CN111088155A - 一种pcr检测微流控纸芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PCR检测微流控纸芯片及其制备方法和应用，属于微生物检测技术领域，所述PCR检测微流控纸芯片包括纸芯片和PCR反应体系；所述纸芯片包括若干个亲水区和疏水区；所述亲水区按照矩阵排列，所述亲水区为检测区域；在所述亲水区包被PCR反应体系；所述PCR检测微流控纸芯片用于空间站微生物检测。本发明提供的PCR检测微流控纸芯片稳定性好，在常温至少可以保存6周；4℃、‑20℃的条件下至少能够保存半年；所述PCR检测微流控纸芯片可以稳定在空间保存并用于检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种PCR检测微流控纸芯片及其制备方法和应用。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，意味着PCR技术的真正诞生。到如今已发展到有30多种不同种类的PCR技术。它以敏感度高、特异型性强、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学、农业科学、食品科学、临床检测等。
但这些技术主要面对地面实验室应用而设计，从体积、功耗、可靠性、自动化程度等方面均不适合空间环境需求。因此要发展空间微生物检测技术，必须重新研制和设计PCR反应装置，以满足空间生命科学实验仪器的特殊要求。
空间站长期在轨运行为人类科学研究和太空探索提供了便利条件，也为空间站内微生物的滋生提供了良好的生长环境。而微生物的滋生会严重破坏空间站设备和污染舱内空气、食物和水源，影响飞行安全并危害宇航员健康。因此，对空间站中致病微生物进行在轨检测，对于保证人机系统的安全性，保障宇航员健康具有重要意义。目前空间站微生物检测主要是在轨擦拭和空间培养和地面返回培养相结合。另外还使用一种手持式微生物检测设备，通过显色试剂的颜色变化检测特征生物分子获取微生物信息。这些方法灵敏度低、特异性差，无法满足空间站的微生物防控的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速PCR检测微流控纸芯片，及其制备方法和应用；利用所述PCR检测微流控纸芯片进行空间站内微生物的检测，检测过程简单、成本低廉、敏感度高、特异型性强、重复性好，仅需两步在60min内即可完成检测。与已有研究比较，本发明提供的微流控纸芯片降低了成本、减少了操作步骤、实现了真正的一次性和便携性检测，可以作为一种非常有潜力的工具在空间站进行微生物的检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种PCR检测微流控纸芯片，包括纸芯片和PCR反应体系；所述纸芯片包括若干个亲水区和疏水区；所述亲水区按照矩阵排列，所述亲水区为检测区域；在所述亲水区包被PCR反应体系；所述PCR检测微流控纸芯片用于空间站微生物检测。
优选的，所述纸芯片的材料为WhatmanTM1号层析纸。
优选的，所述亲水区为10～100个；两两相邻亲水区中心之间的距离为15～20mm。
优选的，每一个亲水区的面积为70～90mm2。
优选的，所述疏水区由蜡打印融化后形成。
优选的，所述PCR反应体系包括特异性引物对、PCR缓冲液和镁离子。
本发明提供了所述的PCR检测微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：1)纸芯片的制备、预处理获得预处理后的纸芯片；2)在所述预处理后的纸芯片的亲水区包被PCR扩增体系获得PCR检测微流控纸芯片。
优选的，步骤1)中所述预处理包括将所述纸芯片在35～40℃干燥40～60min。
优选的，步骤2)中所述包被的PCR扩增体系的体积为20～40μL；包被的特异性引物对的浓度为150～600nM；包被的镁离子溶液中镁离子的浓度为12～20nM。
优选的，步骤2)中所述包被具体包括以下步骤：包被特异性引物对和PCR缓冲液、干燥；然后再包被镁离子溶液、再次干燥。
