CN106622416A - 一种检测人超敏c反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒 - Google Patents

一种检测人超敏c反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。本发明提供的所述方法操作简单、重复性好，适合工业批量生产。

Description

一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和 试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检验技术领域，具体涉及一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒。
背景技术
C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)，是Tillet和Francis于1930年在急性大叶性肺炎患者血清中发现的，因其在钙离子存在时能和肺炎双球菌细胞壁的C多糖起沉淀反应而得名，是相对分子质量为115-140KD的血清β球蛋白。关于CRP的研究已经有70多年的历史，传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物。CRP在临床上主要用于评价感染、组织损伤和炎症性疾病，同时为炎症性疾病的诊断提供数据支持，也可为疾病的治疗和监控提供诊疗信息。
随着检测技术的进步，采用超敏感方法检测到的CRP被称为超敏CRP(HS-CRP)。近年来，大量的文章研究显示，HS-CRP在冠心病、中风、心肌梗死、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用。在由慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素中CRP的作用已被证实，及时监测CRP的水平变化对心血管疾病的干预及预后起重要作用，且CRP水平越高，发生心脑血管的危险性就越大。因此欧美等发达国家已将HS-CRP作为预防心血管疾病的相对独立的一个新的筛查指标。有学者认为CRP是心血管疾病危险评估的“金标准”，是心血管疾病强有力的预示因子与危险因子。
目前在临床上常规测定CRP的主要方法有放射免疫法、免疫比浊法、胶体金免疫层析法以及ELISA法等。放射免疫法结果较准确，线性范围较宽，灵敏度可达3ng/mL，但是操作繁琐且存在同位素污染问题，已逐渐被其它方法所代替。免疫比浊法目前应用广泛，但其检测灵敏度较低约为5μg/mL，且通常需要自动生化分析仪和自动化免疫测定仪等大型仪器，操作复杂耗时长，所需样本量大。胶体金免疫层析法具有快速、便捷、价廉及适合单人份操作等优点，但是只能定性或半定量检测，易出现误判，灵敏度低。而ELISA法检测CRP的检测灵敏度达到10～39ng/ml(专利号为CN201110257767.9，CN201510673472.8和CN201510673472.8)。目前还没有针对CRP的高灵敏度快速检测的试纸装置。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒，使所述微流控纸芯片具有较高的检测灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)在电脑上设计纸芯片的图案；
2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；
3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；
4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；
5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。
优选的，所述步骤1)中图案的形状包括圆形或矩形；所述图案按照矩阵排列；所述纸芯片上图案的个数包括24、48或96个；相邻图案的中心之间的距离为15～20mm；每个图案的面积为70～90mm2。
优选的，所述步骤3)中烘烤温度为100～120℃；烘烤的时间优选为10～40s。
优选的，所述步骤4)中超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为20～80ug/ml。
优选的，所述步骤4)和步骤5)中干燥的温度独立为20～30℃；干燥的时间为5～20min。
