JPWO2021119402A5 - - Google Patents

Description

別の局面では、本明細書において、本明細書に提供される方法において使用するためのデバイスが提供される。いくつかの態様では、該デバイスは、光源および試料ホルダーを含む。
[本発明1001]
a．5'から3'の方向に、
i．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
ii．第1のターゲティングドメイン；および
iii．第1のハイブリダイゼーションドメイン
を含む、第1の核酸と、
b．5'から3'の方向に、
i．バーコードドメイン；および
ii．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン
を含む、第2の核酸と
を含む、バーコード組成物であって、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、前記バーコード組成物。
[本発明1002]
前記第2の核酸が、5'末端に固有分子識別子配列をさらに含む、本発明1001のバーコード組成物。
[本発明1003]
前記第2の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、本発明1001または1002のバーコード組成物。
[本発明1004]
a．5'から3'の方向に、
i．任意で、固有分子識別子配列；
ii．第1のターゲティングドメイン；および
iii．第1のハイブリダイゼーションドメイン
を含む、第1の核酸と、
b．5'から3'の方向に、
i．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
ii．第1のバーコードドメイン
を含む、第2の核酸と
を含む、バーコード組成物であって、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、前記バーコード組成物。
[本発明1005]
第2のバーコードドメインを含む第3の核酸をさらに含み、第2のバーコードドメインが、第1のバーコードドメインと実質的に相補的である、本発明1001～1004のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1006]
前記第3の核酸が、5'末端に固有分子識別子配列をさらに含む、本発明1005のバーコード組成物。
[本発明1007]
前記第3の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、本発明1005または1006のバーコード組成物。
[本発明1008]
a．5'から3'の方向に、
i．任意で、固有分子識別子配列；
ii．第1のターゲティングドメイン；および
iii．第1のハイブリダイゼーションドメイン
を含む、第1の核酸と、
b．5'から3'の方向に、
i．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
ii．第1のバーコードドメイン；
iii．第3のハイブリダイゼーションドメイン
を含む、第2の核酸と
を含む、バーコード組成物であって、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含み、第3のハイブリダイゼーションドメインが、任意で、光反応性要素を含む、前記バーコード組成物。
[本発明1009]
n個の追加の核酸をさらに含み、
nが、1～100の整数であり、
各追加の核酸が、5'から3'の方向に、
i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；
ii．バーコードドメイン；および
iii．第2のハイブリダイゼーションドメイン
を含み、
n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、
n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ
各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、本発明1008のバーコード組成物。
[本発明1010]
5'から3'の方向に、
i．第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、nが1以上であるときn番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン、またはnが0であるとき第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該キャップハイブリダイゼーションドメイン；および
ii．第2のキャップハイブリダイゼーションドメイン
を含む、第1のキャップ核酸鎖
をさらに含み、
第1のキャップハイブリダイゼーションドメインが、任意で、光反応性要素を含む、本発明1008または1009のバーコード組成物。
[本発明1011]
5'から3'の方向に、
i．プライマー配列ドメイン；
ii．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および
iii．ハイブリダイゼーションドメインであって、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該ハイブリダイゼーションドメイン
を含む、第2のキャップ核酸鎖
をさらに含み、
第1のキャップ核酸鎖の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび第2の核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、本発明1010のバーコード組成物。
[本発明1012]
前記第1の核酸が、RNAまたはRNA転写物であり、任意で、第1のハイブリダイゼーションドメインが、ポリ（A）配列を含む、本発明1001～1011のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1013]
前記第1の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、本発明1001～1012のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1014]
前記第1の核酸の第1のターゲティングドメインが、標的核酸と実質的に相補的である、本発明1001～1013のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1015]
標的核酸が、標的結合物質とコンジュゲートされるか、または、標的核酸が、標的分子とコンジュゲートされるか、または、標的核酸が、標的分子（RNAなど）内に含まれるか、または、標的核酸が、標的細胞によって発現されるか、または、標的核酸が、標的分子または細胞上に直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくはアダプター分子、例えば標的結合リガンドを介して間接的に提示される、本発明1014のバーコード組成物。
[本発明1016]
標的結合物質が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドからなる群より選択され、任意で、標的結合物質が、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1015のバーコード組成物。
[本発明1017]
各ドメインが、独立に、1文字コード、2文字コード、3文字コード、または4文字コードを含む、本発明1001～1016のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1018]
各ドメインが、独立に、ゼロまたは少なくとも1つの核酸修飾を含む、本発明1001～1017のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1019]
核酸修飾が、核酸塩基修飾、糖修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群より選択される、本発明1018のバーコード組成物。
[本発明1020]
各ドメインが、独立に、1～1000ヌクレオチド長である、本発明1001～1019のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1021]
核酸のUMIが、同じ核酸の他のドメインの1つに組み込まれる、本発明1001～1020のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1022]
核酸の少なくとも1つが、切断可能なスペーサーを含む、本発明1001～1021のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1023]
切断可能なスペーサーが、光切断性スペーサーである、本発明1022のバーコード組成物。
[本発明1024]
検出可能な標識をさらに含む、本発明1001～1023のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1025]
検出可能な標識が、前記核酸のうちの1つの中に含まれる、本発明1024のバーコード組成物。
[本発明1026]
検出可能な標識が、蛍光分子、ナノ粒子、安定同位体、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、検出可能な標識が、フルオロフォアである、本発明1024または1025のバーコード組成物。
[本発明1027]
ポリメラーゼをさらに含む、本発明1001～1026のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1028]
ポリメラーゼが、鎖置換ポリメラーゼである、本発明1027のバーコード組成物。
[本発明1029]
核酸合成のための緩衝液または塩をさらに含む、本発明1001～1028のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1030]
天然または合成ヌクレオチド三リン酸またはデオキシヌクレオチド三リン酸をさらに含む、本発明1001～1029のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1031]
標的要素をさらに含む、本発明1001～1030のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1032]
標的要素が、基材表面上に固定される、本発明1031のバーコード組成物。
[本発明1033]
標的要素が、基材表面上に所定のパターンで固定される、本発明1032のバーコード組成物。
[本発明1034]
標的要素が、核酸、脂質、糖、小分子、微生物もしくはそれらの断片、ポリペプチド、および／または生体物質である、本発明1031～1033のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1035]
生体物質が、組織、細胞、オルガノイド、人工組織（engineered tissue）；および細胞外マトリックスからなる群より選択される、本発明1034のバーコード組成物。
[本発明1036]
基材が、ガラス、透明ポリマー、ポリスチレン、ヒドロゲル、金属、セラミック、紙、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、酸化鉄、ステンレス鋼、金、銅、塩化銀、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ストレプトアビジン、樹脂、および生体物質からなる群より選択される、本発明1031～1035のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1037]
光反応性要素が、光反応性ヌクレオチドであり、任意で、光反応性ヌクレオチドが、CNVKまたはCNVD架橋塩基である、本発明1001～1036のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1038]
PCRプライマーをさらに含む、本発明1001～1037のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1039]
光源をさらに含み、任意で、光源が、UV光源である、本発明1001～1038のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1040]
キットの形態の、本発明1001～1039のいずれかのバーコード組成物。
[本発明1041]
標的mRNAを検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
a．標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
i．該mRNAが、ポリA配列を含む第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；
ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
2．第1のバーコードドメイン
を含む、段階；
b．該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；
c．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
d．記録核酸を検出する段階。
[本発明1042]
標的核酸を検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
a．標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
i．第1の核酸が、5'から3'の方向に、
1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
2．標的要素の核酸と実質的に相補的な第1のターゲティングドメイン；および
3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
を含み；
ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
2．第1のバーコードドメイン
を含み、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；
b．第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；
c．任意で、プローブ-プライマー複合体を標的核酸から変性させる段階；
d．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
e．記録核酸を検出する段階。
[本発明1043]
前記第2の核酸が、5'末端に固有分子識別子（UMI）配列をさらに含む、本発明1041または1042の方法。
[本発明1044]
前記第2の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、本発明1041～1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、本発明1041～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
配列決定前に、光架橋を切断する、脱架橋させる、除去するまたは逆転させること、および記録核酸を増幅させることをさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記切断する、脱架橋させる、除去するまたは逆転させることが、300～350nm、任意で312nmの波長の光を使用する、本発明1046の方法。
[本発明1048]
標的mRNAを検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
a．標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
i．該mRNAが、ポリA配列を含む第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；
ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、該mRNAの第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
2．第1のバーコードドメイン
を含む、段階；
b．該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；
c．第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸の第1のバーコードドメインと実質的に相補的な第2のバーコードドメインを含む、段階；
d．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
e．記録核酸を検出する段階。
[本発明1049]
標的核酸を検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
a．標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸を第1の核酸にハイブリダイズさせる段階であって、
i．第1の核酸が、5'から3'の方向に、
1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
2．第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および
3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
を含み；
ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；
2．第1のバーコードドメイン
を含み、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；
b．第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；
c．任意で、第1の複合体を標的核酸から変性させる段階；
d．第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸の第1のバーコードドメインと実質的に相補的な第2のバーコードドメインを含む、段階；
e．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
f．記録核酸を検出する段階。
[本発明1050]
前記第3の核酸が、5'末端に固有分子識別子（UMI）配列をさらに含む、本発明1048または1049の方法。
[本発明1051]
