CN113366116A - 用于merfish和其他应用的扩增方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及用于对细胞或其他样品中的核酸进行成像或测定的系统和方法。在一些情况下，可以测定细胞的转录组。某些实施方案一般涉及以相对高的分辨率测定样品中的核酸和其他靶标。例如，可以将核酸探针应用于样品，并且可以使用初级和次级扩增器核酸来扩增核酸探针与靶标的结合。在一些情况下，存在最大数量的可以与靶标结合的扩增器核酸，例如，结合是可饱和的，并且即使在存在充足试剂的情况下也不能无限增长。这可能有利于例如控制每个结合事件的亮度，控制扩增区域的尺寸(例如，在成像期间)，和/或限制扩增噪声的程度(即分子间的扩增信号的最终变化)等。此外，在一些实施方案中，初级和/或次级扩增器核酸可以由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，这可以导致更少的次级结构、更快的结合速率等。在一些情况下，这些特性可以促进多个正交扩增序列的快速设计，从而允许将这样的方法扩展到许多不同的分子靶标。

Description

用于MERFISH和其他应用的扩增方法和系统
相关申请
本申请要求Zhuang等人于2018年12月13日提交的题为“Amplification Methodsand Systems for MERFISH and Other Applications”的美国临时专利申请系列号62/779,333的权益，该申请通过引用整体并入本文。
政府资助
本发明是在美国国立卫生研究院授予的MH113094、MH111502和MH114830下由政府支持完成的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明一般涉及用于对细胞或其他样品中的核酸进行成像或测定的系统和方法。
背景技术
单分子荧光原位杂交(smFISH)通过直接检测单个细胞中的个体RNA分子来提供RNA丰度和空间位置。通过使用这样的技术，RNA定位已被证明与多种细胞功能相关，例如发育中的身体模式化、细胞分裂过程中的细胞命运决定、局部翻译、细胞迁移和极性的建立。为了研究完整细胞和组织内转录组规模上的RNA定位，已开发出多重化抗错荧光原位杂交(MERFISH)和原位测序。其中，MERFISH使用抗错二进制条形码化和顺序成像来在高检测效率的情况下多重化smFISH测量。然而，信号的更高光子计数将改善受成像采集速度限制的通量、深部组织成像引起的光散射以及样品自发荧光导致的低信号背景比。因此，需要在增加光子计数方面的改进，以允许成像通量的显著增加、可能不允许足够探针的结合以产生高于背景信号水平的信号的短RNA的靶向，和/或将多重化测量扩展到具有高水平的背景信号的样品类型。
然而，多重化单分子RNA成像方法的性能取决于信号放大可能降低或挑战的许多特性。例如，通常很重要的是分子间的信号亮度的变化相对较小。类似地，通常很重要的是来自单个分子的信号的物理尺寸或范围尽可能小，以防止来自物理相邻分子的信号的大量重叠。同时，扩增方法可能效率不高，并且一些分子可能不被扩增，而另一些分子则被扩增，导致检测到的分子比例减少。此外，通常很重要的是能够扩增多个正交分子信号，并且关键是能够将扩增方法快速扩展到更多不同的分子信号。最后，这样的扩增方法应该是快速的，以减少样品制备时间。由于这些原因，需要不引入信号亮度变化、增加来自单个分子的信号的物理范围的扩增方法，其在扩增来自所有靶分子的信号方面非常有效，并且可以快速扩展到多个不同的靶标。
发明内容
本发明一般涉及用于对细胞或其他样品中的核酸进行成像或测定的系统和方法。在一些情况下，本发明的主题涉及相关产品、特定问题的替代解决方案和/或一个或多个系统和/或物品的多种不同用途。
一方面，本发明一般涉及一种方法。根据第一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中最大数量的次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸和次级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
在又一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸在固定距离内结合初级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
根据另一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
在又一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
在一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针，使用荧光确定核酸探针在样品内的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，其中如果没有找到匹配，则潜在地对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
在又一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
根据另一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，其中如果没有找到匹配，则潜在地对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
在一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸在固定距离内结合核酸探针，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
根据又一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字，以及对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，其中如果没有找到匹配，则潜在地对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
根据另一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中最大数量的次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸和次级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在又一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸在固定的距离内结合初级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在又一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
根据另一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
根据又一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于与核酸探针缀合的结合实体，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在又一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于与核酸探针缀合的结合实体，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸和次级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
根据又一组实施方案，所述方法包括将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，使用荧光确定样品内核酸探针的分布，并基于样品内的荧光分布创建代码字。
在一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，其中核酸探针包含含有靶序列的第一部分和含有一个或多个读取序列的第二部分，并且其中多个核酸探针中的至少一些包括由取自多个读取序列的一个或多个读取序列的组合性组合形成的可区分的核酸探针，并且将核酸探针暴露于初级扩增器核酸和次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸能够结合核酸探针和次级扩增器核酸和初级核酸探针，并且其中与样品内的靶标缔合的初级扩增器核酸和次级扩增器核酸的最大数量是固定的。
在另一组实施方案中，所述方法包括将样品暴露于核酸探针，将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，使用荧光确定样品内次级扩增器核酸的分布，基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
在另一方面，本发明包括制造本文描述的一个或多个实施方案的方法。在另一方面，本发明包括使用本文描述的一个或多个实施方案的方法。
当结合附图考虑时，根据本发明的各种非限制性实施方案的以下详细描述，本发明的其他优点和新颖特征将变得明显。
附图简要说明
将参考附图通过示例的方式描述本发明的非限制性实施方案，附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所举例说明的每个相同或几乎相同的组分通常由单一数字表示。为了清楚起见，并非每个组分都标记在每个图中，也没有示出本发明的每个实施方案的每个组分，其示出对于允许本领域普通技术人员理解本发明而言不是必需的。在附图中：
图1A-1E提供了使用初级和次级扩增器核酸来扩增信号的实施方案的示意图；
图2A-2F示出了根据本发明的另一个实施方案，扩增可以显著增加信号亮度而不显著改变光斑尺寸；
图3A-3F示出了在本发明的又一实施方案中130个RNA的MERFISH测量；
图4A-4C示出了在本发明的又一实施方案中在组织样品中的扩增；和
图5A-5C示出了在本发明的一个实施方案中用于扩增的某些示例序列。
发明详述
本发明一般涉及用于对细胞或其他样品中的核酸进行成像或测定的系统和方法。在一些情况下，可以测定细胞的转录组。某些实施方案一般涉及以相对高的分辨率测定样品中的核酸和其他靶标。例如，可以将核酸探针应用于样品，并且可以使用初级和次级扩增器核酸来扩增核酸探针与靶标的结合。在一些情况下，存在最大数量的可以与靶标结合的扩增器核酸，例如，结合是可饱和的，并且即使在存在充足试剂的情况下也不能无限增长。这可能有利于例如控制每个结合事件的亮度，控制扩增区域的尺寸(例如，在成像期间)，和/或限制扩增噪声的程度(即分子间的扩增信号的最终变化)等。此外，在一些实施方案中，初级和/或次级扩增器核酸可以由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成，这可以导致更少的二级结构、更快的结合速率等。在一些情况下，这些特性可以促进多个正交扩增序列的快速设计，从而允许将这样的方法扩展到许多不同的分子靶标。
一方面，本发明一般涉及用于扩增生物样品内的(可能数十、数百、数千或更多个)靶标的信号(例如用于使用MERFISH或其他技术进行成像)的系统和方法。例如，在一些实施方案中，这些技术提供了快速、简单和/或有效的方式来同时扩增数百或数千个RNA靶标的信号，例如，在生物样品的天然环境中。在某些实施方案中，如本文所讨论的，可以通过使用可饱和系统来很好地控制这样的扩增。正因为如此，在扩增过程中，光斑间的亮度的变化可以最小化，这在使用MERFISH或其他技术进行解码时可以是非常有用的。在一些实施方案中，扩增的光斑的尺寸也没有增加。这可以提高鉴别靶标(例如相对地位于彼此靠近的位置)的能力。例如，如果光斑尺寸增加太多，来自一个靶标的信号可能与来自另一个靶标的信号重叠。此外，如下文所讨论的，一些实施方案中的扩增器核酸不包含发夹结构，例如，可能参与扩增过程的发夹结构，这可以促进可饱和系统的创建，和/或应用针对大量靶标的多扩增器系统的设计。此外，也如下文所讨论的，可以仅使用三种核苷酸构建扩增器核酸。三字母核苷酸可具有比四字母核苷酸少得多的二级结构，和更快的结合速率。此外，在一些情况下，任何给定扩增器序列将可靠工作的可能性增加，例如，通过降低无意二级结构的可能性。
这样的系统的非限制性实例现在在图1A-1E中示出。在图1A中，示出了靶标10(在此实例中为RNA)。生物样品(例如，细胞或组织)内可能分布有数百或数千个靶标，并且核酸探针与靶标的结合可用于确定它们的分布，例如，通过使用荧光探针和对样品成像。但是，注意的是，为了清楚起见，此处仅示出了一个靶标。
在一些实施方案中，使用具有不同序列的多个核酸探针，并且基于每个核酸探针的结合模式顺序分析每个核酸探针的分布并将其用于为每个位置创建“代码字”。通过选择限定合适代码空间的核酸探针，可以鉴别和/或丢弃和/或校正所观察到的结合模式中的明显错误以鉴别正确的代码字，从而鉴别样品中核酸探针的正确靶标。这样的抗错性和错误校正系统首先被引入用于多重化抗错荧光原位杂交(MERFISH)，并随后还被用于各种相关技术。参见，例如，国际专利申请公开号WO2016/018960和WO2016/018963，各自通过引用整体并入本文。
编码核酸探针的实例示于图1A中，其中编码核酸探针15(以虚线框显示)已结合靶标10，例如靶RNA。其他核酸探针16、17也可以与靶RNA和/或样品内的其他靶标结合。探针15可以包含能够与靶RNA结合(例如，通过特异性结合)的靶序列11和读取序列12(或“读出”序列)，即可以被“读取”以确定是否发生结合的序列。一个、两个、三个或更多个读取序列可以存在于探针上。例如，在该实例中，探针15中存在两个这样的读取序列(鉴别为读取序列12和读取序列19)。读取序列可以各自独立地相同或不同。此外，探针例如16和17可以具有与核酸探针15相同或不同数量的读取序列，和/或相同或不同的结构。
如果不应用扩增，则核酸探针15可以暴露于包含信号传导实体40的合适的次级核酸探针32，如图1E所示。在这个实例中，信号传导实体通过二硫键连接到次级核酸探针，尽管在其他实施方案中可以使用其他技术。然而，在这样的情况下，只有一个信号传导实体可以连接到靶标。由于在这样的结合事件之后产生的低信号强度，因此检测单个信号传导实体并使用它来确定核酸探针15与靶标10的结合可能相对困难。
因此，在图1B中，根据某些实施方案，可以使用初级扩增器核酸20。初级扩增器核-酸可以包含能够(例如，特异性地)结合核酸探针15的读取序列的第一初级识别序列22，和能够(例如，特异性地)结合一个或多个次级扩增器核酸的一个或多个初级读取序列23，如下文所讨论的。在此实例中，“N”个这样的读取序列在初级扩增器核酸中示意性地示出(N可以是例如5、7、9或如本文所讨论的其他数字)。初级读取序列可以各自具有相同或不同的序列，并且可以具有相同或不同的长度。在此实例中，每个读取序列的长度为20个核苷酸，但这仅作为示例。此外，如前所述，虽然这里显示了两个这样的初级扩增器核酸，但这仅作为示例，在其他实施方案中，其他数量的初级扩增器核酸可以结合核酸探针。
接下来，如图1C所示，次级扩增器核酸30可以结合初级扩增器核酸。次级扩增器核酸可以包含能够(例如，特异性地)结合初级扩增器核酸20的读取序列23的第一识别序列33，和能够结合信号传导实体的一个或多个次级读取序列34，如下文讨论的。
与初级扩增器核酸一样，任何数量的次级读取序列可以存在于次级扩增器核酸中，如该图中所示。次级读取序列可以各自具有相同或不同的序列，并且可以相对于彼此具有相同或不同的长度。次级读取序列也可以与初级扩增器核酸的读取序列相同或不同。在这个实例中，每个次级扩增器核酸可以具有“M”个读取序列。M可以是例如5、7、9或如本文中讨论的其他数字，并且M可以与N相同或不同。
在图1D中，多个信号传导实体40已结合次级扩增器核酸的读取序列。在该实例中，信号传导实体各自通过二硫键结合，尽管在其他实施方案中可以使用其他技术，如本文所讨论的。
此外，在这样的情况下，预期存在已结合靶序列的每个读取序列的信号传导实体的最大或饱和限制。在这个特定的实例中，有NxM个这样的位置可用于核酸探针的每个读取序列(在这里2个这样的读取序列)，假设两者具有基本相同的结构(尽管它们不一定必须具有相同的结构，即，相同数量的NxM个位置可用，例如，如果它们具有带有不同结构的扩增器核酸)。因此，可以与给定靶标缔合的信号传导实体的数量是有限的、可预测的数量，并且不能无限地或无限制地增长。
在这个实例中，讨论了两个读取序列12和19，其各自可以具有初级和次级扩增器核酸和缔合的信号传导实体。这些可能具有或可能不具有相同或不同的结构，例如，与读取序列12缔合的信号传导实体和/或扩增器核酸可能不与读取序列19缔合，反之亦然。(然而，如上所述，这里仅以举例的方式提供了2个读取序列，在其他实施方案中，可能有1、2、3、4个等不同的读取序列，其可以并行扩增，例如，使用类似的方法，包括使用不同的扩增器核酸等)可以通过确定(例如顺序地或同时地)与每个读取序列缔合的信号传导实体(其可以是相同的或不同的)来独立地测定读取序列。例如，如图1D所示，信号传导实体40能够与初级扩增器核酸20和次级扩增器核酸30缔合，最终与读取序列12缔合，但不能与读取序列19或其分别缔合的初级和次级扩增器核酸29和39缔合。
此外，在一些实施方案中，扩增可涉及结合仅一轮扩增器核酸(产生N倍扩增)、两轮(产生NxM倍扩增)、三轮(产生NxMxO扩增，其中第三轮分子包含O个读取序列)，或在一些情况下更多轮扩增器核酸。在一些情况下，可以应用任意数量的扩增轮次。
此外，样品可以包含具有许多不同读出序列(例如，可以使用不同的扩增器核酸或信号传导实体鉴别)的核酸探针。例如，可以使用8、10、12、14、16、24、32、48、64或其他数量的读出序列，包括超过64轮。在一些情况下，独特的扩增器核酸可用于扩增读出序列，例如，使用合适的扩增器核酸可将存在的原始读出序列扩增成例如NxM个拷贝。在一些情况下，可以有效地设计扩增器核酸。例如，通过利用扩增器核酸序列中四种核苷酸中的仅三种，可以降低扩增器核酸内意外次级结构的可能性。不希望受任何理论束缚，据信，由于扩增器核酸本身或随后的扩增器核酸的结合的这样的次级结构的影响可能难以预测，减少或消除次级结构可以增加给定的扩增器核酸将正确组装的可能性，这可以促进大量正交扩增器核酸的设计和使用。此外，通过减少次级结构(其还可以抑制这些扩增器核酸的结合速率)，这样的设计考虑可以减少组装这样的结构所需的时间，或减少每个样品所需的扩增器核酸的量等。
此方法提供的受控扩增与诸如发夹解折叠或滚环扩增的技术(在这些技术中，信号的扩增可以以不受控制的方式或无限地有效增长，即当存在足够的试剂时)形成对比。这样的不受控制的扩增可能难以准确测定，因为存在的信号的量可能与靶标的数量或靶标的位置没有很好的相关性(例如，在由不受控制的扩增产生的较大量的信号的情况下，出现在显微图像中的“光斑尺寸”可能会变大，并且不一定以靶标为中心，从而影响图像的分辨率，或干扰来自其他的附近靶标的信号)。相比之下，如本文所讨论的，使用可饱和扩增技术可产生最大数量的可与靶标缔合的信号传导实体，其可限制光斑尺寸、产生光斑亮度或强度的均匀性、改善检测等。
如上所述，在某些实施方案中，此类技术可以与错误校正相结合，例如，如在MERFISH或其他类似技术中使用的。例如，代码字可以基于多个核酸探针的结合(或不结合)，并且在一些情况下，代码字可以定义错误校正码以帮助减少或防止核酸探针的错误鉴别。在一些情况下，可以使用相对少量的标记(例如，通过使用各种组合方法)来鉴别相对大量的不同靶标。图像采集技术(例如STORM)也可用于对此类样品进行成像并促进核酸探针的测定。参见，例如，美国专利号9,712,805或10,073,035，或国际专利申请公开号WO2008/091296或WO2009/085218，其各自通过引用整体并入本文，以获得关于诸如MERFISH的技术的额外细节。
以上讨论是本发明的一个实施方案的非限制性实例，其可用于改进使用MERFISH或其他技术对样品中靶标的测定。然而，除了上述实施方案之外，其他实施方案也是可能的。因此，更一般地，本发明的各个方面涉及用于对细胞或其他样品中的核酸进行成像或测定的各种系统和方法。
因此，某些方面涉及测定样品，其可以包括细胞培养物、细胞悬浮液、生物组织、活组织检查、生物体等。在一些情况下样品也可以是无细胞的，但仍然含有核酸。如果样品含有细胞，则细胞可以是人细胞或任何其他合适的细胞，例如哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、植物细胞等。在一些情况下，可能存在多于一个细胞。
在样品内，待测定的靶标可以包括核酸、蛋白质等。待测定的核酸可以包括例如存在于细胞(或其他样品)内的DNA(例如，基因组DNA)、RNA或其他核酸。核酸对细胞可以是内源的，或被添加到细胞中。例如，核酸可以是病毒的，或人工产生的。在一些情况下，待测定的核酸可由细胞表达。在一些实施方案中，核酸是RNA。RNA可以是编码和/或非编码RNA。例如，RNA可以编码蛋白质。可在细胞内研究的RNA的非限制性实例包括mRNA、siRNA、rRNA、miRNA、tRNA、lncRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、piRNA等。
在一些情况下，可以研究细胞内核酸的重要部分。例如，在一些情况下，可以测定细胞内存在的足够RNA以产生细胞的部分或完整转录组。在一些情况下，测定细胞内的至少4种类型的mRNA，并且在一些情况下，可以测定细胞内的至少3、至少4、至少7、至少8、至少12、至少14、至少15、至少16、至少22、至少30、至少31、至少32、至少50、至少63、至少64、至少72、至少75、至少100、至少127、至少128、至少140、至少255、至少256、至少500、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少7,500、至少10,000、至少12,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少75,000或至少100,000种类型的mRNA。
在一些情况下，可以测定细胞的转录组。应当理解，转录组通常包括细胞内产生的所有RNA分子，而不仅仅是mRNA。因此，例如，在某些情况下，转录组还可以包括rRNA、tRNA、siRNA等。在一些实施方案中，可以测定细胞的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的转录组。
在一些实施方案中，待测定的其他靶标可以包括与核酸、蛋白质等连接的靶标。例如，在一组实施方案中，能够识别靶标的结合实体可以与核酸探针缀合。结合实体可以是可以(例如，特异性地或非特异性地)识别靶标的任何实体。非限制性实例包括酶、抗体、受体、互补核酸链、适配体等。例如，寡核苷酸连接的抗体可用于测定靶标。靶标可以结合寡核苷酸连接的抗体，以及如本文讨论的测定的寡核苷酸。
靶标(例如细胞或其他样品内的核酸)的测定可以是定性和/或定量的。此外，测定也可以是空间的，例如可以在二维或三维上测定细胞或其他样品内的核酸或其他靶标的位置。在一些实施方案中，可以测定细胞或其他样品内的核酸或其他靶标的位置、数量和/或浓度。
在一些情况下，可以测定细胞基因组的重要部分。测定的基因组区段可以是连续的或散布在基因组上。例如，在一些情况下，测定细胞内的至少4个基因组区段，并且在一些情况下，可以测定细胞内的至少3、至少4、至少7、至少8、至少12、至少14、至少15、至少16、至少22、至少30、至少31、至少32、至少50、至少63、至少64、至少72、至少75、至少100、至少127、至少128、至少140、至少255、至少256、至少500、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少7,500、至少10,000、至少12,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少75,000或至少100,000个基因组区段。
