CN102272331A

CN102272331A - 核酸的扩增和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用

Info

Publication number: CN102272331A
Application number: CN201080004048XA
Authority: CN
Inventors: A·拉尤; A·特勒施
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2009-01-05
Filing date: 2010-01-04
Publication date: 2011-12-07
Also published as: EP2373818B1; WO2010076546A1; JP5816094B2; AU2010203252B2; CN106011310A; WO2010076546A9; EP2373818A1; US9365894B2; US20110294129A1; FR2940805B1; AU2010203252A1; FR2940805A1; JP2012514452A

Abstract

本发明涉及扩增和/或检测方法，其用于除去含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；b)加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类型的碱基组成；c)在这些处理之后，在所述生物学样品中加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物；d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增和/或被检测的条件下。本发明还涉及应用所述方法的试剂盒，以及涉及所述方法或者所述试剂盒在特异性扩增和检测细菌、真细菌、真菌、泛真菌(pan-fungal)、病毒或者酵母靶中的应用。本发明优选用在诊断领域中。

Description

核酸的扩增和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用

本发明涉及一种扩增方法，其用于除去含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，在这种方法中，处理所述生物学样品以使得所述感兴趣的核酸的一种碱基转变为另一种碱基，以及导入特异于转变的核酸的引物和检测探针。本发明还涉及应用所述方法的试剂盒，以及所述方法或者试剂盒在特异性扩增和检测细菌、真细菌、真菌、泛真菌(pan-fungal)、病毒或者酵母靶中的应用。

分子生物学的进步已经使其可以操作核酸。目前体外基因扩增方法在生物学诊断中成为必不可少的工具，例如使得已知DNA或者RNA序列可以被大量拷贝，在相对短的时间内以十亿的数量级倍增。这些技术的主要缺点是不希望的核酸被扩增，导致错误的结果，即甚至在不存在所寻找的靶的情况下出现阳性结果。这些被称作由于污染所致的假阳性。

通过PCR(聚合酶链反应)、NASBA(基于核酸序列的扩增)、TMA(转录介导的扩增)或者扩增遗传学材料的任何其它技术扩增细菌靶是一种灵敏性技术，其要求使用没有所有痕量污染核酸的水溶液、酶、试剂等以及塑料容器。事实上，由于这些技术的灵敏性，这些污染核酸可以被扩增，并且可以产生假阳性，显著降低了诊断检验的可靠性。在细菌或者真菌扩增情况中这是真实存在的，甚至在泛细菌(也称作真细菌(eubacterial))和泛真菌扩增中更明显，其中使用的引物(和探针)能扩增(及检测)大多数细菌或者真菌靶。此外，在这种特殊的情况中，用于生产扩增试剂盒的大多数试剂衍生自天然来源(核苷酸、酶等)，因此外源核酸污染的潜在危险较高。因此，在用于评估生物学样品中细菌污染水平并通过扩增进行的检测中，由于使用的一些酶衍生自细菌克隆并提供可能被扩增的核酸，因此会系统地产生阳性结果，导致错误的诊断。

这种污染也可以来自环境及来自去污不良的设备，例如：实验工作台、实验人员、设备以及移液装置，甚至是塑料容器。

已经实施了针对限制这些污染的一些建议。这些建议包括例如涉及样品处理(特别是灭菌技术)或者实验设备(物理上分隔的工作带，使用排风罩，在外部和内部之间的压力梯度，以便流体总是使得以希望的方向排出等)的预防方法。

正如已经提及的，不可忽略的污染源存在于实际用于扩增反应的原材料中，如酶、试剂、塑料容器中。因此，Corless C.E.等描述了Taq聚合酶的污染对于检测RNA 16S的实时PCR灵敏性的不利影响(J.Clin.Microbiol.；(2000)；May；38(5)：1747-52)。

纠正扩增所需的酶污染第一种方式是酶促去污染方法。

由Ashkenas S.et al.(Biotechniques；2005；Jul.；39(1)：69-73)描述的酶促方法包括对含有扩增必需的所有元素的溶液进行去污染。这种方法包括在RT-PCR范围内使用限制酶混合物。这些酶使含有待扩增的靶RNA的扩增反应混合物中存在的双链DNA降解。然后在发生逆转录时，通过加热使其失活。因此也描述了这种方法在存在靶双链DNA的情况中的另一种PCR应用，但是限于使用单一类型的限制酶(Type IIS RE)。然而，使用限制酶具有仅使双链脱氧核糖核酸片段化的缺点，所述双链脱氧核糖核酸必须具有所用酶的特定限制位点。因此，没有除去单链形式的和/或具有极少这种限制位点的污染成分。

去污染的其它酶促方法包括在与核酸靶位接触之前从溶液中除去不希望的核酸。专利申请WO-A-99/07887描述了在与核酸靶位接触之前使用不耐热的DNase降解反应混合物中包含的双链脱氧核糖核酸。然后通过加热使所述酶失活。这种技术的主要缺点是在反应混合物中通过加热使这种酶失活需要使用耐热聚合酶。此外，反应混合物中存在的试剂也可以由于温度而改变。

现有技术还提示处理试剂或者原材料的非酶促方法。

因此，Mohammadi T.et al.(J.Clin.Microbiol.；2003；Oct.；41(10)：4796-8)描述了一种技术，其包括试剂的柱过滤，用于在扩增之前提取及任选通过限制酶Sau3AI消化PCR试剂。过滤技术的缺点是这些技术不能用于复合的培养基而不改变其浓度或者性质。此外，这种技术不能除去塑料容器上存在的污染物。

专利申请WO-A-94/12515描述了使用光反应性化合物处理含有Taq聚合酶及潜在污染核酸的溶液的方法。这种光反应性化合物，如呋喃香豆素(furocoumarin)衍生物，通过暴露于紫外线而活化。除了其限制性应用之外，这种技术的主要缺点是由于所述核酸的随机降解而不是非常有效，以及其可以产生仍可被扩增的片段。这种技术的另一缺点是其仅对使用的Taq聚合酶的酶制备物去污染。核酸扩增方法需要的其它试剂如水、缓冲液、塑料容器等必须通过其它方法去污染。这样需要耗时且可能昂贵的其它操作。

由Delehanty J.B.et al.，(RNA.；2005；May；11(5)：831-6)描述的另一非酶促方法应用钴复合物以抑制翻译。这种复合物使得DNA和RNA的磷酸二酯键水解。

这种技术的主要缺点是核酸的不完全降解以及缓慢的去污染反应(24小时)。

本申请人的专利申请WO-A-2008/132412描述了通过金属螯合剂使核苷酸序列失活的方法。在扩增步骤之后，片段化复合物，如双(1，10-菲咯啉)/Cu，用于对溶液存在的所有核酸去污染。这样使得可以避免新样品被得自先前扩增反应的扩增子污染。

在第一种应用的情况中，这个方法的主要问题是其未真正使所有污染核酸降解，而仅降解得自先前扩增反应的扩增子。另一方法必须在这个方法上游及并行使用，以除去核酸扩增反应需要的原材料污染。