本发明提供了所述的PCR检测微流控纸芯片在空间站微生物检测中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的PCR检测微流控纸芯片，包括纸芯片和PCR反应体系；所述纸芯片包括若干个亲水区和疏水区；所述亲水区按照矩阵排列，所述亲水区为检测区域；在所述亲水区包被PCR反应体系；所述PCR检测微流控纸芯片用于空间站微生物检测。本发明提供PCR检测微流控纸芯片轻便、小巧便于携带；便于检测空间站中的微生物，检测精确度高，检测可以在37℃下进行，满足空间站的需要，操作简单。本发明提供的PCR检测微流控纸芯片稳定性好，在常温至少可以保存6周；4℃、-20℃的条件下至少能够保存半年；并且所述PCR检测微流控纸芯片可以稳定在空间保存并用于检测。
附图说明
图1为本发明提供的PCR检测微流控纸芯片的结构示意图；
图2为不同裂解条件的常温PCR结果，其中1为阴性对照；2为DNA提取试剂盒提取DNA后常温PCR结果；3为常温裂解后常温PCR的结果；4为37℃裂解后常温PCR的结果；
图3为利用本发明提供的PCR检测微流控纸芯片对金黄色葡萄球菌样品检测的结果；
图4为本发明提供的PCR检测微流控纸芯片在飞船搭载空间飞行后对金黄色葡萄球菌样品检测的结果；
图5为本发明提供的PCR检测微流控纸芯片在卫星搭载空间飞行后对金黄色葡萄球菌样品检测的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种PCR检测微流控纸芯片，包括纸芯片和PCR反应体系；所述纸芯片包括若干个亲水区和疏水区；所述亲水区按照矩阵排列，所述亲水区为检测区域；在所述亲水区包被PCR反应体系；所述PCR检测微流控纸芯片用于空间站微生物检测。
在本发明中，所述纸芯片的材料优选为WhatmanTM1号层析纸；所述纸芯片中的亲水区优选为10～100个，具体的可为24、48或96个；本发明中两两相邻亲水区中心之间的距离优选为15～20mm；每一个亲水区的面积优选为70～90mm2，更优选为80mm2。在本发明中，所述疏水区由蜡打印融化后形成。在本发明中，所述纸芯片的具体制备方法参见专利CN201611033217.8中记载。
在本发明中，所述PCR反应体系优选的包括特异性引物对、PCR缓冲液和镁离子。在本发明中，所述特异性引物对为针对不同检测目的微生物设计的引物对，在本发明具体实施过程中，以金黄色葡萄球菌为例；所述特异性引物对包括如下序列：
5’-GTCGTAACAAGGTAGCCGTATCG-3’(SEQ ID NO.1)；
5’-TCCCCATTCGGAAATCTCTG-3’(SEQ ID NO.2)。
在本发明中，所述PCR缓冲液优选的采用市售的PCR缓冲液，所述镁离子优选的也采用市售试剂，在本发明具体实施过程中，所述PCR缓冲液和镁离子购买于TwistXD公司的
Basic kit试剂盒。在本发明中，所述包被的PCR扩增体系的体积优选为20～40μL，更优选为36.8μL；包被的特异性引物对的浓度优选的独立为150～600nM，更优选为200nM；包被的镁离子溶液中镁离子的浓度优选为12～20nM。
本发明提供了所述的PCR检测微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：1)纸芯片的制备、预处理获得预处理后的纸芯片；2)在所述预处理后的纸芯片的亲水区包被PCR扩增体系获得PCR检测微流控纸芯片。
在本发明中，纸芯片的制备、预处理获得预处理后的纸芯片。在本发明中，所述纸芯片的具体制备方法参见专利CN201611033217.8中记载。在本发明中，所述预处理优选的包括将所述纸芯片在35～40℃干燥40～60min，更优选的将所述纸芯片在37℃干燥50min。本发明在所述干燥后，优选的进行冷却；本发明对所述冷却的方法没有特殊限定，采用常规的自然冷却即可。
