CN102168130A

CN102168130A - 用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN102168130A
Application number: CN 201010122197
Authority: CN
Inventors: 倪剑锋; 杨文辉; 赵珊珊
Original assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Current assignee: GENEINN BIOTECHNOLOGY (NINGBO) CO Ltd
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: CN102168130B

Abstract

本发明提供了用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，其中包括的用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2；内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：7，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：8。其中还可以包括的用于检测金黄色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4；用于检测表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：5，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：6。本发明还提供了上述引物组合物的试剂盒。采用所述引物组合物及试剂盒检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法，可以在基因水平上进行迅速判断，具有较好的灵敏度和特异性，具有节约时间、技术成熟及检测结果稳定的优点。

Description

用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

近年来，葡萄球菌感染率呈现不断上升的趋势，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcusaureus，MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Meticillin-sensitive coagulase-negativeStaphylococcus，MSCNS)的耐药性逐渐加强，而后者还被称为耐甲氧西林表皮葡萄球菌。其中，MRSA位居医院感染病原菌之首，MRSA感染与乙型病毒性肝炎、获得性免疫缺陷综合征被认为是目前世界上最难解决的三大感染性难题。

细菌的耐药性是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。长久以来，细菌的耐药性并未引起足够的重视，医生们相信现有药物对付耐药菌已经是绰绰有余。比如对天然青霉素耐药的金黄色葡萄球菌，可以应用氨苄青霉素；当氨苄青霉素无效时，还可以换用头孢菌素；甚至于对头孢菌素耐药的MRSA，人们还有最后一道防线——万古霉素。但是在1992年，美国首次发现了对万古霉素产生耐药性的MRSA，这几乎将医生逼到无药可用的尴尬境地。在我国，滥用抗生素的情况十分普遍。据调查，我国约有75％的门诊感冒患者应用抗生素，而外科手术的围手术期应用抗生素的情况则高达95％。在住院患者中，抗生素应用率为79％，这一数字远远高于英国的22％和各国的平均水平30％。同时，由于医生滥开氨苄西林等广谱抗菌类药物，导致人体内菌群失调并诱发二次感染的情况更是屡见不鲜。我国在职医生中不少人至今仍用天然青霉素对付耐药性早已达98％的金葡菌。另外，有的医院不做药敏试验就使用抗生素的情况也十分严重。药敏实验是确定细菌对何种抗生素敏感的重要步骤，不经过这一步就用药，如同打一场无准备之仗，其效果可想而知。

传统的辨别病原菌是否耐药的方法是制片扩散法，该方法需要对临床样本进行培养，检测耗时长。如能在用药之前准确无误的测得所感染菌株的耐药情况，则将对临床用药起到非常好的指导作用。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物。

本发明的另一个目的是提供上述引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，该引物组合物包括用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物以及内参引物，其中用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2；内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：7，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：8。

本发明还提供了该引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。

优选地，上述引物组合物还包括用于检测金黄色葡萄球菌的引物和/或用于检测表皮葡萄球菌的引物，其中用于检测金黄色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ IDNO：4；用于检测表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO：5，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：6。

本发明还提供了该引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途，其中葡萄球菌为金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组合物。该试剂盒还可以包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。

又一方面，本发明提供了一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法，该方法包括以下步骤：1)提取样本DNA；2)使用上述引物组合物或试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；3)检测步骤2)得到的扩增产物。其中，步骤1)中的样本优选为人的血液、体液或组织；步骤3)中的检测方法优选为微流体芯片检测法。

在本发明的一个优选实施方案中，通过检测两种葡萄球菌特异性基因和耐药菌特异性基因，来鉴别患者所感染的菌种类别，具体包括以下步骤：

1)提取人临床样本的DNA；

2)将四种基因，即人的DNA保守序列，金黄色葡萄球特有基因femA，表皮葡萄球菌特有基因SE，耐甲氧西林葡萄球菌特有基因mecA的特异性引物混和，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增，被扩增的目标基因片段大小不同。