因此仍然需要简便且有效的技术针对感兴趣的核酸处理生物学溶液或者液体生物学样品，以便极大地降低或者甚至消除进行核酸扩增需要的所有试剂以及设备上存在的污染物的影响。这也使得不必使用常规技术对试剂和环境去污染，这些技术非常复杂且通常无效，且存在再污染的危险。

本发明人因此提议用于处理含有感兴趣的核酸的溶液的一种完全新的方法，其不是对扩增反应的扩增试剂包括原材料直接去污染，而是使扩增绝对特异于初始生物学样品中存在的感兴趣的靶核酸。

为此，申请人因此提议使用化学或者酶试剂修饰生物学样品的靶核酸的序列，以转变感兴趣的核酸。这种操作可以就在扩增之前但是在加入扩增需要的试剂进行所述扩增之前进行。然后利用适于特异性杂交于转变的靶的引物和检测探针进行扩增和检测步骤，所述引物和检测探针不特异性杂交于衍生自例如试剂或者水或者塑料容器等的任何污染成分。这种方法使得在提取靶直至对其扩增期间不必对使用的所有试剂和设备进行去污染。

根据第一个实施方案，本发明涉及一种扩增方法，其用于除去含有感兴趣的希望扩增的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：

a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；

b)加入扩增引物，用以特异性扩增所述转变的感兴趣的核酸，每种引物由三种不同类型的碱基组成；

c)在这些处理之后，向所述生物学样品加入扩增所必需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物；

d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增的条件下。

根据第二个实施方案，本发明还涉及一种检测方法，其用于除去含有希望扩增和检测的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：

a)对所述生物学样品进行化学或者酶促处理，以使得所述感兴趣的核酸的至少一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；

b)加入扩增引物和检测探针，分别用以扩增和用以检测从感兴趣的核酸的扩增获得的扩增子，每种引物和探针由三种不同类型碱基组成；

c)向所述生物学样品加入扩增和检测所需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶，以及预先合成的所述引物和探针；

d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增以及产生的扩增子被检测的条件下。

无论使用哪种先前的方法，根据本发明的一个优选的实施方案，在步骤a)和b)之间进行至少一个纯化步骤。

无论使用哪种先前的方法，也根据本发明的一个优选的实施方案，在步骤a)之前进行至少一个提取所述液体生物学样品中包含的核酸的提取步骤。

根据前述任一实例，所述扩增引物对于转变的感兴趣的核酸或者与其互补的那些核酸具有特异性。

根据本发明方法的第二个实施方案，所述检测探针对于转变的靶核酸及扩增子具有特异性。

在所有前述实例及根据一个特定的实施方案，由三种不同类型的碱基组成的所述引物和/或探针含有至少一个修饰的核苷酸。

根据最后的实施方案，所述修饰的核苷酸选自α-寡核苷酸、PNA、LNA、2′-O-烷基核糖核苷酸。

根据这个最后的实施方案，所述修饰的核苷酸是2′-O-甲基核糖核苷酸。

在所有前述实例中，使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的转变是通过含硫化学剂的作用实现的。

在所有前述实例中，使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的化学剂含有亚硫酸氢根离子(HSO₃ ^-)，如亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、亚硫酸氢铵(NH₄HSO₃)、亚硫酸氢镁(MgHSO₃)、焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)、亚硫酸氢钠(sodium hydrogen sulfite)或者亚磺酸。

根据所述方法的另一实施方案，使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的酶剂是胞嘧啶脱氨酶。

根据所述方法的另一实施方案，所述化学或者酶促处理包括使一种类型的碱基转变为尿嘧啶(U)。

根据所述方法的再一实施方案，所述化学或者酶促处理包括使胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)。

根据所述方法的这个最后的实施方案，与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和/或胸腺嘧啶(T)形成，以及与所述第一引物延伸所得的链杂交的第二引物由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)形成。

可以使用酶剂代替化学剂，所述酶剂可以使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基；这种酶剂优选是腺苷脱氨酶。

根据这个最后的新实施方案，所述酶促处理包括使腺嘌呤(A)转变为次黄嘌呤。

在酶剂的情况中，与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和/或鸟嘌呤(G)形成，以及与所述第一引物延伸所得的链杂交第二引物由胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)形成。

无论使用上述何种方法，以及根据第一个实施方案，进行的扩增是RT-PCR扩增。

无论使用上述何种方法，以及根据第二个实施方案，进行的扩增是对单链进行的PCR扩增。

无论使用上述何种方法，以及根据第三个实施方案，进行的扩增是对双链进行的PCR扩增。

在后者的情况中，所述扩增是利用特异于转变的感兴趣的核酸的每条链的两对扩增引物实现的。

无论使用上述何种方法，以及根据第四个实施方案，进行的扩增是转录后扩增，如NASBA或者TMA。

在所有上述情况中，感兴趣的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。

本发明还涉及用于实施上述方法的试剂盒，特征在于其包含：

a.使得所述感兴趣的核酸的至少一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的物质；

b.扩增引物，及任选存在的检测探针，其适合于转变的感兴趣的核酸或者产生的扩增子，这些序列由三种不同类型的碱基组成；

c.扩增及任选地检测需要的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶。

根据所述试剂盒的一个实施方案，所述转变物质选自亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、亚硫酸氢铵(NH₄HSO₃)、亚硫酸氢镁(MgHSO₃)、焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)、亚硫酸氢钠(sodium hydrogen sulfite)或者亚磺酸。

根据所述试剂盒的另一个实施方案，所述物质选自腺苷脱氨酶或者胞嘧啶脱氨酶。

本发明最后涉及上述方法或者上述试剂盒在扩增和检测真细菌和/或真菌和/或病毒和/或酵母靶中的应用。

根据不同的应用，所述扩增引物特异于细菌的属，且每种检测探针特异于至少一个菌种。

如下术语可以单数或者复数形式任意使用。

术语“试剂”、“扩增试剂”、“提取试剂”或者“纯化试剂”或者“原材料”是指这样的试剂，如进行核酸提取、纯化或者酶促扩增反应所需的反应缓冲液、酶、一磷酸核苷、溶剂、盐。

“容器”或者“塑料容器”在本发明中是指任何容器，如试管、锥形瓶或者移液器吸管尖，无论其是否是塑料(例如Eppendorf管)还是玻璃或者任何其他材料。

“核酸”在本发明中是指至少两个核苷酸的序列，优选选自如下四种类型遗传密码核苷酸的至少十个核苷酸，即

如果所述核酸是DNA，则选自：

dAMP(脱氧腺苷5′-一磷酸)

dGMP(脱氧鸟苷5′-一磷酸)

dTMP(脱氧胸苷5′-一磷酸)，以及

dCMP(脱氧胞苷5′-一磷酸)；

如果所述核酸是RNA，则选自：

AMP(腺苷5′-一磷酸)

GMP(尿苷5′-一磷酸)

