JP2023506176A - 光誘導型生体分子バーコーディングのための組成物および方法 - Google Patents

光誘導型生体分子バーコーディングのための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本明細書において、核酸バーコーディングのための組成物、キットおよび方法が提供される。本明細書に提供されるバーコード組成物を使用して、試料中の複数の標的を線形的に、コンビナトリアルに、または空間的にバーコーディングすることができる。また、本明細書において、光源および試料ホルダーを含む、本明細書に提供されるバーコーディング法において使用するためのデバイスも提供される。TIFF2023506176000008.tif36170

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法§119（e）のもと、2019年12月12日に出願された米国仮特許出願第62/947,237号の恩典を主張するものであり、該仮特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
政府による支援
本発明は、米国国防総省／海軍調査研究所（Department of Defense/Office of Naval Research）によって付与されたN00014-16-1-2410およびN00014-18-1-2549；米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって付与されたHL145600およびGM133052；ならびに米国国立科学財団（National Science Foundation）によって付与された1317291および1729397のもと、政府による支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
技術分野
本開示は、核酸バーコーディングのための組成物および方法に関する。
背景
細胞がどのように機能し、分化し、環境因子に応答するのかを理解するために、単一細胞のその天然環境における分子状態をプロファイリングすることが、基礎研究用途および医学生物学に必要不可欠である。単一細胞配列決定は、定量的な細胞レベルのトランスクリプトミクス情報を提供することにより、生物学に対する重要で新しい解釈を明らかにした。しかしながら、マルチスケールの空間情報は、細胞下レベルのものも、組織内に位置する細胞レベルのものも、細胞レベル配列決定のために細胞を解離させる過程で失われる。
概要
本明細書において、光誘導型バーコーディングとそれに続く配列決定のための組成物および方法であって、ヌクレオチド配列にインサイチューで結合するバーコード配列を用いた、生体分子の、長さスケール（細胞下～大きな組織）にわたるプログラム可能なラベリングを可能にする、組成物および方法が提供される。本明細書に提供される方法は、ハイスループットであり、過去のバーコーディング法に勝るいくつかの利点、例えば、配列情報を空間情報と共に提供する能力、改善されたシグナル対バックグラウンドノイズ比、多重化能力、改善された検出速度、選択性、スケーラビリティを有し、かつ、所定の捕捉アレイまたは試料の破壊の必要性がない。
一局面では、本明細書において、第1および第2の核酸鎖を含む、組成物、例えば、バーコード組成物であって、第1の核酸が、5'から3'の方向に、任意の固有分子識別子（UMI）配列、第1のターゲティングドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含み；第2の核酸が、5'から3'の方向に、バーコードドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含み、第1の核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインが、第2の核酸のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、第1の核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインと第2の核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、組成物が提供される。
別の局面では、本明細書において、第1および第2の核酸鎖を含む、組成物、例えば、バーコード組成物であって、第1の核酸が、5'から3'の方向に、任意の固有分子識別子配列、第1のターゲティングドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含み；第2の核酸が、5'から3'の方向に、ハイブリダイゼーションドメインおよびバーコードドメインを含み、第1の核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインが、第2の核酸のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、第1の核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインと第2の核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、組成物が提供される。
いくつかの態様では、第2の核酸鎖も、固有分子識別子配列を含む。例えば、固有分子識別子配列は、バーコード配列の5'側、例えば、5'末端に存在することができる。第2の核酸鎖はまた、プライマー配列を含むこともできる。例えば、ある態様では、第2の核酸鎖は、プライマー配列を含む。例えば、第2の核酸鎖は、バーコードドメインまたは固有分子識別子配列の5'末端にプライマー配列を含むことができる。一般に、プライマー配列は、第2の核酸の5'末端にあるかまたはその近傍にあるだろう。
いくつかの態様では、本明細書に記載される組成物は、第3の核酸鎖をさらに含み、第3の核酸鎖は、バーコードドメインを含み、第3の核酸のバーコードドメインは、第2の核酸鎖のバーコードドメインと実質的に相補的である。いくつかの態様では、第3の核酸は、バーコードドメインの5'末端に固有分子識別子配列をさらに含む。第3の核酸はまた、プライマー配列を含むこともできる。例えば、第3の核酸はまた、バーコードドメインまたは固有分子識別子配列の5'末端にプライマー配列を含むこともできる。一般に、プライマー配列は、第3の核酸の5'末端にあるかまたはその近傍にあるだろう。
さらに別の局面では、本明細書において、5'から3'の方向に、任意の固有分子識別子配列、第1のターゲティングドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸と、n個の追加の核酸とを含む、組成物、例えば、バーコード組成物であって、nが、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、第1のハイブリダイゼーションドメイン、バーコードドメイン；および第2のハイブリダイゼーションドメインを含み、n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含み、かつ、第1の核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインおよびn＝1の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、組成物が提供される。
いくつかの態様では、該組成物は、5'から3'の方向に、第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、n番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン、および第2のキャップハイブリダイゼーションドメインを含む、第1のキャップ核酸鎖をさらに含み、かつ、第1のキャップハイブリダイゼーションドメインおよびn番目の核酸鎖の第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む。
いくつかの態様では、該組成物は、第1のキャップ核酸鎖および第2のキャップ核酸鎖をさらに含み、第2の核酸鎖が、5'から3'の方向に、プライマー配列ドメイン；任意で、固有分子識別子配列；およびハイブリダイゼーションドメインを含み、ハイブリダイゼーションドメインが、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、第1のキャップ核酸鎖の第2のハイブリダイゼーションドメインおよび第2のキャップ核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む。
該組成物の核酸鎖は、追加の要素またはドメインを含むことができる。例えば、第1の核酸は、プライマー配列をさらに含むことができる。プライマー配列は、ターゲティングドメインまたは固有分子識別子配列の5'末端に存在することができる。一般に、プライマー配列は、第1の核酸鎖の5'末端にあるかまたはその近傍にあるだろう。
また、本明細書において、本明細書に記載される組成物を含むキットが提供される。例えば、核酸鎖、および任意で本明細書に記載される追加の要素またはデバイスを含むキットが提供される。
本明細書に開示される組成物およびキットは、標的を検出および／またはバーコーディングするのに有用である。本明細書に開示される組成物およびキットは、生体分子をインビトロ、インビボ、インサイチューまたはイントトでバーコーディングするために使用することができる。したがって、また、本明細書において、標的核酸をバーコーディングまたは検出するための方法も提供される。一局面では、本明細書において、標的mRNAを検出するための方法が提供される。一般に、該方法は、（i）標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、該mRNAが、ポリA配列を含むハイブリダイゼーションドメインを含み、第2の核酸が、5'から3'の方向に、ハイブリダイゼーションドメインおよび第1のバーコードドメインを含み、第2の核酸のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、ハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；ならびに（ii）該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；（iii）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（iv）記録核酸を検出する段階を含む。
別の局面では、本明細書において、標的核酸を検出するための方法が提供される。一般に、該方法は、（i）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、第1の核酸が、5'から3'の方向に、任意の固有分子識別子（UMI）配列、標的要素の核酸と実質的に相補的なターゲティングドメイン；およびハイブリダイゼーションドメインを含み、第2の核酸が、5'から3'の方向に、ハイブリダイゼーションドメインおよびバーコードドメインを含み、第2の鎖のハイブリダイゼーションドメインが、第1の鎖のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、ハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（ii）第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；（iii）任意で、プローブ-プライマー複合体を標的核酸から変性させる段階；（iv）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（v）記録核酸を検出する段階を含む。
さらに別の局面では、本明細書において、標的mRNAを検出するための方法が提供される。該方法は、（i）標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、該mRNAが、ポリA配列を含むハイブリダイゼーションドメインを含み、第2の核酸が、5'から3'の方向に、ハイブリダイゼーションドメインおよびバーコードドメインを含み、かつ、第2の鎖のハイブリダイゼーションドメインが、mRNAのハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、段階；（ii）該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；（iii）第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸の第1のバーコードドメインと実質的に相補的なバーコードドメインを含む、段階；（iv）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（v）記録核酸を検出する段階を含む。
また、本明細書において、標的核酸を検出するための方法が提供される。該方法は、（i）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸を第1の核酸にハイブリダイズさせる段階であって、第1の核酸が、5'から3'の方向に、任意の固有分子識別子配列、ターゲティングドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含み、ターゲティングドメインが、標的核酸と実質的に相補的であり、第2の核酸が、5'から3'の方向に、ハイブリダイゼーションドメインおよびバーコードドメインを含み、第2のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、ハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（ii）第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；（iii）任意で、第1の複合体を標的核酸から変性させる段階；（iv）第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸のバーコードドメインと実質的に相補的なバーコードドメインを含む、段階；（v）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（vi）記録核酸を検出する段階を含む。
さらに別の局面では、本明細書において、標的核酸を検出するための方法が提供される。一般に、該方法は、コンカテマーを調製する段階を含む。例えば、該方法は、（i）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、第1の核酸が、5'から3'の方向に、任意の固有識別子配列、ターゲティングドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含み、第1のターゲティングドメインが、標的核酸と実質的に相補的である、段階；（ii）例えば、段階的な様式で、n個の追加の核酸をハイブリダイズさせ、該追加の核酸と第1の鎖とを光架橋させることによって、コンカテマーを調製する段階であって、nが、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、第1のハイブリダイゼーションドメイン、バーコードドメインおよび第2のハイブリダイゼーションドメインを含み、n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含み、かつ、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインおよび第1の核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（iii）第1のキャップ核酸鎖とコンカテマーとをハイブリダイズさせ、それによりキャップされたコンカテマーを形成する段階であって、第1のキャップ核酸が、第1のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび第2のキャップハイブリダイゼーションドメインを含み、第1のキャップハイブリダイゼーションドメインが、n番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、段階；（iv）第2のキャップ核酸鎖をキャップされたコンカテマーにハイブリダイズさせ、それによりコンカテマー-プライマー複合体を形成する段階であって、第2のキャップ核酸鎖が、5'から3'の方向に、プライマー配列ドメイン、任意の固有分子識別子配列およびハイブリダイゼーションドメインを含み、第2のキャップ核酸のハイブリダイゼーションドメインが、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、第2のキャップ核酸のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび第1のキャップ核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（v）コンカテマー-プライマー複合体を検出する段階、またはコンカテマー-プライマー複合体から記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階を含む。
記録鎖を検出するための例示的な方法としては、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、および／または肉眼が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、記録鎖を、検出、例えば、配列決定の前に増幅させることができる。所望であれば、記録鎖を増幅および／または配列決定する前に、2つの核酸鎖を連結している光架橋を切断する、脱架橋させる、除去する、または逆転させることができる。
別の局面では、本明細書において、試料中の複数の標的を線形的に、コンビナトリアルにまたは空間的にバーコーディングするための方法が提供される。一般に、該方法は、複数の標的の各メンバー中の標的核酸鎖と第1の核酸鎖とをハイブリダイズさせる段階と、それに続く、段階的な様式で1つまたは複数の追加の核酸鎖をハイブリダイズさせ、該追加の核酸鎖と第1の複合体とを光架橋させることによってコンカテマーを調製する段階、その後、コンカテマーを検出する段階および／またはコンカテマーから記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階を含む。
標的核酸鎖は、別の核酸分子内に含まれ得るか、または、標的核酸鎖は、複数の標的の1つのメンバーとコンジュゲートされるか、または、標的核酸鎖は、細胞によって発現されるか、または、標的核酸鎖は、標的もしくは細胞上に直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくは標的結合物質／リガンドを介して間接的に提示される。
いくつかの態様では、第1の核酸鎖は、5'から3'の方向に、1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；2．第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および、3．第1のハイブリダイゼーションドメインを含む。いくつかの態様では、標的核酸鎖は、複数の標的の各メンバー中で異なる。いくつかの態様では、光架橋する工程は、試料の所定の領域を選択し、各追加の核酸鎖をハイブリダイズした後に該所定の領域を光に曝露させ、それにより相補的なハイブリダイゼーションドメインを架橋すること、および、光への曝露後かつ次の追加の核酸鎖のハイブリダイゼーション前にどんな架橋していない追加の核酸鎖も除去することを含む。
いくつかの態様では、各追加の核酸鎖は、5'から3'の方向に、i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；ii．バーコードドメイン；およびiii．第2のハイブリダイゼーションドメインを含む。いくつかの態様では、n番目の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインは、（n-1）番目の追加の核酸鎖の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である。いくつかの態様では、第1の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインは、第1の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である。いくつかの態様では、各核酸鎖の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つは、光反応性要素を含む。
さらに別の局面では、本明細書において、処置のための候補のライブラリをスクリーニングするための、本明細書に提供される方法の使用が提供される。いくつかの態様では、該使用は、本明細書に提供される方法によって所定の領域をイメージングおよびバーコーディングすることによって、1つまたは複数の表現型マーカーを特定することを含む。
別の局面では、本明細書において、候補のスクリーニングのための特定、薬物標的の特定、バイオマーカーの特定、プロファイリング、遺伝子型に対する表現型の細胞状態の特性評価、新たな疾患モデルの作製、細胞および疾患モデルの特性評価、分化状態および細胞状態の特性評価、組織マッピング、多次元分析、ハイコンテントスクリーニング、機械学習に基づくクラスタリングまたは分類、細胞療法開発、CAR-T療法開発、抗体スクリーニング、個別化医療、細胞濃縮、ならびにそれらの任意の組み合わせのための、本明細書に提供される方法の使用が提供される。
別の局面では、本明細書において、本明細書に提供される方法において使用するためのデバイスが提供される。いくつかの態様では、該デバイスは、光源および試料ホルダーを含む。
図1A～1Cは、二重光誘導型バーコーディング（戦略1）を示す。図1Aは、プローブ配列が、関心対象の標的およびその後のバーコード含有プライマーに結合することを示す。適切な波長のUV光で照射したら、プライマーは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになり、ポリメラーゼを使用して完全記録鎖をコピーした後、異なる光波長で架橋を逆転させる。配列決定に送る前に、記録アンプリコンをまずPCR増幅させてもよい。図1Bは、プローブ配列が、ゲノム／トランスクリプトーム標的に加えて核酸で標識された任意のエンティティ、例えば、標的タンパク質に結合しているDNAコンジュゲート抗体にインサイチューで結合することができることを示す。図1Cは、バーコーディングに非標的指向化アプローチを使用することもできることを示す。例えば、mRNA転写物のポリAテールは、バーコードプライマーに結合することができ、次にこれを、先に記載したように架橋させることができる。後続の調製工程および配列決定の前に、逆転写を用いてmRNA転写物配列の一部または全部をコピーする。 図1A-1の説明を参照のこと。 図1A-1の説明を参照のこと。 図1A-1の説明を参照のこと。 図1A-1の説明を参照のこと。 図2A～2Dは、バーコーディングされたブリッジ配列を用いた光誘導型バーコーディング（戦略2）を示す。図2Aは、プローブ配列が、関心対象の標的およびその後のバーコード含有ブリッジ鎖に結合することを示す。UV光の適切な波長で照射したら、ブリッジは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになり、プローブ－ブリッジ複合体は、対応するプライマーがバーコード配列にハイブリダイズする前に変性させることができる。ポリメラーゼを使用して完全記録鎖をコピーし、次にこれを、配列決定前にPCR増幅させることができる。鎖置換ポリメラーゼを使用すれば、プローブが標的に結合したままでも重合反応を起こすことができる（（図2B）部分）。図2Cは、バーコーディングに非標的指向化アプローチを使用することもできることを示す。例えば、mRNA転写物のポリAテールを、いくつかのT塩基を含有するバーコードブリッジに結合させてもよい。図2Dは、次にこれらのバーコードブリッジを架橋させて、配列決定のために先に記載したように調製することができる（逆転写などで）ことを示す。次に、配列決定を用いて、転写物＋バーコード情報を回収する。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図2A-1の説明を参照のこと。 図3A～3Cは、コンカテマーアセンブリを用いた光誘導型バーコーディング（戦略3）を示す。図3Aは、プローブ配列が、関心対象の標的およびその後のバーコード鎖に結合することを示す。適切な波長のUV光で照射したら、バーコードは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになる。コンカテマーは、繰り返しのバーコードハイブリダイゼーションおよび架橋反応を通じて形成される。図3Bは、鎖置換ポリメラーゼを使用して、クロスジャンクション合成反応を通じて完全記録鎖をコピーし、次にこれを、配列決定前にPCR増幅させることができることを示す。配列は、バーコード配列と標的配列の統合情報を明らかにする。コンカテマーアセンブリは、プライミングおよびクロスジャンクション合成の前に、まず試料／表面から変性させてもよい（（図3C）部分）。 図3A-1の説明を参照のこと。 図3A-1の説明を参照のこと。 図3A-1の説明を参照のこと。 図4A～4Dは、光誘導型バーコーディングを示す。図4Aは、基本的な配列特異的架橋反応が、一方がCNVK修飾を含有し、互いに結合する、2つの相補的配列またはほぼ相補的配列を必要とすることを示す。UV光への曝露は、鎖の共有結合連結（架橋）を引き起こす。図4Bは、特定の領域または領域のセットへの限局照射によって、架橋を、これらの領域に限局することもできる（先に記載したような戦略1化学を使用）ことを示す。例えば、CNVKを含有するプローブ配列は、結合するが、一部の領域だけ架橋され、その後、架橋していない鎖をすべて洗い流すと、照射された領域にのみ結合したプローブが生じる。図4Cは、異なるバーコード配列（例えば、B1～Bn）を有するバーコードプライマーを使用した繰り返しのハイブリダイゼーション、空間パターニング架橋および洗浄のラウンドを使用して、別個の領域をラベリングすることができることを示す。配列決定（同時に合成されて配列決定の間にプールされるすべての記録物で行うことができる）後、バーコード配列と標的／転写物の統合情報が回収される。また、繰り返しの空間パターニング架橋を、先に記載した第2のバーコーディング化学（戦略2）と同様ではあるが、異なるバーコードプライマーではなくバーコードブリッジ鎖を異なるラウンドで結合させて行うことができる（（図4D）部分）。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図5A～5Cは、光誘導型コンビナトリアルバーコーディングを示す。図5Aは、コンビナトリアル光誘導型バーコードアセンブリが、異なるバーコード配列（例えば、配列0および1）を有するバーコード鎖の繰り返しのハイブリダイゼーション、空間パターニング架橋、および洗浄のラウンドを介して達成されることを示す。図5Bは、それぞれ個々の領域が固有のアセンブリ順序（例えば、示している例では1010010または0011101）を受けることができるか、または所望であれば複数の領域が同じアセンブリ配列を受け得ることを示す。図5Cは、アセンブリされたバーコード配列＋元のプローブ配列情報の順序が、クロスジャンクション合成反応を通じて記録鎖において合成されることを示す。記録物を配列決定する前に、PCR増幅を実施してもよい。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図6A～6Fは、空間パターニング架橋の実験的検証を実証している。図6Aは、CNVK（灰色の塗りつぶし円）修飾されたバーコーディング鎖を空間フォトマスクと併用して、細胞収集物中のRNA標的にバーコードの架橋を指向することを示す。バーコーディング鎖は、バーコード配列（青色および紫色）とCy3bフルオロフォア（緑色の星）の両方を含有する。繰り返しの光誘導型バーコード構築を、連続的な洗浄およびUV架橋イベントを通じて進行させることができる。図6Bには、最終架橋工程が示されており、Cy5標識プライマー鎖（赤紫色の星を有する橙色の鎖）に対するプライマー結合部位（橙色）を担持する鎖を送達および架橋することを示す。この工程については全域架橋を実施した。図6Cは、DAPI（青色のチャネル）で標識されたEY.T4細胞を示す。架橋なし。図6Dは、空間マスクを適用して、細胞のリボソームRNAとCy3b（緑色のチャネル）標識バーコーディング鎖とを架橋したことを示す。緑色のチャネルは、ホルムアミド洗浄後、架橋が交差長方形パターンで成功したことを例証する。図6Eは、2つの長方形間の「交」点でのパネル（d）のより近い視野を示す。図6Fは、パネル（図6B）に示している最終プライマーキャッピングセット後のDAPI（青色）、Cy3b（緑色）およびCy5（赤紫色）チャネルにおけるイメージングを示す。Cy5標識鎖は、全域UV架橋に起因してすべての細胞に架橋すると予想される。バーコーディングされた鎖とプライマー鎖の両方を含有する細胞は、緑色と赤紫色の両チャネルにおいて重なり、チャネルの重ね合わせにおいて白く見えると予想される。注記、赤紫色のチャネルコントラストは、Cy5と比較して3倍高いCy3bフルオロフォアを有すると予想されるバーコーディングされた細胞と一致するようにスケール調整された。