JP2022514494A - Ｍｅｒｆｉｓｈおよび他の適用のための増幅法およびシステム - Google Patents

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Abstract

本発明は、全般的に、細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するための、システムおよび方法に関する。場合によって、細胞のトランスクリプトームが決定されうる。ある特定の実施形態は、全般的に、試料中の核酸および他の標的を、比較的高分解能において決定することを対象とする。例えば、核酸プローブが、試料へと適用され、一次および二次増幅核酸を使用して、核酸プローブの、標的への結合が増幅されうる。場合によって、標的へと結合されうる増幅核酸の最大数が存在し、例えば、結合は、可飽和であり、豊富な試薬の存在下においてもなお、無際限に増殖することはできない。これは、例えば、各結合イベントの輝度を制御し、増幅領域（例えば、イメージング時における）のサイズを制御し、かつ／または増幅ノイズ（すなわち、分子間の、増幅シグナルの、最終的なばらつき）などを制限するために、有利でありうる。加えて、一部の実施形態において、一次および／または二次増幅核酸は、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されうるが、これは、二次構造の減少、結合速度の増大などを結果としてもたらしうる。これらの特性は、場合によって、複数の直交的増幅配列の迅速なデザインを容易とし、このような手法の、多くの顕著に異なる分子標的への拡張を可能とする。

Description

関連出願
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｚｈｕａｎｇらによる、２０１８年１２月１３日に出願され、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ＭＥＲＦＩＳＨ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」と題された、米国特許仮出願第６２／７７９，３３３号の利益を主張する。
政府による資金供与
本発明は、米国国立保健研究所により与えられる、第ＭＨ１１３０９４号、第ＭＨ１１１５０２号、および第ＭＨ１１４８３０号の下にある政府助成によりなされた。米国連邦政府は、本発明において、一定の権利を有する。
分野
本発明は、全般的に、細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するためのシステムおよび方法に関する。
単一分子蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）は、単一細胞内の、個々のＲＮＡ分子の直接的な検出により、ＲＮＡの存在度および空間的位置の両方を提示する。この技法を使用することにより、ＲＮＡの局在は、身体のパターン化の発生、細胞分裂時における、細胞運命の決定、局所的翻訳、細胞の遊走、および極性の確立など、複数の細胞機能と関連することが示されている。無傷の細胞内および組織内の、トランスクリプトームスケールにおけるＲＮＡの局在について研究するために、ＭＥＲＦＩＳＨ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、およびインサイチューシーケンシングが開発されている。これらの中において、ＭＥＲＦＩＳＨは、エラーに対してロバストな、二進法のバーコード化および逐次的イメージングを使用して、ｓｍＦＩＳＨ測定を、高検出効率を伴って、マルチプレックス化する。しかし、シグナルの光子カウントが大きくなれば、イメージングの収集速度、深部組織のイメージングにより引き起こされる光散乱、および試料の自己蛍光に起因する低シグナル対バックグラウンド比により制限されているスループットを改善するであろう。したがって、光子カウント増大の改善が、イメージングスループットの実質的な増大、バックグラウンドのシグナルレベルを上回るシグナルをもたらすのに十分なプローブの結合を可能としない場合がある短鎖ＲＮＡのターゲティングを可能とし、かつ／またはマルチプレックス測定を、高レベルのバックグラウンドシグナルを伴う種類の試料へと拡張するのに必要とされている。
しかし、マルチプレックス化単一分子ＲＮＡイメージング法の性能は、シグナルの増幅により低下する場合も難題がもたらされる場合もある多くの特性に依存する。例えば、分子間のシグナル輝度のばらつきは、比較的小さいことが重要であることが多い。同様に、シグナルの物理的サイズ、または個々の分子からの拡がりが、可能な限り小さいことも、物理的に隣接する分子からのシグナルの、実質的な重複を防止するのに重要であることが多い。これと平行して、増幅法は、高効率でない場合があり、一部の分子が増幅されない一方、他の分子は増幅される場合もあり、検出分子の割合の低減をもたらす。加えて、複数の、直交的な分子シグナルを増幅することが可能なことも重要であることが多く、増幅法を、より顕著に異なる分子シグナルへと、迅速に拡張することが可能なことは、極めて重要である。最後に、このような増幅法は、試料調製時間を短縮するように、迅速であるべきである。これらの理由により、シグナル輝度のばらつきを導入せず、シグナルの、個々の分子からの物理的拡がりを増大させない増幅法であって、全ての標的分子からのシグナル増幅において、高度に効率的であり、複数の顕著に異なる標的へと、迅速に拡張されうる増幅法が、必要とされている。
本発明は、全般的に、細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するための、システムおよび方法に関する。本発明の対象物は、場合によって、相互に関連した製品、特定の問題に対する代替的な解決法、および／または１つもしくは複数のシステムおよび／もしくは品目の、複数の異なる使用を伴う。
一態様において、本発明は、全般的に、方法を対象とする。実施形態の第１のセットに従い、方法は、試料を、核酸プローブ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ）へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸（ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な一次増幅核酸（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）へと曝露することであって、最大数の二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能なこと、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符合語（ｃｏｄｅｗｏｒｄ）を創出すること、および符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態の別のセットにおける方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸および二次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること、および符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、固定距離以内の一次増幅核酸に結合すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること、および符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態のなおも別のセットに従う方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること、および符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおける方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること、および符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態の１つのセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の別のセットにおける方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出し、符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のなおも別のセットに従う方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出し、符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態の１つのセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、固定距離以内の核酸プローブに結合すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のさらに別のセットに従う方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出し、符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
実施形態のなおも別のセットに従い、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能なこと、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸および二次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおける方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、固定距離以内の一次増幅核酸に結合すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のなおも別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の別のセットに従う方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のなおも別のセットに従い、方法は、試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされた結合性実体へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のさらに別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされた結合性実体へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の１つのセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の別のセットにおける方法は、試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸および二次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のさらに別のセットに従い、方法は、試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態のなおも別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること、蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること、および試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出することを含む。
実施形態の１つのセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露することであって、核酸プローブが、標的配列を含む、第１の部分と、１個または複数個の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）リード配列を含む、第２の部分とを含み、複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、複数個のリード配列から取られた、１個または複数個のリード配列の、コンビナトリアルの組合せから形成される、識別可能な核酸プローブを含むこと、ならびに核酸プローブを、一次増幅核酸および二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能であり、二次増幅核酸が、一次核酸プローブに結合することが可能であり、一次増幅核酸および二次増幅核酸と会合した試料中の標的の最大数が、一定であることを含む。
実施形態の別のセットにおいて、方法は、試料を、核酸プローブへと曝露すること、核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること、一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること、蛍光を使用して、試料中の二次増幅核酸の分布を決定すること、試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出し、符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成することを含む。
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される実施形態のうちの１つまたは複数を行う方法を包含する。なおも別の態様において、本発明は、本明細書において記載される実施形態のうちの１つまたは複数を使用する方法を包含する。
本発明の他の利点および新規の特徴は、付属の図面と共に検討された場合に、本発明の、多様な非限定的実施形態についての、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
本発明の非限定的実施形態が、概略的なものであり、縮尺通りに描示されることが意図されない、付属の図面に関して、例を目的として記載される。図において、例示される、同一であるか、またはほぼ同一な、各構成要素は、典型的に、単一の番号により表される。例示が、当業者に、本発明を理解することを可能とするのに必要ではない場合、明確さを目的として、あらゆる構成要素、あらゆる図において表示されるわけでも、本発明の各実施形態の、あらゆる構成要素が示されるわけでもない。
図１Ａ～１Ｅは、一次および二次増幅核酸を使用して、シグナルを増幅する実施形態についての、概略的例示を提示する。 同上 図２Ａ～２Ｆは、増幅が、本発明の別の実施形態に従う、スポットサイズの、実質的な変化を伴わずにシグナル輝度を、劇的に増大させうることを例示する。 同上 図３Ａ～３Ｆは、本発明の、さらに別の実施形態における、１３０のＲＮＡに対する、ＭＥＲＦＩＳＨ測定を例示する。 同上 図４Ａ～４Ｃは、本発明の、なおも別の実施形態における、組織試料中の増幅を例示する。 図５Ａ～５Ｃは、本発明の一実施形態において、増幅のために使用される、ある特定の配列例を例示する。 同上 同上
本発明は、全般的に、細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するためのシステムおよび方法に関する。場合によって、細胞のトランスクリプトームが決定されうる。ある特定の実施形態は、全般的に、試料中の核酸および他の標的を、比較的高分解能において決定することを対象とする。例えば、核酸プローブが、試料へと適用され、一次および二次増幅核酸を使用して、核酸プローブの、標的への結合が増幅されうる。場合によって、標的へと結合されうる増幅核酸の最大数が存在し、例えば、結合は、可飽和であり、豊富な試薬の存在下においてもなお、無際限に増殖することはできない。これは、例えば、各結合イベントの輝度を制御し、増幅領域（例えば、イメージング時における）のサイズを制御し、かつ／または増幅ノイズ（すなわち、分子間の、増幅シグナルの、最終的なばらつき）などを制限するために、有利でありうる。加えて、一部の実施形態において、一次および／または二次増幅核酸は、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されうるが、これは、二次構造の減少、結合速度の増大などを結果としてもたらしうる。これらの特性は、場合によって、複数の直交的増幅配列（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の迅速なデザインを容易とし、このような手法の、多くの顕著に異なる分子標的への拡張を可能とする。
一態様において、本発明は、全般的に、例えば、イメージングのために、ＭＥＲＦＩＳＨまたは他の技法を使用して、生物学的試料中の標的（潜在的に、数十、数百、数千、またはこれを超える）のシグナルを増幅するためのシステムおよび方法を対象とする。例えば、一部の実施形態において、これらの技法は、数百または数千のＲＮＡ標的のシグナルを、例えば、生物学的試料の天然環境内において、同時に増幅する、迅速であり、簡単であり、かつ／または効率的な方式をもたらす。このような増幅は、ある特定の実施形態において、本明細書において論じられる通り、可飽和システムを使用することにより、よく制御されうる。このために、増幅時における、スポット間の輝度のばらつきの最小化が可能であり、これは、ＭＥＲＦＩＳＨまたは他の技法を使用する復号において、有用でありうる。一部の実施形態において、増幅されたスポットのサイズもまた、増大しない。これは、例えば、互いに対して、比較的近接して位置する標的を同定する能力を改善しうる。例えば、スポットサイズが、過度に増大する場合、１つの標的に由来するシグナルは、別の標的に由来するシグナルと重複しうる。加えて、下記において論じられる通り、一部の実施形態において、増幅核酸は、例えば、増幅工程に関与しうるヘアピン構造を含有せず、これは、可飽和システムの創出を容易とすることが可能であり、かつ／または多重増幅配列（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）システムのデザインを、多数の標的へと適用しうる。加えて、これもまた、下記において論じられる通り、増幅核酸は、３つのヌクレオチドだけを使用して構築されうる。３文字ヌクレオチドは、４文字ヌクレオチドより、著明に低度の二次構造および迅速な結合速度を有しうる。加えて、場合によって、例えば、意図されない二次構造の可能性を低減することにより、任意の所与の増幅配列が、信頼可能な形において作用する可能性が増大させられる。
さて、このようなシステムの非限定例を、図１Ａ～１Ｅに例示する。図１Ａにおいて、標的１０（この例においては、ＲＮＡ）を例示する。生物学的試料中（例えば、細胞内または組織内）には、数百または数千の標的が分布しており、核酸プローブの、標的への結合を使用して、例えば、蛍光プローブを使用し、試料をイメージングすることによりそれらの分布を決定することができる。しかし、本図においては、明確さのために、単一の標的だけが例示されることに注意されたい。
一部の実施形態において、異なる配列を有する、複数個の核酸プローブが使用され、核酸プローブの各々の分布が、逐次的に解析され、核酸プローブの各々の結合パターンに基づき、各位置について、「符合語」を創出するのに使用される。適切な符合空間（ｃｏｄｅ ｓｐａｃｅ）を規定する核酸プローブを選択することにより、観察される結合パターン内の、見かけのエラーが、同定される、かつ／または棄却される、かつ／または適正な符合語を同定し、これにより、試料中の核酸プローブの、適正な標的を同定するように補正される場合がある。このエラーに対してロバストなシステムおよびエラー補正システムは、ＭＥＲＦＩＳＨ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に対して、初めて導入され、その後においてもまた、関連する多様な技法において使用されている。例えば、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号および同第ＷＯ２０１６／０１８９６３号を参照されたい。
符号化核酸プローブ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ）の例を、符号化核酸プローブ１５（点線の枠囲いにより示される）が、標的１０、例えば、標的ＲＮＡに結合している、図１Ａに示す。他の核酸プローブ１６、１７もまた、試料中の標的ＲＮＡおよび／または他の標的に結合しうる。プローブ１５は、標的ＲＮＡに結合することが可能な（例えば、特異的結合を介して）標的配列１１と、リード配列１２（または「リードアウト」配列）、すなわち、結合が生じたのか、生じなかったのかを決定するのに「読み取られ」うる配列とを含みうる。プローブ上には、１、２、３個、またはこれを超えるリード配列が存在しうる。例えば、この例において、プローブ１５には、２つのこのようなリード配列が存在する（リード配列１２およびリード配列１９として同定される）。リード配列は、各々、独立に、同じ場合もあり、異なる場合もある。加えて、１６および１７などのプローブは、核酸プローブ１５と、同じもしくは異なる数のリード配列を有する場合があり、かつ／または同じもしくは異なる構造を有する場合がある。
増幅を適用しない場合、図１Ｅに示される通り、核酸プローブ１５を、シグナル発生実体（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｎｔｉｔｙ）４０を含有する、適切な二次核酸プローブ３２へと曝露することができる。他の実施形態においては、他の技法も使用されうるが、この例においては、シグナル発生実体を、ジスルフィド連結を介して、二次核酸プローブへと連結する。しかし、この場合、１つのシグナル発生実体だけを、標的へと連結することができる。したがって、単一のシグナル発生実体を検出し、これを使用して、核酸プローブ１５の、標的１０への結合を決定することは、このような結合イベントの後においてもたらされる低シグナル強度のために、比較的困難である。
したがって、図１Ｂにおいて、ある特定の実施形態に従い、一次増幅核酸２０を使用することができる。一次増幅核酸は、下記において論じられる通り、核酸プローブ１５のリード配列に結合する（例えば、特異的に）ことが可能な、第１の一次認識配列２２と、１つまたは複数の二次増幅核酸に結合する（例えば、特異的に）ことが可能な１つまたは複数の一次リード配列２３とを含有しうる。この例において、「Ｎ」個の、このようなリード配列を、一次増幅核酸内に、概略的に示す（Ｎは、本明細書において論じられる通り、例えば、５、７、９、または他の数でありうる）。一次リード配列は、各々、同じまたは異なる配列を有する場合があり、同じまたは異なる長さを有する場合がある。この例において、各リード配列は、２０ヌクレオチド長であるが、これは、例だけを目的とする。加えて、既に言及された通り、この例においては、２つこのような一次増幅核酸を示すが、これは、例だけを目的とするものであり、他の実施形態においては他の数の一次増幅核酸を、核酸プローブへと結合させることもできる。
次に、図１Ｃにおいて示される通り、二次増幅核酸３０を、一次増幅核酸へと結合させることができる。二次増幅核酸は、下記において論じられる通り、一次増幅核酸２０のリード配列２３に結合する（例えば、特異的に）ことが可能な、第１の認識配列３３と、シグナル発生実体に結合することが可能な１つまたは複数の二次リード配列３４とを含有しうる。
一次増幅核酸の場合と同様に、この図に示される通り、二次増幅核酸内には、任意の数の二次リード配列が存在しうる。二次リード配列は、各々、互いと比べて、同じまたは異なる配列を有する場合があり、同じまたは異なる長さを有する場合がある。二次リード配列はまた、一次増幅核酸のリード配列と、同じまたは異なる場合がある。この例において、各二次増幅核酸は、「Ｍ」個のリード配列を有しうる。Ｍは、本明細書において論じられる通り、例えば、５、７、９、または他の数であることが可能であり、Ｍは、Ｎと同じ場合もあり、異なる場合もある。
図１Ｄにおいて、複数のシグナル発生実体４０を、二次増幅核酸のリード配列へと結合させた。この例において、シグナル発生実体は、各々、ジスルフィド連結を介して結合されるが、本明細書において論じられる通り、他の実施形態においては、他の技法も使用されうる。
加えて、この場合、標的配列の各リード配列へと結合したシグナル発生実体には、最大数または飽和限界が存在することが予測される。この特定の例において、両者が、実質的に同じ構造を有すると仮定すると（これらは、必ずしも同じ構造を有するわけではないが、すなわち、例えば、異なる構造を伴う増幅核酸を有する場合、同じ数である、Ｎ×Ｍカ所の位置が利用可能である）、核酸プローブのリード配列の各々（この図においては、２つのこのようなリード配列）について、Ｎ×Ｍカ所の、このような位置が利用可能である。したがって、所与の標的と会合しうる、シグナル発生実体の数は、有限であり、予測可能な数であり、無際限に、または結合を伴わずに増殖することはできない。
この例においては、それらの各々が、一次増幅核酸および二次増幅核酸、ならびに会合したシグナル発生実体を有しうる、２個のリード配列である、リード配列１２および１９について論じた。これらは、同じまたは異なる構造を、有するかまたは有さない場合がある、例えば、リード配列１２と会合したシグナル発生実体および／または増幅核酸は、リード配列１９と会合せず、この逆もまた、成り立つ（しかし、上記において言及された通り、この例において、２個のリード配列は、例だけを目的として提示されるものであり、他の実施形態においては、例えば、顕著に異なる増幅核酸を伴う手法などを含む、同様の手法を使用して、並列的に増幅されうる、１つ、２つ、３つ、４つなどの、顕著に異なるリード配列が存在しうる）。リード配列は、独立に、例えば、同じまたは異なる場合がある、リード配列の各々と会合したシグナル発生実体を決定することにより、逐次的にまたは同時に決定されうる。例えば、図１Ｄにおいて示される通り、シグナル発生実体４０は、一次増幅核酸２０および二次増幅核酸３０と会合し、最終的に、リード配列１２と会合することが可能であるが、リード配列１９、またはこれと会合した一次増幅核酸および二次増幅核酸である一次増幅核酸２９および二次増幅核酸３９のそれぞれと会合させることは可能でない。
加えて、一部の実施形態において、増幅は、場合によって、１ラウンドだけの増幅核酸（Ｎ倍の増幅をもたらす）、２ラウンド（Ｎ×Ｍ倍の増幅をもたらす）、３ラウンド（Ｎ×Ｍ×Ｏ倍の増幅をもたらす［式中、第３のラウンドの分子は、Ｏ個のリード配列を含有する］）、またはこれを超えるラウンドの結合を伴いうる。場合によって、任意のラウンド数の増幅が適用されうる。
加えて、試料は、例えば、異なる増幅核酸またはシグナル発生実体を使用して認識されうる、多くの異なるリードアウト配列を有する、核酸プローブを含有しうる。例えば、６４を超えるラウンドを含む、８つ、１０、１２、１４、１６、２４、３２、４８、６４、または他の数のリードアウト配列が使用されうるであろう。場合によって、例えば、存在する、その元のリードアウト配列が、適切な増幅核酸を使用して、例えば、Ｎ×Ｍのコピーへと増幅されうるなど、固有の増幅核酸は、リードアウト配列の増幅に使用されうる。ある特定の場合に、増幅核酸は、効率的にデザインされうる。例えば、増幅核酸の配列内の、４つのヌクレオチドのうちの、３つだけを利用することにより、増幅核酸内の、不測の二次構造の確率が低減されうる。理論に束縛されることを望まずに述べると、増幅核酸自体、または後続の増幅核酸の結合の、このような二次構造の影響は、予測することが困難であるため、二次構造を低減するか、または消失させることは、所与の増幅核酸が、適正にアセンブルされる確率を増大させることが可能であり、これは、多数の直交的増幅核酸のデザインおよび使用を容易としうることが考えられる。加えて、二次構造を低減することにより、これはまた、これらの増幅核酸の結合率も阻害しうるので、このようなデザインの検討事項は、このような構造をアセンブルするのに要求される時間を短縮する場合もあり、各試料に要求される増幅核酸の量を軽減する場合もあるなどである。