UMP(尿苷5′-一磷酸)，以及

CMP(胞苷5′-一磷酸)。

所述核酸也可任选地包含至少一个肌苷和/或至少一个修饰的核苷酸。术语“修饰的核苷酸”在本发明中是指这样的核苷酸，例如具有修饰的碱基、脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或者任何其它修饰的碱基的至少一种核苷酸，优选除了5-甲基胞嘧啶之外。所述核酸也可以在核苷酸间键水平修饰，如硫代磷酸酯、H-磷酸酯、烷基磷酸酯，在主链水平修饰，如α-寡核苷酸(FR-A-2,607,507)或者聚酰胺核酸(PMA)(Egholm M.et al.；J.Am.Chem.Soc.；1992；114；1895-97)或者2′-O-烷基-核糖核苷酸和/或2′-O-氟代核苷酸和/或2′-胺核苷酸和/或阿拉伯糖核苷酸，以及LNA(SunB.W.et al.，Biochemistry；2004；Apr 13；43(14)：4160-69)。在2′-O-烷基-核糖核苷酸中，优选2′-O-甲基-核糖核苷酸，但是也可以使用5-丙炔基嘧啶寡核苷酸(Seitz O.，Angewandte Chemie International Edition 1999；38(23)；Dec：3466-69)。

术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸。

在本发明中，“生物学样品”或者“液体生物学样品”是指可含有核酸的任何样品。后者可提取自患者的组织、血、血清、唾液或者循环细胞，或者可以衍生自农产品或者食物产品，或者可以源于环境。提取是通过本领域技术人员已知的任何方案进行，例如根据专利EP-B-0,369,063所述分离方法进行。

“污染物”或者“污染酸”或者“污染核酸”或者“污染成分”在本发明中是指其扩增是不希望的且在检测期间可产生假阳性结果的任何核酸。

术语“亚硫酸氢盐(bisulfite)”在本发明中是指其反应组分是亚硫酸氢根离子的任何化学试剂。本领域技术人员能例如使用亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、亚硫酸氢铵(NH₄HSO₃)、亚硫酸氢镁(MgHSO₃)、焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)、亚硫酸氢钠(sodium hydrogen sulfite)或者亚磺酸作为所述化学试剂。优选所述化学试剂是焦亚硫酸钠。

“扩增”或者“扩增反应”是指本领域技术人员熟知的任何核酸扩增技术，如：

-PCR(聚合酶链反应)，在专利US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中描述，以及其衍生的RT-PCR(逆转录PCR)，尤其是一步形式的RT-PCR，其在专利EP-B-0,569,272中描述。优选使用单一引物对对单链进行PCR。

-LCR(连接酶链反应)，例如在专利申请EP-B-0,201,184中揭示，

-RCR(修复链反应)，在专利申请WO-A-90/01069中揭示，

-3SR(自主序列复制)，在专利申请WO-A-90/06995中描述，

-NASBA(基于核苷酸序列的扩增)，在专利申请WO-A-91/02818中描述，

-TMA(转录介导的扩增)，在专利US-5,399,491中描述，和

-RCA(滚环扩增)，在专利US-6,576,448中描述。

-RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)。

在本发明中，“靶”或者“核酸靶”或“核靶(nucleic target)”或者“感兴趣的靶”或者“感兴趣的核酸”是指待扩增和/或检测的核酸(寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转移RNA)。所述靶可以自细胞提取或者化学合成。所述靶可以游离于溶液中或者可以结合固体支持物。

术语“溶液”是指均质或者异质水溶液。

“固体支持物”是指颗粒，其可以是橡胶、玻璃(CPG)、二氧化硅、聚苯乙烯、琼脂糖、琼脂糖(Sepharose)、尼龙等。这些材料可任选使得磁性材料包囊。其也可以是滤膜、薄膜、膜或者条带。这些材料为本领域技术人员熟知。

靶可以是以DNA和/或RNA的单链或者双链形式存在于混合物中的病毒、细菌、真菌或者酵母的核酸。通常地，所述靶的长度在50-10000个核苷酸之间，但是最通常在100-1000个核苷酸之间。

术语“天然靶”，称作CNT，在本发明中是指待扩增的靶核酸，由至少四种核苷酸的核苷酸序列组成，所述核苷酸的碱基是四种不同类型的碱基，选自：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶(对于DNA而言)或者尿嘧啶(对于RNA而言)。任选地，可以存在如先前所述修饰的核苷酸。当然，使得CNT扩增的所谓的天然引物被称作PNT1和PNT2。如果同时存在几个扩增，则所述引物例如被称作PNT1a和PNT2a(对于第一对引物)及PNT1b和PNT2b(对于第二对引物)。

术语“转变的靶”或者“四种碱基的靶”称作C4B，是指靶或者靶核酸已经用化学剂或者酶剂处理，使得由核苷酸携带的一种类型的碱基转变为另一种不同类型碱基。核苷酸的数目和顺序不被所述化学剂或者酶剂的作用改变。所述转变的靶核酸(C4B)因此具有与未转变的靶核酸(CNT)相同的核苷酸总数，但是由其中至少一种类型的碱基被改变为另一种类型的碱基的核苷酸序列组成。优选地，所述转变的靶由具有选自如下类型的碱基的核苷酸序列组成：腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和次黄嘌呤。

所述四种碱基靶可因此是已经由亚硫酸氢盐转变的待扩增的靶核酸，即：

·腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶未改变，但是胞嘧啶被转变为尿嘧啶(对于DNA而言)。

·腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶未改变，但是胞嘧啶也被转变为尿嘧啶(对于RNA而言)。在这种情况中，所述转变使得可以获得具有三种碱基的转变的靶，天然存在的尿嘧啶保持未改变，而胞嘧啶被转变为尿嘧啶。该RNA由仅具有三种类型碱基的核苷酸序列组成，即腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶。

为了简化使用的术语，术语C4B用于描述转变的DNA靶(四种碱基)，但是也用于描述转变的RNA靶(三种碱基)。在任何情况中，这不影响使用上游引物称作P3B1及下游引物称作P3B2的特异性引物从C4B开始的靶核酸的扩增，所述扩增子C3B总是具有三种碱基(见下文)。同样，在多重扩增的情况中，所述特异性引物被称作P3B1a和P3B1b(对于上游引物而言)，及被称作P3B2a和P3B2b(对于下游引物而言)。

这种转变可应用胞嘧啶脱氨酶，其中：

·腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶不改变，但是胞嘧啶被转变为尿嘧啶(对于DNA而言)。

·腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶未改变，而胞嘧啶也被转变为尿嘧啶(对于RNA而言)(见专利EP-B-1,654,388所述)。在这种情况中，转变使得可以获得具有三种碱基的转变的靶，天然存在的尿嘧啶保持未改变，而胞嘧啶被转变为尿嘧啶。该RNA由仅具有三种类型碱基的核苷酸序列组成，即腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶。同样，为了简化所用术语，术语C4B也用于描述转变的RNA靶。在任何情况中，这不影响使用上游引物称作P3B1及下游引物称作P3B2的特异性引物从C4B开始的靶核酸的扩增，所述扩增子C3B仍然具有三种碱基(见下文)。

