CN108424972A - 用于检测和鉴定MREJ型xxi的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的序列 - Google Patents

用于检测和鉴定MREJ型xxi的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的序列 Download PDF

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Abstract

本发明的发明名称是用于检测和鉴定MREJ型xxi的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的序列。本文提供用于检测和鉴定包含多态性SCCmec右侧末端(MREP)型xxi序列的金黄色葡萄球菌菌株的组合物和方法。

Description

用于检测和鉴定MREJ型xxi的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的序列
本申请是分案申请，原申请的申请日为2013年3月14日、申请号为201380029724.2(PCT/IB2013/000900)、发明名称为“用于检测和鉴定MREJ型xxi的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的序列”。
对序列表、表或计算机程序列表的引用
本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表作为名称为GENOM.114A.txt的文件提供，2013年3月14日最后保存，大小为85.6kb。信息以其全部通过引用被并入本文。
发明背景
领域
本文公开的实施方式涉及用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)检测的分子诊断工具。
相关技术
凝固酶阳性的物种金黄色葡萄球菌(S.aureus)被充分纪录为人机会致病菌(Murray et al.Eds,1999,Manual of Clinical Microbiology,第七版,ASM Press,Washington,D.C.)。金黄色葡萄球菌引起的医院交叉感染是发病率和死亡率的主要原因。金黄色葡萄球菌引起的最常见的感染中的一些涉及皮肤，并且它们包括疖或痂、蜂窝织炎、脓疱病和在多种部位的手术后伤口感染。金黄色葡萄球菌引起的更严重的感染中的一些是菌血症、肺炎、骨髓炎、急性心内膜炎、心肌炎、心包炎、脑炎、脑膜炎、烫伤样皮肤综合征和多种脓肿。葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是与金黄色葡萄球菌有关的另一种重要的综合征。中毒性休克综合征，一种社区获得性疾病(community-acquired disease)，也已归于产毒的金黄色葡萄球菌的感染或定居。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为医院中主要的临床和流行病学问题出现于20世纪80年代(Oliveira et al.,(2002)Lancet Infect Dis.2:180-9)。MRSA抵抗所有的β-内酰胺，包括青霉素、头孢菌素、碳青霉烯和单酰胺菌素，它们是治愈金黄色葡萄球菌感染最常使用的抗生素。
MRSA感染仅可用毒性的和更昂贵的抗生素治疗，其通常用作最后的防御线。由于MRSA可通过人员在患者之间容易地播散，世界上的医院都面对控制MRSA的问题。
不久前，知道菌株抗性的唯一方法是进行手动抗菌敏感性试验。抗菌敏感性试验具有许多缺点，包括获得结果之前延长的时间(至少48小时)、缺少再现性、缺少过程标准化和使用者的错误。因此，需要发展快速和简单的MRSA检测和/或鉴定的筛选或诊断试验以减少其传播和提高感染患者的诊断和治疗。
对快速和灵敏检测MRSA的组合物和方法存在需求。
概述
本文公开的实施方式部分基于这样的发现：金黄色葡萄球菌的某些菌株，包括包含mecA同系物基因，mecALGA251的那些菌株，共有位于MRSA核酸SCCmec区右侧末端(rightextremity)的相同序列，即，多态性右侧末端连接。本文提供可用于检测这些MRSA菌株的方法和组合物，其是迄今通过常规的商品化基于分子的测定不可检测的。本文还提供组合物和方法，其通常允许除MRSA菌株外的金黄色葡萄球菌的进一步(例如，同时或连续)检测，和/或mecA和/或mecALGA251的进一步检测。
因此，本文提供用于检测包含MREJ型xxi序列的MRSA的方法和组合物。一些实施方式提供用于检测具有MREJ型xxi核酸的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的组合物。MRSA可包括包含mecA同系物(mecALGA251或mecC)的葡萄球菌(Staphylococcal)盒染色体mec(SCCmec)元件，其中SCCmec盒被插入金黄色葡萄球菌染色体DNA，从而产生多态性右侧末端连接(MREJ)型xxi序列，其包括来自右侧末端的多态性序列和靠近多态性右侧末端的染色体DNA。组合物可包括第一扩增引物，其长度在10和45个核苷酸之间，并且在标准PCR条件下与MREJ型xxi核酸的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，第一扩增引物在所述标准PCR条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补物特异地杂交。
本文公开的组合物可进一步包括长度在10和45个核苷酸之间的第二扩增引物，其在标准PCR条件下与位于距SCCmec元件进入染色体DNA的插入点1千碱基内的金黄色葡萄球菌染色体序列特异地杂交。优选，第一和第二扩增引物在标准PCR条件下在存在包括MREJ型xxi核酸的MRSA的情况下一起产生MREJ型xxi核酸右侧末端连接的扩增子。因此，在一些实施方式中，第二扩增引物在标准PCR条件下与orfX特异地杂交。本文公开的组合物可进一步包括探针，例如，包括荧光发射体部分和荧光猝灭剂部分的寡核苷酸探针，其在标准PCR条件下与MREJ型xxi核酸的扩增子特异地杂交。
本文公开的组合物可包括一种或多种长度在10和45个核苷酸之间的另外的扩增引物，其与一种或多种来自MREJ型i至xx MRSA的多态性SCCmec右侧末端序列，即，与一种或多种选自SEQ ID NOs:5至29的多态性SCCmec右侧末端序列特异地杂交。
方法和组合物还可包括另外的寡核苷酸，即，其被配置以特异地扩增mecA和/或mecALGA251/mecC序列，和/或其被配置以特异地扩增金黄色葡萄球菌特异性序列。
因此，一些实施方式提供组合物，其中第一扩增引物与SEQ ID NO:2至少80％相同。在一些实施方式中，组合物可包括第二扩增引物，其与SEQ ID NO:3至少80％相同。在一些实施方式中，组合物可包括探针，其中探针与SEQ ID NO:4或82至少80％相同。
在一些实施方式中，本文公开的组合物以干燥形式，例如，冻干的或类似形式提供。
本文还提供用于检测包括MREJ型xxi核酸的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和用于检测MREJ型xxi核酸的方法，其中金黄色葡萄球菌包括包含mecA同系物(mecALGA251或mecC)的葡萄球菌盒染色体mec(SCCmec)元件。SCCmec盒可插入金黄色葡萄球菌染色体DNA，从而产生多态性右侧末端连接(MREJ)型xxi序列，其包括来自右侧末端(MREP序列)的多态性序列和靠近多态性右侧末端的染色体DNA。因此，在一些实施方式中，方法可包括以下步骤：提供测试样品；将样品与长度在10和45个核苷酸之间的第一扩增引物接触，所述第一扩增引物在标准PCR条件下与MREJ型xxi序列的多态性右侧末端序列特异地杂交；其中接触在这样的条件下进行，其中如果包括MREJ型xxi核酸的金黄色葡萄球菌存在于样品中，那么MREJ型xxi核酸的mec右侧末端连接的扩增子产生。方法还可包括测定接触步骤之后MREJ型xxi核酸扩增子是否产生的步骤。在一些实施方式中，第一扩增引物在所述标准PCR条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列特异地杂交。
在一些实施方式中，方法可包括将样品与长度在10和45个核苷酸之间的第二扩增引物接触，所述第二扩增引物在标准PCR条件下与金黄色葡萄球菌的orfX基因杂交，其中所述第一和第二扩增引物在标准PCR条件下在存在MREJ型xxi核酸的情况下一起产生MRSA的SCCmec右侧末端连接的SCCmec右侧末端连接(MREJ)区序列的扩增子。
权利要求15的方法，进一步包括将样品与探针接触，其中所述探针在标准PCR条件下与MREJ型xxi核酸的SCCmec右侧末端连接(MREJ)区序列的扩增子特异地杂交。在一些实施方式中，探针包括荧光发射体部分和荧光猝灭剂部分。
在一些实施方式中，接触步骤还包括将样品与一种或多种另外的扩增引物接触，其中所述一种或多种另外的扩增引物长度在10和45个核苷酸之间，与来自MREJ型i至xxMRSA的一个或多态性SCCmec右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，接触步骤还包括将样品与一种或多种长度在10和45个核苷酸之间的另外的扩增引物接触，所述扩增引物特异地杂交和被配置以产生mecA序列、mecC序列和/或金黄色葡萄球菌特异性序列的扩增子。金黄色葡萄球菌特异性序列的非限制的实例包括但不限于，nuc序列、rRNA序列、femB序列、Sa442序列等。然而技术人员将容易理解，对金黄色葡萄球菌独特的任何序列均可用于本文描述的实施方式。
因此，本文描述的方法的接触步骤可包括进行核酸扩增反应，如PCR、链置换扩增(SDA)、例如多置换扩增(MDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、连接酶链反应(LCR)、免疫扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)或滚环扩增。在一些优选实施方式中，方法包括进行多重PCR。在一些优选实施方式中，方法包括进行实时PCR。
附图简述
图1显示类型xxi MREJ区的序列。还显示本文描述的实施方式中公开的引物和探针。
详细描述
应当理解，上述一般的描述和下面详细的描述都只是示例和说明的，并且不意欲限制当前教导的范围。在该申请中，单数的使用包括复数，除非另外特别说明。同样，“包括(comprise)”、“含有(contain)”和“包括(include)”，或那些根词的改变，例如不限于，“包括(comprises)”、“含有(contained)”和“包括(including)”也不意欲受限。“或”的使用指“和/或”，除非另外说明。术语“和/或”指之前和之后的术语可一起或分开采用。为了说明目的，但不作为限制，“X和/或Y”可指“X”或“Y”或“X和Y”。
不论何时本文提供值的范围，该范围意欲包括起始值和端值和其间的任何值或值范围，除非另外特别说明。例如，“0.2至0.5”指0.2、0.3、0.4、0.5；其间的范围如0.2-0.3、0.3-0.4、0.2-0.4；其间的增量如0.25、0.35、0.225、0.335、0.49；其间的增量范围如0.26-0.39；等。
本文所用的部分标题仅用于组织的目的并且不被解释为以任何方式限制描述的主题。该申请中引用的所有文献和相似材料——包括，但不限于，专利、专利申请、文章、书、论文和互联网网页，不管这样的文献和相似材料的格式，都以其全部通过引用被清楚地并入，用于任何目的。在并入的文献和相似材料中的一个或多个以与该申请中术语的定义矛盾的方式限定或使用术语的情况下，以该申请为准。虽然目前的教导与多种实施方式连起来描述，但是不期望目前的教导受限于这样的实施方式。相反，目前的教导包括多种备选、改变和等同物，如本领域技术人员所将理解的。
本文提供用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)提高的检测的组合物和方法，特别地，检测包含mecA同系物基因的金黄色葡萄球菌，如CC130或cc130金黄色葡萄球菌菌株的方法。金黄色葡萄球菌中的甲氧西林抗性是由于编码青霉素结合蛋白2a(PBP-2a)、耐β-内酰胺的转肽酶的mecA基因的基因产物。mecA不存在于甲氧西林-敏感的金黄色葡萄球菌，但是广泛分布于葡萄球菌的其它种类，包括凝固酶阴性的葡萄球菌、(CoNS)，如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、缓慢葡萄球菌(S.lentus)、溶血性葡萄球菌(S.hominus)、孔氏葡萄球菌(S.cohnii)、海豚葡萄球菌(S.delphini)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、蝇葡萄球菌(S.muscae)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、凝结葡萄球菌(S.coagulans)和其它的。mecA基因高度保守(Ubukata etal.,1990,Antimicrob.AgentsChemother.34:170-172)。在耐甲氧西林葡萄球菌中，mecA存在于称作葡萄球菌盒染色体mec(SCCmec)的遗传元件，其插入葡萄球菌的染色体。
SCCmec盒长度范围为20kb至超过60kb，并包括除mecA基因外的位点特异性重组酶基因和转座因子。SCCmec盒在金黄色葡萄球菌染色体DNA内称作“attBscc”的固定位置插入，其位于称作“orfX”的开放阅读框架的3’末端。Huletsky et al.(2004)J.Clin.Microbiol.42(5):1875-1884。MRSA菌株已基于SCCmec盒的组构被分类(称作“SCCmec分类)。不同的SCCmecs已根据它们的重组酶基因，和mecI和mecR基因的遗传组构——其是mecA的调节子——分类。
用于检测和鉴定MRSA的许多分子测定包括mecA基因的检测。然而，由于mecA还在CoNS中发现，所以单独mecA的检测不足以确定MRSA的存在，因为耐甲氧西林CoNS也将检测阳性。为了解决该问题，已发展了这样的测定，其中除mecA外，还检测金黄色葡萄球菌特异性基因。参见，Schuenck et al.,Res.Microbiol.,(2006),in press,Shittu et al.,(2006),Diagn Microbiol Infect Dis.Jul 17、Grisold et al.,(2006),MethodsMol.Biol.345:79-89、Costa et al.,(2005),Diag.Microbiol.and Infect.Dis,51:13-17、Mc Donald et al.,(2005),J.Clin.Microbiol.,43:6147-6149、Zhang et al.,(2005),J.Clin.Microbiol.43:5026-5033、Hagen et al.(2005),Int J MedMicrobiol.295:77-86、Maes,et al.(2002)J.Clin.Microbiol.40:1514-1517、Saito etal.,(1995)J.Clin.Microbiol.33:2498-2500；Ubukata et al.,(1992)J.Clin.Microbiol.30:1728-1733；Murakami et al.,(1991)J.Clin.Microbiol.29:2240-2244；Hiramatsu et al.,(1992)Microbiol.Immunol.36:445-453)。此外，Levi和Towner(2003),J.Clin.Microbiol.,41:3890-3892和Poulsen et al.(2003),J AntimicrobChemother.,51:419-421描述利用EVIGENETM MRSA检测试剂盒，检测凝固酶阴性葡萄球菌中和金黄色葡萄球菌中甲氧西林抗性。
然而，因为mecA基因广泛分布在金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中，上面描述的每个方法不能在含有甲氧西林-敏感的金黄色葡萄球菌(“MSSA”)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的样品，和只含有MRSA的样品或具有甲氧西林-敏感性金黄色葡萄球菌和MRSA的样品之间区分。
为了解决该问题，Hiramatsu等发展了对MRSA特异的基于PCR的测定，其利用与SCCmec型I-III的DNA的右侧末端杂交的引物结合对金黄色葡萄球菌染色体特异的引物，其对应SCCmec整合位点右侧上的核苷酸序列。(美国专利6,156,507，在下文中“507专利”)。最近，Zhang et al.,(2005),J.Clin.Microbiol.43:5026-5033描述了将SCCmec型I至V MRSA分成亚型的多重测定。其它葡萄球菌种类(例如，表皮葡萄球菌和溶血性葡萄球菌)中包围SCCmec整合位点的核苷酸序列不同于金黄色葡萄球菌中发现的那些，因此利用与SCCmec的右侧末端和金黄色葡萄球菌染色体杂交的寡核苷酸的多重PCR测定具有对MRSA检测特异的优势。
‘507专利中描述的PCR测定还引起SCCmec DNA的“MREP分型”(mec右侧末端多态性)的发展(Ito et al.,(2001)Antimicrob.Agents Chemother.45:1323-1336；Hiramatsuet al.,(1996)J.Infect.Chemother.2:117-129)。MREP分型方法利用这样的事实：三种MREP类型的核苷酸序列在邻近三种类型SCCmec中整合位点的SCCmec DNA右侧末端不同。
术语“MREJ”指mec右侧末端连接<<mec右侧末端连接>>。MREJ区核酸序列长度为大约1千碱基(kb)，包括SCCmec右侧末端以及细菌染色体DNA至SCCmec整合位点右侧的序列。被分类为MREP型i-iii的菌株对应MREJ型i-iii。MREJ型iv至xx先前已被Huletsky et al.,(2004),J.Clin.Microbiol.42:1875-1884；国际专利申请PCT/CA02/00824，美国专利申请2008/0227087表征。