3)扩增产物通过微流体芯片进行检测；

4)通过各检测峰的位置确定检测到的片段的大小，从而判断检测到的基因，鉴别临床样本感染的菌种类别。

5)结果判断：a)未出现任何特异性峰，说明临床样本的DNA没有提取出来，检测无效；b)只出现DNA内参特异性峰，说明没有葡萄球菌感染；c)出现DNA内参和femA特异性峰，说明有甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染；d)出现DNA内参和SE特异性峰，说明有甲氧西林敏感表皮葡萄球菌感染；e)出现DNA内参、femA和mecA特异性峰，说明有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染；f)出现DNA内参、SE和femA特异性峰，说明有甲氧西林敏感表皮葡萄球菌和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌感染；g)出现DNA内参、SE和mecA特异性峰，说明有耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染；h)出现DNA内参、SE、mecA和femA特异性峰，说明有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌混合感染。

本发明提供了一种可快速便捷检测金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林表皮葡萄球菌的方法，该方法简单，成本较低，适宜推广应用。具体地，本发明具有以下有益效果：

首先，本发明提供了一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，其中包括人DNA保守序列和耐甲氧西林葡萄球菌基因mecA，以及任选的金黄色葡萄球特有基因femA、表皮葡萄球菌特有基因SE的特异性引物。实验表明，通过PCR反应，这些引物较之其它根据其各自的保守序列设计的引物能够更快速、有效地识别出相应的病毒。上述人DNA保守序列作为内参，选用的是人β球蛋白(β-globin)基因。由于人体细胞中都含有此基因，引入该基因可以确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。

其次，本发明提供了用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒，其中包括人DNA保守序列和耐甲氧西林葡萄球菌基因mecA，以及任选的金黄色葡萄球特有基因femA、表皮葡萄球菌特有基因SE的特异性引物。该试剂盒不仅能高效、特异性的扩增出目的DNA，还能确定模板的提取质量，避免扩增结果的假阴性。

本发明提供了一种可快速、便捷检测葡萄球菌种类和/或葡萄球菌耐药性的方法，可以在基因水平上进行迅速的判断，具有较高的灵敏度和特异性。该方法可直接对患者的临床样本(例如血液、体液等)进行检测，不需要对样本进行培养后再对菌株进行检测，节约了时间。同时，微流体芯片检测法比传统的DNA电泳检测法简单、快捷、直观。为临床用药提供了准确、及时的指导。因此，本发明所提供的方法技术成熟，检测结果稳定，比传统的滤纸片法、凝胶法等更快捷、灵敏、准确。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为临床样本出现的各种感染耐药菌情况的电泳结果图；

图2A～图2G为临床样本出现的各种感染耐药菌情况的微流体芯片结果图；

图3A～图3D为感染的不同耐药菌的基因扩增片段的测序比对结果；

图4A～图4D为本发明所提供的引物组合物灵敏度的微流体芯片检测结果图；

图5A～图5B为本发明所提供的合引物组合物特异性的微流体芯片检测结果图；

图6A～图6C为本发明所提供的引物组合物重复性的微流体芯片检测结果图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1：临床样本的制备

本实施例制备本发明检测方法所使用的人体血液样本，详述如下。

1、提取试剂：

A液：细胞裂解液，15ml/瓶，每次用200μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

SDS 2％(g/ml)

B液：核酸结合液，25ml/瓶，每次用400μl。

成份终浓度

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

EDTA(pH8.0) 0.02mol/l

TrtionX-100 2.5％(g/ml)

C液：核酸漂洗液，20ml/瓶，每次用300μl。

成份含量

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

D液：核酸洗脱液，5ml/瓶，每次用50μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

E液：20mg/ml蛋白酶K，1.2ml/管，每次使用20μl。

2、提取方法：

1)取样：将加入EDTA抗凝剂的血液样本解冻，混合均匀后取100μl置于1.5ml的EP管内。

2)裂解：加入A液200μl和蛋白酶K 20μl，混匀后于56℃放置10分钟(每隔2分钟混匀一次，确保裂解充分)。

3)吸附：先在吸附柱中加入B液400μl，然后将裂解液缓慢倾倒入吸附柱中。振荡混匀后放置2分钟，然后12000转/分钟离心2分钟。漂洗：去废液，在吸附柱中加入C液300μl，12000转/分钟离心2分钟，去废液；再加入70％(V/V)的乙醇700μl，12000转/分钟离心2分钟去废液；最后再12000转/分钟离心2分钟，彻底去废液。