这种转变可应用腺苷脱氨酶，其中：

·胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶不改变，但是腺嘌呤被转变为次黄嘌呤(对于DNA而言)。

·胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶不改变，但是腺嘌呤被转变为次黄嘌呤(对于RNA而言)。

就此可以提及文献Gerber A.P.et al.Science；1999；Nov 5；286(5442)：1146-49。

术语“三种碱基的靶”称作C3B，在本发明中是指利用上游(或者正向)引物称作P3B1以及下游(或者反向)引物称作P3B2的特异性引物从C4B中扩增的靶核酸，如下文描述。

术语“碱基的类型”是指碱基的种类，即腺嘌呤(A)、或者胸腺嘧啶(T)、或者胞嘧啶(C)、或者鸟嘌呤(G)、或者尿嘧啶(U)，或者次黄嘌呤，不论事实其与核糖相关(任选是取代的，例如通过2′-O-甲基基团的存在)以及任选具有1、2或者3个磷酸基团。

“三种碱基的引物”称作P3B1和P3B2，在本发明中是指由修饰或未修饰的至少三种核苷酸组成的单链核苷酸序列，由选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶的三种不同类型碱基组成。所述三种碱基的有义引物(P3B1)与转变的靶核酸(C4B)的至少一部分序列互补，或者与自反义引物开始合成的核酸(扩增子)的至少一部分核苷酸序列互补，并且在存在扩增试剂条件下作为核酸合成的起始点。所述反义三种碱基的引物(P3B2)与从有义引物合成的核酸的至少一部分核苷酸序列互补。这些引物的大小在10-100个核苷酸之间，优选在12-50个核苷酸之间，更优选在15-30个核苷酸之间。

根据使用的扩增技术，除了与转变的靶的杂交序列之外，在NASBA或者TMA型转录后扩增的情况中，引物还可包含启动子(例如T3、T7或者SP6)的核苷酸序列。本领域技术人员熟知在这些转录后扩增的情况中，引物由这样的序列的一部分组成，即所述序列的核苷酸序列由四种不同类型碱基的核苷酸组成(启动子序列)，以及所述序列的核苷酸序列由三种不同类型碱基的核苷酸组成(使得引物与转变的靶杂交的序列)。

“检测探针”或者“探针”称作SNT，是指选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶的四种不同类型碱基的核苷酸序列的核酸序列，其能与扩增子特异性杂交且携带至少一种标记物。所述探针可以是圆形探针(称作O-探针，见本申请人在2008年7月4日提交的专利申请FR08/54549)、分子信标、Taqman

探针或者FRET探针。后三种类型的探针为本领域技术人员熟知。这些探针可任选完全或者部分由修饰的核苷酸组成。每种探针具有一种标记物及任选一种猝灭剂。

“标记物”是指由核苷酸携带的分子。所述标记物与核苷酸之间的键合可以通过本领域技术人员已知的各种方式实现。人工偶联是使用携带活性基团、典型为羧基或者硫醇的标记物进行，其与修饰携带相应反应基团(例如胺或者硫醇)的修饰的内部核苷酸偶联，或者与用这些相同的反应基团修饰的核苷酸链的一端偶联。自动偶联是使用携带所述标记物的亚磷酰胺进行，然后根据使用的亚磷酰胺的类型在核苷酸链的自动合成期间与链的一端或者与内在部位发生偶联。所述标记物可以是荧光团或者荧光猝灭剂。

“荧光团”是指当通过适当波长的光激发时发出荧光信号的分子。所述荧光团特别地可以是罗丹明(rhodamine)或者衍生物如德克萨斯红(TexasRed)、荧光素或者衍生物(例如FAM)、Alexa家族荧光团如Alexa 532和Alexa647、Alexa 405、Alexa 700、Alexa 680、Cy5或者根据使用的测量仪器的合适的任何其它荧光团。可用于检测探针的荧光团非常各式各样并且为本领域技术人员已知。

在本发明中，“荧光素”是指芳香族化学分子，当其由490-500am波长、优选495am波长的光激发时发出荧光信号，最大发射在大约530nm。

“荧光猝灭剂”或者“猝灭剂”是指干扰荧光团发出荧光的分子。这种猝灭剂可选自非荧光芳香族分子，以避免寄生发射。优选地，所述猝灭剂是Dabsyl或者Dabcyl或者″Black hole quencher^TM″(BHQ)，其是非荧光芳香族分子，当其物理上接近荧光团时阻止荧光发射。也可以使用荧光共振能量转移(FRET)技术，如Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes，p.4，Ed.V.V.Didenko，Humana Press 2006，ISSN 1064-3745所述。所述猝灭剂也可以选自荧光分子，如TAMRA(羧基四甲基若丹明)。

“三种碱基的检测探针”或者“三种碱基的探针”称作S3B，是如前述的探针，并且其除了前述特性之外，还是由选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶的三种不同类型碱基的核苷酸序列组成。本领域技术人员易于理解，根据探针的形式(分子信标(Beacon)，O-探针等)，所述探针由这样的序列的一部分组成，即所述序列的核苷酸序列由四种不同类型碱基组成，以及所述序列的核苷酸序列由三种不同类型碱基组成(使得扩增子杂交和检测的序列)。

在某些情况中，为了改良与扩增子的杂交及因此的检测，如果必要则本发明的探针可含有尿嘧啶代替胸腺嘧啶。在这种情况中，本发明的探针由具有四种不同类型碱基(尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶)的核苷酸序列组成。为了简化使用的术语，术语“三种碱基的探针”或者S3B也用于描述需要更好杂交的这种类型的探针。在任何情况中，这不影响C3B扩增子和/或互补链C3Bc的检测，所述C3B和C3Bc扩增子总是具有三种碱基(见上文所述)。

为了更好地理解本发明的原理，我们采用了其假定序列如下所示(SEQID No.1)的靶作为实例，其相应于CNT。在用亚硫酸氢盐转变的范围内，所述4种碱基的靶、3种碱基的靶以及引物和探针具有如下序列：

·CNT：5′-ATCGAAATTTCCCGGGATCG-3′，SEQ ID No.1

·C4B：5′-ATUGAAATTTUUUGGGATUG-3′，SEQ ID No.2

·P3B1：3′-TAAC-5′，SEQ ID No.3

·C3B：3′-TAACTTTAAAAAACCCTAAC-5′，SEQ ID No.4

·P3B2：5′-ATTG-3′，SEQ ID No.5，以及

·S3B：3′-AAAAAA-5′，SEQ ID No.6。

C3B因此与C3Bc互补：

·C3B：3′-TAACTTTAAAAAACCCTAAC-5′，SEQ ID No.4

·C3Bc：5′-ATTGAAATTTTTTGGGATTG-3′，SEQ ID No.7

其与CNT完全不同：

·CNT：5′-ATC

GAAATTTCCC

GGGATC

G-3′，SEQ ID No.1

·C3Bc：5′-ATTGAAATTTTTT

GGGATTG-3′，SEQ ID No.7

“杂交”是指这样的过程，在此期间在合适条件下，具有完全或者部分互补序列的两个单链核苷酸片段能形成由核酸碱基之间的氢键稳定的双链或者“双链体”。所述杂交条件由严格性确定，即严格和低盐度运行条件。当用较高严格性条件进行时，杂交的特异性增加。严格性特别地定义为探针/靶双链体的碱基成分的函数以及通过两个核酸之间的错配而定义。严格性也可以是反应参数的函数，如杂交溶液中存在的离子的浓度和类型、变性剂的性质和浓度和/或杂交温度。其中杂交反应必定进行的条件的严格性主要依赖于使用的杂交探针。所有这些数据均为本领域技术人员熟知，且可以由技术人员确定适当条件。