优选的，所述步骤4)和5)中洗涤用洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液为含有体积浓度0.05％Tween-20的PBS缓冲液；PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。
优选的，所述步骤5)中封闭液为含有质量浓度5％BSA的PBST缓冲液；PBST缓冲液的pH值为7.2～7.4。
优选的，所述步骤5)中孵育的时间为5～20min；孵育的温度为20～30℃。
本发明提供了所述的方法制备的检测人超敏C反应蛋白的微流控纸芯片，由纸芯片、附着在纸芯片疏水区域上的蜡和附着在纸芯片亲水区域的人超敏C反应蛋白抗体组成；所述疏水区域将亲水区域包围。
本发明还提供了一种检测人超敏C反应蛋白用试剂盒，包括权利要求1～8任意一项所述的方法制备的微流控纸芯片或权利要求9所述的微流控纸芯片，0.5～5μg/ml生物素标记的人超敏C反应蛋白二抗、0.5～2μg/ml HRP-链霉亲和素、化学发光底物液、人超敏C反应蛋白标准品。
本发明提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。本发明提供的所述方法操作简单、重复性好，适合工业批量生产。
本发明提供的方法制备的纸芯片作为一种新型的检测技术具有价格低廉、可便携式、生物相容性好、简单快速、试剂消耗量小和设计灵活等特点，已显示出其在POCT诊断平台的强大生命力；同时所述纸芯片保存时间长，在4℃至少可以保存6周。
本发明提供的试剂盒是在纸芯片的化学发光免疫分析(CLIA)法中，引入了生物素-亲和素系统来放大信号，提高了纸芯片的检测信噪比，从而提高检测灵敏度。检测的灵敏度可达0.5ng/mL，远远超过用于快速检测的免疫层析试纸的灵敏度至少一个数量级以上；接近部分HS-CRP ELISA试剂盒的检测性能。该灵敏度可以满足对于预防心血管疾病的POCT快速检测的需要。
进一步的，本发明提供的试剂盒，通过进一步限定两种抗体的浓度和种类，实现了纸芯片在生物大分子的应用。本发明首次将微流控纸芯片用于检测CRP。
附图说明
图1为微流控纸芯片的示意图；
图2为测量灵敏度的标准曲线；
图3为纸芯片与ELISA试剂盒CRP检测结果的相关性。
具体实施方式
本发明提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)在电脑上设计纸芯片的图案；
2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；
3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；
4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml
5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。
本发明首先在在电脑上设计纸芯片图案。
本发明中，所述纸芯片优选WhatmanTM1号层析纸。
本发明中，所述设计的方法优选采用Adobe illustrator绘图软件进行设计。
本发明中，所述图案的形状优选包括圆形或矩形。所述图案优选按照矩阵排列。所述纸芯片上图案的个数没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的方案即可。本发明实施例中，设计的纸芯片图案的个数包括24(4×6)、48(6×8)或96(8×12)个。相邻图案的中心之间的距离优选为15～20mm，更优选为18；每个图案的面积优选为25～30mm2；当所述图案为圆形时，所述圆形直径优选为5～6mm。所述图案为亲水区域；纸芯片上亲水区域以外的区域为疏水区域。
在电脑上设计好纸芯片的图案后，本发明用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案为检测区。
本发明对所述喷蜡打印机的种类没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的喷蜡打印机即可。本发明实施例中，所述喷蜡打印机的型号为施乐ColorQube8870。
得到附着有蜡的纸芯片后，本发明将所述得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片。
本发明中，所述烘烤优选采用电子控温仪器进行。所述电子控温仪器的种类没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的电子控温仪器即可。本发明中，所述烘烤温度优选为100～120℃，更优选为105～115℃，最优选为110℃。所述烘烤的时间优选为10～40s，更优选为20～30s，最优选为25s。本发明中，所述烘烤的目的是将蜡均匀的附着在纸芯片上。
