CN107110853A - 确定TNFα抑制药及其相应抗药抗体的量的通用测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组件试剂盒和方法，用于确定各自包含少于200μl的一种或多种生物样品中的一种或多种TNF‑α抑制剂药物和/或抗TNF‑α抑制剂药物抗体的存在和量，所述方法包括以下步骤：提供反应液，反应液包含所述样品、包含TNF‑α和第一缀合部分的第一TNF‑α缀合物、和包含TNF‑α和第二缀合部分的第二TNF‑α缀合物，所述第二部分能够在包含TNF‑α抑制剂的分子复合物的存在下产生或改善可检测信号，然后在所述TNF‑α抑制剂药物、第一TNF‑α缀合物和第二TNF‑α缀合物之间形成复合物时检测信号改变。

Description

确定TNFα抑制药及其相应抗药抗体的量的通用测定法
技术领域
本发明涉及在可能已在TNFα抑制剂药物治疗中发展出抗体反应的患者中监测或测定生物样品中是否存在TNFα抑制剂药物及其抗体，例如抗药抗体(ADA)。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及确定包含少于200μl的生物样品、优选血样中的TNFα抑制剂药物的量的方法。
在另一实施方式中，本发明涉及确定包含少于200μl的生物(血液)样品中的针对TNFα抑制剂药物的一种或多种抗药抗体(ADA)的量的方法。
在另一实施方式中，本发明涉及确定包含少于200μl的生物(血液)样品中的TNFα抑制剂药物及其抗体的量的方法。
此外，本发明涉及用于确定生物样品中的TNFα抑制剂药物及其抗体的量的组件试剂盒。
背景技术
抗肿瘤坏死因子(TNF)疗法已成为用于管理若干种慢性免疫炎性疾病的重要手段。目前，已批准三种重组抗TNFα药物用于各种慢性炎性疾病例如类风湿性关节炎(RA)、克罗恩病和重度牛皮癣患者的临床应用：1)RemicadeTM(英夫利昔单抗)，小鼠-人IgG1-κ抗TNF-α单克隆抗体，2)EnbrelTM(依那西普)，人TNF受体2和人IgG1的融合蛋白，以及3)HumiraTM(阿达木单抗)，全人IgG1-κ抗TNF-α单克隆抗体。另外两种抗TNF-α抗体构建体已经在有相同疾病的患者的关键III期临床试验中表现出希望：4)CimziaTM CDP870(赛妥珠单抗)，人源化抗TNF-α单克隆抗体的聚乙二醇化Fab片段，和5)CNTO 148(戈利木单抗(golimumab))，全人IgG1-κ抗TNF-α单克隆抗体。所有这些蛋白质都显着降低疾病活动，并且在一些患者中可诱导消退。
然而不幸的是，并不是所有患者都有利地响应于抗TNF-α药物。一些患者根本不响应(原发性响应失败)，或者他们最初响应但随后复发(继发性响应失败)，尽管药物剂量增加和/或施用更频繁。这些响应失败的原因并不总是清楚，但个体间甚至个体内的生物利用度和药代动力学差异可能会导致这个问题。许多研究者、药物管制机构、健康保险公司和药物制造商目前已认识到，导致患者发展出抗抗体的药物免疫原性是个问题。因此，应当监测患者的功能性抗TNF-α药物的循环水平和抗抗体的发展，从而可以针对个体患者定制给药，并且可以有效和经济地提供延长的治疗，并且对患者几乎没有或没有风险。
重复输注后，抗TNF-α药物的中和作用的形成是个问题，这需要增加剂量或更频繁地施用药物，并且由于继发性响应失败和/或输注相关的副作用而可能需要中断治疗；已经在RA患者和其他免疫炎性疾病患者中观察到这一点。然而，在临床实践中，用英夫利昔单抗治疗的RA或任何其他慢性炎性疾病的患者可能与随机临床试验中的平均患者有很大差异。例如，即使英夫利昔单抗的初始生物利用度由于药物的静脉内给药而接近100％，药代动力学的差异可导致个体患者在输注之间的较长时间内具有不足的药物水平。这个问题可以因抗体的出现而放大。大量研究报道了RA和克罗恩病患者中针对TNF-α的治疗性蛋白质的浓度-效应关系，以及药物水平与ADA之间的反比关系。