本发明在获得所述预处理后的纸芯片后，在所述预处理后的纸芯片的亲水区包被PCR扩增体系获得PCR检测微流控纸芯片。在本发明中，所述包被具体包括以下步骤：包被特异性引物对和PCR缓冲液、干燥；然后再包被镁离子溶液、再次干燥。在本发明中，优选的首先包被浓度为200nM特异性引物对4μL和PCR缓冲液29.5μL，然后进行干燥；所述干燥的温度优选为35～40℃，更优选为37℃，所述干燥的时间优选为40～60min，更优选为50min。本发明在包被了所述特异性引物对和PCR缓冲液后，再包被镁离子溶液；在本发明中，所述镁离子溶液的浓度优选为20nM，所述镁离子溶液的包被体积优选为2.5μL。在本发明中，所述再次干燥的温度优选为35～40℃，更优选为37℃，所述再次干燥的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明在所述干燥后获得所述PCR检测微流控纸芯片。
本发明还提供了所述的PCR检测微流控纸芯片在空间站微生物检测中的应用。本发明中所述的PCR检测微流控纸芯片根据检测需求包被不同的特异性引物对，来实现不同微生物的检测。在本发明中，在检测时将裂解的微生物样品与去离子水混合滴加到检测区，然后将纸芯片放入37℃孵育30min。取出后用UV照射观察，利用ImageJ灰度分析软件获得的灰度值的定量检测结果。
在本发明中，上述常温以及实施例中的常温放置组处理中的“常温”的具体温度为20～25℃。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
针对空间站环境中微生物检测和航天员健康状况检测问题，本实施例选用空间环境中金黄色葡萄球菌为模式目标物在实验室进行检测。
1、引物设计
使用PRIMER5.0引物设计软件，根据金黄色葡萄球菌的16SrRNA进行引物设计。引物序列如下：5’GTCGTAACAAGGTAGCCGTATCG-3,
5'TCCCCATTCGGAAATCTCTG-3’。
2、DNA模板提取
目前作为模板的核酸物质往往要进行纯化，甚至几次纯化，这样才能避免核酸中的杂质(如血清蛋白，胆红素，脂类等)抑制PCR反应。现在常用的核酸提纯的方法过程比较复杂，繁琐，耗时较长。而且提纯过程需要多次离心或移管等操作，也导致核酸以气溶胶的形式外溢到环境中，不利于空间微生物的测定。因此，本实施例应用核酸释放剂快速获得空间微生物的核酸，实现一步法快速完成空间微生物核酸提取。
试验菌为金黄色葡萄球菌。取冻干菌种管，在无菌操作下，用毛细吸管向其加入营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取菌种滴入含10mL营养肉汤的试管中，置37℃培养24h。裂解液为50MmTris，4M尿素，0.1％trion混合获得裂解液；然后按照裂解液和菌液体积比1:1混合进行裂解，裂解后进行扩增，并比较常温和37℃的裂解效果。结果如图1所示，其中1阴性对照；2为DNA提取试剂盒提取DNA后常温PCR结果；3为常温裂解后常温PCR的结果；4为37℃裂解后常温PCR的结果；由此可见，用裂解液裂解在常温和37℃下直接裂解均可获得细菌DNA，并用于后续的PCR反应。
3、微流控纸芯片检测
首先预处理纸芯片，所述纸芯片的具体制备方法参见专利CN201611033217.8中记载。之后按照顺序在纸芯片的检测区包被200nM金黄色葡萄球菌的特异性引物4.8μL和PCR缓冲液29.5μL，在37℃下干燥50min后加入20nM镁离子2.5μL，再次干燥10min得到检测金黄色葡萄球菌用微流控纸芯片，微流控芯片的包被体积为36.8μL。检测时可以将金黄色葡萄球菌样品2μL与去离子水11.2μL混合滴加到检测区，具体50μL检测体系如下：
检测试剂购买于
Basic kit试剂盒。
试验菌为金黄色葡萄球菌。取冻干菌种管，在无菌操作下，用毛细吸管向其加入营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取菌种滴入含5mL营养肉汤的试管中，置37℃培养24h。离心后用1mL去离子水重新溶解过夜培养的菌落作为菌悬液原液，从中取20μL溶解在180μL的培养基中，之后10倍梯度稀释菌悬液原液，配制成6个梯度稀释菌液，每个浓度的菌液吸取100μL进行涂板过夜。48h后6个梯度进行平板菌落计数，计数结果如下表1，取六个梯度稀释菌液每个2μL作为检测的样品，加入等体积的裂解液。
表1平板菌落计数结果表
| 样品编号 | 稀释倍数 | 平板菌落数(个/100μL) | 检测系统的菌落数(2μL) |
| 1 | 细菌原液 | 5.5×10<sup>6</sup> | 1.1×10<sup>5</sup> |