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図7A～7Cは、コンカテマーの最大3つのジャンクションの繰り返しアセンブリを示す。図7Aは、Cy3b標識バーコード鎖およびCy5標識プライマーを用いた繰り返しのジャンクションアセンブリの略図を示す。 図7A～7Cは、コンカテマーの最大3つのジャンクションの繰り返しアセンブリを示す。図7Bは、1ジャンクションおよび3ジャンクションアセンブリのクロスジャンクション合成とそれに続く記録物のPCR増幅の代表的な略図を示す。 図7A～7Cは、コンカテマーの最大3つのジャンクションの繰り返しアセンブリを示す。図7Cは、2つの実験についてのPCR産物とプローブなし対照を示しているPAGE変性ゲルを示す。 図8A～8Cは、細胞レベル空間ラベリングの実験的検証を示す。図8Aは、異なる表現型マーカーを呈する細胞の混合物を示す。GFPトランスフェクト細胞（緑色の円）が、レポーターフルオロフォア（橙色の星）を担持するCNVK鎖（灰色の塗りつぶし円）との架橋のために選択される。図8Bは、GFPトランスフェクト細胞とトランスフェクトなしの細胞の混合物を示している、明視野および緑色のチャネル画像の重ね合わせを示す。架橋のために選択された関心対象の複数の領域（黄色、青色、緑色、赤色の輪郭）がGFPシグナルを呈する細胞の周囲に描かれる。図8Cは、架橋後の細胞の蛍光画像を示す。核の染色（青色）、GFP（緑色）、および蛍光CNVK鎖（黄色）が重なる。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9A～9Dは、配列決定結果を示す。アンプリコンの両端にUMIを有する戦略2の変法を利用して、固定されたHeLa細胞に対してパターニング照射を使用して、3つの別個の空間的に分離された領域を逐次的にバーコーディングした。図9Aは、6つの別個のプローブ配列（2つがリボソームRNAを標的とし、4つがXist RNAを標的とする）が、FISHを用いてそれらの標的RNA配列に結合したことを実証している。これに続いて、繰り返しのバーコーディング、バーコード含有プライマーの結合、記録物の合成、および増幅を行った。次世代配列決定（HiSeq）のためにCollibri配列決定プレップキットを使用してアンプリコンを調製した。図9B～9Cは、予想されるフォーマットのリードが、整列後に高い割合で回収されたことを示す。図9Dは、データの大部分についてのリード分布がプローブ－領域ペアごとに示されていることを示す。 図9A-1の説明を参照のこと。 図9A-1の説明を参照のこと。 図9A-1の説明を参照のこと。 図9A-1の説明を参照のこと。 図10は、バーコーディングの標的指向化および非標的指向化アプローチを実証している。どんなタイプの核酸をバーコーディングしてもよい。これらの核酸は、典型的には、インサイチューに局在する生体分子と会合するか、それに結合するか、またはハイブリダイズする。特定の生体分子を、標的指向化アプローチまたは親和性に基づくアプローチ、例えば、DNA/RNA標的についてはFISH、タンパク質標的についてはIF（例えば、核酸コンジュゲート抗体またはナノボディを介して）、または核酸とコンジュゲート可能かそれ以外の方法で会合可能な任意の他の親和性に基づく試薬を通じて標的とすることができる。核酸が非標的指向化方式で局在されるかまたは生成される、非標的指向化を代わりに利用してもよい。例えば、RNAの逆転写から産生されたcDNAコピー、あるいは前から存在するRNAもしくはDNA、または修飾された骨格配列、またはポリメラーゼ、リガーゼ、制限酵素、ヌクレアーゼ、テロメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リコンビナーゼもしくはトランスポザーゼの作用によってインサイチューで生成された他の反応生成物、例えば、近接ライゲーションアッセイ、プライマー交換反応、オートサイクリック近接記録法もしくはタグメンテーションの生成物をバーコーディングすることができる。 図11A～11Bは、細胞または他の関心対象の領域に対するバーコードのアセンブリを示す。（図11A）インサイチューに局在している核酸（例えば、cDNA配列）上へのコンカテマーの繰り返しの形成は、その細胞由来のリードに特異的なバーコード（例えば、m-g-o-m-y-r-c）の形成をもたらす。cDNAの3'バーコーディングの配向が示されているが、5'バーコーディングを実施してもよい（例えば、図18および図19を参照のこと）。（図11B）クロスジャンクション合成およびPCRを使用して、配列決定のための記録物を調製する。 図11Aの説明を参照のこと。 図12は、本明細書に提供される方法および組成物の応用を示す。 図12-1の説明を参照のこと。 図12-1の説明を参照のこと。 図13は、解離的スプリット－プールバーコーディングのワークフローを示す。細胞またはそれ以外の会合生体分子（例えば、ヒドロゲル片）のチューブへの分割、例えば他の箇所に描写している光誘導型コンカテマー形成を用いた、核酸のバーコーディング、およびその後の再プールの繰り返しは、固有のバーコード配列がそれぞれの別個の細胞／成分と会合することを可能にする。スプリット－プール戦略は、過去に、複数の高価な酵素ライゲーション工程を通じた単一細胞バーコーディングに使用されていたが、コンカテマーに基づくバーコーディング戦略を使用すれば、各バーコーディング工程を高価な酵素または他の試薬の必要なしに実施できるのでコストが劇的に削減される。配列は、これらが表面上にあるときと同様に、記録物のクロスジャンクション合成およびPCRを用いて抽出することができる。 図13-1の説明を参照のこと。 図14A～14Cは、空間バーコーディングのある態様を示す。（図14A）バーコードは、典型的には、CNVK修飾の使用を通じて架橋され、架橋は、UV光で活性化される。（図14B）UV光照射プロファイルを空間的にアドレスすることによって、バーコードは、ドック配列に、所望の位置でのみ架橋され得、ストリンジェントな洗浄工程（例えば、ホルムアミド含有緩衝液）後、架橋していないすべてのバーコード鎖を洗い流すことができる。（図14C）結合工程、特定の領域の架橋工程、およびストリンジェントな洗浄工程の繰り返しは、その特定の領域に会合したバーコードの繰り返し構築を可能にする。 図14Aの説明を参照のこと。 図14Aの説明を参照のこと。 図15Aは、N個の領域（例えば、N個の別個の細胞）の線形バーコーディングが、N個のバーコードのたった一つが関心対象の各位置または複数の位置に割り当てられるように実施されることを実証している。次に、配列決定結果を一緒に大量に抽出してもよく、リードを、リード中のバーコード配列に基づきそれらの元の対応する位置にマッピングし戻してもよい。図15Bは、コンビナトリアルバーコーディングの方法を実証しており、リードが起因するはずの各領域（例えば、細胞）が固有のバーコードを受け入れるように、連結されたバーコードが繰り返し構築される（例えば、図18を参照のこと）。例えば、M個のバーコードのN回のラウンドについて、M^N個の固有のバーコードが実行可能に割り当てられ得るだろう。 図16は、試料のイメージングデータとRNA配列決定データを組み合わせるためのワークフローのある態様を示す。一般に、追加のイメージング工程および他のアッセイは、バーコーディングの前または後に加えてもよく、任意でAテーリング工程をバーコーディングの前または後に行ってもよい。異なるテーリング（例えば、T-テーリング、C-テーリング、G-テーリング、またはターミナルトランスフェラーゼもしくは他の酵素を用いた任意の他の種類のテーリングを利用してもよい）を代わりに利用してもよい。標的指向化アプローチについて、ワークフローは、プローブがすでに5'および3'テールを含有し得るという点以外は極めて似ており、そのため、RTとAテーリングの両工程を省略することができる。任意のドメイン（例えば、1文字、2文字、3文字または4文字）を3'テール配列に利用してもよい。 図17は、UV出力および照射条件の実験的検証を示す。HeLa細胞中のrRNA転写物に結合しているFISHプローブをバーコーディングするためのUV出力および照射条件を最適化する一連の実験。チェッカー盤パターンをそれぞれの別個の領域を有するウェル全体にラスタ化し、異なるUV出力および照射時間条件を試験した。 図18は、クロスジャンクション合成プライマー上にUMIを有する5'光誘導型バーコーディング戦略の鎖ダイアグラムを示す。オーバーハング5'ドメイン（例えば、端部にランダムなN個の塩基を有する）を有するプライマーを、RNA（例えば、mRNA、非コードRNA）に局在させ、cDNA配列を作製する。次に、cDNA配列に、3'末端上で塩基、例えば、ポリAテールを、ターミナルトランスフェラーゼおよびdATPを使用して付加させてもよい。その後、コンビナトリアルバーコードが、直接cDNAの5'オーバーハングまたは他のインサイチューに局在している配列上に、結合、UV架橋および洗浄の工程を通じて、繰り返しアセンブリされる（バーコーディングの前または後にAテーリング工程が含まれてもよい）。任意で、クロスジャンクション合成の前または同時に、RNAからのバーコードのRNaseH置換を実施してもよい。クロスジャンクション合成後、PCR増幅を介して完全記録物が形成される。 図18-1の説明を参照のこと。 図19は、バーコードキャッピング鎖上にUMIを有する5'光誘導型バーコーディング戦略の鎖ダイアグラムを示す。オーバーハング5'ドメイン（例えば、端部にランダムなN個の塩基を有する）を有するプライマーを、RNA（例えば、mRNA、非コードRNA）に局在させ、cDNA配列を作製する。次に、cDNA配列に、3'末端上で塩基、例えば、ポリAテールを、ターミナルトランスフェラーゼおよびdATPを使用して付加させてもよい。その後、コンビナトリアルバーコードが、直接cDNAの5'オーバーハングまたは他のインサイチューに局在している配列上に、結合、UV架橋および洗浄の工程を通じて、繰り返しアセンブリされる。任意で、クロスジャンクション合成の前または同時に、RNAからのバーコードのRNaseH置換を実施してもよい。クロスジャンクション合成後、PCR増幅を介して完全記録物が形成される。 図19-1の説明を参照のこと。 図20は、cDNAライブラリ作製のためのプライマーセットの実験的検証を示す。（上部）逆転写（RT）に使用するプライマーおよび濃度の表。ウェルラベル（A1～B4）は、下部に示す画像の配向と一致する。ウェルB1～B4は、プライマーの組み合わせならびに逆転写されていない陰性対照を有する。（下部）Cy5標識プライマーを使用した逆転写後のcDNAライブラリの局在の画像。次に、Cy3 CNVKバーコードを付加し、DMDおよび10×対物レンズを使用してチェッカー盤パターンで架橋し、Cy3でイメージングした。 図21は、異なるRTプライマーについての配列決定結果を示す。固定されたHeLa細胞におけるインサイチュー逆転写を、3'末端上のNNNNNNN（7N、実験A1）、NNNNNGGG（5Nおよび3G、実験A2）またはNNNNNCCC（5Nおよび3C、実験A3）と共に5'バーコーディングドメインを含有する異なるプライマーを用いて実施した。図18に描写した戦略に従ったバーコーディング、クロスジャンクション合成およびPCR後、PCRアンプリコンをAmpure XPビーズで精製し、配列決定（250bpペアエンド）に送った。いくつかの予想されるリード結果の例をこれらのプライマーの各々について示し、強調しているcDNA配列（青色）は、予想どおり公知のホモサピエンス配列に位置する。これらのデータは、この一般戦略の成功を立証しており、その各プライマーを使用してトランスクリプトーム記録物を上手く生成することができる。 図21-1の説明を参照のこと。 図22Aは、5'配列（例えば、cDNA、FISHプローブなどの上の5'テール）をバーコーディングするための配列構造を示す。リバース（Rev）プライマーキャッピング鎖、ゼロまたはそれより多いバーコード鎖、およびcDNA、FISH、またはポリAテールを有する他のプローブ配列を用いて形成されたコンカテマーを、フォワード（For）プライマーおよびポリT 3'末端を含有するクロスジャンクション合成プライマーを用いて効果的にコピーして、配列決定することができるPCR増幅可能な記録物を形成することができる。この場合、バーコード配列の2つの異なる配向（W/XドメインおよびY/Zドメイン）が利用されるが、さらに別個のバーコード配列も同様に利用してよい。鎖は、精製されても精製されなくてもよく、3'または5'末端上に追加の塩基（例えば、Tリンカー、フルオロフォア、伸張または分解を防ぐための修飾）を含有してもよい。図22Bは、結合ドメインのある態様を示しており、次のいくつかの図における実証に使用するバーコード配列をそれらのドメインに従って色付けして示す。異なる（バーコード）ドメイン配列を有する任意数のバーコード鎖をバーコーディングに利用してもよい。図22Cは、すべての後続の図に報告される実験のための完全配列情報が示されることを示す。PCRプライマー配列は、Smart Seq3プロトコルに基づく。すべての他の配列および特にバーコーディングのための配列は、数十のクロスジャンクション合成反応のモデリングおよび広域試験後、このバーコーディング適用のために具体的かつ実験的に設計されている。また、実施例における表1～3も参照されたい。 図22Aの説明を参照のこと。 図22Aの説明を参照のこと。 図23A～23Eは、ストレプトアビジンコート表面（ガラススライド）上の繰り返しのバーコードアセンブリの検証を示す。図23Aは、蛍光標識されたDNAバーコード鎖の繰り返しのバーコードアセンブリとそれに続くクロスジャンクション合成およびPCRの略図を示す。図23Bは、それぞれ1～6つのバーコードを含有する、2～7つのジャンクションを有する連結されたバーコードの略図を示す。図23Cは、別個のウェルにおいて予想されるDNAバーコード長の分布を示す（上部）。8ウェルチャンバー中の左上のウェルは、長さ6のDNAバーコードを含有し、最高の蛍光シグナル量を表示する。その後に、5および4などが続く。Cy3蛍光チャネルにおける8ウェルチャンバーのスキャン（下部）。図23Dは、図22A～22Cにおいて提示した配列に基づく7ジャンクションコンカテマーおよびアンプリコンの完全配列設計を示す。図23Eは、抽出、PCR、およびMinElute PCR精製カラムを用いた精製後、左上のウェル（6ジャンクション）からのアンプリコンを配列決定（250bpペアエンド配列決定）したことを示す。配列決定結果の例を、完全長（6バーコードを含有するリード）と短縮型リード（例えば、2または4バーコードを含有する）の両方について示す。コンカテマー形成工程におけるいくらかの非効率性に起因して、完全長リードに加えて短縮型リードが予想される。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図23Aの説明を参照のこと。 図24は、図19に描写した戦略に従う、いくつかの異なる固定、透過処理、RTおよびバーコーディング条件についての配列決定結果を示す。（上部）いくつかの固定／透過処理条件の各々について獲得された（実験B1～B8）、2ラウンドのバーコーディング後の予想される配列フォーマットと一致するいくつかの配列を示す。これらの配列は、各々の場合の予想されるバーコード配列、ならびに異なるUMI、および生じる配列長の例を示す。（下部）固定および透過処理を一定に保ちながら、RT工程に対するいくつかの変形をいくつかの対照と共に試験した。実験C1～C4の各々について、ストリンジェントな洗浄の前に架橋されない1つのバーコードを最初に導入し（交換1）、次に、UVで架橋されて配列決定リード中に現れるはずの第2のバーコードを導入した（交換2）。予想どおり、RT中にRNase Aを含有した対照を除くすべての条件で、架橋された正確なバーコードがリードの大部分で現れ（調べた2,000個のリードのうち＞1,500個）、間違った（架橋していない交換1バーコード）バーコードが極めて稀に現れた（2,000個のリードにおいて0という少なさ）。逆転写酵素（RT）なしの対照（実験B1）を除いた条件のすべてで（実験B2～B8、C1～C4）、強調しているcDNA配列（青色）は、公知のホモサピエンス配列に位置する。例外：Aテーリングを有するいくつかの条件は、図に表示したようにバーコーディング後に行われ、RNaseH処理を有するすべての条件は、クロスジャンクション合成インキュベーションと組み合わせる。 図24-1の説明を参照のこと。 図24-1の説明を参照のこと。 図24-1の説明を参照のこと。 図24-1の説明を参照のこと。 図25A～25Dは、実験B1～B8およびC1～C4のイメージングおよびゲル結果を実証している。図25Aは、実験B1～B8のイメージング結果を示しており、フルオロフォア（Alexa 488）標識RTプライマーを用いた逆転写（RT）後の別個の蛍光形態学を示す。予想どおり、置換後、局在したプライマーからの蛍光シグナルは有意に下降し、このことは、これらが、組み合わせのRNaseH工程およびクロスジャンクション合成工程の間に上手く置換されたことを示している。図25Bは、RTの間にRNase Aを含有するがRNaseOUTのない対照条件を示しており、シグナルがはるかに高く、より低いコントラスト可視化は、強く疑われる核小体シグナルを明らかにした。図25Cには、実験C1、C3およびC4のイメージング結果も示される。図25Dは、すべての条件のゲル結果を示しており、PCR増幅後に生成された記録物の長さを示す（Sybr Goldを含む1％アガロースE-ゲル）。逆転写を含有するがRNase Aを含有しない場合について、回収された典型的な長さは、約150bp～1300bpの範囲である。 図25Aの説明を参照のこと。 図25Aの説明を参照のこと。 図25Aの説明を参照のこと。 図25Aの説明を参照のこと。 図26は、トランスクリプトームマッピング結果を示す。トランスクリプトームマッピングは、配列決定結果に対してSTARアライナを用いて実施した。（左）実験B7について予想される配列フォーマットを有すると特定された1,024個の転写物のマッピング結果について、出力ログファイルの例を左に示す。リードの40.5％が独自にマッピングされたが、49％は複数の遺伝子座にマッピングされ、9.5％は短すぎてマッピングできなかった。（右）遺伝子マッピング結果をマッピングされた転写物の頻度によって分類し、一覧の上位を描写する。最も多い独自にマッピングされた遺伝子は、ミトコンドリアrRNAに対応した。 図26-1の説明を参照のこと。 図27は、表面上での自動バーコード割り当ておよび繰り返しバーコーディングを示す。バーコードの一覧（BC1、BC2、BC3など）を、関心対象の各領域（白色四角、中央パネル）が固有のバーコードに割り当てられた一連のフォトマスク（中央パネル）に変換できるワークフローの例。蛍光DNA鎖を用いた一連の6バーコーディング工程後に撮像し、112個の関心対象の領域のアレイに独自にタグ化およびバーコード化した（右パネル）。 図28A～28Gは、生体分子試料の自動バーコーディングを示す。図28Aは、細胞収集物をコンピュータアルゴリズムで検出し、バーコード送達に関して選択的に標的とし、その結果、固有のバーコード割り当てを有する各細胞を得ることができるワークフローを示す。図28Bは、RNAを標的とする蛍光DNAプライマーを有する細胞の画像を示す。図28Eは、パネル（図28C、28F）からのマスクを使用して蛍光DNAバーコード（緑色）を用いた6ラウンドのバーコーディング後の細胞の画像を示す。図28Cおよび図28Fは、検出された細胞マスクの重ね合わせ（白色の輪郭）を示す。図28Dおよび図28Gは、それぞれ（図28C）および（図28F）からの四角の輪郭の拡大画像を示す。 図28-1の説明を参照のこと。
詳細な説明
本明細書に提供される核酸バーコーディングの基本戦略を図1A～9Dに描写する。
一般に、本明細書に提供される方法は、標的核酸のハイスループット検出ならびに配列および空間情報の生成を可能にする方法および組成物の発見に一部基づく。本明細書に提供される方法および組成物は、診断、病理学および基礎研究のような多くの用途において有用である。
特に、本明細書に提供される組成物および方法は、空間マッピング、生体分子局在の検出、組織における様々な細胞タイプの特定、分子コーディング、データ保存、組織工学、通信、およびバイオセンシングにおいて有用であることができる。本明細書に提供されるアプローチを使用して、オリゴヌクレオチドアレイのためのパターニングおよびバーコーディングされた表面を作製することができる。例えば、本明細書に提供される方法および組成物は、核酸標的（例えば、関心対象のバイオマーカー）の高レベルのパターニング、マスキングおよび捕捉に使用することができる。
別の例として、試料中または表面上に固定された他の核酸、例えば、関心対象のタンパク質標的に結合したDNAコンジュゲート抗体に結合させるために、実施例に提供される標的指向化アプローチ（例えば、戦略1）を使用することもできる（図1Bを参照のこと）。一般に、関心対象の鎖で標識できるまたはそれに架橋できる任意のエンティティ（核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、糖類、小分子、ナノ粒子、ビーズ、ガラス表面など）を、本明細書に提供される方法を使用してパターニング、バーコーディングおよび記録することができる。
いくつかの態様では、バーコード組成物は、
a．5'から3'の方向に、（i）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；（ii）第1のターゲティングドメイン；および（iii）第1のハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸と、
b．5'から3'の方向に、（i）バーコードドメイン；および（ii）第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメインを含む、第2の核酸と
を含み、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む。
いくつかの態様では、バーコード組成物は、
a．5'から3'の方向に、（i）任意で、固有分子識別子配列；（ii）第1のターゲティングドメイン；および（iii）第1のハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸と、
b．5'から3'の方向に、（i）第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および（ii）第1のバーコードドメインを含む、第2の核酸と
を含み、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む。
いくつかの態様では、バーコード組成物は、
a．5'から3'の方向に、（i）任意で、固有分子識別子配列；（ii）第1のターゲティングドメイン；および（iii）第1のハイブリダイゼーションドメインを含む、第1の核酸と、
b．5'から3'の方向に、（i）第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および（ii）第1のバーコードドメイン；および（iii）第3のハイブリダイゼーションドメインを含む、第2の核酸と
を含み、
第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含み、第3のハイブリダイゼーションドメインが、任意で、光反応性要素を含む。
いくつかの態様では、バーコード組成物は、n個の追加の核酸をさらに含み、nが、任意で、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、（i）第1のハイブリダイゼーションドメイン；（ii）バーコードドメイン；および（iii）第2のハイブリダイゼーションドメインを含み、n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む。
いくつかの態様では、バーコード組成物は、5'から3'の方向に、（i）第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、nが1以上であるときn番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン、またはnが0であるとき第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、キャップハイブリダイゼーションドメイン；および（ii）第2のキャップハイブリダイゼーションドメインを含む、第1のキャップ核酸鎖をさらに含み、第1のキャップハイブリダイゼーションドメインが、任意で、光反応性要素を含む。
いくつかの態様では、バーコード組成物は、第1のキャップ核酸鎖および第2のキャップ核酸鎖をさらに含み、第2のキャップ核酸鎖が、5'から3'の方向に、（i）プライマー配列ドメイン；（ii）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および（iii）ハイブリダイゼーションドメインを含み、ハイブリダイゼーションドメインが、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、第2のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび第2の核酸のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む。
本明細書に記載される組成物および方法の核酸鎖は、1つまたは複数のドメインを含む。限定されないが、各ドメインは、独立に、任意の所望のヌクレオチド配列またはヌクレオチド数を含むことができる。言い換えれば、各ドメインは、独立に、あらゆる長さであることができる。したがって、各ドメインは、独立に、一ヌクレオチド～数千ヌクレオチド長であることができる。例えば、各ドメインは、独立に、1～1000、1～500、1～250、1～200、1～150、1～100、1～75、1～50、または1～25ヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様では、各ドメインは、独立に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはより長いヌクレオチド長であることができる。
本明細書に記載されるように、2つの核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインは、互いにハイブリダイズして、二本鎖構造を形成することができる。限定されないが、各二本鎖領域は、独立に、任意の所望の数の塩基対を含むことができる。言い換えれば、各二本鎖領域は、独立に、あらゆる長さであることができる。したがって、各二本鎖領域は、一塩基対～数十塩基対長であることができる。いくつかの態様では、各二本鎖領域は、独立に、1～50、1～45、1～40、1～35、1～30、1～25、1～20または1～15ヌクレオチドまたは塩基対長であることができる。例えば、各二本鎖領域は、独立に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはより長いヌクレオチドまたは塩基対長であることができる。
各核酸鎖は、独立に、あらゆる長さであることができる。例えば、各核酸鎖は、数ヌクレオチド～数千ヌクレオチド長であることができる。例えば、各核酸鎖は、独立に、1～50、1～75、1～100、1～150、1～175、1～200、1～250、1～300、1～400、1～500、1～750、1～1000またはより長いヌクレオチド長であることができる。
各ドメインは、独立に、任意の所望のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、各ドメインは、独立に、1文字、2文字、3文字または4文字コードを利用することができる。本明細書において使用される場合、「1文字コード」は、ドメインが、たった1種類の核酸塩基、すなわち、アデニン、チミン／ウラシル、グアニンおよびシトシン、またはそれらの修飾型のうち1つだけしか含まないことを意味する。例えば、1文字コードを利用するドメインは、同じ核酸塩基または核酸塩基の修飾型を含む、一筋のヌクレオチドを含む。例えば、ドメインは、一筋のポリA、ポリT、ポリCまたはポリGを含むことができる。いくつかの態様では、第1の核酸のハイブリダイゼーションドメインは、1文字コードを利用する。例えば、第1の核酸のハイブリダイゼーションドメインは、ポリ（A）配列を含むことができる。
「2文字コード」は、ドメインが、4つの核酸塩基のうち2つ、すなわち、アデニン、チミン／ウラシル、グアニンおよびシトシン、またはそれらの修飾型のうち2つだけしか含まないことを意味する。例えば、2文字コードは、アデニンおよびチミン／ウラシル、アデニンおよびグアニン、アデニンおよびシトシン、チミン／ウラシルおよびグアニン、チミン／ウラシルおよびシトシン、ならびにグアニンおよびシトシンからなる群より選択される核酸塩基を含む、またはそれからなることができる。
「3文字コード」は、ドメインが、4つの核酸塩基のうち3つだけ、すなわち、アデニン、チミン／ウラシル、グアニンおよびシトシン、またはそれらの修飾型のうち3つだけ含むことを意味する。例えば、3文字コードは、アデニン、チミン／ウラシルおよびグアニン；アデニン、チミン／ウラシルおよびシトシン；アデニン、グアニンおよびシトシン；ならびにチミン／ウラシル、グアニンおよびシトシンからなる群より選択される核酸塩基を含む、またはそれからなることができる。
いくつかの態様では、少なくとも1つのドメインは、同じ種類の核酸塩基を含む。例えば、ドメインは、プリン核酸塩基またはピリミジン核酸塩基しか含まない。
第1の核酸鎖は、RNA分子、例えば、RNA転写物であることができる。一例では、第1の核酸は、mRNAである。例えば、第1の核酸鎖は、mRNAであり、ハイブリダイゼーションドメインは、ポリA配列を含む。