实际上，因诱导针对生物药物(特别是TNFα抑制剂药物)的抗体(ADA)而引起的响应失败越来越多地被认识到。在药物长期递送时，即在数月或数年内定期给药时，针对生物药物的宿主(患者)抗体的发展有很大相关性。抗TNF-α药物通常长期递送。当测量ADA时，重要的是从非中和性ADA中识别出中和性ADA。
宿主抗体的发展可以通过增加剂量来补救，但这通常是延迟的和相当暂时的响应，因为处方剂量通常仅当患者症状明显恶化时增加，并且增加的剂量很可能导致患者免疫系统的进一步放大。通常，更优选的补救措施是更换治疗方案并使用另一种TNFα抑制剂药物。
因此，正确评估患者生物样品中的抗TNFα药物(TNFα抑制剂药物)及其抗体(ADA)的量对医学从业者构成普遍挑战。
已经采用不同方法来评估TNFα抑制剂药物及其抗药抗体的循环水平。其中一些基于酶免疫测定(EIA)，其中将TNFα抑制剂药物固定在塑料珠或孔上，并采用抗药抗体对标记的TNFα抑制剂药物的结合的桥接作为读出值。其他测定法通过选择性吸附来检测抗药物抗体和TNFα抑制剂药物的复合物，例如通过免疫球蛋白TNFα抑制剂的Fab与蛋白A的结合，或抗体对抗轻链Fab的结合。
然而，这些方法繁琐并且对于给定的TNFα抑制剂药物有特异性(该方法不能普遍应用并对几种不同TNFα抑制剂药物有效)。此外，这些方法可能不适用于在同一检测程序中检测和定量TNFα抑制剂药物及其抗体。
因此，开发出可用于监测几种TNFα抑制剂药物的生物利用度以及针对几种TNFα抑制剂药物的抗体发展的测定法具有直接的临床重要性。
因此，在本领域中不断地需要确定TNFα抑制剂药物及其抗体的替代方法，特别是普遍适用、并提供更高的准确性且具有更高的再现性的方法。
本发明的一个目的是提供这样的方法和用于所述方法中的组件试剂盒。
特别地，本领域中需要可以普遍应用的组件试剂盒和方法，从而使医学从业者可以使用相同的测定来评估不同的个体患者(这些患者可能使用不同处方药物)。本发明的一个目的是提供这样的方法和组件试剂盒。
用患者和用户友好型设备对血样中的分析物进行测量通常旨在分析由少于200μl的血液组成的血样。这些量可以容易地被个体患者获得，而不会有相关的严重健康风险。
因此，在本领域中需要能够分析含有少于200μl血液的血样中的TNFα抑制剂药物及其抗体的量的方法和装置。更具体地说，本领域中需要能够分析包含少于180μl血液、例如少于150μl、例如少于100μl、例如少于50μl、例如少于20μl、例如少于10μl、例如少于9μl、例如少于8μl、例如少于7μl、例如少于6μl、例如少于5μl、例如少于4μl、例如少于3μl、例如2μl或更少血液的血样中的TNFα抑制剂药物及其抗体的量的方法和装置。本发明的一个目的是提供这样的方法。
另一个挑战是增加每个分析的便捷性，优选增加到使患者在没有医学从业者的帮助的情况下就能够测量血液中TNFα抑制剂药物及其抗体的程度。此外，将成本降低到使每个测量可由消费者承受的水平也是一个挑战。
因此，本领域中需要允许准确且容易地测量血样中的TNFα抑制剂药物及其抗体的水平的方法和患者友好的组件试剂盒。此外，本领域中需要允许简单容易地处理样品和血液分析的方法和组件试剂盒。本发明的一个目的是提供这种方法。
发明内容
如上所述，本领域中普遍需要能够准确、灵敏和可重复地测量生物样品中的(多种)TNFα抑制剂药物及其抗体的水平的方法和患者友好的组件试剂盒。在一些实施方式中，本发明涉及的生物样品选自由血液、血清、淋巴液、淋巴结组织、脾组织、骨髓或源自一种或多种这些组织的富集了免疫球蛋白的组分组成的组。根据本发明，血样是指来自患者的全血样品或其衍生材料(例如血清)。