| 2 | 10倍稀释 | 5.1×10<sup>5</sup> | 1.0×10<sup>4</sup> |
| 3 | 10<sup>2</sup>倍稀释 | 4.6×10<sup>4</sup> | 9.2×10<sup>2</sup> |
| 4 | 10<sup>3</sup>倍稀释 | 5.1×10<sup>3</sup> | 102 |
| 5 | 10<sup>4</sup>倍稀释 | 5.2×10<sup>2</sup> | 10 |
| 6 | 10<sup>5</sup>倍稀释 | 52 | 1 |
检测时可以将裂解的金黄色葡萄球菌样品4μL与去离子水9.2μL混合滴加到检测区，将纸芯片放入37℃孵育30min。取出后用UV照射观察，利用ImageJ灰度分析软件获得的灰度值的定量检测结果。结果分析如图2；结果显示，微流控纸芯片可以检测样品中含有10个菌落的金黄色葡萄球菌。
实施例2
快速PCR检测微流控纸芯片在空间环境稳定性检测
1、微流控纸芯片PCR反应体系的在飞船空间环境的稳定性研究：
首先预处理纸芯片，之后按照顺序在纸芯片的检测区包被200nM金黄色葡萄球菌的特异性引物对4.8μL和PCR缓冲液29.5μL，在37℃下干燥50min后，加入20nM镁离子2.5μL，再次37℃干燥10min得到检测金黄色葡萄球菌用微流控纸芯片，微流控芯片的包被体积为36.8μL。干燥后体系分为飞船搭载组、-20℃、4℃和常温组分别放置33天后检测。飞船搭载组是指包被后的微流控纸芯片放置在神州十一号飞船上在太空驻留33天返回地面组。
试验菌为金黄色葡萄球菌。取冻干菌种管，在无菌操作下，用毛细吸管向其加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取菌种滴入含5mL营养肉汤的试管中，置37℃培养24h。离心后用1mL去离子水重新溶解过夜培养的菌落作为菌悬液原液，从中取20μL溶解在180μL的培养基中，之后10倍梯度稀释菌悬液原液，配制成6个梯度稀释菌液，每个浓度的菌液吸取100μL进行涂板过夜。48h后6个梯度进行平板菌落计数，计数结果如下表2，取编号为4的稀释菌液每个2μL作为检测的样品，加入等体积的裂解液。
表2平板菌落计数结果
| 样品编号 | 稀释倍数 | 平板菌落数(个/100μL) | 检测系统的菌落数(2μL) |
| 1 | 细菌原液 | 3.5×10<sup>6</sup> | 7×10<sup>4</sup> |
| 2 | 10倍稀释 | 2.1×10<sup>5</sup> | 4.2×10<sup>3</sup> |
| 3 | 10<sup>2</sup>倍稀释 | 3.6×10<sup>4</sup> | 7.2×10<sup>2</sup> |
| 4 | 10<sup>3</sup>倍稀释 | 4.1×10<sup>3</sup> | 82 |
| 5 | 10<sup>4</sup>倍稀释 | 3.2×10<sup>2</sup> | 6.4 |
| 6 | 10<sup>5</sup>倍稀释 | 32 | 0.64 |
检测时将金黄色葡萄球菌样品4μL与去离子水9.2μL混合滴加到检测区。将纸芯片放入37℃孵育30min。取出后用UV照射观察，利用ImageJ灰度分析软件获得的灰度值的定量检测结果。如图3所示，搭载组、-20℃放置组、4℃放置组、常温放置组和未放置组结果没有显著性差异。说明包被在微流控纸芯片中的PCR体系可以稳定在空间保存并用于检测。
实施例3
微流控纸芯片PCR反应体系的在卫星空间环境的稳定性检测
首先预处理纸芯片，之后按照顺序在纸芯片的检测区包被200nM金黄色葡萄球菌的特异性引物4.8μL和PCR缓冲液共29.5μL，在37℃下干燥50min后加入20nM镁离子2.5μL，再次干燥10min得到检测金黄色葡萄球菌用微流控纸芯片，微流控芯片的包被体积为36.8μL。干燥后体系分为卫星搭载组、-20℃、4℃和常温组分别放置12天后检测。卫星搭载组是指包被后的微流控纸芯片放置在实践十号卫星上在太空驻留12天返回地面组。