本明細書に記載されるように、核酸鎖は、固有分子識別子配列またはドメインを含む。固有分子識別子配列またはドメインは、塩基付加化学合成の間にヌクレオチドのミックスを使用してランダム配列（縮重配列）のライブラリを作製することによって合成することができる。固有分子識別子配列またはドメインは、公知のヌクレオチド配列がインターカレーションされているまたはされていない、縦に並んだいくつかのそのようなランダム塩基からなることができる。いくつかの態様では、固有分子識別子配列またはドメインは、プライマーおよび記録配列から除外される。いくつかの態様では、核酸の固有分子識別子配列またはドメインは、同じ核酸のその他のドメインの1つに組み込まれる。
本明細書に記載されるように、ハイブリダイゼーションドメインは、光反応性要素を含むことができる。本明細書において使用される場合、「光反応性要素」という用語は、光源による光照射時に別のヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にすることができる任意の要素（例えば、ヌクレオチド、タンパク質または抗体）のことを指す。いくつかの態様では、光反応性要素は、光反応性ヌクレオチドである。いくつかの態様では、光反応性ヌクレオチドは、CNVKまたはCNVD架橋塩基である。いくつかの態様では、光反応性要素は、ソラレンである。
本明細書に記載される局面のいずれかのいくつかの態様では、核酸鎖は、核酸修飾を含むことができる。例えば、ターゲティングドメイン、バーコードドメイン、ハイブリダイゼーションドメイン、固有分子識別子配列および／またはプライマー配列ドメインの少なくとも1つは、独立に、核酸修飾を含むことができる。例示的な核酸修飾としては、核酸塩基修飾、糖修飾、糖間連結修飾、コンジュゲート（例えば、リガンド）、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。核酸修飾はまた、非天然または縮重核酸塩基も含む。
例示的な修飾核酸塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（nubularine）、イソグアニシン（isoguanisine）、ツベルシジン（tubercidine）、ならびにアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの置換または修飾類似体、例えば、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6およびO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む）、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6,N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノ-アリル-ウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3 カルボキシプロピル)ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N4-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、またはO-アルキル化塩基が挙げられるが、それらに限定されない。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの、およびEnglisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されているものが挙げられる。
いくつかの態様では、修飾核酸塩基は、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、2-(ハロ)アデニン、2-(アルキル)アデニン、2-(プロピル)アデニン、2-(アミノ)アデニン、2-(アミノアルキル)アデニン、2-(アミノプロピル)アデニン、2-(メチルチオ)-N6-(イソペンテニル)アデニン、6-(アルキル)アデニン、6-(メチル)アデニン、7-(デアザ)アデニン、8-(アルケニル)アデニン、8-(アルキル)アデニン、8-(アルキニル)アデニン、8-(アミノ)アデニン、8-(ハロ)アデニン、8-(ヒドロキシル)アデニン、8-(チオアルキル)アデニン、8-(チオール)アデニン、N6-(イソペンチル)アデニン、N6-(メチル)アデニン、N6,N6-(ジメチル)アデニン、2-(アルキル)グアニン、2-(プロピル)グアニン、6-(アルキル)グアニン、6-(メチル)グアニン、7-(アルキル)グアニン、7-(メチル)グアニン、7-(デアザ)グアニン、8-(アルキル)グアニン、8-(アルケニル)グアニン、8-(アルキニル)グアニン、8-(アミノ)グアニン、8-(ハロ)グアニン、8-(ヒドロキシル)グアニン、8-(チオアルキル)グアニン、8-(チオール)グアニン、N-(メチル)グアニン、2-(チオ)シトシン、3-(デアザ)-5-(アザ)シトシン、3-(アルキル)シトシン、3-(メチル)シトシン、5-(アルキル)シトシン、5-(アルキニル)シトシン、5-(ハロ)シトシン、5-(メチル)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(プロピニル)シトシン、5-(トリフルオロメチル)シトシン、6-(アゾ)シトシン、N4-(アセチル)シトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウラシル、5-エチニル-2'-デオキシウリジン、2-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2-(チオ)ウラシル、4-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-4-(チオ)ウラシル、5-(メチル)-2,4-(ジチオ)ウラシル、5-(メチルアミノメチル)-2,4-(ジチオ）ウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-(アルキル)ウラシル、5-(アルキニル)ウラシル、5-(アリルアミノ)ウラシル、5-(アミノアリル)ウラシル、5-(アミノアルキル)ウラシル、5-(グアニジニウムアルキル)ウラシル、5-(1,3-ジアゾール-1-アルキル)ウラシル、5-(シアノアルキル)ウラシル、5-(ジアルキルアミノアルキル)ウラシル、5-(ジメチルアミノアルキル)ウラシル、5-(ハロ)ウラシル、5-(メトキシ)ウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-(メトキシカルボニルメチル)-2-(チオ)ウラシル、5-(メトキシカルボニル-メチル)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(プロピニル)ウラシル、5-(トリフルオロメチル)ウラシル、6-(アゾ)ウラシル、ジヒドロウラシル、N3-(メチル)ウラシル、5-ウラシル(すなわち、シュードウラシル)、2-(チオ)シュードウラシル、4-(チオ)シュードウラシル、2,4-(ジチオ)シュードウラシル、5-(アルキル)シュードウラシル、5-(メチル)シュードウラシル、5-(アルキル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-4-(チオ)シュードウラシル、5-(メチル)-4-(チオ)シュードウラシル、5-(アルキル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、5-(メチル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-置換シュードウラシル、1-置換 2(チオ)-シュードウラシル、1-置換 4-(チオ)シュードウラシル、1-置換 2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-4-(チオ)シュードウラシル、1-(アミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノ-カルボニルエチレニル)-2(チオ)-シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-4-(チオ)シュードウラシル、1-(アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル)-2,4-(ジチオ)シュードウラシル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-置換 1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換 1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-置換 1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-置換 1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(アミノアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノキサジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキル-ヒドロキシ)-1,3-(ジアザ)-2-(オキソ)-フェノチアジン-1-イル、7-(グアニジニウムアルキルヒドロキシ)-1-(アザ)-2-(チオ)-3-(アザ)-フェノチアジン-1-イル、1,3,5-(トリアザ)-2,6-(ジオキサ)-ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、2-アザ-イノシニル、7-デアザ-イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、3-(メチル)イソカルボスチリリル、5-(メチル)イソカルボスチリリル、3-(メチル)-7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、7-(アザ)インドリル、6-(メチル)-7-(アザ)インドリル、イミジゾピリジニル（imidizopyridinyl）、9-(メチル)-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-(プロピニル)イソカルボスチリリル、プロピニル-7-(アザ)インドリル、2,4,5-(トリメチル)フェニル、4-(メチル)インドリル、4,6-(ジメチル)インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、4-(フルオロ)-6-(メチル)ベンゾイミダゾール、4-(メチル)ベンゾイミダゾール、6-(アゾ)チミン、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、6-(アザ)ピリミジン、2-(アミノ)プリン、2,6-(ジアミノ)プリン、5-置換ピリミジン、N2-置換プリン、N6-置換プリン、O6-置換プリン、置換1,2,4-トリアゾール、およびそれらの任意のO-アルキル化またはN-アルキル化誘導体からなる群より選択することができる。
例示的な糖修飾としては、2'-フルオロ、3'-フルオロ、2'-OMe、3'-OMe、2'-デオキシ修飾、および非環式ヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（PNA）、非ロック核酸（UNA）またはグリコール核酸（GNA）が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、核酸修飾は、糖間連結の置換または修飾を含むことができる。例示的な糖間連結修飾としては、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ホスホロアミダート、ホスホロチオアート、メチレンメチルイミノ、チオジエステル、チオノカルバメート、シロキサン、N,N'-ジメチルヒドラジン（-CH2-N(CH3)-N(CH3)-）、アミド-3 (3'-CH2-C(=O)-N(H)-5')およびアミド-4 (3'-CH2-N(H)-C(=O)-5')、ヒドロキシルアミノ、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキサミド、カルボナート、カルボキシメチル、カルバメート、カルボン酸エステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルフィド、スルホナート、スルホンアミド、スルホナートエステル、チオホルムアセタール（3'-S-CH2-O-5'）、ホルムアセタール（3'-O-CH2-O-5'）、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ（MMI、3'-CH2-N(CH3)-O-5'）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル（C3'-O-C5'）、チオエーテル（C3'-S-C5'）、チオアセトアミド（C3'-N(H)-C(=O)-CH2-S-C5'、C3'-O-P(O)-O-SS-C5'、C3'-CH2-NH-NH-C5'、3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'ならびに3'-NHP(O)(OCH3)-O-5'が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの態様では、核酸修飾は、当技術分野において記載されている、ペプチド核酸（PNA）、架橋型核酸（BNA）、モルフォリノ、ロック核酸（LNA）、グリコール核酸（GNA）、トレオース核酸（TNA）、または任意の他のゼノ核酸（XNA）を含むことができる。
本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、核酸は、独立に、3'末端および／または5'末端上で修飾することができる。例えば、標識、フルオロフォア、タグまたはキャップを、本明細書に記載される核酸の3'および／または5'末端に付加することができる。
本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、本明細書に記載される核酸鎖は、リンカーまたはスペーサーを用いて、例えば、内部位置で、3'末端および／または5'末端上で修飾することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、リンカーまたはスペーサーは、核酸鎖を、固体支持体または標識などの部分と連結するために使用することができる。いくつかの態様では、リンカーまたはスペーサーは、光切断性リンカー、加水分解性リンカー、酸化還元切断性リンカー、リン酸系切断性リンカー、酸切断性リンカー、エステル系切断性リンカー、ペプチド系切断性リンカー、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。いくつかの態様では、切断性リンカーは、ジスルフィド結合、テトラジン-trans-シクロオクテン基、スルフヒドリル基、ニトロベンジル基、ニトインドリン（nitoindoline）基、ブロモヒドロキシクマリン基、ブロモヒドロキシキノリン基、ヒドロキシフェナシル基、ジメトキシベンゾイン（dimethozybenzoin）基、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
任意の当技術分野において認められている光切断性リンカーを使用することができる。いくつかの態様では、切断性リンカーは、光切断性リンカーを含むことができる。一般に、光切断性リンカーは、光源（例えば、UV光）または特定の波長に曝露されると切断可能である感光性の官能基を含有する。光切断性スペーサーの非限定例は、例えば、米国特許第6,589,736 B1号；第7,622,279 B2号；第9,371,348 B2号；第7,547,530 B2号；および第7,057,031 B2号；ならびにPCT公報第WO2014200767号において見いだすことができ、そのすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、バーコード組成物は、検出可能な標識を含む。例えば、本明細書に記載される核酸鎖は、検出可能な標識を用いて、例えば、内部位置で、3'末端および／または5'末端上で修飾することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、そのような検出可能な標識は、検出を容易にすることができる。本明細書において使用される場合、「検出可能な標識」という用語は、標的の存在の指標となる検出可能なシグナルを生成可能な組成物のことを指す。検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。好適な標識としては、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、基質、化学発光部分、生物発光部分などが挙げられる。よって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。
多種多様な蛍光レポーター色素が当技術分野において公知である。典型的には、フルオロフォアは、芳香族または複素芳香族の化合物であり、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、シアニン、カルボシアニン、サリチラート、アントラニラート、クマリン、フルオレセイン、ローダミンまたは他の類似化合物であることができる。
例示的なフルオロフォアとしては、1,5 IAEDANS；1,8-ANS；4-メチルウンベリフェロン；5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン；5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）；5-カルボキシナフトフルオレセイン（pH 10）；5-カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）；5-FAM（5-カルボキシフルオレセイン）；5-ヒドロキシトリプタミン（HAT）；5-ROX（カルボキシ-X-ローダミン）；5-TAMRA（5-カルボキシテトラメチルローダミン）；6-カルボキシローダミン6G；6-CR 6G；6-JOE；7-アミノ-4-メチルクマリン；7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）；7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン；9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン；ABQ；アシッドフクシン；ACMA（9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン）；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンSITSA；エクオリン（フォトタンパク質）；Alexa Fluor 350（商標）；Alexa Fluor 430（商標）；Alexa Fluor 488（商標）；Alexa Fluor 532（商標）；Alexa Fluor 546（商標）；Alexa Fluor 568（商標）；Alexa Fluor 594（商標）；Alexa Fluor 633（商標）；Alexa Fluor 647（商標）；Alexa Fluor 660（商標）；Alexa Fluor 680（商標）；アリザリンコンプレキソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（APC）；AMC、AMCA-S；AMCA（アミノメチルクマリン）；AMCA-X；アミノアクチノマイシンD；アミノクマリン；アニリンブルー；ステアリン酸アントロシル（Anthrocyl stearate）；APC-Cy7；APTS；アストラゾンブリリアントレッド4G；アストラゾンオレンジR；アストラゾンレッド6B；アストラゾンイエロー7 GLL；アタブリン；ATTO-TAG（商標）CBQCA；ATTO-TAG（商標）FQ；オーラミン；オーロホスフィンG；オーロホスフィン；BAO 9（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；BCECF（高pH）；BCECF（低pH）；ベルベリン硫酸塩；ベータラクタマーゼ；BFPブルーシフトGFP（Y66H）；BG-647；ビマン；ビスベンズアミド；ブランコフォアFFG；ブランコフォアSV；BOBO（商標）-1；BOBO（商標）-3；ボディピー492/515；ボディピー493/503；ボディピー500/510；ボディピー505/515；ボディピー530/550；ボディピー542/563；ボディピー558/568；ボディピー564/570；ボディピー576/589；ボディピー581/591；ボディピー630/650-X；ボディピー650/665-X；ボディピー665/676；ボディピーFl；ボディピーFL ATP；ボディピーFl-セラミド；ボディピーR6G SE；ボディピーTMR；ボディピーTMR-Xコンジュゲート；ボディピーTMR-X、SE；ボディピーTR；ボディピーTR ATP；ボディピーTR-X SE；BO-PRO（商標）-1；BO-PRO（商標）-3；ブリリアントスルホフラビンFF；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムソン（Calcium Crimson）（商標）；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン-1 Ca2+色素；カルシウムグリーン-2 Ca2+；カルシウムグリーン-5N Ca2+；カルシウムグリーン-C18 Ca2+；カルシウムオレンジ；カルコフルオルホワイト；カルボキシ-X-ローダミン（5-ROX）；カスケードブルー（商標）；カスケードイエロー；カテコールアミン；CFDA；CFP-シアン蛍光タンパク質；クロロフィル；クロモマイシンA；クロモマイシンA；CMFDA；セレンテラジン；セレンテラジンcp；セレンテラジンf；セレンテラジンfcp；セレンテラジンh；セレンテラジンhcp；セレンテラジンip；セレンテラジンO；クマリンファロイジン；CPMメチルクマリン；CTC；Cy2（商標）；Cy3.1 8；Cy3.5（商標）；Cy3（商標）；Cy5.1 8；Cy5.5（商標）；Cy5（商標）；Cy7（商標）；シアンGFP；環状AMPフルオロセンサー（FiCRhR）；d2；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；塩化ダンシル；ダンシルDHPE；フッ化ダンシル；DAPI；ダポキシル；ダポキシル2；ダポキシル3；DCFDA；DCFH（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート）；DDAO；DHR（ジヒドローダミン123）；Di-4-ANEPPS；Di-8-ANEPPS（ノンレシオ）；DiA（4-Di-16-ASP）；DIDS；ジヒドローダミン123（DHR）；DiO（DiOC18(3)）；DiR；DiR（DiIC18(7)）；ドーパミン；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；エオシン；エリスロシン；エリスロシンITC；エチジウムホモダイマー-1（EthD-1）；ユークリシン（Euchrysin）；塩化ユウロピウム（III）；ユウロピウム；EYFP；ファストブルー；FDA；フォイルゲン（パラローズアニリン）；FITC；FL-645；フラゾオレンジ；Fluo-3；Fluo-4；フルオレセインジアセタート；フルオロ-エメラルド；フルオロ-ゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43（商標）；FM 4-46；Fura Red（商標）（高pH）；Fura-2、高カルシウム；Fura-2、低カルシウム；ゲナクリルブリリアントレッドB；ゲナクリルブリリアントイエロー10GF；ゲナクリルピンク3G；ゲナクリルイエロー5GF；GFP（S65T）；GFPレッドシフト（rsGFP）；GFP野生型、非UV励起（wtGFP）；GFP野生型、UV励起（wtGFP）；GFPuv；グロキサン酸；グラニュラーブルー；ヘマトポルフィリン；ヘキスト33258；ヘキスト33342；ヘキスト34580；HPTS；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（フルオロゴールド）；ヒドロキシトリプタミン；インドジカルボシアニン（DiD）；インドトリカルボシアニン（DiR）；イントラホワイトCf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；ラウロダン；LDS 751；ロイコフォア（Leucophor）PAF；ロイコフォアSF；ロイコフォアWS；リサミンローダミン；リサミンローダミンB；LOLO-1；LO-PRO-1；ルシファーイエロー；マググリーン；マグダラレッド（フロキシンB）；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリナブルー；マキシロンブリリアントフラビン10 GFF；マキシロンブリリアントフラビン8 GFF；メロシアニン；メトキシクマリン；ミトトラッカーグリーンFM；ミトトラッカーオレンジ；ミトトラッカーレッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（mBBr-GSH）；モノクロロビマン；MPS（メチルグリーンピロニンスチルベン）；NBD；NBDアミン；ナイルレッド；ニトロベンズオキサジドール（Nitrobenzoxadidole）；ノルアドレナリン；ヌクレアファストレッド；ヌクレアイエロー；ナイロサンブリリアントラビンE8G；オレゴングリーン（商標）；オレゴングリーン488-X；オレゴングリーン（商標）488；オレゴングリーン（商標）500；オレゴングリーン（商標）514；パシフィックブルー；パラローズアニリン（フォイルゲン）；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-テキサスレッド（Red 613）；フロキシンB（マグダラレッド）；ホルワイト（Phorwite）AR；ホルワイトBKL；ホルワイトRev；ホルワイトRPA；ホスフィン3R；フォトレジスト；フィコエリスリンB［PE］；フィコエリスリンR［PE］；PKH26；PKH67；PMIA；ポントクロムブルーブラック；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；プリムリン；プロシオンイエロー；ヨウ化プロピジウム（PI）；PyMPO；ピレン；ピロニン；ピロニンB；ピロザールブリリアントフラビン7GF；QSY 7；キナクリンマスタード；レソルフィン；RH 414；Rhod-2；ローダミン；ローダミン110；ローダミン123；ローダミン5 GLD；ローダミン6G；ローダミンB 540；ローダミンB 200；ローダミンBエクストラ；ローダミンBB；ローダミンBG；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンWT；ローズベンガル；R-フィコエリスリン（PE）；レッドシフトGFP（rsGFP、S65T）；S65A；S65C；S65L；S65T；サファイアGFP；セロトニン；セブロンブリリアントレッド2B；セブロンブリリアントレッド4G；セブロンブリリアントレッドB；セブロンオレンジ；セブロンイエローL；sgBFP（商標）；sgBFP（商標）（スーパーグロウBFP）；sgGFP（商標）；sgGFP（商標）（スーパーグロウGFP）；SITS；SITS（プリムリン）；SITS（スチルベンイソチオスルホン酸）；SPQ（6-メトキシ-N-(3-スルホプロピル)-キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンB can C；スルホローダミンGエクストラ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン；テキサスレッド（商標）；テキサスレッド-X（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（DiSC3）；チアジンレッドR；チアゾールオレンジ；チオフラビン5；チオフラビンS；チオフラビンTCN；チオライト（Thiolyte）；チオゾールオレンジ；チノポールCBS（カルコフルオルホワイト）；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；トリコロール（PE-Cy5）；TRITC（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）；トゥルーブルー；TruRed；ウルトラライト（Ultralite）；ウラニンB；ユビテックスSFC；wt GFP；WW 781；XL665；X-ローダミン；XRITC；キシレンオレンジ；Y66F；Y66H；Y66W；イエローGFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；およびYOYO-3が挙げられるが、それらに限定されない。これらの蛍光化合物の多くの好適な形態が利用可能であり、使用することができる。