本发明的以上目的已经根据本发明得到了解决，本发明提供了一种检测(血液)样品中的TNFα抑制剂药物及其抗体的水平的高度有效且灵敏的测定法。
所述测定法的基本原理是利用“标记”的TNFα作为对TNFα抑制剂药物有特异性的通用配体。对通用配体进行标记以使其在TNF-α抑制剂药物的存在下形成分子复合物，该复合物能够产生或改善可检测信号。
因此，在第一实施方式中，本发明提供了一种确定各自包含少于200μl的一种或多种血液样品中的一种或多种不同的TNF-α抑制剂的存在和量的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含TNF-α和第一缀合部分的第一TNF-α缀合物，
b.提供包含TNF-α和第二缀合部分的第二TNF-α缀合物，所述第二部分能够在包含TNF-α抑制剂、第一TNF-α缀合物和第二TNF-α缀合物的分子复合物的存在下产生或改善可检测信号，
c.提供包含第一和第二TNF-α缀合物的反应液，并使所述样品与所述反应液接触，由此形成包含潜在含有TNF-α抑制剂的所述样品以及第一和第二TNF-α缀合物的检测液，
d.检测步骤c之后的信号变化(当形成了包含TNF-α抑制剂以及第一和第二TNF-α缀合物的复合物时)，和
e.通过将所得结果与内部标准进行比较，确定所述TNF-α抑制剂的量。
内部标准可以由预先制作的标准曲线提供，该标准曲线绘制了通过对具有已知(掺入了标准品的)含量的各特定TNF-α抑制剂药物的相应样品进行上述方法而产生的信号。由于结合亲和力的差异，测定法对不同的TNF-α抑制剂药物表现不同，这要求针对不同的TNF-α抑制剂药物的不同内部标准。
在本发明的一个实施方式中，还测量血红蛋白水平并用于评估血样中TNFα抑制剂药物及其抗体的相对水平。
第一和第二TNF-α缀合物
本发明的TNF-α缀合物(第一和第二TNF-α缀合物)在一些实施方式中可以是相同的，而在其它实施方式中可以以配对方式发挥功能。
在非常优选的实施方式中，TNF-α缀合物是用TNFα包被的固体颗粒。在这些实施方式中，第一和第二部分是固体颗粒，包含TNF-α抑制剂和第一和第二TNF-α缀合物的复合物的形成所提供的可检测信号可以是例如反应液和检测液的浊度变化。令人惊讶地观察到，在这样的实施方式中，单一一种TNF-α抑制剂药物能够结合并固定多于一种TNF-α缀合物(颗粒)，从而产生与药物浓度成比例的可检测的网。
然而，并且特别对于TNF-α抑制剂Enbrel，发现在加入将各个TNF-α抑制剂结合在一起(在除TNF-α结合位点之外的位点)的另一种配体(即TNFα抑制剂结合剂)时，显著提高了测定性能。作为这样的TNFα抑制剂结合剂(参见下文实施例1)的实例，加入多克隆兔抗人IgG Fc，其将单个的TNF-α抑制剂分子在除TNF-α结合位点之外的位点处结合在一起。
因此，在非常优选的实施方式中，本发明的方法包括：在反应液中进一步加入能够将单个的TNF-α抑制剂分子结合在一起的TNFα抑制剂结合剂。优选地，这样的额外配体是多克隆抗TNF-α抑制剂抗体，或针对TNF-α抑制剂分子的在TNFα结合中不参与相互作用的区域的抗体。作为TNFα抑制剂结合剂，可以使用或多或少特异性地结合两种或多种TNF-α抑制剂但在TNFα的结合中不参与相互作用的任何化合物或蛋白质(优选抗体)。TNFα抑制剂结合剂可以选自由抗Ig(例如Fc特异性或Fab特异性抗体)、蛋白G、蛋白A、蛋白H、蛋白L和蛋白A/G融合蛋白组成的组。因此，可以选择TNFα抑制剂结合剂来特异性地结合TNFα抑制剂的特定亚型，例如当使用蛋白A以高亲和力结合人IgG1和IgG2时。