この手法によりもたらされる、制御された増幅は、すなわち、十分な試薬が存在する場合に、シグナルの増幅が、事実上、制御されない形において、または無際限に増殖する、ヘアピンアンフォールディングまたはローリングサークル増幅などの技法とは対照的である。このような制御されない増幅は、存在するシグナルの量が、標的の数または標的の位置と、よく相関しない場合があるので、正確な決定が困難でありうる（例えば、大量のシグナルが、制御されない増幅により創出されるので、顕微鏡画像内に現れる「スポットサイズ」が、大きく増殖する場合があり、必ずしも、標的の近傍に中心化されないので、画像の分解能を損なうか、または他の、近傍の標的からのシグナルに干渉する）。これに対し、本明細書において論じられる、可飽和増幅法の使用は、標的と会合しうる、シグナル発生実体の最大数を創出することが可能であり、これは、スポットサイズを制限し、スポットの輝度または強度における均質性を創出し、検出を改善するなどである。
言及される通り、ある特定の実施形態において、このような技法は、例えば、ＭＥＲＦＩＳＨまたは他の同様の技法において使用されるエラー補正と組み合わされうる。例えば、符合語は、複数個の核酸プローブの結合（または非結合）に基づくことが可能であり、場合によって、符合語は、核酸プローブの誤認を低減または防止する一助となるエラー補正符号を規定しうる。場合によって、例えば、多様なコンビナトリアル法を使用することにより、比較的少数の標識を使用して、比較的多数の異なる標的が同定されうる。このような試料をイメージングし、核酸プローブの決定を容易とするのに、ＳＴＯＲＭなどの画像収集法もまた、使用されうる。例えば、ＭＥＲＦＩＳＨなどの技法に関するさらなる詳細については、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７１２，８０５号または同第１０，０７３，０３５号、または国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０９１２９６号または同第ＷＯ２００９／０８５２１８号を参照されたい。
上記の議論は、ＭＥＲＦＩＳＨまたは他の技法を使用して、試料中の標的の決定を改善するのに使用されうる、本発明の一実施形態についての非限定例である。しかし、上記において記載された実施形態に加えて、他の実施形態もまた、可能でありうる。したがって、より全般的に、本発明の多様な態様は、細胞内または他の試料中の核酸をイメージングするか、または決定するための、多様なシステムおよび方法を対象とする。
したがって、ある特定の態様は、細胞培養物、細胞懸濁液、生物学的組織、生検、生物などを含みうる試料を決定することを対象とする。試料はまた、無細胞でもありうるが、これにもかかわらず、場合によって核酸を含有しうる。試料が、細胞を含有する場合、細胞は、ヒト細胞、または他の任意の適切な細胞、例えば、哺乳動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、植物細胞などでありうる。場合によって、１つを超える細胞が存在する場合もある。
試料中において、決定される標的は、核酸、タンパク質などを含みうる。決定される核酸は、例えば、細胞内に（または他の試料中に）存在する、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、または他の核酸を含みうる。核酸は、細胞に内因性の場合もあり、細胞へと付加される場合もある。例えば、核酸は、ウイルス性の場合もあり、人工的に創出される場合もある。場合によって、決定される核酸は、細胞により発現されうる。一部の実施形態において、核酸は、ＲＮＡである。ＲＮＡは、コードＲＮＡ（ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）および／または非コードＲＮＡの場合がある。例えば、ＲＮＡは、タンパク質をコードしうる。細胞内において研究されうるＲＮＡの非限定例は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡなどを含む。
場合によって、細胞内の核酸のうちの、かなりの部分が、研究されうる。例えば、場合によって、部分的であるか、または完全な細胞のトランスクリプトームをもたらすように、細胞内に存在する、十分量のＲＮＡが決定されうる。場合によって、細胞内の、少なくとも４種類のｍＲＮＡが決定され、場合によって、細胞内の、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも２２、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも５０、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２７、少なくとも１２８、少なくとも１４０、少なくとも２５５、少なくとも２５６、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、または少なくとも１００，０００種類のｍＲＮＡが決定されうる。
場合によって、細胞のトランスクリプトームが決定されうる。トランスクリプトームは、全般的に、ｍＲＮＡだけではなく、細胞内で産生される、全てのＲＮＡ分子を包含することを理解されたい。したがって、例えば、トランスクリプトームはまた、ある特定の場合には、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなども含みうる。一部の実施形態において、細胞のトランスクリプトームのうちの、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が決定されうる。
一部の実施形態において、決定される他の標的は、核酸、タンパク質などへと連結されている標的を含みうる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、標的を認識することが可能な結合性実体は、核酸プローブへとコンジュゲートされていてもよい。結合性実体は、標的を、例えば、特異的に、または非特異的に認識しうる、任意の実体でありうる。非限定例は、酵素、抗体、受容体、相補性核酸鎖、アプタマーなどを含む。例えば、オリゴヌクレオチドへと連結された抗体は、標的を決定するのに使用されうる。標的は、オリゴヌクレオチドへと連結された抗体に結合することが可能であり、オリゴヌクレオチドは、本明細書において論じられる通りに決定されうる。
細胞内または他の試料中の核酸などの標的の決定は、定性的および／または定量的な場合がある。加えて、決定は、空間的であることが可能であり、例えば、細胞内または他の試料中の、核酸または他の標的の位置が、二次元または三次元において決定されうる。一部の実施形態において、細胞内または他の試料中の、核酸または他の標的の、位置、数、および／または濃度が決定されうる。
場合によって、細胞のゲノムのうちの、かなりの部分が決定されうる。決定されたゲノムセグメントは、ゲノム上で、連続または中断される場合がある。例えば、場合によって、細胞内の、少なくとも４つのゲノムセグメントが決定され、場合によって、細胞内の、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも２２、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも５０、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも７２、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２７、少なくとも１２８、少なくとも１４０、少なくとも２５５、少なくとも２５６、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも７，５００、少なくとも１０，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも７５，０００、または少なくとも１００，０００つのゲノムセグメントが決定されうる。
場合によって、細胞の全ゲノムが決定されうる。ゲノムは、全般的に、染色体ＤＮＡだけではなく、細胞内で産生される、全てのＤＮＡ分子を包含することを理解されたい。したがって、例えば、ゲノムはまた、場合によって、例えば、染色体ＤＮＡに加えて（または染色体ＤＮＡではなく）、ミトコンドリアＤＮＡ、クロロプラストＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなども含みうる。一部の実施形態において、細胞のゲノムのうちの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％が決定されうる。
本明細書において論じられる通り、細胞内または他の試料中の、１つまたは複数の標的を決定するのに、様々な核酸プローブが使用されうる。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（ロックト核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、および／またはこれらの組合せなど、核酸（または核酸と、例えば、特異的にハイブリダイズしうる実体）を含みうる。場合によって、例えば、下記において論じられる通り、核酸プローブ内には、さらなる構成要素もまた、存在しうる。加えて、核酸プローブを、細胞へと導入するのに、任意の適切な方法が使用されうる。
例えば、一部の実施形態において、細胞は、例えば、細胞内の核酸または他の標的の位置を保存するように、核酸プローブを導入する前に固定される。当業者には、細胞を固定するための技法が公知である。非限定例として述べると、細胞は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸などの化学物質を使用して固定されうる。一実施形態において、細胞は、ＨＥＰＥＳ－グルタミン酸緩衝液媒介性有機溶媒（ＨＯＰＥ）を使用して固定されうる。
核酸プローブは、任意の適切な方法を使用して、細胞（または他の試料）へと導入されうる。場合によって、細胞は、核酸プローブが、細胞の近傍に核酸プローブを含有する流体により、細胞へと導入されうるように、十分に透過処理されうる。場合によって、細胞は、固定工程の一部として、十分に透過処理される場合もあり、他の実施形態において、細胞は、エタノール、メタノール、Ｔｒｉｔｏｎなどなど、ある特定の化学物質への曝露により透過処理されうる。加えて、一部の実施形態において、核酸プローブを、細胞または他の試料へと導入するのに、電気穿孔またはマイクロインジェクションなどの技法が使用されうる。
したがって、ある特定の態様は、全般的に、細胞（または他の試料）へと導入される核酸プローブを対象とする。プローブは、適用に応じて、典型的に、ワトソン－クリック型の塩基対合により、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどの核酸とハイブリダイズしうる、様々な実体のうちのいずれかを含みうる。核酸プローブは、典型的に、標的、例えば、標的核酸の、少なくとも一部に結合することが可能な標的配列を含有する。場合によって、結合は、特異的結合（例えば、相補的結合を介する）でありうる。細胞または他の系へと導入されると、標的配列は、特異的標的（例えば、ｍＲＮＡまたは本明細書において論じられる他の核酸）に結合することが可能でありうる。核酸プローブはまた、下記において論じられる、１個または複数個のリード配列も含有しうる。
場合によって、１種類を超える核酸プローブは、試料へと、例えば、逐次的に適用される場合もあり、同時に適用される場合もある。例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００の識別可能な核酸プローブが、試料へと適用されうる。場合によって、核酸プローブは、逐次的に添加されうる。しかし、場合によって、１つを超える核酸プローブは、同時に添加されうる。
核酸プローブは、核酸プローブ内の任意の場所に配置されうる、１つまたは複数の標的配列を含みうる。標的配列は、標的、例えば、標的核酸の部分に対して、実質的に相補性である領域を含有しうる。例えば、場合によって、部分は、例えば、特異的結合をもたらすように、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補性でありうる。典型的に、相補性は、ワトソン－クリック型のヌクレオチド塩基対合に基づき決定される。
場合によって、標的配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、標的配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、標的配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
細胞内または他の試料中に存在すると思われる標的に関して、核酸プローブの標的配列が決定されうる。例えば、タンパク質に対する標的核酸は、例えば、タンパク質を形成するように発現される核酸を決定することにより、タンパク質の配列を使用して決定されうる。場合によって、例えば、上記において論じられた長さを有するタンパク質をコードする核酸の一部だけが使用される。加えて、場合によって、特定の標的を同定するのに使用されうる、１つを超える標的配列が使用されうる。例えば、同じ標的の、同じまたは異なる領域に、逐次的に、かつ／もしくは同時に結合しうるか、またはこれと、逐次的に、かつ／もしくは同時にハイブリダイズしうる、複数のプローブが使用されうる。ハイブリダイゼーションとは、典型的に、相補性の一本鎖核酸が、ワトソン－クリック型のヌクレオチド塩基対合（例えば、グアニン－シトシン間およびアデニン－チミン間の水素結合）を介して会合して、二本鎖核酸を形成する、アニーリング工程を指す。
一部の実施形態において、核酸プローブはまた、１つまたは複数の「リード」配列も含みうる。リード配列は、例えば、下記において論じられる、シグナル発生実体との会合を介して、核酸プローブを同定するのに使用されうる。一部の実施形態において、核酸プローブは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはこれを超える、２０個またはこれを超える、２４個またはこれを超える、３２個またはこれを超える、４０個またはこれを超える、４８個またはこれを超える、５０個またはこれを超える、６４個またはこれを超える、７５個またはこれを超える、１００個またはこれを超える、１２８個またはこれを超えるリード配列を含みうる。リード配列は、核酸プローブ内の任意の場所に配置されうる。１つを超えるリード配列が存在する場合、リード配列は、互いと隣り合わせて配置される場合もあり、かつ／または他の配列により中断される場合もある。
リード配列は、任意の長さでありうる。１つを超えるリード配列が使用される場合、リード配列は、独立に、同じまたは異なる場合がある。例えば、リード配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、リード配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、リード配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一部の実施形態において、リード配列は、任意またはランダムでありうる。ある特定の場合に、リード配列は、細胞または他の試料の、他の成分との相同性を低減するか、または最小化するように、例えば、リード配列自体が、細胞内または他の試料中に存在すると思われる他の核酸と結合したり、ハイブリダイズしたりしないように選び出される。場合によって、相同性は、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満でありうる。場合によって、２０塩基対未満、１８塩基対未満、１５塩基対未満、１４塩基対未満、１３塩基対未満、１２塩基対未満、１１塩基対未満、または１０塩基対未満の相同性が存在する場合もある。場合によって、このような塩基対は、連続的である。
実施形態の１つのセットにおいて、核酸プローブ集団は、場合によって、核酸プローブの標的の数未満でありうる、ある特定の数のリード配列を含有しうる。当業者は、１つのシグナル発生実体と、ｎのリード配列が存在する場合、一般に、２ｎ－１の異なる核酸標的が、固有に同定されうることを承知するであろう。しかし、全ての可能な組合せが使用される必要はない。例えば、核酸プローブ集団は、１２の異なる核酸配列をターゲティングしうるが、８個を超えないリード配列を含有しうる。別の例として述べると、核酸集団は、１４０の異なる核酸配列をターゲティングしうるが、１６個を超えないリード配列を含有しうる。各プローブ内のリード配列の、異なる組合せを使用することにより、異なる核酸配列標的が、個別に同定されうる。例えば、各プローブは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６など、またはこれを超えるリード配列を含有しうる。場合によって、核酸プローブ集団は、各々、同じ数のリード配列を含有しうるが、他の場合には、多様なプローブ上に、異なる数のリード配列が存在しうる。
非限定例として述べると、第１の核酸プローブは、第１の標的配列、第１のリード配列、および第２のリード配列を含有しうるが、第２の、異なる核酸プローブは、第２の標的配列、同じ第１のリード配列を含有しうるが、第２のリード配列ではなく、第３のリード配列を含有しうる。このようなプローブは、こうして、本明細書において論じられる通り、所与のプローブまたは位置に存在するか、またはこれと会合した、多様なリード配列を決定することにより識別されうる。例えば、プローブは、下記において論じられる、「符合語」を使用して、逐次的に同定され、符号化されうる。符合語はまた、エラーの検出および／または補正にかけられてもよい。
加えて、ある特定の実施形態において、核酸プローブ集団［および符号化プローブ上の、それらの対応する、相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）部位］は、プローブ集団内の、全ての「Ｇ」を除外するか、または「Ｃ」の全てを除外するなど、４つの天然に存在するヌクレオチド塩基のうちの、２つだけまたは３つだけを使用して作られうる。ある特定の実施形態において、「Ｇ」または「Ｃ」を欠く配列は、二次構造をほとんど形成せず、より均質で、迅速なハイブリダイゼーションに寄与しうる。したがって、場合によって、核酸プローブは、Ａ、Ｔ、およびＧだけ；Ａ、Ｔ、およびＣだけ；Ａ、Ｃ、およびＧだけ；またはＴ、Ｃ、およびＧだけを含有しうる。
一態様において、核酸プローブ上のリード配列は、対応する一次増幅核酸上の認識配列に結合する（例えば、特異的に）ことが可能でありうる。したがって、核酸プローブが、生物学的試料中の標的、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を認識する場合、一次増幅核酸はまた、核酸プローブのリード配列と、対応する、一次増幅核酸上の認識配列との相互作用、例えば、相補性結合により、核酸プローブを介して、標的と会合することも可能である。例えば、認識配列は、標的リード配列を認識することが可能でありうるが、他の非標的リード配列を、実質的に認識しないか、またはこれらに実質的に結合しない。一次増幅核酸はまた、適用に応じて、核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、および／またはＰＮＡなどとハイブリダイズすることが可能な、様々な実体のうちのいずれかも含みうる。例えば、このような実体は、認識配列の一部または全部を形成しうる。
場合によって、認識配列は、標的リード配列に対して、実質的に相補性でありうる。場合によって、配列は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補性でありうる。典型的に、相補性は、ワトソン－クリック型のヌクレオチド塩基対合に基づき決定される。標的リード配列の構造は、既に記載されている構造を含みうる。
場合によって、認識配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、認識配列は、５００、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、認識配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一部の実施形態において、一次増幅核酸はまた、下記において論じられる、二次増幅核酸に結合することが可能な、１個または複数個のリード配列も含みうる。例えば、一次増幅核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはこれを超える、２０個またはこれを超える、３２個またはこれを超える、４０個またはこれを超える、５０個またはこれを超える、６４個またはこれを超える、７５個またはこれを超える、１００個またはこれを超える、１２８個またはこれを超えるリード配列を含みうる。リード配列は、一次増幅核酸内の任意の場所に配置されうる。１つを超えるリード配列が存在する場合、リード配列は、互いと隣り合わせて配置される場合もあり、かつ／または他の配列により中断される場合もある。一実施形態において、一次増幅核酸は、第１の末端において、認識配列を含み、第２の末端において、複数個のリード配列を含む。
場合によって、一次増幅核酸内のリード配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、リード配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、リード配列は、１０～２０ヌクレオチドの間、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一次増幅核酸内には、任意の数のリード配列が存在しうる。例えば、一次増幅核酸内には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはこれを超えるリード配列が存在しうる。一次増幅核酸内に、１つを超えるリード配列が存在する場合、リード配列は、同じまたは異なる場合がある。場合によって、例えば、リード配列は、全て、同一でありうる。
一部の実施形態において、一次増幅核酸の集団は、核酸集団内の、全ての「Ｇ」を除外するか、または「Ｃ」の全てを除外するなど、４つの天然に存在するヌクレオチド塩基のうちの、２つだけまたは３つだけを使用して作られうる。ある特定の実施形態において、「Ｇ」または「Ｃ」を欠く配列は、二次構造をほとんど形成せず、より均質で、迅速なハイブリダイゼーションに寄与しうる。したがって、場合によって、一次増幅核酸は、Ａ、Ｔ、およびＧだけ；Ａ、Ｔ、およびＣだけ；Ａ、Ｃ、およびＧだけ；またはＴ、Ｃ、およびＧだけを含有しうる。
場合によって、１種類を超える一次増幅核酸は、試料へと、例えば、逐次的にまたは同時に適用される場合がある。例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００の識別可能な一次増幅核酸が、試料へと適用されうる。場合によって、一次増幅核酸は、逐次的に添加されうる。しかし、場合によって、１つを超える一次増幅核酸は、同時に添加されうる。
実施形態の１つのセットにおいて、一次増幅核酸上のリード配列は、対応する二次増幅核酸上の認識配列に結合する（例えば、特異的に）ことが可能でありうる。したがって、核酸プローブが、生物学的試料中の標的、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を認識する場合、二次増幅核酸はまた、一次増幅核酸のリード配列と、対応する二次増幅核酸増幅核酸上の認識配列との相互作用、例えば、相補性結合により、一次増幅核酸を介して、標的と会合することも可能である。例えば、二次増幅核酸上の認識配列は、一次増幅核酸上のリード配列を認識することが可能でありうるが、他の非標的リード配列を、実質的に認識しないか、またはこれらに実質的に結合しない。二次増幅核酸はまた、適用に応じて、核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、および／またはＰＮＡなどとハイブリダイズすることが可能な、様々な実体のうちのいずれかも含みうる。例えば、このような実体は、認識配列の一部または全部を形成しうる。
場合によって、二次増幅核酸上の認識配列は、一次増幅核酸上のリード配列に対して、実質的に相補性でありうる。場合によって、配列は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補性でありうる。
場合によって、二次増幅核酸上の認識配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、認識配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、認識配列は、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
一部の実施形態において、二次増幅核酸はまた、本明細書において論じられる、シグナル発生実体に結合することが可能な、１個または複数個のリード配列も含みうる。例えば、二次増幅核酸は、シグナル発生実体に結合することが可能な、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはこれを超える、２０個またはこれを超える、３２個またはこれを超える、４０個またはこれを超える、５０個またはこれを超える、６４個またはこれを超える、７５個またはこれを超える、１００個またはこれを超える、１２８個またはこれを超えるリード配列を含みうる。リード配列は、二次増幅核酸内の任意の場所に配置されうる。１つを超えるリード配列が存在する場合、リード配列は、互いと隣り合わせて配置される場合もあり、かつ／または他の配列により中断される場合もある。一実施形態において、二次増幅核酸は、第１の末端において、認識配列を含み、第２の末端において、複数個のリード配列を含む。この構造はまた、一次増幅核酸の構造と、同じまたは異なる場合がある。
場合によって、二次増幅核酸内のリード配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、または少なくとも４５０ヌクレオチドの長さでありうる。場合によって、リード配列は、５００を超えない、４５０を超えない、４００を超えない、３５０を超えない、３００を超えない、２５０を超えない、２００を超えない、１７５を超えない、１５０を超えない、１２５を超えない、１００を超えない、７５を超えない、６０を超えない、６５を超えない、６０を超えない、５５を超えない、５０を超えない、４５を超えない、４０を超えない、３５を超えない、３０を超えない、２０を超えない、または１０ヌクレオチドを超えない長さでありうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、二次増幅核酸内のリード配列は、１０～２０ヌクレオチドの間、１０～３０ヌクレオチドの間、２０～４０ヌクレオチドの間、５～５０ヌクレオチドの間、１０～２００ヌクレオチドの間、または２５～３５ヌクレオチドの間、１０～３００ヌクレオチドの間などの長さを有しうる。