他の例示的な検出可能な標識としては、発光および生物発光マーカー（例えば、ビオチン、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシのものなど）、ルシフェリンおよびエクオリン）、放射性標識（例えば、3H、125I、35S、14Cまたは32P）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ（glucorinidases）、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、およびコリンエステラーゼ）、およびカロリメトリック標識、例えば金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびラテックス）ビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号、および第4,366,241号が挙げられ、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様では、検出可能な標識は、蛍光分子、ナノ粒子、安定同位体、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、検出可能な標識は、フルオロフォアである。
そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に酵素基質を供給し、酵素基質に対する酵素の作用によって生成された反応生成物を検出することによって検出され、カロリメトリック標識は、着色標識を可視化することによって検出することができる。
いくつかの態様では、検出可能な標識は、フルオロフォアまたは量子ドットである。理論に束縛されることを望むものではないが、蛍光試薬を使用することで、イメージング／リードアウトにおけるシグナル対ノイズを軽減し、したがって、感度を維持することができる。
いくつかの態様では、標識は、本明細書に提供されるバーコード組成物とコンジュゲートされた際には検出不可能である「スマート標識」を含むように構成することができる。
本明細書に記載される核酸鎖に対してアクリダイト（acrydite）修飾を行うこともできる。アクリダイト修飾は、核酸鎖を、チオールなどの求核剤との反応に使用できるようにする（例えば、マイクロアレイ）またはゲルに組み込むことができるようにする（例えば、ポリアクリルアミド）。したがって、いくつかの態様では、核酸鎖は、1つまたは複数のアクリダイトヌクレオシドを含むことができる。アクリダイトヌクレオシドは、核酸鎖の3'末端、5末端、および／または内部位置にあることができる。
本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、バーコード組成物は、ナノ粒子をさらに含む。例えば、本明細書に記載される核酸鎖は、ナノ粒子と、例えば、内部位置で、3'末端および／または5'末端上でコンジュゲートさせることができる。いくつかの態様では、ナノ粒子は、アップコンバージョンナノ粒子である。ほんの一例として、アップコンバージョンナノ粒子を利用して、異なる波長で架橋を実施することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載される核酸鎖は、ポリメラーゼによる伸張を阻害するために3'末端上に修飾を含むことができる。例えば、核酸鎖は、伸張を防ぐために一連のT塩基のような「テール」を含むことができる。
また、精製、抽出、発現の定量、結合、電気泳動などを可能にする、本明細書に提供される核酸鎖に対する任意の修飾を行うこともできる。
本明細書に開示される様々な局面のいくつかの態様では、バーコード組成物は、プライマーをさらに含む。本明細書において使用される場合、「プライマー」という用語は、核酸鎖と対合して、ポリメラーゼが核酸鎖の合成を開始する遊離3'-OHを提供する、DNA（またはRNA）の配列のことを記述するために使用される。好ましくは、プライマーは、オリゴヌクレオチドから構成される。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの供給源を含む多くの要因に依存する。例えば、標的配列の複雑性に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、15～25またはより多くのヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有してもよい。短いプライマー分子は、一般に、テンプレートとの十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。
諸局面のいずれかのいくつかの態様では、バーコード組成物は、ヌクレオチド三リン酸またはデオキシヌクレオチド三リン酸をさらに含む。
本明細書に開示される様々な局面のいくつかの態様では、バーコード組成物は、DNAまたはRNAポリメラーゼをさらに含む。「ポリメラーゼ」は、ポリヌクレオチド、例えば、DNAおよび／またはRNAのテンプレート指向型合成を遂行する酵素のことを指す。この用語は、完全長ポリペプチドとポリメラーゼ活性を有するドメインの両方を包含する。DNAポリメラーゼは、当業者に周知であり、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritime）から単離されたもしくはそれに由来するDNAポリメラーゼ、またはそれらの修飾型を非限定的に含む。市販のポリメラーゼ酵素の追加の例としては、クレノウ断片（New England Biolabs（登録商標）Inc.）、Taq DNAポリメラーゼ（QIAGEN）、9°N（商標）DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）、Deep Vent（商標）DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）、Manta DNAポリメラーゼ（Enzymatics（登録商標））、Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）、およびphi29 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs（登録商標）Inc.）が挙げられるが、それらに限定されない。ポリメラーゼは、DNA依存性ポリメラーゼおよびRNA依存性ポリメラーゼ（逆転写酵素など）の両方を含む。DNA依存性のDNAポリメラーゼには少なくとも5つのファミリーが知られているが、ほとんどがファミリーA、BおよびCに分類される。その様々なファミリー間で配列類似性はほとんどないかまたは全くない。ほとんどのファミリーAポリメラーゼは、ポリメラーゼ、3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性および5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性を含む複数の酵素機能を含有することができる、単鎖タンパク質である。ファミリーBポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼおよび3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性を備えた単一の触媒ドメイン、ならびに補助因子を有する。ファミリーCポリメラーゼは、典型的には、重合活性および3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性を備えたマルチサブユニットタンパク質である。大腸菌（E. coli）では、3種類のDNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI（ファミリーA）、II（ファミリーB）、およびIII（ファミリーC）が見つかっている。真核細胞では、3つの異なるファミリーBポリメラーゼである、DNAポリメラーゼα、δ、およびεが核複製に関わっており、ファミリーAポリメラーゼであるポリメラーゼγがミトコンドリアDNA複製に用いられる。他の種類のDNAポリメラーゼとしては、ファージポリメラーゼが挙げられる。同様に、RNAポリメラーゼとしては、典型的には、真核生物のRNAポリメラーゼI、IIおよびIII、ならびに細菌のRNAポリメラーゼの他、ファージおよびウイルスのポリメラーゼが挙げられる。RNAポリメラーゼは、DNA依存性およびRNA依存性であり得る。
鎖置換DNAまたはRNAポリメラーゼなどの試薬、および核酸テンプレートから核酸配列を合成するための方法は、当技術分野において周知であり、本発明に受け入れ可能であることが留意される。例えば、US20050277146A1、US20100035303A1およびWO2006030455A1を参照されたく、そのすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様では、ポリメラーゼは、鎖置換ポリメラーゼである。
様々な局面のいくつかの態様では、バーコード組成物は、核酸合成のための緩衝液または塩をさらに含む。バーコード組成物において使用される緩衝液は、バーコード組成物の核酸の安定性をもたらすように選択されることが想定される。そのような緩衝液を選択する方法は、当技術分野において公知であり、実施される反応のpHまたは温度を含む様々な条件におけるそれらの性質に関して選択することもできる。
いくつかの態様では、2つの異なるドメインは、同一のヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの態様では、核酸鎖は、制限部位を含むことができる。例えば、結合しているバーコード鎖間の結合領域内に制限部位を、および、切断した端にライゲーションされて完全記録鎖を形成できるヘアピンを使用することができる。あるいは、ジャンクションの間に橋を架ける鎖をアセンブリに結合した後、一緒にライゲーションすることができる。
バーコード組成物はまた、追加の成分および要素を含むこともできる。例えば、バーコード組成物は、光架橋するための、および／または、架橋を切断、脱架橋、除去もしくは逆転させるための光源を含むことができる。いくつかの態様では、光源は、UV光源である。
本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様では、バーコード組成物は、標的要素をさらに含む。本明細書において使用される場合、「標的要素」は、本明細書に提供される方法によって検出することができる、任意の分子、化合物、核酸、ポリペプチド、脂質、抗体またはウイルスのことを指す。
いくつかの態様では、標的要素は、基材表面上に固定される。いくつかの態様では、標的要素は、所定のパターンで固定される。いくつかの態様では、標的要素は、mRNAである。いくつかの態様では、標的要素は、核酸、脂質、糖、小分子、微生物もしくはその断片、ポリペプチドおよび／または生体物質である、要素である。生体物質は、組織、組織切片、人工組織（engineered tissue）、細胞、患者由来細胞、初代細胞、オルガノイド、細胞外マトリックス、3D生体器官、解離細胞、生細胞、固定細胞などから選択することができる。細胞は、原核細胞または真核細胞であることができる。
一般に、第1の核酸のターゲティングドメインは、標的核酸と実質的に相補的である。限定されないが、標的核酸は、任意の核酸であることができる。例えば、標的核酸は、天然に存在する核酸または合成核酸であることができる。標的核酸は、より大きな核酸分子のほんの一部であることができる。
さらに、標的核酸は、遊離していても、標的結合物質とコンジュゲートさせてもよく、または標的核酸は、標的分子とコンジュゲートさせることができる。そのうえ、標的核酸は、標的細胞によって発現させることができる。代替的にまたは追加的に、標的核酸は、標的分子または細胞上に、例えば直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくはアダプター分子、例えば標的結合リガンドを介して間接的に提示することができる。
本明細書に開示される様々な局面のいくつかの態様では、標的核酸は、標的結合物質とコンジュゲートされる。本明細書において使用される場合、「標的結合物質」は、標的要素に結合することができる部分のことを意味する。例示的な標的結合物質としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、標的結合物質は、抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの態様では、標的核酸および／または本明細書に提供されるバーコード組成物の核酸は、基材、例えば、基材の表面に、共有結合または非共有結合でコンジュゲートされる。標的核酸および／または本明細書に提供されるバーコード組成物の核酸は、マイクロアレイチップにおいてよく見られるマイクロウェルの形成のような特殊な表面処理を必要とすることなく、任意の基材表面に適用できることが留意される。表面は、新生鎖バーコードコンカテマーの初期ドッキング鎖としての役割を果たす核酸鎖で機能化することのみ必要である。あるいは、核酸は、基材と非共有結合相互作用を形成することができる。
本明細書において使用される場合、「基材」または「基材表面」という用語は、本明細書に提供される1つまたは複数の核酸バーコードまたは核酸バーコードのコンカテマーをその上に表示させることができるか、追加の核酸および／または標識との接触のためにその上で接触させることができる構造を記述するために互換的に使用される。本明細書に提供される核酸バーコードをこの基材表面にコンジュゲートさせることができる。
本明細書において使用される場合、「～にコンジュゲートされる」という用語は、核酸と基材表面、相変化剤（phase-changing agent）または親和性対のメンバーとの、共有結合（限定されないが架橋剤を介した架橋を含む）によるまたはコンジュゲートを使用しようとする条件下で維持される強い非共有結合相互作用による、会合を包含する。
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイズする」という用語は、一本鎖核酸またはその領域が、別の一本鎖核酸もしくはその領域と（分子間ハイブリダイゼーション）または同じ核酸の別の一本鎖領域と（分子内ハイブリダイゼーション）、水素結合による塩基対相互作用を形成する現象のことを指す。ハイブリダイゼーションは、関与する塩基配列（相補的核酸塩基は水素結合を形成する）、ならびに塩基対のアイデンティティによって決定される任意のハイブリッドの安定性（例えば、G：C塩基対は、A：T塩基対よりも強い）および隣接する塩基対の数（より長く伸びた相補的塩基は、より安定したハイブリッドを形成する）によって左右される。例えば、ドッキング鎖と、光反応性核酸塩基、例えば、CNVK塩基を含む核酸バーコードとの間のハイブリダイゼーションは、基材表面上に保存されたデータの光誘導型の読み取りおよび／または可視化を可能にする。
本明細書に提供される基材表面は、生体物質（例えば、細胞、組織またはその断片）、プラットフォーム、カラム、フィルターまたはシート、ディッシュ、マイクロ流体キャプチャデバイス、キャピラリーチューブ、電気化学応答性プラットフォーム、スキャフォールド、カートリッジ、樹脂、マトリックス、ビーズ、相変化剤、または当技術分野において公知である別の基材表面の形態で存在することができる。複数の表面タイプを使用することができる。基材表面の非限定例としては、ガラス、透明ポリマー、ポリスチレン、ヒドロゲル、金属、セラミック、紙、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、酸化鉄、ステンレス鋼、金ナノビーズまたは粒子、銅、塩化銀、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、シクロオレフィンポリマーまたはシクロオレフィンコポリマー、ストレプトアビジン、Sepharose（商標）樹脂、生体物質（例えば、細胞、組織、細胞膜、細胞外マトリックスタンパク質など）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、基材は、ガラスまたは高分子表面であることができる。いくつかの態様では、基材は、圧縮性ヒドロゲルである。
いくつかの態様では、生体物質は、組織、細胞、オルガノイド、人工組織；および細胞外マトリックスからなる群より選択される。
いくつかの態様では、標的核酸および／または本明細書に提供されるバーコード組成物は、圧縮性ヒドロゲルに適用するかその中に埋め込むことができる。いくつかの態様では、標的核酸および／または本明細書に提供されるバーコード組成物は、特別情報、例えば、デジタルデータを表し、限定されないが文書、画像、図形、動画、配列決定データおよび／または健康記録を含めた任意の情報を保存することができる。いくつかの態様では、核酸バーコードまたは核酸バーコードのコンカテマーは、空間情報を表す。
核酸鎖でのこれらの基材の表面機能化の方法は、当技術分野において公知であり、いくつかの材料に関する要件および最小調製時間を必要とする。典型的な調製は、最初に、表面をウシ血清アルブミン－ビオチン（BSA-ビオチン）で不動態化することを伴う。BSAは、ガラス表面と非特異的に結合する。次に、ストレプトアビジンタンパク質が、BSAタンパク質上のビオチン付着部に結合する。最後に、ビオチンで標識された核酸を導入して、ストレプトアビジンタンパク質上のその他の利用可能な結合部位に結合させ、ガラス表面の機能化を完了することができる。
いくつかの態様では、バーコーディング組成物は、アクリダイトで修飾される。アクリダイト修飾された核酸鎖を、基材またはヒドロゲル材料と混合し、基材またはヒドロゲル材料と一緒に重合することができる。
いくつかの態様では、基材は、ヒドロゲルである。ヒドロゲルは、天然に存在するか、天然源に由来するか、または合成源に由来することができる。ヒドロゲルは、1つまたは複数の単量体の反応によって生成される、任意の水で膨張されかつ架橋された高分子材料であることができる。ヒドロゲルは、水溶液に溶解させることなしにその構造内にかなりの割合の水を保持するように膨張可能である高分子材料であることができる。ヒドロゲルはまた、任意の収縮性材料、例えば、熱収縮性プラスチック、粘弾性発泡体、記憶発泡体であることができる。
ヒドロゲルは、天然の単量体分子（例えば、グリコサミノグリカン）、親水性材料（例えば、メタクリラート、電解質複合体、酢酸ビニル、アクリルアミド）、または天然高分子材料（例えば、ペプチド、糖類）に由来することができる。他の好適なヒドロゲル組成物は、2001年8月7日に交付された「Hydrogel composites and superporous hydrogel composites having fast swelling, high mechanical strength, and superabsorbent properties」という表題の米国特許第6,271,278号に記載されているとおりである。ヒドロゲルは、疎水性材料および／または親水性材料から構成されることができ、疎水性材料は、水に物理的に引き付けられず、親水性材料は、水に物理的に引き付けられる。
いくつかの態様では、ヒドロゲルは、ホモ重合体に基づくヒドロゲルであることができ、このヒドロゲルは、単一の単量体種または分子に由来する。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、共重合体に基づくヒドロゲルであることができ、このヒドロゲルは、2つ以上の異なる単量体種または分子に由来する。いくつかの態様では、共重合体に基づくヒドロゲルは、ランダム、ブロックまたは交互の立体構造で、任意で単量体の1つの骨格に沿って配置される。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、多重合体貫入高分子に基づくヒドロゲルであることができ、このヒドロゲルは、少なくとも2つの異なる、任意で架橋された、高分子サブユニットに由来する。いくつかの態様では、多重合体貫入高分子に基づくヒドロゲルは、架橋されている1つの高分子サブユニットと架橋されていない高分子サブユニットである1つの高分子とを含む。
ヒドロゲルは、非結晶性、半結晶性または結晶性であり得る。ヒドロゲルは、共有結合により架橋されても、されなくてもよい。ヒドロゲルは、化学的方法（例えば、化学的架橋）または物理的方法（例えば、疎水性相互作用）を使用して合成することができる。ヒドロゲルは、中性に荷電されるか、正味正に荷電されるか、または正味負に荷電されることができる。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、正に荷電された基および負に荷電された基を含む。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、両性または双性イオン性であることができる。
いくつかの態様では、ヒドロゲルは、核酸でエンコードする前に、ゲル、鋳型または他の埋め込み材料に事前に鋳込することができる。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、核酸でエンコードした後に、ゲル、鋳型または他の埋め込み材料に鋳込することができる。
核酸または他の分子種の合成、操作および／またはヒドロゲルへの添加は、電場、磁場、圧力、吸引および毛細管現象などの外部刺激を使用して容易にすることができる。本明細書に提供されるヒドロゲルは、バイオセンサー（例えば、疾患をモニタリング、制御された薬物放出機序で疾患を処置、コンタクトレンズ、皮膚もしくは粘膜組織生着、またはマイクロアレイ疾患検出）として使用するために修飾することができる。組織生着および細胞スキャフォールドにおいて使用するためのヒドロゲルに対する修飾は、当技術分野において公知である。
いくつかの態様では、マイクロ流体を使用して、核酸または他の分子種を合成するか、操作するかまたはヒドロゲルへ添加することができる。
いくつかの態様では、ヒドロゲルは、圧縮状態で存在し、この場合、ヒドロゲルは、完全に圧縮または収縮され、ヒドロゲルの水含量は減少する。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、膨張状態で存在し、この場合、ヒドロゲルは、完全に膨張、拡大または膨潤され、ヒドロゲルの水含量は増加する。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、完全に圧縮された状態と完全に膨張された状態の間の中間状態で存在することができる。いくつかの態様では、ヒドロゲルは、外部環境条件における変化に応じて圧縮または膨張される。いくつかの態様では、外部環境条件は、物理的条件および化学的条件を含むことができ、物理的条件は、温度、電位、光、圧力および音を含み、化学的条件は、pH、溶媒組成（例えば、水、有機溶媒の量の変化）、イオン強度および小分子溶質を含む。
いくつかの態様では、分子、細胞フリー反応物、細胞、組織切片、オルガノイドおよび生物などの生体物質を、本明細書に提供される基材上に固定することができる。バーコーディングされた表面および基材を、公知の構成の空間バーコードで事前にパターニングすることができる。バーコーディングされた表面は、生体物質の空間バーコーディングのためのグリッドとして使用することができる。基材は、ゲノムおよびリボ核酸標的を含め、生体試料中の様々な標的のドッキング部位としての役割を果たすことができる。バーコーディングされた基材上のドッキング部位は、生体物質中のタンパク質標的、代謝標的または他の標的に結合するために使用することができる、化学タグまたはタンパク質タグを含む官能基を担持することができる。任意で、バーコーディングされた基材上の核酸バーコードを、バーコードパターン全体を保存しながら、化学的、酵素的または光化学的な方法を使用して表面から切断し、これを、拡散もしくは電気泳動、力分光法または磁場を通じて生体物質に転写することができる。
諸局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書に提供される核酸は、固体支持体にコンジュゲートすることができる。限定されないが、固体支持体は、プラットフォーム、カラム、フィルターまたはシート、ディッシュ、マイクロ流体キャプチャデバイス、キャピラリーチューブ、電気化学応答性プラットフォーム、スキャフォールド、カートリッジ、樹脂、マトリックス、ビーズ、または当技術分野において公知である別の固体支持体の形態で存在することができる。
いくつかの態様では、固体支持体は、限定されないが高分子、金属、セラミック、ゲル、紙またはガラスを含めた材料を含む。固体支持体の材料は、非限定例として、ポリスチレン、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、酸化鉄、ステンレス鋼、金ナノビーズもしくは粒子、銅、塩化銀、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、シクロオレフィンポリマーもしくはシクロオレフィンコポリマー、またはSepharose（商標）樹脂をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、固体支持体は、磁気応答性ビーズなどの磁気応答性要素をさらに含むことができる。いくつかの態様では、磁気応答性要素またはビーズは、球体、立方体、直方体、円柱、円錐、または当技術分野において記載されている任意の他の形状の形態である。
いくつかの態様では、磁気応答性要素は、磁鉄鉱、酸化鉄（III）、サマリウムコバルト、テルフェノール-D、または当技術分野において記載されている任意の他の磁性要素を含む。
いくつかの態様では、基材は、所定のパターンの標的要素または核酸を含む。
いくつかの態様では、基材は、所定のパターンの標的核酸を有しない。例えば、標的核酸（例えば、バイオマーカー）の空間情報は、バーコーディング組成物とのハイブリダイゼーション前に未知であってもよい。
方法
また、本明細書において、標的要素をバーコーディングまたは検出するための方法が提供される。
一局面では、該方法は、（a）標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、（i）該mRNAが、ポリA配列を含む第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；（ii）第2の核酸が、5'から3'の方向に、（1）第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および（2）第1のバーコードドメインを含む、段階、ならびに（b）該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；（c）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（d）記録核酸を検出する段階を含む。
別の局面では、該方法は、（a）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、（i）第1の核酸が、5'から3'の方向に、（1）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；（2）標的要素の核酸と実質的に相補的な第1のターゲティングドメイン；および（3）第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；（ii）第2の核酸が、5'から3'の方向に、（1）第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および（2）第1のバーコードドメインを含み、第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（b）第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；（c）任意で、プローブ-プライマー複合体を標的核酸から変性させる段階；（d）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（e）記録核酸を検出する段階を含む。
別の局面では、該方法は、（a）標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、（i）該mRNAが、ポリA配列を含む第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；（ii）第2の核酸が、5'から3'の方向に、（1）第2のハイブリダイゼーションドメインであって、該mRNAの第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および（2）第1のバーコードドメインを含む、段階、ならびに（b）該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；（c）第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸の第1のバーコードドメインと実質的に相補的な第2のバーコードドメインを含む、段階；（d）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（e）記録核酸を検出する段階を含む。
