PT1886140E - Ensaios imunológicos e anticorpos para a hormona antimülleriana - Google Patents

Description

ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Ensaios imunológicos e anticorpos para a hormona antimulleriana"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do invento 0 presente invento refere-se, de um modo geral, a ensaios e métodos imunológicos para medir compostos biológicos. Mais especificamente, o presente invento refere-se a novos métodos de medição da hormona antimulleriana (HAM) numa amostra, incluindo uma amostra de mamífero como seja uma amostra humana, de ratinho ou de rato. Em particular, são disponibilizados anticorpos que se ligam à região madura da hormona antimulleriana.

Descrição da arte relacionada A hormona antimulleriana (HAM), também conhecida por substância inibidora mulleriana (SIM), é uma hormona do tipo glicoproteina dimérica de 140 quilodalton (kDa) pertencente à superfamilia do factor de crescimento transformante β (TGF-β), que inclui o TGF-β e as várias glicoproteínas inibina e activina (Teixeira et al., 2001). Todos os membros desta superfamilia são glicoproteínas diméricas, e todos eles estão envolvidos na regulação do crescimento e da diferenciação dos tecidos. Em comum com outras proteínas TGF-β, a HAM é sintetizada sob a forma de um precursor grande, com uma sequência sinal curta seguida da pré-pró-hormona que forma homodimeros. Antes da secreção, a hormona madura passa pelos processos de glicosilação e de dimerização para produzir um dímero de 140 kDa constituído por subunidades monoméricas idênticas de 70 kDa, que estão ligadas por meio de ligações dissulfureto; cada monómero contém um domínio N-terminal (também designado por região "pró") e um domínio C-terminal (também designado por região "madura"). Em contraste com outros membros da superfamilia TGF-β, acredita-se que a HAM necessita que o domínio N-terminal potencie a actividade do domínio C-terminal para atingir uma bioactividade total (Wilson et al., 1993). Entre 5-20% da HAM é depois clivada num 2 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ local específico entre o domínio N-terminal (a região pró) e o domínio C-terminal (a região madura) do monómero de 70 kDa durante o trânsito citoplasmático, para formar dois polipéptidos de 58 kDa (região pró) e 12 kDa (região madura) . Estas duas partes do monómero permanecem em ligação não covalente. O gene humano que codifica a HAM foi sequenciado e isolado e encontra-se localizado no braço curto do cromossoma 19 (Picard et al., 1986). A estrutura de um receptor específico para a ham também foi isolada e caracterizada (di Clemente et al., 1994; Barrends et al., 1995) . Entre espécies, a HAM retém 11 a 12 resíduos de cistina conservados, dos quais sete estão localizados na região madura. Esta região apresenta o maior grau de homologia de sequência de aminoácidos entre espécies, em que 108 dos últimos 112 resíduos são conservados entre as sequências do rato e do ser humano (Lee et al., 1993). A HAM desempenha um papel importante na diferenciação sexual durante o desenvolvimento. A ham é produzida pelas células de Sertoli dos testículos no macho e pelas células da granulosa dos ovários na fêmea. Durante o desenvolvimento fetal nos machos, a secreção de HAM a partir das células de Sertoli testiculares é essencial para a regressão dos canais mullerianos e, por conseguinte, para o normal desenvolvimento do aparelho reprodutor masculino (Picon et al., 1969). Os canais mullerianos são o primórdio do útero, das trompas de Falópio e da parte superior da vagina na fêmea. No macho, a secreção de HAM pelas células de Sertoli começa durante a embriogénese e continua ao longo da vida. Os níveis caem após a puberdade, diminuindo lentamente até um valor pós-puberdade relativamente baixo (Teixeira et al., 2001). Na fêmea, a HAM sérica é mantida em níveis relativamente baixos em comparação com o macho. Após a puberdade, quando o ciclo menstrual tem inicio, a HAM circulante diminui lentamente ao longo da vida e torna-se indetectável na menopausa. Em ratinhos, a ablação da função HAM provoca uma perda incrementada dos folículos ováricos e uma cessação prematura do ciclo ovárico (Durlinger et al., 1999) .

Foram identificadas várias aplicações clínicas para a medição da HAM sérica em seres humanos. Entre estas encontram-se o diagnóstico de condições intersexo em crianças 3 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ (Lee et al., 2003), a puberdade precoce e o começo atrasado da puberdade, a criptorquidia, a anorquidia e a avaliação da função gonadal masculina (Teixeira et al., 2001). Outras aplicações potenciais incluem a investigação da transição perimenopausa nas mulheres, e a detecção e monitorização de doentes com cancro das células da granulosa (Long et al., 2000). Investigações recentes mostraram que a HAM tem potencial como marcador circulante em termos da avaliação da reserva ovariana e da fertilidade nas mulheres (van Rooij et al., 2002; te Velde et al., 2002; Gruijters et al., 2003). Após vários anos em que a HAM podia ser descrita como um analito esotérico, existe agora um interesse considerável no seu potencial como marcador clinico de rotina.

Quase todos os estudos de pesquisa anteriores relacionados com a HAM foram efectuados utilizando um de dois imunoensaios. Um ensaio desenvolvido por Hudson et al. (Hudson et al., 1990) utiliza dois anticorpos monoclonais produzidos contra a HAM humana recombinante, em que ambos são dirigidos para epitopos na região pró da molécula. A utilização deste ensaio para medir a HAM em seres humanos, desde a infância até à idade adulta, foi referida por Lee et al. (1996). Lee et al. (1996) também referem que a HAM é estável quando é armazenada a -20°C durante até 2 anos ou durante até três ciclos de congelação-descongelação, mas que os valores medidos aumentaram 2 a 3 vezes acima dos 2 anos de armazenamento e diminuíram em 50% ou mais após três ciclos de congelação-descongelação. Além disso, Lee et al. (1996) referem que os anticorpos utilizados no ensaio de Hudson não reconhecem o fragmento carboxi-terminal (região madura) da HAM e que, embora sejam extremamente específicos para a HAM humana não processada completa (em que não processada significa não estar clivada entre as regiões pró e madura do monómero de 70 kDa), possuem uma afinidade muito mais baixa para o fragmento amino-terminal (região pró) do que para a proteína não processada. Por conseguinte, alguma da variabilidade individual nas concentrações de HAM referida por Lee et al. (1996) poderá dever-se a diferenças na extensão do processamento da proteína HAM que ocorre in vivo. Lee et al. (1996) também referem que os anticorpos do ensaio de Hudson reconhecem a HAM de primatas não humanos, assim como a HAM humana, mas não reconhecem a HAM bovina ou de roedores. Um segundo ensaio empregue nos estudos 4 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ de pesquisa referentes à HAM utiliza um par de anticorpos monoclonais, um dos quais é para um epitopo na região pró e o outro é para um epitopo na região madura da HAM humana (Long et al., 2000). Um terceiro ensaio descrito mais recentemente utiliza dois anticorpos monoclonais dirigidos contra a região pró (Al-Qahtani et al., 2005). A ocorrência de proteólise da HAM em amostras, medida utilizando os ensaios actualmente disponíveis, também foi referida, pelo que poderá ser necessário prestar uma atenção particularmente especial aos processos de recolha e de armazenamento das amostras caso se pretenda obter resultados fiáveis. A região pró da HAM está sujeita a clivagem proteolítica durante a incubação em solução (Cate et al., Patente US 5,359,033). A região madura da HAM é mais estável face à proteólise em comparação com a região pró, em parte devido aos seus múltiplos residuos de cistina.

Os ensaios anteriores da HAM medem a HAM humana, mas não podem ser utilizados para medir a HAM em amostras de roedores, provavelmente porque a sequência de aminoácidos da região pró varia consideravelmente entre espécies. A homologia da sequência de aminoácidos total das regiões pró na HAM de ratinho, de rato, humana, bovina e de galinha varia entre 37-89% (GenBank, base de dados genética de National Centers for Biotechnology Information (NCBI)). Ensaios que podem ser utilizados para medir a HAM em várias espécies, incluindo espécies de mamíferos como o ratinho e o rato, assim como os seres humanos, não estavam anteriormente disponíveis na arte. Além de aplicações clinicas, estes ensaios de medição da HAM teriam aplicações úteis em pesquisas relacionadas com várias aplicações clinicas e de outro tipo. Adicionalmente, as aplicações da medição da HAM beneficiariam da existência de ensaios que proporcionem valores estáveis e precisos da HAM medidos em amostras, incluindo medições da HAM que não sejam afectadas pela proteólise da hormona. O presente invento disponibiliza composições e métodos para medir a HAM numa amostra e anticorpos que se ligam à região madura da HAM. O presente invento também disponibiliza composições e métodos para medir a HAM em amostras biológicas, incluindo amostras de mamíferos como sejam as amostras 5 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ humanas, de macaco, de ratinho, de rato, bovinas e de cavalo. Adicionalmente, o presente invento disponibiliza composições e métodos para medir a HAM numa amostra, em que a quantidade de ham medida não é afectada pela proteólise da HAM na amostra. Por conseguinte, o presente invento satisfaz estas necessidades e desejos de longa data da arte.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento descreve composições e métodos para medir a hormona antimulleriana (HAM) numa amostra.