在一些情况下，可以测定细胞的整个基因组。应当理解，基因组通常包括细胞内产生的所有DNA分子，而不仅仅是染色体DNA。因此，例如，在一些情况下，基因组还可包括线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA等，例如附加于(或代替)染色体DNA。在一些实施方案中，可以测定细胞的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或100％的基因组。
如本文所讨论的，多种核酸探针可用于测定细胞或其他样品内的一种或多种靶标。探针可以包含核酸(或可以与核酸杂交(例如，特异性地)的实体)例如DNA、RNA、LNA(锁核酸)、PNA(肽核酸)和/或它们的组合。在一些情况下，额外的组分也可以存在于核酸探针内，例如，如下文所讨论的。此外，可以使用任何合适的方法将核酸探针引入细胞。
例如，在一些实施方案中，在引入核酸探针之前固定细胞，例如以保留细胞内核酸或其他靶标的位置。用于固定细胞的技术是本领域普通技术人员已知的。作为非限制性实例，可以使用诸如甲醛、多聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸等的化学品来固定细胞。在一个实施方案中，可以使用HEPES-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂(HOPE)固定细胞。
可以使用任何合适的方法将核酸探针引入细胞(或其他样品)中。在一些情况下，细胞可以被充分透化，使得可以通过在细胞周围流动含有核酸探针的流体将核酸探针引入细胞中。在一些情况下，作为固定过程的一部分，细胞可以被充分透化；在其他实施方案中，细胞可以通过暴露于某些化学品例如乙醇、甲醇、Triton等而被透化。此外，在一些实施方案中，诸如电穿孔或显微注射的技术可用于将核酸探针引入细胞或其他样品中。
因此，某些方面一般涉及被引入细胞(或其他样品)中的核酸探针。取决于应用，探针可包含可与核酸杂交(通常通过Watson-Crick碱基配对)的多种实体中的任一种，例如DNA、RNA、LNA、PNA等。核酸探针通常包含能够结合靶标(例如靶核酸)的至少一部分的靶序列。在一些情况下，结合可以是特异性结合(例如，通过互补结合)。当引入细胞或其他系统时，靶序列可能能够结合特定靶标(例如，mRNA，或本文讨论的其他核酸)。核酸探针还可以包含一个或多个读取序列，如下文所讨论的。
在一些情况下，可以将多于一种类型的核酸探针应用于样品，例如顺序或同时。例如，可以有至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少300、至少1,000、至少3,000、至少10,000或至少30,000种可区分的核酸探针应用于样品。在一些情况下，核酸探针可以顺序添加。然而，在一些情况下，可以同时添加多于一种核酸探针。
核酸探针可包括一种或多种靶序列，其可位于核酸探针内的任何位置。靶序列可以包含与靶标(例如靶核酸)的一部分基本上互补的区域。例如，在一些情况下，所述部分可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补，例如以产生特异性结合。通常，互补性是基于Watson-Crick核苷酸碱基配对确定的。
在一些情况下，靶序列的长度可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50、至少60、至少65、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400或至少450个核苷酸。在一些情况下，靶序列的长度可能不超过500、不超过450、不超过400、不超过350、不超过300、不超过250、不超过200、不超过175、不超过150、不超过125、不超过100、不超过75、不超过60、不超过65、不超过60、不超过55、不超过50、不超过45、不超过40、不超过35、不超过30、不超过20或不超过10个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，靶序列可具有10至30个核苷酸、20至40个核苷酸、5至50个核苷酸、10至200个核苷酸或25至35个核苷酸、10至300个核苷酸等的长度。
核酸探针的靶序列可以参照怀疑存在于细胞或其他样品中的靶标来测定。例如，可以使用蛋白质的序列来测定针对蛋白质的靶核酸，例如，通过测定被表达以形成蛋白质的核酸。在一些情况下，仅使用编码蛋白质的核酸的一部分，例如具有如上文所讨论的长度。此外，在一些情况下，可以使用可用于鉴别特定靶标的多于一种靶序列。例如，可以顺序和/或同时使用多个探针，其可以结合或杂交到相同靶标的相同或不同区域。杂交通常是指互补单链核酸通过Watson-Crick核苷酸碱基配对(例如氢键合、鸟嘌呤-胞嘧啶和腺嘌呤-胸腺嘧啶)缔合以形成双链核酸的退火过程。
在一些实施方案中，核酸探针还可包含一个或多个“读取”序列。读取序列可用于鉴别核酸探针，例如，通过与信号传导实体的缔合，如下文所讨论的。在一些实施方案中，核酸探针可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多、20或更多、24或更多、32或更多、40或更多、48或更多、50或更多、64或更多、75或更多、100或更多、128或更多个读取序列。读取序列可以位于核酸探针内的任何位置。如果存在多于一个读取序列，读取序列可以彼此紧挨着放置，和/或散布有其他序列。
读取序列可以具有任何长度。如果使用多于一个读取序列，读取序列可以独立地具有相同或不同的长度。例如，读取序列的长度可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50、至少60、至少65、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400或至少450个核苷酸。在一些情况下，读取序列的长度可能不超过500、不超过450、不超过400、不超过350、不超过300、不超过250、不超过200、不超过175、不超过150、不超过125、不超过100、不超过75、不超过60、不超过65、不超过60、不超过55、不超过50、不超过45、不超过40、不超过35、不超过30、不超过20或不超过10个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，读取序列可以具有10至30个核苷酸、20至40个核苷酸、5至50个核苷酸、10至200个核苷酸或25至35个核苷酸、10至300个核苷酸等的长度。
在一些实施方案中，读取序列可以是任意的或随机的。在一些情况下，选择读取序列以减少或最小化与细胞或其他样品的其他组分的同源性，例如，使得读取序列本身不与怀疑在细胞或其他样品内的其他核酸结合或杂交。在一些情况下，同源性可能小于10％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些情况下，可能存在少于20个碱基对、少于18个碱基对、少于15个碱基对、少于14个碱基对、少于13个碱基对、少于12个碱基对、少于11个碱基对或少于10个碱基对的同源性。在一些情况下，这样的碱基对是连续的。
在一组实施方案中，核酸探针群体可以包含一定数量的读取序列，在一些情况下，其可以少于核酸探针的靶标的数量。本领域普通技术人员将意识到，如果存在一个信号传导实体和n个读取序列，则通常可以唯一地鉴别2n-1个不同的核酸靶标。然而，并非需要使用所有可能的组合。例如，核酸探针群体可以靶向12个不同的核酸序列，但包含不超过8个读取序列。作为另一个实例，核酸群体可以靶向140个不同的核酸种类，但包含不超过16个读取序列。不同的核酸序列靶标可以通过使用每个探针内读取序列的不同组合来分别鉴别。例如，每个探针可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16等或更多个读取序列。在一些情况下，核酸探针群体可以各自包含相同数量的读取序列，尽管在其他情况下，各种探针上可能存在不同数量的读取序列。
作为非限制性实例，第一核酸探针可包含第一靶序列、第一读取序列和第二读取序列，而不同的第二核酸探针可包含第二靶序列、相同的第一读取序列和第三读取序列而不是第二读取序列。这样的探针从而可以通过测定存在的或与给定探针或位置缔合的各种读取序列来区分，如本文所讨论的。例如，如下文所讨论的，可以使用“代码字”顺序地鉴别和编码探针。任选地，还可以对代码字进行错误检测和/或错误校正。
此外，在某些实施方案中，核酸探针群体(以及它们在编码探针上相应的互补位点)可以使用4种天然存在的核苷酸碱基中的仅2种或仅3种制成，例如省去探针群体中的所有“G”或省去所有“C”。在某些实施方案中，缺少“G”或“C”的序列可以形成非常少的次级结构，并且可以有助于更均匀、更快的杂交。因此，在一些情况下，核酸探针可能仅包含A、T和G；仅包含A、T和C；仅包含A、C和G；或仅包含T、C和G。
一方面，核酸探针上的读取序列可能能够(例如，特异性地)结合初级扩增器核酸上的相应识别序列。因此，当核酸探针识别生物样品中的靶标(例如DNA或RNA靶标)时，初级扩增器核酸也能够通过核酸探针与靶标缔合，其中存在核酸探针的读取序列和初级扩增器核酸上的相应识别序列之间的相互作用，例如互补结合。例如，识别序列可能能够识别靶读取序列，但基本上不识别或结合其他非靶读取序列。取决于应用，初级扩增器核酸还可包含能够与核酸杂交的多种实体中的任一种，例如DNA、RNA、LNA和/或PNA等。例如，这样的实体可以形成一些或全部识别序列。
在一些情况下，识别序列可以与靶读取序列基本上互补。在一些情况下，序列可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。通常，互补性是基于Watson-Crick核苷酸碱基配对测定的。靶读取序列的结构可以包括先前描述的那些。
在一些情况下，识别序列的长度可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50、至少60、至少65、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400或至少450个核苷酸。在一些情况下，识别序列的长度可能不超过500、不超过450、不超过400、不超过350、不超过300、不超过250、不超过200、不超过175、不超过150、不超过125、不超过100、不超过75、不超过60、不超过65、不超过60、不超过55、不超过50、不超过45、不超过40、不超过35、不超过30、不超过20或不超过10个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，识别序列可以具有10至30个核苷酸、20至40个核苷酸、5至50个核苷酸、10至200个核苷酸或25至35个核苷酸、10至300个核苷酸等的长度。
在一些实施方案中，初级扩增器核酸还可以包含一个或多个能够结合次级扩增器核酸的读取序列，如下文所讨论的。例如，初级扩增器核酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多、20或更多、32或更多、40或更多、50或更多、64或更多、75或更多、100或更多、128或更多个读取序列。读取序列可以位于初级扩增器核酸内的任何位置。如果存在多于一个读取序列，则读取序列可以彼此紧挨着放置，和/或散布有其他序列。在一个实施方案中，初级扩增器核酸在第一端包含识别序列，并且在第二端包含多个读取序列。
在一些情况下，初级扩增器核酸内的读取序列的长度可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50、至少60、至少65、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400或至少450个核苷酸。在一些情况下，读取序列的长度可能不超过500、不超过450、不超过400、不超过350、不超过300、不超过250、不超过200、不超过175、不超过150、不超过125、不超过100、不超过75、不超过60、不超过65、不超过60、不超过55、不超过50、不超过45、不超过40、不超过35、不超过30、不超过20或不超过10个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，读取序列可以具有10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、20至40个核苷酸、5至50个核苷酸、10至200个核苷酸或25至35个核苷酸、10至300个核苷酸等的长度。
初级扩增器核酸内可以有任意数量的读取序列。例如，可能有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个读取序列存在于初级扩增器核酸中。如果初级扩增器核酸内存在多于一个读取序列，则读取序列可以相同或不同。在一些情况下，例如，读取序列可能全部相同。
在一些实施方案中，初级扩增器核酸群体可以使用4种天然存在的核苷酸碱基中的仅2种或仅3种来制备，例如省去核酸群体中的所有“G”或省去所有“C”。在某些实施方案中，缺少“G”或“C”的序列可以形成非常少的次级结构，并且可以有助于更均匀、更快的杂交。因此，在一些情况下，初级扩增器核酸可能仅包含A、T和G；仅包含A、T和C；仅包含A、C和G；或仅包含T、C和G。
在一些情况下，可以将多于一种类型的初级扩增器核酸应用于样品，例如顺序或同时。例如，可以有至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少300、至少1,000、至少3,000、至少10,000或至少30,000种可区分的初级扩增器核酸应用于样品。在一些情况下，初级扩增器核酸可以顺序添加。然而，在一些情况下，可以同时添加多于一种初级扩增器核酸。
在一组实施方案中，初级扩增器核酸上的读取序列可能能够(例如，特异性地)结合次级扩增器核酸上的相应识别序列。因此，当核酸探针识别生物样品中的靶标(例如DNA或RNA靶标)时，次级扩增器核酸也能够通过初级扩增器核酸与靶标缔合，其中存在初级扩增器核酸的读取序列和次级扩增器核酸上的相应识别序列之间的相互作用，例如互补结合。例如，次级扩增器核酸上的识别序列可能能够识别初级扩增器核酸上的读取序列，但基本上不识别或结合其他非靶读取序列。取决于应用，次级扩增器核酸还可包含能够与核酸杂交的多种实体中的任一种，例如DNA、RNA、LNA和/或PNA等。例如，这样的实体可以形成一些或全部识别序列。
在一些情况下，次级扩增器核酸上的识别序列可以与初级扩增器核酸上的读取序列基本上互补。在一些情况下，序列可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在一些情况下，次级扩增器核酸上的识别序列的长度可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50、至少60、至少65、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400或至少450个核苷酸。在一些情况下，识别序列的长度可能不超过500、不超过450、不超过400、不超过350、不超过300、不超过250、不超过200、不超过175、不超过150、不超过125、不超过100、不超过75、不超过60、不超过65、不超过60、不超过55、不超过50、不超过45、不超过40、不超过35、不超过30、不超过20或不超过10个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，识别序列可以具有10至30个核苷酸、20至40个核苷酸、5至50个核苷酸、10至200个核苷酸或25至35个核苷酸、10至300个核苷酸等的长度。
在一些实施方案中，次级扩增器核酸还可包含一个或多个能够结合信号传导实体的读取序列，如本文所讨论的。例如，次级扩增器核酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多、20或更多、32或更多、40或更多、50或更多、64或更多、75或更多、100或更多、128或更多个能够结合信号传导实体的读取序列。读取序列可以位于次级扩增器核酸内的任何位置。如果存在多于一个读取序列，读取序列可以彼此紧挨着放置，和/或散布有其他序列。在一个实施方案中，次级扩增器核酸在第一端包含识别序列，并且在第二端包含多个读取序列。该结构也可以与初级扩增器核酸的结构相同或不同。
在一些情况下，次级扩增器核酸内的读取序列的长度可以是至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少50、至少60、至少65、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400或至少450个核苷酸。在一些情况下，读取序列的长度可能不超过500、不超过450、不超过400、不超过350、不超过300、不超过250、不超过200、不超过175、不超过150、不超过125、不超过100、不超过75、不超过60、不超过65、不超过60、不超过55、不超过50、不超过45、不超过40、不超过35、不超过30、不超过20或不超过10个核苷酸。任何这些的组合也是可能的，例如，次级扩增器核酸内的读取序列可以具有10至20个核苷酸、10至30个核苷酸、20至40个核苷酸、5至50个核苷酸、10至200个核苷酸或25至35个核苷酸、10至300个核苷酸等的长度。
次级扩增器核酸内可以有任意数量的读取序列。例如，可能有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个读取序列存在于次级扩增器核酸中。如果次级扩增器核酸内存在多于一个读取序列，读取序列可以相同或不同。在一些情况下，例如，读取序列可能全部相同。此外，初级和次级扩增器核酸中可以独立地存在相同或不同数量的读取序列。
在某些实施方案中，次级扩增器核酸群可以使用4种天然存在的核苷酸碱基中的仅2种或仅3种来制备，例如在核酸群体中省去所有“G”或省去所有“C”。在某些实施方案中，缺少“G”或“C”的序列可以形成非常少的次级结构，并且可以有助于更均匀、更快的杂交。因此，在一些情况下，次级扩增器核酸可能仅包含A、T和G；仅包含A、T和C；仅包含A、C和G；或仅包含T、C和G。
在一些情况下，可以将多于一种类型的次级扩增器核酸应用于样品，例如顺序或同时。例如，可以有至少2、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100、至少300、至少1,000、至少3,000、至少10,000或至少30,000种可区分的次级扩增器核酸应用于样品。在一些情况下，次级扩增器核酸可以顺序添加。然而，在一些情况下，可以同时添加多于一种次级扩增器核酸。
此外，在某些实施方案中，该模式可以替代地在信号传导实体之前重复，例如使用三级扩增器核酸、四级核酸等，类似于以上讨论。信号传导实体因此可以与末轮扩增器核酸结合。因此，作为非限制性实例，编码核酸探针可以结合靶标，初级扩增器核酸结合编码核酸探针，次级扩增器核酸结合初级扩增器核酸，三级扩增器核酸结合次级扩增器核酸，信号传导实体结合三级扩增器核酸，或编码核酸探针可以结合靶标，初级扩增器核酸结合编码核酸探针，次级扩增器核酸结合初级扩增器核酸，三级扩增器核酸结合次级扩增器核酸，四级扩增器核酸结合三级扩增器核酸，信号传导实体结合四级扩增器核酸等。因此，末轮扩增器核酸不必在所有实施方案中都是次级扩增器核酸。
其他组分也可以存在于核酸探针或扩增器核酸中。例如，在一组实施方案中，可以存在一个或多个引物序列，例如以促进酶促扩增。本领域普通技术人员将知道适合于应用例如扩增(例如，使用PCR或其他合适的技术)的引物序列。许多这样的引物序列是可商购获得的。可存在于初级核酸探针内的序列的其他实例包括但不限于启动子序列、操纵子、鉴别序列、无义序列等。
通常，引物是用作核酸合成起点的单链或部分双链核酸(例如，DNA)，从而允许聚合酶例如核酸聚合酶延伸引物并复制互补链。引物(例如，被设计为)与靶核酸互补并杂交。在一些实施方案中，引物是合成引物。在一些实施方案中，引物是非天然存在的引物。引物的长度通常为10至50个核苷酸。例如，引物可具有10至40、10至30、10至20、25至50、15至40、15至30、20至50、20至40或20至30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，引物具有18至24个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，一种或多种信号传导实体可以结合次级扩增器核酸(或其他末轮扩增器核酸)上的识别实体。信号传导实体的非限制性实例包括荧光实体(荧光团)或磷光实体，例如，如下文所讨论的。然后可以测定信号传导实体，例如，以测定核酸探针或靶标。在一些情况下，测定可以是空间的，例如在二维或三维上。此外，在一些情况下，测定可以是定量的，例如，可以测定信号传导实体和/或靶标的量或浓度。
在一组实施方案中，信号传导实体可以附接至次级扩增器核酸(或其他末轮扩增器核酸)。在次级扩增器核酸与样品内的靶标缔合之前或之后，信号传导实体可以附接至次级扩增器核酸(或其他末轮扩增器核酸)。例如，信号传导实体可以最初或者在次级扩增器核酸已被应用于样品之后附接至次级扩增器核酸。在一些情况下，信号传导实体被添加，然后反应以将它们附接至扩增器核酸。
在一组实施方案中，信号传导实体可以通过可以被切割以释放信号传导实体的键附接至核苷酸序列。例如，在确定样品中核酸探针的分布之后，在另一轮核酸探针和/或扩增器核酸之前，信号传导实体可以被释放或灭活。因此，在一些实施方案中，该键可以是可切割的键，例如二硫键或可光切割的键。可光切割的键的实例在本文中详细讨论。在一些情况下，这样的键可以在例如暴露于还原剂或光(例如，紫外光)时断裂。有关其他详细信息，参见下文。本文更详细地讨论了用于灭活和/或去除信号传导实体的系统和方法的其他实例。
在某些实施方案中，初级和次级扩增器核酸的使用表明存在最大数量的可与给定核酸探针结合的信号传导实体。例如，可能有最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针，例如，由于能够结合有限数量的初级扩增器核酸的最大数量的次级扩增器核酸，和/或由于能够结合核酸探针上有限数量的读取序列的最大数量的初级扩增器核酸。虽然每个潜在位置实际上不需要被信号传导实体填充，但这样的结构表明存在信号传导实体的饱和极限，超过该极限，任何可能碰巧存在的额外信号传导实体都不能够与核酸探针或其靶标缔合。
因此，本发明的某些实施方案一般涉及扩增指示核酸探针或其靶标的信号的可饱和的系统和方法，即，使得有可以与核酸探针或其靶标缔合的信号传导实体的数量的饱和上限。通常，该数量大于1。例如，信号传导实体的上限可以是至少2、至少3、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少250、至少300、至少400、至少500等。在一些情况下，上限可能是小于500、小于400、小于300、小于250、小于200、小于175、小于150、小于125、小于100、小于75、小于50、小于40、小于30、小于25、小于20、小于15、小于10、小于5等。在一些情况下，上限可以测定为可与次级扩增器核酸结合的信号传导实体的最大数量，乘以可结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸的最大数量，乘以可以与结合靶标的核酸探针结合的初级扩增器核酸的最大数量。相比之下，诸如滚环扩增或发夹解折叠的技术允许以不受控制的方式扩增信号，即当存在足够的试剂时，可以在没有预定终点或饱和限制的情况下持续扩增。因此，这样的技术对于可与核酸探针或其靶标缔合的信号传导实体的数量没有理论上限。
然而，应该理解的是，实际结合核酸探针或其靶标的信号传导实体的平均数量实际上不必与其上限相同，即信号传导实体可能实际上没有完全饱和(尽管它们可以这样)。例如，饱和的量(或相对于可结合的最大数量，结合的信号传导实体的数量)可能小于97％、小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％等，和/或为至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％等。在一些情况下，允许更多时间以用于结合发生和/或增加试剂浓度可能增加饱和量。