本发明中，所述冷却的程度优选为纸芯片的温度降至25～28℃。
得到预处理纸芯片后，本发明在所述预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml。
本发明中，所述人超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度优选为20～80μg/ml，更优选为40～60μg/ml，最优选为50μg/ml。本发明中，所述包被的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的包被方法即可。本发明实施例中，所述包被的方法是将所述一抗溶液滴加到检测区。本发明中，所述包被的时间优选为30～100min，更优选为60min。所述包被的体积优选为1～3mL/cm2。本发明中，所述人超敏C反应蛋白一抗溶液购自广州万孚生物技术股份有限公司。
本发明中，所述干燥的温度独立优选为20～30℃，更优选为25℃；干燥的时间为5～20min，更优选为10min。
本发明中，所述洗涤用洗涤液优选为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液为含有体积浓度0.05％Tween-20的PBS缓冲液；PBS缓冲液的pH值优选为7.2-7.4。
得到的包被纸芯片后，本发明用封闭液封闭所述包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。
本发明中，所述封闭液优选为含有质量浓度5％BSA的PBS溶液；PBS缓冲液的pH值为7.2-7.4。
本发明中，所述孵育的时间优选为5～20min，更优选为10～15min；孵育的温度优选为20～30℃，更优选为15℃。本发明中，洗涤的次数优选为2～3次。本发明中，洗涤用洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液为含有体积浓度0.05％Tween-20的PBS缓冲液；PBS缓冲液的pH值为7.2-7.4。
本发明中，所述干燥的温度独立优选为20～30℃，更优选为25℃；干燥的时间为5～20min，更优选为10min。
本发明提供了所述的方法制备的检测人超敏C反应蛋白的微流控纸芯片，由纸芯片、附着在纸芯片疏水区域上的蜡和附着在纸芯片亲水区域的人超敏C反应蛋白抗体组成；所述疏水区域将亲水区域包围。
本发明还提供了一种检测人超敏C反应蛋白用试剂盒，包括上述方法制备的微流控纸芯片，0.5～5μg/ml生物素标记的人超敏C反应蛋白二抗溶液、0.5～2μg/ml HRP-链霉亲和素、化学发光底物液、人超敏C反应蛋白标准品。
本发明提供的试剂盒包括上述方法制备的微流控纸芯片。
本发明提供的试剂盒包括生物素标记的人超敏C反应蛋白二抗溶液。本发明中，所述生物素标记的人超敏C反应蛋白二抗溶液的浓度为0.5～5μg/ml，优选为1.0～4μg/ml，更优选为1.5～3.0μg/ml，最优选为2.0μg/ml。所述生物素标记的人超敏C反应蛋白二抗溶液的制备方法优选采用生物素标记试剂盒将生物素和二抗体进行偶联。
本发明中，所述生物素标记试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的生物素标记试剂盒即可。本发明实施例中，所述生物素标记试剂盒购thermo fisher公司。所述人超敏C反应蛋白二抗购自杭州启泰生物技术有限公司。
本发明提供的试剂盒包括HRP-链霉亲和素。所述HRP-链霉亲和素的浓度为0.5～2μg/ml，优选为0.8～1.5μg/ml，更优选为1.0～1.2μg/ml。所述HRP-链霉亲和素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的HRP-链霉亲和素即可。本发明中，所述HRP-链霉亲和素购自thermo fisher公司的Poly-HRPStreptavidin。
本发明提供的试剂盒包括化学发光底物液。化学发光底物液的种类没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的化学发光底物液即可。在本发明的实施例中，所述化学发光底物液购自密理博公司。
本发明提供的试剂盒包括人超敏C反应蛋白标准品。所述人超敏C反应蛋白标准品的浓度优选为0～100ng/ml。所述人超敏C反应蛋白标准品的来源优选为杭州启泰生物技术有限公司。
在本发明中，所述试剂盒对人超敏C反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：
1)将5μl待测样品滴加在纸芯片的检测区，室温孵育5min，缓冲液冲洗2次；
2)滴加5μl生物素标记的CRP二抗溶液，室温孵育5min，缓冲液冲洗2次；
