を組み合わせるステップ;
(ii)第1および第2のオリゴヌクレオチド部の第1の部分ならびに第2のオリゴヌクレオチドの3’末端を含むハイブリッドを形成するステップ;
(iii)第2のオリゴヌクレオチド部の3’末端を伸長することによって、二本鎖の第1のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作製するステップ;
(iv)第1のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位にニック形成するステップ;
(v)ニックから第1のオリゴヌクレオチド部を伸長して、第1のオリゴヌクレオチド部の下流部分を置換するステップ;
(vi)制限エンドヌクレアーゼ認識部位から鎖置換増幅して増幅産物を産生するステップ;および
(vii)増幅産物を検出するステップ;
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - 第2のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、鎖置換増幅は第1および第2のオリゴヌクレオチド部の制限エンドヌクレアーゼ認識部位からのものであることを特徴とする請求項70に記載の方法。
- 検出は定量的であることを特徴とする請求項70に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチド部の5’末端は第1の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第2のオリゴヌクレオチド部の5’末端は第2の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項70に記載の方法。
- 増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
(i)(a)分析物と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(c)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素と;
を組み合わせるステップ;
(ii)第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分および第2のオリゴヌクレオチド部の第1の部分を含む少なくとも1つのハイブリッドを形成するステップであって、その少なくとも一つのハイブリッドは、伸長されて5’末端を含む第1のオリゴヌクレオチド部の第2の部分の相補体を形成することができる3’末端を含むステップ;
(iii)アンプリコンを産生するステップ;
(iv)アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ;および
(v)増幅産物を検出するステップ;
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - 少なくとも1つのハイブリッドは、第1および第2のオリゴヌクレオチドの第1の部分を含むことを特徴とする請求項74に記載の方法。
- 第1のハイブリッドは第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分およびスプリントオリゴヌクレオチドの第1の部分を含み、且つ第2のハイブリッドは第2のオリゴヌクレオチド部の第1の部分およびスプリントオリゴヌクレオチドの第2の部分を含む2つのハイブリッドが形成されることを特徴とする請求項74に記載の方法。
- 前記アンプリコンを産生するステップは、3’末端を伸長することを含むことを特徴とする請求項74に記載の方法。
- 前記アンプリコンを産生するステップは、(i)第1のオリゴヌクレオチド部の第2の部分と第3のオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッドを形成すること、および(ii)少なくとも1つのハイブリッドの3’末端を第3のオリゴヌクレオチドの5’末端に連結することを含むことを特徴とする請求項74に記載の方法。
- 増幅産物を検出することにより分析物を検出できる分析物の検出方法であって、
(i)(a)少なくとも2つの抗原特異的結合性部位を含む分析物と;
(b)第1の部分を含む第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の抗原を含む第1の近接構成要素であって、第1の抗原は分析物の抗原結合性部位の1つと複合体を形成することができる第1の近接構成要素と;
(c)第1の部分を含む第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の抗原を含む第2の近接構成要素であって、第2の抗原は分析物の別の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第2の近接構成要素と;
を組み合わせるステップ;
(ii)第1および第2のオリゴヌクレオチド部の第1の部分を含むハイブリッドを形成してアンプリコンを産生するステップ;
(iii)アンプリコンを増幅して増幅産物を産生するステップ;および
(iv)増幅産物を検出するステップ;
を含むことを特徴とする分析物の検出方法。 - 検出は定量的であることを特徴とする請求項79に記載の方法。
- 検出物は抗原特異的免疫グロブリンであることを特徴とする請求項79に記載の方法。
- ハイブリッドは第1または第2のオリゴヌクレオチド部の3’末端を含むことを特徴とする請求項79に記載の方法。
- キットであって、
(a)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素であって、第2のオリゴヌクレオチド部は第1のオリゴヌクレオチドの第1の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第2の近接構成要素と;
(c)第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できる部分を含むハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと;
を含むことを特徴とするキット。 - ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部と相補的ではない3’配列を含むことを特徴とする請求項83に記載のキット。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部と相補的ではない5’配列を含むことを特徴とする請求項83に記載のキット。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部と相補的ではない3’配列および5’配列を含むことを特徴とする請求項83に記載のキット。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによる第1のオリゴヌクレオチド部の3’伸長を妨げる3’キャップを含むことを特徴とする請求項83に記載のキット。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分のすべてを含むハイブリッドを形成できることを特徴とする請求項83に記載のキット。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分のすべてより少ない部分を含むハイブリッドを形成することが可能であることを特徴とする請求項83に記載のキット。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドと第1のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリッドの存在を減少させることができるデブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項83に記載のキット。
- デブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できるハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの部分とハイブリッドを形成できる第1の部分を含むことを特徴とする請求項90に記載のキット。
- デブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部とハイブリッドを形成しないハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドの部分とハイブリッドを形成することが可能な第2の部分を含むことを特徴とする請求項91に記載のキット。
- ハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できるハイブリッド形成ブロッカーの部分の3’である二本鎖部分を含むことを特徴とする請求項92に記載のキット。