由于与核酸探针或其靶标实际结合的信号传导实体的数量的潜在上限，与不受控制的扩增(例如上文讨论的那些)相比，分布在样品中的结合事件(例如在空间上)可呈现基本均匀的尺寸和/或亮度。例如，由于可以结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸的特定数量，次级扩增器核酸不能发现于大于距离核酸探针或其靶标的固定距离，这可能限制指示结合的来自信号传导实体的“光斑尺寸”或荧光直径。
在某些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的结合事件可以表现出基本上相同的亮度、尺寸(例如，表观直径)、颜色等，这可以使得更容易区分结合事件与其他事件，例如非特异性结合、噪声等。
此外，如前所述，本发明的某些方面使用编码各种结合事件的代码空间，并且任选地可以使用错误检测和/或校正来测定核酸探针与其靶标的结合。在一些情况下，如上文所讨论的，核酸探针群体可包含可结合某些扩增器核酸的某些“读取序列”，并且可使用与扩增器核酸缔合(例如，在某个代码空间内，例如，如本文所讨论的)的信号传导实体在样品内确定核酸探针或靶标的位置。还参见国际专利申请公开号WO2016/018960和WO2016/018963，各自通过引用整体并入本文。如上所述，在一些情况下，核酸探针内的读取序列群体可以以各种组合进行组合，例如，使得相对少量的读取序列可以用于确定相对大量的不同核酸探针，如本文所讨论的。
因此，在一些情况下，核酸探针群体可各自含有一定数量的读取序列，其中一些在不同的核酸探针之间共有，使得核酸探针的总群体可包含一定数量的读取序列。核酸探针群体可具有任何合适数量的读取序列。例如，核酸探针群体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等的读取序列。在一些实施方案中，也可以有多于20个。另外，在一些情况下，核酸探针群体总共可具有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、20个或更多个、24个或更多个、32个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、64个或更多个、100个或更多个、128个或更多个等的可能存在的读取序列，尽管一些或所有探针可各自包含多于一个读取序列，如本文所讨论的。另外，在一些实施方案中，核酸探针群体可具有不超过100、不超过80、不超过64、不超过60、不超过50、不超过40、不超过32、不超过24、不超过20、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3或不超过两个存在的读取序列。任何这些的组合也是可能的，例如，核酸探针群体可以总共包含10至15个读取序列。
作为从核酸探针内包含的相对少量的读取序列组合鉴别相对大量核酸探针的方法的非限制性实例，在6种不同类型的核酸探针的群体中，每种核酸探针包含一个或多个读取序列，群体内的读取序列的总数可以不大于4。应当理解，尽管在该实例中使用了4个读取序列以便于解释，但是在其他实施方案中，可以实现更大数量的核酸探针，例如根据应用，使用5、8、10、16、32个等或更多个读取序列，或本文所述的任何其他合适数量的读取序列。例如，如果每个核酸探针含有两个不同的读取序列，则通过使用4个这样的读取序列(A、B、C和D)，可以单独鉴别多达6个探针。应当注意，在该实例中，核酸探针上的读取序列的排序不是必需的，即“AB”和“BA”可以被视为同义的(尽管在其他实施方案中，读取序列的排序可以是必不可少，“AB”和“BA”可能不一定是同义的)。类似地，如果在核酸探针群体中使用5个读取序列(A、B、C、D和E)，则可以单独鉴别多达10个探针(例如AB、AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE)。例如，本领域普通技术人员将理解，对于在每个探针上具有n个读取序列的群体中的k个读取序列，可以产生多达
Figure BDA0003181219900000291
个不同的探针，假设读取序列的排序不是必需的；因为并非所有探针都需要具有相同数量的读取序列，并且不需要在每个实施方案中使用所有读取序列组合，所以在某些实施方案中也可以使用多于或少于这个数量的不同探针。另外，还应该理解，在一些实施方案中，每个探针上的读取序列的数量不必相同。例如，一些探针可以含有2个读取序列，而其他探针可以含有3个读取序列。
在一些方面，样品中核酸探针的读取序列和/或结合模式可用于定义错误检测和/或错误校正代码，例如，以减少或防止核酸的错误鉴别或误差。因此，例如，如果指示了结合(例如，如使用信号传导实体确定的)，则可以用“1”标识位置；相反，如果没有指示结合，则可以用“0”标识位置(或者在某些情况下，反之亦然)。然后能够使用例如使用不同核酸探针的多轮结合测定来产生例如用于该空间位置的“代码字”。在一些实施方案中，可以对代码字进行错误检测和/或校正。例如，可以组织代码字，使得如果对于给定的一组读取序列或核酸探针的结合模式没有找到匹配，则可以将匹配识别为错误，并且任选地，可以对序列应用错误校正以确定核酸探针的正确靶标。在一些情况下，代码字可以具有较少的“字母”或位置，即由代码字编码的核酸的总数，例如，其中每个代码字编码不同的核酸。
这种错误检测和/或错误校正代码可以采用各种形式。先前已在诸如电信行业的其他环境中开发了各种这样的代码，例如Golay代码或汉明代码。在一组实施方案中，分配核酸探针的读取序列或结合模式，使得并非每种可能的组合都被分配。
例如，如果4个读取序列是可能的并且核酸探针含有2个读取序列，那么可以鉴别多达6个核酸探针；但是，使用的核酸探针的数量可能少于6。类似地，对于在每个核酸探针上具有n个读取序列的群体中的k个读取序列，可以产生
Figure BDA0003181219900000292
个不同的探针，但是使用的核酸探针的数量可以是多于或少于
Figure BDA0003181219900000293
的任何数量。另外，这些可以被随机分配，或以特定方式分配以增加检测和/或校正错误的能力。
作为另一个实例，如果使用多轮核酸探针，则可以任意选择轮数。如果在每一轮中，每个靶标可以给出两种可能的结果，例如被检测到或未被检测到，则n轮探针可能有多达2n个不同的靶标，但实际使用的靶标的数量可以是小于2n的任何数量。例如，如果在每一轮中，每个靶标可以给出多于两种可能的结果，例如在不同的颜色通道中检测到，则n轮探针可能有超过2n(例如3n、4n......)个不同的靶标。在一些情况下，实际使用的靶标的数量可以是小于该数量的任何数量。另外，这些可以被随机分配，或以特定方式分配以增加检测和/或校正错误的能力。
代码字可用于定义各种代码空间。例如，在一组实施方案中，可以在代码空间内分配代码字或核酸探针，使得该分配由汉明距离分开，汉明距离测量给定模式中导致核酸探针被误解为不同的有效核酸探针的不正确“读取”的数量。在某些情况下，汉明距离可以是至少2、至少3、至少4、至少5、至少6等。另外，在一组实施方案中，分配可以形成为汉明代码，例如汉明(7,4)代码，汉明(15,11)代码，汉明(31,26)代码，汉明(63,57)代码，汉明(127,120)代码等。在另一组实施方案中，分配可以形成SECDED代码，例如SECDED(8,4)代码、SECDED(16,4)代码、SCEDED(16,11)代码、SCEDED(22,16)代码、SCEDED(39,32)代码、SCEDED(72,64)代码等。在另一组实施方案中，分配可以形成扩展的二进制Golay代码、完美的二进制Golay代码或三进制Golay代码。在另一组实施方案中，分配可以表示从上述任何代码中获取的可能值的子集。
例如，可以通过仅使用包含固定或恒定数量的“1”位(或“0”位)的二进制字来对靶标进行编码来形成错误校正码。例如，代码空间可能仅包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16等个“1”位(或“0”位)，例如，所有代码具有相同数量的“1”位或“0”位等。在另一组实施方案中，为了解决不对称读出错误，分配可以表示从上述代码中获取的可能值的子集。例如，在一些情况下，其中“1”位的数量对于所有使用的二进制字可以是固定的代码可以在“0”位被测量为“1”或“1”位被测量为“0”处的速率不同时消除具有不同数量的“1”的字的偏倚测量。
因此，在一些实施方案中，一旦确定了代码字(例如，如本文所讨论的)，就可以将代码字与已知的核酸代码字进行比较。如果发现匹配，则可以鉴别或确定核酸靶标。如果没有找到匹配，则可以鉴别代码字的读取中的错误。在一些情况下，还可以应用错误校正来确定正确的代码字，从而导致核酸靶标的正确身份。在一些情况下，可以选择代码字，使得在假设仅存在一个错误的情况下只有一个可能的正确代码字可用，因此，核酸靶标的仅一个正确身份是可能的。在一些情况下，这也可以推广到更大的代码字间距或汉明距离；例如，可以选择代码字，使得如果存在两个、三个或四个错误(或者在一些情况下更多)，则只有一个可能的正确代码字可用，并且因此只有核酸靶标的一个正确身份是可能的。
错误校正代码可以是二进制错误校正代码，或者它可以基于其他编号系统，例如三进制或四进制错误校正代码。例如，在一组实施方案中，可以使用多于一种类型的信号传导实体并将其分配至错误校正代码内的不同数字。因此，作为非限制性示例，第一信号传导实体(或在一些情况下，多于一个信号传导实体)可以被分配为“1”，并且第二信号传导实体(或者在一些情况下，多于一个信号传导实体)可以被分配为“2”(“0”表示不存在信号传导实体)，并且分配的代码字用于定义三进制错误校正代码。类似地，第三信号传导实体可以另外被分配为“3”以产生四进制错误校正代码等。
如本文所讨论的，在某些方面，确定信号传导实体，例如通过成像，以确定核酸探针和/或产生代码字。信号传导实体的实例包括这里讨论的那些。在一些情况下，可以使用各种技术，例如在空间上确定样品内的信号传导实体。在一些实施方案中，信号传导实体可以是荧光的，并且用于确定样品内荧光的技术，例如荧光显微术或共聚焦显微术，可以用于在空间上识别细胞内信号传导实体的位置。在一些情况下，样品内的实体的位置可以在两维或甚至三维中确定。另外，在一些实施方案中，多于一个信号传导实体可以一次(例如，具有不同颜色或发射的信号传导实体)和/或顺序地确定。
另外，在一些实施方案中，可以测定鉴别的靶标(例如核酸靶标)的置信水平。例如，可以使用精确匹配的数量与具有一个或多个一位(one-bit)错误的匹配的数量的比率来测定置信水平。在一些情况下，可以仅使用具有大于特定值的置信度比率的匹配。例如，在某些实施方案中，仅当匹配的置信度比率为大于约0.01、大于约0.03、大于约0.05、大于约0.1、大于约0.3、大于约0.5、大于约1、大于约3、大于约5、大于约10、大于约30、大于约50、大于约100、大于约300、大于约500、大于约1000或任何其他合适的值时，才可接受匹配。另外，在一些实施方案中，仅当所鉴别的靶标的置信度比率比内标或假阳性对照大约0.01、约0.03、约0.05、约0.1、约0.3、约0.5、约1、约3、约5、约10、约30、约50、约100、约300、约500、约1000或任何其它合适的值时，才可接受匹配。
在一些实施方案中，可以以相对高的分辨率确定实体的空间位置(并因此，实体可以与之关联的核酸探针)。例如，可以以优于约100微米、优于约30微米、优于约10微米、优于约3微米、优于约1微米、优于约800nm、优于约600nm、优于约500nm、优于约400nm、优于约300nm、优于约200nm、优于约100nm、优于约90nm、优于约80nm、优于约70nm、优于约60nm、优于约50nm、优于约40nm、优于约30nm、优于约20nm、或优于约10nm等的空间分辨率确定位置。
有多种技术能够以光学方式测定或成像实体的空间位置，例如使用荧光显微术。在一些实施方案中可以使用多于一种颜色。在一些情况下，空间位置可以以超分辨率确定，或者以比光的波长或衍射极限更好的分辨率确定。非限制性实例包括STORM(随机光学重建显微术)、STED(受激发射耗尽显微术)、NSOM(近场扫描光学显微术)、4Pi显微术、SIM(结构照明显微术)、SMI(空间调制照明)显微术、RESOLFT(可逆饱和光学线性荧光跃迁显微术)、GSD(基态损耗显微术)、SSIM(饱和结构照明显微术)、SPDM(光谱精密距离显微术)、光活化定位显微术(PALM)、荧光光活化定位显微术(FPALM)、LIMON(3D光学显微术纳米尺寸显微术)、超分辨率光学波动成像(SOFI)等。参见，例如，2010年11月23日发布的Zhuang等人的题为“Sub-Diffraction Limit Image Resolution and Other Imaging Techniques”的美国专利号7,838,302；2013年10月22日发布的Zhuang等人的题为“Sub-diffraction LimitImage Resolution in Three Dimensions”的美国专利号8,564,792；或者2013年6月20日公开的Zhuang等人的题为“High Resolution Dual-Objective Microscopy”的国际专利申请公开号WO2013/090360，其各自通过引用整体并入本文。
作为举例说明性的非限制性实例，在一组实施方案中，样品可以用高数值孔径、100X放大倍率的油浸物镜和在电子倍增CCD相机上收集的光成像。在另一个实例中，样品可以用高数值孔径、40X放大倍率的油浸透镜和用宽视场科学CMOS相机收集的光成像。在各种非限制性实施方案中，使用物镜和相机的不同组合，单个视场可对应于不小于40x40微米、80x80微米、120x120微米、240x240微米、340x340微米或500x500微米等。类似地，在一些实施方案中，单个相机像素可对应于不小于80x80nm、120x120nm、160x160nm、240x240nm或300x300nm等的样品区域。在另一个实例中，样品可以用低数值孔径、10X放大倍率的空气透镜和用sCMOS相机收集的光成像。在另外的实施方案中，可以通过经由由扫描镜或旋转盘产生的单个或多个扫描衍射受限焦点照射样品而对样品进行光学切片，并且收集物通过单个或多个针孔。在另一个实施方案中，还可以通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种产生的光的薄片来照射样品。
在一个实施方案中，可以通过单高斯模式激光线照射样品。在一些实施方案中，通过使这些激光线穿过通过压电或其他机械装置振动的多模光纤，可以使照明轮廓变平。在一些实施方案中，可以通过使单模高斯光束通过各种折射光束形成器(例如，piShaper或一系列堆叠的Powell透镜)来使照明轮廓变平。在又一组实施方案中，高斯光束可以通过各种不同的漫射元件，例如磨砂玻璃或工程化漫射器，其在一些情况下可以高速旋转以去除残留的激光散斑。在又一个实施方案中，激光照射可以通过一系列小透镜阵列以产生近似于平坦照明场的照明重叠图像。
在一些实施方案中，可以确定实体的空间位置的质心。例如，可以使用本领域普通技术人员已知的图像分析算法在图像或一系列图像内确定信号传导实体的质心。在一些情况下，可以选择算法以确定样品中的非重叠单个发射器和/或部分重叠的单个发射器。合适技术的非限制性示例包括最大似然算法、最小二乘算法、贝叶斯算法、压缩感测算法等。在一些情况下也可以使用这些技术的组合。
另外，在一些情况下信号传导实体可以被灭活。例如，在一些实施方案中，可以将可与信号传导实体缔合(例如使用扩增器核酸)的第一次级核酸探针应用于可以识别第一读取序列(例如在核酸探针上)的样品，然后可以在将第二次级核酸探针(例如可与信号传导实体缔合(例如使用扩增器核酸))应用于样品之前灭活信号传导实体。如果使用多个信号传导实体，则可以使用相同或不同的技术来灭活信号传导实体，并且可以例如顺序地或同时地灭活多个信号传导实体中的一些或全部。
灭活可以通过去除信号传导实体(例如，来自样品，或来自核酸探针等)和/或通过以某种方式化学改变信号传导实体(例如通过光漂白信号传导实体，漂白或化学改变信号传导实体的结构，例如通过还原等)来引起。例如，在一组实施方案中，荧光信号传导实体可以通过化学或光学技术灭活，例如氧化、光漂白、化学漂白、严格洗涤或酶消化或通过暴露于酶的反应、使信号传导实体与其他组分(例如，探针)解离、信号传导实体的化学反应(例如，与能够改变信号传导实体的结构的反应物)等。例如，漂白可以通过暴露于氧气、还原剂而发生，或者信号传导实体可以从核酸探针化学裂解并通过流体流动洗掉。
在一些实施方案中，各种核酸探针可与一种或多种信号传导实体缔合，例如使用本文讨论的扩增器核酸。如果使用多于一种核酸探针，则信号传导实体可各自相同或不同。在某些实施方案中，信号传导实体是能够发光的任何实体。例如，在一个实施方案中，信号传导实体是荧光的。在其他实施方案中，信号传导实体可以是磷光的、放射性的、吸收性的等。在一些情况下，信号传导实体是可以以相对高的分辨率(例如，在比可见光的波长或衍射极限更好的分辨率下)在样品内测定的任何实体。信号传导实体可以是例如染料、小分子、肽或蛋白质等。在一些情况下，信号传导实体可以是单个分子。如果使用多个第二核酸探针，则核酸探针可与相同或不同的信号传导实体缔合。
信号传导实体的非限制性实例包括荧光实体(荧光团)或磷光实体，例如，花青染料(例如Cy2，Cy3，Cy3B，Cy5，Cy5.5，Cy7等)，Alexa Fluor染料，Atto染料，光切换染料，光活化染料，荧光染料，金属纳米粒子，半导体纳米粒子或“量子点”，荧光蛋白，例如GFP(绿色荧光蛋白)，或光活化荧光蛋白，例如PAGFP，PSCFP，PSCFP2，Dendra，Dendra2，EosFP，tdEos，mEos2，mEos3，PAmCherry，PAtagRFP，mMaple，mMaple2和mMaple3。其他合适的信号传导实体是本领域普通技术人员已知的。参见，例如，美国专利号7,838,302或国际专利申请公开号WO2015/160690，其各自通过引用整体并入本文。
在一组实施方案中，信号传导实体可以通过可被裂解以释放信号传导实体的键与寡核苷酸序列连接。在一组实施方案中，荧光团可以通过可裂解键(例如光可裂解键)与寡核苷酸缀合。光可裂解键的非限制性实例包括但不限于1-(2-硝基苯基)乙基，2-硝基苄基，生物素亚磷酰胺，丙烯酰亚磷酰胺，二乙基氨基香豆素，1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)乙基，环十二烷基(二甲氧基-2-硝基苯基)乙基，4-氨基甲基-3-硝基苄基，(4-硝基-3-(1-氯羰基氧基乙基)苯基)甲基-S-乙酰硫代酸酯，(4-硝基-3-(1-叔羰基氧基乙基)苯基)甲基-3-(2-吡啶基二硫代丙酸)酯，3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-(2-硝基苯基)-丙烷-1,3-二醇-[2-氰基乙基]-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺，1-[2-硝基-5-(6-三氟乙酰基己酰氨基甲基(trifluoroacetylcaproamidomethyl))苯基]-乙基-[2-氰基-乙基-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺，1-[2-硝基-5-(6-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丁酰氨基甲基)苯基]-乙基-[2-氰基乙基-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺，1-[2-硝基-5-(6-(N-(4,4'-二甲氧基三苯甲基))-生物素酰胺基己酰胺基-甲基)苯基]-乙基-[2-氰基乙基-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺，或类似的接头。寡核苷酸序列可以是例如初级或次级(或其他)扩增器核酸，例如本文讨论的那些。
在另一组实施方案中，荧光团可以通过二硫键与寡核苷酸缀合。二硫键可以被各种还原剂裂解，例如但不限于二硫苏糖醇，二硫赤藓糖醇，β-巯基乙醇，硼氢化钠，硫氧还蛋白，谷氧还蛋白，胰蛋白酶原，肼，二异丁基氢化铝，草酸，甲酸，抗坏血酸，亚磷酸，氯化锡，谷胱甘肽，硫代乙醇酸，2,3-二巯基丙醇，2-巯基乙胺，2-氨基乙醇，三(2-羧乙基)膦，双(2-巯基乙基)砜，N,N'-二甲基-N,N'-双(巯基乙酰基)肼，3-巯基丙酸盐，二甲基甲酰胺，硫代丙基-琼脂糖，三正丁基膦，半胱氨酸，硫酸铁，亚硫酸钠，亚磷酸盐，次磷酸盐，硫代磷酸盐等，和/或其任意的组合。寡核苷酸序列可以是例如初级或次级(或其他)扩增器核酸，例如本文讨论的那些。
在另一个实施方案中，荧光团可以通过一种或多种硫代磷酸酯修饰的核苷酸(其中硫修饰取代桥接和/或非桥接氧)与寡核苷酸缀合。在某些实施方案中，通过添加化合物(例如但不限于碘乙醇，在乙醇中混合的碘，硝酸银或氯化汞)，荧光团可以从寡核苷酸上裂解下来。在又一组实施方案中，信号传导实体可以通过还原或氧化进行化学灭活。例如，在一个实施方案中，可以使用硼氢化钠将发色团例如Cy5或Cy7还原至稳定的非荧光状态。在另一组实施方案中，荧光团可以通过偶氮键与寡核苷酸缀合，偶氮键可以用2-[(2-N-芳基氨基)苯基偶氮]吡啶裂解。在另一组实施方案中，荧光团可以通过合适的核酸区段与寡核苷酸缀合，所述核酸区段可以在适当暴露于DNA酶(例如外切脱氧核糖核酸酶或内切脱氧核糖核酸酶)时裂解。实例包括但不限于脱氧核糖核酸酶I或脱氧核糖核酸酶II。在一组实施方案中，裂解可以通过限制性内切核酸酶发生。可能合适的限制性内切核酸酶的非限制性实例包括BamHI、BsrI、NotI、XmaI、PspAI、DpnI、MboI、MnlI、Eco57I、Ksp632I、DraIII、AhaII、SmaI、MluI、HpaI、ApaI、BclI、BstEII、TaqI、EcoRI、SacI、HindII、HaeII、DraII、Tsp509I、Sau3AI、PacI等。已经详细研究了3000多种限制酶，其中超过600种可商购获得。在另一组实施方案中，荧光团可以与生物素缀合，并且寡核苷酸与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合。生物素与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白之间的相互作用允许荧光团与寡核苷酸缀合，同时充分暴露于过量添加的游离生物素可以“竞争胜过”键联，从而导致裂解发生。另外，在另一组实施方案中，可以使用相应的“立足点探针”去除探针，“立足点探针”包含与探针相同的序列，以及与编码探针同源的额外数量的碱基(例如，1-20个额外的碱基，例如，5个额外的碱基)。这些探针可以通过链置换相互作用去除标记的读取探针。寡核苷酸序列可以是例如初级或次级(或其他)扩增器核酸，例如本文讨论的那些。
如本文所用，术语“光”通常是指具有任何合适波长(或等效地，频率)的电磁辐射。例如，在一些实施方案中，光可以包括光学或视觉范围内的波长(例如，具有约400nm至约700nm的波长，即“可见光”)，红外波长(例如，具有约300微米至700nm的波长)，紫外波长(例如，具有约400nm至约10nm的波长)等。在某些情况下，如下面详细讨论的，可以使用多于一个实体，即化学上不同或独特(例如在结构上)的实体。然而，在其他情况下，实体可以在化学上相同或至少基本上在化学上相同。
在一组实施方案中，信号传导实体是“可切换的”，即该实体可以在两个或多个状态之间切换，其中至少一个状态发射具有期望波长的光。在其他一个或多个状态下，实体可以不发光，或发射不同波长的光。例如，实体可以被“激活”到能够产生具有期望波长的光的第一状态，并且被“灭活”到不能发射相同波长的光的第二状态。如果实体可以被合适波长的入射光激活，则该实体是“可光激活的”。作为非限制性实例，Cy5可以通过不同波长的光以受控和可逆的方式在荧光和暗状态之间切换，即633nm(或642nm、647nm、656nm)红光可以使Cy5切换或灭活到稳定的暗状态，而405nm绿光可以使Cy5切换或激活回到荧光状态。在一些情况下，实体可以在两个或多个状态之间可逆地切换，例如，在暴露于适当的刺激时。例如，可以使用第一刺激(例如，第一波长的光)来激活可切换实体，而可以使用第二刺激(例如，第二波长的光)来灭活可切换的实体，例如，到非发光状态。可以使用任何合适的方法来激活实体。例如，在一个实施方案中，合适波长的入射光可用于激活实体以发射光，即实体是“可光切换的”。因此，可光切换的实体可以通过例如不同波长的入射光在不同的发光或非发光状态之间切换。光可以是单色的(例如，使用激光产生)或多色的。在另一个实施方案中，实体可以在电场和/或磁场的刺激下被激活。在其他实施方案中，实体可以在暴露于合适的化学环境时被激活，例如通过调节pH值，或诱导涉及实体的可逆化学反应等。类似地，可以使用任何合适的方法来使实体灭活，并且激活和灭活实体的方法不必相同。例如，实体可以在暴露于合适波长的入射光时被灭活，或者实体可以通过等待足够的时间而被灭活。