二次増幅核酸内には、任意の数のリード配列が存在しうる。例えば、二次増幅核酸内には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはこれを超えるリード配列が存在しうる。二次増幅核酸内に、１つを超えるリード配列が存在する場合、リード配列は、同じまたは異なる場合がある。場合によって、例えば、リード配列は、全て、同一でありうる。加えて、一次増幅核酸内および二次増幅核酸内には、独立に、同じまたは異なる数のリード配列が存在する場合がある。
ある特定の実施形態において、二次増幅核酸の集団は、核酸集団内の、全ての「Ｇ」を除外するか、または「Ｃ」の全てを除外するなど、４つの天然に存在するヌクレオチド塩基のうちの、２つだけまたは３つだけを使用して作られうる。ある特定の実施形態において、「Ｇ」または「Ｃ」を欠く配列は、二次構造をほとんど形成せず、より均質で、迅速なハイブリダイゼーションに寄与しうる。したがって、場合によって、二次増幅核酸は、Ａ、Ｔ、およびＧだけ；Ａ、Ｔ、およびＣだけ；Ａ、Ｃ、およびＧだけ；またはＴ、Ｃ、およびＧだけを含有しうる。
場合によって、１種類を超える二次増幅核酸は、試料へと、例えば、逐次的にまたは同時に適用される場合がある。例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも３０，０００の識別可能な二次増幅核酸が、試料へと適用されうる。場合によって、二次増幅核酸は、逐次的に添加されうる。しかし、場合によって、１つを超える二次増幅核酸は、同時に添加されうる。
加えて、代わりに、ある特定の実施形態において、このパターンが、上記の議論と同様に、例えば、三次増幅核酸、四次増幅核酸などにより、シグナル発生実体の前に繰り返される。したがって、シグナル発生実体は、最終増幅核酸に結合されうる。したがって、非限定例として述べると、標的に、符号化核酸プローブが結合され、これに、一次増幅核酸が結合され、これに、二次増幅核酸が結合され、これに、三次増幅核酸が結合され、これに、シグナル発生実体が結合される場合もあり、または、標的に、符号化核酸プローブが結合され、これに、一次増幅核酸が結合され、これに、二次増幅核酸が結合され、これに、三次増幅核酸が結合され、これに、四次増幅核酸が結合され、これに、シグナル発生実体が結合される場合もあるなどである。したがって、全ての実施形態において、最終増幅核酸は、必ずしも、二次増幅核酸である必要がない。
核酸プローブ内または増幅核酸内には、他の構成要素もまた、存在しうる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、例えば、酵素による増幅を容易とするように、１つまたは複数のプライマー配列が存在しうる。当業者は、増幅（例えば、ＰＣＲまたは他の適切な技法を使用して）などの適用に適するプライマー配列について承知しているであろう。多くのこのようなプライマー配列は、市販されている。一次核酸プローブ内に存在しうる配列の他の例は、プロモーター配列、オペロン、識別配列、ナンセンス配列などを含むがこれらに限定されない。
典型的に、プライマーは、核酸合成のための出発点として用いられ、核酸ポリメラーゼなどのポリメラーゼ酵素が、プライマーを伸長させ、相補鎖を複製することを可能とする、一本鎖または部分的に二本鎖の核酸（例えば、ＤＮＡ）である。プライマーは、標的核酸に対して相補性であり、これとハイブリダイズする（例えば、これに対して相補性であり、これとハイブリダイズするようにデザインされる）。一部の実施形態において、プライマーは、合成プライマーである。一部の実施形態において、プライマーは、天然に存在しないプライマーである。プライマーは、典型的に、１０～５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマーは、１０～４０、１０～３０、１０～２０、２５～５０、１５～４０、１５～３０、２０～５０、２０～４０、または２０～３０ヌクレオチドの長さを有しうる。一部の実施形態において、プライマーは、１８～２４ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態において、１つまたは複数のシグナル発生実体は、二次増幅核酸（または他の最終増幅核酸）上の認識実体へと結合されうる。シグナル発生実体の非限定例は、例えば、下記において論じられる、蛍光実体（フルオロフォア）またはリン光実体を含む。次いで、シグナル発生実体は、例えば、核酸プローブまたは標的を決定するように決定されうる。場合によって、決定は、空間的であることが可能であり、例えば、二または三次元における決定でありうる。加えて、場合によって、決定は、定量的でありうる、例えば、シグナル発生実体および／または標的の、量または濃度が決定されうる。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、二次増幅核酸（または他の最終増幅核酸）へと接合されうる。シグナル発生実体は、試料中の標的への、二次増幅核酸の会合の前に、またはこの後において、二次増幅核酸（または他の最終増幅核酸）へと接合されうる。例えば、シグナル発生実体は、二次増幅核酸へと、最初に接合される場合もあり、二次増幅核酸が、試料へと適用された後において接合される場合もある。場合によって、シグナル発生実体が添加され、次いで、それらを、増幅核酸へと接合するように反応させられる。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、シグナル発生実体を放出するように切断されうる結合を介して、ヌクレオチド配列へと接合されうる。例えば、試料中の核酸プローブの分布を決定した後、別ラウンドの核酸プローブおよび／または増幅核酸の前に、シグナル発生実体は、放出されるか、または不活化される場合がある。したがって、一部の実施形態において、結合は、ジスルフィド結合または光切断型結合など、切断可能な結合でありうる。光切断型結合の例については、本明細書において、詳細に論じられる。場合によって、このような結合は、例えば、還元剤または光（例えば、紫外光）へと曝露されると切断されうる。さらなる詳細については、下記を参照されたい。シグナル発生実体を不活化し、かつ／または除去するためのシステムおよび方法の他の例については、本明細書において、詳細に論じられる。
ある特定の実施形態において、一次および二次増幅核酸の使用は、所与の核酸プローブに結合されうるシグナル発生実体には、最大数が存在することを示唆する。例えば、有限数の一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸の最大数に起因して、かつ／または有限数の核酸プローブ上のリード配列に結合することが可能な一次増幅核酸の最大数に起因して、例えば、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸には、最大数が存在する。各潜在的位置は、シグナル発生実体により、実際に充填される必要はないが、この構造は、それを越えて、偶然に存在しうる、任意のさらなるシグナル発生実体が、核酸プローブまたはその標的と会合することは不可能である、シグナル発生実体の飽和限界が存在することを示唆する。
したがって、本発明のある特定の実施形態は、全般的に、可飽和である、すなわち、どれほどのシグナル発生実体が、核酸プローブまたはその標的と会合しうるのかについての上限である、飽和限界が存在するような、核酸プローブまたはその標的を指し示すシグナルを増幅する、システムおよび方法を対象とする。典型的に、この数は、１を超える。例えば、シグナル発生実体の上限は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００などでありうる。場合によって、上限は、５００未満、４００未満、３００未満、２５０未満、２００未満、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、７５未満、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、５未満などでありうる。場合によって、上限は、標的に結合する核酸プローブに結合しうる一次増幅核酸の最大数を乗じられた、一次増幅核酸に結合しうる二次増幅核酸の最大数を乗じられた、二次増幅核酸に結合しうるシグナル発生実体の最大数として決定されうる。これに対し、ローリングサークル増幅またはヘアピンアンフォールディングなどの技法は、制御されない形における、シグナルの増幅を可能とする、すなわち、十分な試薬が存在する場合、増幅は、所定の終点または飽和限界を伴わずに持続しうる。したがって、このような技法は、核酸プローブまたはその標的と会合しうるシグナル発生実体の数に関して、理論的上限を有さない。
しかし、核酸プローブまたはその標的に実際に結合したシグナル発生実体の平均数が、実際に、その上限と同じである必要はない、すなわち、シグナル発生実体は、実際には、完全飽和しない場合がある（完全飽和することは可能であるが）ことを理解されたい。例えば、飽和量（または結合しうる最大数と比べた、結合したシグナル発生実体の数）は、９７％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満など、および／または少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％などでありうる。場合によって、結合が生じるための時間を与えること、および／または試薬の濃度を増大させることは、飽和量を増大させうる。
核酸プローブまたはその標的に、実際に結合したシグナル発生実体の数についての潜在的上限のために、試料中に、例えば、空間的に分布した結合イベントは、上記において論じられた制御されない増幅など、制御されない増幅とは対照的に、実質的に均一のサイズおよび／または輝度を提示しうる。例えば、一次増幅核酸に結合しうる、二次増幅核酸の特異的数に起因して、二次増幅核酸は、結合を指し示す、「スポットサイズ」、またはシグナル発生実体からの蛍光の直径を限界づけうる、核酸プローブまたはその標的からの固定距離を超えては見出されえない。
ある特定の実施形態において、結合イベントのうちの、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、結合イベントを、非特異的結合、ノイズなど、他のイベントと識別することを容易としうる、実質的に同じ輝度、サイズ（例えば、見かけの直径）、色などを呈しうる。
加えて、既に論じられた通り、本発明のある特定の態様は、多様な結合イベントを符号化する符合空間を使用するが、エラーの検出および／または補正を使用して、核酸プローブの、それらの標的への結合を決定してもよい。場合によって、核酸プローブ集団は、上記において論じられた通り、ある特定の増幅核酸に結合しうる、ある特定の「リード配列」を含有しうるが、核酸プローブまたは標的の位置は、試料中において、増幅核酸と会合したシグナル発生実体を使用して、例えば、例えば、本明細書において論じられる通り、ある特定の符合空間内において決定されうる。また、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号および同第ＷＯ２０１６／０１８９６３号も参照されたい。言及された通り、場合によって、核酸プローブ内のリード配列の集団は、例えば、本明細書において論じられる通り、比較的少数のリード配列が、比較的多数の異なる核酸プローブを決定するのに使用されうるように、多様な組合せにおいて組み合わされうる。
したがって、場合によって、核酸プローブ集団は、各々、核酸プローブ集団が、ある特定の数のリード配列を含有しうるように、それらのうちの一部が、異なる核酸プローブの間で共有される、ある特定の数のリード配列を含有しうる。核酸プローブ集団は、任意の適切な数のリード配列を有しうる。例えば、核酸プローブ集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個などのリード配列を有しうる。一部の実施形態において、２０を超えるリード配列もまた、可能でありうる。加えて、場合によって、核酸プローブ集団は、存在する可能なリード配列のうちの合計で、１つまたはこれを超える、２個またはこれを超える、３個またはこれを超える、４個またはこれを超える、５個またはこれを超える、６個またはこれを超える、７個またはこれを超える、８個またはこれを超える、９個またはこれを超える、１０個またはこれを超える、１１個またはこれを超える、１２個またはこれを超える、１３個またはこれを超える、１４個またはこれを超える、１５個またはこれを超える、１６個またはこれを超える、２０個またはこれを超える、２４個またはこれを超える、３２個またはこれを超える、４０個またはこれを超える、５０個またはこれを超える、６０個またはこれを超える、６４個またはこれを超える、１００個またはこれを超える、１２８個またはこれを超えるなどのリード配列を有しうるが、プローブの一部または全部は、本明細書において論じられる通り、各々、１つを超えるリード配列を含有しうる。加えて、一部の実施形態において、核酸プローブ集団は、存在する、１００個を超えない、８０個を超えない、６４個を超えない、６０個を超えない、５０個を超えない、４０個を超えない、３２個を超えない、２４個を超えない、２０個を超えない、１６個を超えない、１５個を超えない、１４個を超えない、１３個を超えない、１２個を超えない、１１個を超えない、１０個を超えない、９個を超えない、８個を超えない、７個を超えない、６個を超えない、５個を超えない、４個を超えない、３個を超えない、または２個を超えないリード配列を有しうる。これらのうちのいずれかの組合せもまた、可能でありうる、例えば、核酸プローブ集団は、合計で１０～１５の間のリード配列を含みうる。
核酸プローブ内に含有される、比較的少数のリード配列から、比較的多数の核酸プローブを、コンビナトリアル法により同定する手法についての非限定例として述べると、各々が、１個または複数個のリード配列を含む、６つの異なる種類の核酸プローブの集団内において、集団内のリード配列の総数は、４個を超えない場合がある。この例においては、説明の容易さのために、４個のリード配列が使用されるが、他の実施形態においては、例えば、５、８、１０、１６、３２個など、もしくはこれを超えるリード配列、または適用に応じて、本明細書において記載される、他の任意の適切な数のリード配列を使用して、多数の核酸プローブも実現されうることを理解されたい。例えば、核酸プローブの各々が、２個の異なるリード配列を含有する場合、４つのこのようなリード配列（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）を使用することにより、最大において、６つのプローブが、個別に同定されうる。この例においては、核酸プローブ上のリード配列の順序は、不可欠ではない、すなわち、「ＡＢ」と、「ＢＡ」とは、同義であるものとして処理されうる（他の実施形態においては、リード配列の順序が、不可欠な場合があり、「ＡＢ」と、「ＢＡ」とは、必ずしも同義でない場合もあるが）。同様に、５個のリード配列（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）が、核酸プローブ集団内において使用される場合、最大において１０個のプローブ（例えば、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＣＤ、ＣＥ、ＤＥ）が、個別に同定されうる。例えば、当業者であれば、リード配列の順序が、不可欠ではないと仮定すると、各プローブ上に、ｎ個ずつのリード配列を伴う、集団内のｋ個のリード配列について、最大において、
Figure 2022514494000002
 個の、異なるプローブが作製される場合があり；全てのプローブが、同じ数のリード配列を有する必要はなく、全てのリード配列の組合せが、あらゆる実施形態において使用される必要もないため、ある特定の実施形態においては、この数を超えるか、またはこの数未満の、異なるプローブもまた使用されうることを理解するであろう。加えて、また、一部の実施形態においては、各プローブ上のリード配列の数は、同一である必要がないことも理解されたい。例えば、一部のプローブが、２個のリード配列を含有しうるのに対し、他のプローブは、３個のリード配列を含有しうる。
一部の態様において、試料中の核酸プローブの、リード配列および／または結合パターンは、例えば、核酸の誤認またはエラーを低減または防止するように、エラー検出および／またはエラー補正符号を規定するのに使用されうる。したがって、例えば、結合が指し示される（例えば、シグナル発生実体を使用して決定される）場合、位置は、「１」により同定される場合があり；逆に、結合が指し示されない場合、位置は、「０」により同定されうる（または、場合によって、逆も成り立つ）。次いで、例えば、異なる核酸プローブを使用する、複数ラウンドにわたる結合の決定が、例えば、この空間的位置について、「符合語」を創出するのに使用されうる。一部の実施形態において、符合語は、エラーの検出および／または補正にかけられうる。例えば、符合語は、所与の核酸プローブのリード配列または結合パターンのセットについて、マッチが見出されない場合、マッチがエラーとして同定されうるように構成される場合があり、エラーの補正は、核酸プローブについて、適正な標的を決定するのに適用された配列であってもよい。場合によって、例えば、各符合語が、異なる核酸を符号化する場合、符合語は、符合語により符号化された核酸の総数より少数の「文字」または位置を有しうる。
このようなエラー検出および／またはエラー補正符号は、様々な形態を取りうる。ゴレイ符号またはハミング符号など、様々なこのような符号は、遠隔通信業界など、他の文脈において、既に開発されている。実施形態の１つのセットにおいて、核酸プローブのリード配列または結合パターンは、可能な組合せの全てが割り当てられることにはならないように割り当てられる。
例えば、４個のリード配列が可能であり、核酸プローブが、２個のリード配列を含有する場合、最大において、６個の核酸プローブが同定されうるが、使用される核酸プローブの数は、６未満でありうる。同様に、各核酸プローブ上に、ｎ個ずつのリード配列を伴う集団内の、ｋ個のリード配列について、
Figure 2022514494000003
 個の異なるプローブが、作製されうるが、使用される核酸プローブの数は、
Figure 2022514494000004
 を超えるか、またはこれ未満の任意の数でありうる。加えて、これらは、ランダムに割り当てられるか、またはエラーを検出および／または補正する能力を増大させる、特異的な形において割り当てられる場合がある。
別の例として述べると、複数ラウンドの核酸プローブが使用される場合、ラウンド数は、任意に選び出されうる。各ラウンド内において、各標的が、検出ありまたは検出なしなど、２つの可能なアウトカムをもたらしうる場合、ｎラウンドのプローブについて、最大において、２ｎ個の異なる標的が可能でありうるが、実際に使用される標的の数は、２ｎ未満の任意の数でありうる。例えば、各ラウンド内において、各標的が、異なる色チャネル内の検出ありなど、２つを超える、可能なアウトカムをもたらしうる場合、ｎラウンドのプローブについて、２ｎ個を超える（例えば、３ｎ、４ｎ、・・・個の）異なる標的が可能でありうる。場合によって、実際に使用される標的の数は、この数未満の任意の数でありうる。加えて、これらは、ランダムに割り当てられるか、またはエラーを検出および／または補正する能力を増大させる、特異的な形において割り当てられる場合がある。
符合語は、多様な符合空間を規定するのに使用されうる。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、符合語または核酸プローブは、割当てが、核酸プローブが、異なる、正当な核酸プローブとして誤解釈される原因となる、所与のパターン内の、不正確な「リード」の数を測定するハミング距離（Ｈａｍｍｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ）だけ隔てられるように、符合空間内に割り当てられうる。ある特定の場合に、ハミング距離は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６などでありうる。加えて、実施形態の１つのセットにおいて、割当ては、ハミング符号、例えば、ハミング（７，４）符号、ハミング（１５，１１）符号、ハミング（３１，２６）符号、ハミング（６３，５７）符号、ハミング（１２７，１２０）符号などとして形成されうる。実施形態の別のセットにおいて、割当ては、ＳＥＣＤＥＤ符号、例えば、ＳＥＣＤＥＤ（８，４）符号、ＳＥＣＤＥＤ（１６，４）符号、ＳＥＣＤＥＤ（１６，１１）符号、ＳＥＣＤＥＤ（２２，１６）符号、ＳＥＣＤＥＤ（３９，３２）符号、ＳＥＣＤＥＤ（７２，６４）符号などを形成しうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、割当ては、拡張二元ゴレイ符号、完全二元ゴレイ符号、または三元ゴレイ符号を形成しうる。実施形態の別のセットにおいて、割当ては、上記において記載した符号のうちのいずれかから取られた、可能な値のサブセットを表しうる。
例えば、エラー補正符号は、固定数または一定数の「１」ビット（または「０」ビット）を含有する二進ワードだけを使用して、標的を符号化することにより形成されうる。例えば、符合空間は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６などの「１」ビット（または「０」ビット）だけを含みうる、例えば、符号の全ては、同じ数の「１」ビットまたは「０」ビットなどを有する。実施形態の別のセットにおいて、割当ては、非対称のリードアウトエラーに対処する目的のために、上記において記載した符号のうちのいずれかから取られた、可能な値のサブセットを表しうる。例えば、場合によって、「１」ビットの数が、使用される全ての二進ワードについて固定されうる符号は、「０」ビットが、「１」として測定される割合、または「１」ビットが、「０」として測定される割合が異なる場合に、異なる数の「１」による、ワードのバイアス測定を消失させうる。
したがって、一部の実施形態において、符合語が決定されたら（例えば、本明細書において論じられる通りに）、符合語は、既知の核酸符合語と比較されうる。マッチが見出される場合、核酸標的は、同定または決定されうる。マッチが見出されない場合、符合語の読取りにおけるエラーが同定されうる。場合によって、適正な符合語を決定し、これにより、核酸標的の適正な識別を結果としてもたらすように、エラー補正もまた適用されうる。場合によって、符合語は、１つのエラーだけが存在すると仮定すると、１つの可能であり適正な符合語だけが利用可能であり、これにより、核酸標的の、１つの適正な識別だけが可能となるように選択されうる。場合によって、これはまた、より大きな符合語間隔またはハミング距離へも一般化される場合があり；例えば、符合語は、２つ、３つ、または４つのエラー（または、場合によって、これを超えるエラー）が存在する場合、１つの可能であり適正な符合語だけが利用可能であり、これにより、核酸標的の、１つの適正な識別だけが可能となるように選択されうる。
エラー補正符号は、二進法のエラー補正符号の場合もあり、他の番号付けシステム、例えば、三進法または四進法のエラー補正符号に基づく場合もある。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、１種類を超えるシグナル発生実体が使用され、エラー補正符号内の異なる数へと割り当てられうる。したがって、非限定例として述べると、第１のシグナル発生実体（または、場合によって、１つを超えるシグナル発生実体）は、「１」として割り当てられ、第２のシグナル発生実体（または、場合によって、１つを超えるシグナル発生実体）は、「２」として割り当てられ（「０」は、シグナル発生実体が存在しないことを指し示す）、符合語は、三進法のエラー補正符号を規定するように分布している。同様に、加えて、四進法のエラー補正符号を作るように、第３のシグナル発生実体が、「３」として割り当てられる場合もあるなどである。
本明細書において論じられる通り、ある特定の態様において、シグナル発生実体は、例えば、イメージングして、核酸プローブを決定し、かつ／または符合語を創出することにより決定される。シグナル発生実体の例は、本明細書において論じられるシグナル発生実体を含む。場合によって、試料中のシグナル発生実体は、様々な技法を使用して、例えば、空間的に決定されうる。一部の実施形態において、シグナル発生実体は、蛍光であることが可能であり、蛍光顕微鏡法または共焦点顕微鏡法など、試料中の蛍光を決定するための技法は、細胞内のシグナル発生実体の位置を、空間的に同定するのに使用されうる。場合によって、試料中の実体の位置は、二次元なおまたは三次元において決定される場合もある。加えて、一部の実施形態において、１つを超えるシグナル発生実体は、同時に（例えば、異なる色または発光を伴う、シグナル発生実体）決定される場合もあり、かつ／または逐次的に決定される場合もある。
加えて、一部の実施形態において、同定された標的、例えば、核酸標的についての信頼水準が、決定されうる。例えば、信頼水準は、正確なマッチの数の、１つまたは複数の１ビットエラーを有するマッチの数に対する比を使用して決定されうる。場合によって、ある特定の値を超える信頼比を有するマッチだけが使用されうる。例えば、ある特定の実施形態において、マッチは、マッチについての信頼比が、約０．０１を超える、約０．０３を超える、約０．０５を超える、約０．１を超える、約０．３を超える、約０．５を超える、約１を超える、約３を超える、約５を超える、約１０を超える、約３０を超える、約５０を超える、約１００を超える、約３００を超える、約５００を超える、約１０００を超えるか、または他の任意の適切な値である場合に限り許容されうる。加えて、一部の実施形態において、マッチは、同定された標的についての信頼比が、内部標準または偽陽性対照を、約０．０１、約０．０３、約０．０５、約０．１、約０．３、約０．５、約１、約３、約５、約１０、約３０、約５０、約１００、約３００、約５００、約１０００、または他の任意の適切な値超える場合に限り許容されうる。
一部の実施形態において、実体（および、したがって、実体に会合している可能性がある核酸プローブ）の空間的位置は、比較的高分解能において決定されうる。例えば、位置は、約１００マイクロメーターを超える、約３０マイクロメーターを超える、約１０マイクロメーターを超える、約３マイクロメーターを超える、約１マイクロメーターを超える、約８００ｎｍを超える、約６００ｎｍを超える、約５００ｎｍを超える、約４００ｎｍを超える、約３００ｎｍを超える、約２００ｎｍを超える、約１００ｎｍを超える、約９０ｎｍを超える、約８０ｎｍを超える、約７０ｎｍを超える、約６０ｎｍを超える、約５０ｎｍを超える、約４０ｎｍを超える、約３０ｎｍを超える、約２０ｎｍを超える、または約１０ｎｍを超えるなどの空間的分解能において決定されうる。