最近，Garcia-Alvarez等报道了通过核糖体RNA分析被证实是金黄色葡萄球菌的细菌菌株，并且利用常规的抗生素敏感性试验，其显示甲氧西林抗性。Garcia-Alvarez etal.(2011)Lancet 11:595-603。然而，令人惊讶奇地，利用上面描述的测定——其依赖mecA的检测或已知MREJ区的检测，这些菌株测试为MRSA阴性。测定特异性受限于识别MREJ区。Garcia-Alvarez等证明菌株包含新的mecA同系物，其与已知mecA基因共有有限的同源性，即，在氨基酸水平63％的同一性和在DNA水平70％的同一性，说明依赖mecA基因检测的测定不能检测这些MRSA。mecA同系物称作mecALGA251，本文也称作mecC。因为利用MREJ扩增的测定也不能检测mecALGA251MRSA菌株中的任何一种，所以mecALGA251MRSA菌株将被不正确地鉴定为假阴性。诊断和鉴定MRSA中的该错误可对患者健康结果具有严重影响。
进一步分析金黄色葡萄球菌的这样几个菌株：利用标准的抗生素敏感性试验测试为耐甲氧西林阳性，然而利用常规的商品化分子测定检测为MRSA。菌株列在下面的表1中。
表1
如本文所描述的，本公开部分地基于令人惊讶的发现：大多数分析的包含mecA同系物基因，mecALGA251/mecC的MRSA菌株共有相同的MREJ序列。基于该令人惊讶的发现，本文提供用于提高的检测MRSA的组合物和方法。本文公开的组合物和方法有利地允许mecALGA251MRSA菌株的可靠和快速的检测和鉴定。
寡核苷酸
根据本文公开的一些实施方式，提供寡核苷酸，例如扩增引物和/或序列特异性探针。如本文所用，术语“引物”和“探针”包括，但不限于寡核苷酸。优选，本文公开的寡核苷酸引物和/或探针长度可以在8和45个核苷酸之间。例如，引物和或探针长度可以为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多个核苷酸。引物和/或探针可以以任何合适的形式提供，例如，包括与固体载体结合、液体的和冻干的。本文公开的引物和探针序列可被修饰以在5’或3’末端或两个末端含有另外的核苷酸。然而，技术人员将理解，扩增引物(不必是探针)3’末端的另外碱基通常与模板序列互补。本文公开的引物和探针序列还可被修饰以去除在5’或3’末端的核苷酸。技术人员将理解，为了起到扩增的作用，引物或探针将具有如本文公开的最小的长度和退火温度。
寡核苷酸引物和探针可在退火温度结合它们的靶，退火温度是小于解链温度(Tm)的温度。如本文所用，“Tm”和“解链温度”是可互换的术语，其指50％的双链多核苷酸分子群体变得分离成单链的温度。计算多核苷酸的Tm的公式在本领域众所周知。例如，Tm可通过以下方程计算：Tm＝69.3+0.41×.(G+C)％-6-50/L，其中L是探针的核苷酸长度。杂合的多核苷酸的Tm还可利用1M盐中杂交测定采用的并通常用于计算PCR引物的Tm的公式来估计：[(A+T数)×2℃+(G+C数)×4℃]。参见，例如，C.R.Newton et al.PCR,2nd ed.,Springer-Verlag(New York：1997),p.24。其它更复杂的计算存在于本领域，其针对Tm的计算考虑结构以及序列特性。寡核苷酸的解链温度可取决于寡核苷酸引物或探针与结合序列之间的互补性，并取决于盐条件。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸引物或探针具有50mMKCl、10mM Tris-HCl缓冲液中小于约90℃的Tm，例如约89℃、88、87、86、85、84、83、82、81、8079、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39℃或更低，包括列出的值的任何两个之间的范围。
如下面所进一步详细讨论的，在一些实施方式中，本文公开的引物，例如，扩增引物，可作为扩增引物对提供，例如，包括正向引物和反向引物(第一扩增引物和第二扩增引物)。优选，正向和反向引物具有差别不超过10℃的Tm，例如，其差别小于10℃、小于9℃、小于8℃、小于7℃、小于6℃、小于5℃、小于4℃、小于3℃、小于2℃或小于1℃。
引物和探针序列可以通过寡核苷酸序列内具有核苷酸置换(相对于靶序列)来修饰，只要寡核苷酸含有足够的互补性以与靶核酸序列特异地杂交。以该方式，至少1、2、3、4或达约5个核苷酸可被置换。如本文所用，术语“互补的”指两条多核苷酸链的两个区域之间或同一多核苷酸链的两个区域之间的序列互补性。如果多核苷酸的第一区与相同或不同的多核苷酸的第二区互补，当两个区以反向平行方式排列时，第一区的至少一个核苷酸能与第二区的碱基碱基配对。因此，不需要两个互补的多核苷酸在每一个核苷酸位置都碱基配对。“完全互补的”指第一多核苷酸与第二多核苷酸100％或“完全”互补，并因此在每一个核苷酸位置形成碱基对。“部分互补的”还指第一多核苷酸不是100％互补的(例如，90％或80％或70％互补的)并在一个或多个核苷酸位置含有错配的核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸包括通用碱基。
如本文所用，术语“杂交”参考互补的(包括部分互补的)多核苷酸链的配对使用。杂交和杂交强度(即，多核苷酸链之间结合的强度)受本领域众所周知的许多因素影响，包括多核苷酸之间的互补性程度、涉及的条件的严格性——其受这样的条件影响，如盐浓度、形成的杂合体的解链温度、其它组分的存在(例如，聚乙二醇的存在或缺乏)、杂交链的克分子浓度和多核苷酸链的G:C含量。在一些实施方式，例如，提供超过一个寡核苷酸的实施方式中，设计寡核苷酸以便一个寡核苷酸的Tm在另一个寡核苷酸的Tm的2℃以内。核酸杂交的广泛指导在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,第二章(Elsevier,NewYork)；和Ausubel et al,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)中发现。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)。如本文所进一步讨论的，术语“特异性杂交(specific hybridation)”或“特异地杂交(specifically hybridizes)”指在通常用于核酸扩增的条件下，多核苷酸，例如，寡核苷酸引物或探针或类似物与靶序列，如样品中将被定量的序列、阳性对照靶核酸序列或类似物杂交，但不与无关序列杂交。
在一些实施方式中，引物和/或探针包括与在寡核苷酸序列的全部长度中与靶核酸序列杂交的寡核苷酸。这样的序列可称作相对于彼此“完全互补的”。当寡核苷酸被称作相对于本文的核酸序列“基本上互补的”，两个序列可完全互补，或它们可在杂交之后形成错配，但是保持在如下面所讨论的严格条件或标准的核酸扩增条件下杂交的能力。如本文所用，术语“基本上互补的”指两个核酸之间的互补性，例如，寡核苷酸的互补区和靶序列。互补性不需要是完全的；两个核酸之间可存在任何数目的碱基对错配。然而，如果错配数目太大，以至于杂交可能在甚至最不严格的杂交条件下发生，那么序列不是基本上互补的序列。当本文中两个序列被称作“基本上互补的”，它指序列彼此充分互补，在选择的反应条件下杂交。核酸互补性和足以获得特异性的杂交严格性的关系在本领域众所周知，并在下面参考序列同一性、解链温度和杂交条件而进一步描述。因此，基本上互补的序列可用于本文公开的任何检测方法。这样的探针可以，例如，完全互补或可含有1个至许多个错配，只要杂交条件足以允许，例如靶序列和非靶序列之间的区别。因此，基本上互补的序列指与参考序列相比，百分比同一性范围在100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70或更少、或两者之间的任何数的序列。例如，与寡核苷酸杂交的靶序列相比，本文公开的寡核苷酸可含有1、2、3、4、5或更多的错配和/或简并的碱基，条件是寡核苷酸能与靶序列在，例如，标准的核酸扩增条件下特异性杂交。
因此，通过实例，术语“严格的杂交条件”可指以下中的任何一个或二个：a)在约45℃6×SSC，之后是在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃一次或多次清洗，和b)400mM NaCl、40mMPIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16小时，之后清洗。在一些实施方式中，术语“严格条件”可指标准核酸扩增(例如，PCR)条件。
在一些实施方式中，样品与一组扩增引物在标准核酸扩增条件下接触，扩增条件在下面被进一步详细讨论。对于PCR技术的评论，包括如应用到临床微生物学的标准核酸扩增条件如PCR条件，参见DNA Methods in Clinical Microbiology,Singleton P.,Dordrecht出版；Boston:Kluwer Academic,(2000)Molecular Cloning to GeneticEngineering White,B.A.Ed.in Methods in Molecular Biology 67:Humana Press,Totowa(1997)和“PCR Methods and Applications”，1991至1995(Cold Spring HarborLaboratory Press)。“核酸扩增条件”和“PCR条件”的非限制的实例包括本文引用的参考文献中公开的条件，如，例如，50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.1％Triton X-100、2.5mMMgCl2、退火温度72℃；或4mM MgCl2、100mM Tris、pH 8.3、10mM KCl、5mM(NH4)2SO4、0.15mgBSA、4％Trehalose，具有59℃的退火温度，或50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.1％Triton X-100、2.5mM MgCl2，具有55℃的退火温度，或类似条件。
本文描述的引物可利用本领域已知的技术制备，包括，不限于，适当序列的克隆和消化和直接化学合成。可用于制备本文描述的引物的化学合成方法，包括，但不限于，Narang et al.(1979)Methods in Enzymology 68:90描述的磷酸三酯法、Brown et al.(1979)Methods in Enzymology 68:109公开的磷酸二酯法、Beaucage et al.(1981)Tetrahedron Letters 22:1859公开的二乙基氨基磷酸酯和美国专利号4,458,066中描述的固体载体法。本文还考虑应用自动化的寡核苷酸合成仪来制备本文描述的合成的寡核苷酸引物。
因此，一些实施方式涉及组合物，其包括与具有MREJ型xxi序列的MRSA菌株中多态性SCCmec右侧末端序列特异地杂交(例如，在标准核酸扩增条件，例如，标准PCR条件和/或严格杂交条件下)的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。例如，在一些实施方式中，提供组合物，其包括与存在于SEQ ID NO：1的多态性SCCmec右侧末端序列或其互补物，例如，在SEQID NO:1的1至164位置内的核苷酸，或其互补物特异地杂交的寡核苷酸。与MREJ型xxi的多态性SCCmec右侧末端序列——包括SEQ ID NO：1内的多态性右侧末端序列——特异地杂交的示例的寡核苷酸提供在SEQ ID NO:2或其互补物中。因此，本文提供与SEQ ID NO:2或其互补物基本上互补的寡核苷酸，以及相对于SEQ ID NO:2或其互补物，含有1、2、3、4或更多错配或通用核苷酸的寡核苷酸，例如，包括与SEQ ID NO：2或其互补物至少80％相同(例如至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的寡核苷酸。
在一些实施方式中，组合物和方法可包括寡核苷酸，例如，扩增引物或序列特异性探针，其与除MREJ型xxi外MREJ区内的一种或多种多态性右侧末端序列特异地杂交。因此，一些实施方式提供寡核苷酸，例如，扩增引物或序列特异性探针，其与选自如下的一个或多个MREJ区内的多态性右侧末端序列特异地杂交(在标准核酸扩增条件和/或严格杂交条件下)：MREJ型i区、MREJ型ii区、MREJ型iii区、MREJ型iv区、MREJ型v区、MREJ型vi区、MREJ型vii区、MREJ型viii区、MREJ型ix区、MREJ型x区、MREJ型xi区、MREJ型xii区、MREJ型xiii区、MREJ型xiv区、MREJ型xv区、MREJ型xvi区、MREJ型xvii区、MREJ型xviii区、MREJ型xix区、和MREJ型xx区。
在一些实施方式中，组合物和方法可包括寡核苷酸，例如，扩增引物，其与mecA序列或其片段特异地杂交，并能产生mecA序列或其片段的扩增子。因此，一些实施方式包括寡核苷酸，例如，扩增引物，其与SEQ ID NO:156内的序列特异地杂交，并能产生SEQ ID NO:156内的序列的扩增子。一些实施方式包括寡核苷酸，例如，扩增引物，其与mecC序列，例如，SEQ ID NO:157内的序列，或其片段特异地杂交，并能产生mecC序列，例如，SEQ ID NO:157内的序列，或其片段的扩增子。一些实施方式包括寡核苷酸，例如，扩增引物，其与金黄色葡萄球菌特异序列特异地杂交，并能产生金黄色葡萄球菌特异序列的扩增子。例如，一些实施方式提供寡核苷酸，其与nuc序列(例如，来自SEQ ID NO:158的序列)、femB序列(例如，来自SEQ ID NO：159的序列)、Sa442序列(例如，来自Martineau,et al.1998,J.Clin.Microbiol.36(3):618-623)(SEQ ID NO:160)特异地杂交，并能产生nuc序列(例如，来自SEQ ID NO:158的序列)、femB序列(例如，来自SEQ ID NO：159的序列)、Sa442序列(例如，来自Martineau,et al.1998,J.Clin.Microbiol.36(3):618-623)(SEQ ID NO:160)的扩增子。
在一些实施方式中，提供寡核苷酸，其与MREJ型xxi区的多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型i区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型ii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型iii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型iv区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型v区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型vi区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型vii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型viii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型ix区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型x区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xi区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xiii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xiv区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xv区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xvi区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xvii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xviii区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xix区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如扩增引物和序列特异性探针)在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下与MREJ型xx区的多态性右侧末端序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如，扩增引物和/或序列特异性探针)与mecA序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如，扩增引物和/或序列特异性探针)与mecC序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如，扩增引物和/或序列特异性探针)与nuc序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如，扩增引物和/或序列特异性探针)与Sa442序列特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性寡核苷酸(例如，扩增引物和/或序列特异性探针)与femB序列特异地杂交。
与本文公开的实施方式相关的示例性MREJ区序列包括，例如：
MREJ型 SEQ ID NO(或多个)中示例的：
i 5
ii 6
iii 7
iv 8
v 9
vi 10
vii 11
viii 12
ix 13
x 14
xi 15、16和17
xii 18
xiii 19、20、21
xiv 22
xv 23
xvi 24
xvii 25