通常，“可切换”实体可以由本领域普通技术人员通过确定第一状态的实体在暴露于激发波长时可以发光的条件，将实体从第一状态切换到第二状态(例如在暴露于切换波长的光时)，然后显示当暴露于激发波长时处于第二状态的实体不能再发光(或以大大降低的强度发光)来鉴别。
在一组实施方案中，如所讨论的，可切换实体可在暴露于光时被切换。在一些情况下，用于激活可切换实体的光可以来自外部源，例如光源，例如激光光源，靠近可切换实体的另一个发光实体等。在一些情况下，第二发光实体可以是荧光实体，并且在某些实施方案中，第二发光实体本身也可以是可切换实体。
在一些实施方案中，可切换实体包括第一发光部分(例如荧光团)和激活或“切换”第一部分的第二部分。例如，在暴露于光时，可切换实体的第二部分可以激活第一部分，从而使第一部分发光。活化剂部分的实例包括但不限于Alexa Fluor 405(Invitrogen)、Alexa Fluor 488(Invitrogen)、Cy2(GE Healthcare)、Cy3(GE Healthcare)、Cy3B(GEHealthcare)、Cy3.5(GE Healthcare)或其他合适的染料。发光部分的实例包括但不限于Cy5、Cy5.5(GE Healthcare)、Cy7(GE Healthcare)、Alexa Fluor 647(Invitrogen)、AlexaFluor 680(Invitrogen)、Alexa Fluor 700(Invitrogen)、Alexa Fluor 750(Invitrogen)、Alexa Fluor 790(Invitrogen)、DiD、DiR、YOYO-3(Invitrogen)、YO-PRO-3(Invitrogen)、TOT-3(Invitrogen)、TO-PRO-3(Invitrogen)或其他合适的染料。它们可以例如共价地，例如直接地或通过接头连接在一起，从而例如形成化合物例如但不限于Cy5-Alexa Fluor 405、Cy5-Alexa Fluor 488、Cy5-Cy2、Cy5-Cy3、Cy5-Cy3.5、Cy5.5-AlexaFluor 405、Cy5.5-Alexa Fluor 488、Cy5.5-Cy2、Cy5.5-Cy3、Cy5.5-Cy3.5、Cy7-AlexaFluor 405、Cy7-Alexa Fluor 488、Cy7-Cy2、Cy7-Cy3、Cy7-Cy3.5、Alexa Fluor 647-AlexaFluor 405、Alexa Fluor 647-Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647-Cy2、Alexa Fluor647-Cy3、Alexa Fluor 647-Cy3.5、Alexa Fluor 750-Alexa Fluor 405、Alexa Fluor750-Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 750-Cy2、Alexa Fluor 750-Cy3或Alexa Fluor 750-Cy3.5。本领域普通技术人员将了解这些和其他化合物的结构，其中许多是可商购获得的。这些部分可以通过共价键或通过接头连接，例如下文详细描述的那些。其他发光或活化剂部分可以包括具有通过多甲炔链连接的两个季铵化氮原子的部分，其中每个氮独立地是杂芳族部分(例如吡咯、咪唑、噻唑、吡啶、喹啉、吲哚、苯并噻唑等)的一部分或非芳香胺的一部分。在一些情况下，两个氮原子之间可能有5、6、7、8、9个或更多个碳原子。
在某些情况下，当彼此分离时，发光部分和活化剂部分可以各自是荧光团，即当暴露于刺激(例如激发波长)时可以发射特定发射波长的光的实体。然而，当形成包含第一荧光团和第二荧光团的可切换实体时，第一荧光团形成第一发光部分并且第二荧光团形成激活剂部分，该激活剂部分响应于刺激激活或“切换”第一部分。例如，可切换实体可以包括直接键合到第二荧光团的第一荧光团，或者第一和第二实体可以通过接头或共同实体连接。可以通过本领域普通技术人员已知的方法测试一对发光部分和激活剂部分是否产生合适的可切换实体。例如，可以使用各种波长的光来刺激该对，并且可以测量来自发光部分的发射光以确定该对是否进行了合适的切换。
作为非限制性实例，Cy3和Cy5可以连接在一起以形成这样的实体。在该实例中，Cy3是能够激活Cy5(发光部分)的激活剂部分。因此，处于或接近实体的激活或第二部分的吸收最大值的光(例如，对于Cy3，接近532nm的光)可以使该部分激活第一发光部分，从而使第一部分发光(例如，对于Cy5，接近647nm)。参见，例如，美国专利号7,838,302，通过引用整体并入本文。在一些情况下，随后可以通过任何合适的技术(例如，通过将647nm红光引导至分子的Cy5部分)来将第一发光部分灭活。
可能合适的激活剂部分的其他非限制性实例包括1,5IAEDANS、1,8-ANS、4-甲基伞形酮、5-羧基-2,7-二氯荧光素、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘基荧光素、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5-FAM(5-羧基荧光素)、5-HAT(羟基色胺)、5-羟基色胺(HAT)、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、6-羧基罗丹明6G、6-CR 6G、6-JOE、7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-羟基-4-甲基香豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、ABQ、酸性品红、ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)、吖啶橙、吖啶红、吖啶黄、锥虫黄、锥虫黄Feulgen SITSA、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor 635、茜素络合物、茜素红、AMC、AMCA-S、AMCA(氨甲基香豆素)、AMCA-X、氨基放线菌素D、氨基香豆素、氨甲基香豆素(AMCA)、苯胺蓝、Anthrocyl stearate、APTRA-BTC、APTS、Astrazon Brilliant Red 4G、Astrazon Orange R、Astrazon Red 6B、AstrazonYellow 7GLL、Atabrine、ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 520、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO 590、ATTO 594、ATTO 610、ATTO 611X、ATTO 620、ATTO633、ATTO 635、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、ATTO-TAG CBQCA、ATTO-TAG FQ、金胺、Aurophosphine G、Aurophosphine、BAO 9(双氨基苯基噁二唑)、BCECF(高pH)、BCECF(低pH)、硫酸黄连素、Bimane、双苯甲酰胺、双苯酰亚胺(Hoechst)、双-BTC、Blancophor FFG、Blancophor SV、BOBO-1、BOBO-3、Bodipy 492/515、Bodipy 493/503、Bodipy 500/510、Bodipy 505/515、Bodipy 530/550、Bodipy 542/563、Bodipy 558/568、Bodipy 564/570、Bodipy 576/589、Bodipy 581/591、Bodipy 630/650-X、Bodipy 650/665-X、Bodipy 665/676、Bodipy Fl、Bodipy FL ATP、Bodipy Fl-神经酰胺、Bodipy R6G、Bodipy TMR、Bodipy TMR-X缀合物、Bodipy TMR-X、SE、Bodipy TR、Bodipy TRATP、Bodipy TR-X SE、BO-PRO-1、BO-PRO-3、Brilliant Sulphoflavin FF、BTC、BTC-5N、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、Calcium Crimson、Calcium Green、Calcium Green-1 Ca2+染料、Calcium Green-2 Ca2+、Calcium Green-5N Ca2+、Calcium Green-C18 Ca2+、CalciumOrange、Calcofluor White、羧基-X-罗丹明(5-ROX)、Cascade Blue、Cascade Yellow、儿茶酚胺、CCF2(GeneBlazer)、CFDA、色霉素A、色霉素A、CL-NERF、CMFDA、香豆素鬼笔环肽、CPM甲基香豆素、CTC、CTC Formazan、Cy2、Cy3.1 8、Cy3.5、Cy3、Cy5.1 8、环AMP Fluorosensor(FiCRhR)、Dabcyl、丹磺酰、丹磺酰胺、丹磺酰尸胺、丹磺酰氯、丹磺酰DHPE、丹磺酰氟、DAPI、Dapoxyl、Dapoxyl 2、Dapoxyl 3'DCFDA、DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯)、DDAO、DHR(二氢罗丹明123)、Di-4-ANEPPS、Di-8-ANEPPS(非比率)、DiA(4-Di-16-ASP)、二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)、DiD-亲脂示踪剂、DiD(DiIC18(5))、DIDS、二氢罗丹明123(DHR)、DiI(DiIC18(3))、二硝基苯酚、DiO(DiOC18(3))、DiR、DiR(DiIC18(7))、DM-NERF(高pH)、DNP、多巴胺、DTAF、DY-630-NHS、DY-635-NHS、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 800、ELF 97、曙红、赤藓红、赤藓红ITC、溴化乙锭、乙锭同二聚体-1(EthD-1)、Euchrysin、EukoLight、氯化铕(III)、Fast Blue、FDA、Feulgen(副蔷薇苯胺)、FIF(甲醛诱导的荧光)、FITC、Flazo Orange、Fluo-3、Fluo-4、荧光素(FITC)、荧光素二乙酸酯、荧光祖母绿、荧光金(羟芪巴脒)、荧光红宝石、FluorX、FM 1-43、FM 4-46、Fura Red(高pH)、Fura Red/Fluo-3、Fura-2、Fura-2/BCECF、Genacryl亮红B、Genacryl亮黄10GF、Genacryl粉3G、Genacryl黄5GF、GeneBlazer(CCF2)、Gloxalic Acid、Granular blue、血卟啉、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、HPTS、羟基香豆素、羟芪巴脒(荧光金)、羟色胺、Indo-1,高钙、Indo-1,低钙、吲哚二碳花青(DiD)、吲哚三碳菁(DiR)、Intrawhite Cf、JC-1、JO-JO-1、JO-PRO-1、LaserPro、Laurodan、LDS 751(DNA)、LDS 751(RNA)、Leucophor PAF、Leucophor SF、Leucophor WS、Lissamine罗丹明、Lissamine罗丹明B、钙黄绿素/乙锭同二聚体、LOLO-1、LO-PRO-1、荧光黄、Lyso Tracker Blue、Lyso TrackerBlue-White、Lyso Tracker Green、Lyso Tracker Red、Lyso Tracker Yellow、LysoSensorBlue、LysoSensor Green、LysoSensor Yellow/Blue、Mag Green、Magdala Red(根皮红B)、Mag-Fura Red、Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1、Magnesium Green、MagnesiumOrange、Malachite Green、Marina Blue、Maxilon Brilliant Flavin 10GFF、MaxilonBrilliant Flavin 8GFF、Merocyanin、甲氧基香豆素、Mitotracker Green FM、Mitotracker Orange、Mitotracker Red、光辉霉素、单溴二胺、单溴二胺(mBBr-GSH)、单氯二胺、MPS(甲基绿焦宁茋)、NBD、NBD胺、尼罗红、Nitrobenzoxadidole、去甲肾上腺素、Nuclear Fast Red、Nuclear Yellow、Nylosan Brilliant Iavin E8G、Oregon Green、Oregon Green 488-X、Oregon Green、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、副蔷薇苯胺(Feulgen)、PBFI、根皮红B(Magdala Red)、PhorwiteAR、Phorwite BKL、Phorwite Rev、Phorwite RPA、磷化氢3R、PKH 26(Sigma)、PKH67、PMIA、Pontochrome Blue Black、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、樱草灵、Procion Yellow、碘化丙啶(PI)、PyMPO、芘、焦宁、焦宁B、Pyrozal Brilliant Flavin 7GF、QSY 7、氮芥喹吖因、试卤灵、RH 414、Rhod-2、罗丹明、罗丹明110、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B 200、罗丹明B extra、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明绿、罗丹明Phallicidine、罗丹明Phalloidine、罗丹明红、罗丹明WT、玫瑰红、S65A、S65C、S65L、S65T、SBFI、血清素、Sevron亮红2B、Sevron亮红4G、Sevron亮红B、Sevron橙、Sevron黄L、SITS、SITS(樱草灵)、SITS(茋异硫磺酸)、SNAFL钙黄绿素、SNAFL-1、SNAFL-2、SNARF钙黄绿素、SNARF1、SodiumGreen、SpectrumAqua、SpectrumGreen、SpectrumOrange、Spectrum Red、SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉鎓)、茋类、磺酰罗丹明B can C、磺酰罗丹明Extra、SYTO 11、SYTO 12、SYTO13、SYTO 14、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 17、SYTO 18、SYTO 20、SYTO 21、SYTO 22、SYTO 23、SYTO 24、SYTO 25、SYTO 40、SYTO 41、SYTO 42、SYTO 43、SYTO 44、SYTO 45、SYTO 59、SYTO60、SYTO 61、SYTO 62、SYTO 63、SYTO 64、SYTO 80、SYTO 81、SYTO 82、SYTO 83、SYTO 84、SYTO 85、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、四环素、四甲基罗丹明(TAMRA)、TexasRed、Texas Red-X缀合物、噻二羰花青(DiSC3)、噻嗪红R、噻唑橙、硫磺素5、硫磺素S、硫磺素TCN、Thiolyte、噻唑橙、Tinopol CBS(Calcofluor White)、TMR、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、TRITC(异硫氰酸四甲基罗丹明)、True Blue、TruRed、Ultralite、荧光素钠B、Uvitex SFC、WW 781、X-罗丹明、XRITC、二甲苯橙、Y66F、Y66H、Y66W、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、SYBR Green、噻唑橙(相互螯合染料)，或它们的组合。
本发明的另一方面涉及一种计算机实现的方法。例如，可以提供能够自动和/或重复执行本文描述的任何方法的计算机和/或自动系统。如本文所使用的，“自动”设备是指能够在没有人的指导的情况下操作的设备，即，自动设备可以在任何人已完成采取任何动作以促进功能(例如通过输入指令到计算机中以启动过程)之后的一段时间内执行功能。通常，自动设备可以在此时间点之后执行重复功能。在一些情况下，处理步骤也可以记录在机器可读介质上。
例如，在一些情况下，计算机可用于控制样品的成像，例如，使用荧光显微术、STORM或其他超分辨率技术，例如本文所述的那些。在一些情况下，计算机还可以控制操作例如图像分析中的漂移校正、物理对准、杂交和簇对齐，簇解码(例如，荧光簇解码)，错误检测或校正(例如，如本文所讨论的)，降噪，从背景特征(例如图像中的噪声或碎片)识别前景特征等。作为示例，计算机可用于控制样品内的信号传导实体的激活和/或激发，和/或信号传导实体的图像的获取。在一组实施方案中，可以使用具有各种波长和/或强度的光来激发样品，并且可以使用计算机将用于激发样品的光的波长序列与获取的包含信号传导实体的样品的图像相关联。例如，计算机可以将具有各种波长和/或强度的光应用于样品，以在每个感兴趣区域中产生不同平均数量的信号传导实体(例如，每个位置一个激活的实体，每个位置两个激活的实体等)。在一些情况下，如上所述，该信息可用于构建图像和/或确定信号传导实体的位置，在一些情况下以高分辨率确定。
在一些方面，样品被放置在显微镜上。在一些情况下，显微镜可包含一个或多个通道，例如微流体通道，以引导或控制流体进入或离开样品。例如，在一个实施方案中，可以通过使流体通过一个或多个通道流入或流出样品而将核酸探针例如本文讨论的那些引入样品和/或从样品中移除。在一些情况下，还可以有一个或多个用于保持流体的腔室或储存器，例如与通道和/或与样品流体连通。本领域普通技术人员将熟悉用于将流体移入或移出样品的通道，包括微流体通道。
Zhuang等人于2018年12月13日提交的题为“Amplification Methods andSystems for MERFISH and Other Applications”的美国临时专利申请系列号62/779,333通过引用整体并入本文。以下文件也通过引用整体并入本文：美国专利号2017/0220733和2017/0212986；国际专利申请公开号WO2016/018960、WO2016/018963、WO2018/089445和WO2018/089438；以及国际专利申请系列号PCT/US18/34651。
以下实施例旨在举例说明本发明的某些实施方案，但并不例示本发明的全部范围。
实施例
实施例1
多重化抗错荧光原位杂交(MERFISH)直接成像和分析在其天然细胞环境中的数百至数千个RNA种类，从而实现空间分辨的单细胞转录组学。以下实施例使用受控或可饱和的扩增方法进行MERFISH测量。这些实施例表明RNA FISH样品的显著信号增加，而不会增加光斑尺寸或增加光斑之间的亮度变化。以接近100％的检测效率准确测量和鉴别了130个RNA种类。这些进步应该显著扩展MERFISH在细胞培养和组织中可以解决的生物学问题的范围。
特别地，这些实施例显示了一种结合MERFISH扩增来显著增加MERFISH信号亮度的方法。这些实施例表明，这样的方法以恒定的变异系数方式将RNA smFISH信号放大了30.6倍，而没有光斑尺寸的变化。这样的方法提供了一种快速、简单、有效的方式来以接近100％的检测效率同时扩增同一单细胞中数百个RNA的信号。
将DNA扩增并入MERFISH的设计。这些实施例显示，使用本文所述的某些修改，这样的扩增策略在与MERFISH结合时具有某些优势。发现决定扩增系数的支架是可预测和可设计的。即使多个扩增器具有不同的结合速率，对于所有测试的扩增器，也有足够的时间达到饱和状态，从而使扩增可控、可重复且具有低变异，从而有利于MERFISH解码过程。
在这些实施例中使用的这样的标记方法在图1A-1E中示出。使用MERFISH系统对具有与靶RNA模板互补的30聚体靶区域序列和多个20聚体读出序列的寡核苷酸探针(被称为编码探针)的复杂文库进行染色(参见，例如，国际专利申请公开号WO2016/018960和WO2016/018963，各自通过引用整体并入本文)。
扩增器组根据扩增器染色轮次命名为初级扩增器和次级扩增器。每个初级扩增器具有与编码探针的读出序列之一结合的互补序列和N个20聚体重复序列。每个次级扩增器具有与初级扩增器上的20聚体重复序列之一互补的序列以及与最终读出互补的N个20聚体重复序列。在初级和次级扩增器染色后，原始读出信号被一对一扩增N2倍到最终读出信号。这样的扩增被称为NxN扩增(图1A-1E)。
这些扩增有几个显著的进步。首先，扩增器仅使用三种核苷酸设计。包含四种核苷酸中的仅三种的探针序列比使用所有四种核苷酸的序列具有更快的杂交速率。这被认为是由于这样的序列中的显著较少的次级结构。此外，为了在扩增器染色和洗涤步骤中保留与RNA结合的编码探针，将20聚体结合序列用于在37℃下用10％甲酰胺染色和洗涤的扩增器。含有针对RNA的30聚体靶向区域的编码探针在47℃下用30％甲酰胺洗涤。扩增是在凝胶嵌入和清洗的MERFISH样品上进行的，这些样品继承了去除荧光背景的能力。参见，例如，国际专利申请公开号WO2018/089445，其通过引用整体并入本文。
图1A-1E显示了用于MERFISH成像的扩增的示意图。图1A显示样本用MERFISH编码探针文库染色并在聚丙烯酰胺凝胶中清洗。每个编码探针具有30聚体靶序列和多个读出序列。图1B显示针对图1A中的框出区域，初级扩增器与编码探针上的原始读出杂交，随后进行洗涤步骤以去除额外的初级扩增器。初级扩增器具有与编码探针上的读出序列互补的序列和N个20聚体重复序列。图1C显示次级扩增器结合初级扩增器重复区域。次级扩增器具有与初级扩增器上的20聚体重复序列之一互补的序列以及与最终读出互补的N个20聚体重复序列。洗涤后，将样本用于多轮MERFISH成像，并使用二硫键连接的荧光团进行最终读出。图1D显示了使用NxN扩增的样本的第一轮MERFISH最终读出染色。相比之下，图1E显示了使用未扩增的样本的第一轮MERFISH读出染色。
实施例2
DNA扩增的特性。在该实施例中，为了实施设计，将包含读出序列的编码探针与细丝蛋白A(FLNA)mRNA杂交，并对U-2OS细胞中的编码探针进行5x5扩增，其中每个扩增器染色轮次进行15分钟。测量了编码探针上的直接标记读出或使用编码探针上的读出5x5扩增的标记的平均FLNA smFISH光斑亮度。观察到10.5倍的信号增加，达到理论值的42％。参见图2A和2B。
认为未达到理论扩增系数的一种可能性是扩增器染色时间不够。进行相同的5x5扩增的时间系列，其中每轮扩增器染色进行15分钟、30分钟、60分钟和180分钟(图2C)。结果表明，扩增的信号在每轮中在15分钟内对于杂交的扩增器饱和。在15分钟时的饱和表明扩增器的完全组装非常迅速，说明了在本实施例中使用三字母字母表设计扩增器探针的额外优势。相比之下，其他方法通常每轮扩增可花费45分钟或更长时间。
接下来，研究了扩增器的长度是否影响扩增性能。研究了4x4扩增器和9x9扩增器。对于4x4扩增和9x9扩增分别观察到5.5倍和30.6倍的亮度增加。结果表明，所有三个扩增器长度都提供了理论扩增值的～40％(图2D)。