例えば、蛍光顕微鏡法を使用して、実体の空間的位置を、光学的に決定するか、またはイメージングすることが可能な様々な技法が存在する。一部の実施形態においては、１つを超える色が使用されうる。場合によって、空間的位置は、超高分解能において、または、光の波長もしくは回折限界を超える分解能において決定される場合がある。非限定例は、ＳＴＯＲＭ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＴＥＤ（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＮＳＯＭ（Ｎｅａｒ－ｆｉｅｌｄ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、４Ｐｉ顕微鏡法、ＳＩＭ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＭＩ（Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）顕微鏡法、ＲＥＳＯＬＦＴ（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｓａｔｕｒａｂｌｅ Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｅａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＧＳＤ（Ｇｒｏｕｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＳＩＭ（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ－Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＰＤＭ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、蛍光光活性化局在性顕微鏡法（ＦＰＡＬＭ）、ＬＩＭＯＮ（３Ｄ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ Ｎａｎｏｓｉｚｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＯＦＩ（ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ）などを含む。例えば、各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１０年１１月２３日において交付され、「Ｓｕｂ－Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」と題された、Ｚｈｕａｎｇらによる、２０１３年１０月２２日において交付され、「Ｓｕｂ－ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」と題された、Ｚｈｕａｎｇらによる、米国特許第７，８３８，３０２号；米国特許第８，５６４，７９２号；または２０１３年６月２０日において公開され、「Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄｕａｌ－Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」と題された、Ｚｈｕａｎｇらによる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０９０３６０号を参照されたい。
例示的な非限定例として述べると、実施形態の１つのセットにおいて、試料は、高開口数であり、拡大率を１００倍とする、油浸対物レンズと、電子増倍型ＣＣＤカメラ上に集められた光とによりイメージングされうる。別の例において、試料は、高開口数であり、拡大率を４０倍とする、油浸対物レンズと、広視野学術用ＣＭＯＳカメラにより集められた光とによりイメージングされうるであろう。多様な非限定的実施形態において、対物レンズと、カメラとの異なる組合せにより、単一の視野は、４０×４０ミクロン、８０×８０ミクロン、１２０×１２０ミクロン、２４０×２４０ミクロン、３４０×３４０ミクロン、または５００×５００ミクロンなどを超えない視野に対応しうる。同様に、一部の実施形態において、単一のカメラピクセルは、８０×８０ｎｍ、１２０×１２０ｎｍ、１６０×１６０ｎｍ、２４０×２４０ｎｍ、または３００×３００ｎｍなどを超えない試料領域に対応しうる。別の例において、試料は、低開口数であり、拡大率を１０倍とするエアレンズと、ｓＣＭＯＳカメラにより集められた光とによりイメージングされうる。さらなる実施形態において、試料は、単一のまたは複数のピンホールを通して集光され、走査ミラーまたは回転ディスクにより生成される、単回または複数回の走査による回折限界の焦点光を介してこれを照射することにより、光学的に分割されうる。別の実施形態において、試料はまた、当業者に公知の、複数の方法のうちの任意の１つを介して生成される、光の薄板を介して照射される場合もある。
一実施形態において、試料は、単一ガウスモードのレーザー光線により照射されうる。一部の実施形態において、照射プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅｄ）は、これらのレーザー光線を、圧電手段または他の機械的手段を介して振動させられた、多重モードファイバーに通すことにより、平板化されうる。一部の実施形態において、照射プロファイルは、単一モードのガウスビームを、πシェイパーなど、様々な屈折ビームシェイパーまたは一連の積層型パウエルレンズに通すことにより、平板化されうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、ガウスビームは、場合によって、残留レーザースペックルを除去するように、高速度においてスピニングされうる、グラウンドガラスまたは工学用散光器など、様々な異なる散光要素に通される場合もある。さらに別の実施形態において、レーザー照射は、平板性の照射野を近似する、重複照射画像をもたらすように、一連の小型レンズアレイに通される場合もある。
一部の実施形態において、実体の空間的位置の重心が決定されうる。例えば、シグナル発生実体の重心は、当業者に公知の画像解析アルゴリズムを使用して、画像内において、または一連の画像内において決定されうる。場合によって、アルゴリズムは、試料中の、非重複単一エミッターおよび／または部分重複単一エミッターを決定するように選択されうる。適切な技法の非限定例は、最大尤度アルゴリズム、最小二乗アルゴリズム、ベイズアルゴリズム、圧縮センシングアルゴリズムなどを含む。場合によって、これらの技法の組合せもまた、使用されうる。
加えて、場合によって、シグナル発生実体は、不活化されうる。例えば、一部の実施形態において、シグナル発生実体と会合しうる（例えば、増幅核酸を使用する）、第１の二次核酸プローブであって、第１のリード配列（例えば、核酸プローブ上の）を認識しうる、第１の二次核酸プローブを、試料へと適用することができ、次いで、例えば、シグナル発生実体と会合しうる（例えば、増幅核酸を使用する）、第２の二次核酸プローブが、試料へと適用される前に、シグナル発生実体を不活化することができる。複数のシグナル発生実体が使用される場合、シグナル発生実体を不活化するのに、同じまたは異なる技法が使用される場合があり、複数のシグナル発生実体の一部または全部が、例えば、逐次的にまたは同時に不活化される場合がある。
不活化は、シグナル発生実体の除去（例えば、試料からのまたは核酸プローブからの除去など）により引き起こされる場合もあり、かつ／またはシグナル発生実体を、何らかの形において、化学的に変更することにより引き起こされる場合もある（例えば、シグナル発生実体を光退色させることによるか、シグナル発生実体を退色させることによるか、シグナル発生実体の構造を、例えば、還元により、化学的に変更することなどによる）。例えば、実施形態の１つのセットにおいて、蛍光シグナル発生実体は、酸化、光退色、化学退色（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）などの、化学的もしくは光学的技法、厳密な洗浄、または酵素による消化もしくは酵素への曝露による反応、シグナル発生実体を、他の構成要素（例えば、プローブ）から解離させること、シグナル発生実体の化学反応（例えば、シグナル発生実体の構造を変更することが可能な反応物）などにより、不活化されうる。例えば、酸素、還元剤への曝露により、退色が生じる場合もあり、シグナル発生実体が、核酸プローブから、化学的に切断され、流体流を介して洗い流される場合もある。
一部の実施形態において、例えば、本明細書において論じられる増幅核酸を使用して、多様な核酸プローブを、１つまたは複数のシグナル発生実体と会合させうる。１つを超える核酸プローブが使用される場合、シグナル発生実体は、各々、同じまたは異なる場合がある。ある特定の実施形態において、シグナル発生実体は、発光することが可能な任意の実体である。例えば、一実施形態において、シグナル発生実体は、蛍光実体である。他の実施形態において、シグナル発生実体は、リン光実体、放射性実体、吸光性実体などでありうる。場合によって、シグナル発生実体は、試料中において、比較的高分解能において、例えば、可視光の波長または回折限界を超える分解能において決定されうる、任意の実体である。シグナル発生実体は、例えば、色素、低分子、ペプチド、またはタンパク質などでありうる。シグナル発生実体は、場合によって、単一の分子でありうる。複数の二次核酸プローブが使用される場合、核酸プローブは、同じまたは異なる発生実体と会合する場合がある。
シグナル発生実体の非限定例は、蛍光実体（フルオロフォア）またはリン光実体、例えば、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７など）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ａｔｔｏ色素、光切替え可能型色素、光活性化型色素、蛍光色素、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、もしくは「量子ドット」、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などの蛍光タンパク質、またはＰＡＧＦＰ、ＰＳＣＦＰ、ＰＳＣＦＰ２、Ｄｅｎｄｒａ、Ｄｅｎｄｒａ２、ＥｏｓＦＰ、ｔｄＥｏｓ、ｍＥｏｓ２、ｍＥｏｓ３、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ、ＰＡｔａｇＲＦＰ、ｍＭａｐｌｅ、ｍＭａｐｌｅ２、およびｍＭａｐｌｅ３などの光活性化型蛍光タンパク質を含む。他の適切なシグナル発生実体も当業者に公知である。例えば、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８３８，３０２号、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１６０６９０号を参照されたい。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、シグナル発生実体を放出するように切断されうる結合を介して、オリゴヌクレオチド配列へと接合されうる。実施形態の１つのセットにおいて、フルオロフォアは、光切断型結合など、切断可能な結合を介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。光切断型結合の非限定例は、１－（２－ニトロフェニル）エチル、２－ニトロベンジル、ビオチンホスホルアミダイト、アクリルホスホルアミダイト、ジエチルアミノクマリン、１－（４，５－ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、シクロドデシル（ジメトキシ－２－ニトロフェニル）エチル、４－アミノメチル－３－ニトロベンジル、（４－ニトロ－３－（１－クロロカルボニルオキシエチル）フェニル）メチル－Ｓ－アセチルチオ酸エステル、［４－ニトロ－３－（１－クロロカルボニルオキシエチル）フェニル］メチル－３－（２－ピリジルジチオプロピオン酸）エステル［（４－ｎｉｔｒｏ－３－（１－ｔｈｌｏｒｏｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｅｓｔｅｒ］、３－（４，４’－ジメトキシトリチル）－１－（２－ニトロフェニル）－プロパン－１，３－ジオール－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－トリフルオロアセチルカプロアミドメチル）フェニル］－エチル－［２－シアノ－エチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）ブチルアミドメチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、１－［２－ニトロ－５－（６－（Ｎ－（４，４’－ジメトキシトリチル））－ビオチンアミドカプロアミド－メチル）フェニル］－エチル－［２－シアノエチル－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト、または同様のリンカーを含むがこれらに限定されない。オリゴヌクレオチド配列は、例えば、本明細書において論じられる増幅核酸など、一次または二次（または他の）増幅核酸でありうる。
実施形態の別のセットにおいて、フルオロフォアは、ジスルフィド結合を介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。ジスルフィド結合は、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、ベータ－メルカプトエタノール、ナトリウムホウ化水素、チオレドキシン、グルタルレドキシン、トリプシノーゲン、ヒドラジン、水素化ジイソブチルアルミニウム、シュウ酸、ギ酸、アスコルビン酸、リン酸、塩化スズ、グルタチオン、チオグリコール酸塩、２，３－ジメルカプトプロパノール、２－メルカプトエチルアミン、２－アミノエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、ビス（２－メルカプトエチル）スルホン、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン、３－メルカプトプロピオン酸塩、ジメチルホルムアミド、チオプロピルアガロース、トリ－ｎ－ブチルホスフィン、システイン、硫酸鉄、亜硫酸ナトリウム、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、ホスホロチオエートなど、および／またはこれらのうちのいずれかの組合せなどであるがこれらに限定されない、様々な還元剤により切断されうる。オリゴヌクレオチド配列は、例えば、本明細書において論じられる増幅核酸など、一次または二次（または他の）増幅核酸でありうる。
別の実施形態において、フルオロフォアは、硫黄修飾が、架橋酸素および／または非架橋酸素を置きかえる、１つまたは複数のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。ある特定の実施形態において、フルオロフォアは、エタノール中に混合されたヨウ素である、ヨードエタノール、硝酸銀、または塩化水銀などであるがこれらに限定されない化合物の添加を介して、オリゴヌクレオチドから切断されうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、シグナル発生実体は、還元または酸化を介して、化学的に不活化されうる。例えば、一実施形態において、Ｃｙ５またはＣｙ７などの発色団は、ホウ化水素ナトリウムを使用して、安定的な、非蛍光状態へと還元されうる。実施形態のなおも別のセットにおいて、フルオロフォアは、アゾ結合を介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされる可能性があり、アゾ結合は、２－［（２－Ｎ－アリールアミノ）フェニルアゾ］ピリジンにより切断されうる。実施形態のさらに別のセットにおいて、フルオロフォアは、ＤＮアーゼ、例えば、エクソデオキシリボヌクレアーゼまたはエンドデオキシリボヌクレアーゼへと、適切に曝露されると切断されうる、適切な核酸セグメントを介して、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートされうる。例は、デオキシリボヌクレアーゼＩまたはデオキシリボヌクレアーゼＩＩを含むがこれらに限定されない。実施形態の１つのセットにおいて、切断は、制限エンドヌクレアーゼを介して生じうる。潜在的に適切な制限エンドヌクレアーゼの非限定例は、ＢａｍＨＩ、ＢｓｒＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩ、ＰｓｐＡＩ、ＤｐｎＩ、ＭｂｏＩ、ＭｎｌＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｈａＩＩ、ＳｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＨｐａＩ、ＡｐａＩ、ＢｃｌＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＴａｑＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨａｅＩＩ、ＤｒａＩＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＰａｃＩなどを含む。３０００を超える制限酵素について、詳細に研究されており、これらのうちの６００を超える制限酵素が市販されている。実施形態のさらに別のセットにおいて、フルオロフォアは、ビオチンへとコンジュゲートされる場合があり、オリゴヌクレオチドは、アビジンまたはストレプトアビジンへとコンジュゲートされうる。ビオチンと、アビジンまたはストレプトアビジンとの相互作用は、フルオロフォアを、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートする一方で、過剰な添加への十分な曝露がなされると、遊離ビオチンは、連結を「凌駕」し、これにより、切断を生じさせうるであろう。加えて、実施形態の別のセットにおいて、プローブは、プローブと同じ配列のほか、符号化プローブに対する相同性を有する、余分な数の塩基（例えば、１つ～２０の余分な塩基、例えば、５つの余分な塩基）を含む、対応する「トーホールドプローブ（ｔｏｅ－ｈｏｌｄ－ｐｒｏｂｅ）」を使用して除去されうる。これらのプローブは、鎖置換相互作用を介して、標識付けされたリードアウトプローブを除去しうる。オリゴヌクレオチド配列は、例えば、本明細書において論じられる増幅核酸など、一次または二次（または他の）増幅核酸でありうる。
本明細書において使用される、「光」という用語は、全般的に、任意の適切な波長（または、同義に、周波数）を有する、電磁放射線を指す。例えば、一部の実施形態において、光は、光学的または目視可能な範囲の波長（例えば、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの間の波長を有する光、すなわち、「可視光」）、赤外波長（例えば、約３００マイクロメーター～７００ｎｍの間の波長を有する光）、紫外波長（例えば、約４００ｎｍ～約１０ｎｍの間の波長を有する光）などを含みうる。ある特定の場合に、下記において詳細に論じられる通り、１つを超える実体、すなわち、化学的に異なるまたは顕著に、例えば、構造的に異なる実体が使用されうる。しかし、他の場合に、実体は、化学的に同一であるか、または少なくとも実質的に、化学的に同一でありうる。
実施形態の１つのセットにおいて、シグナル発生実体は、「切替え可能型」である、すなわち、実体は、それらのうちの少なくとも１つが、所望の波長を有する光を発する、２つまたはこれを超える状態の間において切り替えられうる。他の状態（複数可）において、実体は、光を発しない場合もあり、異なる波長の光を発する場合もある。例えば、実体は、所望の波長を有する光をもたらすことが可能な、第１の状態へと「活性化」され、同じ波長の光を発することが可能ではない、第２の状態へと「不活化」されうる。実体は、適切な波長の入射光により活性化される場合、「光活性化型」である。非限定例として述べると、Ｃｙ５は、異なる波長の光により、制御された可逆的な形において、蛍光状態と、無光状態との間において切り替えられうる、すなわち、６３３ｎｍ（または６４２ｎｍ、６４７ｎｍ、６５６ｎｍ）の赤色光が、Ｃｙ５を、安定的な無光状態へと切り替えるか、または不活化しうるのに対し、４０５ｎｍの緑色光は、Ｃｙ５を、蛍光状態へと切り替えるか、または戻して活性化させうる。場合によって、実体は、例えば、適正な刺激へと曝露されると、２つまたはこれを超える状態の間において可逆的に切り替えられうる。例えば、第１の刺激（例えば、第１の波長の光）が、切替え可能型実体を活性化させるのに使用されうるのに対し、第２の刺激（例えば、第２の波長の光）は、切替え可能型実体を、例えば、非発光状態へと不活化するのに使用されうる。任意の適切な方法が、実体を活性化させるのに使用されうる。例えば、一実施形態において、適切な波長の入射光は、実体を活性化させて、発光させるのに使用されうる、すなわち、実体は、「光切替え可能型」である。したがって、光切替え可能型実体は、例えば、異なる波長の入射光により、異なる発光状態または非発光状態の間において切り替えられうる。光は、単色（例えば、レーザーを使用してもたらされる）の場合もあり、多色の場合もある。別の実施形態において、実体は、電界および／または磁界により刺激されると活性化されうる。他の実施形態において、実体は、例えば、ｐＨを調整すること、または実体に関与する、可逆的な化学反応を誘導することなどにより、適切な化学的環境へと曝露されると活性化されうる。同様に、任意の適切な方法が、実体を不活化するのに使用される場合があり、実体を活性化させる方法と、実体を不活化する方法とは、同じである必要がない。例えば、実体は、適切な波長の入射光へと曝露されると、不活化される場合もあり、実体は、十分な時間にわたり待機することにより不活化される場合もある。
典型的に、「切替え可能型」実体は、第１の状態にある実体が、励起波長へと曝露されると、その条件下において発光しうる条件を決定し、実体を、第１の状態から、第２の状態へと切り替え、例えば、波長を切り替えた光へと曝露し、次いで、実体が、第２の状態にある場合、励起波長へと曝露されても、もはや発光しない（または強度を低減した光を発する）ことを示すことにより、当業者により同定されうる。
論じられる通り、実施形態の１つのセットにおいて、切替え可能型実体は、光へと曝露されると切り替えられうる。場合によって、切替え可能型実体を活性化させるのに使用される光は、外部の光源、例えば、レーザー光源などの光源、切替え可能型実体に近接する別の発光実体などに由来しうる。場合によって、第２の発光実体は、蛍光実体であることが可能であり、ある特定の実施形態において、第２の発光実体もまた、それ自体、切替え可能型実体でありうる。
一部の実施形態において、切替え可能型実体は、第１の発光部分（例えば、フルオロフォア）と、第１の部分を活性化させるか、または「切り替える」第２の部分とを含む。例えば、光へと曝露されると、切替え可能型実体の第２の部分は、第１の部分を活性化させ、第１の部分に発光させうる。活性化剤部分の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｙ２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ３．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、または他の適切な色素を含むがこれらに限定されない。発光部分の例は、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃｙ７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤｉＤ、ＤｉＲ、ＹＯＹＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＹＯ－ＰＲＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＯＴ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴＯ－ＰＲＯ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または他の適切な色素を含むがこれらに限定されない。これらは、例えば、共有結合的に、例えば、直接的に、一体に連結される場合もあり、リンカーを介して、一体に連結される場合もあり、例えば、Ｃｙ５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５－Ｃｙ２、Ｃｙ５－Ｃｙ３、Ｃｙ５－Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ５．５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ５．５－Ｃｙ２、Ｃｙ５．５－Ｃｙ３、Ｃｙ５．５－Ｃｙ３．５、Ｃｙ７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｃｙ７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ７－Ｃｙ２、Ｃｙ７－Ｃｙ３、Ｃｙ７－Ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ｃｙ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ｃｙ３、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０－Ｃｙ３．５などであるがこれらに限定されない化合物を形成する。当業者は、それらのうちの多くが市販されている、これらの化合物および他の化合物の構造について承知しているであろう。部分は、共有結合を介して連結される場合もあり、下記において詳細に記載されているリンカーなどのリンカーにより連結される場合もある。他の発光部分または活性化剤部分は、ポリメチン鎖により接続された、２つの四級化窒素原子を有する部分であって、各窒素が、独立に、ピロール、イミダゾール、チアゾール、ピリジン、キノリン（ｑｕｉｎｏｉｎｅ）、インドール、ベンゾチアゾールなど、ヘテロ芳香族部分の一部であるか、または非芳香族アミンの一部である部分を含みうる。場合によって、２つの窒素原子の間に、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはこれを超える炭素原子が存在しうる。
ある特定の場合に、発光部分と、活性化剤部分とは、互いから分離されると、各々が、フルオロフォア、すなわち、刺激、例えば、励起波長へと曝露されると、ある特定の発光波長の光を発しうる実体でありうる。しかし、第１のフルオロフォアと、第２のフルオロフォアとを含む、切替え可能型実体が形成される場合、第１のフルオロフォアは、第１の発光部分を形成し、第２のフルオロフォアは、刺激に応答して、第１の部分を活性化させるか、または「切り替える」、活性化剤部分を形成する。例えば、切替え可能型実体は、第２のフルオロフォアに、直接的に結合した第１のフルオロフォアを含む場合もあり、第１および第２の実体は、リンカーまたは共通の実体を介してつながれる場合もある。発光部分と、活性化剤部分との対が、適切な切替え可能型実体をもたらすのかどうかは、当業者に公知の方法により調べられうる。例えば、多様な波長の光は、対を刺激するのに使用される場合があり、対が、適切なスイッチをもたらすのかどうかを決定するように、発光部分からの発光が決定されうる。
非限定例として述べると、Ｃｙ３と、Ｃｙ５とは、このような実体を形成するように、一体に連結されうる。この例において、Ｃｙ３は、発光部分である、Ｃｙ５を活性化させることが可能な、活性化剤部分である。したがって、実体のうちの、活性化または第２の部分の吸収極大（例えば、Ｃｙ３について、５３２ｎｍ近傍の光）における光、またはこの近傍の光は、この部分に、第１の発光部分を活性化させ、これにより、第１の部分に発光させうる（例えば、Ｃｙ５について、６４７ｎｍ近傍において）。例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８３８，３０２号を参照されたい。場合によって、第１の発光部分は、その後、任意の適切な技法により、不活化されうる（例えば、６４７ｎｍ赤色光を、分子のうちのＣｙ５部分へと方向付けることにより）。