前記第3の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、本発明1048～1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、本発明1048～1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
配列決定前に、記録核酸を増幅させることをさらに含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
標的核酸を検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
a．標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
i．第1の核酸が、5'から3'の方向に、
1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
2．第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および
3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
を含む、段階；
b．n個の追加の核酸をハイブリダイズさせ、該追加の核酸と第1の複合体とを光架橋させることによって、コンカテマーを調製する段階であって、nが、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、
i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；
ii．バーコードドメイン；および
iii．第2のハイブリダイゼーションドメイン
を含み、
n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；
c．第1のキャップ核酸鎖とコンカテマーとをハイブリダイズさせ、それによりキャップされたコンカテマーを形成する段階であって、第1のキャップ核酸が、
i．第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、n番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン；および
ii．第2のキャップハイブリダイゼーションドメイン
を含む、段階；
d．第2のキャップ核酸鎖をキャップされたコンカテマーにハイブリダイズさせ、それによりコンカテマー-プライマー複合体を形成する段階であって、第2のキャップ核酸鎖が、5'から3'の方向に、
i．プライマー配列ドメイン；
ii．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および
iii．ハイブリダイゼーションドメインであって、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、ハイブリダイゼーションドメイン
を含む、段階；ならびに
e．コンカテマー-プライマー複合体を検出する段階、またはコンカテマー-プライマー複合体から記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階。
[本発明1055]
前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、本発明1054の方法。
[本発明1056]
配列決定前に、記録核酸を増幅させることをさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記光架橋させることが、水溶液中で実施される、本発明1041～1054のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記光架橋させることが、350～400nm、任意で365nmの波長の光を使用する、本発明1041～1055のいずれかの方法。
[本発明1059]
1つまたは複数の洗浄工程をさらに含む、本発明1041～1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
標的核酸が、標的結合リガンドとコンジュゲートされる、本発明1041～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
標的結合リガンドが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドからなる群より選択され、任意で、標的結合リガンドが、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
標的核酸が、生体物質中に含まれる、本発明1041～1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
生体物質が、組織、細胞、オルガノイド、人工組織、および細胞外マトリックスからなる群より選択される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
標的核酸が、基材表面上に固定される、本発明1041～1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
標的核酸が、基材表面上に所定のパターンで固定される、本発明1041～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
基材が、ガラス、透明ポリマー、ポリスチレン、ヒドロゲル、金属、セラミック、紙、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、酸化鉄、ステンレス鋼、金、銅、塩化銀、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ストレプトアビジン、樹脂、および生体物質からなる群より選択される、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記第1の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、本発明1041～1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
各ドメインが、独立に、1文字コード、2文字コード、3文字コード、または4文字コードを含む、本発明1041～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
各ドメインが、独立に、ゼロまたは少なくとも1つの核酸修飾を含む、本発明1041～1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
核酸修飾が、核酸塩基修飾、糖修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群より選択される、本発明1069の方法。
[本発明1071]
各ドメインが、独立に、1～1000ヌクレオチド長である、本発明1041～1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
核酸のUMIが、同じ核酸のバーコードドメインまたはプローブドメインに組み込まれる、本発明1041～1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
核酸の少なくとも1つが、切断可能なスペーサーを含む、本発明1041～1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
切断可能なスペーサーが、光切断性スペーサーである、本発明1073の方法。
[本発明1075]
核酸の少なくとも1つが、検出可能な標識を含む、本発明1041～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
検出可能な標識が、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、検出可能な標識が、フルオロフォアである、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記記録核酸を合成する段階が、鎖置換ポリメラーゼを使用することを含む、本発明1041～1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
照射または検出のための関心対象の1つまたは複数の特定の領域を選択する段階をさらに含む、本発明1041～1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
1つまたは複数の特定の領域を選択する段階が、手作業によるかまたはコンピュータを利用する、本発明1078の方法。
[本発明1080]
前記選択が、1つまたは複数の表現型マーカーに基づく、本発明1078または1079の方法。
[本発明1081]
1つまたは複数の表現型マーカーが、蛍光、形状、強度、組織染色、抗体染色、または形態学である、本発明1080の方法。
[本発明1082]
空間照射または検出のための関心対象の1つまたは複数の領域を自動的に検出するソフトウェアをさらに含む、本発明1041～1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
試料中の複数の標的を線形的に、コンビナトリアルにまたは空間的にバーコーディングするための方法であって、以下の段階を含む、方法：
a．複数の標的の各メンバー中の標的核酸鎖と第1の核酸鎖とをハイブリダイズさせる段階であって、標的核酸鎖が、複数の標的の各メンバー中で異なり、標的核酸鎖が、別の核酸分子内に含まれるか、または、標的核酸鎖が、複数の標的の1つのメンバーとコンジュゲートされるか、または、標的核酸鎖が、細胞によって発現されるか、または、標的核酸鎖が、標的もしくは細胞上に直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくは標的結合物質／リガンドを介して間接的に提示され、かつ、
i．第1の核酸鎖が、5'から3'の方向に、
1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
2．第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および
3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
を含む、段階；
b．段階的な様式で1つまたは複数の追加の核酸鎖をハイブリダイズさせ、該追加の核酸鎖と第1の複合体とを光架橋させることによってコンカテマーを調製する段階であって、該光架橋させることが、試料の所定の領域を選択し、各追加の核酸鎖をハイブリダイズした後に該所定の領域を光に曝露させ、それにより相補的なハイブリダイゼーションドメインを架橋すること、および、光への曝露後かつ次の追加の核酸鎖のハイブリダイゼーション前にどんな架橋していない追加の核酸鎖も除去することを含み、
各追加の核酸鎖が、5'から3'の方向に、
i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；
ii．バーコードドメイン；および
iii．第2のハイブリダイゼーションドメイン
を含み、
n番目の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の追加の核酸鎖の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、第1の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸鎖の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；ならびに
c．コンカテマーを検出する段階および／またはコンカテマーから記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階。
[本発明1084]
複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、別の核酸分子内に含まれる、本発明1083の方法。
[本発明1085]
複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、RNA、RNA転写物、ゲノムDNA、核酸増幅産物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より独立に選択される別の核酸分子内に含まれる、本発明1083または1084の方法。
[本発明1086]
複数の標的の少なくとも1つのメンバーがcDNAである、本発明1083～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、標的核酸鎖にコンジュゲートされた非核酸分子である、本発明1083～1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、標的核酸鎖に連結されたターゲティング結合物質を介して標的核酸鎖にコンジュゲートされた非核酸分子である、本発明1083～1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
標的結合物質／リガンドが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドからなる群より選択され、任意で、標的結合物質が、抗体またはその抗原結合断片である、本発明1083～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
複数の標的の少なくとも1つのメンバーが核酸であり、複数の標的の少なくとも1つのメンバーが非核酸分子である、本発明1083～1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
複数の標的の少なくとも1つのメンバーがタンパク質である、本発明1083～1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
試料が、生体物質である、本発明1083～1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
試料が、組織、細胞、オルガノイド、人工組織、および細胞外マトリックスからなる群より選択される生体物質である、本発明1083～1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
試料が、全組織、組織領域、細胞収集物、単一細胞、細胞内領域、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、本発明1083～1092のいずれかの方法。
[本発明1095]
光反応性要素がCNVKである、本発明1083～1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
光反応性要素が、ポリメラーゼの活性を阻害または遮断し、任意で、ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、本発明1083～1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
試料の所定の領域のマルチモーダル統合解析のためにコンカテマーおよび／または記録鎖をイメージング法および記録核酸の配列決定によって検出する段階を含む、本発明1083～1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
試料の所定の領域のマルチモーダル統合解析のために記録鎖の配列を空間位置に相関させるためにコンカテマーおよび／または記録鎖をイメージング法および記録核酸の配列決定によって検出する段階を含む、本発明1083～1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、本発明1083～1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
配列決定前に、記録核酸を増幅させることをさらに含む、本発明1099の方法。
[本発明1101]
配列決定前に、光架橋を切断する、脱架橋させる、除去するまたは逆転させること、および記録核酸を増幅させることをさらに含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
前記光架橋させることが、350～400nm、任意で365nmの波長の光を使用する、本発明1083～1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
各ドメインが、独立に、1文字コード、2文字コード、3文字コード、または4文字コードを含む、本発明1083～1102のいずれかの方法。
[本発明1104]
核酸鎖の少なくとも1つが、検出可能な標識を含む、本発明1083～1103のいずれかの方法。
[本発明1105]
検出可能な標識が、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、検出可能な標識が、フルオロフォアである、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記記録核酸を合成することが、鎖置換ポリメラーゼを使用することを含む、本発明1083～1105のいずれかの方法。
[本発明1107]
前記所定の領域を選択することが、手作業によるかまたはコンピュータを利用する、本発明1083～1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
処置のための候補のライブラリをスクリーニングするための本発明1040～1107のいずれかの方法の使用であって、本発明1040～1107のいずれかの方法によって所定の領域をイメージングおよびバーコーディングすることによって1つまたは複数の表現型マーカーを特定することを含む、前記使用。
[本発明1109]
1つまたは複数の表現型マーカーが、蛍光、形状、強度、組織染色、抗体染色、または形態学である、本発明1108の使用。
[本発明1110]
候補のスクリーニングのための特定、薬物標的の特定、バイオマーカーの特定、プロファイリング、遺伝子型に対する表現型の細胞状態の特性評価、新たな疾患モデルの作製、細胞および疾患モデルの特性評価、分化状態および細胞状態の特性評価、組織マッピング、多次元分析、ハイコンテントスクリーニング、機械学習に基づくクラスタリングまたは分類、細胞療法開発、CAR-T療法開発、抗体スクリーニング、個別化医療、細胞濃縮、ならびにそれらの任意の組み合わせのための、本発明1040～1107のいずれかの方法の使用。
[本発明1111]
候補が、小分子薬、生物製剤、治療用核酸、遺伝子または細胞療法、siRNA、gRNA、ペプチド、タンパク質、抗体、代謝物質、ホルモン、およびDNAコードライブラリからなる群より選択される、本発明1108～1110のいずれかの使用。
[本発明1112]
本発明1083～1111のいずれかの方法を使用して生体分子をインビトロ、インビボ、インサイチューまたはイントトでバーコーディングするための方法において使用するための、本発明1040のキット。