扩增的一个潜在后果是增加FISH光斑尺寸，这可能会降低鉴别这些RNA的能力，因为来自一个分子的信号与来自其他分子的信号重叠。据信，9x9扩增器支架的长度为约132nm(200个核苷酸x 2x0.33nm/核苷酸)，这在衍射极限内。正如预期的那样，4x4扩增、5x5扩增和9x9扩增的光斑尺寸测量结果是相同的(图2E)。基于这样的设计，光斑间的亮度变化预计不会显著增加。为了证实这一点，使用未扩增、4x4扩增、5x5扩增和9x9扩增的样品测量了光斑亮度的变化系数。发现光斑间的亮度变化没有随着扩增而增加(图2F)。
图2A-2F显示DNA扩增显著增加了信号亮度，而光斑尺寸和光斑之间的亮度变化没有显著变化。图2A显示了用FLNA smFISH探针染色的U-2OS细胞(用读出探针标记的未扩增的样品)的图像(左)。对比度相对于左图增加10倍以更好地示出荧光信号(中)，或者对比度在5x5扩增并用读出探针染色后增加(右)。(比例尺，10微米)。图2B是图2A中的框出区域的展开图。(比例尺，2微米)。
图2C显示了使用扩增器染色时间系列的各个FLNA mRNA光斑的平均亮度。平均亮度已标准化至直接用读出探针染色的未扩增的对照样品。图2D显示了4x4扩增和9x9扩增的样品中各个FLNA mRNA光斑的平均亮度。平均亮度已标准化至直接用读出探针染色的未扩增的对照样品。图2E显示了未扩增、4x4扩增、5x5扩增和9x9扩增的细胞中的平均FLNA mRNA光斑尺寸。宽度(半极大处全宽度)由RNA光斑的点扩散函数(PSF)的高斯拟合确定。图2F显示了未扩增、4x4扩增、5x5扩增和9x9扩增的样品中RNA光斑亮度的变异系数。
实施例3
用于MERFISH成像的扩增器筛选。在该实施例中，为了将扩增扩展到MERFISH测量，通过使用16位的改进的汉明距离-4(MHD4)编码方案，使用了16对初级扩增器和次级扩增器。简而言之，通过生成随机序列组来设计20聚体的三字母重复序列，其中对于初级扩增器和次级扩增器分别为针对A的25％、针对T的25％和针对C的50％或针对A的25％、针对T的25％和针对G的50％的每碱基概率。序列在序列本身内进行交叉检查，并针对人类转录组进行blast以避免长于11nt的同源区域。5x5扩增器提供光斑亮度的一个数量级的变化。因此，在随后的MERFISH测量中使用了5x5扩增。还发现大约20％的扩增器具有强烈的次级扩增器诱导的、RNA依赖性的或背景或低扩增效率。这些可以通过改变扩增器对来校正。从20对5x5扩增器中筛选出16对用于MERFISH成像(图5A-5C)。
实施例4
使用DNA扩增进行MERFISH测量。为了验证实施例3中描述的16对扩增器是否适用于MERIFSH，在U-2OS细胞中使用130RNA MERFISH文库进行5x5扩增。8轮双色成像用于读出16位。此外，使用二硫键的还原裂解来在使用扩增和未扩增样品的连续几轮成像之间去除连接到读出探针的荧光团。图3A显示可以在5x5扩增样品的八个杂交和成像轮次中的每一轮中检测到个体RNA分子，从而允许对它们的身份进行解码。
为了确定5x5扩增的MERFISH测量的RNA解码质量，从几个方面考虑了由于将某些RNA误认为错误种类而导致的非零错误鉴别错误以及由于在检测和解码过程中遗漏了某些RNA而导致的非100％检出率。首先，检查了与错误鉴别率相关的空白条形码的每个细胞的RNA计数和130个真实的RNA条形码。发现在5x5扩增的MERFISH测量中，130个RNA种类中的121个对每个细胞具有比用空白条形码观察到的每个细胞的最大拷贝数更高的拷贝数(图3B)。
接下来，确定每个位的平均1到0错误率和0到1错误率。如果这些错误率很低，会观察到理论上的潜在获得的高检出率。观察到约1.7％的1到0错误率和约0.6％的0到1错误率(图3C)。将5x5扩增的数据与之前未扩增的MERFISH数据进行进一步比较，后者具有接近100％的检测效率。图3D显示，在扩增的样品中观察到的每个细胞的拷贝数与未扩增的样品中测量的那些强烈相关，其Pearson相关系数为0.98(对于其测量的拷贝数大于对于最大的空白条形码计数观察到的拷贝数的121个RNA种类，ρ10(rho)＝0.98)。扩增的样品中测量的拷贝数与未扩增的样品中测量的拷贝数之比为0.98+/-0.12(SEM，n＝121个RNA)；因此，5x5扩增保持接近100％的检测效率。
将通过MERFISH针对这些RNA检测到的每个细胞的平均拷贝数与5x5扩增关于通过RNA-seq测量的RNA丰度进行比较(图3E)。Pearson相关系数为0.90。此外，每个细胞的拷贝数结果在具有扩增的MERFISH实验的重复之间具有高度可重复性(图3F)。
图3A-3F显示了在U-2OS细胞中使用5x5扩增的130个RNA的MERFISH测量。在图3A的左侧，在使用RNA的条形码的130个RNA种类的5x5扩增的MERFISH测量中检测到的所有鉴别的RNA由标记的颜色(此处由阴影表示)表示。(比例尺，10微米)。右侧，对于左图的框出区域的来自使用标记有Cy5(绿色)或Alexa750(红色)的读出探针的八轮杂交和成像中的每一轮的双色smFISH图像。(比例尺，2微米)。图3B显示了在大约1200个细胞中用5x5扩增检测到的真实RNA条形码(深色)和空白对照条形码(浅色)的每个细胞的平均RNA拷贝数，从最大值到最小值排序。图3C显示了对于使用5x5扩增的MERFISH测量的每个位的错误率，即包含给定的位翻转的测量的条形码的比例。显示了每个位的1到0错误率(左)和0到1错误率(右)。图3D显示了在5x5扩增的U-2OS细胞中对于这些RNA种类观察到的每个细胞的平均拷贝数相对从未扩增的样品获得的拷贝数。Pearson相关系数为0.98。图3E显示了通过使用5x5扩增的MERFISH测定的每个细胞的平均RNA拷贝数相对通过RNAseq测定的丰度。RNA丰度的log10值的Pearson相关系数为0.9。图3F显示了相对重复样品在一个5x5扩增的样品中检测到的每个细胞的平均拷贝数。Pearson相关系数为0.96。
实施例5
这些实施例呈现了MERFISH和三字母扩增方法的组合以测量单个细胞中的数百个RNA。结果表明，三字母扩增器与靶标结合并在每个扩增器染色轮次的15分钟内达到饱和状态。该方法用于通过分别使用4x4扩增、5x5扩增和9x9扩增将RNA smFISH信号放大到5.5倍、10.5倍和30.6倍，而没有光斑尺寸变化。未扩增、4x4扩增、5x5扩增和9x9扩增的样品中光斑亮度的变化系数非常接近，表明DNA扩增过程中光斑亮度的变化没有增加，这对于MERFISH解码很重要。最后，根据在扩增的样品中测量的拷贝数与在未扩增样品中测量的拷贝数之比为0.98，在扩增样品中证明了接近100％的检测效率的对130个RNA种类的准确鉴别和计数。
观察到对于所有三个扩增，包括4x4、5x5和9x9扩增，扩增系数约为理论值的40％。据信扩增器和读出结合效率不是100％。每轮的平均结合率为约73.5％。此外，80％的经筛选的扩增器组运行良好，产生了显著的扩增。剩下的20％具有高背景或低扩增效率。扩增器组在没有进一步精炼的情况下即可工作的这样的可能性说明了将这样的方法快速扩展到大量读出序列的扩增的能力，这进而将有助于扩展多重化能力。
将扩增应用于现有的MERFISH文库。扩增产生的信号亮度的显著增加应该会扩展MERFISH的几个额外应用。在这里，每个RNA使用92个编码探针进行MERFISH测量。来自这样的扩增方法的信号的增加应提供检测短得多的RNA的可能性，潜在地使用少至10个编码探针的短至300聚体长度的RNA。用相对较少的探针检测RNA分子的能力也将显著提高RNA同种型的辨别。其次，MERFISH测量使用与成像视野(FOV)数成正比的动态时间，以及固定的读出染色、读出切割和洗涤时间。当FOV增加到大的数量时，成像时间将主导MERFISH吞吐量。应该可能通过扩增的信号以更短的暴露时间显著减少成像持续时间，从而提高MERFISH吞吐量。此外，与宽视场显微术相比，转盘共焦成像在检测较厚样品中的光子时具有更高的对比度，但灵敏度较低。因此，扩增与MERFISH的整合将有助于检测组织中的FISH信号，例如，使用转盘共聚焦显微镜。
实施例6
以下是上述实施例中使用的各种材料和方法。
编码探针的设计。如下进行人骨肉瘤细胞(U-2OS)(ATCC)中的MERFISH测量。简而言之，使用16位MHD4代码来编码RNA。在这样的编码方案中，140个可能的条形码中的每一个具有恒定的4的汉明权重(即每个条形码中“1”位的数量)，以避免由于“1”到“0”和“0”到“1”错误的差异率而在不同条形码的测量中出现潜在偏倚。此外，所有条形码具有至少4的汉明距离以允许错误检测和错误校正。140个可能的条形码中的130个用于编码细胞RNA，10个条形码用作空白对照。在编码探针文库中，每个RNA种类包含92个编码探针，每个编码探针包含分配给每个RNA的四个读出序列中的三个。
编码探针的构建。从复杂的寡核苷酸库中扩增编码探针文库。简而言之，oligopool(CustomArray)首先通过有限循环PCR扩增以制作体外转录模板，通过体外转录(New England Biolabs)转化并扩增成RNA，然后通过逆转录(Maxima RT H-,ThermoFisher)将RNA转化回DNA。参见，例如，美国专利申请公开号2017/0212986，其通过引用并入本文。在体外转录和苯酚-氯仿提取后，通过脱盐柱(Thermo Fisher)去除过量的NTP或dNTP，以提高纯度和反应产率。最终的DNA探针通过碱水解去除RNA模板、苯酚-氯仿提取以去除蛋白质和乙醇沉淀以浓缩探针来进行纯化。最终的探针重新悬浮在不含RNA酶的水中，并储存在-20℃。
盖玻片的硅烷化。为了稳定聚丙烯酰胺(PA)凝胶，将盖玻片硅烷化。简而言之，将40毫米直径的1.5号盖玻片(Bioptechs，0420-0323-2)通过在化学通风橱中在室温下浸入37％(vol/vol)甲醇和盐酸的1:1混合物中洗涤30分钟。然后将盖玻片在去离子水中洗涤3次，并在70％(vol/vol)乙醇中洗涤一次。将盖玻片用氮气气流干燥，然后在室温下浸入含有0.1％(vol/vol)三乙胺(Sigma)和0.2％(vol/vol)烯丙基三氯甲硅烷(Sigma)的氯仿中30分钟。盖玻片分别用纯氯仿和纯乙醇洗涤一次，然后用氮气吹干。然后将硅烷化的盖玻片在室温下储存在干燥室中数周，其中硅烷层的质量没有明显降低。
细胞培养和固定。U-2OS细胞用含有10％(vol/vol)胎牛血清(FBS)(ThermoFisher Scientific)和青霉素链霉素(Thermo Fisher Scientific)的Eagle极限必需培养基(ATCC)培养。为了帮助细胞粘附，将硅烷化的盖玻片用在无核酸酶的水中稀释的0.1mg/mL聚-D-赖氨酸(PDL)(Sigma)在室温下涂覆1小时。将盖玻片用水洗涤3次，在室温下在水中孵育过夜，然后在接种细胞前干燥和UV灭菌。然后，U-2OS细胞以每个盖玻片250,000个细胞接种，在37℃和5％CO2下持续48小时。在室温下将细胞用1xPBS中的4％(vol/vol)多聚甲醛(PFA)(Electron Microscopy Sciences)固定15分钟，用1xPBS洗涤3次，然后用在1xPBS中的0.5％(vol/vol))Triton X-100(Sigma)透化10分钟，并再次用1xPBS洗涤3次。
编码探针染色如下进行。固定和透化的U-2OS细胞在编码洗涤缓冲液中孵育5分钟，该缓冲液包含在无核酸酶水中的2x柠檬酸钠盐水(SSC)(Ambion)和30％(vol/vol)甲酰胺(Ambion)。然后将编码杂交缓冲液中的30微升的～300微摩尔MERFISH编码探针或～1微摩尔FLNA编码探针和3.3微摩尔聚(dT)LNA锚定探针(具有序列/5Acryd/TTGAGTGGATGGAGTGTAATT+TT+TT+TT+TT+TT+TT+TT+TT+TT+T(SEQ ID NO:65)，读出序列的20-nt反向互补序列和20-nt交替dT的序列和胸苷锁定核酸(dT+)，具有5’-丙烯酰胺基(acrydite)修饰(Integrated DNA Technologies))添加到石蜡膜的表面，并用含有细胞的盖玻片覆盖。编码杂交缓冲液含有补充有10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯(Sigma)、0.1％(wt/vol)酵母tRNA(Life Technologies)和1％(vol/vol)鼠RNase抑制剂(New EnglandBiolabs)的编码洗涤缓冲液。样品在杂交烘箱内的潮湿室中在37℃下孵育36h。然后将细胞用编码洗涤缓冲液洗涤两次，并各自在47℃下孵育30分钟。
样品嵌入和清洗。使用4％PA凝胶将RNA锚定在编码探针染色的样品中适当的位置。简而言之，首先将盖玻片上的编码探针染色的样品与脱气PA溶液(其含有4％(vol/vol)的19:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺(BioRad)、60mM Tris·HCl pH 8(Thermo Fisher)、0.3MNaCl(Thermo Fisher))和1:100,000稀释的0.1微米直径的羧酸盐修饰的橙色荧光珠(LifeTechnologies，F-8800)孵育2分钟。珠子用作基准标记，用于对齐多轮MERFISH成像中拍摄的图像。然后将含有细胞的盖玻片与含有最终浓度分别为0.05％(wt/vol)和0.05％(vol/vol)的聚合引发剂过硫酸铵(Sigma)和促进剂TEMED(Sigma)的相同PA凝胶溶液再次孵育2分钟。将50微升这样的凝胶溶液添加到已经用1mL GelSlick(Lonza)预处理过(以免粘至PA)的玻璃板(TED Pella)的表面上。吸出样品以去除多余的PA凝胶溶液，然后倒转在50微升的液滴上以在盖玻片和玻璃板之间形成没有任何气泡的PA薄层。然后在室温下凝胶浇注1.5小时后轻轻分离盖玻片和玻璃板，并用在无核酸酶的水中的2％(wt/vol)十二烷基硫酸钠(SDS)(Thermo Fisher Scientific)、50mM Tris·HCl pH 8(Ambion)、1mM EDTA(Ambion)和0.5％(vol/vol)Triton X-100的消化缓冲液洗涤盖玻片两次。然后，将凝胶浸入补充有1％(vol/vol)蛋白酶K(New England Biolabs)的消化缓冲液并在潮湿的37℃培养箱中消化>12小时。消化的样品在振荡器上用2xSSC洗涤3次，每次15分钟。对于未扩增的MERFISH测量，将样品在4℃下储存在补充有0.1％(vol/vol)鼠RNase抑制剂的2xSSC中不超过48小时，或者将样品进行扩增器染色。
扩增器染色。初级和次级扩增器在凝胶嵌入和清洗的样品中染色。样品在10％甲酰胺洗涤缓冲液中孵育5分钟，该缓冲液含有在无核酸酶的水中的2xSSC(Thermo Fisher)和10％(vol/vol)甲酰胺(Thermo Fisher)。接下来，将在包含2xSSC、10％(vol/vol)甲酰胺、0.1％(wt/vol)酵母tRNA(Life Technologies)、1％(vol/vol)鼠RNase抑制剂(NewEngland Biolabs)和10％(wt/vol)硫酸葡聚糖(Sigma)的扩增器杂交缓冲液中的50微升5nM初级扩增器添加到石蜡膜的表面。用Kimwipes去除额外的10％甲酰胺洗涤缓冲液后，将样品覆盖在石蜡膜上的50微升液滴上，并在湿度控制的37℃培养箱中孵育30分钟(MERFISH)或15分钟、30分钟、60分钟和180分钟的时间系列以用于结合率测量。然后将样品在室温下在皮氏培养皿中用10％甲酰胺洗涤缓冲液洗涤3次，每次5分钟。在新的石蜡膜上，添加在扩增器杂交缓冲液中的50微升的5nM次级扩增器。将洗涤过的样品再次覆盖在液滴上，并在37℃培养箱中孵育与初级扩增器染色相同的时间。然后将样品在室温下在10％甲酰胺洗涤缓冲液中洗涤两次，每次5分钟，在37℃培养箱中用10％甲酰胺洗涤缓冲液洗涤第三次，进行15分钟。将样品立即成像，或在4℃下储存在补充有0.1％(vol/vol)鼠RNase抑制剂的2xSSC中不超过48h。
MERFISH成像平台。样品在哈佛大学高级成像中心的自制高通量成像平台上成像。简而言之，该显微镜围绕Olympus IX-71显微镜主体和Nikon CFI Plan Apo Lambda 60x油镜构建。使用固态激光器(MBP Communications，2RU-VFL-P-500-750-B1R；MBPCommunications，2RU-VFL-P-2000-647-B1R；MBP Communications，2RU-VFL-P-2000-560-B1R；MBP Communications，2RU-VFL-P-500-488-B1R；Coherent，Cube 405)提供750、647、560、488和405nm的照射。这些激光线用于激发分别用Alexa750和Cy5、橙色基准珠、聚dT读出和DAPI标记的读出探针。使用πShaper(Pishaper)使照明轮廓变平。使用五波段二向色镜(Chroma，zy405/488/561/647/752RP-UF1)将来自样品的荧光发射与激光照射分离，并在通过两个重复的定制五陷波滤波器(Chroma，ZET405/488/561/647-656/752m)以去除杂散激发光后用科学CMOS相机(sCMOS；Hamamatsu，C11440-22CU)成像。sCMOS相机的像素尺寸被确定为对应于样品平面中的109nm。每个成像帧的曝光时间为500毫秒。通过电动显微镜载物台(Ludl)控制样品位置，并通过定制的聚焦锁定系统保持焦点，该系统通过物镜纳米定位器(Mad City Labs，Nano-F100S)和IR激光器(Thorlabs，LP980-SF15)在CMOS相机(Thorlabs，DCC1545M)上的反射之间的反馈系统实现。样品盖玻片保持在流动室(Bioptechs，FCS2)内，该室中的缓冲液交换使用控制三个八通阀(Hamilton、MVP和HVXM 8-5)和一个蠕动泵(Gilison，Minipuls 3)的定制的自动化流体系统进行指导。
样品成像。连续MERFISH成像是在上文描述的高通量成像平台上进行的。简而言之，每轮MERFISH使用读出探针染色(10分钟)、洗涤缓冲液洗涤(5分钟)、成像缓冲液流动(3分钟)、100-400FOV成像、读出荧光团切割(15分钟)和2xSSC洗涤(5分钟)。对每个样品进行8轮两色MERFISH成像。具体而言，读出探针染色是通过在无核酸酶的水中的2xSSC、10％(vol/vol)碳酸亚乙酯(Sigma-Aldrich)、0.1％(vol/vol)鼠RNase抑制剂(NEB)的杂交缓冲液中流动3nM读出探针来完成的。洗涤缓冲液含有在无核酸酶的水中的2xSSC和10％(vol/vol)碳酸亚乙酯。成像缓冲液使用在无核酸酶的水中的2xSSC、50mM Tris·HCl pH 8、10％(wt/vol)葡萄糖、2mM Trolox(Sigma-Aldrich)、0.5mg/mL葡萄糖氧化酶(Sigma-Aldrich)、40微克/mL过氧化氢酶(Sigma-Aldrich)和0.1％(vol/vol)鼠RNase抑制剂。使用包含2xSSC和50mM Tris(2-羧乙基)膦(TCEP；Sigma)的切割缓冲液切割使染料与探针缀合的二硫键。SmFISH成像类似于单轮MERFISH成像，但没有切割和2xSSC洗涤步骤。
图像处理和解码。对于FLNA smFISH数据，未扩增和扩增的FISH光斑的亮度和PSF尺寸通过高斯拟合程序计算。对于MERFISH数据，不同成像轮次中相同FOV的图像的配准以及RNA条形码的解码如下进行。简而言之，使用每轮成像中基准珠的定位来校正每轮成像中图像之间的偏移。接下来，图像中的背景用高通滤波器去除，RNA光斑通过反卷积收紧，图像之间位置略有不同的RNA质心通过低通滤波器连接。然后通过经由迭代过程均衡它们的强度直方图来将RNA光斑不同颜色通道的亮度标准化。通过比较8个双色轮次中所有16个图像中的每个像素的标准化强度，将条形码分配给各个像素。
在包含两个10核Intel Xeon E5-2680 2.8-GHz CPU和256GB RAM的桌面服务器上运行计算。
实施例7
为了显示组织样品中的5x5扩增器，在该实施例中，选择了小鼠内侧视前区(MPOA)。将该组织切成10微米的切片，并用135基因MERFISH文库染色，然后进行凝胶嵌入和清洗。然后使用与上述技术类似的技术对组织样品进行5x5扩增。
图4A显示了5x5扩增的亮光斑的第一轮原始图像。图4B是图4A中白色框出区域的放大视图。(图4A中的比例尺为10微米，图4B中的比例尺为2微米)。
解码后，将来自MERFISH测量的RNA计数与来自RNA-seq的RNA丰度数据进行比较。它们是强烈相关的，Pearson相关系数为0.81。这可以在图4C中看到，其显示了FPKM(每百万个映射读数的每千碱基转录物的片段)和每个视野(FOV)的计数的图。
虽然已在本文中描述和说明了本发明的几个实施方案，但本领域普通技术人员将容易地设想用于进行所述功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个优点的各种其它方法和/或结构，并且这样的变化和/或修改的每一种被认为在本发明的范围内。更通常地，本领域技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺度、材料和构型意欲为示例性的并且实际参数、尺度、材料和/或构型将取决于对其使用本发明的教导的具体一个或多个应用。使用不超过常规实验，本领域技术人员将认可或能够确定本文所述的特定的本发明的实施方案的许多等同物。因此，应理解，前述实施方案仅通过举例的方式提出，并且在所附权利要求和其等同物的范围内，本发明可按与明确描述和要求保护的方式不同的方式来实施。本发明涉及本文所述的各种个体特性、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特性、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个这样的特性、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合包括在本发明的范围内。
在本说明书和通过引用并入的文献包括冲突和/或不一致的公开内容的情况下，以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或更多个文献包括冲突和/或不一致的公开内容，则以具有较晚生效日期的文献为准。
如本文中所定义和使用的，所有定义应当被理解为优先于词典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义的术语的一般含义。
除非明确地指示与之相反，否则不定冠词“一种/一个(a)”和“一种/一个(an)”，如本文中在说明书和权利要求中所用，应当被理解为意指“至少一种/一个”。
短语“和/或”，如在本文中在说明书和权利要求中所用，应当被理解为意指所连接的元素的“任一个或两者”，即元素在一些情况下结合地存在以及在其它情况下分离地存在。利用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式来解释，即所连接的元素的“一个或多个”。除通过“和/或”从句明确确定的元素外，还可任选地存在其它元素，无论与明确确定的那些元素相关还是无关。因此，作为非限定性实例，对“A和/或B”的提及，当与开放性措辞诸如“包含/包括”结合使用时，在一个实施方案中可仅指A(任选地包括除B以外的元素)；在另一个实施方案中可仅指B(任选地包括除A以外的元素)；在另一个实施方案中，可指A和B(任选地包括其它元素)；依此类推。
如本文中在说明书和权利要求中所用，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分开各项时，“或”或“和/或”应当被理解为是包含性的，即包含至少一个，但也包括许多个元素或一列元素中的多于一个，以及任选地，包括另外未列出的项。只有明确地指明相反的术语，例如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或当用于权利要求中时的“由……组成”将指包含多个元素或一列元素中的恰好一个元素。一般地，如本文中所用的术语“或”应当仅在冠有排他性的术语诸如“任一”、“……之一”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时被解释为表示排他性选择(即“一个或另一个但非两个”)。