4)洗脱：换一个干净的1.5ml EP管，套住吸附柱，在吸附柱中央加入D液50μL，于56℃放置10分钟，12000转/分钟离心2分钟。流出液即为提取的DNA样品，可直接用于PCR反应。

实施例2：菌株的培养和核酸提取

本实施例为培养各种葡萄球菌，并提取相应的核酸，作为试剂盒的质控品(阳性对照)以检验试剂盒的提取性能。

1)菌株名称及编号

菌株名称 ATCC编号

金黄色葡萄球菌 ATCC25923

甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 ATCC29213

甲氧西林敏感表皮葡萄球菌 ATCC14990

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ATCC43300

耐甲氧西林表皮葡萄球菌 ATCC51625

2)LB培养基1000ml，包括以下成分及含量：

蒸馏水 950ml

NaCl 10g

胰蛋白胨 10g

酵母膏 5g

配制液体培养基不需要加入琼脂粉；配制固体平板培养基需加入琼脂粉15g；配制半固体穿刺保藏培养基需加入琼脂粉7.5g。

将上述成分加热，充分搅拌溶解后，用5M的NaOH(约0.2ml)调pH值至7.0，然后用蒸馏水定容至1000ml。混匀后分装在三角瓶中(装量不能超过容积的1/3)，于1.05kg/cm²下灭菌20分钟。耐药菌培养基要加入氨苄西林以防污染，氨苄西林的终浓度为60mg/L，但对氨苄西林敏感的菌种培养基中不能加入。

3)提取液成分：

A液：细胞裂解液，15ml/瓶，每次用200μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

SDS 2％(g/ml)

B液：核酸结合液，25ml/瓶，每次用400μl。

成份终浓度

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

EDTA(pH8.0) 0.02mol/l

TrtionX-100 2.5％(g/ml)

C液：核酸漂洗液，20ml/瓶，每次用300l。

成份含量

GuSCN 5mol/l

Tris-HCl(pH6.4) 0.05mol/l

D液：核酸洗脱液，5ml/瓶，每次用50μl。

成份终浓度

Tris-HCl(pH8.0) 0.01mol/l

NaCl 0.1mol/l

EDTA(pH8.0) 0.01mol/l

E液：20mg/ml RNaseA，600μl/管，每次使用10μl。

4)提取菌体总DNA的方法

a)培养：取20％甘油保藏的菌种100μl于30ml LB培养基中，200r/分钟，37℃培养过夜。

b)取样：取浑浊的菌液1ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心2分钟，去上清。

c)裂解：在沉淀中加入A液200μl和RNase A 10μl混匀后室温放置2分钟后，再于沸水上煮10分钟。

d)吸附：先在吸附柱中加入B液400μl，然后将裂解液缓慢倾倒入吸附柱中(若有杂质，勿将杂质倒入)。振荡混匀后放置2分钟，然后12000转/分钟离心2分钟。

e)漂洗：去废液，在吸附柱中加入C液300μl，12000转/分钟离心2分钟，去废液；再加入70％(v/v)的乙醇700μl，12000转/分钟离心2分钟去废液；最后再12000转/分钟离心2分钟，彻底去废液。

f)洗脱：换一个干净的1.5ml EP管，套住吸附柱，在吸附柱中央加入D液50μL，于56℃放置10分钟，12000转/分钟离心2分钟。流出液即为提取的DNA样品，可直接用于PCR反应。

实施例3：用引物组合物扩增DNA

本实施例采用本发明所提供的引物组合物扩增实施例1所提取的DNA样品，并采用凝胶电泳检测PCR产物的正确性。

1)引物组合物的PCR扩增

a)在200μL Eppendorf管内配制25μl反应体系：

成份体积/μl

ddH₂O 10.3

2×buffer^* 12.5

混合引物 1.2

提取的临床样本DNA 1

注：2×buffer中含有Tris-HCl(pH 8.4)40mM，MgCl₂ 20mM，KCl 50mM，(NH)₂SO₄ 10Mm，每个dNTP 0.2mM，Taq DNA多聚酶0.08U/μL。