潜在的に適切な活性化剤部分の、他の非限定例は、１，５ ＩＡＥＤＡＮＳ、１，８－ＡＮＳ、４－メチルウンベリフェロン、５－カルボキシ－２，７－ジクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、５－カルボキシナフトフルオレセイン、５－カルボキシテトラメチルローダミン（５－ＴＡＭＲＡ）、５－ＦＡＭ（５－カルボキシフルオレセイン）、５－ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５－ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）、５－ＲＯＸ（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、５－ＴＡＭＲＡ（５－カルボキシテトラメチルローダミン）、６－カルボキシローダミン６Ｇ、６－ＣＲ ６Ｇ、６－ＪＯＥ、７－アミノ－４－メチルクマリン、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、７－ヒドロキシ－４－メチルクマリン、９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン、ＡＢＱ、酸性フクシン、ＡＣＭＡ（９－アミノ－６－クロロ－２－メトキシアクリジン）、アクリジンオレンジ、アクリジンレッド、アクリジンイエロー、アクリフラビン、アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ－Ｓ、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、ＡＭＣＡ－Ｘ、アミノアクチノマイシンＤ、アミノクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、アニリンブルー、ステアリン酸アントロシル、ＡＰＴＲＡ－ＢＴＣ、ＡＰＴＳ、Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ、Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｏｒａｎｇｅ Ｒ、Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｒｅｄ ６Ｂ、Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ ７ ＧＬＬ、アタブリン、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６１１Ｘ、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６３５、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０、ＡＴＴＯ－ＴＡＧ ＣＢＱＣＡ、ＡＴＴＯ－ＴＡＧ ＦＱ、オーラミン、オーロホスフィンＧ、オーロホスフィン、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）、ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）、ベルベリン硫酸塩、ビマン、ビスベンザミド、ビスベンジミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、ビス－ＢＴＣ、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＦＦＧ、Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＳＶ、ＢＯＢＯ－１、ＢＯＢＯ－３、Ｂｏｄｉｐｙ ４９２／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ ４９３／５０３、Ｂｏｄｉｐｙ ５００／５１０、Ｂｏｄｉｐｙ ５０５／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ ５３０／５５０、Ｂｏｄｉｐｙ ５４２／５６３、Ｂｏｄｉｐｙ ５５８／５６８、Ｂｏｄｉｐｙ ５６４／５７０、Ｂｏｄｉｐｙ ５７６／５８９、Ｂｏｄｉｐｙ ５８１／５９１、Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０－Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５－Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ ６６５／６７６、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ、Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ－セラミド、Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘコンジュゲート、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ－Ｘ、ＳＥ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ－Ｘ ＳＥ、ＢＯ－ＰＲＯ－１、ＢＯ－ＰＲＯ－３、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＳｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎＦＦ、ＢＴＣ、ＢＴＣ－５Ｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ Ｂｌｕｅ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－１ Ｃａ２＋色素、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－２ Ｃａ２＋、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－５Ｎ Ｃａ２＋、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ－Ｃ１８ Ｃａ２＋、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（５－ＲＯＸ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ、カテコールアミン、ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）、ＣＦＤＡ、クロモマイシンＡ、クロモマイシンＡ、ＣＬ－ＮＥＲＦ、ＣＭＦＤＡ、クマリンファロイジン、ＣＰＭメチルクマリン、ＣＴＣ、ＣＴＣホルマザン、Ｃｙ２、Ｃｙ３．１８、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３、Ｃｙ５．１８、環状ＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）、Ｄａｂｃｙｌ、ダンシル、ダンシルアミン、ダンシルカダベリン、ダンシルクロリド、ダンシルＤＨＰＥ、ダンシルフルオリド、ＤＡＰＩ、Ｄａｐｏｘｙｌ、Ｄａｐｏｘｙｌ ２、Ｄａｐｏｘｙｌ ３’ＤＣＦＤＡ、ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸塩）、ＤＤＡＯ、ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）、ジ－４－ＡＮＥＰＰＳ、ジ－８－ＡＮＥＰＰＳ［非レシオメトリック（ｎｏｎ－ｒａｔｉｏ）］、ＤｉＡ（４－ジ－１６－ＡＳＰ）、ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ）、ＤｉＤ（親油性トレーサー）、ＤｉＤ［ＤｉＩＣ１８（５）］、ＤＩＤＳ、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）、ＤｉＩ［ＤｉＩＣ１８（３）］、ジニトロフェノール、ＤｉＯ［ＤｉＯＣ１８（３）］、ＤｉＲ、ＤｉＲ［ＤｉＩＣ１８（７）］、ＤＭ－ＮＥＲＦ（高ｐＨ）、ＤＮＰ、ドーパミン、ＤＴＡＦ、ＤＹ－６３０－ＮＨＳ、ＤＹ－６３５－ＮＨＳ、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００、ＥＬＦ９７、エオシン、エリスロシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ）、エリスロシンＩＴＣ、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体１（ＥｔｈＤ－１）、オイクリシン、ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ、塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）、Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ、ＦＤＡ、フォイルゲン（パラローズアニリン）、ＦＩＦ［ホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄ）誘導性蛍光］、ＦＩＴＣ、Ｆｌａｚｏ Ｏｒａｎｇｅ、Ｆｌｕｏ－３、Ｆｌｕｏ－４、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン二酢酸塩、Ｆｌｕｏｒｏ－Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｆｌｕｏｒｏ－Ｇｏｌｄ（ヒドロキシスチルバミジン）、Ｆｌｕｏｒ－Ｒｕｂｙ、ＦｌｕｏｒＸ、ＦＭ１－４３、ＦＭ４－４６、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ（高ｐＨ）、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ／Ｆｌｕｏ－３、Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－２／ＢＣＥＣＦ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １０ＧＦ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｐｉｎｋ ３Ｇ、Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｙｅｌｌｏｗ ５ＧＦ、ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ（ＣＣＦ２）、Ｇｌｏｘａｌｉｃ Ａｃｉｄ、Ｇｒａｎｕｌａｒ ｂｌｕｅ、ヘマトポルフィリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０、ＨＰＴＳ、ヒドロキシクマリン、ヒドロキシスチルバミジン（ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）、ヒドロキシトリプタミン、Ｉｎｄｏ－１（高カルシウム）、Ｉｎｄｏ－１（低カルシウム）、インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）、インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）、Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ Ｃｆ、ＪＣ－１、ＪＯ－ＪＯ－１、ＪＯ－ＰＲＯ－１、ＬａｓｅｒＰｒｏ、Ｌａｕｒｏｄａｎ、ＬＤＳ ７５１（ＤＮＡ）、ＬＤＳ ７５１（ＲＮＡ）、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＷＳ、リサミンローダミン、リサミンローダミンＢ、Ｃａｌｃｅｉｎ／エチジウムホモ二量体、ＬＯＬＯ－１、ＬＯ－ＰＲＯ－１、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ、Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ、Ｍａｇ Ｇｒｅｅｎ、Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ（Ｐｈｌｏｘｉｎ Ｂ）、Ｍａｇ－Ｆｕｒａ Ｒｅｄ、Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２、Ｍａｇ－Ｆｕｒａ－５、Ｍａｇ－Ｉｎｄｏ－１、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、マラカイトグリーン、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ １０ ＧＦＦ、Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ ８ ＧＦＦ、メロシアニン、メトキシクマリン、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ、ミトラマイシン、モノブロモビマン、モノブロモビマン（ｍＢＢｒ－ＧＳＨ）、モノクロロビマン、ＭＰＳ（Ｍｅｔｈｙｌ Ｇｒｅｅｎ Ｐｙｒｏｎｉｎｅ Ｓｔｉｌｂｅｎｅ）、ＮＢＤ、ＮＢＤアミン、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ、ニトロベンゾキサジアゾール（Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉｄｏｌｅ）、ノルアドレナリン、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｎｙｌｏｓａｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｉａｖｉｎ Ｅ８Ｇ（Ｎｙｌｏｓａｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｉａｖｉｎ Ｅ８Ｇ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８－Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、パラローズアニリン（フォイルゲン）、ＰＢＦＩ、Ｐｈｌｏｘｉｎ Ｂ（Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ）、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＡＲ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＢＫＬ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ Ｒｅｖ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）、ＰＫＨ６７、ＰＭＩＡ、Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂｌｕｅ Ｂｌａｃｋ、ＰＯＰＯ－１、ＰＯＰＯ－３、ＰＯ－ＰＲＯ－１、ＰＯ－ＰＲＯ－３、プリムリン、Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ、ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄ）（ＰＩ）、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ピロニン、ピロニンＢ、ピラゾールブリリアントフラビン７ＧＦ、ＱＳＹ ７、キナクリンマスタード、レソルフィン、ＲＨ ４１４、Ｒｈｏｄ－２、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン５ ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミングリーン、ローダミンファリシジン、ローダミンファロイジン、ローダミンレッド、ローダミンＷＴ、ローズベンガル、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、ＳＢＦＩ、セロトニン、Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ２Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ、Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｅｖｒｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌ、ＳＩＴＳ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（イソチオスルホン酸スティルベン）、ＳＮＡＦＬ ｃａｌｃｅｉｎ、ＳＮＡＦＬ－１、ＳＮＡＦＬ－２、ＳＮＡＲＦカルセイン、ＳＮＡＲＦ１、Ｓｏｄｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ａｑｕａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、ＳＰＱ［６－メトキシ－Ｎ－（３－スルホプロピル）キノリニウム］、スティルベン、スルホローダミンＢおよびＣ、スルホローダミンエクストラ、ＳＹＴＯ １１、ＳＹＴＯ １２、ＳＹＴＯ １３、ＳＹＴＯ １４、ＳＹＴＯ １５、ＳＹＴＯ １６、ＳＹＴＯ １７、ＳＹＴＯ １８、ＳＹＴＯ ２０、ＳＹＴＯ ２１、ＳＹＴＯ ２２、ＳＹＴＯ ２３、ＳＹＴＯ ２４、ＳＹＴＯ ２５、Ｓ
ＹＴＯ ４０、ＳＹＴＯ ４１、ＳＹＴＯ ４２、ＳＹＴＯ ４３、ＳＹＴＯ ４４、ＳＹＴＯ ４５、ＳＹＴＯ ５９、ＳＹＴＯ ６０、ＳＹＴＯ ６１、ＳＹＴＯ ６２、ＳＹＴＯ ６３、ＳＹＴＯ ６４、ＳＹＴＯ ８０、ＳＹＴＯ ８１、ＳＹＴＯ ８２、ＳＹＴＯ ８３、ＳＹＴＯ ８４、ＳＹＴＯ ８５、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ、テトラサイクリン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テキサスレッド、テキサスレッド－Ｘコンジュゲート、チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）、チアジンレッドＲ、チアゾールオレンジ、チオフラビン５、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、Ｔｈｉｏｌｙｔｅ、チアゾールオレンジ（Ｔｈｉｏｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ）、Ｔｉｎｏｐｏｌ ＣＢＳ（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ Ｗｈｉｔｅ）、ＴＭＲ、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＴＯＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３、ＴＲＩＴＣ（イソチオシアン酸テトラメチルローダミン）、Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ、ＴｒｕＲｅｄ、Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ、Ｕｒａｎｉｎｅ Ｂ、Ｕｖｉｔｅｘ ＳＦＣ、ＷＷ ７８１、Ｘ－ローダミン、ＸＲＩＴＣ、Ｘｙｌｅｎｅ Ｏｒａｎｇｅ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、ＹＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ［挿入型（ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｉｎｇ）色素］、またはこれらの組合せを含む。
本発明の別の態様は、コンピュータ実装法を対象とする。例えば、本明細書において記載される方法のうちのいずれかを、自動的に、かつ／または反復的に実施することが可能な、コンピュータおよび／または自動式システムが提供されうる。本明細書において使用される、「自動式」デバイスとは、ヒトの指示を伴わずに作動することが可能なデバイスを指す、すなわち、自動式デバイスは、任意のヒトが、例えば、工程を開始するための命令を、コンピュータへと入力することにより、機能を推し進めるための任意の措置を取ることを終えた後の時間において、機能を果たしうる。典型的に、自動式装置は、この時点の後に、反復的機能を果たしうる。場合によって、処理工程はまた、コンピュータ読取り型メディアへも記録されうる。
例えば、場合によって、コンピュータは、例えば、本明細書において記載される技法など、蛍光顕微鏡、ＳＴＯＲＭ、または他の超高分解能手法を使用して、試料のイメージングを制御するのに使用されうる。場合によって、コンピュータはまた、画像解析における、ドリフト補正、物理的登録、ハイブリダイゼーション、およびクラスターの位置合わせ、クラスターの復号（例えば、蛍光クラスターの復号）、エラーの検出または補正（例えば、本明細書において論じられる）、ノイズの低減、フォアグラウンド特徴の、バックグラウンド特徴（画像内のノイズまたはデブリなど）からの識別などの操作も制御しうる。例として述べると、コンピュータは、試料中のシグナル発生実体の活性化および／もしくは励起、ならびに／またはシグナル発生実体についての画像の収集を制御するのに使用されうる。実施形態の１つのセットにおいて、試料は、多様な波長および／または強度を有する光を使用して励起される場合があり、コンピュータを使用すると、試料を励起するのに使用される光の波長のシーケンスは、シグナル発生実体を含有する試料について収集される画像と相関しうる。例えば、コンピュータは、目的の各領域内の、異なるシグナル発生実体の平均数（例えば、位置１つ当たり１つの活性化実体、位置１つ当たり２つの活性化実体など）をもたらすように、多様な波長および／または強度を有する光を、試料へと当てうる。場合によって、この情報は、場合によって、上記において言及された通り、高分解能において、シグナル発生実体についての画像を構築し、かつ／またはシグナル発生実体の位置を決定するのに使用されうる。
一部の態様において、試料は、顕微鏡上に置かれる。場合によって、顕微鏡は、流体を、試料へと、または試料から、方向付けるか、または制御する、マイクロ流体チャネルなど、１つまたは複数のチャネルを含有しうる。例えば、一実施形態において、本明細書において論じられる核酸プローブなどの核酸プローブは、１つまたは複数のチャネルを介して、流体により、試料へと、または試料から、導入および／または除去されうる。場合によって、また、流体を保持するための、例えば、チャネルおよび／または試料と流体連絡した、１つまたは複数のチャンバーまたはレザバーも存在しうる。当業者は、流体を、試料へと、または試料から動かすための、マイクロ流体チャネルを含むチャネルについて精通しているであろう。
Ｚｈｕａｎｇらによる、２０１８年１２月１３日に出願され、「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ＭＥＲＦＩＳＨ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」と題された、米国特許仮出願第６２／７７９，３３３号は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。以下の文献：米国特許出願第２０１７／０２２０７３３号および同第２０１７／０２１２９８６号；国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号、同第ＷＯ２０１６／０１８９６３号、同第ＷＯ２０１８／０８９４４５号、および同第ＷＯ２０１８／０８９４３８号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／３４６５１号もまた、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
以下の例は、本発明のある特定の実施形態を例示することを意図するものであり、本発明の全範囲を例示するものではない。
ＭＥＲＦＩＳＨ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、数百～数千に及ぶＲＮＡ分子種を、それらの天然の細胞内環境において、直接イメージングおよびプロファイリングするので、空間的に分解された、単一細胞トランスクリプトミクスを可能とする。以下の例は、ＭＥＲＦＩＳＨ測定のための、制御増幅法または可飽和増幅法を使用する。これらの例は、スポットサイズを増大させたり、スポット間の輝度のばらつきを増大させたりせずに、ＲＮＡ ＦＩＳＨ試料中の実質的なシグナルの増大を裏付ける。１３０のＲＮＡ分子種が、正確に測定され、ほぼ１００％の検出効率により同定された。これらの進歩は、細胞培養物中および組織内の両方において、ＭＥＲＦＩＳＨにより対処されうる生物学的問題の範囲を実質的に拡張するはずである。
特に、これらの例は、ＭＥＲＦＩＳＨ増幅を組み合わせて、ＭＥＲＦＩＳＨによるシグナル輝度を、劇的に増大させる手法を示す。これらの例は、この手法が、変動係数を一定として、スポットサイズの変化を伴わずに、ＲＮＡｓｍＦＩＳＨシグナルを、最大において、３０．６倍に増幅したことを裏付ける。この手法は、シグナルを、同じ単一の細胞内の数百のＲＮＡを、ほぼ１００％の検出効率により、同時に増幅するための、迅速であり、簡単であり、効率的な方式をもたらした。
ＤＮＡ増幅を、ＭＥＲＦＩＳＨへと組み込むデザイン：これらの例は、この増幅戦略が、本明細書において記載される、ある特定の修飾を使用して、ＭＥＲＦＩＳＨと組み合わされた場合に、ある特定の利点を有することを示す。増幅倍数を決定する足場は、予測可能であり、デザイン可能であることが見出された。複数の増幅配列が、異なる結合速度を有する場合であってもなお、全ての被験増幅配列に十分な時間を与えて、飽和状態に到達することから、増幅を制御可能とし、再現可能とし、ばらつきを小さくし、ＭＥＲＦＩＳＨの復号工程に利益をもたらす。
これらの例において使用される、この標識付け法を、図１Ａ～１Ｅに例示する。ＭＥＲＦＩＳＨシステムを使用して、標的ＲＮＡ鋳型と相補的な、３０マーの標的領域配列と、符号化プローブと称される、複数の２０マーのリードアウト配列とを有する、オリゴヌクレオチドプローブの複合ライブラリーを染色した（例えば、各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１８９６０号および同第ＷＯ２０１６／０１８９６３号を参照されたい）。
増幅配列セットは、増幅配列染色ラウンドに従い、一次および二次増幅配列と名付けた。一次増幅配列セットの各々は、符号化プローブのリードアウト配列のうちの１個と、２０マーの反復配列Ｎ個（Ｎ）とに結合する相補配列を有した。二次増幅配列セットの各々は、一次増幅配列上の、２０マーの反復配列１個に対する相補配列と、最終的なリードアウトと相補的な、２０マーの反復配列Ｎ個とを有した。一次および二次増幅配列の染色後、元のリードアウトシグナルを、最終的なリードアウトシグナルへと、Ｎ２倍に、１対１増幅した。この増幅を、Ｎ×Ｎ増幅と称した（図１Ａ～１Ｅ）。
これらの増幅には、いくつかの注目すべき進歩がなされている。第１に、増幅配列は、３つのヌクレオチドだけを使用してデザインした。４つのヌクレオチドのうちの３つだけを含有するプローブ配列は、４つのヌクレオチド全てを使用する配列より、ハイブリダイゼーション速度が大きかった。これは、このような配列内の二次構造が、著明に少ないことに起因すると考えられる。加えて、増幅配列の染色および洗浄工程において、符号化プローブの、ＲＮＡへの結合を保持するために、２０マーの結合性配列を、増幅配列に使用し、これを、染色し、３７℃において、１０％ホルムアミドにより洗浄した。３０マーの、ＲＮＡに対するターゲティング領域を含有する符号化プローブを、４７℃において、３０％ホルムアミドにより洗浄した。増幅を、蛍光バックグラウンドを除去する能力を内在させる、ゲル包埋され、透明化された、ＭＥＲＦＩＳＨ試料上において実施した。例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８９４４５号を参照されたい。