术语“Ceq”定义为细胞当量，是在真细菌PCR扩增中使用的一个单位，其相应于1000拷贝的DNA。一个细胞可含有大约10³个拷贝的RNA16s(真细菌引物和探针的靶)。

实施例和附图代表本发明的具体实施方案，不限制本发明的范围。

-图1示出在扩增之前应用亚硫酸氢钠转变核酸靶的步骤的优势。如果扩增是常规进行的，即使用天然靶(未转变的靶，在图中被称作天然的或者CNT)及使用正常核苷酸引物(在图中被称作PNT1和PNT2)进行，则扩增混合物中天然存在的污染物任选与感兴趣的靶共扩增。相反，如果在图中被称作C4B的靶在扩增之间被转变，以及使用针对转变的靶设计的被称作P3B1和P3B2的三种碱基的核苷酸引物进行扩增，则仅这个特定靶将被扩增和检测。尽管仍存在于溶液中，但是污染物不能被扩增。事实上，本发明的引物，三种碱基的引物P3B，不能与具有四种不同类型碱基的的核苷酸的污染核酸杂交，甚至不能非特异性杂交。从转变的靶C4B开始的扩增反应提供在图中被称作C3B的扩增子，然后提供与C3B链互补的C3Bc。本发明对于细菌、真细菌、真菌、泛真菌、病毒或者酵母的靶的扩增(NASBA、PCR、RT-PCR、TMA等)特别有益。

-图2描述了使得胞嘧啶碱基转变为尿嘧啶碱基的化学反应(根据Hayatsu H.；Mut.Research；2008；659：77-82所述进行)。

-图3示出通过具有电喷雾离子化(ESI)的质谱分析对DNA组分的分析谱。这个分析在由亚硫酸氢钠转变之前(a)和之后(b)对DNA靶进行。横坐标示出以分钟表示的时间，纵坐标示出任意单位的吸光度。M+H值表示分子的分子量，其中加入了1摩尔质子的质量。例如，脱氧胞嘧啶的存在通过出现相应于这个分子的质量而证实。

-图4是在用不同类型扩增引物(如前述PNT或者P3B)进行的真细菌NASBA扩增中阴性对照(所述靶用水代替)的对比。扩增子的检测通过测量在488nm的荧光而实时实现，所述荧光以任意单位(相对荧光单位RFU)在纵坐标上示出；横坐标示出以分钟表示的经过时间(elapsed time)。实验条件(a)相应于用引物(PNT)和天然检测探针(SNT)进行的阴性对照的扩增和检测。实验条件(b)相应于用三种碱基的引物(P3B)和三种碱基的检测探针(S3B)进行的阴性对照的扩增和检测。

-图5是当转变的靶是双链DNA时根据本发明原理的PCR扩增示意图。需要两个引物对P3B进行该扩增。

-图6示出在真细菌NASBA扩增中系列稀释的靶的对比。扩增子的检测通过在488nm测量作为时间(分钟，横坐标)的函数的荧光(任意单位RFU，纵坐标)而实时实现。

·图6A：由四种不同类型碱基组成的合成靶(CNT)的0-10^e7拷贝的稀释系列的扩增(引物PNT)和检测(探针SNT)。

·图6B：由三种不同类型碱基组成的合成靶(C3Bc)的0-10^e7拷贝的稀释系列的扩增(引物P3B)和检测(探针S3B)。

-图7示出真细菌PCR扩增。扩增子的检测通过在每个循环结束时测量在488nm的荧光(任意单位RFU)而实现。横坐标示出循环次数，纵坐标示出任意单位的荧光。

·图7A：由四种不同类型碱基组成的合成靶(CNT)的0-10^e5拷贝的稀释系列的扩增(引物PNT)和检测(探针SNT)。

·图7B：由三种不同类型碱基组成的合成靶(C3Bc)的0-10^e5拷贝的稀释系列的扩增(引物P3B)和检测(探针S3B)。

-图8示出大肠杆菌的gDNA的系列稀释物的真细菌PCR扩增。扩增子的检测如已经提及的通过在每个循环结束时测量在488nm的荧光而实现。如前所述，横坐标示出循环次数，纵坐标示出任意单位的荧光。

·图8A：0-10^e5拷贝的大肠杆菌的gDNA的稀释系列的扩增(引物PNT)和检测(探针SNT)。

·图8B：通过用亚硫酸氢盐处理而转变的0-10^e5拷贝的大肠杆菌的gDNA(C4B)的稀释系列的扩增(引物P3B)和检测(探针S3B)。

参考图1和图2，更准确地，如下所述进行通过亚硫酸氢钠对靶进行转变。这是包括四步骤的方案：

(1)首先，转变自用氢氧化钠(NaOH)使所述靶变性开始，然后加入亚硫酸氢钠和氢醌(后者可限制亚硫酸氢盐的氧化)。

(2)然后通过柱过滤纯化所述靶。

(3)在碱性介质中对所述靶进行脱磺酸化。

(4)最后，最后的柱纯化提供准备扩增的转变的靶。

现有技术领域已知通过亚硫酸氢盐对核酸的化学转变。关于此，发现如下证据：

1)由Shapiro及由Hayatsu进行的非常早期的工作，其中：

·″Reaction of Cytosine and Uracil with sodium bisulfite″Shapiro R.et al.，J.Biol.Chem.；1973；Jun；248：4060-64，

·″The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine″Hayatsu H.etal.，J.Am.Chem.Soc.；1970；40(26)：724-26。

这证明了在这个领域已经公布了许多文献，但是在那时未确切定义诊断学应用。

2)涉及用亚硫酸氢盐处理DNA的专利申请，使用非简并引物扩增属于同一原始种的一套核酸：

·细菌(WO-A-2006/058393和WO-A-2007/140506)，

·病毒(WO-A-2007/030882)。

3)用亚硫酸氢盐处理核酸以检测DNA基因组序列的甲基化基序的方法的改良，″High Sensitivity mapping of methylated cytosines″by Clark S.J.，Nucleic.Acids Res.；1994 August 11；Vol.22(15)：2990-97。

4)用亚硫酸氢盐处理核酸的新开发的方法，所述处理适合固定在固体支持物上的核酸(EP-B-1,590,362和EP-A-1,394,173)。

5)概括本领域用亚硫酸氢盐处理核酸以对基因组DNA进行测序及鉴别甲基化胞嘧啶基序状况的出版物。这个概要由亚硫酸氢盐技术的开发者描述：Hayatsu H.，Mut.Research；2008；659：77-82。