各引物的具体序列如表1所示。

表1 用于PCR扩增的各引物序列

基因名称	选取长度	基因信息	引物信息方向5′→3′
				mecA	393bp	BX571856.1	AGAGTAGCACTCGAATTAGGCAG(200-223)(SEQ ID NO：1)AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC(603-685)(SEQ ID NO：2)
femA	686bp	DQ352465.	CTTACTTACTGCTGTACCTG(217-237)(SEQ ID NO：3)ATCTCGCTTGTTATGCGC(902-884)(SEQ ID NO：4)
				SE	125bp	NC_004461.1	ATCAAAAAGTTGGCGAACCTTTTC(2893-3004)(SEQ ID NO：5)CAAAAGAGCGTGGAGAAAAGTATC(3017-2995)(SEQ ID NO：6)

DNA内参

238bp

NC_000007.13

GGGTGTAGGTACTAACACTGGCTCG(SEQ ID NO：7)AGGTCTCAAACATGATCTGTAAGGC(SEQ ID NO：8)

其中，各引物的摩尔比例为mecA∶femA∶SE∶DNA内参＝4∶1∶1∶5。

b)PCR条件：

第一阶段：94℃，5分钟；

第二阶段：94℃，30s；60℃，30秒；72℃，1分钟；32个循环；

第三阶段：72℃，10分钟。

2)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的正确性。

a)制胶(2％琼脂糖凝胶)

称取琼脂糖0.8g于三角瓶中，加入50ml电泳缓冲液TAE(购自上海生物工程技术服务有限公司，规格为50×TAE，稀释50倍使用)，混匀后于微波炉上高火煮2分钟(TAE挥发约10ml)。取出后冷却到60℃以下，加入0.3μl Goldview(购自上海赛百盛基因技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后倒入两端封闭的胶板中，插入电泳齿梳。待彻底冷却后，去掉两端的封闭，拔掉齿梳，将胶板放入电泳槽中，倒入适量的TAE溶液，以刚好浸没胶板为宜。

b)点样

取以上得到的PCR产物5μl，加入1μl 6×上样缓冲液(含溴酚蓝染料，购自北京全式金生物技术有限公司，规格1ml/支)，混匀后点入胶孔中。同时，点DNA marker(购自于北京全式金生物技术有限公司，规格100bp，50次)2μl作为参照。

c)电泳

电泳条件：100V，100mA，25分钟。

d)拍照

电泳结束后，将胶板中的胶块取出，放在紫外仪下用透射光照射，同时用照相机拍照。对照标准品，看是否有相应的病毒条带，其中图1中的标记1为未感染葡萄球菌的样品的电泳结果图，标记2为感染甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的样品的电泳结果图，标记3为感染甲氧西林敏感表皮葡萄球菌的样品的电泳结果图，标记4为感染耐甲氧西林(耐药)金黄色葡萄球菌的样品的电泳结果图，标记5为感染甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感表皮葡萄球菌的样品的电泳结果图，标记6为感染耐甲氧西林(耐药)表皮葡萄球菌的样品的电泳结果图，标记7为感染耐甲氧西林(耐药)金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林(耐药)表皮葡萄球菌的样品的电泳结果图。

实施例4：微流体芯片检测样本方法

本实施例为采用微流体芯片检测实施例3中所扩增出的DNA样品。微流体芯片检测样本具体包括以下操作步骤：

1)接通MS-CE-1型仪器(购自宁波美生医疗器械材有限公司)电源，仪器预热30分钟。

2)连接检测池与主机箱正面输出接口，在缓冲溶液瓶中加入新配制好的缓冲溶液(2％HPMC-50，80mM MES，40mM Tris)，将电极和毛细管的两端浸在缓冲溶液中，保持毛细管两端出口在同一水平面上，且毛细管内必须充满缓冲溶液，关好仪器正门，确认仪器各部分连接正确后，按动高压启动按钮，如果发生异常应立即按动高压关断钮，检查并排除故障后，再重新加压。

3)进样：用样品瓶更换样品支架上的缓冲溶液瓶，插入电极及毛细管，关好正门后施加380伏的电压，待达到30秒后断开高压，换上缓冲溶液瓶后即可开始实验。

4)流体压差进样：将样品瓶放在高度差进样部件上，根据需要调整进样高度，然后把毛细管的进样端插入样品池中，待达到预定时间后取出放入有缓冲溶液的进样支架中即可开始实验。

5)根据实验需要设定仪器工作参数，将进样电压设定为380伏，电泳电压设定为700伏。

6)等待仪器各部分工作正常后，将微流体芯片置于支架上，调节芯片位置，使检测光速通过距芯片进样点1cm处。运行进样及电泳程序，当DNA条带通过检测点时，其信息由数据采集系统记录下来，并转化为电信号，即开始样品的分析工作。