図１Ａ～１Ｅは、ＭＥＲＦＩＳＨイメージングのための増幅についての概略的例示を示す。図１Ａは、検体を、ＭＥＲＦＩＳＨ符号化プローブライブラリーにより染色し、ポリアクリルアミドゲル中において透明化したことを示す。各符号化プローブは、３０マーの標的配列と、複数個のリードアウト配列とを有する。図１Ｂは、図１Ａ内の枠囲い領域について、一次増幅配列を、符号化プローブ上の、元のリードアウトとハイブリダイズさせた後、過剰量の一次増幅配列を除去する洗浄工程を行ったことを示す。一次増幅配列は、符号化プローブ上のリードアウト配列に対する相補配列と、２０マーの反復配列Ｎ個とを有した。図１Ｃは、二次増幅配列が、一次増幅配列の反復領域に結合することを示す。二次増幅配列は、一次増幅配列上の、２０マーの反復配列のうちの１個に対する相補配列と、最終的なリードアウトと相補的な、２０マーの反復配列Ｎ個とを有した。洗浄の後、検体を、最終的なリードアウトが、ジスルフィドにより連結されたフルオロフォアを使用する、マルチラウンドのＭＥＲＦＩＳＨイメージングにおいて使用した。図１Ｄは、Ｎ×Ｎ増幅検体による、第１ラウンドのＭＥＲＦＩＳＨによる、最終的なリードアウト染色を示す。これと比較して、図１Ｅは、非増幅検体による、第１ラウンドのＭＥＲＦＩＳＨによる、リードアウト染色を示す。
ＤＮＡ増幅の特性：本実施例においては、デザインを実現するために、リードアウト配列を含有する符号化プローブを、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）ｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、５×５増幅を、増幅配列染色ラウンド１つ当たり１５分間として、Ｕ－２ ＯＳ細胞内の符号化プローブ上において実施した。平均ＦＬＮＡ ｓｍＦＩＳＨスポット輝度符号化プローブ上のリードアウトの直接的な標識付け、または符号化プローブ上のリードアウトにより、５×５増幅された標識付けを測定した。シグナルの、１０．５倍の増大を観察したが、これは、理論値の４２％を達成した。図２Ａおよび２Ｂを参照されたい。
理論的増幅倍数に到達しなかった、１つの可能性は、増幅配列の染色時間が、十分ではなかったことだと推論された。増幅配列の染色の各ラウンドを、１５分間、３０分間、６０分間、および１８０分間の時間系列として、同じ５×５増幅を行った（図２Ｃ）。結果は、増幅された信号は、各ラウンドにおいて１５分間以内にハイブリダイズされた増幅配列で飽和されたことを示した。１５分後における飽和は、増幅配列の完全なアセンブリーが迅速であったことを指し示し、本実施例における増幅プローブのデザインのための、３文字アルファベットの使用の、さらなる利点を例示する。これと比較して、他の方法は、増幅１ラウンド当たり、４５分間またはこれを超える時間を要しうることが多い。
次に、増幅配列の長さが、増幅の性能に影響するのかどうかについて研究した。４×４増幅配列および９×９増幅配列について研究した。４×４増幅配列および９×９増幅配列について、それぞれ、５．５倍および３０．６倍の輝度の増大が観察された。結果は、３つの増幅配列の長さ全てが、約４０％の理論的増幅値をもたらしたことを示唆した。（図２Ｄ）。
増幅の、１つの潜在的帰結は、１つの分子からのシグナルが、他の分子からのシグナルと重複することに起因して、これらのＲＮＡを同定する能力を減少させうる、ＦＩＳＨスポットサイズの増大である。９×９増幅配列の足場は、約１３２ｎｍの長さ（ヌクレオチド１つ当たり、２００ヌクレオチド×２×０．３３ｎｍ）を有し、これは、回折限界内にあると考えられる。４×４増幅、５×５増幅、および９×９増幅による、スポットサイズの測定値は、予測される通り、同一であった（図２Ｅ）。このデザインに基づけば、スポット間の輝度のばらつきは、実質的に増大しないことが予測された。これを確認するために、スポット輝度の変動係数を、非増幅試料、４×４増幅試料、５×５増幅試料、および９×９増幅試料について測定した。スポット間の輝度のばらつきは、増幅により増大しないことが見出された（図２Ｆ）。
図２Ａ～２Ｆは、ＤＮＡ増幅が、スポットサイズおよびスポット間の輝度のばらつきを、実質的に変化させずに、シグナル輝度を、劇的に増大させたことを示す。図２Ａは、リードアウトプローブにより標識された非増幅試料である、ＦＬＮＡ ｓｍＦＩＳＨプローブにより染色された、Ｕ－２ ＯＳ細胞画像についての画像を示す（左）。明暗差を、左画像と比べて、１０倍に増大させて、蛍光シグナルを、よりよく例示するか（中）、または５×５増幅の後において、リードアウトプローブにより染色した（右）（スケールバー：１０マイクロメーター）。図２Ｂは、図２Ａ内の、枠囲い領域についての拡大図である（スケールバー：２マイクロメーター）。
図２Ｃは、増幅配列染色の時間系列による、個々のＦＬＮＡ ｍＲＮＡスポットの平均輝度を示す。平均輝度は、リードアウトプローブにより直接染色された、非増幅対照試料に照らして正規化した。図２Ｄは、４×４増幅試料中および９×９増幅試料中の、個々のＦＬＮＡ ｍＲＮＡスポットの平均輝度を示す。平均輝度は、リードアウトプローブにより直接染色された、非増幅対照試料に照らして正規化した。図２Ｅは、非増幅細胞内、４×４増幅細胞内、５×５増幅細胞内、および９×９増幅細胞内の、平均ＦＬＮＡ ｍＲＮＡスポットサイズを示す。幅（半値幅）は、ガウス分布による、点拡がり関数（ＰＳＦ）の、ＲＮＡスポットへの当てはめにより決定した。図２Ｆは、非増幅試料中、４×４増幅試料中、５×５増幅試料中、および９×９増幅試料中の、ＲＮＡスポット輝度についての変動係数を示す。
ＭＥＲＦＩＳＨイメージングのための増幅配列のスクリーニング：本実施例においては、１６ビットの、改変ハミング距離４（ＭＨＤ４）による符号化スキームにより、増幅を、ＭＥＲＦＩＳＨ測定へと拡張するために、１６対の一次増幅配列および二次増幅配列を使用した。略述すると、２０マーの、３文字反復配列は、一次増幅配列および二次増幅配列の、塩基１つ当たりの確率を、それぞれ、Ａについて２５％、Ｔについて２５％、およびＣについて５０％、またはＡについて２５％、Ｔについて２５％、およびＧについて５０％とする、配列のランダムセットを生成することによりデザインした。配列を、配列自体の中において照合し、１１ヌクレオチドより長い相同性領域を回避するように、ヒトトランスクリプトームに照らして、ＢＬＡＳＴ解析を行った。５×５増幅配列は、スポット輝度の、桁数単位の変化をもたらす。したがって、後続のＭＥＲＦＩＳＨ測定においても、５×５増幅配列を使用した。また、増幅配列のうちの約２０％は、二次増幅配列を強く誘導するか、ＲＮＡ依存性を有するか、またはバックグラウンド程度の効率もしくは低増幅効率を有することも見出された。これらは、増幅配列対を変化させることにより、補正することができた。１６対は、ＭＥＲＦＩＳＨイメージングのための、２０対の５×５増幅配列からスクリーニングした（図５Ａ～５Ｃ）。
ＤＮＡの増幅を伴うＭＥＲＦＩＳＨ測定：実施例３において記載された、１６対の増幅配列が、ＭＥＲＩＦＳＨと共に働くのかどうかを検証するために、１３０ＲＮＡのＭＥＲＦＩＳＨライブラリーを、Ｕ－２ ＯＳ細胞内において使用して、５×５増幅を実施した。８ラウンドの２色イメージングを使用して、１６ビットをリードアウトした。加えて、還元によるジスルフィド結合の切断を使用して、増幅および非増幅試料の両方による、連続ラウンドのイメージングの間に、リードアウトプローブへと連結されたフルオロフォアを除去した。図３Ａは、個々のＲＮＡ分子が、５×５増幅試料に対する、８回にわたるハイブリダイゼーションおよびイメージングラウンドの各々において検出することができ、それらの識別の復号化が可能となったことを示す。
５×５増幅されたＭＥＲＦＩＳＨ測定のＲＮＡ復号の品質を決定するために、一部のＲＮＡを、誤った分子種として誤認することにより引き起こされる、非ゼロの誤認エラーと、検出時および復号時に、一部のＲＮＡを逸することにより引き起こされる非１００％の判定率とを、いくつかの側面から考察した。第１に、誤認率と相関する、細胞１つ当たりの、ブランクバーコードのＲＮＡカウントと、１３０の実際のＲＮＡバーコードとを検討した。５×５増幅されたＭＥＲＦＩＳＨ測定における、１３０のＲＮＡ分子種のうちの１２１は、ブランクバーコードと共に観察される、細胞１つ当たりの最大コピー数より大きな、細胞１つ当たりのコピー数を有することが見出された（図３Ｂ）。
次に、各ビットについて、０に対する１の平均エラー率、および１に対する０の平均エラー率を決定した。これらのエラー率が低度である場合、理論において潜在的に得られる高判定率が観察されるであろう。１の０へのエラー率である、約１．７％、および０の１へのエラー率である、約０．６％が観察された（図３Ｃ）。５×５増幅データを、ほぼ１００％の検出効率を有した、かつての非増幅ＭＥＲＦＩＳＨデータと、さらに比較した。図３Ｄは、増幅試料中において観察される、細胞１つ当たりのコピー数が、非増幅試料中において測定される、細胞１つ当たりのコピー数と、０．９８のピアソン相関係数により、強く相関することを示す［それらの測定コピー数が、最大のブランクバーコードカウントについて観察されたコピー数より大きかった、１２１のＲＮＡ分子種についてのρ１０（ロー）＝０．９８である］。増幅試料中において測定されるコピー数ｔの、非増幅試料中において測定されるコピー数に対する比は、０．９８±０．１２（ＳＥＭ；ＲＮＡのｎ＝１２１）であったので、５×５増幅は、ほぼ１００％の検出効率を保持した。
これらのＲＮＡについて、ＭＥＲＦＩＳＨにより検出された、細胞１個当たりの平均コピー数を、ＲＮＡ存在度が、ＲＮＡ－ｓｅｑにより測定された、５×５増幅と比較した（図３Ｅ）。ピアソンの相関係数は、０．９０であった。細胞１個当たりのコピー数の結果も、また、増幅を伴う、多連にわたるＭＥＲＦＩＳＨ実験の間において、高度に再現可能であった（図３Ｆ）。
図３Ａ～３Ｆは、Ｕ－２ ＯＳ細胞内の、５×５増幅を伴う、１３０のＲＮＡについてのＭＥＲＦＩＳＨ測定を示す。図３Ａ、左図：マーカーの色（本図においては、影を付すことにより表される）により表される、ＲＮＡのバーコードを伴う、１３０のＲＮＡ分子種についての、５×５増幅されたＭＥＲＦＩＳＨ測定において検出された、全ての同定ＲＮＡである（スケールバー：１０マイクロメーター）。右図：左図の写真の枠囲い領域について、Ｃｙ５（緑）またはＡｌｅｘａ７５０（赤）により標識されたリードアウトプローブを使用する、８ラウンドにわたるハイブリダイゼーションおよびイメージングの各々に由来する、２色ｓｍＦＩＳＨ画像である（スケールバー：２マイクロメーター）。図３Ｂは、５×５増幅された、約１２００の細胞内において検出された、実際のＲＮＡバーコード（暗色）およびブランク対照バーコード（明色）についての、最大～最小値からソートされた、細胞１つ当たりの平均ＲＮＡコピー数を示す。図３Ｃは、５×５増幅されたＭＥＲＦＩＳＨ測定を伴う、各ビットについて、測定されたバーコードのうちの、所与のビット反転を含有する割合である、エラー率を示す。１の０へのエラー率（左）と、０の１へのエラー率（右）とを、各ビットについて示す。図３Ｄは、５×５増幅されたＵ－２ ＯＳ細胞内の、これらのＲＮＡ分子種について観察される、細胞１つ当たりの平均コピー数を、非増幅試料から得られたコピー数と対比して示す。ピアソンの相関係数は、０．９８であった。図３Ｅは、５×５増幅を伴うＭＥＲＦＩＳＨにより決定された、細胞１つ当たりの平均ＲＮＡコピー数を、ＲＮＡｓｅｑにより決定された存在度と対比して示す。ＲＮＡ存在度のｌｏｇ１０値に対するピアソン相関係数は、０．９であった。図３Ｆは、１回の５×５増幅試料中において検出される、細胞１つ当たりの平均コピー数を、多連試料と対比して示す。ピアソンの相関係数は、０．９６であった。
これらの例は、単一の細胞内の、数百のＲＮＡを測定するための、ＭＥＲＦＩＳＨと、３文字増幅法との組合せを提示する。３文字増幅配列は、標的に結合し、増幅配列染色ラウンド１つ当たり１５分間以内に、飽和状態に到達することが示された。この手法を使用して、それぞれ、４×４増幅、５×５増幅、および９×９増幅を使用することによりにより、スポットサイズの変化を伴わずに、ＲＮＡ ｓｍＦＩＳＨシグナルを、５．５倍、１０．５倍、および３０．６倍へと増幅した。非増幅試料中、４×４増幅試料中、５×５増幅試料中、および９×９増幅試料中のスポット輝度の変動係数が、極めて近接したことは、スポット輝度のばらつきが、ＤＮＡ増幅時に増大しなかったことを指し示すが、これは、ＭＥＲＦＩＳＨ復号に重要である。最後に、１３０のＲＮＡ分子種の、正確な同定およびカウンティングは、増幅試料中において測定されるコピー数の、非増幅試料中において測定されるコピー数に対する比が、０．９８であったことによると、増幅試料中における、ほぼ１００％の検出効率により裏付けられた。
増幅倍数は、４×４増幅、５×５増幅、および９×９増幅を含む、３つの増幅全てについて、理論数値のほぼ４０％であることが観察された。増幅配列およびリードアウトの結合効率は、１００％ではなかったと考えられる。ラウンド１つ当たりの平均結合率は、ほぼ７３．５％であった。加えて、スクリーニングされた増幅配列セットのうちの、８０％は、よく働き、実質的な増幅をもたらした。残りの２０％は、高バックグラウンドまたは低増幅効率を有した。増幅配列セットが、さらなる精緻化を伴わずに働く、この確率は、この手法を、多数のリードアウト配列の増幅へと、迅速にスケールアップする能力を例示し、これは、マルチプレックス化能を拡大するために有用となろう。
増幅を、既存のＭＥＲＦＩＳＨライブラリーへと適用した。増幅によりもたらされる、シグナル輝度の実質的な増大は、ＭＥＲＦＩＳＨの、いくつかのさらなる適用を拡大するはずである。本実施例において、ＲＮＡ １つ当たり９２の符号化プローブを使用して、ＭＥＲＦＩＳＨ測定を実施した。この増幅法によるシグナルの増大は１０という少数の符号化プローブにより、はるかに短いＲＮＡ、潜在的に、３００マーという短いＲＮＡを検出する可能性をもたらすはずである。比較的少数のプローブにより、ＲＮＡ分子を検出する能力はまた、ＲＮＡアイソフォームの弁別も、劇的に改善するであろう。第２に、ＭＥＲＦＩＳＨ測定は、イメージング視野（ＦＯＶ）数、ならびにリードアウト染色の固定、リードアウトの切断、および洗浄時間と比例する、動的時間を使用した。視野が、大きな数へと増大する場合、イメージング時間は、ＭＥＲＦＩＳＨのスループットを左右するであろう。増幅シグナルによる曝露時間が短くなれば、イメージングの持続時間を実質的に短縮することが可能となるはずであり、これにより、ＭＥＲＦＩＳＨのスループットを改善する。加えて、スピニングディスク共焦点イメージングは、より大きな明暗差をもたらしたが、より厚い試料中の光子の検出において、広視野顕微鏡法より低感度であった。したがって、ＭＥＲＦＩＳＨによる増幅の組込みは、例えば、スピニングディスク共焦点顕微鏡法による、組織内のＦＩＳＨシグナルの検出を容易とするであろう。
以下は、上記の例において使用された、多様な材料および方法である。
符号化プローブのデザイン：ヒト骨肉腫細胞（Ｕ－２ ＯＳ）（ＡＴＣＣ）内のＭＥＲＦＩＳＨ測定は、以下の通りに実施した。略述すると、１６ビットのＭＨＤ４符号を使用して、ＲＮＡを符号化した。この符号化スキームにおいては、１４０の可能なバーコードの各々は、ハミング重み（すなわち、各バーコード内の、「１」ビットの数）を、一定の４として、「１」の「０」へのエラーと、「０」の「１」へのエラーとの示差的割合に起因する、異なるバーコードの測定における、潜在的バイアスを回避する。加えて、全てのバーコードは、エラー検出およびエラー補正を可能とするように、少なくとも４のハミング距離を有する。１４０の可能なバーコードのうちの、１３０を使用して、細胞内ＲＮＡを符号化し、１０のバーコードを使用して、ブランク対照として用いた。符号化プローブライブラリー内において、各ＲＮＡ分子種は、９２の符号化プローブを含有し、各符号化プローブは、各ＲＮＡへと割り当てられた４つのリードアウト配列のうちの３つを含有した。
符号化プローブの構築：符号化プローブライブラリーは、複合オリゴヌクレオチドプールから増幅した。略述すると、まず、オリゴプール（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ）を、サイクル数を限定したＰＣＲを介して増幅して、インビトロ転写鋳型を作り、インビトロ転写（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を介して、ＲＮＡへと転換および増幅し、次いで、逆転写（Ｍａｘｉｍａ ＲＴ Ｈ－、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介して、ＲＮＡを、ＤＮＡへと、転換し戻した。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７／０２１２９８６号を参照されたい。過剰量のＮＴＰまたはＮＴＰを、両方のインビトロ転写の後に、脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を介して除去し、フェノール－クロロホルム抽出を行って、純度および反応収量を改善した。最終的なＤＮＡプローブは、ＲＮＡ鋳型を除去する、アルカリ加水分解、タンパク質を除去する、フェノール－クロロホルム抽出、およびプローブを濃縮するエタノール沈殿を介して精製した。最終的なプローブは、ＲＮＡアーゼ非含有水中に再懸濁させ、－２０℃において保管した。
カバースリップのシラン化：ポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルを安定化させるため、カバースリップをシラン化した。略述すると、４０－ｍｍ－ｄｉａｍｅｔｅｒ Ｎｏ．１．５ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、０４２０－０３２３－２）を、ドラフトチャンバー内、室温における、３７％（容量／容量）のメタノールと塩酸との１：１混合物中の浸漬を介して、３０分間にわたり洗浄した。次いで、カバースリップを、脱塩水中において、３回にわたり洗浄し、７０％（容量／容量）エタノール中において、１回洗浄した。カバースリップを、窒素ガスの気流により乾燥させ、次いで、０．１％（容量／容量）のトリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ）および０．２％（容量／容量）のアリルトリクロロシラン（Ｓｉｇｍａ）を伴うクロロホルム中、室温において、３０分間にわたり浸漬した。カバースリップを、純粋クロロホルムおよび純粋エタノールにより、１回ずつ洗浄し、次いで、窒素ガスにより、ドライヤー乾燥させた。次いで、シラン化カバースリップを、乾燥チャンバー内、室温において、数週間にわたり保管したが、シラン層の品質に、明白な劣化は見られなかった。
細胞の培養および固定：Ｕ－２ ＯＳ細胞は、１０％（容量／容量）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する、イーグル最小必須培地（ＡＴＣＣ）と共に培養した。細胞接着の一助とするため、シラン化されたカバースリップを、ヌクレアーゼ非含有水中において希釈された０．１ｍｇ／ｍＬのポリ－Ｄ－リシン（ＰＤＬ）（Ｓｉｇｍａ）により、室温において、１時間にわたりコーティングした。カバースリップは、水により、３回にわたり洗浄し、水中、室温において、一晩にわたりインキュベートし、次いで、乾燥させ、ＵＶ殺菌してから、細胞を播種した。次いで、Ｕ－２ ＯＳ細胞を、カバースリップ１枚当たりの細胞２５０，０００個において、３７℃、５％のＣＯ２と共に、４８時間にわたり播種した。細胞を、１倍濃度のＰＢＳ中、４％（容量／容量）のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、室温において、１５分間にわたり固定し、１倍濃度のＰＢＳにより、３回にわたり洗浄し、次いで、１倍濃度のＰＢＳ中に、０．５％（容量／容量）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）により、１０分間にわたり透過処理し、１倍濃度のＰＢＳにより、再度、３回にわたり洗浄した。
符号化プローブの染色を、以下の通りに実施した。固定され、透過処理されたＵ－２ ＯＳ細胞を、ヌクレアーゼ非含有水中に、２倍濃度のクエン酸ナトリウム生理食塩液（ＳＳＣ）（Ａｍｂｉｏｎ）、および３０％（容量／容量）のホルムアミド（Ａｍｂｉｏｎ）を含む、符号化洗浄緩衝液中において、５分間にわたりインキュベートした。次いで、符号化ハイブリダイゼーション緩衝液中に、３０マイクロリットルの、約３００マイクロモルのＭＥＲＦＩＳＨ符号化プローブまたは約１マイクロモルのＦＬＮＡ符号化プローブ、および３．３マイクロモルのポリ（ｄＴ）ＬＮＡアンカープローブ［配列：５Ａｃｒｙｄ／ＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＴＡＡＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋ＴＴ＋Ｔ（配列番号６５）を有し、リードアウト配列の、２０ヌクレオチドの逆相補体、および５’－アクリダイト修飾（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を伴い、ｄＴとチミジン－ロックト核酸とが交代する（ｄＴ＋）、２０ヌクレオチドの配列である］を、Ｐａｒａｆｉｌｍの表面へと添加し、細胞を含有するカバースリップによりカバーした。符号化ハイブリダイゼーション緩衝液は、１０％（重量／容量）の硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ）、０．１％（重量／容量）の酵母ｔＲＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１％（容量／容量）のマウスＲＮアーゼ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した符号化洗浄緩衝液を含有した。試料を、ハイブリダイゼーションオーブン内部の加湿チャンバー内、３７℃において、３６時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、符号化洗浄緩衝液により、２回にわたり洗浄し、４７℃において、各回、３０分間にわたりインキュベートした。
試料の包埋および透明化：４％のＰＡゲルを使用して、ＲＮＡを、符号化プローブ染色試料中の定位置にアンカリングした。略述すると、まず、カバースリップ上の符号化プローブ染色試料を、４％（容量／容量）の、１９：１アクリルアミド／ビス－アクリルアミド（ＢｉｏＲａｄ）、６０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．３ＭのＮａＣｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、および直径０．１マイクロメーターのカルボン酸修飾オレンジ蛍光ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆ－８８００）の１：１００，０００希釈液を伴う、脱気ＰＡ溶液と共に、２分間にわたりインキュベートした。ビーズを、複数のラウンドのＭＥＲＦＩＳＨイメージングにわたり撮影された画像の位置合わせのための基準マーカーとして使用した。次いで、細胞を含有するカバースリップを、重合化誘発剤である過硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）および加速化剤であるＴＥＭＥＤ（Ｓｉｇｍａ）を、それぞれ、０．０５％（重量／容量）および０．０５％（容量／容量）の最終濃度において含有する、同じＰＡゲル溶液と共に、再度、２分間にわたりインキュベートした。このゲル溶液５０マイクロリットルを、ＰＡに固着しないように、１ｍＬのＧｅｌＳｌｉｃｋ（Ｌｏｎｚａ）により前処理された、ガラスプレート（ＴＥＤ Ｐｅｌｌａ）の表面へと添加した。試料を吸引して、過剰量のＰＡゲル溶液を除去し、次いで、５０マイクロリットル液滴上へと、裏返して、カバースリップと、ガラスプレートとの間に、気泡を伴わずに、ＰＡの薄層を形成した。次いで、室温において、１．５時間にわたるゲルキャストの後、カバースリップと、ガラスプレートとを、静かに引き離し、カバースリップを、ヌクレアーゼ非含有水中に、２％（重量／容量）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８（Ａｍｂｉｏｎ）、１ｍＭのＥＤＴＡ（Ａｍｂｉｏｎ）、および０．５％（容量／容量）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を有する消化緩衝液により、２回にわたり洗浄した。次いで、ゲルを、浸漬し、加湿された、３７℃のインキュベーター内の、１％（容量／容量）のプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を補充した消化緩衝液中において、＞１２時間にわたり消化した。消化された試料を、ロッカー上において、２倍濃度のＳＳＣにより、各回１５分間ずつ、３回にわたり洗浄した。試料は、非増幅ＭＥＲＦＩＳＨ測定のために、０．１％（容量／容量）のマウスＲＮアーゼ阻害剤を補充した、２倍濃度のＳＳＣ中、４℃において、４８時間を超えずに保管するか、または増幅配列の染色へと進めた。
増幅配列の染色：一次および二次増幅配列を、ゲル包埋され、透明化された試料中において染色した。試料を、ヌクレアーゼ非含有水中に、２倍濃度のＳＳＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、および１０％（容量／容量）のホルムアミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有する、１０％のホルムアミド洗浄緩衝液中において、５分間にわたりインキュベートした。次に、２倍濃度のＳＳＣ、１０％（容量／容量）のホルムアミド、０．１％（重量／容量）の酵母ｔＲＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％（容量／容量）のマウスＲＮアーゼ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および１０％（重量／容量）の硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を含有する増幅配列ハイブリダイゼーション緩衝液中に５ｎＭの一次増幅配列５０マイクロリットルを、Ｐａｒａｆｉｌｍの表面へと添加した。Ｐａｒａｆｉｌｍ上の、５０マイクロリットルの液滴上においてカバーされた試料を、余分な１０％ホルムアミド洗浄緩衝液を、Ｋｉｍｗｉｐｅｓにより除去した後、湿度を制御された、３７℃のインキュベーター内において、３０分間にわたり（ＭＥＲＦＩＳＨ）、または結合率測定のために、１５分間、３０分間、６０分間、および１８０分間の時間系列にわたりインキュベートした。次いで、試料を、ペトリディッシュ内の、１０％のホルムアミド洗浄緩衝液中、室温において、各回５分間ずつ、３回にわたり洗浄した。未使用のＰａｒａｆｉｌｍ上に、増幅配列ハイブリダイゼーション緩衝液中に５ｎＭの二次増幅配列５０マイクロリットルを添加した。洗浄された試料を、液滴上において、再度カバーし、３７℃のインキュベーター内において、一次増幅配列染色と同じ時間によりインキュベートした。次いで、試料を、１０％のホルムアミド洗浄緩衝液中、室温において、各回５分間ずつ、２回にわたり洗浄し、３回目の洗浄は、３７℃インキュベーター内において、１０％のホルムアミド洗浄緩衝液中、１５分間にわたり行った。試料は、速やかにイメージングするか、または０．１％（容量／容量）のマウスＲＮアーゼ阻害剤を補充した、２倍濃度のＳＳＣ中、４℃において、４８時間を超えずに保管した。