因此明了使用亚硫酸氢盐进行转变的化学在35年前已经充分描述。相反，用于在靶核酸的提取、纯化和扩增期间使用的试剂所致污染核酸的化学或者酶促转变方法确定未描述或者甚至未提及。

我们的发明因此涉及转变的靶的特异性扩增，而无由于污染核酸所致的背景噪音。

本发明的目的因此是提供具有如下优势的一种方法：

1)简便且快速，

2)就在扩增步骤之前可使用，

3)能以高产量转变靶，

4)与众多的扩增技术包括PCR以及所谓的转录后扩增(NASBA和TMA)相容，

5)可以自动进行，且可以适合固体和/或磁性支持物。

目的：

为了证实亚硫酸氢盐使具有四种不同类型碱基A、T、G、C的生物学靶(即A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶))转变为具有四种碱基A、T、G和U(尿嘧啶)的靶。

程序：

所述转变是使用商购试剂盒ZYMO-EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，ZYMO Research，#D5005(Orange，CA 92867-United States of America)，根据该试剂盒提供的方案进行。

被转变的靶是从大肠杆菌O157，#IRMM449-1EA，Sigma-AldrichChimie(L′Isle d′Abeau Chesnes-FRANCE)中提取的具有500-4000个双链核苷酸的基因组DNA商购样品。

通过亚硫酸氢盐转变：根据所述试剂盒提供的方案，将130μl的CT转化试剂加入20μl样品(相应于从大肠杆菌中提取的200ng基因组DNA)中。将混合物在98℃保温10分钟，以使大肠杆菌的基因组靶变性，然后在64℃保温150分钟及在4℃保温5分钟(Thermocycler Applied BiosystemsGeneAmp 9700，Foster City，U.S.A.)。由此提供了含有转变的靶的溶液。

纯化：将在该试剂盒中被称作结合缓冲液的600μl固定缓冲液加入150μl含有转变的靶的溶液中。将该混合物置于所述试剂盒提供的柱上，并在10,000×g离心30秒。将100μl体积的洗涤缓冲液置于柱上，在12,000×g离心30秒。

脱磺酸化：将200μl体积的脱磺酸化缓冲液置于同一柱上，在室温保温15分钟，然后在12,000×g离心30秒。然后通过加入200μl洗涤缓冲液将该柱洗涤两次，及在12,000×g离心30秒。

洗脱：将该柱置于清洁的管中。在该柱的中心加入称作M-洗脱缓冲液的10μl体积的洗脱缓冲液，在12,000×g离心30秒。10μl洗脱液含有通过亚硫酸氢盐转变的DNA，准备用于扩增。

然后将转变的大肠杆菌gDNA样品用核酸酶P1(13U)(N8630-1VL，Sigma Aldrich，St Louis，U.S.A.)和碱性磷酸酶(3U)(P7923-2KU，SigmaAldrich，St Louis，U.S.A.)的混合物在37℃水解过夜。然后通过HPLC分析水解的基因组DNA。

HPLC及通过电喷雾离子化质谱分析检测的条件

为此，我们使用：

·WATERS Alliance 2795HPLC链(Milford，Connecticut(CT)USA)，

·WATERS XTerra MS C18柱(Milford，CT，USA)4.6×30 2.5μm，使用在30℃流速为1ml/分钟(在260nm检测)，在10mM甲酸铵pH 7中的乙腈的线性梯度：0％-5％(4分钟)、5％-12％(5分钟)、12％-90％(2分钟)及90％-0％(3分钟)。

·PDA 996二极管阵列检测仪，软件Empower第二版(Milford，CT，USA)，

·质量检测仪(ZQ Electrospray WATERS((Milford，CT，USA)。

结论：

图3(a)示出通过电喷雾离子化(ESI)质谱分析对未用亚硫酸氢盐转化的大肠杆菌中水解的gDNA组分的分析结果。可见四个主要的峰，相应于四种类型的核苷：脱氧腺苷dA、脱氧胸苷dT、脱氧鸟苷dG、脱氧胞苷dC，及痕量的脱氧肌苷dI。脱氧肌苷来自腺苷脱氨酶对脱氧腺苷的酶促作用。腺苷脱氨酶是在商业碱性磷酸酶制备物中以痕量水平发现的污染物。

图3(b)示出对在通过亚硫酸氢盐转变后来自大肠杆菌的水解的gDNA的组分的分析。在此出现一个新的洗脱峰(峰7)，相应于脱氧尿苷dU，以及几乎消失的(quasi-disappearance)dC峰(峰2)。其它洗脱峰(峰3、4和5)未变，相应于dG、dT和dA的存在。这个层析图示出这个DNA由四种核苷组成，即dU、dA、dT和dG。

在这个实施例中，这些实验条件中的转变效率是80％。这个效率是待处理的感兴趣的DNA大小的函数。对DNA的短片段，转变程度(或者效率水平)更高。在我们的实验条件下处理的DNA是来自大肠杆菌的基因组DNA，即较长的靶DNA，非常难以变性和转变。然而，已经证实大多数dC转变为dU。

目的：

为了提供证据，即证实使用三种碱基的引物(P3B1和P3B2)和碱基探针(S3B)进行的真细菌NASBA可以扩增及特异性检测三种碱基的合成靶，而不扩增天然靶(CNT)，如污染的细菌靶。

利用四种碱基的检测探针(SNT)或者三种碱基的检测探针(S3B)实现实时检测。

程序：

这个检验通过进行真细菌NASBA扩增而进行，一方面使用：

-称作CNT的四种碱基的寡核苷酸靶的稀释系列，四种碱基的引物(称作PNT1和PNT2)及四种碱基的检测探针(SNT)，所述四种类型的碱基是A、T、G和C；

另一方面使用：

-称作C3B的三种碱基的寡核苷酸靶的稀释系列，引物(P3B1和P3B2)及可以与C3B杂交三种碱基的检测探针(S3B)。

所述稀释系列是每个检验0-10⁷拷贝的靶。

所述寡核苷酸靶、引物和探针以其本身从Eurogentec，Seraing，Belgium定制，未被亚硫酸氢盐转变，并具有如下所示序列：

靶CNT(SEQ ID No.8)：

5′-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGCTACAACTGTCGTCAGCTCGTGTTCCGCGGGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCT-3′，