如本文中在说明书和权利要求中所用，关于一列一个或多个元素的短语“至少一个”应当被理解为意指选自一列元素中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表内明确列出的每一个元素的至少一个并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许可任选地存在除短语“至少一个”所指的元素列表内明确确定的元素之外的元素，无论与那些明确确定的元素相关还是不相关。因此，作为非限定性实例，“A和B的至少一个”(或，等同地，“A或B的至少一个”或，等同地“A和/或B的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)A而无B存在(且任选地包括除B以外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)B而无A存在(且任选地包括除A以外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)A和至少一个(任选地包括不止一个)B(且任选地包括其它元素)；依此类推。
当在本文中使用词语“约”来表示数字时，应该理解，本发明的又一个实施方案包括未通过词语“约”的存在而修饰的该数字。
还应当理解，除非明确地指明与之相反，否则在包括不止一个步骤或行为的本文请求保护的任何方法中，所述方法的步骤或行为的顺序不必须地限定于其中叙述所述方法的步骤或行为的顺序。
在权利要求中，以及在上述说明书中，所有过渡短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“牵涉”、“拥有”、“组成”等被理解为开放性的，即意指包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭性的或半封闭性的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所示的。
序列表
<110> 哈佛学院院长及董事
<120> 用于MERFISH和其他应用的扩增方法和系统
<130> H0498.70680WO00
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/779,333
<151> 2018-12-13
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
atcctccttc aatacatccc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
acactaccac catttcctat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
actccactac tactcactct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
accctctaac ttccatcaca 20
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<212> DNA
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accacaaccc attcctttca 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 6
tttctaccac taatcaaccc 20
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
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accctttaca aacacaccct 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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tcctattctc aacctaacct 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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tatccttcaa tccctccaca 20
<210> 10
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
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acattacacc tcattctccc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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tttactccct acacctccaa 20
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ttctccctct atcaactcta 20
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 13
acccttacta ctacatcatc 20
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tcctaacaac caactactcc 20
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<223> 合成多核苷酸
<400> 15
tctatcatta ccctcctcct 20
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<212> DNA
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tattcacctt acaaaccctc 20
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<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 17
acactttcac cttcccatta ttacactttc accttcccat tattacactt tcaccttccc 60
attattacac tttcaccttc ccattattac actttcacct tcccattatt atcctccttc 120
aatacatccc 130
<210> 18
<211> 130
<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
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tcccaacaca tcctatctca tatcccaaca catcctatct catatcccaa cacatcctat 60
ctcatatccc aacacatcct atctcatatc ccaacacatc ctatctcata acactaccac 120
catttcctat 130
<210> 19
<211> 130
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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acccattact ccattaccat atacccatta ctccattacc atatacccat tactccatta 60
ccatataccc attactccat taccatatac ccattactcc attaccatat actccactac 120
tactcactct 130
<210> 20
<211> 130
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 20
tatcatcctt acacctcact aatatcatcc ttacacctca ctaatatcat ccttacacct 60
cactaatatc atccttacac ctcactaata tcatccttac acctcactaa accctctaac 120
ttccatcaca 130
<210> 21
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 21
actctccttt cccataacct atactctcct ttcccataac ctatactctc ctttcccata 60
acctatactc tcctttccca taacctatac tctcctttcc cataacctat accacaaccc 120
attcctttca 130
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成多核苷酸
<400> 22
atcatcaaca cctcatcaac atatcatcaa cacctcatca acatatcatc aacacctcat 60
caacatatca tcaacacctc atcaacatat catcaacacc tcatcaacat tttctaccac 120
taatcaaccc 130
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
accctttcaa tccattccaa ttaccctttc aatccattcc aattaccctt tcaatccatt 60
ccaattaccc tttcaatcca ttccaattac cctttcaatc cattccaatt accctttaca 120
aacacaccct 130
<210> 24
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
acttctcacc taccaatcat atacttctca cctaccaatc atatacttct cacctaccaa 60
tcatatactt ctcacctacc aatcatatac ttctcaccta ccaatcatat tcctattctc 120
aacctaacct 130
<210> 25
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
tcccacacat catttccatt aatcccacac atcatttcca ttaatcccac acatcatttc 60
cattaatccc acacatcatt tccattaatc ccacacatca tttccattaa tatccttcaa 120
tccctccaca 130
<210> 26
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
tcctcctatt ccctaacaac tatcctccta ttccctaaca actatcctcc tattccctaa 60
caactatcct cctattccct aacaactatc ctcctattcc ctaacaacta acattacacc 120
tcattctccc 130
<210> 27
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 27
tcccatcttc ttcctaacta tatcccatct tcttcctaac tatatcccat cttcttccta 60
actatatccc atcttcttcc taactatatc ccatcttctt cctaactata tttactccct 120
acacctccaa 130
<210> 28
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
tcacaatcct accactacct aatcacaatc ctaccactac ctaatcacaa tcctaccact 60
acctaatcac aatcctacca ctacctaatc acaatcctac cactacctaa ttctccctct 120
atcaactcta 130
<210> 29
<211> 130
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 29
taacctacac atctccacaa tataacctac acatctccac aatataacct acacatctcc 60
acaatataac ctacacatct ccacaatata acctacacat ctccacaata acccttacta 120
ctacatcatc 130
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<213> 人工序列
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<223> 合成多核苷酸
<400> 30
tcaatccatt accatcccac attcaatcca ttaccatccc acattcaatc cattaccatc 60
ccacattcaa tccattacca tcccacattc aatccattac catcccacat tcctaacaac 120
caactactcc 130
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
aaccaaaccc actactacca ttaaccaaac ccactactac cattaaccaa acccactact 60
accattaacc aaacccacta ctaccattaa ccaaacccac tactaccatt tctatcatta 120
ccctcctcct 130
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 32
tacccaacta aacccaactc tatacccaac taaacccaac tctataccca actaaaccca 60
actctatacc caactaaacc caactctata cccaactaaa cccaactcta tattcacctt 120
acaaaccctc 130
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 33
atgaggaaag tggtgtgaga ttatgaggaa agtggtgtga gattatgagg aaagtggtgt 60
gagattatga ggaaagtggt gtgagattat gaggaaagtg gtgtgagata taatgggaag 120
gtgaaagtgt 130
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<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 34
gaggagtgga taaatggtgt atgaggagtg gataaatggt gtatgaggag tggataaatg 60
gtgtatgagg agtggataaa tggtgtatga ggagtggata aatggtgtat tgagatagga 120
tgtgttggga 130
<210> 35
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 35
agtgtgggat tgatgagata ttagtgtggg attgatgaga tattagtgtg ggattgatga 60
gatattagtg tgggattgat gagatattag tgtgggattg atgagatatt atggtaatgg 120
agtaatgggt 130
<210> 36
<211> 130
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 36
tgtggtttgg agatgataga tatgtggttt ggagatgata gatatgtggt ttggagatga 60
tagatatgtg gtttggagat gatagatatg tggtttggag atgatagata agtgaggtgt 120
aaggatgata 130
<210> 37
<211> 130
<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 37
gagattagag atgagttgga tagagattag agatgagttg gatagagatt agagatgagt 60
tggatagaga ttagagatga gttggataga gattagagat gagttggata aggttatggg 120
aaaggagagt 130
<210> 38
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
agttgaggtg ggagagtatt atagttgagg tgggagagta ttatagttga ggtgggagag 60
tattatagtt gaggtgggag agtattatag ttgaggtggg agagtattat gttgatgagg 120
tgttgatgat 130
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 39
gggtagtggg aatgatttat atgggtagtg ggaatgattt atatgggtag tgggaatgat 60
ttatatgggt agtgggaatg atttatatgg gtagtgggaa tgatttatat ttggaatgga 120
ttgaaagggt 130
<210> 40
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 40
aggtaatgag ttagaggtga ttaggtaatg agttagaggt gattaggtaa tgagttagag 60
gtgattaggt aatgagttag aggtgattag gtaatgagtt agaggtgatt atgattggta 120
ggtgagaagt 130
<210> 41
<211> 130
<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 41
gggatgtgat ttgttaggaa ttgggatgtg atttgttagg aattgggatg tgatttgtta 60
ggaattggga tgtgatttgt taggaattgg gatgtgattt gttaggaatt aatggaaatg 120
atgtgtggga 130
<210> 42
<211> 130
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<220>
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<400> 42
gatgaagatt gagggaagaa ttgatgaaga ttgagggaag aattgatgaa gattgaggga 60
agaattgatg aagattgagg gaagaattga tgaagattga gggaagaatt gttgttaggg 120
aataggagga 130
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<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 43
gggattatgg gtttgtagta ttgggattat gggtttgtag tattgggatt atgggtttgt 60
agtattggga ttatgggttt gtagtattgg gattatgggt ttgtagtata tagttaggaa 120
gaagatggga 130
<210> 44
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<223> 合成多核苷酸
<400> 44
tagagggagt aagatgagga tatagaggga gtaagatgag gatatagagg gagtaagatg 60
aggatataga gggagtaaga tgaggatata gagggagtaa gatgaggata aggtagtggt 120
aggattgtga 130
<210> 45
<211> 130
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 45
gtgaagtgga aggtgagatt atgtgaagtg gaaggtgaga ttatgtgaag tggaaggtga 60
gattatgtga agtggaaggt gagattatgt gaagtggaag gtgagattaa ttgtggagat 120
gtgtaggtta 130
<210> 46
<211> 130
<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 46
gaatggaggg ttagaggtaa ttgaatggag ggttagaggt aattgaatgg agggttagag 60
gtaattgaat ggagggttag aggtaattga atggagggtt agaggtaatt gtgggatggt 120
aatggattga 130
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 47
tgggatagta tgtggaaagt aatgggatag tatgtggaaa gtaatgggat agtatgtgga 60
aagtaatggg atagtatgtg gaaagtaatg ggatagtatg tggaaagtaa tggtagtagt 120
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<223> 合成多核苷酸
<400> 48
agttgggtat ggagaaaggt atagttgggt atggagaaag gtatagttgg gtatggagaa 60
aggtatagtt gggtatggag aaaggtatag ttgggtatgg agaaaggtat gagttgggtt 120
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<223> 合成多核苷酸
<400> 49
tctcacacca ctttcctcat 20
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<212> DNA
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acaccattta tccactcctc 20
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<212> DNA
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<400> 51
tatctcatca atcccacact 20
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<400> 52
tctatcatct ccaaaccaca 20
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<223> 合成多核苷酸
<400> 54
aatactctcc cacctcaact 20
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 55