应当理解，TNFα抑制剂结合剂通常不对具体的TNFα抑制剂具有特异性。通常，TNFα抑制剂结合剂将以不同的特异性结合相同或不同的抗体类别或亚型中的不同抗体。
在本发明的一个非常优选的实施方式中，第一和第二部分均为相同或不同尺寸的固体颗粒，例如聚苯乙烯颗粒、胶乳颗粒、琼脂糖凝胶(sepharose)或琼脂糖珠或其他多糖聚合物的珠、或磁性或顺磁珠。此外，在非常优选的实施方式中，当第一部分和第二部分是功能不成对的部分、即均为固体颗粒时，优选使用能够将一种TNF-α抑制剂与另一种TNFα抑制剂连接起来的TNFα抑制剂结合剂。
在本发明的另一优选实施方式中，TNF-α缀合物包括以配对方式发挥功能的第一和第二缀合物。这样的配对是例如包含与酶缀合的TNFα的第一TNFα缀合物和包含与所述酶的底物缀合的TNFα的第二TNFα缀合物。因此，在本发明的优选实施方式中，第一部分是酶且第二部分为第一部分的底物。这种系统的优选实例是辣根过氧化物酶(HRP)系统。
在本发明的另一个优选实施方式中，这样的配对是例如包含与荧光团缀合的TNFα的第一TNFα缀合物和包含与所述荧光团的调节剂(例如猝灭剂)缀合的TNFα的第二TNFα缀合物。因此，在本发明的优选实施方式中，第一部分是荧光团，第二部分是由第一部分提供的荧光的调节剂。这样的系统的优选实例是基于抗体的均相邻近延伸测定法，例如来自Perkin Elmer的基于荧光的α筛选或来自Beckman Coulter的基于化学发光的SPARCL(Spatial Proximity Analyte Reagent Capture Luminescence)技术。
根据本发明，荧光团是指在反应和检测液中存在时会引起可检测的电磁辐射(光)发射的试剂或元件，例如光致发光或化学发光标记化合物。在优选实施方式中，荧光团是对不同波长的光的照射或接触做出响应而发射可检测光的试剂。
掺样测试
令人惊奇地发现，可以确定用本发明的方法(通过检测患者来源的抗药抗体的存在/不存在)测量的TNF-α抑制剂的量的测量是有效的，和/或可以使用间接测量在相同测定中检测和定量样品中的患者来源的抗药抗体水平，其中在所述样品中已掺入了已知量的相应TNF-α抑制剂。
通过将所得测量值与所述测量值的预期结果(包含掺入量的TNFα药物)相比较，可以确立样品中是否存在抗药抗体。如果存在，则TNF-α抑制剂的测得量应小于掺入了标准量的样品中的预期量。
通过将多于一个的所获测量值与所述测量值的相应预期结果进行比较，可以确立样品中抗药物抗体的量(见下文实施例2)。
因此，在高度优选的实施方式中，本发明的方法包括以下额外步骤：在步骤d中进行检测之前，将一种或多种已知量的TNF-α抑制剂掺入样品或反应液中，从而提供一种确定样品中TNF-α抑制剂的存在的测量结果的有效性的方法，并进一步提供一种确定样品中一种或多种不同的TNF-α抑制剂抗体的存在和量的方法。
本文所用术语抗TNFα抑制剂药物抗体(ADA)是指源自受试者的生物样品的特异性识别特定TNFα抑制剂药物的多种抗体。它可以是同一抗体类别或同种型(例如IgG、IgE、IgA、IgD和IgM)内的多种抗体。因此，在一些实施方式中，被检测或测量的ADA属于特定的抗体同种型(例如IgG和/或IgE)。通常，生物样品的特定抗体尚未针对任何特定成分(例如生物样品的特定抗体)进行过纯化。本文中ADA量的测量是指确定受试者中(例如在样品中，或在对应于该样品的组织中)针对TNFα抑制剂药物的宿主来源的抗体的浓度。