Uma concretização do presente invento descreve uma composição compreendendo um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que o primeiro anticorpo se liga a um primeiro epitopo numa região madura de uma hormona antimulleriana e o segundo anticorpo se liga a um segundo epitopo numa região madura de uma hormona antimulleriana, em que o primeiro epitopo ao qual se liga o primeiro anticorpo é diferente do segundo epitopo ao qual se liga o segundo anticorpo, de modo que a ligação de um anticorpo ao seu epitopo não interfere com a ligação do outro anticorpo, em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compreendem anticorpos monoclonais.

Outra concretização descreve um método para medir uma quantidade de uma hormona antimulleriana numa amostra contendo hormona antimulleriana, que compreende: ligar um primeiro anticorpo a uma hormona antimulleriana, em que o primeiro anticorpo se liga a um primeiro epitopo numa região madura da hormona antimulleriana; ligar um segundo anticorpo à hormona antimulleriana, em que o segundo anticorpo se liga a um segundo epitopo na região madura da hormona antimulleriana, criando, deste modo, uma quantidade de segundo anticorpo ligado; medir a quantidade de segundo anticorpo ligado; e calcular a quantidade de hormona antimulleriana na amostra, em que o primeiro epitopo ao qual se liga o primeiro anticorpo é diferente do segundo epitopo ao qual se liga o segundo anticorpo, de modo que a ligação de um anticorpo ao seu epitopo não interfere com a ligação do outro anticorpo, em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compreendem anticorpos monoclonais. 6 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ A composição para medir uma quantidade de hormona antimulleriana numa amostra poderá compreender adicionalmente um suporte sólido acoplado ao primeiro anticorpo e um marcador acoplado ao segundo anticorpo.

Outros aspectos, caracteristicas e vantagens adicionais do presente invento serão evidentes a partir da descrição que se segue das concretizações actualmente preferidas do invento. Estas concretizações são disponibilizadas para efeitos de descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

De modo que a forma em que as caracteristicas, vantagens e objectivos do invento acima referidos, bem como outros que serão evidentes, seja obtida e possa ser compreendida em detalhe, descrições mais particulares do invento resumido acima poderão ser obtidas por meio de referência a certas das suas concretizações que estão ilustradas nas figuras anexas. Estas figuras constituem uma parte das concretizações preferidas do invento e, por conseguinte, não devem ser consideradas limitativas no seu âmbito.

As Figuras l(A-B) ilustram transferências de Western demonstrando que o anticorpo F2B7A (anticorpo 7A) para HAM se liga à HAM humana e de rato em condições redutoras e não redutoras.

As Figuras 2(A-B) ilustram transferências de Western demonstrando que o anticorpo F2B12H (anticorpo 12H) para HAM reconhece a região madura de ambas as HAM humana e de rato em condições não redutoras. A Figura 3 representa o processamento proteolitico da HAM humana recombinante nas regiões pró e madura. 0 "local de clivagem adicional", que existe no interior da região pró da HAM humana recombinante, também está representado.

As Figuras 4(A-C) representam ensaios de transferência de Western de HAM humana recombinante e de HAM de rato pesquisados com os anticorpos para HAM 5/6, 2/6 e 9/6 como sondas, em que a HAM humana (hHAM) foi armazenada sob várias 7 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ condições. A Figura 4A mostra que o anticorpo 5/6 reconhece a região madura (12 kDa) da HAM humana recombinante e da HAM de rato. A Figura 4B ilustra como o anticorpo 2/6 reconhece a região pró da HAM humana recombinante, incluindo ambas as bandas que são produzidas após a clivagem proteolitica do "local de clivagem adicional". 0 epitopo do anticorpo 2/6 é, pois, estável à proteólise, uma vez que o anticorpo reconhece ambas as bandas. 0 anticorpo 2/6 não reconhece a HAM de rato. A Figura 4C mostra que o anticorpo 9/6 reconhece a região pró da HAM humana e de rato, mas não reconhece o fragmento mais pequeno após a clivagem proteolitica da região pró da HAM humana recombinante no "local de clivagem adicional". 0 epitopo do anticorpo 9/6 não é, por conseguinte, estável à proteólise. A Figura 5 representa os níveis de HAM medidos ao longo da vida no ratinho fêmea, por meio de um imunoensaio que utiliza os anticorpos 12H e 7A. Os resultados mostram um declínio da HAM sérica com a idade em ratinhos fêmea.

As Figuras 6(A-B) ilustram medições dos níveis séricos de HAM durante o ciclo éstrico em ratinhos fêmea, utilizando os anticorpos 12H e 7A num imunoensaio. A Figura 6 (A) representa um gráfico de barras das medições de HAM no ratinho em diferentes fases do ciclo éstrico. A Figura 6 (B) representa um gráfico da correlação do número de folículos antrais pequenos em diferentes fases do ciclo éstrico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento refere-se a composições e métodos para medir a hormona antimulleriana (HAM) numa amostra.

0 presente invento descreve uma composição compreendendo um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que o primeiro anticorpo se liga a um primeiro epitopo numa região madura de uma hormona antimulleriana e o segundo anticorpo se liga a um segundo epitopo numa região madura de uma hormona antimulleriana. Estes anticorpos são úteis em imunoensaios para medir uma quantidade de HAM numa amostra. O primeiro e o segundo anticorpos são anticorpos monoclonais. Estes anticorpos poderão ligar-se a epítopos na região madura da HAM 8 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ ou a epítopos que estão parcialmente localizados na região madura da HAM e parcialmente localizados na região pró da HAM. 0 primeiro epitopo ao qual se liga o primeiro anticorpo é diferente do segundo epitopo ao qual se liga o segundo anticorpo, de modo que a ligação de um anticorpo ao seu epitopo não interfere com a ligação do outro anticorpo. 0 primeiro e o segundo anticorpos também poderiam compreender fragmentos de anticorpo.

Em um aspecto, um suporte sólido poderá ser ligado ao primeiro anticorpo. Um anticorpo poderá ser preso ou aplicado como revestimento sobre tal suporte sólido, utilizando técnicas conhecidas na arte. Os exemplos de um suporte sólido ou, em alternativa, de uma partícula em fase sólida incluem uma superfície de ligação a proteínas, como seja uma placa de microtitulação, uma partícula de metal coloidal, uma partícula de óxido de ferro, uma partícula de látex ou uma esfera polimérica. Outros exemplos de um suporte sólido ou de uma partícula em fase sólida incluem uma esfera paramagnética, a celulose, a agarose, o carvão revestido com dextrano, o Ficoll, o Sephadex, esferas de vidro, esferas cerâmicas ou outras substâncias inertes conhecidas na arte e adequadas para a ligação a proteínas.

Em outro aspecto, um segundo anticorpo poderá estar acoplado a um marcador, embora, em alternativa, ambos o primeiro e segundo anticorpos possam estar acoplados a um marcador diferente. Este marcador poderá ser acoplado ou conjugado com um anticorpo, utilizando técnicas conhecidas na arte. Os tipos representativos de marcadores incluem um agente quimioluminescente, um agente colorimétrico, um agente de transferência de energia, uma enzima, um agente fluorescente ou um radioisótopo. Estes agentes produzem um sinal detectável que é medido utilizando métodos conhecidos na arte; as medições são depois utilizadas para calcular a quantidade de um analito numa amostra, usando técnicas padrão. Os exemplos de agentes quimioluminescentes incluem uma enzima que produz um sinal quimioluminescente na presença de (um) substrato(s) que produz(em) energia quimioluminescente quando reage(m) com a enzima. Os exemplos de enzimas deste tipo incluem a peroxidase de rábano (HRP de "horseradish peroxidase") e a fosfatase alcalina. Outros exemplos de agentes 9 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ quimioluminescentes incluem um marcador quimioluminescente directo não enzimático, como seja o sistema do éster de acridinio. Os exemplos de agentes colorimétricos incluem uma enzima como a peroxidase de rábano, a fosfatase alcalina e a acetilcolina-estearase (AChE). Um exemplo de um agente de transferência de energia consiste nos quelatos de lantanídeos fluorescentes; os corantes fluorescentes poderão ser utilizados como agentes fluorescentes. Os radioisótopos representativos incluem 125i, 14C e 3H.