ataaatcatt cccactaccc 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成多核苷酸
<400> 56
tcacctctaa ctcattacct 20
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
<400> 57
ttcctaacaa atcacatccc 20
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<223> 合成多核苷酸
<400> 58
ttcttccctc aatcttcatc 20
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<212> DNA
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<223> 合成多核苷酸
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tactacaaac ccataatccc 20
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aatctcacct tccacttcac 20
<210> 62
<211> 20
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<223> 合成多核苷酸
<400> 62
ttacctctaa ccctccattc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 63
actttccaca tactatccca 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 64
acctttctcc atacccaact 20
<210> 65
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 可以通过5'-丙烯酰胺基修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> t为胸苷锁定核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> t为胸苷锁定核酸
<400> 65
ttgagtggat ggagtgtaat tttttttttt tttttttttt 40

Claims (211)

1.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中最大数量的次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；
基于样品内的荧光分布创建代码字；和
对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
2.权利要求1的方法，其包括将所述样品暴露于至少5种不同的核酸探针。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其包括将所述样品暴露于至少10种不同的核酸探针。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其包括将所述样品暴露于至少100种不同的核酸探针。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其包括将所述样品顺序地暴露于多个核酸探针。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述多个核酸探针包括具有不同序列的核酸探针的组合性组合。
7.权利要求6的方法，其中核酸探针的组合性组合靶向样品中RNA种类的组合性组合。
8.权利要求6或7中任一项的方法，其中核酸探针的组合性组合靶向样品中DNA序列的组合性组合。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含DNA。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含RNA。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述多个核酸探针的平均长度为10至300个核苷酸。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些被配置为结合所述样品内的核酸。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含靶序列和一个或多个读取序列。
14.权利要求13的方法，其中所述多个核酸探针的靶序列的平均长度为10至200个核苷酸。
15.权利要求13或14中任一项的方法，其中所述靶序列与编码蛋白质的核酸序列基本上互补。
16.权利要求13-15中任一项的方法，其中所述靶序列通过特异性结合与靶标结合。
17.权利要求16的方法，其中所述靶标包括RNA。
18.权利要求17的方法，其中所述RNA包括非编码RNA。
19.权利要求17或18中任一项的方法，其中所述RNA包括mRNA。
20.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述RNA包括转移RNA(tRNA)。
21.权利要求17-20中任一项的方法，其中所述RNA包括核糖体RNA(rRNA)。
22.权利要求16-21中任一项的方法，其中所述靶标包括DNA。
23.权利要求22的方法，其中所述DNA包括基因组DNA。
24.权利要求13-23中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸通过所述读取序列结合所述核酸探针。
25.权利要求13-24中任一项的方法，其中所述多个核酸探针包括由一个或多个读取序列的集合的组合性组合形成的可区分的核酸探针。
26.权利要求25的方法，其中所述集合具有至少8个可能的读取序列。
27.权利要求25或26中任一项的方法，其中所述集合具有至少16个可能的读取序列。
28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所述集合具有至少24个可能的读取序列。
29.权利要求25-28中任一项的方法，其中所述集合具有至少32个可能的读取序列。
30.权利要求25-29中任一项的方法，其中所述集合具有至少48个可能的读取序列。
31.权利要求25-30中任一项的方法，其中所述集合具有至少64个可能的读取序列。
32.权利要求25-31中任一项的方法，其中所述集合具有不超过32个可能的读取序列。
33.权利要求25-32中任一项的方法，其中所述集合具有不超过16个可能的读取序列。
34.权利要求25-33中任一项的方法，其中所述多个读取序列分布在所述多个核酸探针上以定义错误校正码。
35.权利要求13-34中任一项的方法，其中所述读取序列的平均长度为5个核苷酸至50个核苷酸。
36.权利要求13-35中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含不超过10个读取序列。
37.权利要求13-36中任一项的方法，其中所述多个核酸探针中的至少一些包含不超过5个读取序列。
38.权利要求1-37中任一项的方法，其中不超过20个初级扩增器核酸能够结合所述核酸探针。
39.权利要求1-38中任一项的方法，其中不超过10个初级扩增器核酸能够结合所述核酸探针。
40.权利要求1-39中任一项的方法，其中不超过5个初级扩增器核酸能够结合所述核酸探针。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸具有小于300个核苷酸的平均长度。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸具有小于200个核苷酸的平均长度。
43.权利要求1-42中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸具有所述次级扩增器核酸能够结合的重复序列。
44.权利要求1-43中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸各自靶向所述初级扩增器核酸上少于10个核苷酸的序列。
45.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
46.权利要求1-45中任一项的方法，其中不超过20个次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸。
47.权利要求1-46中任一项的方法，其中不超过10个次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸。
48.权利要求1-47中任一项的方法，其中不超过5个次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸。
49.权利要求1-48中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸具有小于300个核苷酸的平均长度。
50.权利要求1-49中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸具有小于200个核苷酸的平均长度。
51.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
52.权利要求1-51中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
53.权利要求1-52中任一项的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
54.权利要求52或53中任一项的方法，其中所述次级扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
55.权利要求52-54中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体通过二硫键与所述次级扩增器核酸连接。
56.权利要求1-51中任一项的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于能够与所述次级扩增器核酸结合的三级扩增器核酸。
57.权利要求56的方法，其中所述三级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
58.权利要求56的方法，其还包括将所述三级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
59.权利要求57或58中任一项的方法，其中所述三级扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
60.权利要求56的方法，其还包括将所述三级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
61.权利要求60的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
62.权利要求60的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
63.权利要求61或62中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
64.权利要求52-55、57-59或61-63中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括蛋白质。
65.权利要求52-55、57-59或61-64中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括染料。
66.权利要求52-55、57-59或61-65中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括Alexa Fluor 750。
67.权利要求52、52-55、57-59或61-66中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括Cy5。
68.权利要求52-55、57-59或61-67中任一项的方法，其中所述荧光信号传导实体包括纳米颗粒。
69.权利要求52-55、57-59或61-68中任一项的方法，其包括在所述样品暴露于核酸探针之间灭活所述荧光信号传导实体。
70.权利要求69的方法，其包括通过去除所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。
71.权利要求69或70中任一项的方法，其包括使用还原剂灭活所述荧光信号传导实体。
72.权利要求69-71中任一项的方法，其包括使用二硫键裂解灭活所述荧光信号传导实体。
73.权利要求69-72中任一项的方法，其包括通过光漂白所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。
74.权利要求69-73中任一项的方法，其包括通过化学漂白所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。
75.权利要求69-74中任一项的方法，其包括通过酶促切割所述荧光信号传导实体来灭活所述荧光信号传导实体。
76.权利要求1-75中任一项的方法，其中所述多个核酸探针限定具有至少2的汉明距离的代码空间。
77.权利要求76中任一项的方法，其中所述多个核酸探针限定具有至少3的汉明距离的代码空间。
78.权利要求76或77中任一项的方法，其中所述代码空间是汉明(7,4)代码、汉明(15,11)代码、汉明(31,26)代码、汉明(63,57)代码或汉明(127,120)代码。
79.权利要求76-78中任一项的方法，其中所述代码空间是SECDED代码。
80.权利要求79的方法，其中所述代码空间是SECDED(8,4)代码、SECDED(16,4)代码、SECDED(16,11)代码、SECDED(22,16)代码、SECDED(39,32)代码或SECDED(72,64)代码。
81.权利要求76-80中任一项的方法，其中所述核酸探针限定仅具有恒定数量的代码空间。
82.权利要求1-81中任一项的方法，其包括通过对所述样品的至少一部分进行成像来确定核酸探针的分布。
83.权利要求82的方法，其包括使用光学成像技术确定核酸探针的结合。
84.权利要求82或83中任一项的方法，其包括使用荧光成像技术确定核酸探针的结合。
85.权利要求82-84中任一项的方法，其包括使用多色荧光成像技术确定核酸探针的结合。
86.权利要求82-85中任一项的方法，其包括使用超分辨率荧光成像技术确定核酸探针的结合。
87.权利要求86的方法，其包括使用随机光学重建显微术(STORM)确定核酸探针的结合。
88.权利要求82-87中任一项的方法，其包括使用用于确定非重叠的单发射体的算法来确定所述次级扩增器核酸的图像的质心。
89.权利要求82-88中任一项的方法，其包括使用用于确定部分重叠的单发射体的算法来确定所述次级扩增器核酸的图像的质心。
90.权利要求88或89中任一项的方法，其还包括确定所述次级扩增器核酸的置信水平。
91.权利要求90的方法，其包括使用精确匹配的数量与具有针对代码字的一个或多个一位错误的匹配的数量的比率来确定所述置信水平。
92.权利要求90或91中任一项的方法，其包括使用精确匹配的数量与具有针对代码字的恰好一个一位错误的匹配的数量的比率来确定所述置信水平。
93.权利要求82-92的方法，其包括以优于300nm的分辨率确定样品内核酸探针的分布。
94.权利要求82-93的方法，其包括以优于100nm的分辨率确定样品内核酸探针的分布。
95.权利要求82-94的方法，其包括以优于50nm的分辨率确定所述样品内核酸探针的分布。
96.权利要求1-95中任一项的方法，其中所述样品包括细胞。
97.权利要求96的方法，其中所述细胞是人类细胞。
98.权利要求96-97中任一项的方法，其中所述细胞是固定的。
99.权利要求1-98中任一项的方法，其中所述样品包括组织。
100.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸和次级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；
基于样品内的荧光分布创建代码字；和
对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
101.权利要求100的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
102.权利要求101的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
103.权利要求101的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
104.权利要求102或103中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
105.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中所述次级扩增器核酸在固定距离内结合所述初级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；
基于样品内的荧光分布创建代码字；和
对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
106.权利要求105的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
107.权利要求106的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
108.权利要求106的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
109.权利要求107或108中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
110.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；
基于样品内的荧光分布创建代码字；和
对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
111.权利要求110的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
112.权利要求111的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
113.权利要求111的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
114.权利要求112或113中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
115.权利要求111-114中任一项的方法，其中所述额外的一轮或多轮的扩增器核酸中的至少一个由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
116.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；
基于样品内的荧光分布创建代码字；和
对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，任选地其中如果没有找到匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
117.权利要求116的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
118.权利要求117的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
119.权利要求117的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
120.权利要求118或119中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
121.权利要求117-120中任一项的方法，其中所述额外的一轮或多轮的扩增器核酸中的至少一个由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
122.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
123.权利要求122的方法，其还包括将初级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
124.权利要求122的方法，其中所述初级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
125.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，其中如果没有找到匹配，则潜在地对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
126.权利要求125的方法，其还包括将所述初级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
127.权利要求125的方法，其中所述初级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
128.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
129.权利要求128的方法，其还包括将所述初级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
130.权利要求128的方法，其中所述初级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
131.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字，并且对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，其中如果没有找到匹配，则潜在地对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
132.权利要求131的方法，其还包括将所述初级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
133.权利要求131的方法，其中所述初级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
134.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸在固定距离内结合核酸探针；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
135.权利要求134的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
136.权利要求135的方法，其中如果没有发现匹配，则对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
137.权利要求134-136中任一项的方法，其还包括将所述初级扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
138.权利要求134-136中任一项的方法，其中所述初级扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