別の局面では、該方法は、（a）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸を第1の核酸にハイブリダイズさせる段階であって、（i）第1の核酸が、5'から3'の方向に、（1）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；（2）第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および（3）第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；（ii）第2の核酸が、5'から3'の方向に、（1）第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および（2）第1のバーコードドメインを含み、第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；ならびに（b）第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；（c）任意で、第1の複合体を標的核酸から変性させる段階；（d）第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸の第1のバーコードドメインと実質的に相補的な第2のバーコードドメインを含む、段階；（e）プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに（f）記録核酸を検出する段階を含む。
別の局面では、該方法は、（a）標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、（i）第1の核酸が、5'から3'の方向に、（1）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；（2）第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および（3）第1のハイブリダイゼーションドメインを含む、段階；（b）n個の追加の核酸をハイブリダイズさせ、該追加の核酸と第1の複合体とを光架橋させることによって、コンカテマーを調製する段階であって、nが、任意で、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、（i）第1のハイブリダイゼーションドメイン；（ii）バーコードドメイン；および（iii）第2のハイブリダイゼーションドメインを含み、n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；（c）第1のキャップ核酸とコンカテマーとをハイブリダイズさせ、それによりキャップされたコンカテマーを形成する段階であって、第1のキャップ核酸が、（i）第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、n番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン；および（ii）第2のキャップハイブリダイゼーションドメインを含む、段階；（d）第2のキャップ核酸をキャップされたコンカテマーにハイブリダイズさせ、それによりコンカテマー-プライマー複合体を形成する段階であって、第2のキャップ核酸が、5'から3'の方向に、（i）プライマー配列ドメイン；（ii）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および（iii）ハイブリダイゼーションドメインであって、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、ハイブリダイゼーションドメインを含み、第2のキャップ核酸の第1のキャップハイブリダイゼーションドメインの第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；ならびに（e）コンカテマー-プライマー複合体を検出する段階、またはコンカテマー-プライマー複合体から記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階を含む。
別の局面では、該方法は、（a）複数の標的の各メンバー中の標的核酸鎖と第1の核酸鎖とをハイブリダイズさせる段階であって、標的核酸鎖が、複数の標的の各メンバー中で異なり、標的核酸鎖が、別の核酸分子内に含まれるか、または、標的核酸鎖が、複数の標的の1つのメンバーとコンジュゲートされるか、または、標的核酸鎖が、細胞によって発現されるか、または、標的核酸鎖が、標的もしくは細胞上に直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくは標的結合物質／リガンドを介して間接的に提示され、かつ、（i）第1の核酸鎖が、5'から3'の方向に、（1）任意で、固有分子識別子（UMI）配列；（2）第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および（3）第1のハイブリダイゼーションドメインを含む、段階；（b）段階的な様式で1つまたは複数の追加の核酸鎖をハイブリダイズさせ、該追加の核酸鎖と第1の複合体とを光架橋させることによってコンカテマーを調製する段階であって、該光架橋させることが、試料の所定の領域を選択し、各追加の核酸鎖をハイブリダイズした後に該所定の領域を光に曝露させ、それにより相補的なハイブリダイゼーションドメインを架橋すること、および、光への曝露後かつ次の追加の核酸鎖のハイブリダイゼーション前にどんな架橋していない追加の核酸鎖も除去することを含み、かつ、各追加の核酸鎖が、5'から3'の方向に、（i）第1のハイブリダイゼーションドメイン；（ii）バーコードドメイン；および（iii）第2のハイブリダイゼーションドメインを含み、n番目の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の追加の核酸鎖の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、第1の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸鎖の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；ならびに（c）コンカテマーを検出する段階および／またはコンカテマーから記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階を含む。
本明細書に提供される局面の様々な態様では、該方法は、生体試料を調製することを含む。試料調製は、対象から生体試料を得ることを含むことができる。試料調製はまた、当技術分野において公知である方法によって細胞、組織およびオルガノイドを培養することを含むこともできる。いくつかの態様では、試料は、イメージングされる。いくつかの態様では、試料は、生細胞イメージングを受ける。いくつかの態様では、試料は、イメージングのために固定および透過処理される。試料が調製される時間は、当業者によって決定され得る。
本明細書に提供される局面の様々な態様では、該方法は、試料中の標的核酸をイメージングおよびバーコーディングすることを含む。本明細書に提供される試料は、インサイチュー逆転写、A-テーリング、および任意でインサイチューハイブリダイゼーション（ISH）、免疫蛍光（IF）、または他の免疫組織化学的方法を受けることができる。
本明細書に提供される局面の様々な態様では、該方法は、2つ以上の核酸鎖を光架橋することを含む。光架橋は、任意の必要な条件下で実施することができる。いくつかの態様では、光架橋は、水溶液中で実施することができる。
光架橋に使用される光は、光反応性要素に依存する。一般に、光架橋は、350～400nmの波長の光を使用する。好ましくは、光架橋は、約365nmの波長を有する光源を使用する。
いくつかの態様では、該方法は、例えば、任意の残留試薬および／または核酸鎖を洗い流すための、1つまたは複数の洗浄工程をさらに含む。
本明細書に記載される様々な方法のいくつかの態様では、標的要素、例えば、標的核酸は、標的結合リガンドとコンジュゲートさせることができる。例えば、標的核酸は、バーコーディングおよび／または検出しようとする実際の標的要素に結合するために標的結合要素とコンジュゲートさせることができる。
本明細書に記載される様々な方法のいくつかの態様では、標的核酸は、生体物質中に含まれる。例えば、標的核酸は、標的細胞によって発現させることができ、標的核酸は、標的分子または細胞上に、例えば直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくはアダプター分子、例えば標的結合リガンドを介して間接的に提示することができる。
本明細書に記載される様々な方法のいくつかの態様では、標的要素、例えば、標的核酸は、基材表面上に固定される。標的要素、例えば、標的核酸は、基材表面上に所定のパターンで固定させることができる。
いくつかの態様では、該方法は、照射または検出のための関心対象の1つまたは複数の特定の領域を選択する段階をさらに含む。該選択は、手作業でもコンピュータを利用してもよい。一般に、選択は、1つまたは複数の表現型マーカーに基づく。照射または検出のための関心対象の1つまたは複数の特定の領域を選択するための例示的な表現型マーカーとしては、蛍光、形状、または形態学が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、表現型マーカーは、蛍光、形状、強度、組織染色、抗体染色、または形態学である。
本明細書に記載される様々な局面のいくつかの態様は、空間照射または検出のための関心対象の1つまたは複数の領域を自動で検出および処理するためのソフトウェアをさらに含む。
本明細書に提供される局面の様々な態様では、該方法は、記録鎖抽出および配列決定を含む。記録物抽出は、RNase H置換および／またはインサイチューもしくはインビトロhopPER合成によって実施することができる。いくつかの態様では、鎖は、当技術分野において公知であるカラムまたはビーズに基づく精製法によって精製することができる。次に、鎖は、検出および／または配列決定のためにPCRによって増幅させることができる。任意で、アンプリコンを、ライブラリ調製のために二次増幅工程および／またはアダプターライゲーションと一緒に精製することができる。任意で、rRNAを当技術分野において公知である方法によって低減させることもできる。
諸局面のいずれかのいくつかの態様では、該方法を、合成されたcDNAライブラリの5'末端に適用することができる。
いくつかの態様では、該方法は、ブロッキングドメインとしての役割を果たす光反応性剤を利用することができる。いくつかの態様では、光反応性剤は、CNVKである。
記録鎖を検出するための例示的な方法としては、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、および／または肉眼が挙げられるが、それらに限定されない。
諸局面のいずれかのいくつかの態様では、該方法は、記録鎖を、例えば、検出前に増幅させることをさらに含む。本明細書において使用される場合、「増幅させる」という用語は、反応の成分のすべてが完全である場合にポリヌクレオチドの増幅を可能にするのに十分な条件に、核酸配列を供する工程のことを指す。増幅反応の成分は、例えば、プライマー、ポリヌクレオチドテンプレート、ポリメラーゼ、ヌクレオチドなどを含む。「増幅させる」という用語は、典型的には、標的核酸の「指数関数的」増加のことを指す。しかしながら、「増幅させる」は、本明細書において使用される場合、サイクル配列決定を用いて得られるような、選択した核酸の標的配列の数の線形増加のことも指すことができる。核酸配列を増幅および合成する方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第7,906.282号、第8,367,328号、第5,518,900号、第7,378,262号、第5,476,774号、および第6,638,722号を参照されたく、そのすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様では、記録鎖を増幅させることは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む。PCRは、当業者に周知である；例えば、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号；ならびにPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990を参照されたく、そのすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。例示的なPCR反応条件は、典型的には、2工程サイクルまたは3工程サイクルのいずれかを含む。2工程サイクルは、変性工程とそれに続くハイブリダイゼーション／伸長工程を有する。3工程サイクルは、変性工程とそれに続くハイブリダイゼーション工程とそれに続く別個の伸長工程を含む。
いくつかの態様では、増幅工程は、増幅工程に無関係な（orthogonal）ヘアピンを有する追加のポリヌクレオチド配列またはテンプレートを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、そのような追加のDNAヘアピンは、オフターゲット反応を低減または補正することができる。例えば、3文字コードが使用される場合、これらの追加のヘアピンを含む配列またはテンプレートは、一部の試料に存在し得る微量の不要なヌクレオチドを取り込む役目を果たすことができる。
いくつかの態様では、記録鎖を増幅および／または配列決定する前に、2つの核酸鎖を連結している光架橋を切断する、脱架橋させる、除去する、または逆転させることができる。光架橋は、約315nmの波長を有する光源を使用した光を使用して、切断する、脱架橋させる、除去する、または逆転させることができる。
記録鎖は、核酸配列決定技術を使用して読み取ることができる。いくつかの態様では、記録鎖の配列は、検出可能部分、例えば、フルオロフォア、量子ドット、ペプチドタグ、ビーズ（例えば、アガロース、ラテックス、磁気応答性、クロマチック）、高分子ドット、ナノ粒子、追加のドッキング部位、ビオチンなどのタグ、または、それらの存在が、例えば、蛍光顕微鏡検査、蛍光スキャナー、光学スキャナーなどによって検出され得るような官能基で標識された相補的配列の使用を通じて決定することができる。
本明細書に提供される局面のいずれかのいくつかの態様では、該方法は、関心対象の所定の領域中の生体分子をバーコーディングすることを含む。例えば、全組織、組織領域、細胞収集物、単一細胞、細胞内領域、微生物、および表面。マルチモーダル統合解析のために各領域をタグ化するために、イメージングに基づく方法および／または配列決定を上記のとおり使用することができる。
本明細書に提供される局面のいずれかのいくつかの態様では、該方法は、選択された関心対象の領域のマルチモーダル統合解析のために、生体分子をバーコーディングして、配列決定リードを空間位置に遡って関連付ける空間タグを作製することを含む。
本明細書に提供される方法は、様々な疾患および障害のための候補処置（例えば、小分子薬、生物製剤、治療用核酸、遺伝子または細胞療法、siRNA、gRNA、プラスミド、ファージ、ウイルス、ペプチド、タンパク質、抗体、代謝物質、ホルモン、DNAコードライブラリ）のライブラリをスクリーニングするために使用することができる。いくつかの態様では、表現型アウトカムは、イメージングによって特定される。選択された領域は、本明細書に提供される方法を使用した配列決定に基づく分析のために光曝露によってバーコーディングすることができる。
本明細書に提供される方法を使用して、様々な疾患および障害のための新規治療および診断を特定することができる。小分子薬、生物製剤、治療用核酸、遺伝子または細胞療法、siRNA、gRNA、ペプチド、タンパク質、抗体、代謝物質、ホルモン、DNAコードライブラリをスクリーニングして、薬物標的および／またはバイオマーカーを特定することができる。本明細書に提供される方法の用途の非限定例としては、薬物スクリーニング、バイオマーカーの特定、プロファイリング、遺伝子型に対する表現型の細胞状態の特性評価、新たな疾患モデルの作製、細胞および疾患モデルの特性評価、分化状態および細胞状態の特性評価、組織マッピング、多次元分析、ハイコンテントスクリーニング、機械学習に基づくクラスタリングまたは分類、細胞療法開発、CAR-T療法開発、抗体スクリーニング、個別化医療、および細胞濃縮が挙げられる。
デバイス
本明細書に記載される方法は、デバイス上で実施することができる。例えば、本明細書に記載される方法は、光源および試料ホルダーを含むデバイス上で実施することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、光源、光学マスクまたはデジタルマイクロミラーデバイスおよび試料ホルダー、および任意で光を集束するための1つまたは複数のレンズを含むデバイス上で実施することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、光源、光学マスクまたはデジタルマイクロミラーデバイス、試料ホルダーおよび流体またはマイクロ流体システムを含むデバイス上で実施することができ、該デバイスは、自動化用に構成される。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、バーコード組成物が所定の工程で試料上に送達されるように構成された流体システムを含むデバイス上で実施することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、光源、光学マスクまたはデジタルマイクロミラーデバイス、カメラ、流体またはマイクロ流体システムおよび一連のソフトウェアツールを含むデバイス上で実施することができ、該デバイスは、細胞および／またはバーコード割り当てを自動で特定するように構成される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、センサーを含むデバイス上で実施することができ、該デバイスは、本明細書に記載される方法からのシグナルに応答するように、およびバーコード組成物の送達を調整／調節するように構成される。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、センサーおよび流体デバイスを含むデバイス上で実施することができ、該デバイスは、1つまたは複数の取得画像からの外部入力および／または本明細書に記載される方法からのシグナルに応答するように、ならびにバーコード組成物の送達を調整／調節するように構成される。
本明細書に記載されるバーコード組成物をデバイスに含めることができることが留意される。例えば、デバイスは、本明細書に記載されるバーコード組成物を含むことができ、該デバイスは、自動化のためにバーコード組成物が所定の工程で試料上に送達される機構を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されるデバイスは、試料ホルダーを含み、該試料ホルダーは、本明細書に記載されるバーコード組成物の自動化送達用に構成される。いくつかの態様では、本明細書に記載されるデバイスは、試料ホルダーを含み、該試料ホルダーは、本明細書に記載されるバーコード組成物を固定するように構成される。本明細書に記載されるバーコード組成物を含むデバイスは、既存のデバイスおよびワークフローに取り付けるおよび／またはそれを補強するように、構成することができる。
いくつかの態様では、デバイスは、本明細書に記載されるバーコード組成物の1つまたは複数の成分を保持するためのリザーバーを含むことができる。例えば、該デバイスは、光反応性要素を含む核酸鎖、例えば、CNVK修飾されたバーコーディング鎖を保持するためのリザーバーを含むことができる。
別の局面では、本明細書において、本明細書に提供される方法において使用するためのデバイスが提供され、該デバイスは、光源および試料ホルダーを含む。いくつかの態様では、該デバイスは、本明細書に提供されるバーコード組成物を試料ホルダー中に含む。
いくつかの態様では、該デバイスは、光学マスクまたはデジタルマイクロミラーデバイスをさらに含む。いくつかの態様では、該デバイスは、光を集束するための少なくとも1つのレンズをさらに含む。該局面のいずれかのいくつかの態様では、本明細書に提供される光源は、UV光源、ランプ、LED、少なくとも1つのレーザーまたは二光子レーザーであって、レンズシステム、フォトマスク、デジタルマイクロミラーデバイス、ピンホールおよび／または構造化照明による変調を受けたものまたは受けていないものである。
いくつかの態様では、該デバイスは、筺体を含む。いくつかの態様では、該デバイスは、流体またはマイクロ流体システムをさらに含む。いくつかの態様では、該デバイスは、本明細書に提供される組成物を所定の工程で試料ホルダーに送達するための流体またはマイクロ流体システムを含む。マイクロ流体システムは、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許出願第16/125,433号；同第16/134,746号；米国特許第9,694,361 B2号；同第5,876,675 A号；同第6,991,713 B2号；およびWO2001/045843A2に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様では、該デバイスは、検出器をさらに含む。いくつかの態様では、該デバイスは、カメラをさらに含む。
いくつかの態様では、該デバイスは、本明細書に提供される方法によって検出されたバーコードを処理するための構成要素を含む。いくつかの態様では、該デバイスは、細胞および／またはバーコード割り当てを自動で特定するためのソフトウェアを含む。
いくつかの態様では、該デバイスは、架橋可能な鎖を含有するリザーバーを含む。いくつかの態様では、該デバイスは、CNVK修飾されたバーコーディング鎖を含有するリザーバーを含む。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるデバイスは、本明細書に提供される組成物の送達を可能にする自動化された特徴を有する。
いくつかの態様では、該デバイスは、本明細書に提供される組成物を固定するように設計された試料ホルダーを含む。
いくつかの態様では、該デバイスは、センサーを含む。いくつかの態様では、該デバイスは、センサー、取得画像からの外部入力、本明細書に提供される検出されたシグナルに応答する、ならびに本明細書に提供される組成物の送達を調整する流体デバイスを含む。
いくつかの態様では、該デバイスは、顕微鏡および／またはコンピュータシステムに取り付けられる。
定義：
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および語句の意味を以下に与える。別途指定されるまたは文脈から黙示的である場合を除き、以下の用語および語句は、以下に与える意味を含む。別途明示的に指定されるまたは文脈から明白である場合を除き、以下の用語および語句は、その用語および語句が、それが関係する技術分野において獲得されている意味を排除するものではない。定義は、本明細書に提供される局面の特定の態様を説明する上で助けとなるように与えられるものであり、本発明の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特許請求された発明を限定することを意図するものではない。さらに、文脈により別途必要とされる場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；および Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway’s Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)；Lewin’s Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見いだすことができ、それらの内容はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書において使用される場合、「核酸」は、DNA、RNA、一本鎖、二本鎖、またはより高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフ、およびそれらの任意の化学修飾のことを意味する。
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性のことを指し、一般に、2標準偏差（2SD）またはより大きな差のことを意味する。
本明細書において使用される場合、「～を含む（comprising）」または「～を含む（comprises）」という用語は、方法または組成物にとって必須であるものの、必須であるか否かにかかわらず、明記されていない要素を含める余地のある、組成物、方法およびそれらの各成分に関して使用される。
本明細書において使用される場合、「～から本質的になる」という用語は、所与の態様にとって必要な要素のことを指す。この用語は、本発明のその態様の基本的かつ新規または機能的な特徴に著しい影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
単数形の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に別途指示する場合を除き、複数形の指示対象を含む。同様に、「または/もしくは」という単語は、文脈が明確に別途指示する場合を除き、「および/ならびに」を含むことが意図される。本開示を実施または試験する際には本明細書に提供されるものと類似または同等な方法および材料を使用することができるが、以下には好適な方法および材料を記載している。「例えば（e.g.）」という略語は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非限定例を示すために使用される。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義である。
さらに、文脈により別途必要とされる場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
実施例または別途指示がある場合を除き、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数値はすべて、あらゆる場合に、「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。「約」という用語は、百分率に関連して使用される場合、±1％を意味することができる。
「実質的に同一な」という用語は、2つ以上のヌクレオチド配列が、少なくとも65％、70％、80％、85％、90％、95％、または97％同一のヌクレオチドを有することを意味する。いくつかの態様では、「実質的に同一な」は、2つ以上のヌクレオチド配列が、同じ同一のヌクレオチドを有することを意味する。
本明細書において使用される場合、「相補的」という用語は、一般に、2セットの核酸間のハイブリダイズによる対合または結合相互作用の可能性のことを指す。相補的核酸は、標準的なワトソン・クリック塩基対合および非ワトソン・クリック塩基対合（例えば、揺らぎ塩基対合およびフーグスティーン塩基対合）に従う水素結合対合を通じて互いに結合可能である。いくつかの態様では、2セットの核酸は、互いに100％相補的であり得る。他の態様では、2セットの核酸は、相補的ではない1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはより多くのヌクレオチドを含み得る。他の態様では、2セットの核酸は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％相補的であり得る。いくつかの態様では、2セットの核酸は、これらが安定したまたは一過性の複合体を形成可能である限り、相補的である。「相補的」配列は、本明細書において使用される場合、それらのハイブリダイズ能に関する上記要件が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対ならびに／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含んでもよく、あるいはそれらから全体的に形成されてもよい。そのような非ワトソン・クリック塩基対としては、G：U揺らぎ塩基対合またはフーグスティーン塩基対合が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「ハイブリダイゼーションドメイン」という用語は、一般に、第1の核酸または第2の核酸のいずれかの一部分のことを指し、第2の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインは、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である。いくつかの態様では、ハイブリダイゼーションドメインは、本明細書に定義されるように、光反応性鎖である。いくつかの態様では、ハイブリダイゼーションドメインは、本明細書に定義されるように、相補的鎖である。いくつかの態様では、2つの交互のハイブリダイゼーションドメインは、単一の架橋鎖および単一の相補的鎖のことを指す。
本明細書において使用される場合、「プローブドメイン」または「ターゲティングドメイン」という用語は、一般に、標的要素と相補的である第1の核酸の一部分のことを指す。
本明細書において使用される場合、「付着核酸鎖」は、本明細書に提供される核酸が本明細書に提供される別の核酸または基材と会合する、それに架橋する、その中に埋め込まれる、またはそれに係留する、それと共有結合によりもしくは非共有結合により相互作用することを可能にする、任意の核酸のことを指す。いくつかの態様では、付着核酸鎖は、バーコードドメインおよびハイブリダイゼーションドメインを含み、ハイブリダイゼーションドメインは、任意で、光反応性要素を含む。いくつかの態様では、付着核酸鎖は、第1の核酸の少なくとも一部と実質的に相補的である。