Em outra concretização do presente invento, as composições e métodos aqui descritos são úteis para medir uma quantidade de hormona antimulleriana numa amostra de mamíferos, que poderá incluir a hormona antimulleriana de primata, roedor, equina ou bovina. A hormona antimulleriana de primata poderá incluir uma hormona antimulleriana humana, e a hormona antimulleriana de roedor poderá incluir uma hormona antimulleriana de ratinho ou de rato. A amostra contendo a hormona antimulleriana que se pretende medir poderá ser uma amostra biológica, tal como lisados celulares ou meio de cultura, ou um fluido corporal, tal como o soro, o plasma, o fluido cerebrospinal, a saliva, a urina, o leite, o sémen ou outro fluido corporal.

Uma concretização adicional do presente invento descreve um método para medir uma quantidade de uma hormona antimulleriana numa amostra contendo hormona antimulleriana, que compreende: ligar um primeiro anticorpo a uma hormona antimulleriana, em que o primeiro anticorpo se liga a um primeiro epitopo numa região madura da hormona antimulleriana, ligar um segundo anticorpo à hormona antimulleriana, em que o segundo anticorpo se liga a um segundo epitopo na região madura da hormona antimulleriana, criando, deste modo, uma quantidade de segundo anticorpo ligado; medir a quantidade de segundo anticorpo ligado; e calcular a quantidade de hormona antimulleriana na amostra, em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compreendem anticorpos monoclonais. Em um aspecto, um suporte sólido poderá estar ligado ao primeiro anticorpo. 0 suporte sólido poderá compreender uma superfície de ligação a proteínas, como seja uma placa de microtitulação, uma partícula de metal coloidal, uma partícula de óxido de ferro, uma partícula de látex ou uma esfera polimérica. Em 10 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ outro aspecto, um marcador poderá estar acoplado ao segundo anticorpo. Os marcadores possíveis incluem um agente quimioluminescente, um agente colorimétrico, um agente de transferência de energia, uma enzima, um agente fluorescente ou um radioisótopo.

As concretizações do invento, tal como aqui descritas, poderão ser utilizadas para realizar imunoensaios designados por imunoensaios imunométricos, em "dois locais" ou em "sanduíche", em que o analito poderá estar preso ou ensanduichado entre dois anticorpos que se ligam a diferentes epítopos no analito. Os exemplos representativos destes imunoensaios incluem os imunoensaios enzimáticos ou os ensaios imunossorventes ligados a enzima (EIA ou ELISA), os ensaios imunorradiométricos (IRMA), os imunoensaios fluorescentes, os testes de fluxo lateral, os imunoensaios de difusão, os ensaios de imunoprecipitação e os ensaios de separação magnética (MAS). Num ensaio deste tipo, um primeiro anticorpo, que poderá ser descrito como o anticorpo de "captura", poderá estar preso a um suporte sólido, como seja uma superfície de ligação a proteínas, partículas de metal coloidal, partículas de óxido de ferro, partículas de látex ou esferas poliméricas. O anticorpo de captura poderá ser preso ou aplicado como revestimento sobre um suporte sólido, utilizando procedimentos conhecidos na arte. Em alternativa, o anticorpo de captura poderá estar acoplado a um ligando que é reconhecido por um anticorpo adicional, que está preso ou aplicado como revestimento sobre um suporte sólido. A ligação do anticorpo de captura ao anticorpo adicional via o ligando imobiliza, assim, indirectamente o anticorpo de captura sobre o suporte sólido. Um exemplo de um ligando deste tipo é a fluoresceína. O segundo anticorpo, que poderá ser descrito como o anticorpo de "detecção", poderá estar acoplado a um marcador, que poderá compreender um agente quimioluminescente, um agente colorimétrico, um agente de transferência de energia, uma enzima, um agente fluorescente ou um radioisótopo. O anticorpo de detecção poderá ser acoplado ou conjugado com um marcador, utilizando procedimentos conhecidos na arte. O marcador poderá compreender uma primeira proteína, como seja a biotina, acoplada ao segundo anticorpo, e uma segunda proteína, tal como a estreptavidina, que está acoplada a uma enzima. A segunda proteína liga-se à primeira proteína. A enzima produz 11 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ um sinal detectável quando lhe é fornecido (o) substrato(s), de modo que a quantidade de sinal medido corresponde à quantidade de segundo anticorpo que está ligado ao analito. A peroxidase de rábano é um exemplo de uma enzima deste tipo; os substratos possíveis incluem a TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina), a OPD (o-fenilenodiamina) e o ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico).

Os exemplos que se seguem são fornecidos com o intuito de ilustrar várias concretizações do invento e não se destinam a limitar o presente invento de nenhuma forma. EXEMPLO 1

Produção de anticorpos

Ratinhos fêmea C57B1/6J nulos para HAM foram imunizados com HAM humana recombinante preparada como descrito anteriormente (Hudson et al., 1990). Uma injecção inicial de 50 μρ de HAM humana recombinante foi administrada subcutaneamente em adjuvante Ribi (Sigma M6536), e duas injecções de reforço similares foram administradas a cada animal com intervalos de 4 semanas. Quatro dias após o terceiro reforço, recolheram-se 5 μΐ de sangue de cada animal para rastreio por ELISA. Cada amostra foi diluída em 2 ml de PBS contendo BSA a 1% (p/v) e NaN3 a 0,1% (p/v) como conservante e analisada da seguinte forma: placas Nunc Maxisorb (SLS, Reino Unido) foram revestidas com HAM humana recombinante, fornecida pelo Dr. Richard Cate (Biogen, Cambridge, Massachussets, EUA), a uma concentração de 0,1 μρ/ιηΐ em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,2M; pH 9,4 (Perbio) durante a noite (50 μΐ/poço). Após a adsorção, as placas foram aspiradas e bloqueadas com 100 μΐ por poço de BSA a 1% (p/v) em PBS durante uma hora. As placas foram depois lavadas com tampão de lavagem (tampão Tris-HCl 0,05M contendo NaCl 0,15M e Tween 20 a 0,05% (v/v) (Sigma)), antes do soro dos animais ser titulado através das placas diluídas com tampão Tris conjugado (BSA a 1% (p/v) em Tris-HCl 25 mM, pH 7,5; contendo NaCl 0,15M e Tween 20 a 0,5% (p/v)) e incubado à temperatura ambiente durante uma hora. As placas foram depois muito bem lavadas com tampão de lavagem, adicionando-se, em seguida, a cada poço 50 μΐ de uma diluição 12 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ de 1:2000 de peroxidase de rábano conjugada com anticorpo de cabra anti-lgG de ratinho (HRP, Dako) em tampão Tris conjugado. Após um periodo de incubação de 30 minutos, as placas foram lavadas e adicionaram-se 50 μΐ/poço de TMB (tetrametilbenzidina peroxidase (Dynatech)). Quando se atingiu um nível adequado de cor (aproximadamente 10-15 minutos), a reacção foi parada por meio da adição de 50 μΐ de ácido ortofosfórico (BDH) a 6% (v/v) a cada poço. A absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de placas Biotek (instrumentos Bio-Tek). O animal com a resposta mais elevada foi seleccionado e processado com hiperestimulação do baço antes do sacrifício. O reforço final foi realizado injectando intravenosamente 50 μg de HAM estéril. O baço foi removido assepticamente, recolheram-se alíquotas e armazenou-se em azoto líquido antes da fusão. EXEMPLO 2