xviii 26和27
xix 28
xx 29
xxi 1
除了上面讨论的SEQ ID NO:2的寡核苷酸——其与MREJ型xxi区内多态性右侧末端序列特异地杂交，用于本文公开的实施方式的对MREJ区序列内一个或多个多态性序列，或对金黄色葡萄球菌染色体DNA序列特异的寡核苷酸包括，但不限于以下：
除了上述的，熟练的技术人员将理解本文公开的组合物和方法可包括用于除上面本文提到的那些外的多种MRSA菌株中SCCmec序列的右侧末端区的特异性检测的引物和/或探针。通过实例，在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法包括序列，例如，国际专利申请公开号WO 08/080620中描述的引物和/或探针，包括其变体和其互补物。因此，本文公开的组合物和方法可包括下面列出的引物和/或探针：
表2
因此，在示例的实施方式中，提供用于检测包括MREJ xxi和选自MREJ型i-xx的一种或多种MREJ型的MRSA的方法和组合物。例如，一些实施方式利用本文公开的MREJ特异性和金黄色葡萄球菌染色体DNA特异性寡核苷酸提供包括型i、ii、iii和xxi MREJ核酸的MRSA的检测和/或鉴定。一些实施方式利用如本文所描述的MREJ特异性寡核苷酸的组合提供包括型i、ii、iii、iv和xxi MREJ序列的MRSA的检测和/或鉴定。一些实施方式利用本文公开的MREJ特异性寡核苷酸的组合提供包括型i、ii、iii、iv、v、vii和xxi MREJ核酸的MRSA的检测。一些实施方式提供利用本文公开的MREJ特异性寡核苷酸的组合包括型i、ii、iii、iv、v、vii和xxi MREJ核酸的MRSA的鉴定。一些实施方式利用本文公开的MREJ特异性寡核苷酸的组合提供包括型i、ii、iii、iv、v、vii和xxi MREJ核酸的MRSA的检测。一些实施方式利用本文公开的MREJ特异性寡核苷酸的组合提供包括型i、ii、iii、iv、v、vii和xxi MREJ核酸的MRSA的鉴定。一些实施方式利用本文公开的MREJ特异性寡核苷酸的组合提供包括型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、ix、xiii、xiv和xxi核酸的MRSA的检测。一些实施方式利用本文公开的MREJ特异性寡核苷酸的组合提供包括型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、ix、xiii、xiv和xxi核酸的MRSA的鉴定。一些实施方式利用本文公开的MREJ特异性组合提供包括型i、ii、iii、iv、vii、xvi和xxi核酸的MRSA的检测和/或鉴定。
探针
在一些实施方式中，提供序列特异性探针。探针包括，但不限于如本文所描述的寡核苷酸。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与靶序列，如MREJ型xxi区核酸序列特异地杂交。例如，在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与SEQ ID NO:1、或其互补物、或其子序列(例如，SEQ ID NO:1内区域的扩增子)特异地杂交。在一些实施方式中，序列特异性探针与本文公开的正向引物和反向引物的结合部位两侧的核苷酸序列特异地杂交，并且与本文公开的正向引物和反向引物的结合部位两侧的核苷酸序列完全或基本上互补。在一些实施方式中，序列特异性探针包括SEQ ID NO：2或3的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，以便序列特异性探针与本文公开的扩增引物的结合部位重叠。
在一些实施方式中，提供与orfX杂交的序列特异性探针。在一些实施方式中，提供与mecA杂交的序列特异性探针。在一些实施方式中，提供与mecC杂交的序列特异性探针。在一些实施方式中，提供与nuc杂交的序列特异性探针。在一些实施方式中，提供与femB杂交的序列特异性探针。在一些实施方式中，提供与Sa442杂交的序列特异性探针。
熟练的技术人员将容易理解可一起提供同源的扩增引物对和序列特异性探针。即，在提供与特定序列特异性杂交并产生特定序列的扩增子的扩增引物的实施方式中，本文公开的实施方式还可包括序列特异性探针，其与扩增子杂交并且对扩增子特异。
在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xxi区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型i区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型ii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型iii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型iv区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型v区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型vi区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型vii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型viii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型ix区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型x区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xi区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xiii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xiv区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xv区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xvi区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xvii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xviii区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xix区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREJ型xx区多态性右侧末端序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与mecA序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与mecC序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与nuc序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与femB序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与Sa442序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。
在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与位于距SCCmec元件进入染色体DNA的插入点1千碱基内的金黄色葡萄球菌染色体序列特异地杂交。例如，在一些实施方式中，提供序列特异性探针，其与金黄色葡萄球菌orfX序列在核酸扩增的标准条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。在一些实施方式中，提供序列特异性探针，其与orfSA0022在核酸扩增的标准条件下杂交。在一些实施方式中，本文公开的序列特异性探针与MREP序列，例如，MREP型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix、xx或xxi序列特异地杂交。在一些实施方式中，提供一个以上的序列特异性探针。例如，在一些实施方式中，提供与MREP型xxi序列特异地杂交的序列特异性探针，连同一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十或更多个序列特异性探针。
在一些实施方式中，寡核苷酸探针可包括可检测的部分。例如，在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸探针可包括放射性标记。放射性标记的非限制的实例包括3H、14C、32P和35S。在一些实施方式中，寡核苷酸探针可包括一种或多种非放射的可检测的标记或部分，包括但不限于配体、荧光团、化学发光剂、酶和抗体。与探针一起使用的其它可检测的标记——其可使得本发明方法的灵敏度增加——包括生物素和放射-核苷酸。对普通技术人员将变得明显的是特定标记的选择指示它结合探针的方式。例如，寡核苷酸探针用一种或多种染料标记，以便与模板核酸杂交之后，产生荧光可检测的变化。虽然非特异性染料对于一些应用可能是期望的，但是序列特异性探针可提供更精确的扩增测量。序列特异性探针的一个构型可包括与荧光团连接的探针的一端和与猝灭剂连接的探针的另一端。当探针未杂交时，它可保持茎-环构型，其中荧光团被猝灭剂淬灭，因此阻止荧光团发荧光。当探针与模板核序列杂交时，它被线性化，使荧光团远离猝灭剂，并因此允许荧光团发荧光。序列特异性探针的另一个构型可包括与FRET对的第一荧光团连接的第一探针和与FRET对的第二荧光团连接的第二探针。第一探针和第二探针可被配置以当第一探针和第二探针与相同的扩增子杂交时与在充分近端内的扩增子序列杂交以允许FRET引起的能量传递。
在一些实施方式中，序列特异性探针包括如本文所公开的与荧光团结合的寡核苷酸。在一些实施方式中，探针与两个或更多荧光团结合。荧光团的实例包括：氧杂蒽染料，例如，荧光素和罗丹明染料，如异硫氰酸荧光素(FITC)、2-[乙氨基)-3-(乙亚氨基(ethylimino))-2-7-二甲基-3H-氧杂蒽(xanthen)-9-基]苯甲酸乙酯单氢氯化物(R6G)(发射波长范围为约500至560nm的响应辐射)、1,1,3,3,3',3'-六甲基吲哚二碳花青碘化物Hexamethylindodicarbocyanine iodide(HIDC)(发射波长范围为约600至660nm的响应辐射)、6-羧基荧光素(通常称作缩写FAM和F)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110；花青染料、例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素类，例如，伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；胡米胺染料；吖啶染料；咔唑染料；吩嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如花青染料如Cy3(发射波长范围为约540至580nm的响应辐射)、Cy5(发射波长范围为约640至680nm的响应辐射)等；BODIPY染料和喹啉染料。感兴趣的特异性荧光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、荧光素氯三嗪(Fluorescein Chlorotriazinyl)、荧光素、R110、伊红、JOE、R6G、HIDC、四甲基罗丹明、TAMRA、丽丝胺、ROX、Napthofluorescein、德克萨斯红、Napthofluorescein、Cy3和Cy5和类似物。
在一些实施方式中，探针与猝灭剂结合。猝灭剂可吸收电磁辐射和将其消散为热，因此保持黑暗。实例猝灭剂包括Dabcyl、NFQ’s，如BHQ-1或BHQ-2(Biosearch)、IOWA BLACKFQ(IDT)和IOWA BLACK RQ(IDT)。在一些实施方式中，选择猝灭剂以与荧光团配对，以吸收荧光团发射的电磁辐射。用于本文公开的组合物和方法的荧光团/猝灭剂对在本领域众所周知，并可被找到，例如，在万维网网址molecular-beacons.org/download/marras,mmb06％28335％293.pdf获得的S.Marras,“Selection of Fluorophore and QuencherPairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes”中被描述。
在一些实施方式中，荧光团与探针的第一端连接，猝灭剂与探针的第二端连接。结合可包括共价结合，并可任选地包括位于探针和荧光团或猝灭剂之间的至少一个连接分子。在一些实施方式中，荧光团与探针的5’端连接，猝灭剂与探针的3’端连接。在一些实施方式中，荧光团与探针的3’端连接，猝灭剂与探针的5’端连接。可用于定量核酸扩增的探针的实例包括分子信标、SCORPIONTM探针(Sigma)、TAQMANTM探针(Life Technologies)等。用于本文公开的实施方式的其它核酸检测技术包括，但不限于纳米颗粒探针技术(参见，Elghanian,et al.(1997)Science 277:1078-1081.)和Amplifluor探针技术(参见，美国专利号：5,866,366；6,090,592；6,117,635；和6,117,986)。
本文公开的一些实施方式提供探针，其与MREJ型xxi序列，或MREJ型xxi序列的扩增子，例如，SEQ ID NO：1，或其子序列特异地杂交。因此，本文公开的一些实施方式提供探针，其利用扩增引物SEQ ID NOs：2和3与来自包括SEQ ID NO：1的模板扩增的扩增子杂交。仅通过实例，在一些实施方式中，探针可包括SEQ ID NO：4的序列，基本上由SEQ ID NO：4的序列组成，或由SEQ ID NO：4的序列组成，或提供其变体。在一些实施方式中，探针包括如本文所描述的荧光团和/或猝灭剂。在一些实施方式中，探针可包括SEQ ID NO：82的序列，基本上由SEQ ID NO：82的序列组成，或由SEQ ID NO：82的序列组成，或提供其变体。在一些实施方式中，探针包括如本文所描述的荧光团和/或猝灭剂。在优选实施方式中，探针可包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO:82、或其变体，荧光团6-羧基荧光素(“FAM”)与探针的5’端连接，猝灭剂IOWA BLACK Black-hole 2(IDT)(“BHQ”)与探针的3’端连接。
试剂盒
本文还提供试剂盒。本文公开的试剂盒、引物和探针可用于在体外和/或原位应用中检测和/或鉴定MREJ型xxi的MRSA(并且，在一些实施方式中，另外检测和/或鉴定MREJ型i-xx中一种或多种的MRSA)。例如，考虑试剂盒可与任何先前描述的引物/探针组合使用，用于检测MREJ型i至xx的MRSA。还考虑本文公开的诊断试剂盒、引物和探针可单独使用或与适合检测和/或鉴定微生物的任何其它测定组合使用，适合检测和/或鉴定微生物的任何其它测定包括不限于：基于核酸检测的任何测定、任何免疫测定、任何酶测定、任何生物化学测定、任何溶菌测定、任何血清学测定、任何差异培养基、任何富集培养基、任何选择培养基、任何特异性测定培养基、任何鉴定培养基、任何计数培养基、任何细胞株、特异性细胞系上的任何培养和动物上的任何感染性测定。
因此，在一些实施方式中，本文公开的试剂盒将包括寡核苷酸，其与MREJ型xxi序列的多态性右侧末端序列(例如，SEQ ID NO:1或其互补物)在标准核酸扩增条件和/或严格杂交条件下特异地结合。例如，在一些实施方式中，本文公开的试剂盒将包括寡核苷酸(例如，第一扩增引物)，其包括SEQ ID NO:2或其变体，基本上由SEQ ID NO:2或其变体组成，或由SEQ ID NO:2或其变体组成。在一些实施方式中，试剂盒还可包括一种或多种另外的寡核苷酸，例如，第二扩增引物如寡核苷酸，其包括SEQ ID NO:3或其变体，基本上由SEQ ID NO:3或其变体组成，或由SEQ ID NO:3或其变体组成，其连同第一扩增引物将产生MREJ型xxi序列的多态性右侧末端连接的扩增子。在一些实施方式中，试剂盒还可包括如本文所描述的探针。例如，在一些实施方式中，试剂盒可包括寡核苷酸探针，其包括SEQ ID NO:4或其变体，基本上由SEQ ID NO:4或其变体组成，或由SEQ ID NO:4或其变体组成。
在一些实施方式中，除了与MREJ型xxi序列的多态性右侧末端序列在标准扩增条件下特异地结合的寡核苷酸外，本文公开的试剂盒可包括一种或多种寡核苷酸，其与MREJ型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix或xx内SCCmec多态性右侧末端序列(MREP)的一种或多种特异地结合。在一些实施方式中，除了与MREJ型xxi序列的多态性右侧末端序列在标准扩增条件下特异地结合的寡核苷酸外，本文公开的可包括一种或多种寡核苷酸，其与mecA序列特异地结合。在一些实施方式中，除了与MREJ型xxi序列的多态性右侧末端序列在标准扩增条件下特异地结合的寡核苷酸外，本文公开的试剂盒可包括一种或多种寡核苷酸，其与mecC序列特异地结合。在一些实施方式中，除了与MREJ型xxi序列的多态性右侧末端序列在标准扩增条件下特异地结合的寡核苷酸外，本文公开的试剂盒可包括一种或多种寡核苷酸，其与nuc序列特异地结合。在一些实施方式中，除了与MREJ型xxi序列的多态性右侧末端序列在标准扩增条件下特异地结合的寡核苷酸外，本文公开的试剂盒可包括一种或多种寡核苷酸，其与金黄色葡萄球菌-特异性核苷酸序列，例如，femB序列特异地结合。在一些实施方式中，除了与MREJ型xxi序列多态性右侧末端序列在标准扩增条件下特异地结合的寡核苷酸外，本文公开的试剂盒可包括与Sa442序列特异地结合的一种或多种寡核苷酸。