- 二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項93に記載のキット。
- 第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成できる第2のオリゴヌクレオチド部の部分とハイブリッド形成できる第2のハイブリッド形成ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項83に記載のキット。
- キットであって、
(a)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分および第2の部分を含む第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素であって、第2のオリゴヌクレオチド部は第1のオリゴヌクレオチドの第1の部分とハイブリッド形成できる部分を含む第2の近接構成要素と;
(c)第1のオリゴヌクレオチド部の第2の部分とハイブリッド形成できる捕捉オリゴヌクレオチドを含む支持体と;
を含むことを特徴とするキット。 - 第1のオリゴヌクレオチドの第1および第2の部分はオーバーラップする塩基を含まないことを特徴とする請求項96に記載のキット。
- 第1のオリゴヌクレオチドの第1および第2の部分は隣接した塩基を共に含むことを特徴とする請求項96に記載のキット。
- 第1のオリゴヌクレオチドの第1および第2の部分は同じ塩基配列であることを特徴とする請求項96に記載のキット。
- 捕捉オリゴヌクレオチドまたは第1のオリゴヌクレオチド部は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の1つの鎖を含むことを特徴とする請求項96に記載のキット。
- 捕捉オリゴヌクレオチドは二本鎖部分を含むことを特徴とする請求項96に記載のキット。
- 捕捉オリゴヌクレオチドの二本鎖部分はヘアピンループを含むことを特徴とする請求項101に記載のキット。
- 捕捉オリゴヌクレオチドは、第1のオリゴヌクレオチド部とハイブリッドを形成できるRNA部分を含むことを特徴とする請求項96に記載のキット。
- 第1のオリゴヌクレオチド部は、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成できるRNA部分を含むことを特徴とする請求項96に記載のキット。
- キットであって、
(a)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含むテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含むオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素と;
(c)(i)オリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第1の部分および(ii)テザーオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第2の部分を含むスプリントオリゴヌクレオチドと;
を含むことを特徴とするキット。 - テザーオリゴヌクレオチドの3’末端は第1の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、オリゴヌクレオチド部の5’末端は第2の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項105に記載のキット。
- スプリントオリゴヌクレオチドは、第2の部分の3’に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位ならびに制限エンドヌクレアーゼ認識部位の3’および第1の部分の5’に位置する第1のプライマー結合性部位をさらに含み、オリゴヌクレオチド部は、オリゴヌクレオチド部の第1の部分の5’に位置する第2のプライマー結合性部位を含むことを特徴とする請求項105に記載のキット。
- キットであって、
(a)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第1のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1の部分を含む第2のテザーオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素と;
(c)(i)第1のテザーオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第1の部分および(ii)第2のスプリントオリゴヌクレオチドの第2の部分とハイブリッド形成できる第2の部分を含む第1のスプリントオリゴヌクレオチドと;
(d)(i)第2のテザーオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッド形成できる第1の部分および(ii)第1のスプリントオリゴヌクレオチドの第2の部分とハイブリッド形成できる第2の部分を含む第2のスプリントオリゴヌクレオチドと;
を含むことを特徴とするキット。 - 第1のテザーオリゴヌクレオチドの3’または5’末端は第1の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第2のテザーオリゴヌクレオチドの3’末端は第2の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項108に記載のキット。
- キットであって、
(a)分析物と複合体を形成することができて、且つ第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の分析物特異的結合単位を含む第1の近接構成要素であって、第1のオリゴヌクレオチド部は制限エンドヌクレアーゼ認識部位、DNAポリメラーゼによる第1のオリゴヌクレオチド部の3’伸長を妨げる3’キャップ、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位の3’である第1の部分を含む第1の近接構成要素と;
(b)分析物と複合体を形成することができて、且つ第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の分析物特異的結合単位を含む第2の近接構成要素であって、第2のオリゴヌクレオチド部は第1のオリゴヌクレオチド部の第1の部分とハイブリッドを形成することができる第1の部分を含む第2の近接構成要素と;
を含むことを特徴とするキット。 - 第2のオリゴヌクレオチド部は、第1の部分の5’である制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項110に記載のキット。
- 第1のオリゴヌクレオチド部の5’末端は第1の分析物特異的結合単位に複合体形成しており、第2のオリゴヌクレオチド部の5’末端は第2の分析物特異的結合単位に複合体形成していることを特徴とする請求項110に記載のキット。
- キットであって、
(a)第1の部分を含む第1のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第1の抗原を含む第1の近接構成要素であって、第1の抗原は少なくとも2つの抗原特異的結合性部位を含む分析物の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第1の近接構成要素と;
(b)第1の部分を含む第2のオリゴヌクレオチド部に複合体形成している第2の抗原を含む第2の近接構成要素であって、第2の抗原は分析物の別の抗原結合性部位と複合体を形成することができる第2の近接構成要素と;
を含むことを特徴とするキット。 - 非核酸分析物の定量方法であって、
(i)(a)オリゴヌクレオチド部に複合体形成している分析物特異的結合単位をそれぞれ含む第1および第2の近接構成要素と、
(b)既知の出発量の核酸対照と、
(c)既知の量の非核酸分析物と、
を含む複数の標準試料を形成することにより、第1および第2のオリゴヌクレオチド部の部分を含むアンプリコンを形成するステップ;
(ii)(a)オリゴヌクレオチド部に複合体形成している分析物特異的結合単位をそれぞれ含む第1および第2の近接構成要素と、
(b)同じ既知の出発量の核酸対照と、
(c)未知の量の非核酸分析物と、
を含む少なくとも1つの試験試料を形成することにより、第1および第2のオリゴヌクレオチド部の部分を含むアンプリコンを形成するステップ;
(iii)アンプリコンおよび核酸対照を増幅するステップ;
(iv)増幅したアンプリコンおよび核酸対照を測定して表示測定値を決定するステップ;
(v)複数の標準試料の表示測定値から検量曲線を決定するステップ;ならびに
(vi)少なくとも1つの試験試料の表示測定値を検量曲線と比較して試験試料中の非核酸分析物の量を決定するステップ;
を含むことを特徴とする非核酸分析物の定量方法。
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