Rastreio de anticorpos. Uma alíquota de esplenócitos foi fundida com células de mieloma SP2/0 na presença de polietilenoglicol (Boehringer Mannheim), de acordo com Kõhler e Milstein (Lee et al., 1996). As fusões foram primeiro rastreadas por ELISA perante a HAM que é uma versão expressa por E. coli apenas da região madura humana (R & D Systems). Um segundo ciclo de rastreio foi efectuado em placas de ELISA revestidas com uma preparação de HAM intacta de rato, tal como descrito por Weenen et al. (Weenen et al., Mol. Hum. Reprod. 2004). Os clones com resposta elevada foram reclonados em meio de metilcelulose (Clonacell HY), e as linhas celulares foram crescidas em meio de crescimento contendo concentrações baixas de IgG. Os anticorpos foram purificados por cromatografia de Proteína G e biotinilados com éster de biotina-LC solúvel em água (Pierce Chemicals). Os procedimentos utilizados foram oriundos de protocolos padrão (Harlow and Lane). Estes clones seleccionados para estudos de imunoensaios foram, assim, rastreados para fornecer epítopos na HAM que se encontram, pelo menos parcialmente, na região madura da HAM e que são comuns à HAM humana e de rato. Os clones seguintes foram seleccionados para análise subsequente: F2/A4, F2/A2, F2B/12F, F2B/7H, F2B/7A, F2B/12H, F2B/6L, F2B/7C, F2B/5B e F2A/23. 13 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ EXEMPLO 3

Transferência de Western. A análise de transferência de Western foi efectuada utilizando os anticorpos monoclonais de ratinho 5/6A, 9/6, 2/6, F2B12H (anticorpo 12H) e F2B7A (anticorpo 7A) . Os anticorpos 5/6A, 9/6 e 2/6 são anticorpos para a HAM humana descritos anteriormente (Al-Qahtani et ai., 2005); os resultados obtidos utilizando estes anticorpos são aqui apresentados para fins de comparação com as caracteristicas dos anticorpos 12H e 7A. O anticorpo 5/6A liga-se à região madura da HAM humana; os anticorpos 2/6 e 9/6 ligam-se à região pró da HAM humana. As HAM humana recombinante e de rato foram separadas utilizando electroforese em gel de poliacrilamida a 10%, em condições redutoras e não redutoras. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e incubadas com o anticorpo a uma diluição de 1:1000, seguido de um anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase a uma diluição de 1:10 000. As proteínas foram visualizadas por meio do sistema de detecção ECL plus Western Blotting (Amersham Biosciences).

As Figuras l(A-B) representam transferências de Western demonstrando que o anticorpo F2B7A (anticorpo 7A) para HAM se liga à HAM humana e de rato em condições redutoras e não redutoras. A exposição de 1 minuto na Figura IA mostra que o anticorpo 7A (AC 7A) reconhece a região pró da HAM humana recombinante e de rato, tanto em condições redutoras como não redutoras (banda de 58 kD) . Observa-se uma banda adicional (cerca de 25 kDa) após a clivagem do "local de clivagem adicional" que existe no interior da região pró da HAM humana, em condições redutoras e não redutoras (ver pistas "H" e Figura 3). A exposição de 4 minutos da mesma transferência, na Figura 1B, mostra que, após uma exposição mais longa, o anticorpo 7A reconhece a região madura de ambas as HAM humana recombinante e de rato em condições não redutoras (banda de 12 kDa).

As Figuras 2(A-B) ilustram transferências de Western demonstrando que o anticorpo F2B12H (anticorpo 12H) para HAM reconhece a região madura de ambas as HAM humana e de rato em condições não redutoras. A Figura 2A mostra que o anticorpo 12H reconhece a região madura da HAM humana 14 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ recombinante e de rato em condições não redutoras, mas não em condições redutoras, numa exposição de 1 minuto (bandas de 12 kDa) . A Figura 2B mostra que, numa exposição de 4 minutos da mesma transferência, o anticorpo 12H também reconhece as regiões pró tanto da HAM humana recombinante como da HAM de rato em condições não redutoras, mas não em condições redutoras (bandas de 58 kDa). EXEMPLO 4

Revestimento de placas para trabalhos de imunoensaio em ratinhos. 0 protocolo seguinte foi utilizado para proporcionar placas revestidas destinadas a testar anticorpos candidatos por meio de imunoensaio, com o objectivo de medir a HAM em amostras de ratinho. 1. Cada uma das placas Nunc Maxisorb foi revestida com 0,05 ml dos anticorpos a uma concentração de 2 micrograma por ml em tampão bicarbonato 0,05M; pH 9,4. 2. Permitiu-se que o processo de revestimento decorresse durante a noite nas placas. 3. As placas foram aspiradas individualmente, batidas sobre uma toalha até estarem secas e adicionaram-se 200 microlitros de tampão caseína a 0,5% (p/v) contendo sacarose a 6%. O tampão caseína (CLB-M2052) foi obtido de Mast Cell Group, Derby Road, Bootle, Merseyside, L20 1EA, Reino Unido. O tampão caseína é fornecido como uma solução a 5% e é diluído dez vezes em PBS antes de ser utilizado. 4. Após 1 hora para permitir que a caseína bloqueasse os locais em excesso no plástico, o conteúdo dos poços foi batido sobre uma toalha de papel, e a placa foi colocada numa câmara de secagem com fluxo de ar forçado proveniente de um humidificador industrial (Munters). 5. Depois de secagem durante a noite, cada placa foi selada numa bolsa de alumínio contendo um saquinho de exsicante. 15 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ EXEMPLO 5

Selecção de pares de anticorpos para os imunoensaios. 0 seguinte protocolo de ensaio padrão foi adoptado para testar vários pares de anticorpos quanto à sua capacidade para medir a HAM, por meio de ensaio ELISA em "dois locais". Todas as lavagens das placas foram efectuadas com PBS contendo Tween 20 a 0,05% (p/v). 1. Os padrões e as amostras foram diluídos em diluente de ensaio HPE comercial (CLB M1940) obtido do grupo Mast Cell. Este é fornecido como um concentrado 5X a diluir em água para proporcionar uma solução de trabalho. 2. Adicionaram-se 0,05 ml de cada amostra ou padrão em duplicado aos poços na placa. 3. A placa foi coberta e incubada durante 2 horas num agitador. 4. A placa foi lavada (5x) e adicionou-se um anticorpo biotinilado apropriado, numa concentração final de 0,3 microgramas/ml em tampão caseína de trabalho.

Adicionaram-se 0,05 ml do anticorpo biotinilado a cada poço, e a placa foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. 5. A placa foi lavada e adicionou-se uma diluição de 1:10 000 de conjugado poli-HRP-estreptavidina. O stock de conjugado foi obtido do Mast Group como CLB M2051. Ele é armazenado a menos 20 graus centígrados até à utilização. A diluição do conjugado é efectuada em tampão caseína de trabalho. 6. A placa foi incubada no agitador durante 30 minutos, depois foi lavada e batida até estar seca e adicionaram-se 0,1 ml de substrato de peroxidase da KPL. 7. O desenvolvimento de cor teve lugar, e a placa foi parada após 10-20 min por meio da adição de 0,1 ml de ácido fosfórico a 6%. 16 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ 8. A absorvância foi lida a 450 nm contra um branco lido a 620 nm. EXEMPLO 6

Imunoensaio com anticorpos. Os pares de anticorpos produzidos da forma aqui descrita foram testados num procedimento de ELISA para determinar a sua capacidade de detecção da HAM em amostras de várias espécies. Os resultados dos imunoensaios utilizando estes pares de anticorpos foram comparados com os resultados de imunoensaios similares utilizando anticorpos previamente desenvolvidos para a HAM e já descritos (Al-Qahtani et al., 2005). Os resultados estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

Resultados dos imunoensaios de seis combinações diferentes de anticorpo de captura e anticorpo de detecção.