いくつかの態様では、該組成物は、第1のキャップ核酸鎖および第2のキャップ核酸鎖をさらに含み、第2のキャップ核酸鎖が、5'から3'の方向に、プライマー配列ドメイン；任意で、固有分子識別子配列；およびハイブリダイゼーションドメインを含み、ハイブリダイゼーションドメインが、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、第1のキャップ核酸鎖の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび第2のキャップ核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む。

さらに別の局面では、本明細書において、標的核酸を検出するための方法が提供される。一般に、該方法は、コンカテマーを調製する段階を含む。例えば、該方法は、（i）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、第1の核酸が、5'から3'の方向に、任意の固有識別子配列、ターゲティングドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含み、第1のターゲティングドメインが、標的核酸と実質的に相補的である、段階；（ii）例えば、段階的な様式で、n個の追加の核酸をハイブリダイズさせ、該追加の核酸と第1の鎖とを光架橋させることによって、コンカテマーを調製する段階であって、nが、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、第1のハイブリダイゼーションドメイン、バーコードドメインおよび第2のハイブリダイゼーションドメインを含み、n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含み、かつ、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインおよび第1の核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（iii）第1のキャップ核酸鎖とコンカテマーとをハイブリダイズさせ、それによりキャップされたコンカテマーを形成する段階であって、第1のキャップ核酸が、第1のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび第2のキャップハイブリダイゼーションドメインを含み、第1のキャップハイブリダイゼーションドメインが、n番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、段階；（iv）第2のキャップ核酸鎖をキャップされたコンカテマーにハイブリダイズさせ、それによりコンカテマー-プライマー複合体を形成する段階であって、第2のキャップ核酸鎖が、5'から3'の方向に、プライマー配列ドメイン、任意の固有分子識別子配列およびハイブリダイゼーションドメインを含み、第2のキャップ核酸のハイブリダイゼーションドメインが、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、第2のキャップ核酸のハイブリダイゼーションドメインおよび第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（v）コンカテマー-プライマー複合体を検出する段階、またはコンカテマー-プライマー複合体から記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階を含む。