本明細書において使用される場合、「バーコードドメイン」は、空間情報、配列決定情報を表すおよび／またはデータをコードする核酸配列を含む、バーコード鎖の一部のことを指す。バーコードドメイン配列は、バーコードライブラリによって事前決定されることができる。バーコードドメインは、DNA、RNA、合成核酸塩基またはそれらの任意の組み合わせを含む配列であることができる。バーコードドメインは、ビット値に割り当てることができる。例えば、各バーコードドメインは、独立に、ビット値に割り当てることができる。ビット値は、0および1に限定されないことが留意される。バーコードドメインを含む核酸鎖はまた、本明細書においてバーコード鎖と称することもできる。
本明細書において使用される場合、「バーコードライブラリ」という用語は、保存された核酸配列と関連情報の集合体である。各配列および関連情報は、配列、パターン、構造およびラベルなどの情報のデータベースに保存される。バーコードライブラリを使用して、各バーコード鎖に含有される特別情報を解読または読み取ることができる。また、バーコードライブラリを使用して、コンカテマーのデータ保存、書き込みおよび読み取りのためにコンカテマーパターンを事前決定することもできる。いくつかの態様では、第1および／または第2の核酸のバーコードドメインは、最小ハミング距離4を有するバーコードライブラリから選択される。
本明細書において使用される場合、「核酸コンカテマー」という用語は、一般に、少なくとも3つの核酸バーコードを含む核酸のことを指す。核酸コンカテマーは、光反応性ヌクレオチドを介して互いに共有結合で連結された核酸バーコードを含み得る。いくつかの態様では、核酸コンカテマーは、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも10個の核酸バーコードを含み得る。いくつかの態様では、核酸コンカテマーは、各々データを包含する少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも10個のバーコード鎖を含み得、例えば、各バーコード鎖は、独自に／独立に、空間情報または配列決定情報に割り当てられ得る。
本明細書において使用される場合、「空間情報」という用語は、バーコードに保存することができる、生体組織またはマトリックス中の任意の情報、座標、マーカーである。空間情報は、基材上の特定のマーカー、バーコードまたはパターンが位置する場所を当業者に知らせることができる。例えば、空間情報は、核酸バーコードを含む画像またはQRコードを作成する際に有用であり得る。空間情報はまた、特定の核酸標的の検出においても有用であり得る。
本明細書において使用される場合、「作用物質」という用語は、合成または生体起源の任意の物質、化学構成成分、化学分子のことを指す。
本開示は、本明細書に提供される特定の方法論、プロトコルおよび試薬などに限定されないこと、よって変動し得るものと理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明する目的でしかなく、特許請求の範囲によってのみ定義される本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、実施例は、さらなる限定として解釈されるべきではない。
実施例1：光誘導型生体分子バーコーディングの概要
単一細胞配列決定は、定量的な細胞レベルのトランスクリプトミクス情報を提供することにより、生物学に対する重要で新しい解釈を明らかにした。しかし、マルチスケールの空間情報は、細胞下レベルのものも、組織内に位置する細胞レベルのものも、細胞レベル配列決定のために細胞を解離させる過程で失われる。本明細書において、光誘導型バーコーディングとそれに続く配列決定のための方法であって、固定された配列にインサイチューで結合するバーコード配列を用いた、固定された生体分子の、長さスケール（細胞下～大きな組織）にわたるプログラム可能なラベリングを可能にする方法が提供される。連結されたバーコードおよびインサイチュー配列を、次世代配列決定プラットフォームで読み出して、配列と空間の統合情報を提供することができる。
細胞がどのように機能し、分化し、環境因子に応答するのかを理解するために、単一細胞のその天然環境における分子状態をプロファイリングできるハイスループットな方法が必要不可欠である。次世代配列決定法は、細胞集団からの数千の別個の転写物の同時検出によって細胞多様性を特性評価することを可能にする。さらに最近では、これらのアプローチが、単離された細胞または核の元となる転写物情報を追跡することに依拠するDrop-Seqに似た単一細胞RNA-Seq（scRNA-Seq）法によって、個々の細胞のトランスクリプトームプロファイリングにさらに拡張された。次に、配列決定リードアウトを使用して、リードプロファイルのクラスタリングにより細胞の種類および状態を定義することができる。しかしながら、これらの方法は、セルソーター、マイクロウェルまたはマイクロフルイディクスのような特殊な装置を必要とし、限定されたスループットを提供する。さらに重要なことに、本来得られたリードは、分子プロファイルを、組織中の個々の細胞の元の位置に関連付け、さらにはこれらの細胞内の関心対象の分子の細胞内局在にも関連付けることを可能にする、空間情報を欠いている。
単一分子FISH（smFISH）におけるような顕微鏡検査による試料の直接イメージングは、配列情報と空間的状況との調和を提供する。しかしながら、FISHアプローチは、低いシグナル対バックグラウンドおよび低多重化という課題を抱えている。高い自家蛍光および散乱を有する組織試料において信頼性のあるRNA検出ができるようシグナルレベルを改善するために、いくつかの研究は、FISHを、ローリングサークル増幅（RCA）、ハイブリダイゼーション連鎖反応（HCR）、分岐DNAアッセイ（bDNA）、交換反応によるシグナル増幅（SABER）またはクランプFISHのようなアプローチを使用して蛍光をスポット当たりであるが同じ標的上の多数の蛍光オリゴヌクレオチドを限局して改善する、シグナル増幅と統合させた。
スペクトルの重なりが原因で、同じ試料の多重化解析もまたかなり制限されており、ロープレックス（一度に3～4つの標的）の調査しかできない。多重化の制限は、反復交換ラウンドのフルオロフォアまたはプローブ、コンビナトリアル蛍光バーコーディングまたはインサイチュー配列決定を介して克服されてきた。交換－イメージング法は、規模拡大するのに時間がかかるが、コンビナトリアル蛍光ラベリングまたはインサイチュー配列決定に依拠する方法は、標的が、空間的に分離されて固有の斑点として解像可能であることを要求するので、一般に、低存在量の転写物に対してより確実に機能する。これは、とりわけ、インサイチュー酵素反応からのノイズおよびバイアス、ならびにリード深度、リード長およびベースコールエラーに関するインサイチュー配列決定の制限が考慮される場合に、細胞当たり入手可能なリードの数に上限を課し、低い検出感度を導く。最新の改善をもってしても、これらの方法の検出効率は、smFISHの＜50％であった。コンビナトリアルラベリング法を、局在顕微鏡検査および拡大顕微鏡検査のような超解像アプローチと組み合わせることは、超解像情報をさらに提供する一方で、データ取得は、イメージング時間が長くなるにつれ、また体積に合わせて拡大するにつれ、抑制的に遅くなる。さらに、光学的要素は最終結果に強い影響を与えるので、イメージングアッセイへの異なるフルオロフォアの使用だけでなく、カメラ、対物レンズ、ピンホール、光源のような光学的要素の設定ごとの変動も、光収集、ノイズ、色収差、照射野の平坦度、焦点外蛍光、スペクトラルブリードスルー、光退色、消光のような側面を変化させる。
空間情報を単一細胞配列決定技術と組み合わせるための新たに出現した戦略は、プリンティングまたは連結することを介して空間位置ごとに固有のDNA配列（すなわちDNAバーコード）がプレバーコーディングされた、オリゴヌクレオチド捕捉アレイまたは表面を利用することである。これらのDNAバーコードは、その後、バーコーディングされた各空間位置の近くで関心対象の分子と会合し、最後に配列決定されて、補足された標的ごとに空間情報が検索およびマッピングされる。他の最近の進歩は、オルガネラのような分子目印への近接度、細胞膜の透過処理の差またはRNAのプロセシング段階に基づいた、転写物の細胞内分布情報の部分的検索を可能にする。また、近くの配列を物理的に一緒に結合する方法を使用して、RNA転写物およびゲノムリードを互いの近接度によってグループ分けすることもできる。
これらのすべての制限にまとめて取り組むために、予めパターニングされた捕捉アレイの必要も、試料の破壊もなく、インサイチューで、空間情報を各標的分子上に直接エンコードする、光に基づく空間バーコーディングおよびハイスループット配列決定戦略が開発された。本明細書において、指定された空間位置でバーコード鎖を標的分子に選択的に架橋するために使用される、DNAフォトリソグラフィの方法が提供される。
本明細書に提供される方法は、標的分子ごとに細胞内解像を伴う絶対空間情報を保存しながら、ハイスループットで高度に多重化された次世代配列決定の能力を、FISHの検出感度およびサンプリング効率と、拡張可能な様式で調和する。これは、既存の単一細胞配列決定法を補完し、試料のプロービングを所望の解像度レベルで可能にすると共に、関心対象の領域をマーカーに基づきさらに規定する可能性を有する。また、この追加の柔軟性を使用して、細胞の解離も、機能的もしくは空間的マーカーのすぐ近くの分子サブセットの近接度に基づいたラベリングもなしに、インサイチューでFACS様ソーティングを達成することもできる。
本方法：本明細書に提供される光誘導型生体分子バーコーディング法の基本戦略は、高速のDNA架橋化学および空間的に限局された光パターンを活用して、DNAバーコードを大規模並列方式で空間的にアドレスかつプリンティングする。この架橋設計は、配列特異的かつ可逆的であり、これは、バーコード検索用に操作できる固有の架橋幾何学を可能にする。
実施例2：バーコーディングのための反応化学
戦略1：二重光誘導型バーコーディング：
第1の戦略は、2種類の波長の光を利用して、プライマーを関心対象のプローブ／転写物に架橋（約365nm）し、続いて、架橋逆転工程（約312nm）を行う（図1A～1Dを参照のこと）。標的指向化アプローチでは、関心対象のゲノム配列、トランスクリプトーム配列または他の配列と相補的になるように設計されたプローブが、インサイチューでハイブリダイズする（図1A）。2番目のハイブリダイゼーション工程によって、フォワードプライマー（For）、任意で固有分子識別子（UMI）およびバーコード配列（紫色）を含む5'末端上の追加のドメインに加えてプローブと相補的な領域中にCNVK修飾を含有する、プライマーが結合する。UV光（およそ365nm）下で照射すると、プライマーは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになり、ポリメラーゼを使用して完全記録鎖がコピーされる。これは、プローブ-プライマー複合体が試料から変性された後に行われてもよく、あるいは鎖置換ポリメラーゼを使用して記録鎖をインサイチューで置換してもよい。架橋は、およそ312nmのUV光を使用して逆転される。記録鎖は、バーコード／UMIとプローブ配列／アイデンティティの統合情報を回収するために、最終的に配列決定する前にPCR増幅させてもよい。
標的指向化アプローチを使用して、試料中または表面上に固定された他の核酸、例えば、関心対象のタンパク質標的に結合したDNAコンジュゲート抗体に結合させることもできる（図1B）。一般に、関心対象の鎖で標識できるまたはそれに架橋できる任意のエンティティを、この戦略を用いて記録することができる。
非標的指向化アプローチでは、プライマーが、関心対象の標的中の保存されたまたは豊富な配列に結合する。例えば、3'末端上にポリA配列を有するmRNAを、1つまたは複数のポリT配列を含む相補的なCNVK含有配列ドメインを介して、バーコード含有プライマーに結合させてもよい（図1C）。プライマーは、CNVK含有ドメインに加えて、プライマードメイン（For）、任意で固有分子識別子（UMI）ドメイン、バーコードドメイン（バーコード／Bar）を含有する。次に、架橋を逆転させる前または後に、逆転写酵素を使用してプライマーを伸長させ、mRNA配列をコピーすることができる。次に、配列決定のために、バーコードとmRNA配列の統合情報を含有する記録配列を、標準的な方法で、例えばPCR増幅が可能になるように記録鎖の3'末端上にプライマーを付加するテンプレートスイッチングオリゴ（TSO）を利用することによって調製する。記録物の配列決定を用いて、RNA転写物とバーコード配列の統合データを回収する。RNAおよびDNA分子の他の種類および／または部分を、プライマーライブラリおよび／またはランダム配列を有するプライマーの使用を通じて調べることができる。
戦略2：ブリッジ配列を用いた光誘導型バーコーディング：
第2の戦略は、CNVK含有配列を半相補的または完全相補的な配列に架橋するためにたった一種類の波長の光（約365nm）と、架橋の逆転の必要がないブリッジ配列を使用する（図2A～2Dを参照のこと）。
標的指向化アプローチでは、関心対象のゲノム配列またはトランスクリプトーム配列と相補的になるように設計されたプローブが、インサイチューでハイブリダイズする（図2A～2B）。2番目のハイブリダイゼーション工程によって、バーコードドメイン（バーコード*）に加えてプローブと相補的な領域中にCNVK修飾を含有するブリッジ配列が結合する。UV光（およそ365nm）下で照射すると、ブリッジは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになる。プローブ－ブリッジ複合体の変性後、プライマーがハイブリダイズする。このプライマーは、フォワードプライマー配列（For）、任意で固有分子識別子（UMI）、ブリッジと相補的なバーコード配列（バーコード）、およびプローブ－ブリッジジャンクションを越えることが可能となるプローブオーバーハングと相補的な短い3'オーバーハングを含有する（図2A）。ポリメラーゼを使用して完全記録鎖がコピーされる。記録鎖は、バーコード／UMIとプローブ配列／アイデンティティの統合情報を回収するために、最終的に配列決定する前にフォワード（For）およびリバース（Rev）プライマーでPCR増幅させてもよい。鎖置換ポリメラーゼを使用して記録物をコピーする場合、変性工程を省略することができ、プライマーをインサイチューでプローブ－ブリッジ複合体に直接ハイブリダイズさせてもよい（図2B）。
非標的指向化アプローチでは、ブリッジが、関心対象の標的中の保存されたまたは豊富な配列に結合する。例えば、3'末端上にポリA配列を有するmRNAを、1つまたは複数のポリT配列を含む相補的なCNVK含有配列ドメインを介して、バーコード含有ブリッジに結合させてもよい（図2C～2D）。プライマーは、プライマードメイン（For）、任意で固有分子識別子（UMI）ドメイン、およびブリッジ鎖上のバーコードドメイン（バーコード*）に結合するバーコードドメイン（バーコード）を含有する。次に、架橋を逆転させる前または後に、逆転写酵素を使用してプライマーを伸長させ、mRNA配列をコピーすることができる。次に、配列決定のために、バーコードとmRNA配列の統合情報を含有する記録配列を、標準的な方法で、例えばPCR増幅が可能になるように記録鎖の3'末端上にプライマーを付加するテンプレートスイッチングオリゴ（TSO）を利用することによって調製する。記録物の配列決定を用いて、RNA転写物とバーコード配列の統合データを回収する。RNAおよびDNA分子の他の種類および／または部分を、プライマーライブラリおよび／またはランダム配列を有するプライマーの使用を通じて調べることができる。
戦略3：コンカテマーアセンブリを用いた光誘導型バーコーディング：
第3の戦略も同じく、CNVK含有配列を半相補的または完全相補的な配列に架橋させるためにたった一種類の波長の光（約365nm）を使用する。この戦略は、多本鎖複合体（コンカテマー）がアセンブリされるような複数ラウンドの架橋を同じ領域または配列に対して行うことを利用する（図3A～3Cを参照のこと）。次に、クロスジャンクション合成を使用して、コンカテマー上のバーコード配列の鎖を配列決定可能な記録鎖にコピーすることができる。
標的指向化アプローチでは、関心対象のゲノム配列またはトランスクリプトーム配列と相補的になるように設計されたプローブが、インサイチューでハイブリダイズする（図3A～3C）。2番目のハイブリダイゼーション工程によって、鎖の一端のプローブ上のオーバーハングと相補的な領域中のCNVK修飾、鎖の中央のバーコード配列ドメイン、およびもう一方の端の別のCNVK含有バーコード鎖と相補的な領域を含有する、バーコード配列が結合する。UV光（およそ365nm）下で照射すると、第1のバーコードは、プローブ配列に共有結合で連結される（架橋される）ようになる。その後、第2のバーコード鎖は、コンカテマーにハイブリダイズし、架橋することができる。さらなる鎖を架橋して、コンカテマー配列を繰り返しアセンブリしてもよい。結合している最後のコンカテマーバーコード鎖（「キャッピング」バーコード鎖）は、「キャッピング」プライマーの結合部位を含有し、コンカテマーアセンブリに架橋しても、架橋しなくてもよい。
導入された最終鎖は、フォワードプライマー配列（For）、任意で固有分子識別子（UMI）、および「キャッピング」バーコード鎖と相補的なプライマー配列を含有する、「キャッピング」プライマーである。次に、鎖置換ポリメラーゼを使用し、クロスジャンクション合成反応を通じて完全記録鎖をコピーすることができ、これは、基材からの変性前（図3B）または後（図3C）のいずれかに行うことができる。記録鎖は、バーコード／UMIとプローブ配列／アイデンティティの統合情報を回収するために、最終的に配列決定する前にフォワード（For）およびリバース（Rev）プライマーでPCR増幅させてもよい。コンカテマーアセンブリは、プローブ配列の3'オーバーハング上に描写しているが、代替的に、プローブ配列がコピーされた後にクロスジャンクション合成が起こるように、5'オーバーハング上で行ってもよい。この戦略はまた、同じバーコード配列をコンカテマー全体にわたって再使用することを可能にし、コンビナトリアルなアセンブリ法であると考えることができる。
標的指向化アプローチを使用して、試料中または表面上に固定された他の核酸、例えば、関心対象のタンパク質標的に結合したDNAコンジュゲート抗体に結合させてもよい（図3Bを参照のこと）。一般に、関心対象の鎖で標識できるまたはそれに架橋できる任意のエンティティを、この戦略を用いて記録することができる。
また、コンカテマーアセンブリを、戦略1および2に記載の方法と同じく、バーコード鎖の結合ドメインのオーバーハング上にコンカテマーをアセンブリすることによって非標的指向化アプローチと組み合わせてもよい（例えば、図3A～3Cを参照のこと）。コンカテマーを、テンプレートスイッチングオリゴ（TSO）の5'オーバーハング上に形成させてもよい。
変法に関する注記：
バーコードドメインは、0～100ヌクレオチド長またはより長くてもよく、1文字、2文字、3文字または4文字コード配列を使用してよい。これらはまた、修飾、非天然または縮重塩基を含有してもよい。
UMIドメインは、任意で、バーコード鎖および／またはプローブ鎖中に含まれてよい。
UMIドメインは、塩基付加化学合成の間にヌクレオチドのミックスを使用してランダム配列（縮重配列）のライブラリを作製することによって合成してもよい。これらは、公知のヌクレオチド配列がインターカレーションされているまたはされていない、縦に並んだいくつかのそのようなランダム塩基からなり得る。
すべての鎖中のすべてのドメインは、1文字、2文字、3文字または4文字コード配列であることができる。これらはまた、修飾、非天然または縮重塩基を含むこともできる。
提示したアプローチを使用して、任意でより高いレベルのパターニング、マスキングおよび捕捉用のオリゴヌクレオチドアレイとして利用できる、パターニングおよびバーコーディングされた表面を作製することができる。
標的指向化アプローチを使用して、試料中または表面上に固定された他の核酸、例えば、関心対象のタンパク質標的に結合したDNAコンジュゲート抗体に結合させてもよい（図1Bを参照のこと）。一般に、関心対象の鎖で標識できるまたはそれに架橋できる任意のエンティティ（核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、糖類、小分子、ナノ粒子、ビーズ、ガラス表面など）を、この戦略を用いてパターニング、バーコーディングおよび記録することができる。
架橋逆転（戦略1）は、ポリメラーゼによる記録物合成の前または後に実施してもよい。
架橋逆転（戦略1）は、尿素、塩化グアニジニウムもしくはホルムアミド含有緩衝液中などのカオトロピックもしくは変性条件下、または低塩条件下で実施することができる。
架橋逆転（戦略1）は、高温条件下で実施することができる。
架橋逆転（戦略1）は、鎖置換ポリメラーゼの存在下で実施してもよい。
バーコードドメインは、戦略2のための結合ドメイン（例えば、mRNAのポリAテールに結合するドメイン）の5'または3'にあり得る。
コンカテマーアセンブリアプローチ（戦略3）では、任意のラウンド数を使用して、任意の長さのコンカテマー（例えば、1、2、3もしくは最大で500またはより長い鎖を含む）を生成することができる。
コンカテマーアセンブリアプローチでは、ラウンド当たり2～100またはより多くの範囲の別個のバーコード配列。
PCRは、記録物の配列決定の前に実施することができる。記録物はまた、さらに処理して、次世代配列決定のために調製してもよい。
UMIは、任意で、プライマーおよび記録配列から除外することができる。
バーコード鎖は、ポリメラーゼによる伸張を阻害するための修飾を3'末端上に含むことができる。これらは、代替的に、伸張を防ぐための一連のT塩基のような「テール」を含有してもよい。これらはまた、ポリメラーゼによる伸張から保護され得ない。
いくつかの変法において、アンプリコンのいずれかの側のプライマー（例えば、ForドメインおよびRevドメイン）は、同一であってよい。
CNVK塩基を利用した架橋に代わる手段は、バーコード鎖の5'末端上に、バーコード鎖をプローブまたは他の配列の3'末端にライゲーションするのを可能にする光切断性スペーサーを使用することである。切断されない鎖は、プローブ／標的に共有結合で連結されず、後続のバーコーディングラウンドの前に洗い流すことができるだろう。
架橋は、UV（300～400nm）もしくは近UV波長（400～500nm）で、または2光子照射を使用することによってより高い波長で実施することができる。
架橋の逆転のための波長は、UVおよび近UV波長（300～405nm）で実施することができる。
アップコンバージョンナノ粒子を利用して、異なる波長で架橋を行うことができる。
架橋されたアセンブリを配列決定可能な記録物に変換するために、他の方法を使用することができる。例えば、結合しているバーコード鎖間の結合領域内に制限部位を使用してもよく、完全記録鎖を形成するために、ヘアピンを切断した端にライゲーションさせてもよい。あるいは、連結の間に橋を架ける鎖をアセンブリに結合し、次に、おそらくはポリメラーゼによるギャップ充填工程の後またはその途中に一緒にライゲーションさせてもよい。
顕鏡観察のためにフルオロフォアまたはナノ粒子を使用するなど、バーコーディングプロセスを観察または検証するために他の方法を使用することができる。
関心対象の生体分子上にバーコードを直接アセンブリする代わりに、バーコードを、ヒドロゲルマトリックスに共有結合で連結された鎖上など、分子上の近くに形成することができる。次に、これらの近くのアセンブリを、他の分子を越えて配列情報をコピーするか、または近接配列のライゲーションもしくはそれ以外の物理的連結を通じて（例えば、Hi-CまたはDNA顕微鏡検査からの戦略を用いて）記録物に変換してもよい。
標的指向化アプローチを用いて、リバースプライマー部位（Rev）を代わりに、Revドメインとバーコード鎖に結合するドメインとの間の3'にプローブ特定ドメインが存在するように、他のオーバーハング鎖（プローブ配列の3'末端上）に移動させてもよい。このプローブ特定ドメインは、0、1、2、最大で50塩基長またはより長くてよく、これは、実際にプローブ結合配列それ自体を配列決定する必要なく、プローブ配列がどのように結合したかを特定するインデックスとして役立つこともできるだろう。
バーコーディングされた生体分子は、下流アッセイにも適合可能である。例えば、タンパク質は、その後にバーコーディングされる核酸鎖で非特異的に標識され得る（それにコンジュゲートされ得る）。バーコーディング後、試料からタンパク質を精製し、タンパク質または抗体マイクロアレイにアプライして、タンパク質のアイデンティティを明らかにしてもよく、これはまた、標的上にバーコーディングすることもできる（例えば、より大きなバーコードコンカテマーをアセンブリすることによって）。一般に、分子を何らかの方法（例えば、ゲル、ウエスタンブロット、FACS、サイズ排除カラム）で物理的に分離または選別する任意の下流アッセイは、後続のバーコーディング工程を利用して、アセンブリされたバーコード配列中の標的／転写物に関する追加の情報をエンコードできる。
さらなる分析のためにバーコーディングに続いて二次アッセイを行うことができる。これらのアッセイとして、qPCR、顕微鏡検査、プルダウン、DNA/RNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、抗体アレイ、電気泳動ゲル、ウエスタンブロット、細胞選別、FACS、ドロップレットまたはマイクロ流体に基づく方法、質量分析、質量分析イメージング、レーザーマイクロダイセクションを挙げることができる。
実施例3：繰り返しの光架橋を用いた空間パターニング
任意の光誘導型バーコーディング戦略（例えば、上記の戦略1～3）を繰り返しラウンドの空間パターニング照射と組み合わせて、より高いレベルの多重化配列決定リードアウトを達成してもよい。基本的な架橋反応を図4Aに描写する。CNVK修飾を含有する配列は、部分的または完全に相補的な配列に結合し、UV照射すると共有結合が形成される。光照射の領域または容積を特定の領域または領域のセットに空間的に限局することによって、照射された領域内でのみ架橋が起こるようにすることができる（図4B）。架橋していない鎖を洗い流した後、その領域だけが、架橋された鎖に結合したままであろう。
別個のバーコード配列は、選択された光誘導型バーコーディング戦略を使用した繰り返しのハイブリダイゼーションおよび架橋ラウンドを利用することによって、異なる位置でインサイチューにアセンブリされ、先のセクションに記載したバーコーディング手順に従って同じ配列決定ランで一緒にプールことができる。配列決定したら、バーコード配列を使用して、バーコード配列に関連するバーコーディングラウンドの間に、配列決定データが元の指定された（照射された）位置にマッピングされる。この配列決定データは、任意で、さらにより高次元のデータを提供するために、関心対象の試料または表面の顕微鏡検査または他の種類の分析とさらに組み合わせてもよい。以下の図は、デジタルマイクロミラーデバイス（DMD）を利用したパターニング照射について示しているが、プログラム可能な光照射が可能な任意のデバイス（ポイントスキャン共焦点、スピニングディスク共焦点、ライトシート顕微鏡、ハイスループットスキャナー、構造化照射顕微鏡、誘導放出抑制顕微鏡など）をバーコーディング化学と組み合わせることができる。
いくつかの実験では、複数の領域が、同じラウンドの間に同じバーコード配列を受け入れる場合があり、このことは、空間的位置決め以外の性質を表し得る。例えば、同じマーカー遺伝子または他の共有性質（例えば、同じ細胞状態）を有するすべての細胞が同じバーコード配列で標識された場合、それらの配列決定リードは後に一緒のグループに分けることができる。いくつかの実験では、照射は、細胞下レベルで、核領域にだけ、全細胞レベルで、または細胞より大きなレベルで行ってもよい。照射は、固定された細胞または組織試料において実施されてもよく、あるいは機能化表面上に直接実施されてもよい。
アプローチ：二重波長を使用した繰り返しの光架橋による空間パターニング（戦略1）。光誘導型バーコーディングに関する記載の第1の戦略を利用した、複数（n個）の領域を固有のバーコード配列（B1～Bn）で標識できる繰り返しの光架橋の一例を図4Cに描写する。各ラウンドは、バーコード鎖がすべての領域に結合するハイブリダイゼーション工程、指定のプログラム化された領域（1つまたは複数）に照射を限局する架橋工程、および試料／基材から架橋していないバーコード鎖をすべて解離させる洗浄工程からなるだろう。任意で、架橋は、ハイブリダイゼーション工程の間に実施することもできる。指定の領域は各々、固有のバーコード配列（B1～Bn）を有するバーコード鎖を受け入れることができ、後に、これを配列決定の間に回収して、プローブ／転写物配列情報を照射された領域にマッピングし戻すことが可能である。
アプローチ：ブリッジ配列を使用した繰り返しの光架橋による空間パターニング（戦略2）。光誘導型バーコーディングに関する記載の第2の戦略を利用した、複数（n個）の領域を固有のバーコード配列（B1～Bn）で標識できる繰り返しの光架橋の一例を図4Dに描写する。各ラウンドは、バーコード鎖がすべての領域に結合するハイブリダイゼーション工程、指定のプログラム化された領域（1つまたは複数）に照射を限局する架橋工程、および試料／基材から架橋していないバーコード鎖をすべて解離させる洗浄工程からなるだろう。任意で、架橋は、ハイブリダイゼーション工程の間に実施することもできる。指定の領域は各々、固有のバーコード配列（B1～Bn）を有するバーコード鎖を受け入れることができ、後に、これを配列決定の間に回収して、プローブ／転写物配列情報を照射された領域にマッピングし戻すことが可能である。
アプローチ：コンビナトリアルバーコードを作製するための繰り返しの光架橋およびコンカテマーアセンブリを用いた空間パターニング（戦略3）
大規模多重化バーコードのための戦略を図5A～5Cに描写する。この戦略は、2つの部分に分けられる。第1段階では、DNAバーコードが、成長している鎖に、固有の架橋幾何学で繰り返し光架橋され、これは、第2段階における酵素的複製のためのテンプレートとして役立つ（図5A）。第2段階は、鎖置換DNAポリメラーゼを利用して、架橋されたバーコードのアセンブリされた鎖全体をコピーして、バーコード情報を単一の隣接DNA鎖にコピーし、その情報は、次に配列決定を通じて検索することができる（図5B）。