Número da amostra Amostra placa F2B/7A marcador F2A/4 Ng/ml de AMH do padrão humano placa F2B/7A marcador F2A2 Ng/ml de AMH do padrão humano placa F2B/12H marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2A2 marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2B12/F marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2B/7H marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2A/4 marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano Valores Obtidos utilizando o ensaio de Brookes existente com marcador 9/6 e detecção 2/6 1 Soro de boi 66 UD UD UD UD UD UD UD 2 Soro de touro 67 1, 46 0,96 0,7 0,9 0,4 0,6 2,1 3 Soro de vaca Ovx 68 , 41 0,3 UD 0,3 UD 0,3 0,4 4 Porca 28 de 1,1 anos de idade UD UD UD UD UD UD UD 5 Porca 37 de 2,4 anos de idade UD UD UD UD UD UD UD 6 Soro de cavalo ,51 0,3 0,4 0,37 UD 0,5 0,3 7 Soro de ratinho A UD 1,39 2,4 1,3 2,7 2,7 UD 8 Soro de ratinho B UD 6,8 8,8 6,8 6,1 9,4 0,3 9 Soro de burro UD UD UD UD UD UD UD 17 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ Número da amostra Amostra placa F2B/7A marcador F2A/4 Ng/ml de AMH do padrão humano placa F2B/7A marcador F2A2 Ng/ml de AMH do padrão humano placa F2B/12H marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2A2 marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2B12/F marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2B/7H marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano placa F2A/4 marcador F2B/7A Ng/ml do padrão humano Valores Obtidos utilizando o ensaio de Brookes existente com marcador 9/6 e detecção 2/6 10 Soro de coelho UD UD UD UD UD UD UD 11 Soro de cabra UD UD UD UD UD 0,3 UD 12 Vitela de 12 meses UD UD UD UD UD 0,3 0,3 13 Vaca de 8 anos de idade UD UD UD UD UD 0,3 0,3 14 Vaca de 12 anos de idade UD UD UD UD UD UD 0,4 19 Padrão de rato a 2, 5 ng/ml 2,08 1,17 0, 6 1,1 0,79 1,1 1,3 25 Soro Humano feminino 137 7, 9 5,5 7,3 5,5 4, 4 7, 8 6,7 5,08 26 Soro Humano feminino 216 3,47 2,0 3,3 2,0 2,3 3,6 2,8 1,37 27 Soro Humano feminino 029 UD UD UD UD UD UD UD UD 28 Soro Humano feminino 081 5, 1 3,4 4, 8 3,4 3,2 5,3 4, 7 2,16 29 Soro Humano feminino 200 1, 7 1,1 1,5 1,1 1,4 1,7 1,5 1,05 Limite de detecção estimado para seres humanos em diluente de ensaio 0,039 ng/ml 0,3 ng/ml 0,013 ng/ml 0, 013 ng/ml 0,078 ng/ml 0,078ng/ ml 0,026 Reacção cruzada de rato estimada 83% 46% 24% 44% 31% 44% 52% Melhor reacção cruzada para AMH de ratinho 18 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

Na Tabela 1 acima, "placa" designa o anticorpo de captura preso à superfície de uma placa, e "marcador" designa o anticorpo de detecção acoplado a um marcador; "ID" significa "indetectável". A coluna mais à direita da Tabela 1 mostra os resultados obtidos utilizando os anticorpos 9/6 e 2/6 contra HAM (o "ensaio de Brookes existente") que foram previamente desenvolvidos (Al-Qahtani et al., 2005). Os anticorpos 9/6 e 2/6 ligam-se ambos à região pró de HAM. Os resultados na Tabela 1 mostram que a utilização dos anticorpos F2B/12H (anticorpo 12H) e F2B/7A (anticorpo 7A) é eficaz num ensaio para medir a HAM em amostras humanas, de rato e de ratinho. A utilização do anticorpo F2B/12H para captura e do anticorpo F2B/7A para detecção proporciona a estimativa mais elevada de HAM no soro de ratinho, um ensaio sensível para a HAM humana e uma boa reacção cruzada (24%) com a HAM recombinante de rato. Observa-se uma boa correlação com os valores obtidos por meio do ensaio que utiliza os anticorpos 9/6 e 2/6, mas com valores aproximadamente duplos daqueles obtidos utilizando os anticorpos 9/6 e 2/6. EXEMPLO 7

Estabilidade da imunorreactividade da HAM humana recombinante em imunoensaios.

As Figuras 4(A-C) ilustram ensaios de transferência de Western de HAM humana recombinante e de HAM de rato pesquisados com os anticorpos para HAM 5/6, 2/6 e 9/6 como sondas, em que a HAM humana (hHAM) foi armazenada sob várias condições. A Figura 4A mostra que o anticorpo 5/6 reconhece a região madura (12 kDa) da HAM humana recombinante e da HAM de rato. A Figura 4B mostra que o anticorpo 2/6 reconhece a região pró da HAM humana recombinante, incluindo ambas as bandas que são produzidas após a clivagem proteolítica do "local de clivagem adicional" (ver Figura 3) . O epítopo do anticorpo 2/6 é, pois, estável à proteólise, uma vez que o anticorpo reconhece ambas as bandas. O anticorpo 2/6 não reconhece a HAM de rato. A Figura 4C ilustra como o anticorpo 9/6 reconhece a região pró da HAM humana e de rato, mas não reconhece o fragmento mais pequeno após a clivagem proteolítica da região pró da HAM humana recombinante ao nível 19 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ do "local de clivagem adicional". O epítopo do anticorpo 9/6 não é, pois, estável à proteólise. A Tabela 2 representa a estabilidade da imunorreactividade da HAM humana recombinante em imunoensaios de tipo ELISA utilizando os anticorpos F2B/7A e F2B/12H, em comparação com ensaios similares utilizando os anticorpos 2/6 e 9/6 previamente descritos (Al-Qahtani et al., 2005).

Tabela 2

ESTABILIDADE DA IMUNORREACTIVIDADE DE HAM

A B Comentário Valor obtido por imunoensaio com o anticorpo 2/6 para captura e o anticorpo 9/6 para detecção. Lido contra padrão da Biogen. Valor obtido por imunoensaio com o anticorpo F2B/12H para captura e o anticorpo F2B/7A para detecção. Lido contra padrão da Biogen. Solução de HAM humana recombinante purificada fornecida pelo Dr. Axel Themmen, de concentração nominal 30 microgramas/ml 2,5 microgramas/ml 29, 4 microgramas/ml Uma grande parte da imunorreactividade no ensaio da HAM com 9/6 e 2/6 foi perdida a partir da preparação recombinante de Themmen. Solução de HAM acima incubada durante 6 dias a 37°C 0,1 microgramas/ml 30,1 microgramas/ml No ensaio com F2B/7A e F2B/12H, as HAM de Themmen e da Biogen possuem imunorreactividades similares, e a imunorreactividade é estável com a incubação a 37°C

No imunoensaio inicial com o par de anticorpos 2/6 e 9/6, verificou-se que as preparações de HAM humana recombinante 20 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ (obtidas do Dr. Axel Themmen) forneciam estimativas de concentração muito baixas em comparação com a HAM humana recombinante da Biogen. Trabalhos subsequentes revelaram que ambos os epítopos para estes anticorpos são instáveis face às enzimas que permanecem na HAM purificada. Quando a mesma preparação de HAM humana recombinante é incubada durante 6 dias a 37°C, a quantidade de imunorreactividade aparente diminui ainda mais. Em contraste, a mesma preparação de HAM humana recombinante pode ser incubada durante 6 dias a 37°C com uma redução insignificante da imunorreactividade, quando é medida utilizando os anticorpos F2B/12 e F2B/7A. Este resultado requer que ambos os epitopos sejam mais estáveis à proteólise que aqueles reconhecidos pelos anticorpos 9/6 e 2/6. As amostras incubadas continham azida de sódio a 0,1% (p/v) adicionada como conservante. A HAM humana recombinante da Biogen foi uma oferta do Dr. Richard Cate. EXEMPLO 8

Medição do declínio da HAM sérica em ratinhos em função da idade. Um ensaio baseado nos anticorpos 12H e 7A como aqui descritos foi empregue para determinar o nível de HAM no soro de ratinhos, obtido de ratinhos fêmea envelhecidos (ver Figura 5). Ratinhos com diferentes idades foram mortos no dia do estro com base em esfregaços vaginais. Subsequentemente, as amostras de soro foram submetidas a análise de HAM por meio do ensaio, após uma diluição de 41x. Os níveis de HAM sérica dos ratinhos com 4, 6 e 8 meses de idade não foram diferentes e foram de aproximadamente 28,5 ng/ml de padrão humano. Os ratinhos com 10 e 12 meses de idade apresentaram níveis de HAM menores (22,0 e 20,5 ng/ml de padrão humano). Os ratinhos mais velhos com 14, 16 e 18 meses de idade apresentaram níveis ainda menores de HAM: 8,2; 6,4 e 3,8 ng/ml de padrão humano, respectivamente. EXEMPLO 9 Níveis de HAM ao longo do ciclo éstrico em ratinhos. Ratinhos fêmea com quatro meses de idade foram classificados em diferentes fases do ciclo éstrico com base em esfregaços vaginais e numa análise post mortem dos folículos ováricos. Os níveis de HAM sérica foram determinados utilizando o ensaio de 21 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ HAM baseado nos anticorpos 7Α e 12H. Os níveis de HAM sérica foram estáveis ao longo do ciclo éstrico, situando-se num valor de aproximadamente 29 ng/ml de padrão humano, excepto no estro quando se obtiveram níveis mais elevados, 40 ng/ml de HAM padrão humana (ver Figura 6A). A análise preliminar mostrou uma correlação dos níveis de HAM com o número de folículos pré-antrais e antrais pequenos nos ovários destes animais (ver Figura 6B). EXEMPLO 10