図1A～1Cは、二重光誘導型バーコーディング（戦略1）を示す。図1Aは、プローブ配列が、関心対象の標的およびその後のバーコード含有プライマーに結合することを示す。適切な波長のUV光で照射したら、プライマーは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになり、ポリメラーゼを使用して完全記録鎖をコピーした後、異なる光波長で架橋を逆転させる。配列決定に送る前に、記録アンプリコンをまずPCR増幅させてもよい。図1Bは、プローブ配列が、ゲノム／トランスクリプトーム標的に加えて核酸で標識された任意のエンティティ、例えば、標的タンパク質に結合しているDNAコンジュゲート抗体にインサイチューで結合することができることを示す。図1Cは、バーコーディングに非標的指向化アプローチを使用することもできることを示す。例えば、mRNA転写物のポリAテールは、バーコードプライマーに結合することができ、次にこれを、先に記載したように架橋させることができる。後続の調製工程および配列決定の前に、逆転写を用いてmRNA転写物配列の一部または全部をコピーする。 図1A-1の説明を参照のこと。 図1A-1の説明を参照のこと。 図1A-1の説明を参照のこと。 図1A-1の説明を参照のこと。 図2A～2Dは、バーコーディングされたブリッジ配列を用いた光誘導型バーコーディング（戦略2）を示す。図2Aは、プローブ配列が、関心対象の標的およびその後のバーコード含有ブリッジ鎖に結合することを示す。UV光の適切な波長で照射したら、ブリッジは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになり、プローブ－ブリッジ複合体は、対応するプライマーがバーコード配列にハイブリダイズする前に変性させることができる。ポリメラーゼを使用して完全記録鎖をコピーし、次にこれを、配列決定前にPCR増幅させることができる。鎖置換ポリメラーゼを使用すれば、プローブが標的に結合したままでも重合反応を起こすことができる（（図2B）部分）。図2Cは、バーコーディングに非標的指向化アプローチを使用することもできることを示す。例えば、mRNA転写物のポリAテールを、いくつかのT塩基を含有するバーコードブリッジに結合させてもよい。図2Dは、次にこれらのバーコードブリッジを架橋させて、配列決定のために先に記載したように調製することができる（逆転写などで）ことを示す。次に、配列決定を用いて、転写物＋バーコード情報を回収する。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図3A～3Cは、コンカテマーアセンブリを用いた光誘導型バーコーディング（戦略3）を示す。図3Aは、プローブ配列が、関心対象の標的およびその後のバーコード鎖に結合することを示す。適切な波長のUV光で照射したら、バーコードは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになる。コンカテマーは、繰り返しのバーコードハイブリダイゼーションおよび架橋反応を通じて形成される。図3Bは、鎖置換ポリメラーゼを使用して、クロスジャンクション合成反応を通じて完全記録鎖をコピーし、次にこれを、配列決定前にPCR増幅させることができることを示す。配列は、バーコード配列と標的配列の統合情報を明らかにする。コンカテマーアセンブリは、プライミングおよびクロスジャンクション合成の前に、まず試料／表面から変性させてもよい（（図3C）部分）。 図3A-1の説明を参照のこと。 図3A-1の説明を参照のこと。 図3A-1の説明を参照のこと。 図4A～4Dは、光誘導型バーコーディングを示す。図4Aは、基本的な配列特異的架橋反応が、一方がCNVK修飾を含有し、互いに結合する、2つの相補的配列またはほぼ相補的配列を必要とすることを示す。UV光への曝露は、鎖の共有結合連結（架橋）を引き起こす。図4Bは、特定の領域または領域のセットへの限局照射によって、架橋を、これらの領域に限局することもできる（先に記載したような戦略1化学を使用）ことを示す。例えば、CNVKを含有するプローブ配列は、結合するが、一部の領域だけ架橋され、その後、架橋していない鎖をすべて洗い流すと、照射された領域にのみ結合したプローブが生じる。図4Cは、異なるバーコード配列（例えば、B1～Bn）を有するバーコードプライマーを使用した繰り返しのハイブリダイゼーション、空間パターニング架橋および洗浄のラウンドを使用して、別個の領域をラベリングすることができることを示す。配列決定（同時に合成されて配列決定の間にプールされるすべての記録物で行うことができる）後、バーコード配列と標的／転写物の統合情報が回収される。また、繰り返しの空間パターニング架橋を、先に記載した第2のバーコーディング化学（戦略2）と同様ではあるが、異なるバーコードプライマーではなくバーコードブリッジ鎖を異なるラウンドで結合させて行うことができる（（図4D）部分）。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図5A～5Cは、光誘導型コンビナトリアルバーコーディングを示す。図5Aは、コンビナトリアル光誘導型バーコードアセンブリが、異なるバーコード配列（例えば、配列0および1）を有するバーコード鎖の繰り返しのハイブリダイゼーション、空間パターニング架橋、および洗浄のラウンドを介して達成されることを示す。図5Bは、それぞれ個々の領域が固有のアセンブリ順序（例えば、示している例では1010010または0011101）を受けることができるか、または所望であれば複数の領域が同じアセンブリ配列を受け得ることを示す。図5Cは、アセンブリされたバーコード配列＋元のプローブ配列情報の順序が、クロスジャンクション合成反応を通じて記録鎖において合成されることを示す。記録物を配列決定する前に、PCR増幅を実施してもよい。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図6A～6Fは、空間パターニング架橋の実験的検証を実証している。図6Aは、CNVK（灰色の塗りつぶし円）修飾されたバーコーディング鎖を空間フォトマスクと併用して、細胞収集物中のRNA標的にバーコードの架橋を指向することを示す。バーコーディング鎖は、バーコード配列（青色および紫色）とCy3bフルオロフォア（緑色の星）の両方を含有する。繰り返しの光誘導型バーコード構築を、連続的な洗浄およびUV架橋イベントを通じて進行させることができる。図6Bには、最終架橋工程が示されており、Cy5標識プライマー鎖（赤紫色の星を有する橙色の鎖）に対するプライマー結合部位（橙色）を担持する鎖を送達および架橋することを示す。この工程については全域架橋を実施した。図6Cは、DAPI（青色のチャネル）で標識されたEY.T4細胞を示す。架橋なし。図6Dは、空間マスクを適用して、細胞のリボソームRNAとCy3b（緑色のチャネル）標識バーコーディング鎖とを架橋したことを示す。緑色のチャネルは、ホルムアミド洗浄後、架橋が交差長方形パターンで成功したことを例証する。図6Eは、2つの長方形間の「交」点でのパネル（d）のより近い視野を示す。図6Fは、パネル（図6B）に示している最終プライマーキャッピングセット後のDAPI（青色）、Cy3b（緑色）およびCy5（赤紫色）チャネルにおけるイメージングを示す。Cy5標識鎖は、全域UV架橋に起因してすべての細胞に架橋すると予想される。バーコーディングされた鎖とプライマー鎖の両方を含有する細胞は、緑色と赤紫色の両チャネルにおいて重なり、チャネルの重ね合わせにおいて白く見えると予想される。注記、赤紫色のチャネルコントラストは、Cy5と比較して3倍高いCy3bフルオロフォアを有すると予想されるバーコーディングされた細胞と一致するようにスケール調整された。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図7A～7Cは、コンカテマーの最大3つのジャンクションの繰り返しアセンブリを示す。図7Aは、Cy3b標識バーコード鎖およびCy5標識プライマーを用いた繰り返しのジャンクションアセンブリの略図を示す。 図7A～7Cは、コンカテマーの最大3つのジャンクションの繰り返しアセンブリを示す。図7Bは、1ジャンクションおよび3ジャンクションアセンブリのクロスジャンクション合成とそれに続く記録物のPCR増幅の代表的な略図を示す。 図7A～7Cは、コンカテマーの最大3つのジャンクションの繰り返しアセンブリを示す。図7Cは、2つの実験についてのPCR産物とプローブなし対照を示しているPAGE変性ゲルを示す。 図8A～8Cは、細胞レベル空間ラベリングの実験的検証を示す。図8Aは、異なる表現型マーカーを呈する細胞の混合物を示す。GFPトランスフェクト細胞（緑色の円）が、レポーターフルオロフォア（橙色の星）を担持するCNVK鎖（灰色の塗りつぶし円）との架橋のために選択される。図8Bは、GFPトランスフェクト細胞とトランスフェクトなしの細胞の混合物を示している、明視野および緑色のチャネル画像の重ね合わせを示す。架橋のために選択された関心対象の複数の領域（黄色、青色、緑色、赤色の輪郭）がGFPシグナルを呈する細胞の周囲に描かれる。図8Cは、架橋後の細胞の蛍光画像を示す。核の染色（青色）、GFP（緑色）、および蛍光CNVK鎖（黄色）が重なる。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9A～9Dは、配列決定結果を示す。アンプリコンの両端にUMIを有する戦略2の変法を利用して、固定されたHeLa細胞に対してパターニング照射を使用して、3つの別個の空間的に分離された領域を逐次的にバーコーディングした。図9Aは、6つの別個のプローブ配列（2つがリボソームRNAを標的とし、4つがXist RNAを標的とする）が、FISHを用いてそれらの標的RNA配列に結合したことを実証している。これに続いて、繰り返しのバーコーディング、バーコード含有プライマーの結合、記録物の合成、および増幅を行った。次世代配列決定（HiSeq）のためにCollibri配列決定プレップキットを使用してアンプリコンを調製した。図9B～9Cは、予想されるフォーマットのリードが、整列後に高い割合で回収されたことを示す。図9Bは、それぞれ出現順に、SEQ ID NO：15～16を開示する。図9Dは、プローブ－領域ペアごとに示されている、データの大部分についてのリード分布を示す。 図9A-1の説明を参照のこと。 図9A-1の説明を参照のこと。 図9A-1の説明を参照のこと。 図9A-1の説明を参照のこと。 図10は、バーコーディングの標的指向化および非標的指向化アプローチを実証している。どんなタイプの核酸をバーコーディングしてもよい。これらの核酸は、典型的には、インサイチューに局在する生体分子と会合するか、それに結合するか、またはハイブリダイズする。特定の生体分子を、標的指向化アプローチまたは親和性に基づくアプローチ、例えば、DNA/RNA標的についてはFISH、タンパク質標的についてはIF（例えば、核酸コンジュゲート抗体またはナノボディを介して）、または核酸とコンジュゲート可能かそれ以外の方法で会合可能な任意の他の親和性に基づく試薬を通じて標的とすることができる。核酸が非標的指向化方式で局在されるかまたは生成される、非標的指向化アプローチを代わりに利用してもよい。例えば、RNAの逆転写から産生されたcDNAコピー、あるいは前から存在するRNAもしくはDNA、または修飾された骨格配列、またはポリメラーゼ、リガーゼ、制限酵素、ヌクレアーゼ、テロメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リコンビナーゼもしくはトランスポザーゼの作用によってインサイチューで生成された他の反応生成物、例えば、近接ライゲーションアッセイ、プライマー交換反応、オートサイクリック近接記録法もしくはタグメンテーションの生成物をバーコーディングすることができる。 図11A～11Bは、細胞または他の関心対象の領域に対するバーコードのアセンブリを示す。（図11A）インサイチューに局在している核酸（例えば、cDNA配列）上へのコンカテマーの繰り返しの形成は、その細胞由来のリードに特異的なバーコード（例えば、m-g-o-m-y-r-c）の形成をもたらす。cDNAの3'バーコーディングの配向が示されているが、5'バーコーディングを実施してもよい（例えば、図18および図19を参照のこと）。（図11B）クロスジャンクション合成およびPCRを使用して、配列決定のための記録物を調製する。 図11Aの説明を参照のこと。 図12は、本明細書に提供される方法および組成物の応用を示す。 図12-1の説明を参照のこと。 図12-1の説明を参照のこと。 図13は、解離的スプリット－プールバーコーディングのワークフローを示す。細胞またはそれ以外の会合生体分子（例えば、ヒドロゲル片）のチューブへの分割、例えば他の箇所に描写している光誘導型コンカテマー形成を用いた、核酸のバーコーディング、およびその後の再プールの繰り返しは、固有のバーコード配列がそれぞれの別個の細胞／成分と会合することを可能にする。スプリット－プール戦略は、過去に、複数の高価な酵素ライゲーション工程を通じた単一細胞バーコーディングに使用されていたが、コンカテマーに基づくバーコーディング戦略を使用すれば、各バーコーディング工程を高価な酵素または他の試薬の必要なしに実施できるのでコストが劇的に削減される。配列は、これらが表面上にあるときと同様に、記録物のクロスジャンクション合成およびPCRを用いて抽出することができる。 図13-1の説明を参照のこと。 図14A～14Cは、空間バーコーディングのある態様を示す。（図14A）バーコードは、典型的には、CNVK修飾の使用を通じて架橋され、架橋は、UV光で活性化される。（図14B）UV光照射プロファイルを空間的にアドレスすることによって、バーコードは、ドック配列に、所望の位置でのみ架橋され得、ストリンジェントな洗浄工程（例えば、ホルムアミド含有緩衝液）後、架橋していないすべてのバーコード鎖を洗い流すことができる。（図14C）結合工程、特定の領域の架橋工程、およびストリンジェントな洗浄工程の繰り返しは、その特定の領域に会合したバーコードの繰り返し構築を可能にする。 