3)滴加5μl HRP-链霉亲和素，室温孵育5min，洗涤液冲洗2次；
4)滴加5μl化学发光底物液，在化学发光仪拍照；
5)用图像分析软件对化学发光仪拍摄的照片进行灰度分析，根据绘制标准曲线，计算得到待测样品的准确CRP浓度。
标准曲线的获取方法没有特殊限制，按照样品的检测方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用Adobe illustrator绘图软件设计纸芯片的圆形，按照微孔板的排列方式设置圆形图案，每隔一列设计纸芯片检测区，纸芯片测定区的直径为5mm，相邻的圆形测定区之间的距离为18mm，绘制了4×6共24个检测区(图1微流控纸芯片的示意图)。用施乐ColorQube8870喷蜡打印机在WhatmanTM1号层析纸上打印设计好的图案。
用电子控温仪器在110℃对蜡印的层析纸烘烤30s，目的是将打印的蜡烤化并使其均匀的渗透到层析纸的内部，从而在未被蜡浸染的部分形成亲水的检测区，取出层析纸，室温冷却。
在检测区滴加5μl浓度为20μg/ml CRP一抗，室温自然干燥10min，缓冲液冲洗2次；将10μl封闭液滴加在检测区，室温孵育10min，缓冲液冲洗2次；室温干燥后，即完成了纸芯片的制备。
实施例2
利用Adobe illustrator绘图软件设计纸芯片的圆形，按照微孔板的排列方式设置圆形图案，每隔一列设计纸芯片检测区，纸芯片测定区的直径为6mm，相邻的圆形测定区之间的距离为20mm，绘制了6×8共48个检测区(图1微流控纸芯片的示意图)。用施乐ColorQube8870喷蜡打印机在WhatmanTM1号层析纸上打印设计好的图案。
用电子控温仪器在100℃对蜡印的层析纸烘烤40s，目的是将打印的蜡烤化并使其均匀的渗透到层析纸的内部，从而在未被蜡浸染的部分形成亲水的检测区，取出层析纸，室温冷却。
在检测区滴加5μl浓度为80ug/ml CRP一抗，室温自然干燥15min，缓冲液冲洗2次；将10μl封闭液滴加在检测区，室温孵育10min，缓冲液冲洗2次；室温干燥后，即完成了纸芯片的制备。
实施例3
利用Adobe illustrator绘图软件设计纸芯片的圆形，按照微孔板的排列方式设置圆形图案，每隔一列设计纸芯片检测区，纸芯片测定区的直径为6mm，相邻的圆形测定区之间的距离为15mm，绘制了9×12共96个检测区。用施乐ColorQube8870喷蜡打印机在WhatmanTM1号层析纸上打印设计好的图案。
用电子控温仪器在120℃对蜡印的层析纸烘烤20s，目的是将打印的蜡烤化并使其均匀的渗透到层析纸的内部，从而在未被蜡浸染的部分形成亲水的检测区，取出层析纸，室温冷却。
在检测区滴加5μl浓度为40μg/ml CRP一抗，室温自然干燥15min，缓冲液冲洗2次；将10μl封闭液滴加在检测区，室温孵育15min，缓冲液冲洗2次；室温干燥后，即完成了纸芯片的制备。
实施例4
利用Adobe illustrator绘图软件设计纸芯片的圆形，按照微孔板的排列方式设置圆形图案，每隔一列设计纸芯片检测区，纸芯片测定区的直径为4mm，相邻的圆形测定区之间的距离为15mm，绘制了9×12共96个检测区。用施乐ColorQube8870喷蜡打印机在WhatmanTM1号层析纸上打印设计好的图案。
用电子控温仪器在120℃对蜡印的层析纸烘烤20s，目的是将打印的蜡烤化并使其均匀的渗透到层析纸的内部，从而在未被蜡浸染的部分形成亲水的检测区，取出层析纸，室温冷却。
在检测区滴加5μl浓度为60μg/ml CRP一抗，室温自然干燥12min，缓冲液冲洗2次；将10μl封闭液滴加在检测区，室温孵育12min，缓冲液冲洗2次；室温干燥后，即完成了纸芯片的制备。
实施例5
利用Adobe illustrator绘图软件设计纸芯片的圆形，按照微孔板的排列方式设置圆形图案，每隔一列设计纸芯片检测区，纸芯片测定区的直径为4mm，相邻的圆形测定区之间的距离为15mm，绘制了9×12共48个检测区。用施乐ColorQube8870喷蜡打印机在WhatmanTM1号层析纸上打印设计好的图案。
用电子控温仪器在120℃对蜡印的层析纸烘烤20s，目的是将打印的蜡烤化并使其均匀的渗透到层析纸的内部，从而在未被蜡浸染的部分形成亲水的检测区，取出层析纸，室温冷却。
在检测区滴加5μl浓度为50μg/ml CRP一抗，室温自然干燥20min，缓冲液冲洗2次；将10μl封闭液滴加在检测区，室温孵育20min，缓冲液冲洗2次；室温干燥后，即完成了纸芯片的制备。
实施例6
标准曲线的建立：