在一些实施方式中，提供含有试剂和组合物以进行本文描述的方法的试剂盒。这样的试剂盒可包括载体，其被区划，其中严格限制地接收一个或多个容器，如管或管形瓶。容器之一可含有至少一种未标记的或本文公开的可检测的标记的引物或探针。引物或引物可以以冻干形式存在或必要时存在于适当的缓冲液中。一个或多个容器可含有一种或多种将用于，例如，核酸扩增反应的酶或试剂。这些酶可单独存在或以混合物存在，以冻干形式存在或存在于适当的缓冲液中。用于如本文所公开的核酸扩增反应的示例性酶包括，但不限于，FASTSTARTTM Taq DNA聚合酶、APTATAQTM DNA聚合酶(Roche)、KLENTAQ 1TM DNA聚合酶(AB peptides Inc.)、HOTGOLDSTARTM DNA聚合酶(Eurogentec)、KAPATAQTM HotStart DNA聚合酶、KAPA2GTM Fast HotStart DNA聚合酶(Kapa Biosystemss)、PHUSIONTM Hot StartDNA聚合酶(Finnzymes)或类似的酶。
另外，本文公开的试剂盒可包括进行本文公开的方法必需的所有另外的成分，如缓冲液、提取试剂、酶、吸管、板、核酸、三磷酸核苷、滤纸、凝胶材料、转移材料、放射自显影供应物等。
在一些实施方式中，试剂盒包括另外的试剂，其是必需的或方便的和/或期望的，包括在本文公开的方法期间制备的反应混合物中，其中这样的试剂包括：一种或多种聚合酶；含水缓冲介质(制备的或以其组成组分存在，其中组分中的一种或多种可预混合或所有组分可分开)和类似物。试剂盒的各种试剂组分可存在于单独的容器，或可以全部预先组合成试剂组合物，用于与模板核酸组合。
除了以上组分，在一些实施方式中，试剂盒还可包括实施本文公开的方法的说明书。这些说明书可以以多种形式存在于试剂盒，其一种或多种可存在于试剂盒中。这些说明书可存在的一种形式是作为合适的介质或衬底上印刷的信息，例如，信息印刷在其上的一张或多张纸，试剂盒的包装中、包装插件中等印刷的信息。然而另一种手段将是计算机可读的介质，例如，磁盘、CD等，信息也被记录在其上。然而可存在的另一种手段是网站地址，其可通过互联网来使用以在移动的位置访问信息。任何方便的手段可存在于试剂盒中。
方法
本文提供方法，用于检测、鉴定和/或定量来自样品的具有MREJ型xxi核酸的MRSA的。在一些实施方式中，方法包括将待被分析的样品与寡核苷酸接触的步骤，所述寡核苷酸与SCCmec MREJ型xxi区的多态性右侧末端序列在标准核酸扩增条件和/或严格杂交条件下特异地杂交。
在一些实施方式中，待被测试具有SCCmec MREJ型xxi区的MRSA存在的样品在进行本文公开的方法之前进行。例如，在一些实施方式中，在进行本文公开的方法之前，样品可被分离、浓缩或经历多种其它处理步骤。例如，在一些实施方式中，在使样品与如本文所公开的寡核苷酸接触之前，样品可被处理以从样品分离核酸。如本文所用，短语“分离核酸”指从一种或多种细胞组分的核酸的纯化。熟练的技术人员将理解，处理以从中“分离核酸”的样品可包括除核酸外的组分和杂质。在一些实施方式中，本文公开的方法在样品上进行，无需体外培养样品。在一些实施方式中，本文公开的方法在样品上进行，在将样品与如本文所公开的寡核苷酸接触之前无需从样品分离核酸。
i.基于非扩增的方法
在一些实施方式中，寡核苷酸包括可检测的部分，如本文别处所描述的，并且可检测寡核苷酸与SCCmec MREJ型xxi区的多态性右侧末端序列的特异性杂交，例如，通过直接或间接的方法。因此，针对包括MREJ型xxi核酸的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测和/或鉴定的一些实施方式包括以下步骤：提供测试样品；和将样品与接触，所述寡核苷酸探针与SCCmec MREJ型xxi区的多态性右侧末端序列在标准核酸扩增条件和/或严格杂交条件下特异地杂交，其中所述寡核苷酸探针长度在10和45个核苷酸之间，并包括可检测的部分，其中如果包括MREJ型xxi序列的金黄色葡萄球菌存在于样品中，那么接触在允许引物与MREJ型xxi序列的mec右侧末端连接的特异杂交的条件下进行。可测定与MREJ型xxi序列(如果存在于正被测试的样品中)的mec右侧末端连接特异地结合的探针的存在和/或量，其中结合的探针指示样品中具有SCCmec MREJ型xxi序列的MRSA的存在。在一些实施方式中，结合的探针的量用于测定样品中具有SCCmec MREJ型xxi序列的MRSA的量。
相似地，在一些实施方式中，基于非扩增的方法可用于检测另外的核苷酸序列。例如，在一些实施方式中，本文公开的方法可包括基于非扩增的方法检测除MREJ型xxi序列外其它MREJ序列，例如，MREJ型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix或xx中的一种或多种或其任何组合的存在和/或量的应用。在一些实施方式中，本文公开的方法可包括基于非扩增的方法检测除MREJ(或MREP)型xxi序列外mecA序列的存在的应用。在一些实施方式中，本文公开的方法可包括基于非扩增的方法检测除MREJ(或MREP)型xxi序列外mecC序列的存在的应用。在一些实施方式中，本文公开的方法可包括基于非扩增的方法检测除(MREP)MREJ型xxi序列外金黄色葡萄球菌特异性序列，如nuc序列、femB序列、Sa442序列、16S rRNA序列或类似序列存在的应用。因此，在示例的实施方式中，本文提供用于MREJ型xxi、i、ii、iii、iv、vii、mecA、mecC和nuc序列同时检测的方法和组合物。
测定步骤可利用本领域技术人员已知的任何方法实现，包括但不限于，接触步骤之后原位杂交。杂合双链(即，特异地结合来自MREJ型xxi区的多态性右侧末端序列的探针的)的检测可通过许多方法来进行。通常，杂合双链分离自未杂交的核酸，然后检测与双链体结合的标记。这样的标记指本领域标准使用的放射性的、荧光的、生物的或酶学的标签或标记。标记可结合到寡核苷酸探针或来自生物样品的核酸。本领域技术人员将理解清洗步骤可用于洗掉过量样品/靶核酸或寡核苷酸探针(以及未结合的结合物，当可适用时)。另外，标准的异种测定形式适合利用存在于寡核苷酸引物和探针上的标记检测杂合子。
因此，根据一些实施方式，本文公开的方法可包括，例如利用本领域公认的方法，ELISA(例如，以浸渍片形式、多孔形式或类似形式)。
ii.基于扩增的方法
在一些实施方式中，用于检测和/或鉴定包括MREJ型xxi核酸的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法包括以下步骤：提供测试样品；和将样品与寡核苷酸探针接触，寡核苷酸探针与SCCmec MREJ型xxi区的多态性右侧末端序列在标准核酸扩增条件和/或严格杂交条件下特异性杂交，其中寡核苷酸探针长度在10和45个核苷酸之间。
在一些实施方式中，样品在标准扩增条件，或如果包括MREJ型xxi序列的金黄色葡萄球菌存在于样品中，允许引物与MREJ型xxi序列的mec右侧末端多态性序列(MREP序列)特异性杂交和延伸的条件下接触。因此，方法包括特异性扩增来自样品的MREJ型xxi核酸，例如，以产生包括MREJ型xxi序列的mec右侧末端连接的扩增子或扩增产物的步骤。在一些实施方式中，样品在标准扩增条件，或允许引物对，例如，与mec右侧末端多态性序列(MREP序列)杂交的第一引物和与邻近SCCmec右侧末端的金黄色葡萄球菌染色体序列，即，orfX杂交的第二引物特异杂交的条件下接触，以产生跨SCCmec–染色体连接的扩增子。一些实施方式提供方法以通过在标准扩增条件，或允许引物对，例如，与mec右侧末端多态性序列(MREP序列)杂交的第一引物和与邻近SCCmec右侧末端的金黄色葡萄球菌染色体序列，即，orfX杂交的第二引物特异杂交的条件下接触样品以产生跨SCCmec–染色体连接的扩增子而产生SCCmec右侧末端连接序列数据。
在一些实施方式中，样品，例如，与MREJ型xxi特异性寡核苷酸(一个或多个)接触的同时(如在多重PCR中)或与MREJ型xxi特异的寡核苷酸(一个或多个)接触连续地，在相同的标准扩增条件下与另外的引物接触，所述另外的引物允许一种或多种另外的MREJ型序列，例如，MREJ型i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix或xx序列中的一个或多个的特异性扩增。在一些实施方式中，样品，例如，与MREJ型xxi特异的寡核苷酸(一个或多个)接触的同时(多重PCR)或与MREJ型xxi特异的寡核苷酸(一个或多个)接触连续地，在相同的标准扩增条件下与另外的引物接触，所述另外的引物允许mecA和/或mecC序列的特异性扩增。在一些实施方式中，样品，例如，与MREJ型xxi特异的寡核苷酸(一个或多个)接触的同时(如在多重PCR中)或与MREJ型xxi特异的寡核苷酸(一个或多个)接触连续地，在相同的标准扩增条件下与另外的引物接触，所述另外的引物允许对金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌特异性序列)独特的一个或多个序列，如nuc、femB、Sa442等的特异性扩增。因此，在一些实施方式中，样品与对MREP型xxi、i、ii、iii、iv、v、vii、ix、xiii、xiv和xxi序列，以及mecA、mecC和nuc序列特异的引物接触。
在一些实施方式中，方法包括特异类型的序列(例如，MREJ型xxi序列)的鉴定。例如，在包括只有MREJ型xxi序列特异扩增的在实施方式中，扩增子的存在或缺乏指示样品中MREJ型xxi序列的存在或缺乏。在一些实施方式中，方法包括另外序列，例如，MREJ序列、mec序列、金黄色葡萄球菌特异性序列和类似序列的多重特异性扩增，连同MREJ型xxi序列特异性扩增。在包括多重扩增的实施方式中，在一些实施方式中，方法可包括特异序列的鉴定或检测，例如，通过利用只与一个扩增子杂交的序列特异性探针。在一些实施方式中，方法不区分扩增之后存在于样品中不同的可能的扩增子的一些或全部。例如，在一些实施方式中，与orfX杂交的序列特异性探针可用于检测一种或多种MREJ类型的扩增子的存在。在一些实施方式中，方法包括扩增产物的检测，没有特定序列的特异性检测。
用于靶核酸特异扩增的几种方法在本领域已知，并用于本文公开的实施方式。扩增方法的非限制的实例包括聚合酶链反应(PCR；参见Saiki et al.,1985,Science 230:1350-1354，通过引用并入本文)、连接酶链反应(LCR；参见Wu et al.,1989,Genomics 4:560-569；Barringer et al.,1990,Gene 89:117-122；Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193，其所有通过引用并入本文)、转录介导的扩增(TMA；参见Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177，通过引用并入本文)、自主序列复制(3SR；参见Guatelli et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878，通过引用并入本文)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、Qβ复制酶系统(Lizardi et al.,1988,BioTechnology 6:1197-1202，通过引用并入本文)和包括嗜热的SDA(tSDA)的链置换扩增(SDA；参见Walker et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396；Walker et al.,1992,Nuc.Acids.Res.20:1691-1696；和EP 0 497 272，其所有通过引用并入本文))。
在多种实施方式中，本文公开的方法用于检测临床样品中SCCmec MREJ型xxi核酸或序列的存在。例如，在一些实施方式中，本文公开的方法用于检测和鉴定具有型xxi MREJ区的金黄色葡萄球菌样品——具有处于生理学范围内的细菌浓度(即，采集自感染细菌的对象的样品中的细菌浓度)。因此，样品可被直接筛选而无需分离、浓缩或扩展(例如，培养)细菌群体以检测具有MREJ型xxi核酸的MRSA的存在。在多种实施方式中，本文公开的方法能检测来自样品的具有MREJ型xxi核酸的MRSA的存在，所述样品具有约1CFU/ml、10CFU/ml、100CFU/ml、1×103CFU/ml、1×103CFU/ml、约1×104CFU/ml、约1×105CFU/ml或约1×106CFU/ml或两者之间的任何数的细菌浓度。
在一些实施方式中，本文描述的方法，方法包括进行PCR或qPCR以产生扩增子。很多不同的PCR和qPCR程序在本领域已知和在下面在本文例证，并可直接应用或利用目前描述的用于检测和/或鉴定样品中具有MREJ型xxi核酸的MRSA的组合物被改变而用于使用。
通常，在PCR中，靶多核苷酸序列通过利用至少一个寡核苷酸引物或寡核苷酸引物对进行的反应而扩增。引物(一个或多个)与靶核酸的互补区特异地杂交，DNA聚合酶延伸引物(或多个)以扩增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下，一个大小的核酸片段在反应产物(为扩增产物的靶多核苷酸序列)中占优势。重复扩增循环以增加单个靶多核苷酸序列的浓度。反应可在通常用于PCR的任何热循环仪中进行。然而，优选的是具有实时荧光测量能力的循环仪，例如，(Cepheid,Sunnyvale,CA)、ABIPRISM(Applied Biosystems,Foster City,CA)、ROTOR-GENETM；(Corbett Research,Sydney,Australia)、(Roche Diagnostics Corp,Indianapolis,IN)、(Biorad Laboratories,Hercules,CA)和(Stratagene,La Jolla,CA)。
一些实施方式提供包括定量PCR(qPCR)(也称作实时PCR)的方法。qPCR可提供定量测量，还提供减少的时间和污染的益处。如本文所用，“定量PCR”(或“实时qPCR”)指当它发生时直接监测PCR扩增的过程而无需反应产物的重复取样。在qPCR中，当反应产物产生时，它们可通过发信号机制(例如，荧光)监测并在信号升高在本底水平之上之后但在反应达到平顶之前追踪。需要获得荧光可检测的或“阈”水平(本文称作循环阈值或“CT”)的循环数直接随着在PCR过程开始的可扩增靶浓度而变化，赋予信号强度的测量以提供样品中靶核酸的量的实时测量。
建立PCR和qPCR的方法对本领域技术人员来说众所周知。反应混合物最低限度地包括模板核酸(例如，如存在于测试样品中，除了在如下面所描述的阴性对照的情况下)和寡核苷酸引物和/或探针，连同合适的缓冲液、盐和类似物，和适当浓度的核酸聚合酶。如本文所用，“核酸聚合酶”指催化三磷酸核苷聚合的酶。通常，该酶将启动在与靶序列退火的引物3'端的合成和将沿着模板以5'-方向进行，直到合成终止。适当的浓度包括在目前描述的方法中催化该反应的一个浓度。用于本文公开的方法的已知DNA聚合酶包括，例如，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶、嗜热水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶和强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶、FASTSTARTTM Taq DNA聚合酶、APTATAQTM DNA聚合酶(Roche)、KLENTAQ 1TM DNA聚合酶(AB peptides Inc.)、HOTGOLDSTARTM DNA聚合酶(Eurogentec)、KAPATAQTM HotStart DNA聚合酶、KAPA2GTM FastHotStart DNA聚合酶(Kapa Biosystemss)、PHUSIONTM Hot Start DNA聚合酶(Finnzymes)、或类似的酶。
除了以上组分，本方法的反应混合物包括引物、探针和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。
通常反应混合物将进一步包括四种不同类型的dNTP——对应四种天然存在的核苷碱基，即，dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本发明的方法中，每种dNTP将通常以约10至5000μM，通常约20至1000μM、约100至800μM、或约300至600μM范围的量存在。
反应混合物可进一步包括含水缓冲介质，其包括单价离子来源、二价阳离子来源和缓冲剂。可利用任何方便的单价离子来源，如氯化钾、乙酸钾、乙酸铵、谷氨酸钾、氯化铵、硫酸铵和类似物。二价阳离子可以是镁、锰、锌和类似物，其中阳离子将通常是镁。可利用任何方便的镁阳离子来源，包括氯化镁、乙酸镁等。存在于缓冲液中的镁的量范围可以是0.5至10mM，并可以是约1至约6mM、或约3至约5mM。可存在于缓冲液中的代表性的缓冲剂或盐包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等，其中缓冲剂的量范围将通常是约5至150mM，通常约10至100mM，并且更通常约20至50mM，其中在某些优选实施方式中，缓冲剂将以足以提供约6.0至9.5范围的pH，例如，pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5的量存在。可存在于缓冲介质中的其它的剂包括螯合剂，如EDTA、EGTA和类似物。在一些实施方式中，反应混合物可包括BSA，或类似物。此外，在一些实施方式中，反应可包括冷冻保护剂，如海藻糖，特别地当试剂作为主混合物提供时，其可被超时储存。
在制备反应混合物中，多种组成组分可以以任何方便的顺序混合。例如，缓冲液可以与引物、聚合酶混合，然后是模板核酸，或所有的多种组成组分可同时混合以产生反应混合物。
可选地，商业上可获得的预混合的试剂可用于本文公开的方法，根据制造者的指导，或被修改以改进反应条件(例如，需要时，缓冲液浓度、阳离子浓度或dNTP浓度的修改)，包括，例如， Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)、或(Cepheid)、IQ&#8482；Supermix(Bio-Rad Laboratories)、 FastStart(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)或 QPCR Master Mix(Stratagene,La Jolla,CA)。