図14Aの説明を参照のこと。 図14Aの説明を参照のこと。 図15Aは、N個の領域（例えば、N個の別個の細胞）の線形バーコーディングが、N個のバーコードのたった一つが関心対象の各位置または複数の位置に割り当てられるように実施されることを実証している。次に、配列決定結果を一緒に大量に抽出してもよく、リードを、リード中のバーコード配列に基づきそれらの元の対応する位置にマッピングし戻してもよい。図15Bは、コンビナトリアルバーコーディングの方法を実証しており、リードが起因するはずの各領域（例えば、細胞）が固有のバーコードを受け入れるように、連結されたバーコードが繰り返し構築される（例えば、図18を参照のこと）。例えば、M個のバーコードのN回のラウンドについて、M^N個の固有のバーコードが実行可能に割り当てられ得るだろう。 図16は、試料のイメージングデータとRNA配列決定データを組み合わせるためのワークフローのある態様を示す。一般に、追加のイメージング工程および他のアッセイは、バーコーディングの前または後に加えてもよく、任意でAテーリング工程をバーコーディングの前または後に行ってもよい。異なるテーリング（例えば、T-テーリング、C-テーリング、G-テーリング、またはターミナルトランスフェラーゼもしくは他の酵素を用いた任意の他の種類のテーリングを利用してもよい）を代わりに利用してもよい。標的指向化アプローチについて、ワークフローは、プローブがすでに5'および3'テールを含有し得るという点以外は極めて似ており、そのため、RTとAテーリングの両工程を省略することができる。任意のドメイン（例えば、1文字、2文字、3文字または4文字）を3'テール配列に利用してもよい。 図17は、UV出力および照射条件の実験的検証を示す。HeLa細胞中のrRNA転写物に結合しているFISHプローブをバーコーディングするためのUV出力および照射条件を最適化する一連の実験。チェッカー盤パターンをそれぞれの別個の領域を有するウェル全体にラスタ化し、異なるUV出力および照射時間条件を試験した。 図18は、クロスジャンクション合成プライマー上にUMIを有する5'光誘導型バーコーディング戦略の鎖ダイアグラムを示す。オーバーハング5'ドメイン（例えば、端部にランダムなN個の塩基を有する）を有するプライマーを、RNA（例えば、mRNA、非コードRNA）に局在させ、cDNA配列を作製する。次に、cDNA配列に、3'末端上で塩基、例えば、ポリAテールを、ターミナルトランスフェラーゼおよびdATPを使用して付加させてもよい。その後、コンビナトリアルバーコードが、直接cDNAの5'オーバーハングまたは他のインサイチューに局在している配列上に、結合、UV架橋および洗浄の工程を通じて、繰り返しアセンブリされる（バーコーディングの前または後にAテーリング工程が含まれてもよい）。任意で、クロスジャンクション合成の前または同時に、RNAからのバーコードのRNaseH置換を実施してもよい。クロスジャンクション合成後、PCR増幅を介して完全記録物が形成される。 図18-1の説明を参照のこと。 図19は、バーコードキャッピング鎖上にUMIを有する5'光誘導型バーコーディング戦略の鎖ダイアグラムを示す。オーバーハング5'ドメイン（例えば、端部にランダムなN個の塩基を有する）を有するプライマーを、RNA（例えば、mRNA、非コードRNA）に局在させ、cDNA配列を作製する。次に、cDNA配列に、3'末端上で塩基、例えば、ポリAテールを、ターミナルトランスフェラーゼおよびdATPを使用して付加させてもよい。その後、コンビナトリアルバーコードが、直接cDNAの5'オーバーハングまたは他のインサイチューに局在している配列上に、結合、UV架橋および洗浄の工程を通じて、繰り返しアセンブリされる。任意で、クロスジャンクション合成の前または同時に、RNAからのバーコードのRNaseH置換を実施してもよい。クロスジャンクション合成後、PCR増幅を介して完全記録物が形成される。 図19-1の説明を参照のこと。 図20は、cDNAライブラリ作製のためのプライマーセットの実験的検証を示す。（上部）逆転写（RT）に使用するプライマーおよび濃度の表。ウェルラベル（A1～B4）は、下部に示す画像の配向と一致する。ウェルB1～B4は、プライマーの組み合わせならびに逆転写されていない陰性対照を有する。（下部）Cy5標識プライマーを使用した逆転写後のcDNAライブラリの局在の画像。次に、Cy3 CNVKバーコードを付加し、DMDおよび10×対物レンズを使用してチェッカー盤パターンで架橋し、Cy3でイメージングした。 図21は、異なるRTプライマーについての配列決定結果を示す。固定されたHeLa細胞におけるインサイチュー逆転写を、3'末端上のNNNNNNN（7N、実験A1）、NNNNNGGG（5Nおよび3G、実験A2）またはNNNNNCCC（5Nおよび3C、実験A3）と共に5'バーコーディングドメインを含有する異なるプライマーを用いて実施した。図18に描写した戦略に従ったバーコーディング、クロスジャンクション合成およびPCR後、PCRアンプリコンをAmpure XPビーズで精製し、配列決定（250bpペアエンド）に送った。いくつかの予想されるリード結果の例をこれらのプライマーの各々について示し、強調しているcDNA配列（青色）は、予想どおり公知のホモサピエンス配列に位置する。これらのデータは、この一般戦略の成功を立証しており、その各プライマーを使用してトランスクリプトーム記録物を上手く生成することができる。図21は、それぞれ出現順に、SEQ ID NO：17～28を開示する。 図21-1の説明を参照のこと。 図22Aは、5'配列（例えば、cDNA、FISHプローブなどの上の5'テール）をバーコーディングするための配列構造を示す。リバース（Rev）プライマーキャッピング鎖、ゼロまたはそれより多いバーコード鎖、およびcDNA、FISH、またはポリAテールを有する他のプローブ配列を用いて形成されたコンカテマーを、フォワード（For）プライマーおよびポリT 3'末端を含有するクロスジャンクション合成プライマーを用いて効果的にコピーして、配列決定することができるPCR増幅可能な記録物を形成することができる。この場合、バーコード配列の2つの異なる配向（W/XドメインおよびY/Zドメイン）が利用されるが、さらに別個のバーコード配列も同様に利用してよい。鎖は、精製されても精製されなくてもよく、3'または5'末端上に追加の塩基（例えば、Tリンカー、フルオロフォア、伸張または分解を防ぐための修飾）を含有してもよい。図22Bは、次のいくつかの図における実証に使用する結合ドメインバーコード配列の、ある態様を示しており、それらのドメインに従って色付けされている。異なる（バーコード）ドメイン配列を有する任意数のバーコード鎖をバーコーディングに利用してもよい。図22Bは、それぞれ出現順に、SEQ ID NO：11～13、11、14、12～14、および13～14を開示する。図22Cは、すべての後続の図に報告される実験のための完全配列情報を示す。PCRプライマー配列は、Smart Seq3プロトコルに基づく。すべての他の配列および特にバーコーディングのための配列は、数十のクロスジャンクション合成反応のモデリングおよび広域試験後、このバーコーディング適用のために具体的かつ実験的に設計されている。また、実施例における表1～3も参照されたい。図22Cは、それぞれ出現順に、SEQ ID NO：1～9、29～31、および10を開示する。 図22Aの説明を参照のこと。 図22Aの説明を参照のこと。 図23A～23Eは、ストレプトアビジンコート表面（ガラススライド）上の繰り返しのバーコードアセンブリの検証を示す。図23Aは、蛍光標識されたDNAバーコード鎖の繰り返しのバーコードアセンブリとそれに続くクロスジャンクション合成およびPCRの略図を示す。図23Bは、それぞれ1～6つのバーコードを含有する、2～7つのジャンクションを有する連結されたバーコードの略図を示す。図23Cは、別個のウェルにおいて予想されるDNAバーコード長の分布を示す（上部）。8ウェルチャンバー中の左上のウェルは、長さ6のDNAバーコードを含有し、最高の蛍光シグナル量を表示する。その後に、5および4などが続く。Cy3蛍光チャネルにおける8ウェルチャンバーのスキャン（下部）。図23Dは、図22A～22Cにおいて提示した配列に基づく7ジャンクションコンカテマーおよびアンプリコンの完全配列設計を示す。図23Dは、それぞれ出現順に、SEQ ID NO：1、8、7、6、5、4、3、10、9、30、29、および32を開示する。図23Eは、抽出、PCR、およびMinElute PCR精製カラムを用いた精製後、左上のウェル（6ジャンクション）からのアンプリコンを配列決定（250bpペアエンド配列決定）したことを示す。配列決定結果の例を、完全長（6バーコードを含有するリード）と短縮型リード（例えば、2または4バーコードを含有する）の両方について示す。コンカテマー形成工程におけるいくらかの非効率性に起因して、完全長リードに加えて短縮型リードが予想される。図23Eは、それぞれ出現順に、SEQ ID NO：33～39を開示する。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図24は、図19に描写した戦略に従う、いくつかの異なる固定、透過処理、RTおよびバーコーディング条件についての配列決定結果を示す。（上部）いくつかの固定／透過処理条件の各々について獲得された（実験B1～B8）、2ラウンドのバーコーディング後の予想される配列フォーマットと一致するいくつかの配列を示す。これらの配列は、各々の場合の予想されるバーコード配列、ならびに異なるUMI、および生じる配列長の例を示す。（下部）固定および透過処理を一定に保ちながら、RT工程に対するいくつかの変形をいくつかの対照と共に試験した。実験C1～C4の各々について、ストリンジェントな洗浄の前に架橋されない1つのバーコードを最初に導入し（交換1）、次に、UVで架橋されて配列決定リード中に現れるはずの第2のバーコードを導入した（交換2）。予想どおり、RT中にRNase Aを含有した対照を除くすべての条件で、架橋された正確なバーコードがリードの大部分で現れ（調べた2,000個のリードのうち＞1,500個）、間違った（架橋していない交換1バーコード）バーコードが極めて稀に現れた（2,000個のリードにおいて0という少なさ）。逆転写酵素（RT）なしの対照（実験B1）を除いた条件のすべてで（実験B2～B8、C1～C4）、強調しているcDNA配列（青色）は、公知のホモサピエンス配列に位置する。例外：Aテーリングを有するいくつかの条件は、図に表示したようにバーコーディング後に行われ、RNaseH処理を有するすべての条件は、クロスジャンクション合成インキュベーションと組み合わせる。図24は、それぞれ出現順に、SEQ ID NO：40～75を開示する。 図24-1の説明を参照のこと。 図24-1の説明を参照のこと。 図24-1の説明を参照のこと。 図24-1の説明を参照のこと。 図25A～25Dは、実験B1～B8およびC1～C4のイメージングおよびゲル結果を実証している。図25Aは、実験B1～B8のイメージング結果を示しており、フルオロフォア（Alexa 488）標識RTプライマーを用いた逆転写（RT）後の別個の蛍光形態学を示す。予想どおり、置換後、局在したプライマーからの蛍光シグナルは有意に下降し、このことは、これらが、組み合わせのRNaseH工程およびクロスジャンクション合成工程の間に上手く置換されたことを示している。図25Bは、RTの間にRNase Aを含有するがRNaseOUTのない対照条件について、シグナルがはるかに高いことを示しており、より低いコントラスト可視化は、強く疑われる核小体シグナルを明らかにした。図25Cには、実験C1、C3およびC4のイメージング結果が示される。図25Dは、PCR増幅後に生成された記録物の長さを示す（Sybr Goldを含む1％アガロースE-ゲル）、すべての条件のゲル結果を示している。逆転写を含有するがRNase Aを含有しない場合について、回収された典型的な長さは、約150bp～1300bpの範囲である。 図25Aの説明を参照のこと。 図25Aの説明を参照のこと。 図25Aの説明を参照のこと。 図25Aの説明を参照のこと。 図26は、トランスクリプトームマッピング結果を示す。トランスクリプトームマッピングは、配列決定結果に対してSTARアライナを用いて実施した。（左）実験B7について予想される配列フォーマットを有すると特定された1,024個の転写物のマッピング結果について、出力ログファイルの例を左に示す。リードの40.5％が独自にマッピングされたが、49％は複数の遺伝子座にマッピングされ、9.5％は短すぎてマッピングできなかった。（右）遺伝子マッピング結果をマッピングされた転写物の頻度によって分類し、一覧の上位を描写する。最も多い独自にマッピングされた遺伝子は、ミトコンドリアrRNAに対応した。 図26-1の説明を参照のこと。 図27は、表面上での自動バーコード割り当ておよび繰り返しバーコーディングを示す。バーコードの一覧（BC1、BC2、BC3など）を、関心対象の各領域（白色四角、中央パネル）が固有のバーコードに割り当てられた一連のフォトマスク（中央パネル）に変換できるワークフローの例。蛍光DNA鎖を用いた一連の6バーコーディング工程後に撮像し、112個の関心対象の領域のアレイに独自にタグ化およびバーコード化した（右パネル）。 図28A～28Gは、生体分子試料の自動バーコーディングを示す。図28Aは、細胞収集物をコンピュータアルゴリズムで検出し、バーコード送達に関して選択的に標的とし、その結果、固有のバーコード割り当てを有する各細胞を得ることができるワークフローを示す。図28Bは、RNAを標的とする蛍光DNAプライマーを有する細胞の画像を示す。図28Eは、パネル（図28C、28F）からのマスクを使用して蛍光DNAバーコード（緑色）を用いた6ラウンドのバーコーディング後の細胞の画像を示す。図28Cおよび図28Fは、検出された細胞マスクの重ね合わせ（白色の輪郭）を示す。図28Dおよび図28Gは、それぞれ（図28C）および（図28F）からの四角の輪郭の拡大画像を示す。 図28-1の説明を参照のこと。