Medição da HAM de rato num ambiente transgénico de ratinho. O ensaio baseado nos anticorpos 7A e 12H foi utilizado para determinar os níveis de HAM de rato produzidos num ambiente transgénico de ratinho. Ratinhos transgénicos transportando uma construção que dirige a expressão de HAM recombinante de rato, sob o controlo do promotor PEPCK, foram mortos, e a HAM foi determinada no seu soro. Com base na transferência de Western do soro das linhas transgénicas, duas linhas haviam sido anteriormente identificadas: a linha 21 de baixa expressão e a linha 30 de expressão elevada. O ensaio baseado nos anticorpos 7A e 12H determinou os seguintes níveis de HAM nestas linhas: linha 21-9 ng/ml de HAM padrão humana; linha 30 - 70 ng/ml de HAM padrão humana. Espera-se que ambas as linhas segreguem uma quantidade mínima a inexistente de HAM endógena de ratinho, uma vez que os seus ovários estavam desprovidos de folículos e das células da granulosa que produzem a HAM na fêmea. EXEMPLO 11

Medição dos níveis de HAM em amostras de macaco e de touro, utilizando os ensaios aqui descritos. Os valores da HAM sérica foram determinados em macacos fêmea de várias idades e em várias fases da menopausa, como ilustrado na Tabela 3. 22 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

Tabela 3

Medições da HAM sérica em macacos fêmea

Ano de nascimento Fase HAM [ng/ml] 1975 menopáusica 0,89 1982 menopáusica 0,24 1990 cíclica 5, 71 1990 cíclica 19, 59 1990 cíclica 11, 15 1990 cíclica 1,28 1990 cíclica 9,16 1990 cíclica 4,36

Os níveis de HAM sérica também foram medidos em amostras de soro bovino utilizando os ensaios aqui descritos, como representado na Tabela 4.

Tabela 4

Medições de HAM sérica em amostras bovinas

Amostra HAM (ng/ml) boi 1 (touro castrado) 0,00 boi 2 (touro castrado) 0,00 boi 3 (touro castrado) 0,45 novilho macho jovem 1 8,12 novilho macho jovem 2 8,20 EXEMPLO 12

Ensaio ELISA para a medição quantitativa de SIM/HAM no soro. O ensaio ELISA para SIM/HAM aqui descrito é um imunoensaio em dois locais amplificado enzimaticamente. No ensaio, os padrões, os controlos e as amostras de soro desconhecidas são incubados em poços de microtitulação que foram revestidos com anticorpo anti-SIM/HAM. Após a incubação e a lavagem, os poços são tratados com outro anticorpo de detecção anti-SIM/HAM marcado com biotina. Após um segundo passo de incubação e de lavagem, os poços são incubados com estreptavidina-peroxidase de rábano (HRP). Após um terceiro passo de incubação e de lavagem, os poços são incubados com o substrato tetrametilbenzidina (TMB). Uma solução de paragem 23 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ acídica é depois adicionada, e o grau de renovação enzimática do substrato é determinado por medição da absorvância ao duplo comprimento de onda de 450 e 620 nm. A absorvância medida é directamente proporcional à concentração de SIM/ham presente. Um conjunto de padrões de SIM/HAM é utilizado para representar graficamente uma curva padrão da absorvância em função da concentração de SIM/HAM, a partir da qual as concentrações de SIM/HAM nas amostras desconhecidas podem ser calculadas.

REAGENTES

A. Tiras de microtitulação revestidas com anticorpo anti-SIM/HAM

Suportes de tira com 96 poços de microtitulação contendo igG anti-SiM/HAM imobilizado na parede interna de cada poço. Estes foram armazenados a 2-8°C com um exsicante para proteger da humidade.

B. Diluente da amostra SIM/HAM

Diluente da amostra contendo concentrações de 0 ng/ml de SIM/HAM, num tampão de base proteica com um conservante não mercúrico. O diluente da amostra foi armazenado a 2-8°C.

C. Padrões de SIM/HAM

Padrões contendo concentrações de aproximadamente 0,025; 0,10; 0,25; 1,5; 7,5 e 15 ng/ml de SIM/HAM, num tampão de base proteica com um conservante não mercúrico. Os padrões foram armazenados a 2-8°C.

D. Controlos de SIM/HAM

Os controlos foram identificados como Níveis I e II, contendo concentrações baixas e elevadas de SIM/HAM num tampão de base proteica com um conservante não mercúrico. Os controlos foram armazenados a 2-8°C. E. Conjugado anticorpo SIM/HAM-Biotina (pronto a utilizar)

Anticorpo para SIM/HAM biotinilado em tampão de base proteica com um conservante não mercúrico, armazenado a 2-8°C. 24 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ F. Conjugado Estreptavidina-Enzima (pronto a utilizar)

Estreptavidina-HRP (peroxidase de rábano) num tampão de base proteica (BSA) e um conservante não mercúrico. Não diluido de fábrica a 2-8°C.

G. Tampão de ensaio SIM/HAM

Tampão de base proteica (BSA) com um conservante não mercúrico, armazenado a 2-8°C.

H. Solução cromogénica TMB

Uma solução de tetrametilbenzidina (TMB) em tampão citrato com peróxido de hidrogénio, armazenada a 2-8°C. I. Concentrado de lavagem

Solução salina tamponada com um detergente não iónico, armazenada a 2-8°C ou à temperatura ambiente (~25°C). 0 concentrado de lavagem foi diluido lOx com água desionizada antes da utilização. J. Solução de paragem

Uma solução de ácido sulfúrico 0,2M, armazenada a 2-8°C ou à temperatura ambiente (~25°C) .

Permitiu-se que todos os reagentes e amostras atingissem a temperatura ambiente (~25°C), e todos eles foram muito bem misturados por meio de inversão cuidadosa antes da utilização.

PROCEDIMENTO DE ENSAIO

Permitiu-se que todas as amostras e reagentes atingissem a temperatura ambiente (~25°C), e todos eles foram muito bem misturados por meio de inversão cuidadosa antes da utilização. Os padrões, os controlos e as amostras desconhecidas foram analisados em duplicado.