反应混合物可经历引物延伸反应条件(“足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件”)，即，利用模板链作为模板，通过将核苷酸加到引物分子末端而允许聚合酶介导的引物延伸的条件。在许多实施方式种，引物延伸反应条件是扩增条件，该条件包括多个反应循环，其中每个反应循环包括：(1)变性步骤、(2)退火步骤和(3)聚合步骤。如下面所讨论的，在一些实施方式中，扩增程序不包括退火专用的特定的时间，而只包括变性和延伸专用的特定的时间。反应循环数将根据正进行的应用而变化，但是通常将是至少15，更通常至少20并可高达60或更高，其中不同的循环数通常将是约20至40的范围。对于进行超过约25，通常超过约30个循环的方法，可方便或期望的将另外的聚合酶引入反应混合物，以便保持适合酶法引物延伸的条件。
变性步骤包括将反应混合物加热到升高的温度和将混合物保持在升高的温度，持续足够使存在于反应混合物中的任何双链或杂交核酸分离的一段时间。为了变性，反应混合物的温度通常将升高到和保持在约85至100℃，通常约90至98℃和更通常约93至96℃的温度范围，持续约3至120sec，通常约3sec范围的一段时间。
变性之后，反应混合物可经历这样的条件，其对于与存在于混合物(如果存在)的模板核酸的引物退火和对于以利用引物与之杂交的核酸作为模板，引物以5'至3'方向延伸的方式，核苷酸聚合到引物末端是足够的，即，足够酶法产生引物延伸产物的条件。在一些实施方式中，退火和延伸过程发生在相同的步骤中。将反应混合物降低以达到这些条件的温度通常将被选择以提供最佳效率和特异性，并通常将是约50至85℃，通常约55至70℃和更通常约60至68℃的范围。在一些实施方式中，退火条件可保持约15sec至30min，通常约20sec至5min、或约30sec至1分钟或约30秒范围的一段时间。
该步骤可任选地包括退火步骤和延伸步骤中每个之一，改变和优化每个步骤的温度和时间长度。在两步退火和延伸中，允许退火步骤如上进行。引物与模板核酸退火之后，反应混合物将进一步经历足以提供如上核苷酸与引物末端聚合的条件。为了达到聚合条件，反应混合物的温度通常将升高到或保持在约65至75℃，通常约67至73℃的温度范围，并保持约15sec至20min，通常约30sec至5min范围的一段时间。在一些实施方式中，本文公开的方法不包括单独的退火和延伸步骤。而是，所述方法包括变性和延伸步骤，没有针对退火特别专用的任何步骤。
以上变性、退火和延伸的循环可利用自动化的装置，通常称作热循环仪进行。可利用的热循环仪在本文别处以及在美国专利号5,612,473；5,602,756；5,538,871；和5,475,610中被描述，其公开通过引用被并入本文。
本文描述的方法还可用于基于非PCR的应用以检测靶核酸序列，其中这样的靶可被固定到固体载体上。将核酸序列固定到固体载体上的方法在本领域已知并在以下中被描述：Ausubel et ah,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing and Wiley-Interscience,NY)，和制造者提供的程序，例如，对于膜：PallCorporation,Schleicher&amp；Schuell；对于磁珠：Dynal；对于培养板：Costar,Nalgenunc；对于珠阵列平台：Luminex和Becton Dickinson；并且，对于根据本文提供的实施方式有用的其他载体，CPG,Inc。
对于多种试剂的精确量和对于PCR条件或导致相似的扩增或检测/定量结果的其它合适的扩增程序(例如，缓冲条件、循环时间等)的改变对于本领域的技术人员来说是已知的并被认为是相等的。在一个实施方式中，受试者qPCR检测具有检测样品中小于50个拷贝(优选少于25个拷贝、更优选少于15个拷贝、仍热更优选少于10个拷贝，例如5、4、3、2或1个拷贝)的靶核酸(即，MREJ型xxi核酸)的灵敏度。
对照
本文公开的测定可任选地包括对照。本文公开的PCR或qPCR反应可含有多种对照。这样的对照可包括“无模板”阴性的对照，其中引物、缓冲液、酶(一种或多种)和其它必需试剂(例如，MgCl2、核苷酸等)在缺少加入的测试样品的情况下循环。这确保试剂不被与引物反应的多核苷酸和产生假的扩增产物的多核苷酸污染。除了“无模板”对照，阴性对照还可包括与反应中包括的非特异性靶核酸扩增反应，或可以是利用样品制备(从核酸提取到扩增制备)的任何或全部步骤而不加入测试样品(例如，每个步骤不利用测试样品或利用已知不含耐碳青霉烯的微生物的样品)而制备的样品。
在一些实施方式中，本文公开的方法可包括阳性对照，例如，以确保方法和试剂如所期望的进行。阳性对照可包括与本文公开的MREJ型xxi靶核酸无关的已知靶。扩增之前，阳性对照核酸(例如，以线性化或非线性化的质粒的形式)可加入扩增反应。单个反应可含有阳性对照模板、阴性对照或样品模板，或单个反应可含有样品模板和阳性对照。优选，阳性对照将包括与来自本文公开的MREJ型xxi序列的MREJ型xxi正向和反向扩增引物基本上互补的序列，以便用于扩增MREJ型xxi序列的扩增引物对在相同的测定条件下也将扩增对照核酸。在一些实施方式中，产生自阳性对照模板核酸的扩增子大于靶扩增子。优选，除与正向和反向引物互补或基本上互补的阳性对照核酸中的序列外，阳性对照核酸将不与本文公开的靶扩增子/MREJ型xxi序列共享实质的相似性。换言之，在正向和反向引物外，阳性对照扩增子与阳性对照多核苷酸同一性优选小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％，并且甚至更优选，小于10％，例如，当利用NCBI BLAST ALIGN工具比较序列同一性时。
阳性和/或阴性对照可用于设置参数，在该参数内测试样品将被分类为具有或不具有MRSA——具有MREJ型xxi序列。例如，在qPCR反应中，扩增子在阳性对照样品中被检测的循环阈值可用于设置用于将样品分类为“阳性”的阈值，扩增子在阴性对照样品中被检测的循环阈值可用于设置用于将样品分类为“阴性”的阈值。来自单个反应的CT可用于每个对照，可使用平行测定的样品的中间值或平均值。在再一个实施方式中，可使用历史对照值。针对阴性和阳性对照中每个的检测的最低水平通常设置在跨多个反应的平均CT的95％置信区间的较低端。该值可根据诊断测定的需要而调整。
优选，PCR对照应在与测试样品相同的时间，在相同的扩增反应中，利用相同的试剂进行。
一些实施方式提供扩增反应期间，例如，实时，靶扩增产物的同一性和/或量的测定。例如，一些实施方式涉及测量，例如，与靶扩增子核酸和/或阳性对照扩增子(例如，如通过荧光所指示的)特异性结合的探针。在一些实施方式中，不是利用序列特异性寡核苷酸探针，而是所述方法可利用非序列特异性探针，其与双链核酸，例如，嵌入剂或类似物特异性结合。当未结合时嵌入剂具有相对低的荧光，在与双链核酸结合之后具有相对高的荧光。像这样，嵌入剂可用于监测核酸扩增反应期间双链核酸的积累。非特异性染料的实例包括嵌入剂如SYBR Green ITM(分子探针)、碘化丙啶、溴乙啶、LC绿、SYTO9、荧光染料、BEBO等，其在存在双链核酸的情况下发荧光和产生可检测的信号。测量可在扩增反应的每个循环期间指定的点，例如，在每个延伸步骤之后(在每个变性步骤之前)进行。不管是否使用序列特异性寡核苷酸探针或非序列特异性寡核苷酸探针，与靶扩增子核酸和/或阳性对照扩增子特异结合的探针的量的测量可在每个循环自始至终连续地进行。
可选地，在一些实施方式中，扩增子(例如，靶和/或阳性对照)的同一性/量可在扩增反应结束之后利用标准的分子技术包括(例如)DNA印迹法、点印迹法等来证实。
实施例
提供以下实施例以显示该技术可应用的特定的情形和背景，并不意欲限制本发明的范围和该公开中包括的权利要求。
实施例1：来自临床样品的MREJ型XXI MRSA的检测和鉴定
进行qPCR反应以检测和鉴定具有MREJ型xxi核酸的MRSA。临床样品利用Amies液体拭子(Copan Diagnostics,Inc)从患者采集。
利用BD基因OhmTM Lysis试剂盒(Becton Dickinson)根据制造者的指导任选地从临床样品分离DNA。分离的DNA样品与引物接触，所述引物在标准扩增条件下与金黄色葡萄球菌种类特异性orfX序列和与MREJ型xxi多态性右侧末端序列，即，SEQ ID NOs：2和3每种0.2-0.7μM，特异地杂交。0.3μM dNTPs(Roche)、4mM MgCl2(SIGMA)、2.8单位Taq聚合酶(Roche)、100mM Tris，pH 8.3(EMD)、10mM KCl(LaboratoireMat)、5mM(NH4)2SO4(SIGMA)、0.15mg/mL BSA(SIGMA)4％海藻糖(SIGMA)。反应还包括分子信标探针，其与可检测的MREJ型xxi的右侧末端连接的扩增产物特异性杂交，并且其包括可检测的部分，该可检测的部分在BD MAXTM(Becton Dickinson)、(Cepheid)设备、或配置用于在FAM、德克萨斯红和Tet通道加入反应混合物的实时PCR的其它设备上可检测。
PCR在BD MAXTM(Becton Dickinson)或(Cepheid)中利用与下面相同的循环参数进行：
FAM、德克萨斯红和TET通道中的循环阈值(CT)利用BD MAXTM或软件来测定。
实施例2：来自临床样品的MREJ型I-XXI MRSA的多重检测
进行多重扩增反应以检测具有MREJ型i-vii、ix、xiii、xiv和xxi中任一种的MRSA的存在。临床样品利用Amies液体拭子(Copan Diagnostics,Inc)从患者采集。
利用BD基因OhmTM裂解试剂盒(Becton Dickinson)根据制造者的指导任选地自临床样品分离DNA。分离的DNA样品与引物接触，所述引物在标准扩增条件下与金黄色葡萄球菌种类特异性orfX序列和与MREJ型i-vii、ix、xiii、xiv和xxi多态性右侧末端序列，即，0.2-0.7μM SEQ ID NOs：2、3、39、77和81的每一种，特异地杂交。0.3μM dNTPs(Roche)、4mMMgCl2(SIGMA)、2.8单位Taq聚合酶(Roche)、100mM Tris，pH 8.3(EMD)、10mMKCl(LaboratoireMat)、5mM(NH4)2SO4(SIGMA)、0.15mg/mL BSA(SIGMA)4％海藻糖(SIGMA)。反应还包括分子信标探针，其与可检测的MREJ型xxi的右侧末端连接的扩增产物特异性杂交，并且其包括可检测的部分，该可检测的部分在BD MAXTM(Becton Dickinson)、(Cepheid)设备、或配置用于在FAM、德克萨斯红和Tet通道加入反应混合物的实时PCR的其它设备上可检测，即，SEQ ID NO:4。
PCR在BD MAXTM(Becton Dickinson)或(Cepheid)中利用与下面相同的循环参数进行：
FAM、德克萨斯红和TET通道中的循环阈值(CT)利用BD MAXTM或软件来测定。CT用于测定MREJ型i-vii、xvi、ix、xiii、xiv和xxi中任一种的MRSA是否存在。
实施例3：MREJ型XXI序列与mecA同系物，MECc相关
针对分离自牛或人宿主的MRSA的51个分离群进行MREJ型xxi区和mecC基因的PCR扩增。
分离群列表提供在下面的表中：
利用BD基因OhmTM裂解试剂盒(Becton Dickinson)根据制造者的指导自上述已知包含mecC的临床样品分离DNA。PCR反应如下制备：SEQ ID NOs：182、183和187每种0.2-0.7μM、0.3μM dNTPs(Roche)、4mM MgCl2(SIGMA)、2.8单位 Taq聚合酶(Roche)、100mM Tris，pH 8.3(EMD)、10mM KCl(LaboratoireMat)、5mM(NH4)2SO4(SIGMA)、0.15mg/mLBSA(SIGMA)4％海藻糖(SIGMA)。
反应利用FAM通道在BD 系统上进行。
数据表明，51种包含mecC基因的MRSA菌株中的50种含有MREJ型xxi序列，因此利用MREJ型xxi序列，提供mecC MRSA菌株检测的高度普遍性的证据。
已经总体描述了本发明，进一步的理解可参考具体的实施例而获得，所述实施例由本文提供，仅用于说明目的，并不意欲受限制。
序列表
<110> 基因欧姆科技加拿大公司
C.梅纳德
C.罗杰-达勒姆波特
<120> 用于检测和鉴定MREJ型xxi的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的序列
<130> GENOM.114WO
<150> 61/621368
<151> 2012-04-06
<160> 187
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 772
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<223> n= c, a, t, or g
<220>
<221> misc_feature
<222> 4, 6
<223> n = A,T,C or G
<400> 1
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gaacattaga ttaagtaaga aatctttgtt tgctttgcta agatctccat ca 772
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 4
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<210> 5
<211> 3050
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
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<211> 3050
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 6
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<212> DNA
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tcgataatca tgaaaattaa gaacataatt gtacctagta ctaataaatg tgtatgtgta 3900
acatttaatt gagaaaaacc gctaaaatct tccgcttttg tcatttctct ataaaataga 3960
ccacttaata accctaatag tgtatagagc gctgaactat acattaatct tttcatttta 4020
attcccccta tttttaatta cgagataagt atagcggtag tttatgaact gagtatgaac 4080
ttacaacaaa aaaattaatg aagtacttta caataaactc aatttattag atggtggagg 4140
gacgaaaaag gattttagaa aaataaatta atatattttt attttgataa gtaataatta 4200
ataatatctt ggaaatcatt gttaagtatt gttgtaatac aatcgtcatt cataaaatct 4260
tcatagattt tatcaagaat ttcttcatct tcgatagatg tgaaatgatt agctaaccct 4320
tttataattt aagtgtaatt tgtgaatcta aac 4353
<210> 23
<211> 2031
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 23
accattttag ctgtagggaa actaaaagag aaatattgga agcaagccat agcagaatat 60
gaaaaacgtt taggcccata caccaagata gacatcatag aagttccaga cgaaaaagca 120
ccagaaaata tgagtgacaa agaaattgag caagtaaaag aaaaagaagg ccaacgaata 180
ctagccaaaa tcaaaccaca atccacagtc attacattag aaatacaagg aaagatgcta 240
tcttccgaag gattggccca agaattgaac caacgcatga cccaagggca aagcgacttt 300
gttttcgtca ttggcggatc aaacggcctg cacaaggacg tcttacaacg cagtaactac 360
gcactatcat tcagcaaaat gacattccca catcaaatga tgcgggttgt gttaattgaa 420
caagtgtaca gagcatttaa gattatgcga ggagaagcgt atcacaaata aaactaaaaa 480
atagattgtg tataatataa aaggagcgga tttatattaa aactttgaat tcaaaaatta 540
ttgaaaggga agctacctta gaaattgaat ctatggcaac taatacattg aaaataaacc 600
cggatattaa ttcaaacgat acaaaaatgt ctttcgatgg agaattggaa gtgtatgatt 660
ctgaaaattt gagtaaaaaa aatttcgttg gaaaaataca agttcaagtt aaaggaaagg 720
aagtagctaa aagaggaggt aaggttattc atcgaagtaa tgtcaaaatg aatgatttaa 780