因此，本发明还涉及确定一种或多种各自包含少于200μl的血样中的一种或多种不同的TNF-α抑制剂药物抗体(ADA)的存在和量的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含TNF-α和第一缀合部分的第一TNF-α缀合物，
b.提供包含TNF-α和第二缀合部分的第二TNF-α缀合物，所述第二部分能够在包含TNF-α抑制剂、第一TNF-α缀合物和第二TNF-α缀合物的分子复合物的存在下产生或改善可检测信号，
c.提供反应液，所述反应液包含第一和第二TNF-α缀合物以及含有已知量的所述TNF-α抑制剂的掺入物，并使样品与所述反应液接触，由此形成检测液，所述检测液包含：所述样品(潜在地包含TNF-α抑制剂药物抗体)、掺入量的所述TNF-α制剂以及第一和第二TNF-α缀合物(可以在样品或反应液中加入掺入量的TNF-α抑制剂药物)，
d.检测步骤c之后的信号变化(当形成包含TNF-α抑制剂以及第一和第二TNF-α缀合物的复合物时)，和
e.通过将所得结果与内部标准进行比较，确定所述TNF-α抑制剂的量，
f.通过将所得结果与内部标准进行比较，确定所述TNF-α抑制剂抗体是否存在，信号变化小于在反应液中加入样品和掺入物后所预期的变化则表明存在TNF-α抑制剂抗体。
在优选的实施方式中，步骤a-f至少重复进行一次，其中，使用已知量的所述TNF-α抑制剂的第二掺入物，或者作为另选，包括额外的步骤g和h：提供已知量的所述TNF-α抑制剂的第二掺入物，在步骤d后向所述检测液中加入第二掺入物，并且随后检测加入第二掺入物所提供的信号变化，并确定所述样品中TNF-α抑制剂抗体的量。
由于本发明的方法可以普遍地用于不同类型的TNFα抑制剂药物，因此本发明的方法非常适合于提供可直接用于临床测量个体患者体内的处方药物(药)水平的通用测定法。
因此，在本发明的优选实施方式中，TNF-α抑制剂是处方药。目前优选的处方药选自依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)和戈利木单抗(Simponi)。
在一个实施方式中，本发明是用于确定样品中的TNF-α抑制剂的量和/或确定样品中的TNF-α抑制剂抗体的量的组件试剂盒，所述组件试剂盒包含：
a.上文定义的包含TNF-α和第一缀合部分的第一TNF-α缀合物，
b.上文定义的包含TNF-α和第二缀合部分的第二TNF-α缀合物，
c.各自包含已知量的TNF-α抑制剂药物的一种或多种掺入物标准溶液。
本发明的用于检测测量的优选装置是能够检测在200μl或更少的样品检测液中产生的或改善的信号的装置。这样的装置包括例如和类似装置，例如Atonomics A/S名下的EP2281631及相关申请所述的装置。
优选的是，所述组件试剂盒包含多于一种TNF-α抑制剂的标准溶液(掺样溶液)，例如优选包含至少两种不同的TNF-α抑制剂的至少两种不同的掺入物标准溶液。在优选实施方式中，所述组件试剂盒包括包含至少三种、例如至少四种不同的TNF-α抑制剂药物的至少三种、例如至少四种不同的掺入物标准溶液。优选的是，本发明的组件试剂盒包含TNF-α抑制剂依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)和戈利木单抗(Simponi)中至少两种的标准掺入物溶液。
在本发明高度优选的实施方式中，所述组件试剂盒包含TNF-α抑制剂依那西普(Enbrel)的至少一种标准掺入物溶液。
在优选的实施方式中，所述组件试剂盒还包含TNFα抑制剂结合剂，即，能够将单个的TNF-α抑制剂结合在一起的配体。优选的是，这种额外的配体是多克隆抗TNFα抑制剂抗体，或针对TNFα抑制剂分子的在TNFα的结合中不参与相互作用的区域的抗体。