Protocolo: 1. Identifique as tiras de microtitulação que serão utilizadas. 25 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ 2. Pipete 20 μΐ dos padrões, controlos e amostras desconhecidas para os poços apropriados. 3. Adicione 100 μΐ do tampão de ensaio SIM/HAM a cada poço, utilizando um distribuidor semiautomático. 4. Incube os poços, agitando a uma velocidade rápida (500-700 rpm) num agitador orbital de microplacas, durante 1 hora à temperatura ambiente (~25°C). 5. Aspire e lave cada poço 5 vezes com a solução de lavagem, utilizando um lavador de microplacas automático ou aspirando o líquido de cada poço, distribuindo 0,35 ml da solução de lavagem por cada poço e aspirando a solução de lavagem. Seque através de inversão da placa sobre material absorvente. 6. Adicione 100 μΐ do conjugado anticorpo-biotina (pronto a utilizar) a cada poço, utilizando um distribuidor semiautomático. 7. Incube os poços, agitando a uma velocidade rápida (500-700 rpm) num agitador orbital de microplacas, durante 1 hora à temperatura ambiente (~25°C). 8. Aspire e lave cada poço 5 vezes com a solução de lavagem, utilizando um lavador de microplacas automático ou aspirando completamente o liquido de cada poço, distribuindo 0,35 ml da solução de lavagem por cada poço e aspirando a solução de lavagem. Seque através de inversão da placa sobre material absorvente. 9. Adicione 100 μΐ do conjugado estreptavidina-enzima (pronto a utilizar) a cada poço, utilizando um distribuidor semiautomático. 10. Incube os poços, agitando a uma velocidade rápida (500-700 rpm) num agitador orbital de microplacas, durante 30 minutos à temperatura ambiente (~25°C). 11. Aspire e lave cada poço 5 vezes com a solução de lavagem, utilizando um lavador de microplacas automático ou 26 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ aspirando completamente ο líquido de cada poço, distribuindo 0,35 ml da solução de lavagem por cada poço e aspirando a solução de lavagem. Seque através de inversão da placa sobre material absorvente. 12. Adicione 100 μι da solução cromogénica tmb a cada poço, utilizando um distribuidor semiautomático. 13. Incube os poços, agitando a uma velocidade rápida (500-700 rpm) num agitador orbital de microplacas, durante 15-30 minutos à temperatura ambiente (~25°C). Evite a exposição à luz solar directa 14. Adicione 100 μΐ da solução de paragem a cada poço, utilizando um distribuidor semiautomático. 15. Leia a absorvância da solução nos poços no espaço de 30 minutos, utilizando um leitor de microplacas regulado para 450 nm. Ao ler a absorvância do poço de microtitulação, é necessário programar o padrão zero como um "Branco". Caso seja possível efectuar uma correcção do comprimento de onda, configure o instrumento para medição de duplo comprimento de onda a 450 nm com a correcção do comprimento de onda do fundo regulada para 600 ou 620 nm. Cálculo dos resultados: 1. Calcule a absorvância média para cada padrão, controlo ou amostra desconhecida. 2. Represente o log das leituras de absorvância média para cada um dos padrões ao longo do eixo yy em função do log das concentrações de SIM/HAM em ng/ml ao longo do eixo xx, utilizando um ajuste de curva linear. Em alternativa, os resultados podem ser representados graficamente no formato linear em função de linear, utilizando-se um ajuste de curva "spline" suave. 3. Desenhe a curva que melhor se ajusta através da média dos pontos em duplicado. 27 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ 4. Determine as concentrações de SIM/HAM dos controlos e das amostras desconhecidas a partir da curva padrão, fazendo corresponder as leituras da sua absorvância média às concentrações de SIM/ham correspondentes. EXEMPLO 13

Medição da HAM em soro humano por meio de imunoensaio. As características de desempenho das medições de HAM em soro humano através de um ensaio ELISA como aqui descrito, utilizando os anticorpos 12H e 7A, estão apresentadas abaixo na Tabela 5 e na Tabela 6. Neste exemplo, o anticorpo 12H foi utilizado como anticorpo de captura, e o anticorpo 7A foi utilizado como anticorpo de detecção. A sensibilidade teórica, ou limite minimo de detecção, tal como calculado por interpolação da média mais dois desvios padrão de 8 réplicas do padrão de SIM/HAM 0 ng/ml, foi de 0,0058 ng/ml. A Tabela 5 ilustra a linearidade da diluição de quantidades medidas de HAM em amostras séricas humanas. A recuperação é calculada como a percentagem da concentração observada dividida pela concentração esperada. 28 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

Tabela 5

Linearidade da diluição de valores medidos de HAM em amostras séricas humanas, utilizando um ensaio ELISA.

Linearidade da diluição Número da amostra Valor de HAM medido (ng/ml) Factor de diluição Valor esperado (ng/ml) Valor observado (ng/ml) Recuperação (%) I — — — 1,931 1:2 0, 965 0, 997 103 1: 4 0, 482 0, 445 92 1:8 0,241 0,222 92 1:16 0, 120 0, 096 80 1:32 II — 2,462 1:2 1,231 1,225 100 1: 4 0,615 0,569 92.5 1: 8 0,307 0,259 84 1:16 0,154 0,149 97 1:32 III — 7,650 1:2 3, 825 4,159 109 1:4 1, 912 2, 097 110 1:8 0,956 0, 981 93 1:16 0, 478 0, 441 92 1:32 A Tabela 6 mostra a precisão intra-ensaio e inter-ensaios e as características de recuperação do ensaio. Cada precisão intra-ensaio foi determinada a partir da média de 8 réplicas. A recuperação é calculada como a percentagem da concentração observada dividida pela concentração esperada. 29 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

Tabela 6

Precisão (Intra-ensaio) Número da amostra N Média (ng/ml) DP CV (percentagem) I 8 0,241 0,011 4,1 II 8 1, 422 0,038 2,7 III 8 7, 871 0,3 3,8 Precisão (Inter-ensaios) Número da amostra N Média (ng/ml) DP CV (percentagem) I 10 0,236 0,0134 5,7 II 10 1, 415 0,106 7,4 III 10 7,584 0,568 7,5 Recuperação Número da amostra Endógena (ng/ml) Adicionada (ng/ml) Esperada (ng/ml) Observada (ng/ml) Recuperação (percentagem) I 1,866 1,15 2,876 2,968 103 2,3 3,886 3,540 91 II 2,919 1,15 3,848 4,211 109 2,3 4, 777 4, 972 104 III 4,610 1,15 5,409 5,157 95 2,3 6,208 6,548 105

Nas Tabelas 5 e 6 acima, "N" designa o número de medições repetidas de uma amostra, "DP" significa desvio padrão, "CV" significa coeficiente de variabilidade, "Endógena" significa a quantidade de HAM medida na amostra antes da adição de uma quantidade conhecida de HAM; "Adicionada" significa a quantidade adicional conhecida de HAM adicionada à amostra; "Esperada" significa a quantidade medida esperada de HAM endógena mais HAM adicionada; "Observada" significa a quantidade medida efectiva de HAM endógena mais HAM adicionada; e "Recuperação" significa a percentagem da quantidade adicionada conhecida de HAM que foi efectivamente medida pelo ensaio. 30 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ EXEMPLO 14

Medição da HAM em soro de rato por meio de imunoensaio. Um ensaio elisa como aqui descrito foi efectuado para medir a HAM em soro de rato, utilizando os anticorpos 12H e 7A. Neste exemplo, o anticorpo 12H foi utilizado como anticorpo de captura, e o anticorpo 7A foi utilizado como anticorpo de detecção. As características de desempenho deste ensaio estão apresentadas nas Tabelas 7 e 8. A Tabela 7 ilustra a linearidade da diluição de quantidades medidas de HAM em amostras de rato, que foram medidas utilizando um ensaio ELISA. As amostras séricas de rato foram diluídas com diluente da amostra (HAM 0 ng/ml) e analisadas. A recuperação é calculada como a percentagem da concentração observada dividida pela concentração esperada. A sensibilidade teórica do ensaio ELISA para a HAM de rato foi de 0,012 ng/ml e foi calculada por interpolação da média mais dois desvios padrão de 16 medições do diluente da amostra. 31 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

Tabela 7

Linearidade da diluição de valores medidos de HAM em amostras séricas de rato, num ensaio ELISA.

Linearidade da diluição de valores de AMH medidos em amostras de soro de rato em ensaio ELISA Número da amostra Factor de Diluição Esperado Observado Recuperação (percentagem) I — 3.987 1:2 1,993 1,830 92 1:4 0,997 0,902 91 1:8 0,498 0,466 94 1:16 0,249 0, 237 95 II — 6,268 1:2 3,134 3,007 96 1:4 1,567 1,530 98 1:8 0,783 0,802 102 1:16 0,391 0, 409 105 III — 11,322 1:2 3,134 3,007 96 1:4 1,567 1,530 98 1:8 0,783 0,802 102 1:16 0,391 0, 409 105 A Tabela 8 ilustra as caracteristicas de recuperação de quantidades medidas de HAM de rato num ensaio ELISA. As amostras séricas foram suplementadas com diferentes quantidades conhecidas de uma amostra-stock de HAM de concentração elevada e analisadas. A recuperação é calculada como a percentagem do valor observado dividido pela concentração esperada. 32 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

Tabela 8

Recuperação de quantidades adicionadas conhecidas de HAM de rato a amostras séricas de rato, num ensaio ELISA Número da amostra Endógena (ng/ml) Adicionada (ng/ml) Esperada (ng/ml) Observada (ng/ml) Recuperação (percentagem) I 1, 534 2,7 3,982 4,315 108 5,4 6,430 6,376 99 II 3, 405 2,7 5,513 5,270 95,6 5,4 7, 621 7,253 95 III 6,760 2,7 8,258 8,135 98,5 5,4 9,756 9, 718 100

Os exemplos aqui disponibilizados descrevem composições e métodos eficazes para medir a HAM numa amostra, incluindo amostras biológicas, tais como amostras humanas, de ratinho, de rato, bovinas e de cavalo. Anticorpos úteis para estas composições e métodos são descritos. Os anticorpos aqui descritos ligam-se à região madura da HAM e reconhecem epitopos que são estáveis à proteólise da HAM, de modo que as quantidades de HAM medidas não são afectadas pela proteólise de HAM.