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aaaaagttgt tgagaagcag gtttatggta aacaattaca tcaattagat ttacaatttt 900
tactgcaaaa aaagcagaaa agcgtcacta taaaaatgta tgaaattgaa aatgaaaaaa 960
ttttatataa taattgcgta aaatatataa atgaaaagag attacaaaat caagtaggtc 1020
aagttaaagt aaagaacata gaaaaagctt tatcatatat agctacacct gaaaatattg 1080
tgatggatca tagaggttta ccattaaatg atttttatgg ctatataaaa attaattcat 1140
ctgaattaga tgtaactata ccagatggag tattaagtat ggaaaaagta aaaagagtga 1200
acaaaaagca gataataaaa gaaggcaagt tattatttga aggtatggta ggtattgaaa 1260
cttcaaagga gtccatctct ataactatag atgatatttt caaaattcaa acatttgaaa 1320
gtgataacaa aagtatatat acaatgttac catttaaaaa attaaatata gccgaacaat 1380
cttttaatgt tataaacgaa ttgtcgaaag gcggcgaatt ctttttggat caaatccaat 1440
tagtaatcca accttttgaa attaatatta ttgaaataaa agaaacaata aataagttga 1500
atattaaatt atcagagtat agtaacttgc tttcgtttga tgtgagtcta aaatctacag 1560
aatttgataa gcagatgaat gagataaaag gtttattaga attattggaa tataaaaatt 1620
ttaaagattt taaaatgcat aataatggat actataaaat gaagttttgt ggaaaattta 1680
tattattatt taaagacaat acatcattgt ataatgtcta ctctaatgac tttgtagata 1740
gatttgaggc tgttacaaaa gaaagagttg tacagatgcc aattgtttac acattaacaa 1800
gagatatgat tgtagatgta ctgaattttg atataaatgt tattaaagaa tgtattgaat 1860
cagataaaat tgctattcaa tctgacatta aatgggagaa attaaataac tttgcattag 1920
aattaatcgc agcctatgat gaaactcaaa gaaccgattt attagaatta gctgaatatg 1980
tattaaataa tttgctgaat tttgataatg ataaaatatt tatgaactta a 2031
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<211> 818
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 24
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acatcataga agttccagac gaaaaagcac cagaaaatat gagcgacaaa gaaattgagc 120
aagtgtatag agcatttaag attatgcgtg gagaagcata tcataaatga tgcggttttt 180
tcagccgctt cataaaggga ttttgaatgt atcagaacat atgaggttta tgtgaattgc 240
tgttatgttt ttaagaagct tatcataagt aatgaggttc atgatttttg acatagttag 300
cctccgcagt ctttcatttc aagtaaataa tagcgaaata ttctttatac tgaatactta 360
tagtgaagca aagttctagc tttgagaaaa ttctttctgc aactaaatat agtaaattac 420
ggtaaaatat aaataagtac atattgaaga aaatgagaca taatatattt tataatagga 480
gggaatttca aatgatagac aactttatgc aggtccttaa attaattaaa gagaaacgta 540
ccaataatgt agttaaaaaa tctgattggg ataaaggtga tctatataaa actttagtcc 600
atgataagtt acccaagcag ttaaaagtgc atataaaaga agataaatat tcagttgtag 660
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<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
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atcatagaag ttccagacga aaaagcacca gaaaatatga gcgacaaaga aattgagcaa 120
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acattagaaa tacaaggaaa gatgctatct tccgaaggat tggcccaaga attgaaccaa 240
cgcatgaccc aagggcaaag cgactttgta ttcgtcattg gcggatcaaa cggcctgcac 300
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ccaggctgtc tggtaaattg agaagttggg ttttggagcg tataaatgat agaattaata 600
taaaattcaa tttgaggagt aggagattat gtcgaatata aaaacaacac tagagacgtc 660
cgtaggacta gaaaaagaca acgataagct atttgattat ataactgaat tagagattca 720
aaacacgcct gaaaaccggg aagcaaaagt tgttattgaa gaaaggttac ataaagaata 780
taaatatgaa ttagatcaaa tgacaccaga gtatggaata caaaaaggca gtgttagaat 840
aggtcatgca gatgttgtaa tatttcatga ttctaaagat aaatctcaag agaatattaa 900
aataatagta gagtgtaaaa gaaagaatcg cagggatggt attgaacaat taaaaacata 960
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<213> 金黄色葡萄球菌
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cttgtactat tataaagtac gacatcagta ttaggtatca ctttgaacac atgaatttca 300
ttatcacttt tattattcac aaaaaatttt ccaattctca attactgaat tatgtgtata 360
catgttgtta aaaattaata aaggatattt atgtttgttt aaagcatatc acaagtgatg 420
cggtttttta taaagattta cttgttagtg attttgataa aaatgcttaa tactatttca 480
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<212> DNA
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<220>
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
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<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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gttgccatag attcaatttc taag 24
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
gctccaaaac ccaacttctc aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
aatggaattt gttaatttca taaat 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
ttccgaagct aattctgtta ata 23
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
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<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
gccaaaatca aaccacaatc cac 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
gccaaaatca aaccacaatc aac 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
accacgaatg tttgctgcta atg 23
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
cgcttgccac atcaaatgat gcgggttgtg caagcg 36
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<400> 51
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<211> 37
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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cccgcgcata gttactgcgt tgtaagacgt ccgcggg 37
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<211> 37
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<220>
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<211> 19
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<223> 合成寡核苷酸
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
ctctataaac atcgtatgat attgc 25
<210> 73
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
caaatattat ctcgtaattt accttgttc 29
<210> 74
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 74
ctctgcttta tattataaaa ttacggctg 29
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
ttcgttccct ccattaactg tc 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 76
tcaccgtctt tcttttgacc tt 22
<210> 77
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 77
cactttttat tcttcaaaga tttgagc 27
<210> 78
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 78
atggaaattc ttaatcttta cttgtacc 28
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 79
cagcaattcw cataaacctc ata 23
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
acaaactttg aggggatttt tagtaaa 27
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
tgataagcca ttcattcacc ctaa 24
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
tagttactgt gttgtaagac gtcc 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
ctactatgaa ctgtgcaatt tgttct 26
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
gcaattcaca taaacctcat atgttc 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
acctcatatg ttctgataca ttca 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 86
gcaattcaca taaacctcat at 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 87
cataacagca attcacataa acctc 25
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 88
taacagcaat tcacataaac ct 22
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 89
cgctattatt tacttgaaat gaaagac 27
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 90
cttgaaatga aagactgcgg a 21
<210> 91
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 91
ttgcttcact ataagtattc agtataaaga atttacttga aatgaaagac tgcg 54
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 92
atttacttga aatgaaagac tgcg 24
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 93
aaagaatatt tcgctattat ttacttgaa 29
<210> 94
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 94
tcagtataaa gaatatttcg ctattattt 29
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 95
tgaaatgaaa gactgcggag 20
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 96
aacctcatat gttctgatac attcaaa 27
<210> 97
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 97
tatgtcaaaa atcatgaacc tcattact 28
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 98
cataacagca attcacataa acctc 25
<210> 99
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 99
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<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 100
atccctttat gaagcggc 18
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 101
tgaaatgaaa gactgcggag 20
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 102