引物PNT1(SEQ ID No.9)：

5′-aattctaatacgactcactataggGCGGGACTTAACCCAACATC-3′

引物PNT2(SEQ ID No.10)：

5′-ggagcatgtggtttaattcg-3′

检测探针SNT(SEQ ID No.11)：

TWTCGTCAGCTCGTGT

W＝2′-O-Me-鸟苷。

靶C3B(SEQ ID No.12)：

5′-TGGAGTATGTGGTTTAATTTGTTATAATTGTTGTTAGTTTGTGTTTTGTGGGATGTTGGGTTAAGTTTTGTAATGAGTGTAATTTTTATTTT-3′

引物P3B1(SEQ ID No.13)：

5′-aattctaatacgactcactataggACAAAACTTAACCCAACATC-3′

引物P3B2(SEQ ID No.14)：

5′-GGAGTATGTGGTTTAATTTG-3′

检测探针S3B(SEQ ID No.15)：

TWTTGTTAGTTTGTGT

W＝2′-O-Me-鸟苷。

在这些序列中，启动子T7的序列相应于小写字母所示，检测探针是分子信标，环的序列以大写字母表示，茎的序列以粗体的小写字母表示。

根据试剂盒NASBA NucliSENS EasyQ HIV-1 v1.2(Ref.285 036，bioMérieux，Marcy l′Etoile，France)中提供的厂商指导进行NASBA。简而言之，如下所述制备扩增混合物(Mix)和酶混合物。

扩增混合物(8管的量)：

·NASBA级别的水，称作NASBA水，11.2μl，

·试剂稀释剂：64μl

·KCl：12.8μl

·试剂的sphere：1 sphere

·引物与探针的混合物：8μl。

酶混合物(8个试管的量)：

·酶稀释剂：45μl(8个试管)，及

·酶sphere：1sphere。

设置：将10μl体积的扩增混合物置于0.2-ml试管中，向其中加入5μl体积的靶核酸。将5μl体积的酶混合物置于该管的塞子中。将该管盖上，在65℃保温5分钟，然后在41℃保温5分钟。将该管不搅拌简短离心，以组合这两种混合物，然后在NucliSens EasyQ荧光计(Ref.200309，bioMérieux，Marcy l′Etoile，France)中在41℃保温90分钟(标准程序QL1-90)。在反应期间在488nm读取荧光。

发现相应于图4曲线(a)的靶CNT的NASBA扩增使污染核酸非常强地扩增，而在在四种碱基的靶的NASBA扩增情况中，在图4曲线(b)中的该信号保持非常弱。这个结果证实几乎没有引物P3B1和P3B2对污染物的扩增，及几乎没有通过探针S3B对其检测。

图6A示出使用引物PNT1和PNT2进行的NASBA扩增没有使得特定靶CNT(每个检验的浓度为0-10⁷个拷贝)与阴性对照组(每个检验0个拷贝)有所区别。

相反，使用引物P3B1和P3B2对三种碱基的靶C3B进行的NASBA扩增(图6B)以良好的检测灵敏性给出的特定靶C3B的稀释系列。在这个实施例中，灵敏性是每个检验10³个拷贝。

结论：

这个实验清晰示出这种对三种碱基的靶的扩增的益处，使得靶的检测灵敏性增加大约4个对数级。在靶CNT的NASBA扩增中，阴性对照物通过相应于大约10^e7拷贝/检验的信号鉴别，而在靶C3B的NASBA扩增中这个信号低于10^e3拷贝/检验。

目的：

为了证实在通过使用特异于三种碱基的靶(C3B)的三种碱基的引物(P3B)进行真细菌PCR扩增之后，使得三种碱基的合成的细菌靶(C3B)的检测灵敏性相对于通过使用四种碱基的引物(PNT)和四种碱基的探针(SNT)对天然靶(CNT)进行真细菌PCR扩增增加。

程序：

使用称作TaqmanSNT或S3B的荧光检测引物和探针进行真细菌PCR扩增。所述靶是具有92个核苷酸的合成的寡核苷酸，具有四种碱基的序列(对于CNT是A、T、G、C；SEQ ID No.8)或者三种碱基的序列(对于C3B是A、T、G；SEQ ID No.12)。对0-10⁵拷贝/检验的不同稀释度的靶进行扩增。

根据试剂盒Roche LightCycler FastStart DNA Master Hyprobe，#030003248001(Basle，Switzerland)中提供的厂商指导进行扩增。使用的引物和探针的序列如下所示：

对天然靶，靶CNT进行PCR：

·引物PNT1a(SEQ ID No.16)：

5′-AGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGG-3′

·引物PNT2a(SEQ ID No.17)：

5′-TGGAGCATGTGGTTTAATTC-3′

·探针TaqMan

SNTa(SEQ ID No.18)：

5′-FAM-TWTCGTCAGCTCGTGT-BHQ1-3′with W＝2′-OMe-G

对三种碱基的靶，靶C3B进行PCR：

·引物P3B1a(SEQ ID No.19)：

5′-AAAATAAAAATTACACTCATTACAAA-3′

·引物P3B2a(SEQ ID No.20)：

5′-TGGAGTATGTGGTTTAATTT-3′

·引物TaqManS3Ba(SEQ ID No.21)：

5′-FAM-TGTTGYYKWYYYGTGT-BHQ 1-3′，Y＝2′-OMe-U，W＝2′-OMe-G，K＝2′-OMe-A。

核苷酸2′-O-Me使得可以补偿杂交温度的丧失(与三种碱基的探针的序列中C碱基的消失相关)。这个TaqMan

探针的设计中尿嘧啶(在这种情况下是修饰的尿嘧啶)的点导入使得可以改良与扩增子的杂交。

扩增混合物(一个管)：

·用于PCR的水：10.4μl

·引物P1(10μM)：1μl

·引物P2(10μM)：1μl

·探针(2.5μM)：2μl

·MgCl₂(25mM)：1.6μl

·扩增混合物(10×Master Mix)：2μl.

将最终的扩增混合物在95℃预保温10分钟，然后进行45次循环扩增，所述循环包括在95℃变性10秒钟，在50℃杂交15秒钟，及在60℃延伸15秒钟。通过在95℃保温5分钟终止扩增。在延伸循环期间在530nm读取荧光。

图7A示出在低于每个检验10³个拷贝CNT靶的条件下，PCR信号与阴性对照(0个拷贝)的信号不能区分。真细菌PCR对于CNT靶的灵敏性因此是10³个拷贝/检验。

在图7B中，对三种碱基的寡核苷酸靶(C3B)进行的真细菌PCR示出与阴性对照(0个拷贝/检验)保持水平曲线的极佳灵敏性，灵敏性高于10个拷贝/检验。

结论：

这个实验证实对三种碱基的合成靶C3B使用真细菌PCR扩增增加灵敏性4个对数级。

三种碱基的靶扩增的灵敏性不依赖于使用的扩增技术和检测方式。这些实验示出无论使用的扩增技术和三种碱基的检测探针的形式如何，本发明的三种碱基的靶的扩增灵敏性远高于天然靶(CNT)的常规扩增的灵敏性。

目的：

在对合成模型(实施例2和3)的证实之后，对通过亚硫酸氢盐实验性转变的真实生物学模型进行测定。目的是证实细菌靶在转变及使用特异于转变的靶的P3B扩增引物进行PCR扩增后，检测灵敏性增加。

程序：

这个证实是使用商购转变试剂盒(Zymo Research)并根据该试剂盒供应商的指导进行(参见实施例1)。所述转变是对大肠杆菌(O157，SigmaIRMM449-1EA)的基因组DNA提取物进行，其由50-4000个核苷酸的核酸组成。以与实施例3所述那些相同的实验条件、相同引物和相同检测探针进行真细菌PCR扩增。在延伸循环期间在530nm读取荧光。