As seguintes referências são aqui citadas:

Al-Qahtani, A., Muttukrishna, S., Appasamy, M., Johns, J, Cranfield, M., Visser, J.A., Themmen, A.P.N., Groome, N.P. (2005) Development of a sensitive enzyme immunoassay for Anti-Mullerian Hormone (AMH) and the evaluation of potential clinicai applications in males and females. Clin. Endocrinol., 63(3), 267-73.

Baarends, W.M., Uilenbroek, J.T., Kramer, P., Hoogerbrugge, J.W., van Leeuwen, E.C., Themmen, A.P., et al. (1995). Endocrinology, 136, 4951-4962.

Cate, R. L. and Pepinsky, R. B., US Patent 5,359,033. di Clemente, N. et al. (1994). Mol. Endocrinol., 8, 1006- 1020. 33 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ

Durlinger, A.L., Kramer, Ρ., Karels, Β., de Jong, F.H., Uilenbroek, J.T., Grootegoed, j.a., et al. (1999).

Endocrinology, 140, 5789-5796.

GenBank, National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov. Homology data derived from AMH gene sequences from the NCBI GenBank public nucleotide sequence database.

Gruijters, M., Visser, J., Durlinger, A., Themmen, A.P. (2003) Anti- Mullerian hormone and its role in ovarian function. Molecular and Cellular Endocrinology, 211, 85-90.

Hudson, P., Dougas, I., Donahoe, P., Cate, R., Epstein, J., Pepinsky, RB., MacLaughlin, D. (1990). An immunoassay to detect human Mullerian inhibiting substance in males and females during normal development. Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism, 70, 16-22.

Lee, M., Donahoe, P. (1993) Mullerian-inhibiting substance: A gonadal hormone with multiple functions.

Endocrine Reviews, 142, 152-164.

Lee, M., Donahoe, P., Hasegawa, T., Silverman, B., Crist, G., Best, S., Hasegawa, Y., Noto, R., Schoenfeld, D.,

MacLaughlin, D. (1996) Mullerian Inhibiting Substance in human: normal leveis from infancy to adulthood. Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism 81, 571-575.

Lee, M., Misra, M., Donahoe, P., MacLaughlin, D. (2003) MIS/AMH in the assessment of cryptorchidism and intersex conditions. Molecular and Cellular Endocrinology, 211, 91-98.

Long, W.Q., Ranchin, V., Pautier, P., Belville, C.,

Denizot, P., Cailla, H., Lhomme, C., Picard, J.Y., Bidart. J.M., Rey, R. (2000) Detection of minimal leveis of serum anti-Mullerian hormone during follow-up of patients with ovarian granulosa cell tumor by means of a highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Clinicai Endocrinology Metabolism, 85, 540-544.

Picard, J.Y., et al. (1986). Proc. Natl. Acad. Sei., 83, 5464-5468.

Picon, R. (1969). Arch. Anat. Microsc. Morphol. Exp., 58, 1-19. 34 ΕΡ 1 886 140/ΡΤ te Velde, Ε., Pearson, ρ. (2002) The variability of female reproductive ageing. Human Reproduction. Update, 8, 141-154.

Teixeira, J. et al. (2001). Endocrine Reviews, 22, 657- 674. van Rooij, I.A., Broekmans, F.J., teVelde, E.R., Fauser, B.C., , Bancsi, L.F., de Jong, F.H., Themmen, A. P. (2002) Serum anti-Mullerian hormone leveis: a novel measure of ovarian reserve. Human Reproduction, 17, 3065-3071.

Wilson, C., Di Clemente, N., Ehrenfels, C., Pepinsky, R., Josso, N., Vigier, B., Cate, R. (1993) Mullerian inhibiting substance requires its N-terminal domain for maintenance of biological-activity, a novel finding within the transforming growth-factor-beta superfamily. Molecular Endocrinology, 7, 247-257.

Quaisquer patentes ou publicações referidas neste fascículo são indicativas das qualificações dos peritos na arte à qual o invento se refere.

Um perito na arte compreenderá facilmente que o presente invento está bem adaptado para realizar os objectivos e alcançar os fins e as vantagens mencionados, assim como aqueles objectivos, fins e vantagens inerentes. Os presentes exemplos, juntamente com os métodos, procedimentos, tratamentos, moléculas e compostos específicos aqui descritos, são presentemente representativos de concretizações preferidas, são exemplificativos e não se destinam a constituir limitações ao âmbito do invento. Ocorrerão aos peritos na arte alterações a estes, assim como outras utilizações que estão incluídas no âmbito das reivindicações.

Lisboa, 2010-11-17

Claims (13)

1. ΕΡ 1 886 140/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que o primeiro anticorpo se liga a um primeiro epitopo numa região madura de uma hormona antimulleriana e o segundo anticorpo se liga a um segundo epitopo numa região madura de uma hormona antimulleriana, em que o primeiro epitopo ao qual se liga o primeiro anticorpo é diferente do segundo epitopo ao qual se liga o segundo anticorpo, de modo que a ligação de um anticorpo ao seu epitopo não interfere com a ligação do outro anticorpo, e em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compreendem anticorpos monoclonais.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente um suporte sólido ligado ao primeiro anticorpo.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que o suporte sólido compreende uma superfície de ligação a proteínas seleccionada entre o grupo que consiste em uma placa de microtitulação, uma partícula de metal coloidal, uma partícula de óxido de ferro, uma partícula de látex e uma esfera polimérica.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente o facto de o segundo anticorpo estar acoplado a um marcador.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que o marcador compreende um agente quimioluminescente, um agente colorimétrico, um agente de transferência de energia, uma enzima, um agente fluorescente ou um radioisótopo.
6. 6. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a hormona antimulleriana compreende uma hormona antimulleriana de mamífero seleccionada entre o grupo que consiste na hormona antimulleriana de primata, de roedor, equina e bovina.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, em que a hormona antimulleriana de primata compreende uma hormona ΕΡ 1 886 140/ΡΤ 2/3 antimulleriana humana, e a hormona antimulleriana de roedor compreende uma hormona antimulleriana de ratinho ou de rato.
8. 8. Método para medir uma quantidade de uma hormona antimulleriana numa amostra contendo hormona antimulleriana, que compreende: (a) ligar um primeiro anticorpo a uma hormona antimulleriana, em que o primeiro anticorpo se liga a um primeiro epitopo numa região madura da hormona antimulleriana; (b) ligar um segundo anticorpo à hormona antimulleriana, em que o segundo anticorpo se liga a um segundo epitopo na região madura da hormona antimulleriana, criando assim, uma quantidade de segundo anticorpo ligado; (c) medir a quantidade de segundo anticorpo ligado; e (d) calcular a quantidade de hormona antimulleriana na amostra em que o primeiro epitopo ao qual se liga o primeiro anticorpo é diferente do segundo epitopo ao qual se liga o segundo anticorpo, de modo que a ligação de um anticorpo ao seu epitopo não interfere com a ligação do outro anticorpo, e em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compreendem anticorpos monoclonais.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, compreendendo adicionalmente um suporte sólido ligado ao primeiro anticorpo.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o suporte sólido compreende uma superfície de ligação a proteínas seleccionada entre o grupo que consiste em uma placa de microtitulação, uma partícula de metal coloidal, uma partícula de óxido de ferro, uma partícula de látex e uma esfera polimérica.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 8, compreendendo adicionalmente um marcador acoplado ao segundo anticorpo.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o marcador compreende um agente quimioluminescente, um agente ΕΡ 1 886 140/ΡΤ 3/3 colorimétrico, um agente de transferência de energia, uma enzima, um agente fluorescente ou um radioisótopo.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a hormona antimulleriana compreende uma hormona antimulleriana de mamífero seleccionada entre o grupo que consiste na hormona antimulleriana de primata, de roedor, equina e bovina. Lisboa, 2010-11-17