将CRP标准品浓度分别稀释为0、10、25、100ng/mL，将5μl不同浓度的CRP标准品，滴加在实施例5制备的纸芯片的检测区上，室温孵育5min，缓冲液冲洗2次；滴加5μl生物素标记的CRP二抗溶液，室温孵育5min，缓冲液冲洗2次；滴加5μl HRP-链霉亲和素，室温孵育5min，缓冲液冲洗2次。滴加5μl化学发光底物液，用便携式化学发光仪拍照，整个测定过程可在20min之内完成。用化学发光分析仪拍照，通过灰度分析获得各反应区的相对发光值(RLU)。依据标准品绘制出标注曲线并得到方程，把待测品的相对发光值(RLU)代入方程，求得样品的CRP浓度。
以CRP标准品各浓度(0、10、25、100ng/mL)为X，各标准品发光值为Y，进行线性拟合，绘制标准曲线如附图2，拟合方程为y＝8.199x+102.669，相关系数为0.999。
用零浓度校准品，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光值(RLU)，计算其平均值(Mean)和标准差(SD)，Mean+2SD的RLU值代入拟合方程，对应的浓度值，即为本纸芯片检测CRP的灵敏度0.41ng/mL。
实施例7
将实施例1～5制备的纸芯片用于精密度检测，具体是按照实施例6中步骤进行操作。
低值标准品选择12.5ng/mL，高值标准品选择50ng/mL，分别计算批内和批间的变异系数(CV)。结果如表1所示。
表1 CRP纸芯片的精密度
注：批间指不同实施例制备得到的5个纸芯片；批内指同一芯片上不同检测区的检测值。
由表1中检测数据可知，批内和批间CV均控制在10％以内，表明CRP纸芯片的精密度较好。
实施例8
与商业化ELISA试剂盒的相关性：
收集31份病人血清，把本发明制作的纸芯片测定值与诊断级ELISA试剂盒(Diagnostic Automation公司CRP ELISA试剂盒)的测定值进行对比。图3为纸芯片与ELISA试剂盒CRP检测结果的相关性，图3表明，本发明制作的纸芯片测定值与诊断级ELISA试剂盒的测定值具有良好的相关性，相关系数r＝0.964(图3)。此外，本发明提供的方法制备的纸芯片能够用时在20min以内实现了快速检测，比ELISA试剂盒的检测时间缩短了40min。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)在电脑上设计纸芯片的图案；
2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；
3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；
4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；
5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中图案的形状包括圆形或矩形；所述图案按照矩阵排列；所述纸芯片上图案的个数包括24、48或96个；相邻图案的中心之间的距离为15～20mm；每个图案的面积为70～90mm2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中烘烤温度为100～120℃；烘烤的时间优选为10～40s。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为20～80μg/ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)和步骤5)中干燥的温度独立为20～30℃；干燥的时间独立为5～20min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)和5)中洗涤用洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液为含有体积浓度0.05％Tween-20的PBS缓冲液；PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中封闭液为含有质量浓度5％BSA的PBST缓冲液；PBST缓冲液的pH值为7.2～7.4。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中孵育的时间为5～20min；孵育的温度为20～30℃。
9.权利要求1～8任意一项所述的方法制备的检测人超敏C反应蛋白的微流控纸芯片，包括纸芯片、附着在所述纸芯片疏水区域上的蜡和附着在纸芯片亲水区域的人超敏C反应蛋白抗体；所述疏水区域将亲水区域包围。
10.一种检测人超敏C反应蛋白用试剂盒，包括所述的微流控纸芯片、0.5～5μg/ml生物素标记的人超敏C反应蛋白二抗、0.5～2μg/ml HRP-链霉亲和素、化学发光底物液和人超敏C反应蛋白标准品。
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