以下の工程は、ラウンドごとに、バーコード鎖ごとに行われるだろう：バーコード鎖がすべての領域に結合するハイブリダイゼーション工程、指定のプログラム化された領域（1つまたは複数）に照射を限局する架橋工程、および試料／基材から架橋していないバーコード鎖をすべて解離させる洗浄工程。任意で、架橋は、ハイブリダイゼーション工程の間に実施することもできる。各ラウンドは、このプロセスを受けている複数のバーコード鎖からなる。m個のバーコード鎖がn回のラウンドの各々で使用されてn個のバーコード配列を含有するコンカテマーを構築する場合、例えば、プログラムに従ってアセンブリできるm"n個の可能なコンカテマー配列が存在する。図5Aでは、m=2の一例を示しており、そこで、n回のラウンドで2"n個の可能なプログラム可能なコンカテマー配列が存在するだろう。
実験的検証
空間パターニング照射を固定されたEY.T4細胞で検証した。4％ PFAを使用して細胞をウェルチャンバーのカバーガラス上に単層として固定した。その後、細胞を透過性にするために数回の洗浄ならびに0.5％（vol/vol）Triton X-100を含む1×PBS中での10分間のインキュベーションを実施し、プローブターゲティングリボソームRNA（rRNA）を、標準的なプロトコルに従って60℃で3分間インキュベーションした後、2×SSCT、50％ホルムアミド、10％デキストラン、0.1％ Tween-20および約67nMのプローブ配列を含む緩衝液中、37℃で一晩、インサイチューでハイブリダイズさせた。プローブ配列は、第1のバーコード鎖が結合できる3'オーバーハングを含有した。検証のために、バーコード鎖は、5'末端上にCy3bフルオロフォアを担持した。細胞試料を50nMの第1のバーコード鎖とPBS中で10分間インキュベートした。未結合鎖をPBSで3×1分間洗浄した。次に、選択した領域を365nmのUVレーザー（5、ファイバから電力密度10w/cm"2で）に2秒間曝露させ、4×対物レンズを備えたDMDを使用して架橋を誘導した。脱架橋させた鎖をPBS中50％ホルムアミドで2×2.5分間洗浄した。PBSで1分間洗浄した後、核をDAPIで標識し、広視野顕微鏡を用いて20×で撮像した（図6A～6F）。
また、生体分子バーコーディングのための繰り返し架橋を、同じ種類のrRNAターゲティング試料を使用して試験した。この事例では、電力密度2w/cm"2で365nmの光を出力する携帯式UVガンを用いて工程ごとに試料全体を照射し、最大で3つのバーコード鎖を含有するコンカテマーを順次アセンブリした。ラウンドごとに、50nMのCy3b標識バーコード鎖をPBS中で細胞に10分間アプライし、続いて、3×1分間のPBS洗浄による未結合鎖の除去、UV曝露、およびPBS中50％ホルムアミドでの2×3分間の洗浄による脱架橋鎖の除去を行った。最終ラウンドで、Cy5標識プライマー鎖（プライマーキャッピング）をアプライし、クロスジャンクションDNA合成に使用した（図7A）。クロスジャンクション合成およびPCR増幅後、1ジャンクションおよび3ジャンクションアセンブリのための正確な長さの鎖を、15％ TBE-Urea PAGE変性ゲル上で可視化した（図7B、実験2）。
主に単一ジャンクションのアセンブリを有する別の試料（全試料中のより長いアセンブリにパターニングされた小さな領域のみ含有した、図6A～6F中の試料に相当する）も、クロスジャンクション合成およびPCR後に可視化した（実験1）。最後に、基礎となるプローブなし（インサイチューハイブリダイゼーション中にプローブなし）だが後続のバーコードおよび架橋処理をすべて受けている対照試料をプロトコルに通したところ、予想どおりの記録物長の鎖を生成しなかった。
実施例4：空間ラベリングおよび配列決定の検証
図8A～8Cは、細胞レベル空間ラベリングの実験的検証を示す。架橋のために予め選択した関心対象の複数領域（黄色、青色、緑色、赤色の輪郭）を、GFPシグナルを呈する細胞の周囲に描いている（図8B）。
図9A～9Dは、配列決定結果を示す。アンプリコンの両端にUMIを有する戦略2の変法を利用して、固定されたHeLa細胞に対してパターニング照射を使用して、3つの別個の空間的に分離された領域を逐次的にバーコーディングした。図9Aは、6つの別個のプローブ配列（2つがリボソームRNAを標的とし、4つがXist RNAを標的とする）が、FISHを用いてそれらの標的RNA配列に結合したことを実証している。これに続いて、繰り返しのバーコーディング、バーコード含有プライマーの結合、記録物の合成、および増幅を行った。次世代配列決定（HiSeq）のためにCollibri配列決定プレップキットを使用してアンプリコンを調製した。図9B～9Cは、予想されるフォーマットのリードが、整列後に高い割合で回収されたことを示す。図9Dは、データの大部分についてのリード分布がプローブ－領域ペアごとに示されていることを示す。
実施例5：バーコーディング法
標的指向化バーコーディングは、cDNA配列、FISHプローブ配列、抗体にコンジュゲートされた核酸、またはインサイチューで関心対象の生体分子にアフィニティー試薬を介して局在する任意の他の核酸に対して実施することができる。あるいは、トランスクリプトームワイドプロファイリングのためのランダムプライマーを使用したcDNA配列の生成などの、非標的指向化アプローチも、任意の前から存在するRNAもしくはDNA配列、または修飾骨格を有する他の核酸ポリマー、例えばLNAもしくはPNA、または核酸類似体もしくは修飾モノマー、またはポリメラーゼ、リガーゼ、制限酵素、ヌクレアーゼ、テロメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リコンビナーゼもしくはトランスポザーゼの作用によってインサイチューで生成された他の反応生成物、例えば、近接ライゲーションアッセイ、プライマー交換反応、オートサイクリック近接記録法、またはタグメンテーションのものに対して実施することができるバーコーディングのための基礎として機能し得る（図10）。バーコーディングは、特定の領域（例えば、単一細胞、図11A）から抽出されたリードについて、公知のバーコード順列がマルチジャンクションコンカテマー中に配置されて形成されるように、繰り返し実施することができる。クロスジャンクション合成およびPCRを使用して、これらのコンカテマーから配列決定可能なリードを抽出することができる。生体分子に対するこのタイプのインサイチューコンビナトリアルバーコード構築は、単一細胞スプリット－プールバーコーディング（図13）、関心対象の個々の細胞または細胞内および細胞超領域に対する空間バーコードのアセンブリ（図14）、ならびに、例えば創薬のためのある特定のフェノタイピングを用いた細胞の特異的バーコーディング（図12）を含む、数多くの潜在的な用途を有する。
バーコーディングは、線形方式で実施してもよく、この場合、各々のバーコーディングされた領域が単一の固有のバーコードを受け入れる（図15A）。あるいは、ジャンクションコンカテマーをコンビナトリアルな様式で形成してもよく、それにより、M個のバーコードによるN回のラウンドはそれぞれ、M^N個の固有のバーコード順列を生成することができる（図15B）。
一般に、バーコーディングを使用して、形態学的イメージングに基づくデータセットを、全く同じ関心対象の試料または領域に関連する配列決定データセットに直接関連付けることができる。RNA配列決定をイメージングデータと組み合わせるための一般的なワークフローを図16に記載する。細胞、組織またはオルガノイドはすべて、固定および透過処理後にバーコーディングすることができる。トランスクリプトーム解析にとって、インサイチューで逆転写されたcDNA配列および／またはFISHに基づくプローブは、バーコーディングのための基材であり得る。プロテオミクスおよび他の種類のオミクス解析にとって、抗体、タンパク質、ナノボディまたは他のアフィニティー試薬にコンジュゲートされた核酸は、標的またはバーコーディング基材として機能し得る。いくつかの場合、3'オーバーハングをバーコーディングされる核酸（例えば、cDNA配列）に付加するために、テーリング工程（例えば、「A-テーリング」）が必要となり得る。所望のイメージングアッセイを実施した後、細胞および／または細胞内または細胞超領域が次に、繰り返しのジャンクションコンカテマー構築を通してバーコーディングされる。RNAに結合しているコンカテマーを、RNAを特異的に切断する酵素（例えば、RNaseH）を使用して置換してもよく、これは、任意で、後続の合成工程と共に行ってもよい。クロスジャンクション合成は、直接インサイチューに、または置換の途中／後（妥当な場合）に実施してもよい。完全記録物のPCR増幅後、配列決定のためにアンプリコンを調製（例えば、精製、ゲル電気泳動を通じた分析、ライブラリ調製）し、次に配列決定する。バーコードが割り当てられた特定の領域に配列決定リードをマッピングし戻すために、バーコードを配列決定リードから抽出する。
テーリング（例えば、「A-テーリング」）は、ターミナルトランスフェラーゼ酵素およびdATPの使用を通じて達成してもよい。クロスジャンクション合成工程中に後続の伸張から保護されるように、任意で、ddATPまたは別の終結ヌクレオチドを低濃度で含めて、3'末端をランダムに終結させてもよい。テーリングは、代わりに異なるヌクレオチド、例えば、dCTP、dGTPもしくはdTTP、またはヌクレオチドのミックスを用いて実施してもよい。3'オーバーハングを付加するために、他の戦略、例えば、ライゲーションを使用してもよい。
異なるUV出力および照射時間条件を調製したHeLa細胞において試験した。rRNAを標的とするFISHプローブをインサイチューでハイブリダイズさせ、その5'オーバーハングドメインを介してバーコーディング基材として作用させた（図17）。制御マクロを作製して、試料を複数の視野にわたって自動的にラスタ化し、チェッカー盤パターンを有する領域を照射し、そのようにしてUV出力および照射時間を調整した。特定の光源ごとの最適なUV条件は、架橋効率を最大限に高め、オフターゲット架橋を最小限に抑える。光源、波長、出力、距離、倍率、ピントおよび他の制約に応じて、この照射時間量は、幅広く変動し、例えば、1ミリ秒～数分またはそれ以上であり得る。例えば、この照射は、1％、2％、5％、10％、100％などの出力で、1ミリ秒、5ミリ秒、10ミリ秒、100ミリ秒、1000ミリ秒、10000ミリ秒、100000ミリ秒、1000000ミリ秒などであり得る。
インサイチューに局在する核酸の5'オーバーハングのバーコーディングのための鎖ダイアグラムの組み合わせバリエーションを図18および図19に示す。
いくつかの異なるCy5標識プライマー設計をcDNAライブラリ作製について試験した（図20A）。HeLa細胞をIbidi 8ウェルチャンバー上に調製し、1％ PFAで固定し、0.1％ Tween-20を補充した70％メタノールおよび30％ PBS緩衝液200ulで透過処理した。同一の逆転写（RT）プロトコルを、陰性対照を除くすべてのウェルに対して実施した。その後、Cy5チャネルにおいてプライマーを撮像して、それらの局在をアッセイした（図20B）。ある特定のプライマー設計が、細胞質領域を優先したが、このことは、異なるプライマーが、RT工程の間に異なる種類のRNA種に接近およびコピーしている可能性があることを示している。次に、すべてのプライマー設計のバーコーディングを、チェッカー盤パターンを有する同じ細胞にCy3標識CNVKバーコードを架橋することによって検証した。これらのプライマーのいくつかの配列決定結果を図21に示す。
インサイチューに局在する核酸の5'オーバーハングのバーコーディングのための一般的な配列設計戦略を図22Aおよび下記表1に描写する。
（表１）2配向設定のバーコーディング鎖の一般的な構造（図22Aも参照のこと）。バーコーディングは、revキャッピングバーコード鎖、ゼロまたはそれより多いバーコード鎖、およびドック鎖（例えば、RNA上にcDNA配列を作製するために伸長されたRTプライマー、FISHもしくは他の標的指向性プローブ、またはそれ以外の何らかの親和性関係を介して生体分子にインサイチューに局在している鎖）を含むコンカテマーを構築することによって行われる。この場合、配列に2つの配向があり、配向は、バーコーディングのラウンド1回おきに入れ替わる。より多くの配向を利用してもよい。星印は、相補的またはほぼ相補的なドメインを示しており、例えば、（結合ドメインX）は（結合ドメインX）＊にハイブリダイズする。
Figure 2023506176000002
後続の図において使用される具体的な結合ドメイン配列を図22Bおよび表2に描写する。この例では、A塩基とそれに続くCNVK修飾が2つのTヌクレオチドを挟んで対合される。架橋後、CNVKは、ポリメラーゼ伸張のブロッカーとして作用するのに非常に効果的であり、それによって、4つすべてのヌクレオチド（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）が存在する場合でも、クロスジャンクション合成中のブロッキングドメインとして直接使用できることが見いだされた。
（表２）d0およびd1結合ドメインを有する配列の具体的な構造（図22Bも参照のこと）。実験的に検証されたバーコーディング結合ドメインの具体的なセットを記載する（d0＝表1に記載した（結合ドメインW）およびd1＝表1からの（結合ドメインY））。結合ドメインは、架橋していないバーコード鎖が、ドッキング配列（例えば、cDNA配列または局在化FISHもしくは標的指向性プローブ）の根底にある親和性または結合を破壊することなく洗い流され得るように十分短く設計されなければならない。
Figure 2023506176000003
図22Cおよび表3は、後続の図において使用される正確なバーコーディングおよびプライマー配列を示す。
（表３）実験的に検証された配列（図22Cおよびデータ図も参照のこと）。バーコード配列は、配列決定を含む完全バーコーディングワークフローで検証した。
Figure 2023506176000004
これらの配列は、ストレプトアビジンコートガラススライドに結合しているビオチン化鎖の繰り返しのバーコーディングを介して、最大で8つの鎖を一緒に連結する（7つのジャンクションを形成する）ことにより試験した（図23A～23B）。6ウェルの各々で、異なる数のバーコードを導入して、クロスジャンクション合成のために2～7つのジャンクションを作製した（図23C）。完全な予想されるジャンクションおよびアンプリコン配列設計を図23Dに描写し、予想される架橋部位はCNVK（「X」）修飾から示される。予想される6バーコードを有するいくつかの完全配列を配列決定後に特定し、不完全なアセンブリ効率を示している短縮型の4、2および0バーコード配列の大部分も特定した。圧倒的多数のリードが、正確な導入順序のバーコードを示したが、このことは、バーコード記録が、実際に特定のバーコード配列の一過性の導入を反映していることを示している。
次に、これらの配列を、図19に記載するワークフローに従って、固定されたHeLa細胞におけるcDNA配列のバーコーディングに適用した。多種多様な固定、透過処理、RT、A-テーリングおよびバーコーディング条件を一緒に試験し、示したすべての条件がいくつかの予想される配列決定結果を生成した（図24）。示した配列決定結果において、RT酵素のない対照を除き、強調しているcDNAリード（青色）は、公知のホモサピエンス配列に位置した。まとめると、これらのデータは、広範なRT、透過処理および固定条件下でのこの技術のロバスト性を示している。実験C1～C4からの結果は、先のラウンドで導入されたが架橋されていないバーコードからのバックグラウンドが、以前のバーコードについてわずか数リードが認められることから、極めて少ないことをさらに示している。このことは、選択されたストリンジェントな洗浄条件（1×PBSまたは1×PBS-Tweenのいずれか中40％ホルムアミド）が、結合しているが架橋していないバーコード鎖を洗い流すには十分であることを示している。これらの同じ実験（B1～B8およびC1～C4）のイメージングおよびゲル結果を図25A～25Dに示す。これらの実験の1つ（B7）からの正確な配列フォーマットの1,024個の解析されたリードについての成功した遺伝子配列マッピング結果の一例を図26に示す。
コンビナトリアルバーコーディング戦略の実験試験を、6つのDNAバーコードのセットを使用して実施し、自動流体交換ユニットならびにバーコーディングラウンド当たりのフォトマスクを調整するための制御マクロと統合した（図27）。合計112個の関心対象の正方形の領域を固有のDNAバーコード配列に割り当てた。本発明者らのエンコーディング戦略は、3進エンコーディングスキーム（0,1,2）を活用する。合計6回のバーコーディングラウンドを実施し、続いて、revプライマー鎖を付加する最終キャッピングラウンドを行った。各バーコードラウンドは、視野内のバーコード割り当てを並列化するために、固有のフォトマスクに割り当てられる。最終キャッピング鎖付加に続いて、Cy3チャネルにおいて撮像し、成功したバーコード組み込みを可視化した。
統合した自動細胞検出、フォトマスキングおよびバーコーディングワークフローの実験試験（図28A）。HeLa細胞をIbidiフローチャンバーに播種し、4％ PFAで固定し、0.25％ Triton-Xを補充した1×PBS中で透過処理した。5N.3G（図22A～22Cを参照のこと）プライマーを逆転写に使用し、Cy5チャネルにおいて撮像した（図28B）。アルゴリズムを使用してCy5シグナルに基づき細胞を特定し、検出された細胞の輪郭をCy5シグナル上に重ね合わせた（図28C）。各細胞の輪郭は、関心対象の領域として機能し、それ独自の固有のバーコード配列に割り当てられる。自動バーコーディングおよびDNAバーコード交換を、選択された細胞に対してCy3標識CNVK DNAバーコードを使用して実施した。その後、細胞をCy3チャネルにおいて撮像し（図28E）、成功したバーコード送達を確認した。
図16に提供されるワークフローを使用して、イメージングに基づく方法および配列決定に基づく方法の両方によってマルチモーダル統合解析のために生体分子をタグ化するために、関心対象の所定の領域（全組織、組織領域、細胞収集物、単一細胞、細胞内領域、微生物、表面など）中の生体分子をバーコーディングすることができる。この場合、本明細書に提供される方法を使用して、配列決定リードを起源となる空間位置に遡って関連付ける空間タグを作製する。よって、バーコーディング法は、候補処置（小分子薬、治療用核酸、遺伝子または細胞療法、ペプチド、タンパク質、抗体、代謝物質、ホルモン、DNAコードライブラリ）のライブラリをスクリーニングすることを可能にし、ここで、表現型アウトカムは、イメージングによって特定され、選択された領域は、本明細書に提供される方法を使用して配列決定に基づく分析のために光曝露によってバーコーディングされる。該方法の用途としては、療法（小分子薬、生物製剤、治療用核酸、遺伝子または細胞療法、siRNA、gRNA、ペプチド、タンパク質、抗体、代謝物質、ホルモン、DNAコードライブラリ）のスクリーニング、薬物標的の特定、バイオマーカーの特定、プロファイリング、遺伝子型に対する表現型の細胞状態の特性評価、新たな疾患モデルの作製、細胞および疾患モデルの特性評価、分化状態および細胞状態の特性評価、組織マッピング、多次元分析、ハイコンテントスクリーニング、機械学習に基づくクラスタリングまたは分類、細胞療法開発、CAR-T療法開発、抗体スクリーニング、個別化医療、細胞濃縮が挙げられるが、それらに限定されない。
該方法を、任意の前から存在する標的核酸、および核酸に直接コンジュゲートしているか核酸に親和性結合剤、抗体、ナノボディ、アプタマー、アフィボディ、タグ、融合タンパク質、リンカーなどのアダプターを介して間接的に結合している他の生体分子に適用することができる。この場合、潜在的な標的分子としては、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、リガンド、プラスミド、siRNA、ガイド（gRNA）、プラスミド、ファージ、ウイルス、代謝物質、ホルモン、およびDNAバーコーディング表面、細胞内構造または全細胞または微生物のDNAコードライブラリが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書に提供される方法を使用して、生体分子を、架橋されたDNA鎖を用いて、本明細書に提供される組成物のいずれかを使用し、関心対象の所定の領域中の分子を光に曝露させることによって、線形的にまたはコンビナトリアルにバーコーディングすることができる。
例えば、該方法を使用して、イメージングに基づく方法と配列決定に基づく方法の両方によってマルチモーダル統合解析のために生体分子をタグ化するために、関心対象の所定の領域（全組織、組織領域、細胞収集物、単一細胞、細胞内領域、微生物、表面）中の生体分子をバーコーディングすることができる。
さらに、生体分子をバーコーディングして、配列決定リードを空間位置に遡って関連付ける空間タグを作製することは、イメージングに基づく方法と配列決定に基づく方法によって、選択された関心対象の領域のマルチモーダル統合解析のために達成することができる。
図16のワークフローは、様々な疾患のための候補処置のライブラリのスクリーニング、例えば、小分子薬、生物製剤、治療用核酸、遺伝子または細胞療法、siRNA、gRNA、プラスミド、ファージ、ウイルス、ペプチド、タンパク質、抗体、代謝物質、ホルモン、およびDNAコードライブラリのスクリーニングのために使用することもできる。表現型アウトカムは、イメージングによって特定され、選択された領域は、本明細書に提供される方法を使用して配列決定に基づく分析のために光曝露によってバーコーディングされる。
本明細書に提供される方法は、薬物標的の特定、バイオマーカーの特定、プロファイリング、遺伝子型に対する表現型の細胞状態の特性評価、新たな疾患モデルの作製、細胞および疾患モデルの特性評価、分化状態および細胞状態の特性評価、組織マッピング、多次元分析、ハイコンテントスクリーニング、機械学習に基づくクラスタリングまたは分類、細胞療法開発、CAR-T療法開発、抗体スクリーニング、個別化医療、および細胞濃縮を非限定的に含む様々な用途にとって有益であることができる。
参考文献
Figure 2023506176000005
Figure 2023506176000006
Figure 2023506176000007

Claims (112)

  1. a．5'から3'の方向に、
    i．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
    ii．第1のターゲティングドメイン；および
    iii．第1のハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、第1の核酸と、
    b．5'から3'の方向に、
    i．バーコードドメイン；および
    ii．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、第2の核酸と
    を含む、バーコード組成物であって、
    第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、前記バーコード組成物。
  2. 前記第2の核酸が、5'末端に固有分子識別子配列をさらに含む、請求項1記載のバーコード組成物。
  3. 前記第2の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、請求項1または2記載のバーコード組成物。
  4. a．5'から3'の方向に、
    i．任意で、固有分子識別子配列；
    ii．第1のターゲティングドメイン；および
    iii．第1のハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、第1の核酸と、
    b．5'から3'の方向に、
    i．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
    ii．第1のバーコードドメイン
    を含む、第2の核酸と
    を含む、バーコード組成物であって、
    第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、前記バーコード組成物。
  5. 第2のバーコードドメインを含む第3の核酸をさらに含み、第2のバーコードドメインが、第1のバーコードドメインと実質的に相補的である、請求項1～4のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  6. 前記第3の核酸が、5'末端に固有分子識別子配列をさらに含む、請求項5記載のバーコード組成物。
  7. 前記第3の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、請求項5または6記載のバーコード組成物。
  8. a．5'から3'の方向に、
    i．任意で、固有分子識別子配列；
    ii．第1のターゲティングドメイン；および
    iii．第1のハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、第1の核酸と、
    b．5'から3'の方向に、
    i．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
    ii．第1のバーコードドメイン；
    iii．第3のハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、第2の核酸と
    を含む、バーコード組成物であって、
    第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含み、第3のハイブリダイゼーションドメインが、任意で、光反応性要素を含む、前記バーコード組成物。
  9. n個の追加の核酸をさらに含み、
    nが、1～100の整数であり、
    各追加の核酸が、5'から3'の方向に、
    i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；
    ii．バーコードドメイン；および
    iii．第2のハイブリダイゼーションドメイン
    を含み、
    n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、
    n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ
    各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、請求項8記載のバーコード組成物。
  10. 5'から3'の方向に、
    i．第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、nが1以上であるときn番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン、またはnが0であるとき第3のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該キャップハイブリダイゼーションドメイン；および
    ii．第2のキャップハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、第1のキャップ核酸鎖
    をさらに含み、
    第1のキャップハイブリダイゼーションドメインが、任意で、光反応性要素を含む、請求項8または9記載のバーコード組成物。
  11. 5'から3'の方向に、
    i．プライマー配列ドメイン；
    ii．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および
    iii．ハイブリダイゼーションドメインであって、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、該ハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、第2のキャップ核酸鎖
    をさらに含み、
    第1のキャップ核酸鎖の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインおよび第2の核酸鎖のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、請求項10記載のバーコード組成物。
  12. 前記第1の核酸が、RNAまたはRNA転写物であり、任意で、第1のハイブリダイゼーションドメインが、ポリ（A）配列を含む、請求項1～11のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  13. 前記第1の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、請求項1～12のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  14. 前記第1の核酸の第1のターゲティングドメインが、標的核酸と実質的に相補的である、請求項1～13のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  15. 標的核酸が、標的結合物質とコンジュゲートされるか、または、標的核酸が、標的分子とコンジュゲートされるか、または、標的核酸が、標的分子（RNAなど）内に含まれるか、または、標的核酸が、標的細胞によって発現されるか、または、標的核酸が、標的分子または細胞上に直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくはアダプター分子、例えば標的結合リガンドを介して間接的に提示される、請求項14記載のバーコード組成物。