当测量ADA时，重要的是从非中和性ADA中鉴定出中和性ADA。将患者的非应答者资料与本专利申请中描述的掺样重获方法相结合，使得可以为对特定抗TNFα药物临床反应不足的患者提出治疗方案。
本发明的测定法还可以包括测量潜在中和性ADA池中的IgG4抗体。检测IgG4抗体对基于“桥式”ELISA的测定而言一直是个挑战，因为IgG4抗体是单价的。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种治疗正在接受TNF-α抑制剂药物治疗的患者的疾病的方法，所述方法包括：对源自患者的样品执行本发明的方法，以确定该患者是需要改变该TNF-α抑制剂药物的剂量方案还是需要替代性的TNF-α抑制剂药物或替代性的药物疗法。
本发明的方法还可用于鉴定对于特定TNFα治疗的原发非应答者或低应答者。这些患者例如可以是对该TNFα抑制剂恰好具有先天免疫球蛋白响应或预先发展的免疫球蛋白响应的患者。
因此，在另一个实施方式中，本发明涉及一种鉴定患者疾病的最佳TNF-α抑制剂药物治疗的方法，所述方法包括：对源自患者的样品执行本发明的方法，以确定该患者是需要改变该TNF-α抑制剂药物的剂量方案还是需要替代性的TNF-α抑制剂药物或替代性的药物疗法。
本发明的方法也可以例如用于鉴定具有继发性响应失败的患者。继发性的响应失败可以是无症状的，即，唯一的症状是治疗变得效果降低甚至无效。在这种情况下，使用本发明的方法可以在患者或医疗从业者注意到治疗效果降低之前鉴定出继发性响应失败的发展。可以应用更高的治疗剂量以确保实现正确和有效的体内浓度，或者可以选择替代性治疗，或其组合。
因此，本发明包括一种确定患者缺乏治疗响应是否是因为形成了针对TNFα抑制剂的源于患者的抗体的方法。因此，本发明提供了一种(使用本文所述的方法步骤)为患有可用TNFα抑制剂治疗的疾病的患者选择适当的药物治疗的方法。
实施例
测定法原理
将TNFα(人)固定在羧化聚苯乙烯颗粒(R1)上。TNFα抑制剂药物与TNFα包被的颗粒结合并促进颗粒凝集。为了增强颗粒凝集反应(响应于TNFα抑制剂药物的存在)，加入多克隆兔抗人IgG Fc(R2)，其与TNFα抑制剂分子相互作用。
试剂1：HEPES pH 7.2 10mmol/L聚乙二醇(PEG)，NaCl，与羧化聚苯乙烯颗粒结合的人TNFα分子，去垢剂，和稳定剂。
试剂2：硼酸盐缓冲液4.6mmol/L，多克隆多克隆兔抗人IgG Fc，聚乙二醇(PEG)，NaCl，去垢剂，和稳定剂。
实施例1.TNFα抑制性通用药物的测定程序
实施例1的目的是调查在单独的测定(Enbrel测定和Humira测定)中，以相同的亲和配体(TNFα)与颗粒结合，是否可以采用所开发的测定原理(在颗粒增强型免疫比浊法测量的实施方式中)来测量不同的TNFα药物(Enbrel和Humira)。
样品
将依那西普掺入不含任何种类的药物或抗药抗体的人血浆中，并利用颗粒增强型免疫比浊法进行测量。数据如表1所示。
将阿达木单抗(Humira)掺入不含任何种类的药物或抗药抗体的人血浆中，并利用颗粒增强型免疫比浊法进行测量。数据如表1所示。
测定原理
测定
将含有TNFα抑制剂的样品加入到含有试剂1的反应液中。将试剂2加入到反应中，并测量570nm处的吸光度的发展。
表1
利用颗粒增强型免疫比浊法测量阿达木单抗和依那西普。
如表1所示，在免疫比浊法测定设置中，两种TNFα抑制性抗炎药物中的每一种都在不同浓度下产生了不同信号，这最有可能是由于对固定在聚苯乙烯颗粒上的TNFα分子的不同亲和力。
该实施例表明利用所述方法可以准确测量人样品(不含抗药抗体)中不同的TNFα抑制剂的浓度。
实施例2.测量抗药抗体(ADA)的存在
实施例2的目的是调查该方法是否可用于检测ADA的存在。