gcaaggtata atccaatatt tcatatatgt 30
<210> 103
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 103
agttccataa tcaatataat ttgtacagt 29
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 105
ctttcattct ttcttgattc cattag 26
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
cactctataa acatcgtatg atattgc 27
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
ttcttaattt aattgtagtt ccataatcaa 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
aattatacac aacctaattt ttagttttat 30
<210> 109
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
aatttttagt tttatttatg atacgcttc 29
<210> 110
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
acacaaccta atttttagtt ttatttatga 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
tttattaaac actctataaa catcgtatga 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
ccacatctca ttaaattttt aaattataca c 31
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
atattataca caatccgttt tttagtttta 30
<210> 115
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
acacaatccg ttttttagtt ttatttatg 29
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
ttctaattta tttaacataa aatcaatcct 30
<210> 117
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
caatcctttt tatatttaaa atatattata cac 33
<210> 118
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
tacaaagtcg ctttgccttt gggtca 26
<210> 120
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
ggccgtttga tccgccaat 19
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
aagtcgcttt gcccttgggt a 21
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 122
aagtcgcttt gcccttgggt 20
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
aagtcgcttt gcccttgggt ca 22
<210> 124
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
aagtcgcttt gcccttggg 19
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
caagaattga accaacgcat 20
<210> 126
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
caatgacgaa tacatagtcg ctttgccctt 30
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
cgtttgatcc gccaatgacg a 21
<210> 128
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 128
gccaatcctt cggaagatag ca 22
<210> 129
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 129
attaacacaa cccgcatc 18
<210> 130
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 130
gtcgctttgc ccttgggtc 19
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 131
tcgctttgcc cttgggtcat 20
<210> 132
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 132
ggccgtttga tccgccaat 19
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 133
gtccttgtgc aggccgtttg at 22
<210> 134
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 134
cttgggtcat gcgttggttc aatt 24
<210> 135
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 135
cgaatacaaa gtcgctttgc ccttggg 27
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 136
atgcgttggt tcaattcttg 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 137
gcgttggttc aattcttggg 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 138
acccaagggc aaagcgactt 20
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 139
ggtaatgcgt tggttcaatt cttg 24
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 140
acaaagtcgc tatgcccttg ggtca 25
<210> 141
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 141
ctttccttgt atttctaatg taatgactg 29
<210> 142
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 142
ttgatgtggg aatgtcattt tgctgaa 27
<210> 143
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 143
gcgttggttc aattcttggg ccaat 25
<210> 144
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 144
gttggttcaa ttcttgggcc aatccttcg 29
<210> 145
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 145
cgaatacaaa gtcgctttgc ccttgg 26
<210> 146
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 146
gccaatgacg aatacaaagt cgctttgcc 29
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 147
tgggccaatc cttcggaaga tagca 25
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 148
atgcgttggt tcgattcttg 20
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 149
catgcgttgg ttcgattctt g 21
<210> 150
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 150
aagtcgcttt gcccttggg 19
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 151
catgcgttgg ttcgattctt g 21
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 152
aagtcgcttt gcccttgggt cat 23
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 153
tgctcaatta acacaacccg catca 25
<210> 154
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 154
gccgcgctgc tcaattaaca caacccgcgc ggc 33
<210> 155
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 155
gccgcgcatg cgttggttca attctgcgcg gc 32
<210> 156
<211> 2123
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 156
ctccatatca caaaaattat aacattattt tgacataaat actacatttg taatatacta 60
caaatgtagt cttatataag gaggatattg atgaaaaaga taaaaattgt tccacttatt 120
ttaatagttg tagttgtcgg gtttggtata tatttttatg cttcaaaaga taaagaaatt 180
aataatacta ttgatgcaat tgaagataaa aatttcaaac aagtttataa agatagcagt 240
tatatttcta aaagcgataa tggtgaagta gaaatgactg aacgtccgat aaaaatatat 300
aatagtttag gcgttaaaga tataaacatt caggatcgta aaataaaaaa agtatctaaa 360
aataaaaaac gagtagatgc tcaatataaa attaaaacaa actacggtaa cattgatcgc 420
aacgttcaat ttaattttgt taaagaagat ggtatgtgga agttagattg ggatcatagc 480
gtcattattc caggaatgca gaaagaccaa agcatacata ttgaaaattt aaaatcagaa 540
cgtggtaaaa ttttagaccg aaacaatgtg gaattggcca atacaggaac agcatatgag 600
ataggcatcg ttccaaagaa tgtatctaaa aaagattata aagcaatcgc taaagaacta 660
agtatttctg aagactatat caaacaacaa atggatcaaa attgggtaca agatgatacc 720
ttcgttccac ttaaaaccgt taaaaaaatg gatgaatatt taagtgattt cgcaaaaaaa 780
tttcatctta caactaatga aacagaaagt cgtaactatc ctctagaaaa agcgacttca 840
catctattag gttatgttgg tcccattaac tctgaagaat taaaacaaaa agaatataaa 900
ggctataaag atgatgcagt tattggtaaa aagggactcg aaaaacttta cgataaaaag 960
ctccaacatg aagatggcta tcgtgtcaca atcgttgacg ataatagcaa tacaatcgca 1020
catacattaa tagagaaaaa gaaaaaagat ggcaaagata ttcaactaac tattgatgct 1080
aaagttcaaa agagtattta taacaacatg aaaaatgatt atggctcagg tactgctatc 1140
caccctcaaa caggtgaatt attagcactt gtaagcacac cttcatatga cgtctatcca 1200
tttatgtatg gcatgagtaa cgaagaatat aataaattaa ccgaagataa aaaagaacct 1260
ctgctcaaca agttccagat tacaacttca ccaggttcaa ctcaaaaaat attaacagca 1320
atgattgggt taaataacaa aacattagac gataaaacaa gttataaaat cgatggtaaa 1380
ggttggcaaa aagataaatc ttggggtggt tacaacgtta caagatatga agtggtaaat 1440
ggtaatatcg acttaaaaca agcaatagaa tcatcagata acattttctt tgctagagta 1500
gcactcgaat taggcagtaa gaaatttgaa aaaggcatga aaaaactagg tgttggtgaa 1560
gatataccaa gtgattatcc attttataat gctcaaattt caaacaaaaa tttagataat 1620
gaaatattat tagctgattc aggttacgga caaggtgaaa tactgattaa cccagtacag 1680
atcctttcaa tctatagcgc attagaaaat aatggcaata ttaacgcacc tcacttatta 1740
aaagacacga aaaacaaagt ttggaagaaa aatattattt ccaaagaaaa tatcaatcta 1800
ttaactgatg gtatgcaaca agtcgtaaat aaaacacata aagaagatat ttatagatct 1860
tatgcaaact taattggcaa atccggtact gcagaactca aaatgaaaca aggagaaact 1920
ggcagacaaa ttgggtggtt tatatcatat gataaagata atccaaacat gatgatggct 1980
attaatgtta aagatgtaca agataaagga atggctagct acaatgccaa aatctcaggt 2040
aaagtgtatg atgagctata tgagaacggt aataaaaaat acgatataga tgaataacaa 2100
aacagtgaag caatccgtaa cga 2123
<210> 157
<211> 1998
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 157
ttactgatct atatcaaatt gagtttttcc attatcatac aaatcatcat aaacttttcc 60
agatatagta gcattatagc tggccatccc tttattttga acgtctttaa cattaatcgc 120
cattaacata ttaggattat ttttattata tgaaacaaac caacctattt gtcttccagt 180
ttccccttga ttcattttta attctgctgt gccagattta ccaataattc gggcataatt 240
tttgtatata tcatccctat gtgttttatt aactacacgt tccataccat tagttaatat 300
atctatgtct tttttaggta taatatcttt tttccatatt tgagattttg ttttacgtaa 360
aacatgagga ttttgtatat ttccgttatt ttctaaagca ctgtatattg ataaaatttg 420
tatagggttt actagtatct cgccttggcc atatcctgaa tctgctaata atatttcatt 480
ttttaaatta ctatttgaga tttgtgcttt ataaaaggga taatcactcg ggatattttc 540
accgattccc aaatcttgca taccttgctc aaattttttg gctcctaatg ctaatgcaat 600
