CN106018830A - 层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒包括：层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体。这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成层粘连蛋白的检测这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到2.0ng/mL，相对于传统的层粘连蛋白的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。

Description

层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
层粘连蛋白(LN)又称板层素，主要存在于基膜结构中，是基膜所特有的非胶原糖蛋白，相对分子质量为820kDa，由一个400kD的α链和两条200kD左右的β链组成。作为基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用，其主要功能就是在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基膜上。层粘连蛋白与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关，慢性活动型肝炎和肝硬变及原发性肝癌时明显增高，LN也可以反映肝纤维化的进展与严重程度，纤维化后期升高尤为显著。
肝纤维化是慢性肝炎向肝硬化发展的必经阶段，当细胞外基质大量形成并在肝脏内沉积时，就形成肝纤维化。目前，肝纤维化主要的诊断方法包括影像学诊断、病理学诊断三种。影像学诊断只能在肝纤维化晚期才能发现异常图像，而肝纤维化的诊断金标准-肝组织活检，由于所取标本量较少，以及肝病变的不均一性，会导致取样误差。
临床上，血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、血清III型胶原(PCIII)、血清IV型胶原(Collagen IV)的水平可反映肝纤维化程度，这四项血清学指标能反映肝脏纤维化的情况，且可降低活检的医疗费用。
传统的层粘连蛋白的检测方法主要采用酶联免疫吸附法，然而，受限于酶联免疫的特点，传统的层粘连蛋白的检测方法在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染，并且由于检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测精度较差。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
一种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，包括：层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体。
在一个实施例中，所述层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，所述层粘连蛋白单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的质量比为1：25～35。
在一个实施例中，所述化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体中，所述层粘连蛋白单克隆抗体与所述化学发光标记物的质量比为50：1～10。
在一个实施例中，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm～1μm。
在一个实施例中，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
在一个实施例中，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
在一个实施例中，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
在一个实施例中，还包括层粘连蛋白定标品。
在一个实施例中，所述层粘连蛋白定标品为浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、700ng/mL和1000ng/mL的层粘连蛋白的溶液。
一种上述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入层粘连蛋白单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒；以及
取层粘连蛋白单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h～2h后除杂，得到化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体。
这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成层粘连蛋白的检测这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到2.0ng/mL，相对于传统的层粘连蛋白的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
附图说明
图1为一实施方式的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的制备流程示意图；
图2为实施例3得到的层粘连蛋白标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，包括：层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体。
优选的，层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，层粘连蛋白单克隆抗体与羧基化的磁微粒的质量比为1：25～35。
优选的，化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体中，层粘连蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的质量比为50：1～10。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm～1μm。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
在其他的实施例中，上述层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
在其他的实施例中，上述层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒还包括层粘连蛋白定标品。
层粘连蛋白定标品为浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、700ng/mL和1000ng/mL的层粘连蛋白的溶液。
具体的，层粘连蛋白定标品可以采用标准品缓冲液将层粘连蛋白配制成浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、700ng/mL和1000ng/mL的层粘连蛋白的溶液。
这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒用于层粘连蛋白检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对层粘连蛋白定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对层粘连蛋白全自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评价。
这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成层粘连蛋白的检测这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到2.0ng/mL，相对于传统的层粘连蛋白的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
此外，这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点：
1、选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到2.0ng/mL～1000ng/mL，而传统的层粘连蛋白的检测方法的检线性范围为20ng/mL～1000ng/mL；
3、吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5％以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
4、化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
5、化学发光免疫分析系统可以实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。
结合图1，上述层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入层粘连蛋白单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒；以及
取层粘连蛋白单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h～2h后除杂，得到化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体。
MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液的浓度为0.02M，pH为5.5。
Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2％BSA，pH为8.0。
EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)水溶液的浓度为10mg/mL～20mg/mL，EDC与羧基化的磁微粒的质量比为0.05：0.1～1。
优选的，层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，层粘连蛋白单克隆抗体与羧基化的磁微粒的质量比为1：25～35。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm～1μm。
碳酸盐缓冲液浓度为0.1M，pH为9.0～9.5，
除杂的操作为离心脱盐柱脱盐，具体操作为：先分别用纯净水及TBS缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)处理离心脱盐柱，最后加入得到的层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集离心管中的液体。
优选的，化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体中，层粘连蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的质量比为50：1～10。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
得到的层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体组合即可得到上述层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒。
这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒在使用时，还需要化学发光底物液和层粘连蛋白定标品。
化学发光底物液和层粘连蛋白定标品可以自行配制得到。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
具体的，层粘连蛋白定标品可以采用标准品缓冲液将层粘连蛋白配制成浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、700ng/mL和1000ng/mL的层粘连蛋白的溶液。
这种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便，制得的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
以下为具体实施例。
实施例1：层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备
(1)层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的制备：
取含有50mg粒径为0.05μm～1μm的羧基化的磁微粒(MagnaBindTM，货号21353)悬浮液，磁分离去上清，用0.02M，pH为5.5MES缓冲液重悬，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg层粘连蛋白单克隆抗体(biorbyt，货号orb48780)，室温下混悬6h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M，pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
(2)层粘连蛋白单克隆抗体标记的吖啶酯的制备：
取50μL浓度为25mg/mL的层粘连蛋白单克隆抗体，加入150μL浓度为0.1M、pH为9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5μL浓度为5mg/mL的吖啶酯溶液混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的层粘连蛋白单克隆抗体标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到层粘连蛋白单克隆抗体标记的吖啶酯，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
(3)层粘连蛋白定标品的制备：
用标准品缓冲液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)将层粘连蛋白配置成浓度为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、700ng/mL和1000ng/mL，每瓶0.5mL分装冻干，4℃保存备用。
实施例2：层粘连蛋白化学发光免疫检测方法
以全自动化学发光免疫分析仪(YHLO，货号iFlash3000)为检测工具，方法学模式为双抗体夹心法，即仪器依次加入50μL的样品、50μL的层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒以及50μL的层粘连蛋白包被的吖啶酯，，反应20min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物A液(H2O2)及B液(NaOH)进行发光反应，最后记录发光值。
实施例3：层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒性能评价
采用实施例2中的方法对层粘连蛋白定标品进行检测，得到绘制标准曲线如图2所示。
接着对接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为2.0ng/mL。
线性的检测：
对浓度为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、700ng/mL和1000ng/mL标准品做线性分析，计算线性相关系数，r＝0.9996，另外，该试剂盒对层粘连蛋白样品检测的线性范围为2.0ng/ml～1000ng/mL。
精密度测定：
取浓度为500ng/mL及1000ng/mL两个层粘连蛋白样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5％。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括：结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加质量比按照1：20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以±10％为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件标准，可用于临床实验室层粘连蛋白状况的准确评估。
实施例4、层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0ng/mL、的层粘连蛋白样品做检测，两种方法检测灵敏度相比，数据如下表所示：
由上表可以看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约20倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒中，所述层粘连蛋白单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的质量比为1：25～35。
3.根据权利要求1所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体中，所述层粘连蛋白单克隆抗体与所述化学发光标记物的质量比为50：1～10。
4.根据权利要求1所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm～1μm。
5.根据权利要求1所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
6.根据权利要求1所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
7.根据权利要求6所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
8.根据权利要求1所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括层粘连蛋白定标品。
9.根据权利要求8所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述层粘连蛋白定标品为浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、700ng/mL和1000ng/mL的层粘连蛋白的溶液。
10.一种根据权利要求1～9中任一项所述的层粘连蛋白化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入层粘连蛋白单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到层粘连蛋白单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒；以及
取层粘连蛋白单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h～2h后除杂，得到化学发光标记物标记的层粘连蛋白单克隆抗体。
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