例示的な修飾核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（nubularine）、イソグアノシン（isoguanosine）、ツベルシジン（tubercidin）、ならびにアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの置換または修飾類似体、例えば、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6およびO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む）、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6,N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノ-アリル-ウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3 カルボキシプロピル)ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N⁴-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、またはO-アルキル化塩基が挙げられるが、それらに限定されない。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、およびEnglisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されているものが挙げられる。

いくつかの態様では、修飾核酸塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアノシン、ツベルシジン、2-(ハロ)アデニン、2-(アルキル)アデニン、2-(プロピル)アデニン、2-(アミノ)アデニン、2-(アミノアルキル)アデニン、2-(アミノプロピル)アデニン、2-(メチルチオ)-N⁶-(イソペンテニル)アデニン、6-(アルキル)アデニン、6-(メチル)アデニン、7-(デアザ)アデニン、8-(アルケニル)アデニン、8-(アルキル)アデニン、8-(アルキニル)アデニン、8-(アミノ)アデニン、8-(ハロ)アデニン、8-(ヒドロキシル)アデニン、8-(チオアルキル)アデニン、8-(チオール)アデニン、N⁶-(イソペンチル)アデニン、N⁶-(メチル)アデニン、N⁶,N⁶-(ジメチル)アデニン、2-(アルキル)グアニン、2-(プロピル)グアニン、6-(アルキル)グアニン、6-(メチル)グアニン、7-(アルキル)グアニン、7-(メチル)グアニン、7-(デアザ)グアニン、8-(アルキル)グアニン、8-(アルケニル)グアニン、8-(アルキニル)グアニン、8-(アミノ)グアニン、8-(ハロ)グアニン、8-(ヒドロキシル)グアニン、8-(チオアルキル)グアニン、8-(チオール)グアニン、N-(メチル)グアニン、2-(チオ)シトシン、3-(デアザ)-5-(アザ)シトシン、3-(アルキル)シトシン、3-(メチル)シトシン、5-(アルキル)シトシン、5-(アルキニル)シトシン、5-(ハロ)シトシン、5-(メチル)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(トリフルオロメチル)シトシン、6-(アゾ)シトシン、N⁴-(アセチル)シトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウラシル、5-エチニル-2'-デオキシウリジン、2-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2-(チオ)ウラシル、4-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2,4-(ジチオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2,4-(ジチオ）ウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5-(アミノアリル)ウラシル、5-(アミノアルキル)ウラシル、5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5-(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(トリフルオロメチル)ウラシル、6-(アゾ)ウラシル、ジヒドロウラシル、N³-(メチル)ウラシル、5-ウラシル(すなわち、シュードウラシル)、2-(チオ)シュードウラシル、4-(チオ)シュードウラシル、2,4-(ジチオ)シュードウラシル、5-(アルキル)シュードウラシル、5-(メチル)シュードウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-4-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-4-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-置換シュードウラシル、1-置換 2-(チオ)-シュードウラシル、1-置換 4-(チオ)シュードウラシル、1-置換 2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-2-(チオ)-シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-4-(チオ)シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2-(チオ)-シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4-(チオ)シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-置換 1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換 1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換 1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-置換 1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアノシン、イノシニル、2-アザ-イノシニル、7-デアザ-イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、3-(メチル)イソカルボスチリリル、5-(メチル)イソカルボスチリリル、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、7-(アザ)インドリル、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、イミジゾピリジニル（imidizopyridinyl）、9-(メチル)-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、2,4,5-(トリメチル)フェニル、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)ベンゾイミダゾール、6-(アゾ)チミン、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、6-(アザ)ピリミジン、2-(アミノ)プリン、2,6-(ジアミノ)プリン、5-置換ピリミジン、N²-置換プリン、N⁶-置換プリン、O⁶-置換プリン、置換1,2,4-トリアゾール、およびそれらの任意のO-アルキル化またはN-アルキル化誘導体からなる群より選択することができる。

本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、本明細書に記載される核酸鎖は、リンカーまたはスペーサーを用いて、例えば、内部位置で、3'末端および／または5'末端上で修飾することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、リンカーまたはスペーサーは、核酸鎖を、固体支持体または標識などの部分と連結するために使用することができる。いくつかの態様では、リンカーまたはスペーサーは、光切断性リンカー、加水分解性リンカー、酸化還元切断性リンカー、リン酸系切断性リンカー、酸切断性リンカー、エステル系切断性リンカー、ペプチド系切断性リンカー、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。いくつかの態様では、切断性リンカーは、ジスルフィド結合、テトラジン-trans-シクロオクテン基、スルフヒドリル基、ニトロベンジル基、ニトロインドリン（nitroindoline）基、ブロモヒドロキシクマリン基、ブロモヒドロキシキノリン基、ヒドロキシフェナシル基、ジメトキシベンゾイン（dimethoxybenzoin）基、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