139.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
140.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字，以及对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配，其中如果没有找到匹配，则潜在地对代码字应用错误校正以形成有效代码字。
141.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中最大数量的初级扩增器核酸能够结合核酸探针；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中最大数量的次级扩增器核酸能够结合初级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
142.权利要求141的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
143.权利要求142的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
144.权利要求142的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
145.权利要求143或144中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
146.权利要求141-145中任一项的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
147.权利要求146的方法，其中如果没有发现匹配，则潜在地对所述代码字应用错误校正以形成有效代码字。
148.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸和次级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
149.权利要求148的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
150.权利要求149的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
151.权利要求149的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
152.权利要求150或151中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
153.权利要求148-152中任一项的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
154.权利要求153的方法，其中如果没有发现匹配，则潜在地对所述代码字应用错误校正以形成有效代码字。
155.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸在固定距离内结合初级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
156.权利要求155的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
157.权利要求156的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
158.权利要求156的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
159.权利要求157或158中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
160.权利要求155-159中任一项的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
161.权利要求160的方法，其中如果没有发现匹配，则潜在地对所述代码字应用错误校正以形成有效代码字。
162.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
163.权利要求162的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
164.权利要求163的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
165.权利要求163的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
166.权利要求164或165中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
167.权利要求162至166中任一项的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
168.权利要求167的方法，其中如果没有找到匹配，则潜在地对所述代码字应用错误校正以形成有效代码字。
169.权利要求162-168中任一项的方法，其中所述额外的一轮或多轮的扩增器核酸中的至少一个由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
170.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
171.权利要求170的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
172.权利要求171的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
173.权利要求171的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
174.权利要求172或173中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
175.权利要求170-174中任一项的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
176.权利要求175的方法，其中如果没有发现匹配，则潜在地对所述代码字应用错误校正以形成有效代码字。
177.权利要求170-176中任一项的方法，其中所述额外的一轮或多轮的扩增器核酸中的至少一个由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
178.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
179.一种方法，其包括：
将样品暴露于核酸探针；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
180.权利要求179的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
181.权利要求180的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
182.权利要求180的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
183.权利要求181或182中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
184.一种方法，其包括：
将样品暴露于与核酸探针缀合的结合实体；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
185.一种方法，其包括：
将样品暴露于与核酸探针缀合的结合实体；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
186.一种方法，其包括：
将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
187.权利要求186的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
188.权利要求187的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
189.权利要求187的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
190.权利要求188或189中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
191.一种方法，其包括：
将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸和次级扩增器核酸与靶标的结合是可饱和的；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
192.权利要求191的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
193.权利要求192的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
194.权利要求192的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
195.权利要求193或194中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
196.一种方法，其包括：
将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸，其中初级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
197.权利要求196的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
198.权利要求197的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
199.权利要求197的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
200.权利要求198或199中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
201.权利要求196-200中任一项的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
202.权利要求201的方法，其中如果没有找到匹配，则潜在地对所述代码字应用错误校正以形成有效代码字。
203.权利要求196-202中任一项的方法，其中所述额外的一轮或多轮的扩增器核酸中的至少一个由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
204.一种方法，其包括：
将样品暴露于与核酸探针缀合的靶向实体；
将核酸探针暴露于能够结合核酸探针的初级扩增器核酸；
将初级扩增器核酸暴露于能够结合初级扩增器核酸的次级扩增器核酸，其中次级扩增器核酸由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成；
使用荧光确定样品内核酸探针的分布；和
基于样品内的荧光分布创建代码字。
205.权利要求204的方法，其还包括将所述次级扩增器核酸暴露于额外的一轮或多轮的扩增器核酸，包括末轮扩增器核酸，其各自能够结合前一轮的扩增器核酸。
206.权利要求205的方法，其中所述末轮扩增器核酸包含荧光信号传导实体。
207.权利要求205的方法，其还包括将所述末轮扩增器核酸暴露于荧光信号传导实体。
208.权利要求206或207中任一项的方法，其中所述末轮扩增器核酸具有所述荧光信号传导实体能够结合的重复序列。
209.权利要求204-208中任一项的方法，其中对于至少一些代码字，将代码字与有效代码字匹配。
210.权利要求209的方法，其中如果没有找到匹配，则潜在地对所述代码字应用错误校正以形成有效代码字。
211.权利要求204-210中任一项的方法，其中所述额外的一轮或多轮的扩增器核酸中的至少一个由4种天然存在的核苷酸中的仅3种形成。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4328322A2 (en) 2014-07-30 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College Probe library construction
EP3472359B1 (en) 2016-06-21 2022-03-16 10X Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing
WO2018218150A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
EP3668998A1 (en) 2017-10-06 2020-06-24 Cartana AB Rna templated ligation
AU2020282024A1 (en) 2019-05-31 2021-11-11 10X Genomics, Inc. Method of detecting target nucleic acid molecules
US20220036556A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 The Joan and Irwin Jacobs Technion-Cornell Institute System and method for on-phase microscopy
US20220083832A1 (en) 2020-09-16 2022-03-17 10X Genomics, Inc. Methods and systems for barcode-assisted image registration and alignment
WO2022066654A1 (en) * 2020-09-22 2022-03-31 Applied Materials, Inc. Processing of images from fluorescent in-situ hybridization using multiplexed fluorescent switching
US20220186300A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
TW202239968A (zh) * 2020-12-21 2022-10-16 美商應用材料股份有限公司 Merfish成像系統的標準化
WO2022250774A1 (en) * 2021-05-24 2022-12-01 California Institute Of Technology Linked amplification tethered with exponential radiance
EP4347877A1 (en) * 2021-06-01 2024-04-10 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection and probe resolution
EP4347880A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 10X Genomics, Inc. Sample analysis using asymmetric circularizable probes
EP4367262A1 (en) 2021-07-09 2024-05-15 10X Genomics, Inc. Methods for detecting analytes using sparse labelling
CN117651855A (zh) 2021-07-13 2024-03-05 10X基因组学有限公司 用于制备具有可控厚度的聚合基质的方法
EP4326898A1 (en) 2021-08-16 2024-02-28 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
WO2023108139A2 (en) 2021-12-10 2023-06-15 10X Genomics, Inc. Multi-resolution in situ decoding
WO2023129898A2 (en) 2021-12-27 2023-07-06 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
US20230279475A1 (en) 2022-01-21 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
US20230279465A1 (en) * 2022-02-17 2023-09-07 Vizgen, Inc. Methods of anchoring fragmented nucleic acid targets in a polymer matrix for imaging
WO2023172915A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 10X Genomics, Inc. In situ code design methods for minimizing optical crowding
WO2023192302A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Spectral unmixing combined with decoding for super-multiplexed in situ analysis
WO2023192616A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
US20230323427A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multiplex cell analysis
US20240026427A1 (en) 2022-05-06 2024-01-25 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of v(d)j sequences
US20240084378A1 (en) 2022-05-11 2024-03-14 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for in situ sequencing
WO2023245190A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272331A (zh) * 2009-01-05 2011-12-07 生物梅里埃公司 核酸的扩增和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用
US20130023433A1 (en) * 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
CN103429755A (zh) * 2010-10-21 2013-12-04 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
US20150105298A1 (en) * 2013-10-10 2015-04-16 The Research Foundation For The State University Of New York Multi-oligomer in situ hybridization probes
CN106715768A (zh) * 2014-07-30 2017-05-24 哈佛学院院长及董事 用于测定核酸的系统和方法
US20170327876A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-16 Nanostring Technologies, Inc. Methods for detecting target nucleic acids in a sample
WO2018089445A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 President And Fellows Of Harvard College Matrix imprinting and clearing
US20180142286A1 (en) * 2016-11-21 2018-05-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3491151A4 (en) * 2016-08-01 2020-07-29 California Institute of Technology SEQUENTIAL SURVEY OF MOLECULAR TARGETS BASED ON PSEUDO-COLORED BAR CODES PRESENTING AN INTEGRATED ERROR CORRECTION MECHANISM
US20190276881A1 (en) * 2016-11-08 2019-09-12 President And Fellows Of Harvard College Multiplexed imaging using merfish, expansion microscopy, and related technologies

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272331A (zh) * 2009-01-05 2011-12-07 生物梅里埃公司 核酸的扩增和/或检测方法、试剂盒及所述方法的应用
US20130023433A1 (en) * 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
CN103429755A (zh) * 2010-10-21 2013-12-04 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
US20150105298A1 (en) * 2013-10-10 2015-04-16 The Research Foundation For The State University Of New York Multi-oligomer in situ hybridization probes
CN106715768A (zh) * 2014-07-30 2017-05-24 哈佛学院院长及董事 用于测定核酸的系统和方法
US20170327876A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-16 Nanostring Technologies, Inc. Methods for detecting target nucleic acids in a sample
WO2018089445A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 President And Fellows Of Harvard College Matrix imprinting and clearing
US20180142286A1 (en) * 2016-11-21 2018-05-24 Nanostring Technologies, Inc. Chemical compositions and methods of using same

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