图8A相应于其中来自大肠杆菌的靶DNA未用亚硫酸氢盐处理的实验条件。该DNA因此由具有四种不同类型碱基即A、T、G和C的核苷酸序列组成。该DNA的扩增产生由四种不同类型碱基(A、T、G和C)的序列组成的扩增子。

图8B相应于其中来自大肠杆菌的DNA在用亚硫酸氢盐处理后被转变的实验条件。这种转变的DNA(4种碱基的转变的靶)由具有四种不同类型碱基即A、T、G、U的核苷酸序列组成。使用本发明的引物(3种碱基的引物)转变的该DNA的扩增产生由具有三种不同类型碱基A、T、C或者A、T、G的核苷酸序列组成的扩增子。

如图8A所示，在来自大肠杆菌的未转变的DNA的真细菌PCR扩增的情况中，灵敏性水平为1000Ceq/检验。在0Ceq/检验的阴性对照与100Ceq/检验分不清。这个图示出在低于100,000个拷贝的靶DNA的阈值下，不能区分靶DNA与使用的各种试剂中存在的污染DNA。

图8B示出在通过亚硫酸氢盐对样品进行转变及真细菌PCR扩增之后，获得的灵敏性水平为0.1-1Ceq/检验。阴性对照提供非常弱的信号。这个实验证实本发明的方法使得可以规避所有污染物，因此获得灵敏性的显著增加。

此外，尽管在我们的实验条件下来自大肠杆菌的基因组DNA的转变效率是80％(见上述)，但是检测灵敏性相对较高，且不出现受未转变的20％的大肠杆菌基因组DNA的影响。因为这20％的基因组DNA在其碱基类型水平未改变，其自动变成污染物且不被本发明的方法扩增。

结论：

对通过亚硫酸氢盐转变的细菌DNA靶进行真细菌PCR扩增的这个实施例清晰证实通过对样品进行这种处理可以增加灵敏性。事实上，所述灵敏性增加4个对数级。通过应用预先用亚硫酸氢盐处理的扩增技术，得自阴性对照的信号可以关闭(turned off)，即使转变处理的效率水平未接近100％。

因此本发明提供了完全避免在提取、纯化和扩增试剂中存在的细菌污染物的选择方法。

Claims

1.一种扩增方法，其用于除去含有希望扩增的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：

d)将所述溶液和试剂置于使得转变的核酸被扩增的条件下。

2.一种检测方法，其用于除去含有希望扩增及检测的感兴趣的核酸的液体生物学样品中的污染物，所述方法包括如下步骤：

b)加入扩增引物及检测探针，分别用以扩增及检测从感兴趣的核酸的扩增所获得的扩增子，每种引物和探针由三种不同类型的碱基组成；

d)将所述溶液和试剂置于使得所述转变的核酸被扩增及产生的扩增子被检测的条件下。

3.权利要求1或2的方法，特征在于在步骤a)和b)之间进行至少一个纯化步骤。

4.权利要求1-3任一项的方法，特征在于在步骤a)之前进行至少一个提取所述液体生物学样品中包含的核酸的步骤。

5.权利要求1-4任一项的方法，特征在于所述扩增引物对所述转变的感兴趣的核酸或者与其互补的那些核酸具有特异性。

6.权利要求2的方法，特征在于所述检测探针对所述转变的靶和所述扩增子具有特异性。

7.权利要求1-6任一项的方法，特征在于所述由三种不同类型碱基组成的引物和/或探针含有至少一个修饰的核苷酸。

8.权利要求7的方法，特征在于所述修饰的核苷酸选自α-寡核苷酸、PNA、LNA、2′-O-烷基核糖核苷酸。

9.权利要求8的方法，特征在于所述修饰的核苷酸是2′-O-甲基核糖核苷酸。

10.权利要求1-9任一项的方法，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的所述化学处理是通过含硫化学剂的作用实现的。

11.权利要求1-10任一项的方法，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的化学剂含有亚硫酸氢根离子(HSO₃ ^-)，如亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、亚硫酸氢铵(NH₄HSO₃)、亚硫酸氢镁(MgHSO₃)、焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)、亚硫酸氢钠(sodium hydrogen sulfite)或者亚磺酸。

12.权利要求1-9任一项的方法，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的酶剂是胞嘧啶脱氨酶。

13.权利要求1-12任一项的方法，特征在于所述化学或者酶促处理包括使一种类型的碱基转变为尿嘧啶(U)。

14.权利要求1-13任一项的方法，特征在于所述化学或者酶促处理包括使胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)。

15.权利要求14的方法，特征在于与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和/或胸腺嘧啶(T)组成，与所述第一引物延伸所得的链杂交的第二引物由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)组成。

16.权利要求1-9任一项的方法，特征在于使得一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的酶剂是腺苷脱氨酶。

17.权利要求16的方法，特征在于所述酶促处理包括使腺嘌呤(A)转变为次黄嘌呤。

18.权利要求16和17的方法，特征在于与转变的感兴趣的核酸杂交的第一引物由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和/或鸟嘌呤(G)组成，与所述第一引物延伸所得的链杂交的第二引物由胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)组成。

19.权利要求1-18任一项的方法，特征在于进行的扩增是RT-PCR扩增。

20.权利要求1-18任一项的方法，特征在于进行的扩增是对单链进行的PCR扩增。

21.权利要求1-18任一项的方法，特征在于进行的扩增是对双链进行的PCR扩增。

22.权利要求21的方法，特征在于所述扩增是通过两对扩增引物实现的，所述引物特异于转变的感兴趣的核酸的每条链。

23.权利要求1-18任一项的方法，特征在于进行的扩增是转录后扩增，如NASBA或者TMA。

24.权利要求1-23任一项的方法，特征在于感兴趣的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。

25.实施权利要求1-24任一项的方法的试剂盒，特征在于其包含：

a.使得至少一种类型的碱基转变为另一种类型的碱基的物质；

b.扩增引物及任选存在的检测探针，其适合于转变的感兴趣的核酸或者产生的扩增子，这些序列由三种不同类型的碱基组成；

c.扩增所需的试剂及任选存在的检测所需的试剂，如水溶液、溶剂、核苷酸、酶。

26.权利要求25的试剂盒，特征在于所述物质选自亚硫酸氢钠(NaHSO₃)、亚硫酸氢铵(NH₄HSO₃)、亚硫酸氢镁(MgHSO₃)、焦亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)、亚硫酸氢钠(sodium hydrogen sulfite)或者亚磺酸。

27.权利要求25的试剂盒，特征在于所述物质选自腺苷脱氨酶或者胞嘧啶脱氨酶。

28.权利要求1-24任一项的方法或者权利要求25-27任一项的试剂盒在扩增和检测真细菌和/或真菌和/或病毒和/或酵母靶中的应用。

29.权利要求28的试剂盒的应用，特征在于所述扩增引物特异于细菌的属，其中每种检测探针特异于至少一个菌种。