例示的なフルオロフォアとしては、1,5 IAEDANS；1,8-ANS；4-メチルウンベリフェロン；5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン；5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）；5-カルボキシナフトフルオレセイン（pH 10）；5-カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）；5-FAM（5-カルボキシフルオレセイン）；5-ヒドロキシトリプタミン（HAT）；5-ROX（カルボキシ-X-ローダミン）；5-TAMRA（5-カルボキシテトラメチルローダミン）；6-カルボキシローダミン6G；6-CR 6G；6-JOE；7-アミノ-4-メチルクマリン；7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）；7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン；9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン；ABQ；アシッドフクシン；ACMA（9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン）；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンSITSA；エクオリン（フォトタンパク質）；Alexa Fluor 350（商標）；Alexa Fluor 430（商標）；Alexa Fluor 488（商標）；Alexa Fluor 532（商標）；Alexa Fluor 546（商標）；Alexa Fluor 568（商標）；Alexa Fluor 594（商標）；Alexa Fluor 633（商標）；Alexa Fluor 647（商標）；Alexa Fluor 660（商標）；Alexa Fluor 680（商標）；アリザリンコンプレキソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（APC）；AMC、AMCA-S；AMCA（アミノメチルクマリン）；AMCA-X；アミノアクチノマイシンD；アミノクマリン；アニリンブルー；ステアリン酸アントラシル（Anthracyl stearate）；APC-Cy7；APTS；アストラゾンブリリアントレッド4G；アストラゾンオレンジR；アストラゾンレッド6B；アストラゾンイエロー7 GLL；アタブリン；ATTO-TAG（商標）CBQCA；ATTO-TAG（商標）FQ；オーラミン；オーロホスフィンG；オーロホスフィン；BAO 9（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；BCECF（高pH）；BCECF（低pH）；ベルベリン硫酸塩；ベータラクタマーゼ；BFPブルーシフトGFP（Y66H）；BG-647；ビマン；ビスベンズアミド；ブランコフォアFFG；ブランコフォアSV；BOBO（商標）-1；BOBO（商標）-3；ボディピー492/515；ボディピー493/503；ボディピー500/510；ボディピー505/515；ボディピー530/550；ボディピー542/563；ボディピー558/568；ボディピー564/570；ボディピー576/589；ボディピー581/591；ボディピー630/650-X；ボディピー650/665-X；ボディピー665/676；ボディピーFl；ボディピーFL ATP；ボディピーFl-セラミド；ボディピーR6G SE；ボディピーTMR；ボディピーTMR-Xコンジュゲート；ボディピーTMR-X、SE；ボディピーTR；ボディピーTR ATP；ボディピーTR-X SE；BO-PRO（商標）-1；BO-PRO（商標）-3；ブリリアントスルホフラビンFF；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムソン（Calcium Crimson）（商標）；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン-1 Ca²⁺色素；カルシウムグリーン-2 Ca²⁺；カルシウムグリーン-5N Ca²⁺；カルシウムグリーン-C18 Ca²⁺；カルシウムオレンジ；カルコフルオルホワイト；カルボキシ-X-ローダミン（5-ROX）；カスケードブルー（商標）；カスケードイエロー；カテコールアミン；CFDA；CFP-シアン蛍光タンパク質；クロロフィル；クロモマイシンA；クロモマイシンA；CMFDA；セレンテラジン；セレンテラジンcp；セレンテラジンf；セレンテラジンfcp；セレンテラジンh；セレンテラジンhcp；セレンテラジンip；セレンテラジンO；クマリンファロイジン；CPMメチルクマリン；CTC；Cy2（商標）；Cy3.1 8；Cy3.5（商標）；Cy3（商標）；Cy5.1 8；Cy5.5（商標）；Cy5（商標）；Cy7（商標）；シアンGFP；環状AMPフルオロセンサー（FiCRhR）；d2；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；塩化ダンシル；ダンシルDHPE；フッ化ダンシル；DAPI；ダポキシル；ダポキシル2；ダポキシル3；DCFDA；DCFH（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート）；DDAO；DHR（ジヒドロローダミン123）；Di-4-ANEPPS；Di-8-ANEPPS（ノンレシオ）；DiA（4-Di-16-ASP）；DIDS；ジヒドロローダミン123（DHR）；DiO（DiOC18(3)）；DiR；DiR（DiIC18(7)）；ドーパミン；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；エオシン；エリスロシン；エリスロシンITC；エチジウムホモダイマー-1（EthD-1）；ユークリシン（Euchrysin）；塩化ユウロピウム（III）；ユウロピウム；EYFP；ファストブルー；FDA；フォイルゲン（パラローズアニリン）；FITC；FL-645；フラゾオレンジ；Fluo-3；Fluo-4；フルオレセインジアセタート；フルオロ-エメラルド；フルオロ-ゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43（商標）；FM 4-46；Fura Red（商標）（高pH）；Fura-2、高カルシウム；Fura-2、低カルシウム；ゲナクリルブリリアントレッドB；ゲナクリルブリリアントイエロー10GF；ゲナクリルピンク3G；ゲナクリルイエロー5GF；GFP（S65T）；GFPレッドシフト（rsGFP）；GFP野生型、非UV励起（wtGFP）；GFP野生型、UV励起（wtGFP）；GFPuv；グロキサン酸；グラニュラーブルー；ヘマトポルフィリン；ヘキスト33258；ヘキスト33342；ヘキスト34580；HPTS；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）；ヒドロキシトリプタミン；インドジカルボシアニン（DiD）；インドトリカルボシアニン（DiR）；イントラホワイトCf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；ラウロダン；LDS 751；ロイコフォア（Leucophor）PAF；ロイコフォアSF；ロイコフォアWS；リサミンローダミン；リサミンローダミンB；LOLO-1；LO-PRO-1；ルシファーイエロー；マググリーン；マグダラレッド（フロキシンB）；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリナブルー；マキシロンブリリアントフラビン10 GFF；マキシロンブリリアントフラビン8 GFF；メロシアニン；メトキシクマリン；ミトトラッカーグリーンFM；ミトトラッカーオレンジ；ミトトラッカーレッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（mBBr-GSH）；モノクロロビマン；MPS（メチルグリーンピロニンスチルベン）；NBD；NBDアミン；ナイルレッド；ニトロベンズオキサジアゾール（Nitrobenzoxadiazole）；ノルアドレナリン；ヌクレアファストレッド；ヌクレアイエロー；ナイロサンブリリアントラビンE8G；オレゴングリーン（商標）；オレゴングリーン488-X；オレゴングリーン（商標）488；オレゴングリーン（商標）500；オレゴングリーン（商標）514；パシフィックブルー；パラローズアニリン（フォイルゲン）；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-テキサスレッド（Red 613）；フロキシンB（マグダラレッド）；ホルワイト（Phorwite）AR；ホルワイトBKL；ホルワイトRev；ホルワイトRPA；ホスフィン3R；フォトレジスト；フィコエリスリンB［PE］；フィコエリスリンR［PE］；PKH26；PKH67；PMIA；ポントクロムブルーブラック；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；プリムリン；プロシオンイエロー；ヨウ化プロピジウム（PI）；PyMPO；ピレン；ピロニン；ピロニンB；ピロザールブリリアントフラビン7GF；QSY 7；キナクリンマスタード；レソルフィン；RH 414；Rhod-2；ローダミン；ローダミン110；ローダミン123；ローダミン5 GLD；ローダミン6G；ローダミンB 540；ローダミンB 200；ローダミンBエクストラ；ローダミンBB；ローダミンBG；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンWT；ローズベンガル；R-フィコエリスリン（PE）；レッドシフトGFP（rsGFP、S65T）；S65A；S65C；S65L；S65T；サファイアGFP；セロトニン；セブロンブリリアントレッド2B；セブロンブリリアントレッド4G；セブロンブリリアントレッドB；セブロンオレンジ；セブロンイエローL；sgBFP（商標）；sgBFP（商標）（スーパーグロウBFP）；sgGFP（商標）；sgGFP（商標）（スーパーグロウGFP）；SITS；SITS（プリムリン）；SITS（スチルベンイソチオスルホン酸）；SPQ（6-メトキシ-N-(3-スルホプロピル)-キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンB can C；スルホローダミンGエクストラ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン；テキサスレッド（商標）；テキサスレッド-X（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（DiSC3）；チアジンレッドR；チアゾールオレンジ；チオフラビン5；チオフラビンS；チオフラビンTCN；チオライト（Thiolyte）；チオゾールオレンジ；チノポールCBS（カルコフルオルホワイト）；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；トリコロール（PE-Cy5）；TRITC（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）；トゥルーブルー；TruRed；ウルトラライト（Ultralite）；ウラニンB；ユビテックスSFC；wt GFP；WW 781；XL665；X-ローダミン；XRITC；キシレンオレンジ；Y66F；Y66H；Y66W；イエローGFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；およびYOYO-3が挙げられるが、それらに限定されない。これらの蛍光化合物の多くの好適な形態が利用可能であり、使用することができる。

他の例示的な検出可能な標識としては、発光および生物発光マーカー（例えば、ビオチン、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシのものなど）、ルシフェリンおよびエクオリン）、放射性標識（例えば、3H、125I、35S、14Cまたは32P）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ（glucorinidases）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、およびコリンエステラーゼ）、および比色標識、例えば金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびラテックス）ビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号、および第4,366,241号が挙げられ、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に酵素基質を供給し、酵素基質に対する酵素の作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、着色標識を可視化することによって検出することができる。