gcgggcaaaa aatatgttgt ctgatgattc tattgcttgc tttaaatcga tattgccgtc 660
tactacttta aatcttgtga tattataatt accccatgat gcatcttttt gccaaccctt 720
accataaata tcaaaattag tatttttgtc tagtttattt tcttttaagg ctataataga 780
tgttaatatt ttttgggttg aacctggtga tgtagtgatt tgaaatttgt tgagcaaagg 840
ctctttttta ttgttagtta atttacggta gtcattattg cttaatccat tcatgaatgg 900
ataaacatcg tacgatgggg tacttaccaa agctaaaatt tctccagttt ttggttgtaa 960
tgctgtacca gatccatcgt catttttcat atgtttataa atactttctt gtactctagc 1020
atctatagtt aaatgaagat cttttccgtt ttcagccttt ttctccaata atgtgtctaa 1080
aggtttattg tcataagtat ttgcaatgga taccttaaaa ccatcagtgt tttgcaattg 1140
tttatcatag aggcgttcta agcctttttt tccaataaca gtatttttgc tatagtttct 1200
aaattgctta ctttttaact cgtcagaatt aattggaccc acataaccta aaaggtgtac 1260
tgttgcttcg ttcaatggat aaacacggct ttttatagtg tttatttgta aattgtatga 1320
tttaattaat ttgtctatat attcatcttg tttatttatc tttttaattg gtacaaatga 1380
atctggctga acccattttt gattaacttt attggttata gcttttgtat caatttgtaa 1440
gtcacgagca atatcatcat atttttcttt gggtgttttg ttagggacaa taccgatttc 1500
atatgtattt ccagttttag ctaattctat accatttcta tcttttattt tgcctcgctc 1560
tgattttaat gtttctatat taattttctg tccatttttc aaaccaggta ctattacgtc 1620
tggtctccaa tctaatttcc aatgcttatc ttcataaata aagtttaatt gtgtattacg 1680
tcgtatagtt ccatattttg tatatatgtt atatttaaca tcaacttgct ttttatcttt 1740
tccagttttt ttaatttcat gattagtaat ttttaagtta ttgacactta aatctttgta 1800
aattttttta ttcctatcta caatttcttc ttctccatat gccagtttag atttttctga 1860
actattttta tatacttcgt tatagtttcc tttttcaata gaactaattg ttttctcaat 1920
atcgtcatct ttgaataacc aagttattat aatcataatt agtaaaagaa ctagcacact 1980
aatataaatt tttttcat 1998
<210> 158
<211> 686
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 158
atgacagaat acttattaag tgctggcata tgtatggcaa ttgtttcaat attacttata 60
gggatggcta tcagtaatgt ttcgaaaggg caatacgcaa agaggttttt ctttttcgct 120
actagttgct tagtgttaac tttagttgta gtttcaagtc taagtagctc agcaaatgca 180
tcacaaacag ataacggcgt aaatagaagt ggttctgaag atccaacagt atatagtgca 240
acttcaacta aaaaattaca taaagaacct gcgacattaa ttaaagcgat tgatggtgat 300
acggttaaat taatgtacaa aggtcaacca atgacattca gactattatt agttgataca 360
cctgaaacaa agcatcctaa aaaaggtgta gagaaatatg gccctgaagc aagtgcattt 420
acgaaaaaaa tggtagaaaa tgcaaataaa attgaagtcg agtttgacaa aggtcaaaga 480
actgataaat atggacgtgg cttagcgtat atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa 540
gctttagttc gtcaaggctt ggctaaagtt gcttatgttt ataaacctaa caatacacat 600
gaacaacttt taagaaaaag tgaagcacaa gcgaaaaaag agaaattaaa tatttggagc 660
gaagacaacg ctgattcagg tcaata 686
<210> 159
<211> 686
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 159
atgacagaat acttattaag tgctggcata tgtatggcaa ttgtttcaat attacttata 60
gggatggcta tcagtaatgt ttcgaaaggg caatacgcaa agaggttttt ctttttcgct 120
actagttgct tagtgttaac tttagttgta gtttcaagtc taagtagctc agcaaatgca 180
tcacaaacag ataacggcgt aaatagaagt ggttctgaag atccaacagt atatagtgca 240
acttcaacta aaaaattaca taaagaacct gcgacattaa ttaaagcgat tgatggtgat 300
acggttaaat taatgtacaa aggtcaacca atgacattca gactattatt agttgataca 360
cctgaaacaa agcatcctaa aaaaggtgta gagaaatatg gccctgaagc aagtgcattt 420
acgaaaaaaa tggtagaaaa tgcaaataaa attgaagtcg agtttgacaa aggtcaaaga 480
actgataaat atggacgtgg cttagcgtat atttatgctg atggaaaaat ggtaaacgaa 540
gctttagttc gtcaaggctt ggctaaagtt gcttatgttt ataaacctaa caatacacat 600
gaacaacttt taagaaaaag tgaagcacaa gcgaaaaaag agaaattaaa tatttggagc 660
gaagacaacg ctgattcagg tcaata 686
<210> 160
<211> 442
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 160
gatcaatctt tgtcggtaca cgatattctt cacgactaaa taaacgctca ttcgcgattt 60
tataaatgaa tgttgataac aatgttgtat tatctactga aatctcatta cgttgcatcg 120
gaaacattgt gttctgtatg taaaagccgt cttgataatc tttagtagta ccgaagctgg 180
tcatacgaga gttatatttt ccagccaaaa cgatattttt ataatcatta cgtgaaaaag 240
gtttcccttc attatcacac aaatatttta gcttttcagt ttctatatca actgtagctt 300
ctttatccat acgttgaata attgtacgat tctgacgcac catcttttgc acacctttaa 360
tgttatttgt tttaaaagca tgaataagtt tttcaacaca acgatgtgaa tcttctaaga 420
agtcaccgta aaatgaagga tc 442
<210> 161
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 161
acagaatact tattaagtgc tggc 24
<210> 162
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 162
gtttcaatat tacttatagg gatggct 27
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 163
ctgatggaaa aatggtaaac gaag 24
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 164
atggaaaaat ggtaaacgaa gc 22
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 165
tgctgagcta cttagacttg aa 22
<210> 166
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 166
gcatttgctg agctacttag ac 22
<210> 167
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 167
gttgttcatg tgtattgtta ggttt 25
<210> 168
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 168
ttattgacct gaatcagcgt tg 22
<210> 169
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 169
cgaaacatta ctgatagcca tccctataag 30
<210> 170
<211> 40
<212> DNA
<213> cgcaccgaaa cattactgat agccatccct ataaggtgcgArtific
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 170
cgcaccgaaa cattactgat agccatccct ataaggtgcg 40
<210> 171
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 171
acataagcaa ctttagccaa gccttgacg 29
<210> 172
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 172
cgcgcaacat aagcaacttt agccaagcct tgacgtgcgc g 41
<210> 173
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 173
aatctttgtc ggtacacgat attcttcacg 30
<210> 174
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 174
cgtaatgaga tttcagtaga taatacaaca 30
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 175
ttacagagtt aactgttacc 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 176
atacaaatcc agcacgctct 20
<210> 177
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 177
tkggaccmac ataacctaa 19
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 178
ggacccacat aacctaaaag 20
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 179
ctaacaaaac acccaaagaa 20
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 180
cctgaatctg ctaataatat ttc 23
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 181
tcaccaggtt caacccaaaa 20
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 182
ggccatatcc tgaatctgct a 21
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 183
gcaagcaata gaatcatcag aca 23
<210> 184
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 184
ttggtacaaa tgaatctggc tgaaccc 27
<210> 185
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 185
tgcttcgttc aatggataaa cacggc 26
<210> 186
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 186
tggctcctaa tgctaatgca atgcgg 26
<210> 187
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 187
ccgcattgca ttagcattag gagccaa 27

Claims (10)

1.检测包括MREJ型xxi核酸的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)的组合物，所述金黄色葡萄球菌包括包含mecA同系物(mecALGA251)的葡萄球菌盒染色体mec(SCCmec)元件，所述SCCmec盒被插入所述金黄色葡萄球菌染色体DNA，从而产生多态性右侧末端连接(MREJ)型xxi序列，所述多态性右侧末端连接(MREJ)型xxi序列包括来自右侧末端的多态性序列和靠近所述多态性右侧末端的染色体DNA，所述组合物包括:
第一扩增引物，所述第一扩增引物长度在10和45个核苷酸之间，其中所述第一扩增引物在标准PCR条件下与所述MREJ型xxi核酸的多态性右侧末端序列特异地杂交。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述第一扩增引物与SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补物在所述标准PCR条件下特异地杂交。
3.权利要求1所述的组合物，进一步包括：
第二扩增引物，所述第二扩增引物长度在10和45个核苷酸之间，其中所述第二扩增引物在标准PCR条件下与位于距所述SCCmec元件进入所述染色体DNA的插入点1千碱基内的金黄色葡萄球菌染色体序列特异地杂交，并且其中所述第一和第二扩增引物一起在标准PCR条件下在存在包括MREJ型xxi核酸的MRSA的情况下产生MREJ型xxi核酸右侧末端连接的扩增子。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述第二扩增引物在标准PCR条件下与orfX特异地杂交。
5.权利要求3所述的组合物，进一步包括探针，其中所述探针与所述MREJ型xxi核酸的扩增子在所述标准PCR条件下特异地杂交。
6.权利要求1所述的组合物，进一步包括引物对，所述引物对特异地与SEQ ID NO:156内的mecA序列杂交，并能扩增SEQ ID NO:156内的mecA序列。
7.权利要求1所述的组合物，进一步包括引物对，所述引物对特异地与SEQ ID NO:157内的mecC序列杂交，并能扩增SEQ ID NO：157内的mecC序列。
8.权利要求1所述的组合物，进一步包括引物对，所述引物对特异地与SEQ ID NO：158内的nuc序列杂交，并能扩增SEQ ID NO：158内的nuc序列。
9.权利要求1所述的组合物，进一步包括一种或多种另外的扩增引物，其中所述一种或多种另外的扩增引物长度在10和45个核苷酸之间，并且其中所述一种或多种另外的扩增引物与来自MREJ型i至xx MRSA的一种或多种多态性SCCmec右侧末端序列特异地杂交。
10.权利要求9所述的组合物，其中所述一种或多种多态性SCCmec右侧末端序列选自SEQ ID NOs：5至29。
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