ＭＥＲＦＩＳＨイメージングプラットフォーム：試料は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおける、自家製のハイスループットイメージングプラットフォーム上においてイメージングした。略述すると、この顕微鏡は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ－７１顕微鏡本体、およびＮｉｋｏｎ、ＣＦＩ Ｐｌａｎ Ａｐｏ Ｌａｍｂｄａ ６０ｘ ｏｉｌ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅの周囲に構築した。７５０、６４７、５６０、４８８、および４０５ｎｍにおける照射は、固体レーザー（ＭＢＰ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－７５０－Ｂ１Ｒ；ＭＢＰ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－２０００－６４７－Ｂ１Ｒ；ＭＢＰ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－２０００－５６０－Ｂ１Ｒ；ＭＢＰ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－５００－４８８－Ｂ１Ｒ；Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、Ｃｕｂｅ ４０５）を使用して施した。これらのレーザー光線を使用して、それぞれ、Ａｌｅｘａ７５０およびＣｙ５、オレンジ色基準ビーズ、ポリｄＴリードアウトおよびＤＡＰＩにより標識されたリードアウトプローブを励起した。照射プロファイルを、πＳｈａｐｅｒ（Ｐｉｓｈａｐｅｒ）により平板化した。試料からの蛍光発光は、ペンタバンドダイクロイックミラー（Ｃｈｒｏｍａ、ｚｙ４０５／４８８／５６１／６４７／７５２ＲＰ－ＵＦ１）を使用して、レーザー照射から分離し、２つの特注重複ベンタノッチフィルター（Ｃｈｒｏｍａ、ＺＥＴ４０５／４８８／５６１／６４７－６５６／７５２ｍ）を通して、励起迷光を除去した後において、学術用ＣＭＯＳカメラ（ｓＣＭＯＳ；浜松ホトニクス、Ｃ１１４４０－Ｃ２２ＣＵ）によりイメージングした。ｓＣＭＯＳカメラのためのピクセルサイズは、試料平面内の１０９ｎｍに対応するように決定した。曝露時間は、各イメージングフレームについて、５００ミリ秒間であった。試料位置は、動力型顕微鏡載物台（Ｌｕｄｌ）を介して制御し、焦点は、対物レンズナノポジショナー（Ｍａｄ Ｃｉｔｙ Ｌａｂｓ、Ｎａｎｏ－Ｆ１００Ｓ）と、ＩＲレーザー（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＬＰ９８０－ＳＦ１５）の、ＣＭＯＳカメラ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＤＣＣ１５４５Ｍ）上の反射光との間のフィードバックシステムを介して実現された、特注の焦点ロックシステムを介して維持した。試料カバースリップは、流動チャンバー（Ｂｉｏｐｔｅｃｈｓ、ＦＣＳ２）内において保持し、このチャンバー内の緩衝液交換は、３つの８方弁（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＶＰおよびＨＶＸＭ ８－５）、および蠕動ポンプ（Ｇｉｌｉｓｏｎ、Ｍｉｎｉｐｕｌｓ ３）を制御する、特注により構築された自動式フリュイディクスシステムを使用して方向付けた。
試料のイメージング：逐次的ＭＥＲＦＩＳＨイメージングは、上記において記載したハイスループットイメージングプラットフォーム上において実行した。略述すると、各ＭＥＲＦＩＳＨラウンドは、リードアウトプローブの染色（１０分間）、洗浄緩衝液による洗浄（５分間）、イメージング緩衝液の流動（３分間）、１００～４００の視野によるイメージング、リードアウトのフルオロフォア切断（１５分間）、および２倍濃度のＳＳＣによる洗浄（５分間）を使用した。８ラウンドにわたる２色ＭＥＲＦＩＳＨイメージングを、各試料に対して実施した。具体的には、リードアウトプローブの染色は、３ｎＭのリードアウトプローブを、ヌクレアーゼ非含有水中に、２倍濃度のＳＳＣ、１０％（容量／容量）のエチレンカーボネート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１％（容量／容量）のマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）を有する、ハイブリダイゼーション緩衝液中に流動させることにより行った。洗浄緩衝液は、ヌクレアーゼ非含有水中に、２倍濃度のＳＳＣ、および１０％（容量／容量）エチレンカーボネートを含有した。イメージング緩衝液は、ヌクレアーゼ非含有水中に、２倍濃度のＳＳＣ、５０ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８、１０％（重量／容量）のグルコース、２ｍＭのＴｒｏｌｏｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＬ当たり４０マイクログラムのカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．１％（容量／容量）のマウスＲＮアーゼ阻害剤を使用した。２倍濃度のＳＳＣ、および５０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ；Ｓｉｇｍａ）を含む切断緩衝液を使用して、色素を、プローブへとコンジュゲートするジスルフィド結合を切断した。ＳｍＦＩＳＨイメージングも、単一ラウンドのＭＥＲＦＩＳＨイメージングと同様であったが、切断および２倍濃度のＳＳＣによる洗浄工程を伴わなかった。
画像の加工および復号：ＦＬＮＡ ｓｍＦＩＳＨデータのために、ガウス分布による当てはめのルーチンを介して、非増幅および増幅ＦＩＳＨスポットの輝度およびＰＳＦサイズを計算した。ＭＥＲＦＩＳＨデータのために、異なるイメージングラウンドにわたる、同じ視野の画像の登録、ならびにＲＮＡバーコードの復号は、以下の通りに行った。略述すると、各イメージングラウンドにおける画像間のオフセットは、各イメージングラウンドにおける基準ビーズの位置特定を使用して補正した。次に、画像中のバックグラウンドは、ハイパスフィルターにより除去し、ＲＮＡスポットは、デコンボリューションにより引き締め、画像間において、位置がわずかに異なる、ＲＮＡの重心は、ローパスフィルターを介してつないだ。次いで、ＲＮＡスポットが異なる色チャネルの輝度は、反復工程を介して、それらの強度ヒストグラムを均一化することにより正規化した。正規化された各ピクセルの強度を、８つの２色ラウンドにおける、全１６画像の間において比較することにより、バーコードを、個々のピクセルへと割り当てた。
計算は、１０－ｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ Ｅ５－２６８０ ２．８－ＧＨｚ ＣＰＵ ２つと、２５６ＧＢのＲＡＭとを含有する、デスクトップサーバー上で行った。
組織試料中の、５×５増幅を裏付けるために、本実施例においては、マウス内側視索前野（ＭＰＯＡ）を選び出した。この組織を、１０マイクロメーターの切片に切り分け、１３５遺伝子のＭＥＲＦＩＳＨライブラリーにより染色した後、ゲルによる包埋および透明化を行った。次いで、５×５増幅を、上記において記載した技法と同様の技法を使用して、組織試料上において実施した。
図４Ａは、５×５増幅された明スポットについての、第１のラウンドの生画像を示す。図４Ｂは、図４Ａ内において、白色により枠囲いされた領域の拡大図である（図４Ａにおけるスケールバーは、１０マイクロメーターであり、図４Ｂにおけるスケールバーは、２マイクロメーターである）。
復号の後において、ＭＥＲＦＩＳＨ測定からのＲＮＡカウントを、ＲＮＡ－ｓｅｑからのＲＮＡ存在度データと比較した。これらは、０．８１．のピアソン相関係数により、強く相関した。これを、ＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）および視野（ＦＯＶ）１つ当たりのカウントについてのプロットを示す、図４Ｃに示すことができる。
本明細書においては、本発明のいくつかの実施形態が、記載および例示されたが、当業者は、機能を実施し、かつ／または本明細書において記載される結果および／もしくは利点のうちの１つもしくは複数を得るための、他の様々な手段および／または構造を、たやすく想定し、このような変動および／または改変の各々は、本発明の範囲内にあるものとみなされる。より全般的に、当業者は、本明細書において記載される、全てのパラメータ、寸法、材料、および構成は、例示的であることを意図するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、具体的な適用、または本発明の教示が使用される適用に依存することをたやすく理解するであろう。当業者は、規定を超えない実験を使用して、本明細書において記載される、本発明の特異的実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能であろう。したがって、前出の実施形態は、例だけを目的として提示されるものであり、付属の特許請求、およびこれらの均等物の範囲内において、本発明は、具体的に記載され、特許請求されたのと別の形でも実施されうることを理解されたい。本発明は、本明細書において記載される、各個別の特徴、システム、品目、材料、キット、および／または方法を対象とする。加えて、２つまたはこれを超える、このような特徴、システム、品目、材料、キット、および／または方法の、任意の組合せも、このような特徴、システム、品目、材料、キット、および／または方法が、相互に矛盾しない限りにおいて、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書、および参照により組み込まれる文献が、相反し、かつ／または矛盾する開示を含む場合、本明細書に従うものとする。参照により組み込まれる、２つまたはこれを超える文献が、互いに対して、相反し、かつ／または矛盾する開示を含む場合は、新しい刊行日を有する文献に従うものとする。
本明細書において規定され、使用される、全ての定義は、辞書による定義、参照により組み込まれる文献における定義、および／または規定された用語の通常の意味に優先されて理解されるものとする。
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞である、「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」は、逆のことが指し示されない限りにおいて、「少なくとも１つの」を意味するように理解されるものとする。
本明細書および特許請求の範囲において使用される、「および／または」という語句は、このように接続された要素の「一方または両方」、すなわち、ある場合には、連言的に存在し、他の場合には、選言的に存在する要素を意味するように理解されるものとする。「および／または」を伴って列挙される複数の要素は、同じ形において、すなわち、このように接続された要素のうちの「１つまたは複数」であると理解されるものとする。「および／または」節により、具体的に同定された要素以外に、具体的に同定された要素と関連する場合であれ、関連しない場合であれ、他の要素が存在してもよい。したがって、非限定例として述べると、「～を含むこと」などのオープンエンドの表現と共に使用される場合の、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、一実施形態においては、Ａだけを指す場合もあり（Ｂ以外の要素を含んでもよい）；別の実施形態においては、Ｂだけを指す場合もあり（Ａ以外の要素を含んでもよい）；さらに別の実施形態においては、ＡおよびＢの両方を指す場合もある（他の要素を含んでもよい）などである。
本明細書および特許請求の範囲において使用される、「または」とは、上記において規定された「および／または」と同じ意味を有するように理解されるものとする。例えば、リスト内の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包含的である、すなわち、要素の数またはリストのうちの、少なくとも１つの包含であるが、また、１つを超える数またはリストも含み、列挙されていない、さらなる項目を含んでもよいと解釈されるものとする。「～のうちの１つだけ」もしくは「～のうちの正確に１つ」、または、特許請求の範囲において使用される場合の、「～からなること」など、逆のことが明確に指し示された用語だけが、要素の数またはリストのうちの、正確に１つの要素を指すことになる。全般的に、本明細書において使用される「または」という用語は、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つだけ」、または「～のうちの正確に１つ」など、排他性の用語により先立たれている場合に限り、排他的代替物（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を指し示すと解釈されるものとする。
１つまたは複数の要素を有するリストに言及して、本明細書および特許請求の範囲において使用される、「少なくとも１つの」という語句は、要素のリスト内の要素のうちの、任意の１つまたは複数から選択されるが、要素のリスト内において、具体的に列挙される、各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１つを、必ずしも含まず、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外しない、少なくとも１つの要素を意味するように理解されるものとする。この定義はまた、要素が、具体的に同定される要素に関連する場合であれ、関連しない場合であれ、「少なくとも１つの」という語句が指す要素のリスト内において、具体的に同定される要素以外に存在してもよいことを可能とする。したがって、非限定例として述べると、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、これと同義に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または、これと同義に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態において、１つを超えるＡを含んでもよいが、Ｂは存在しない、少なくとも１つのＡを指す場合もあり（かつ、Ｂ以外の要素を含んでもよい）；別の実施形態において、１つを超えるＢを含んでもよいが、Ａは存在しない、少なくとも１つのＢを指す場合もあり（かつ、Ａ以外の要素を含んでもよい）；さらに別の実施形態において、１つを超えるＡを含んでもよい、少なくとも１つのＡ、および１つを超えるＢを含んでもよい、少なくとも１つのＢを指す場合もある（かつ、他の要素を含んでもよい）などである。
数に言及して、本明細書において、「約」という語が使用される場合、本発明のさらに別の実施形態は、「約」という語により修飾されていない数も含むことを理解されたい。
また、逆のことが明確に指し示されない限り、本明細書において特許請求される、１つを超える工程または行為を含む、任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、列挙された方法の工程または行為の順序に、必ずしも限定されないことも理解されたい。
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書において、「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を保有すること」、「～を有すること」、「～を含有すること」、「～を伴うこと」、「～を保持すること」、「～から構成されること」など、全ての移行句は、オープンエンドである、すなわち、「～を含むがこれらに限定されないこと」を意味するように理解されるものとする。United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03において明示されている通り、「～からなること」および「～から本質的になる」という移行句だけが、それぞれ、クローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。

Claims (211)

  1. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能なこと；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること；および
    符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  2. 試料を、少なくとも５個の異なる核酸プローブへと曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 試料を、少なくとも１０個の異なる核酸プローブへと曝露することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 試料を、少なくとも１００個の異なる核酸プローブへと曝露することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 試料を、複数個の核酸プローブへと、逐次的に曝露することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 複数個の核酸プローブが、異なる配列を伴う核酸プローブのコンビナトリアルの組合せを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 核酸プローブの、コンビナトリアルの組合せが、試料中のＲＮＡ分子種のコンビナトリアルの組合せをターゲティングする、請求項６に記載の方法。
  8. 核酸プローブの、コンビナトリアルの組合せが、試料中のＤＮＡ配列のコンビナトリアルの組合せをターゲティングする、請求項６または７に記載の方法。
  9. 複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、ＤＮＡを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、ＲＮＡを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 複数個の核酸プローブが、１０～３００ヌクレオチドの間の平均長を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、試料中の核酸に結合するように構成されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、標的配列と、１個または複数個のリード配列とを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 複数個の核酸プローブの標的配列が、１０～２００ヌクレオチドの間の平均長を有する、請求項１３に記載の方法。
  15. 標的配列が、タンパク質をコードする核酸配列と、実質的に相補性である、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 標的配列が、特異的結合を介して、標的に結合する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 標的が、ＲＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. ＲＮＡが、非コードＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. ＲＮＡが、ｍＲＮＡを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. ＲＮＡが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ＲＮＡが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 標的が、ＤＮＡを含む、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 一次増幅核酸が、リード配列を介して、核酸プローブに結合する、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 複数個の核酸プローブが、１個または複数個のリード配列のプールの、コンビナトリアルの組合せから形成された、識別可能な核酸プローブを含む、請求項１３から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. プールが、少なくとも８個の可能なリード配列を有する、請求項２５に記載の方法。
  27. プールが、少なくとも１６個の可能なリード配列を有する、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. プールが、少なくとも２４個の可能なリード配列を有する、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. プールが、少なくとも３２個の可能なリード配列を有する、請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. プールが、少なくとも４８個の可能なリード配列を有する、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. プールが、少なくとも６４個の可能なリード配列を有する、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. プールが、３２個を超えない可能なリード配列を有する、請求項２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. プールが、１６個を超えない可能なリード配列を有する、請求項２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 複数個のリード配列が、エラー補正符号を規定するように、複数個の核酸プローブ上に分布している、請求項２５から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. リード配列が、５ヌクレオチド～５０ヌクレオチドの間の平均長を有する、請求項１３から３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、１０個を超えないリード配列を含む、請求項１３から３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 複数個の核酸プローブのうちの少なくとも一部が、５個を超えないリード配列を含む、請求項１３から３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. ２０個を超えない一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. １０個を超えない一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能である、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. ５個を超えない一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能である、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 一次増幅核酸が、３００ヌクレオチド未満の平均長を有する、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 一次増幅核酸が、２００ヌクレオチド未満の平均長を有する、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 一次増幅核酸が、二次増幅核酸が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 二次増幅核酸が、各々、一次増幅核酸上の１０ヌクレオチド未満の配列をターゲティングする、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. ２０個を超えない二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能である、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. １０個を超えない二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. ５個を超えない二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能である、請求項１から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 二次増幅核酸が、３００ヌクレオチド未満の平均長を有する、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 二次増幅核酸が、２００ヌクレオチド未満の平均長を有する、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 二次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 二次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 二次増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 二次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 蛍光シグナル発生実体が、ジスルフィドにより二次増幅核酸へと連結されている、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 二次増幅核酸を、二次増幅核酸に結合することが可能な三次増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
  57. 三次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 三次増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  59. 三次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項５７または５８に記載の方法。
  60. 三次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  61. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
  63. 最終ラウンドの増幅核酸（ｎｕｃｌｅｉ ａｃｉｄ）が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項６１または６２に記載の方法。