いくつかの態様では、2つの異なるドメインは、同一のヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの態様では、核酸鎖は、制限部位を含むことができる。例えば、結合しているバーコード鎖間の結合領域内に制限部位を使用することができ、切断した端にヘアピンをライゲーションして完全記録鎖を形成することができる。あるいは、ジャンクションの間に橋を架ける鎖をアセンブリに結合した後、一緒にライゲーションすることができる。

別の局面では、該方法は、（a）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、（i）第1の核酸が、5'から3'の方向に、（1）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；（2）第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および（3）第1のハイブリダイゼーションドメインを含む、段階；（b）n個の追加の核酸をハイブリダイズさせ、該追加の核酸と第1の複合体とを光架橋させることによって、コンカテマーを調製する段階であって、nが、任意で、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、（i）第1のハイブリダイゼーションドメイン；（ii）バーコードドメイン；および（iii）第2のハイブリダイゼーションドメインを含み、n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（c）第1のキャップ核酸とコンカテマーとをハイブリダイズさせ、それによりキャップされたコンカテマーを形成する段階であって、第1のキャップ核酸が、（i）第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、n番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン；および（ii）第2のキャップハイブリダイゼーションドメインを含む、段階；（d）第2のキャップ核酸をキャップされたコンカテマーにハイブリダイズさせ、それによりコンカテマー-プライマー複合体を形成する段階であって、第2のキャップ核酸が、5'から3'の方向に、（i）プライマー配列ドメイン；（ii）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および（iii）ハイブリダイゼーションドメインであって、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、ハイブリダイゼーションドメインを含み、第1のキャップ核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインおよび第2のキャップ核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；ならびに（e）コンカテマー-プライマー複合体を検出する段階、またはコンカテマー-プライマー複合体から記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階を含む。

戦略3：コンカテマーアセンブリを用いた光誘導型バーコーディング：
第3の戦略も同じく、CNVK含有配列を半相補的または完全相補的な配列に架橋させるためにたった一種類の波長の光（約365nm）を使用する。この戦略は、多本鎖複合体（コンカテマー）がアセンブリされるように、同じ領域または配列に対して行われる複数ラウンドの架橋を利用する（図3A～3Cを参照のこと）。次に、クロスジャンクション合成を使用して、コンカテマー上のバーコード配列の鎖を配列決定可能な記録鎖にコピーすることができる。

図9A～9Dは、配列決定結果を示す。アンプリコンの両端にUMIを有する戦略2の変法を利用して、固定されたHeLa細胞に対してパターニング照射を使用して、3つの別個の空間的に分離された領域を逐次的にバーコーディングした。図9Aは、6つの別個のプローブ配列（2つがリボソームRNAを標的とし、4つがXist RNAを標的とする）が、FISHを用いてそれらの標的RNA配列に結合したことを実証している。これに続いて、繰り返しのバーコーディング、バーコード含有プライマーの結合、記録物の合成、および増幅を行った。次世代配列決定（HiSeq）のためにCollibri配列決定プレップキットを使用してアンプリコンを調製した。図9B～9Cは、予想されるフォーマットのリードが、整列後に高い割合で回収されたことを示す。図9Dは、プローブ－領域ペアごとに示されている、データの大部分についてのリード分布を示す。

（表２）d0およびd1結合ドメインを有する配列の具体的な構造（図22Bも参照のこと）。実験的に検証されたバーコーディング結合ドメインの具体的なセットを記載する（d0＝表1に記載した（結合ドメインW）およびd1＝表1からの（結合ドメインY））。結合ドメインは、架橋していないバーコード鎖が、ドッキング配列（例えば、cDNA配列または局在化FISHもしくは標的指向性プローブ）の根底にある親和性または結合を破壊することなく洗い流され得るように十分短く設計されなければならない。

Claims (22)

1. a．3'から5'の方向に、または5'から3'の方向に、
   i．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
   ii．第1のターゲティングドメイン；および
   iii．第1のハイブリダイゼーションドメイン
   を含む、第1の核酸と、
   b．5'から3'の方向に、または3'から5'の方向に、
   i．第1のバーコードドメイン；および
   ii．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、該第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該第2のハイブリダイゼーションドメイン
   を含む、第2の核酸と
   を含む、バーコード組成物であって、
   該第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、前記バーコード組成物。
2. 前記第2の核酸が、3'末端または5'末端の一方に固有分子識別子配列をさらに含む、請求項1記載のバーコード組成物。
3. 第2のバーコードドメインを含む第3の核酸をさらに含み、該第2のバーコードドメインが、前記第1のバーコードドメインと実質的に相補的である、請求項1または2記載のバーコード組成物。
4. 前記第3の核酸が、3'末端または5'末端に固有分子識別子配列をさらに含む、請求項3記載のバーコード組成物。
5. n個の追加の核酸をさらに含み、
   nが、1～100の整数であり、
   各追加の核酸が、3'から5'の方向に、または5'から3'の方向に、
   i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；
   ii．バーコードドメイン；および
   iii．第2のハイブリダイゼーションドメイン
   を含み、
   n番目の核酸の該第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の該第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、
   n＝1の核酸の該第1のハイブリダイゼーションドメインが、第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ
   各核酸の該第1または該第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、請求項1記載のバーコード組成物。
6. 3'から5'の方向に、または5'から3'の方向に、
   i．第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、nが1以上であるときn番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン、またはnが0であるとき第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該キャップハイブリダイゼーションドメイン；および
   ii．第2のキャップハイブリダイゼーションドメイン
   を含む、第1のキャップ核酸鎖
   をさらに含み、
   該第1のキャップハイブリダイゼーションドメインが、任意で、光反応性要素を含む、請求項5記載のバーコード組成物。
7. 3'から5'の方向に、または5'から3'の方向に、
   i．プライマー配列ドメイン；
   ii．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および
   iii．ハイブリダイゼーションドメインであって、前記第1のキャップ核酸の前記第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該ハイブリダイゼーションドメイン
   を含む、第2のキャップ核酸鎖
   をさらに含み、
   前記第1のキャップ核酸鎖の前記第2のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび該第2のキャップ核酸鎖の該ハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、請求項6記載のバーコード組成物。
8. 前記第1の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、請求項1または2記載のバーコード組成物。
9. 前記第1の核酸の前記第1のターゲティングドメインが、標的核酸と実質的に相補的である、請求項1または2記載のバーコード組成物。
10. 前記標的核酸が、標的結合物質とコンジュゲートされるか、または、前記標的核酸が、標的分子とコンジュゲートされるか、または、前記標的核酸が、標的分子内に含まれるか、または、前記標的核酸が、標的細胞によって発現されるか、または、前記標的核酸が、標的分子または細胞上に直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくはアダプター分子、例えば標的結合リガンドを介して間接的に提示される、請求項9記載のバーコード組成物。
11. 前記標的結合物質が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドからなる群より選択され、任意で、前記標的結合物質が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項10記載のバーコード組成物。
12. 核酸の前記UMIが、同じ核酸の他のドメインの1つに組み込まれる、請求項1または2記載のバーコード組成物。
13. 前記核酸の少なくとも1つが、切断可能なスペーサーを含む、請求項1または2記載のバーコード組成物。
14. 検出可能な標識；
    鎖置換ポリメラーゼ；
    核酸合成のための緩衝液または塩；
    天然または合成ヌクレオチド三リン酸またはデオキシヌクレオチド三リン酸；
    標的要素；
    PCRプライマー；または
    光源であって、任意で、光源が、UV光源である、光源
    をさらに含む、請求項1または2記載のバーコード組成物。
15. 前記検出可能な標識が、
    前記核酸のうちの1つの中に含まれる、または
    蛍光分子、ナノ粒子、安定同位体、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、前記検出可能な標識が、フルオロフォアである、
    請求項14記載のバーコード組成物。
16. 前記光反応性要素が、光反応性ヌクレオチドであり、任意で、該光反応性ヌクレオチドが、CNVKまたはCNVD架橋塩基である、請求項1または2記載のバーコード組成物。
17. キットの形態の、請求項1記載のバーコード組成物。
18. 標的mRNAを検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    a．標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
    i．該mRNAが、ポリA配列を含む第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；
    ii．該第2の核酸が、5’から3’の方向に、
    1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、該第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、該第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
    2．第1のバーコードドメイン
    を含む、段階；
    b．該mRNAと該第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；
    c．該プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
    d．該記録核酸を検出する段階。
19. 前記第1の核酸の前記第1のターゲティングドメインが、RNAまたはRNA転写物と実質的に相補的である、請求項9記載のバーコード組成物。
20. 前記第2の核酸が、3’末端か5’末端のいずれかに第3のハイブリダイゼーションドメインをさらに含み、該第3のハイブリダイゼーションドメインが任意で光反応性要素を含む、請求項1または2記載のバーコード組成物。
21. 前記第1の核酸が3'テール配列をさらに含み、該テール配列が、Aテーリング、Tテーリング、Cテーリング、Gテーリング、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1または2記載のバーコード組成物。
22. 前記テール配列がポリA配列を含む、請求項21記載のバーコード組成物。