试验菌为金黄色葡萄球菌。取冻干菌种管，在无菌操作下，用毛细吸管向其加入营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取菌种滴入含5mL营养肉汤的试管中，置37℃培养24h。离心后用1mL去离子水重新溶解过夜培养的菌落作为菌悬液原液，从中取20μL溶解在180μL的培养基中，之后10倍梯度稀释菌悬液原液，配制成6个梯度稀释菌液，每个浓度的菌液吸取100μL进行涂板过夜。48h后6个梯度进行平板菌落计数，计数结果如下表3，取编号为5的稀释菌液每个2μL作为检测的样品，加入等体积的裂解液。
表3平板菌落计数结果
| 样品编号 | 稀释倍数 | 平板菌落数(个/100μL) | 检测系统的菌落数(2μL) |
| 1 | 细菌原液 | 4.7×10<sup>6</sup> | 9.4×10<sup>4</sup> |
| 2 | 10倍稀释 | 4.9×10<sup>5</sup> | 9.8×10<sup>3</sup> |
| 3 | 10<sup>2</sup>倍稀释 | 5.1×10<sup>4</sup> | 1.0×10<sup>3</sup> |
| 4 | 10<sup>3</sup>倍稀释 | 5.4×10<sup>3</sup> | 1.1×10<sup>2</sup> |
| 5 | 10<sup>4</sup>倍稀释 | 5.5×10<sup>2</sup> | 11 |
| 6 | 10<sup>5</sup>倍稀释 | 59 | 1.2 |
检测时可以将金黄色葡萄球菌样品4μL与去离子水9.2μL混合滴加到检测区。将纸芯片放入37℃孵育30min。取出后用UV照射观察，利用ImageJ灰度分析软件获得的灰度值的定量检测结果。如图4所示，搭载组的阳性结果明显好于-20℃、4℃和常温组，说明包被在微流控纸芯片中的PCR体系更适应在真空环境下保存。
由上述实施例可知，本发明提供PCR检测微流控纸芯片便于检测空间站中的微生物，检测精确度高，稳定性好，所述PCR检测微流控纸芯片可以稳定在空间保存并用于检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种PCR检测微流控纸芯片，其特征在于，包括纸芯片和PCR反应体系；所述纸芯片包括若干个亲水区和疏水区；所述亲水区按照矩阵排列，所述亲水区为检测区域；在所述亲水区包被PCR反应体系；所述PCR检测微流控纸芯片用于空间站微生物检测。
2.根据权利要求1所述的PCR检测微流控纸芯片，其特征在于，所述纸芯片的材料为WhatmanTM1号层析纸。
3.根据权利要求1或2所述的PCR检测微流控纸芯片，其特征在于，所述亲水区为10～100个；两两相邻的亲水区中心之间的距离为15～20mm；每一个亲水区的面积为70～90mm2。
4.根据权利要求1所述的PCR检测微流控纸芯片，其特征在于，所述疏水区由蜡打印融化后形成。
5.根据权利要求1所述的PCR检测微流控纸芯片，其特征在于，所述PCR反应体系包括特异性引物对、PCR缓冲液和镁离子。
6.权利要求1～5任意一项所述的PCR检测微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)纸芯片的制备、预处理获得预处理后的纸芯片；
2)在所述预处理后的纸芯片的亲水区包被PCR扩增体系获得PCR检测微流控纸芯片。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述预处理包括将所述纸芯片在35～40℃干燥40～60min。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述包被的PCR扩增体系的体积为20～40μL；包被的特异性引物对的浓度为150～600nM；包被的镁离子溶液中镁离子的浓度为12～20nM。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述包被具体包括以下步骤：包被特异性引物对和PCR缓冲液、干燥；然后再包被镁离子溶液、再次干燥。
10.权利要求1～5任意一项所述的PCR检测微流控纸芯片在空间站微生物检测中的应用。
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