  64. 蛍光シグナル発生実体が、タンパク質を含む、請求項５２から５５、５７～５９、または６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 蛍光シグナル発生実体が、色素を含む、請求項５２から５５、５７～５９、または６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 蛍光シグナル発生実体が、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０を含む、請求項５２から５５、５７～５９、または６１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 蛍光シグナル発生実体が、Ｃｙ５を含む、請求項５２から５５、５７～５９、または６１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 蛍光シグナル発生実体が、ナノ粒子を含む、請求項５２から５５、５７～５９、または６１～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 試料の、核酸プローブへの曝露の間に、蛍光シグナル発生実体を不活化することを含む、請求項５２から５５、５７～５９、または６１～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 蛍光シグナル発生実体を除去することにより、蛍光シグナル発生実体を不活化することを含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 還元剤を使用して、蛍光シグナル発生実体を不活化することを含む、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. ジスルフィドの切断を使用して、蛍光シグナル発生実体を不活化することを含む、請求項６９から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 蛍光シグナル発生実体を光退色させることにより、蛍光シグナル発生実体を不活化することを含む、請求項６９から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 蛍光シグナル発生実体を化学退色させることにより、蛍光シグナル発生実体を不活化することを含む、請求項６９から７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 蛍光シグナル発生実体を、酵素により切断することにより、蛍光シグナル発生実体を不活化することを含む、請求項６９から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 複数個の核酸プローブが、ハミング距離を、少なくとも２とする符合空間を規定する、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 複数個の核酸プローブが、ハミング距離を、少なくとも３とする符合空間を規定する、請求項７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 符合空間が、ハミング（７，４）符号、ハミング（１５，１１）符号、ハミング（３１，２６）符号、ハミング（６３，５７）符号、またはハミング（１２７，１２０）符号である、請求項７６または７７に記載の方法。
  79. 符合空間が、ＳＥＣＤＥＤ符号である、請求項７６から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 符合空間が、ＳＥＣＤＥＤ（８，４）符号、ＳＥＣＤＥＤ（１６，４）符号、ＳＥＣＤＥＤ（１６，１１）符号、ＳＥＣＤＥＤ（２２，１６）符号、ＳＥＣＤＥＤ（３９，３２）符号、またはＳＥＣＤＥＤ（７２，６４）符号である、請求項７９に記載の方法。
  81. 核酸プローブが、一定数の１だけを有する符合空間を規定する、請求項７６から８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 試料のうちの少なくとも一部をイメージングすることにより、核酸プローブの分布を決定することを含む、請求項１から８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 光学的イメージング法を使用して、核酸プローブの結合を決定することを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 蛍光イメージング法を使用して、核酸プローブの結合を決定することを含む、請求項８２または８３に記載の方法。
  85. 多色蛍光イメージング法を使用して、核酸プローブの結合を決定することを含む、請求項８２から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 超高分解能蛍光イメージング法を使用して、核酸プローブの結合を決定することを含む、請求項８２から８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. ＳＴＯＲＭ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して、核酸プローブの結合を決定することを含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 非重複単一エミッターを決定するためのアルゴリズムを使用して、二次増幅核酸についての画像の重心を決定することを含む、請求項８２から８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 部分重複単一エミッターを決定するためのアルゴリズムを使用して、二次増幅核酸についての画像の重心を決定することを含む、請求項８２から８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 二次増幅核酸についての信頼水準を決定することをさらに含む、請求項８８または８９に記載の方法。
  91. 正確なマッチの数の、符合語に対して１つまたは複数の１ビットエラーを有するマッチの数に対する比を使用して、信頼水準を決定することを含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 正確なマッチの数の、符合語に対して正確に１つの１ビットエラーを有するマッチの数に対する比を使用して、信頼水準を決定することを含む、請求項９０または９１に記載の方法。
  93. ３００ｎｍを超える分解能において、試料中の核酸プローブの分布を決定することを含む、請求項８２から９２に記載の方法。
  94. １００ｎｍを超える分解能において、試料中の核酸プローブの分布を決定することを含む、請求項８２から９３に記載の方法。
  95. ５０ｎｍを超える分解能において、試料中の核酸プローブの分布を決定することを含む、請求項８２から９４に記載の方法。
  96. 試料が、細胞を含む、請求項１から９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 細胞が、ヒト細胞である、請求項９６に記載の方法。
  98. 細胞が、固定される、請求項９６から９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 試料が、組織を含む、請求項１から９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸および二次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること；および
    符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  101. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１０１に記載の方法。
  103. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
  104. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１０２または１０３に記載の方法。
  105. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、固定距離以内の一次増幅核酸に結合すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること；および
    符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  106. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
  109. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１０７または１０８に記載の方法。
  110. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること；および
    符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  111. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
  114. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１１２または１１３に記載の方法。
  115. １つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸のうちの少なくとも１個が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項１１１から１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること；および
    符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、適宜、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  117. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
  120. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１１８または１１９に記載の方法。
  121. １つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸のうちの少なくとも１個が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項１１７から１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  123. 一次増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１２２に記載の方法。
  124. 一次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１２２に記載の方法。
  125. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出し、符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  126. 一次増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１２５に記載の方法。
  127. 一次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１２５に記載の方法。
  128. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  129. 一次増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１２８に記載の方法。
  130. 一次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１２８に記載の方法。
  131. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出し、符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  132. 一次増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
  133. 一次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１３１に記載の方法。
  134. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、固定距離以内の核酸プローブに結合すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  135. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項１３４に記載の方法。
  136. マッチが見出されない場合、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項１３５に記載の方法。
  137. 一次増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１３４から１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 一次増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１３４から１３６のいずれか一項に記載の方法。
  139. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  140. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出し、符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせることであって、マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成すること
    を含む方法。
  141. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の一次増幅核酸が、核酸プローブに結合することが可能なこと；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、最大数の二次増幅核酸が、一次増幅核酸に結合することが可能なこと；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  142. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１４１に記載の方法。
  143. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１４２に記載の方法。
  144. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１４２に記載の方法。
  145. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１４３または１４４に記載の方法。
  146. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項１４１から１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項１４６に記載の方法。
  148. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸および二次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  149. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１４８に記載の方法。
  150. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１４９に記載の方法。
  152. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１５０または１５１に記載の方法。
  153. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項１４８から１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項１５３に記載の方法。
  155. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、固定距離以内の一次増幅核酸に結合すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  156. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１５５に記載の方法。
  157. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１５６に記載の方法。
  158. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１５６に記載の方法。
  159. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１５７または１５８に記載の方法。
  160. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項１５５から１５９のいずれか一項に記載の方法。
  161. マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項１６０に記載の方法。
  162. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  163. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１６２に記載の方法。
  164. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１６３に記載の方法。
  165. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１６３に記載の方法。
  166. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１６４または１６５に記載の方法。
  167. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項１６２から１６６のいずれか一項に記載の方法。
  168. マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項１６７に記載の方法。
  169. １つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸のうちの少なくとも１個が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項１６２から１６８のいずれか一項に記載の方法。
  170. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  171. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１７０に記載の方法。
  172. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１７１に記載の方法。
  173. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１７１に記載の方法。
  174. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１７２または１７３に記載の方法。
  175. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項１７０から１７４のいずれか一項に記載の方法。
  176. マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項１７５に記載の方法。
  177. １つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸のうちの少なくとも１個が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項１７０から１７６のいずれか一項に記載の方法。
  178. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  179. 試料を、核酸プローブへと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  180. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１７９に記載の方法。
  181. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１８０に記載の方法。
  182. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１８０に記載の方法。
  183. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１８１または１８２に記載の方法。
  184. 試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされた結合性実体へと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  185. 試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされた結合性実体へと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  186. 試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露すること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  187. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１８６に記載の方法。
  188. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１８７に記載の方法。
  189. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１８７に記載の方法。
  190. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１８８または１８９に記載の方法。
  191. 試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸および二次増幅核酸の、標的への結合が、可飽和であること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  192. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１９１に記載の方法。
  193. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１９２に記載の方法。
  194. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１９２に記載の方法。
  195. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１９３または１９４に記載の方法。
  196. 試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露することであって、一次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  197. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項１９６に記載の方法。
  198. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項１９７に記載の方法。
  199. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項１９７に記載の方法。
  200. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項１９８または１９９に記載の方法。
  201. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項１９６から２００のいずれか一項に記載の方法。
  202. マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項２０１に記載の方法。
  203. １つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸のうちの少なくとも１個が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項１９６から２０２のいずれか一項に記載の方法。
  204. 試料を、核酸プローブへとコンジュゲートされたターゲティング実体へと曝露すること；
    核酸プローブを、核酸プローブに結合することが可能な一次増幅核酸へと曝露すること；
    一次増幅核酸を、一次増幅核酸に結合することが可能な二次増幅核酸へと曝露することであって、二次増幅核酸が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成されること；
    蛍光を使用して、試料中の核酸プローブの分布を決定すること；および
    試料中の蛍光分布に基づき、符合語を創出すること
    を含む方法。
  205. 二次増幅核酸を、各増幅核酸が先行ラウンドの増幅核酸に結合することが可能な、最終ラウンドの増幅核酸を含む１つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸へと曝露することをさらに含む、請求項２０４に記載の方法。
  206. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体を含む、請求項２０５に記載の方法。
  207. 最終ラウンドの増幅核酸を、蛍光シグナル発生実体へと曝露することをさらに含む、請求項２０５に記載の方法。
  208. 最終増幅核酸が、蛍光シグナル発生実体が結合することが可能である反復配列を有する、請求項２０６または２０７に記載の方法。
  209. 符合語のうちの少なくとも一部について、符合語を、正当な符合語へとマッチさせる、請求項２０４から２０８のいずれか一項に記載の方法。
  210. マッチが見出されない場合、場合によって、エラー補正を符合語へと適用して、正当な符合語を形成する、請求項２０９に記載の方法。
  211. １つまたは複数のさらなるラウンドの増幅核酸のうちの少なくとも１個が、４つの天然に存在するヌクレオチドのうちの３つだけから形成される、請求項２０４から２１０のいずれか一項に記載の方法。
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