  16. 標的結合物質が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドからなる群より選択され、任意で、標的結合物質が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項15記載のバーコード組成物。
  17. 各ドメインが、独立に、1文字コード、2文字コード、3文字コード、または4文字コードを含む、請求項1～16のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  18. 各ドメインが、独立に、ゼロまたは少なくとも1つの核酸修飾を含む、請求項1～17のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  19. 核酸修飾が、核酸塩基修飾、糖修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群より選択される、請求項18記載のバーコード組成物。
  20. 各ドメインが、独立に、1～1000ヌクレオチド長である、請求項1～19のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  21. 核酸のUMIが、同じ核酸の他のドメインの1つに組み込まれる、請求項1～20のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  22. 核酸の少なくとも1つが、切断可能なスペーサーを含む、請求項1～21のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  23. 切断可能なスペーサーが、光切断性スペーサーである、請求項22記載のバーコード組成物。
  24. 検出可能な標識をさらに含む、請求項1～23のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  25. 検出可能な標識が、前記核酸のうちの1つの中に含まれる、請求項24記載のバーコード組成物。
  26. 検出可能な標識が、蛍光分子、ナノ粒子、安定同位体、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項24または25記載のバーコード組成物。
  27. ポリメラーゼをさらに含む、請求項1～26のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  28. ポリメラーゼが、鎖置換ポリメラーゼである、請求項27記載のバーコード組成物。
  29. 核酸合成のための緩衝液または塩をさらに含む、請求項1～28のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  30. 天然または合成ヌクレオチド三リン酸またはデオキシヌクレオチド三リン酸をさらに含む、請求項1～29のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  31. 標的要素をさらに含む、請求項1～30のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  32. 標的要素が、基材表面上に固定される、請求項31記載のバーコード組成物。
  33. 標的要素が、基材表面上に所定のパターンで固定される、請求項32記載のバーコード組成物。
  34. 標的要素が、核酸、脂質、糖、小分子、微生物もしくはそれらの断片、ポリペプチド、および／または生体物質である、請求項31～33のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  35. 生体物質が、組織、細胞、オルガノイド、人工組織（engineered tissue）；および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項34記載のバーコード組成物。
  36. 基材が、ガラス、透明ポリマー、ポリスチレン、ヒドロゲル、金属、セラミック、紙、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、酸化鉄、ステンレス鋼、金、銅、塩化銀、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ストレプトアビジン、樹脂、および生体物質からなる群より選択される、請求項31～35のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  37. 光反応性要素が、光反応性ヌクレオチドであり、任意で、光反応性ヌクレオチドが、CNVKまたはCNVD架橋塩基である、請求項1～36のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  38. PCRプライマーをさらに含む、請求項1～37のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  39. 光源をさらに含み、任意で、光源が、UV光源である、請求項1～38のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  40. キットの形態の、請求項1～39のいずれか一項記載のバーコード組成物。
  41. 標的mRNAを検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    a．標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
    i．該mRNAが、ポリA配列を含む第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；
    ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
    1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
    2．第1のバーコードドメイン
    を含む、段階；
    b．該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；
    c．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
    d．記録核酸を検出する段階。
  42. 標的核酸を検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    a．標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
    i．第1の核酸が、5'から3'の方向に、
    1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
    2．標的要素の核酸と実質的に相補的な第1のターゲティングドメイン；および
    3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
    を含み；
    ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
    1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
    2．第1のバーコードドメイン
    を含み、
    第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；
    b．第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階；
    c．任意で、プローブ-プライマー複合体を標的核酸から変性させる段階；
    d．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
    e．記録核酸を検出する段階。
  43. 前記第2の核酸が、5'末端に固有分子識別子（UMI）配列をさらに含む、請求項41または42記載の方法。
  44. 前記第2の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、請求項41～43のいずれか一項記載の方法。
  45. 前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、請求項41～44のいずれか一項記載の方法。
  46. 配列決定前に、光架橋を切断する、脱架橋させる、除去するまたは逆転させること、および記録核酸を増幅させることをさらに含む、請求項45記載の方法。
  47. 前記切断する、脱架橋させる、除去するまたは逆転させることが、300～350nm、任意で312nmの波長の光を使用する、請求項46記載の方法。
  48. 標的mRNAを検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    a．標的mRNA（第1の核酸）と第2の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
    i．該mRNAが、ポリA配列を含む第1のハイブリダイゼーションドメインを含み；
    ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
    1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、該mRNAの第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、光反応性要素を含む、第2のハイブリダイゼーションドメイン；および
    2．第1のバーコードドメイン
    を含む、段階；
    b．該mRNAと第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；
    c．第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸の第1のバーコードドメインと実質的に相補的な第2のバーコードドメインを含む、段階；
    d．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
    e．記録核酸を検出する段階。
  49. 標的核酸を検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    a．標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせ、第2の核酸を第1の核酸にハイブリダイズさせる段階であって、
    i．第1の核酸が、5'から3'の方向に、
    1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
    2．第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および
    3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
    を含み；
    ii．第2の核酸が、5'から3'の方向に、
    1．第2のハイブリダイゼーションドメインであって、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第2のハイブリダイゼーションドメイン；
    2．第1のバーコードドメイン
    を含み、
    第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；
    b．第1の核酸と第2の核酸とを光架橋させ、それにより第1の複合体を形成する段階；
    c．任意で、第1の複合体を標的核酸から変性させる段階；
    d．第3の核酸を第1の複合体中の第2の核酸にハイブリダイズさせ、それによりプローブ-プライマー複合体を形成する段階であって、第3の核酸が、第2の核酸の第1のバーコードドメインと実質的に相補的な第2のバーコードドメインを含む、段階；
    e．プローブ-プライマー複合体から記録核酸を合成する段階；ならびに
    f．記録核酸を検出する段階。
  50. 前記第3の核酸が、5'末端に固有分子識別子（UMI）配列をさらに含む、請求項48または49記載の方法。
  51. 前記第3の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、請求項48～50のいずれか一項記載の方法。
  52. 前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、請求項48～51のいずれか一項記載の方法。
  53. 配列決定前に、記録核酸を増幅させることをさらに含む、請求項52記載の方法。
  54. 標的核酸を検出する方法であって、以下の段階を含む、方法：
    a．標的核酸と第1の核酸とをハイブリダイズさせる段階であって、
    i．第1の核酸が、5'から3'の方向に、
    1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
    2．第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および
    3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、段階；
    b．n個の追加の核酸をハイブリダイズさせ、該追加の核酸と第1の複合体とを光架橋させることによって、コンカテマーを調製する段階であって、nが、1～100の整数であり、各追加の核酸が、5'から3'の方向に、
    i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；
    ii．バーコードドメイン；および
    iii．第2のハイブリダイゼーションドメイン
    を含み、
    n番目の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、n＝1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；
    c．第1のキャップ核酸鎖とコンカテマーとをハイブリダイズさせ、それによりキャップされたコンカテマーを形成する段階であって、第1のキャップ核酸が、
    i．第1のキャップハイブリダイゼーションドメインであって、n番目の核酸の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、第1のキャップハイブリダイゼーションドメイン；および
    ii．第2のキャップハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、段階；
    d．第2のキャップ核酸鎖をキャップされたコンカテマーにハイブリダイズさせ、それによりコンカテマー-プライマー複合体を形成する段階であって、第2のキャップ核酸鎖が、5'から3'の方向に、
    i．プライマー配列ドメイン；
    ii．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；および
    iii．ハイブリダイゼーションドメインであって、第1のキャップ核酸の第2のキャップハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的である、ハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、段階；ならびに
    e．コンカテマー-プライマー複合体を検出する段階、またはコンカテマー-プライマー複合体から記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階。
  55. 前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、請求項54記載の方法。
  56. 配列決定前に、記録核酸を増幅させることをさらに含む、請求項55記載の方法。
  57. 前記光架橋させることが、水溶液中で実施される、請求項41～54のいずれか一項記載の方法。
  58. 前記光架橋させることが、350～400nm、任意で365nmの波長の光を使用する、請求項41～55のいずれか一項記載の方法。
  59. 1つまたは複数の洗浄工程をさらに含む、請求項41～58のいずれか一項記載の方法。
  60. 標的核酸が、標的結合リガンドとコンジュゲートされる、請求項41～59のいずれか一項記載の方法。
  61. 標的結合リガンドが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドからなる群より選択され、任意で、標的結合リガンドが、抗体またはその抗原結合断片である、請求項60記載の方法。
  62. 標的核酸が、生体物質中に含まれる、請求項41～61のいずれか一項記載の方法。
  63. 生体物質が、組織、細胞、オルガノイド、人工組織、および細胞外マトリックスからなる群より選択される、請求項62記載の方法。
  64. 標的核酸が、基材表面上に固定される、請求項41～63のいずれか一項記載の方法。
  65. 標的核酸が、基材表面上に所定のパターンで固定される、請求項41～64のいずれか一項記載の方法。
  66. 基材が、ガラス、透明ポリマー、ポリスチレン、ヒドロゲル、金属、セラミック、紙、アガロース、ゼラチン、アルギン酸塩、デキストラン、酸化鉄、ステンレス鋼、金、銅、塩化銀、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、ストレプトアビジン、樹脂、および生体物質からなる群より選択される、請求項65記載の方法。
  67. 前記第1の核酸が、5'末端にプライマー配列をさらに含む、請求項41～66のいずれか一項記載の方法。
  68. 各ドメインが、独立に、1文字コード、2文字コード、3文字コード、または4文字コードを含む、請求項41～67のいずれか一項記載の方法。
  69. 各ドメインが、独立に、ゼロまたは少なくとも1つの核酸修飾を含む、請求項41～68のいずれか一項記載の方法。
  70. 核酸修飾が、核酸塩基修飾、糖修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群より選択される、請求項69記載の方法。
  71. 各ドメインが、独立に、1～1000ヌクレオチド長である、請求項41～70のいずれか一項記載の方法。
  72. 核酸のUMIが、同じ核酸のバーコードドメインまたはプローブドメインに組み込まれる、請求項41～71のいずれか一項記載の方法。
  73. 核酸の少なくとも1つが、切断可能なスペーサーを含む、請求項41～72のいずれか一項記載の方法。
  74. 切断可能なスペーサーが、光切断性スペーサーである、請求項73記載の方法。
  75. 核酸の少なくとも1つが、検出可能な標識を含む、請求項41～74のいずれか一項記載の方法。
  76. 検出可能な標識が、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項75記載の方法。
  77. 前記記録核酸を合成する段階が、鎖置換ポリメラーゼを使用することを含む、請求項41～76のいずれか一項記載の方法。
  78. 照射または検出のための関心対象の1つまたは複数の特定の領域を選択する段階をさらに含む、請求項41～77のいずれか一項記載の方法。
  79. 1つまたは複数の特定の領域を選択する段階が、手作業によるかまたはコンピュータを利用する、請求項78記載の方法。
  80. 前記選択が、1つまたは複数の表現型マーカーに基づく、請求項78または79記載の方法。
  81. 1つまたは複数の表現型マーカーが、蛍光、形状、強度、組織染色、抗体染色、または形態学である、請求項80記載の方法。
  82. 空間照射または検出のための関心対象の1つまたは複数の領域を自動的に検出するソフトウェアをさらに含む、請求項41～81のいずれか一項記載の方法。
  83. 試料中の複数の標的を線形的に、コンビナトリアルにまたは空間的にバーコーディングするための方法であって、以下の段階を含む、方法：
    a．複数の標的の各メンバー中の標的核酸鎖と第1の核酸鎖とをハイブリダイズさせる段階であって、標的核酸鎖が、複数の標的の各メンバー中で異なり、標的核酸鎖が、別の核酸分子内に含まれるか、または、標的核酸鎖が、複数の標的の1つのメンバーとコンジュゲートされるか、または、標的核酸鎖が、細胞によって発現されるか、または、標的核酸鎖が、標的もしくは細胞上に直接的に、もしくは、化学的架橋、遺伝子エンコーディング、ウイルス形質導入、トランスフェクション、コンジュゲーション、細胞融合、細胞内取り込み、ハイブリダイゼーション、DNA結合タンパク質もしくは標的結合物質／リガンドを介して間接的に提示され、かつ、
    i．第1の核酸鎖が、5'から3'の方向に、
    1．任意で、固有分子識別子（UMI）配列；
    2．第1のターゲティングドメインであって、標的核酸と実質的に相補的である、第1のターゲティングドメイン；および
    3．第1のハイブリダイゼーションドメイン
    を含む、段階；
    b．段階的な様式で1つまたは複数の追加の核酸鎖をハイブリダイズさせ、該追加の核酸鎖と第1の複合体とを光架橋させることによってコンカテマーを調製する段階であって、該光架橋させることが、試料の所定の領域を選択し、各追加の核酸鎖をハイブリダイズした後に該所定の領域を光に曝露させ、それにより相補的なハイブリダイゼーションドメインを架橋すること、および、光への曝露後かつ次の追加の核酸鎖のハイブリダイゼーション前にどんな架橋していない追加の核酸鎖も除去することを含み、
    各追加の核酸鎖が、5'から3'の方向に、
    i．第1のハイブリダイゼーションドメイン；
    ii．バーコードドメイン；および
    iii．第2のハイブリダイゼーションドメイン
    を含み、
    n番目の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインが、（n-1）番目の追加の核酸鎖の第2のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、第1の追加の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインが、第1の核酸鎖の第1のハイブリダイゼーションドメインと実質的に相補的であり、かつ、各核酸鎖の第1または第2のハイブリダイゼーションドメインの少なくとも1つが、光反応性要素を含む、段階；ならびに
    c．コンカテマーを検出する段階および／またはコンカテマーから記録核酸を合成して記録核酸を検出する段階。
  84. 複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、別の核酸分子内に含まれる、請求項83記載の方法。
  85. 複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、RNA、RNA転写物、ゲノムDNA、核酸増幅産物、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より独立に選択される別の核酸分子内に含まれる、請求項83または84記載の方法。
  86. 複数の標的の少なくとも1つのメンバーがcDNAである、請求項83～85のいずれか一項記載の方法。
  87. 複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、標的核酸鎖にコンジュゲートされた非核酸分子である、請求項83～86のいずれか一項記載の方法。
  88. 複数の標的の少なくとも1つのメンバーが、標的核酸鎖に連結されたターゲティング結合物質を介して標的核酸鎖にコンジュゲートされた非核酸分子である、請求項83～87のいずれか一項記載の方法。
  89. 標的結合物質／リガンドが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、レクチン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、ビタミン、ステロイド、ホルモン、補因子、受容体および受容体リガンドからなる群より選択され、任意で、標的結合物質が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項83～88のいずれか一項記載の方法。
  90. 複数の標的の少なくとも1つのメンバーが核酸であり、複数の標的の少なくとも1つのメンバーが非核酸分子である、請求項83～89のいずれか一項記載の方法。
  91. 複数の標的の少なくとも1つのメンバーがタンパク質である、請求項83～90のいずれか一項記載の方法。
  92. 試料が、生体物質である、請求項83～91のいずれか一項記載の方法。
  93. 試料が、組織、細胞、オルガノイド、人工組織、および細胞外マトリックスからなる群より選択される生体物質である、請求項83～92のいずれか一項記載の方法。
  94. 試料が、全組織、組織領域、細胞収集物、単一細胞、細胞内領域、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項83～92のいずれか一項記載の方法。
  95. 光反応性要素がCNVKである、請求項83～94のいずれか一項記載の方法。
  96. 光反応性要素が、ポリメラーゼの活性を阻害または遮断し、任意で、ポリメラーゼが鎖置換ポリメラーゼである、請求項83～95のいずれか一項記載の方法。
  97. 試料の所定の領域のマルチモーダル統合解析のためにコンカテマーおよび／または記録鎖をイメージング法および記録核酸の配列決定によって検出する段階を含む、請求項83～96のいずれか一項記載の方法。
  98. 試料の所定の領域のマルチモーダル統合解析のために記録鎖の配列を空間位置に相関させるためにコンカテマーおよび／または記録鎖をイメージング法および記録核酸の配列決定によって検出する段階を含む、請求項83～97のいずれか一項記載の方法。
  99. 前記検出する段階が、記録核酸の配列決定、光学顕微鏡検査、ハイスループットスキャナー、共焦点顕微鏡検査、光シート顕微鏡検査、電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査、または肉眼を含む、請求項83～98のいずれか一項記載の方法。
  100. 配列決定前に、記録核酸を増幅させることをさらに含む、請求項99記載の方法。
  101. 配列決定前に、光架橋を切断する、脱架橋させる、除去するまたは逆転させること、および記録核酸を増幅させることをさらに含む、請求項100記載の方法。
  102. 前記光架橋させることが、350～400nm、任意で365nmの波長の光を使用する、請求項83～101のいずれか一項記載の方法。
  103. 各ドメインが、独立に、1文字コード、2文字コード、3文字コード、または4文字コードを含む、請求項83～102のいずれか一項記載の方法。
  104. 核酸鎖の少なくとも1つが、検出可能な標識を含む、請求項83～103のいずれか一項記載の方法。
  105. 検出可能な標識が、蛍光分子、放射性同位体、ヌクレオチドクロモフォア、酵素、酵素基質、化学発光部分および生物発光部分、エコー源性物質、非金属同位体、光学レポーター、常磁性金属イオン、および強磁性金属からなる群より選択され、任意で、検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項104記載の方法。
  106. 前記記録核酸を合成することが、鎖置換ポリメラーゼを使用することを含む、請求項83～105のいずれか一項記載の方法。
  107. 前記所定の領域を選択することが、手作業によるかまたはコンピュータを利用する、請求項83～106のいずれか一項記載の方法。
  108. 処置のための候補のライブラリをスクリーニングするための請求項40～107のいずれか一項記載の方法の使用であって、請求項40～107のいずれか一項記載の方法によって所定の領域をイメージングおよびバーコーディングすることによって1つまたは複数の表現型マーカーを特定することを含む、前記使用。
  109. 1つまたは複数の表現型マーカーが、蛍光、形状、強度、組織染色、抗体染色、または形態学である、請求項108記載の使用。
  110. 候補のスクリーニングのための特定、薬物標的の特定、バイオマーカーの特定、プロファイリング、遺伝子型に対する表現型の細胞状態の特性評価、新たな疾患モデルの作製、細胞および疾患モデルの特性評価、分化状態および細胞状態の特性評価、組織マッピング、多次元分析、ハイコンテントスクリーニング、機械学習に基づくクラスタリングまたは分類、細胞療法開発、CAR-T療法開発、抗体スクリーニング、個別化医療、細胞濃縮、ならびにそれらの任意の組み合わせのための、請求項40～107のいずれか一項記載の方法の使用。
  111. 候補が、小分子薬、生物製剤、治療用核酸、遺伝子または細胞療法、siRNA、gRNA、ペプチド、タンパク質、抗体、代謝物質、ホルモン、およびDNAコードライブラリからなる群より選択される、請求項108～110のいずれか一項記載の使用。
  112. 請求項83～111のいずれか一項記載の方法を使用して生体分子をインビトロ、インビボ、インサイチューまたはイントトでバーコーディングするための方法において使用するための、請求項40記載のキット。
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