掺样和重获值(recovery)可用于验证免疫测定的分析有效性。如果没有其他种类的结合剂来竞争分析物，并且将已知量的分析物添加到人血液、血清或血浆样品中，则随后对掺入了标准品的样品的分析应当在测定误差范围(通常为+/-5％)内给出100％掺入量的分析物。
例如，如果将2ug/mL的药物掺入正常的人样品中，则可以预期在随后的分析中发现1.90μg/mL至2.10μg/mL。
然而，将已知量的药物掺入已经皮下注射该药物数个月的患者(或来自该患者的样品)中可能会得到因存在ADA而大幅变小的重获值。
两个或多个掺样点和重获值点使得可以对ADA浓度及其平均亲和力常数进行定量确定。
结合性蛋白(例如抗体)及其目标分析物之间的相互作用由质量作用定律(Eq 1)支配：
1.K＝C/(Ag)(Ab)
其中C是抗体-分析物复合物的摩尔浓度，Ag是游离或未结合的分析物的浓度，并且Ab是未在复合物中与分析物结合的抗体的浓度。
该等式可以用x来重写，该x是复合物中结合的总分析物(Ag0)的比例
2.C＝x Ago其中
3.Ag＝(1-x)Ago
4.Ab＝Abo-xAgo
代入获得等式5
5.K＝xAgo/((1-x)Ago*(Abo-xAgo))
其简化为等式6
6.K＝x/(1-x)(Abo-xAgo)
两侧通乘并进行移项得到等式7
7.(1-x)*(Abo-xAgo)＝x/K，其可以进一步简化为等式8
8.Abo-x(Ago+Abo)+x^2Ago＝x/K，并进而得到等式9
9.X^2Ago-x(Ago+Abo+1/K)+Abo＝0
经检查，等式9是二次方程的形式，并且具有等式10中给出的解
10.X＝((b^2-4ac)1/2)/@＝2a
其中a＝Ago,b＝Ago+Abo+1/K并且c＝Abo
表2对于K和Abo的设定值，该表显示了各种水平的总药物(Ago)的结合药物和游离药物的量
在抗药抗体的存在下，只有游离药物能够在测定法中被测量出。抗药抗体复合物中结合的药物因空间位阻而不能参与另一种结合相互作用。
在药物总量为8μg/mL的情况下，游离药物的表观量经测量为1.18μg/mL。
如果掺入另外4ug/mL的药物，总药物浓度现在将是12μg/mL。但只能看到游离药物水平的观察者将检测到仅1.90ug/mL，而不是1.18ug/mL加上4μg/mL的掺入值，或5.18ug/mL。只有36.6％的预期药物水平会被看到，因为绝大多数的药物(内源性和掺入的)都束缚在抗药复合物中。
因此，所述方法能够用于评估样品中ADA的真实水平。

Claims (15)

1.一种确定各自包含少于200μl的一种或多种生物样品中的一种或多种不同的TNF-α抑制剂的存在和量的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含TNF-α和第一缀合部分的第一TNF-α缀合物，
b.提供包含TNF-α和第二缀合部分的第二TNF-α缀合物，所述第二部分能够在包含TNF-α抑制剂、第一TNF-α缀合物和第二TNF-α缀合物的分子复合物的存在下产生或改善可检测信号，
c.提供包含第一和第二TNF-α缀合物的反应液，并使所述样品与所述反应液接触，由此形成包含潜在含有所述TNF-α抑制剂的所述样品以及第一和第二TNF-α缀合物的检测液，
d.检测步骤c之后的信号变化，和
e.通过将所得结果与内部标准进行比较，确定所述TNF-α抑制剂的量。
2.如权利要求1所述的方法，其中，第一和第二部分为固体颗粒，或者其中，第一部分是酶且第二部分是第一部分的底物，或者其中，第一部分是荧光团且第二部分是第一部分所提供的荧光的调节剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中，第一和第二部分均为固体颗粒，并且其中，在所述反应液中加入能够将一种TNF-α抑制剂与另一种TNF-α抑制剂连接起来的TNF-α抑制剂结合剂。