7)实验结束后关闭电源，用蒸馏水冲洗毛细管30分钟，或将缓冲溶液保持在毛细管中即将毛细管置于压力清洗装置中。

按照上述方法检测实施例3中所扩增出的DNA样品，图2A为未感染葡萄球菌的样品的微流体芯片检测结果图，图2B为感染甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的样品的微流体芯片检测结果图，图2C为感染甲氧西林敏感表皮葡萄球菌的样品的微流体芯片检测结果图，图2D为感染耐甲氧西林(耐药)金黄色葡萄球菌的样品的微流体芯片检测结果图，图2E为感染耐甲氧西林(耐药)表皮葡萄球菌的样品的微流体芯片检测结果图，图2F为感染甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感表皮葡萄球菌的样品的微流体芯片检测结果图，图2G为感染耐甲氧西林(耐药)金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林(耐药)表皮葡萄球菌的样品的微流体芯片检测结果图。

对图中所示的含有femA、SE、mecA及内参基因的样品委托Invitrogen上海分公司进行测序比对。黄色葡萄球菌femA基因扩增片段的测序比对结果显示相符率为97％，如图3A所示。表皮葡萄球菌SE基因扩增片段的测序比对结果如图3B所示，相符率为100％。耐药葡萄球菌mecA基因扩增片段的测序比对结果如图3C所示，相符率为100％。内参基因扩增片段的测序比对结果显示相符率为99％，如图3D所示。

实施例5：本发明混合引物的灵敏度、特异性和重复性

本实施例对本发明所提供混合引物的灵敏度、特异性和重复性进行了检测。

1、引物组合物的灵敏度

参照实施例4中的方法对含有不同SE、mecA、femA和B238拷贝数的质粒(质粒构建：委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，连接至PGH载体)进行稀释并扩增验证混合组合物的灵敏度，所得到的微流体芯片检测结果见图4A～图4D。

由图可知，本发明提供的混合引物能够检测出SE、mecA、femA的最低拷贝数为1×10⁵。

2、引物组合物的特异性

参照实施例4中的方法对含有SE、mecA、femA和B238的质粒的样品以及空白样品进行稀释并扩增验证引物组合物的特异性，具体结果如图5A和图5B所示，其中图5A为阳性结果，图5B为阴性结果。

由图可知，本发明提供的引物组合物能够特异性扩增出目标产物。

3、引物组合物的重复性

参照实施例4中的方法对含有SE、mecA、femA和B238的质粒进行稀释并扩增不同批次以验证引物组合物的重复性，具体结果如图6A、图6B和图6C所示。

由图可知，本发明提供的引物组合物对不同的扩增均具有较好的重复性。

序列表

<110>宁波基内生物技术有限公司

<120>用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及方法

<130>DIC09110173

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agagtagcac tcgaattagg cag 23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

agttctgcag taccggattt gc 22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cttacttact gctgtacctg 20

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atctcgcttg ttatgcgc 18

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atcaaaaagt tggcgaacct tttc 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

caaaagagcg tggagaaaag tatc 24

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gggtgtaggt actaacactg gctcg 25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

aggtctcaaa catgatctgt aaggc 25

Claims

1.一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物组合物，该引物组合物包括用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物以及内参引物，其中用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2；内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO：7，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：8。

2.根据权利要求1所述的引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途。

3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物还包括用于检测金黄色葡萄球菌的引物和/或用于检测表皮葡萄球菌的引物，其中用于检测金黄色葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ IDNO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4；用于检测表皮葡萄球菌的引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：5，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：6。

4.根据权利要求3所述的引物组合物在制备用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的工具中的用途，其中葡萄球菌为金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。

5.一种用于检测耐甲氧西林葡萄球菌的试剂盒，该试剂盒包括根据权利要求1或3所述的引物组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。

7.一种检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法，该方法包括以下步骤：

1)提取样本DNA；

2)使用根据权利要求1或3所述的引物组合物，或根据权利要求5或6所述的试剂盒对步骤1)得到的DNA进行PCR扩增；

3)检测步骤2)所得到的扩增产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的样本为人的血液、体液或组织。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的检测方法为微流体芯片检测法。