4.如权利要求2所述的方法，其中，第一部分是辣根过氧化物酶(HRP)且第二部分是HRP的底物。
5.如权利要求2所述的方法，其中，第一部分是荧光团且第二部分是猝灭剂，例如SPARCL系统。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，所述方法包括以下额外步骤：在步骤d中进行的检测之前，在所述样品或反应液中掺入一种或多种已知量的TNF-α抑制剂。
7.一种确定一种或多种各自包含少于200μl的生物样品中的一种或多种不同的TNF-α抑制剂药物抗体的存在和量的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含TNF-α和第一缀合部分的第一TNF-α缀合物，
b.提供包含TNF-α和第二缀合部分的第二TNF-α缀合物，所述第二部分能够在包含TNF-α抑制剂和第一TNF-α缀合物以及第二TNF-α缀合物的分子复合物的存在下产生或改善可检测信号，
c.提供反应液，所述反应液包含第一和第二TNF-α缀合物以及含有已知量的所述TNF-α抑制剂的掺入物，并使样品与所述反应液接触，由此形成检测液，所述检测液包含：潜在含有所述TNF-α抑制剂药物抗体的所述样品、掺入量的所述TNF-α抑制剂以及第一和第二TNF-α缀合物，
d.检测步骤c之后的信号变化，和
e.通过将所得结果与内部标准进行比较，确定所述TNF-α抑制剂的量，和
f.通过将所得结果与内部标准进行比较，确定所述TNF-α抑制剂抗体是否存在。
8.如权利要求7所述的方法，所述方法包括：步骤a-f至少重复进行一次，其中，使用已知量的所述TNF-α抑制剂的第二掺入物，或者，所述方法包括额外的步骤g和h：提供已知量的所述TNF-α抑制剂的第二掺入物或在步骤d后向所述检测液中加入所述第二掺入物，并且随后检测加入第二掺入物所提供的信号变化，并确定所述样品中TNF-α抑制剂抗体的量。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述TNF-α抑制剂是处方药物。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述药物选自依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)和戈利木单抗(Simponi)。
11.一种确定样品中TNF-α抑制剂药物和/或TNF-α抑制剂药物抗体的量的组件试剂盒，所述组件试剂盒包含：
a.权利要求1～5中定义的包含TNF-α和第一缀合部分的第一TNF-α缀合物，
b.权利要求1～5中定义的包含TNF-α和第二缀合部分的第二TNF-α缀合物，
c.各自包含已知量的TNF-α抑制剂的一种或多种掺入物标准溶液。
12.如权利要求11所述的组件试剂盒，其还包含TNFα抑制剂结合剂。
13.如权利要求11或12所述的组件试剂盒，其包含含有不同的TNF-α抑制剂的至少两种不同的掺入物标准溶液。
14.如权利要求11～13中任一项所述的组件试剂盒，其中，所述掺入物标准溶液中的TNF-α抑制剂选自依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)和戈利木单抗(Simponi)。
15.如权利要求14所述的组件试剂盒，其中，所述掺入物溶液中的至少一种所述TNF-α抑制剂是依那西普(Enbrel)。
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