CN117425737A - 用于定位和分析生物样品中的单细胞的方法和构建体 - Google Patents

用于定位和分析生物样品中的单细胞的方法和构建体 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及用于下一代测序的生物样品的制备。特别地，本发明利用序列条形码和可见珠特征，诸如荧光标记组合，的组合来识别源自单细胞的mRNA产物并定位样品中的所述单细胞。为了实现这种效果，本发明提供了一种新构建体，其包括与此类可见特征偶联的珠，其中所述珠进一步通过可裂解、优选可光裂解的连接子与所述第一寡核苷酸偶联，所述第一寡核苷酸包括a)扩增柄序列，b)对所述珠特征特异的条形码序列，以及c)用于与互补序列杂交的锚定序列或捕获序列，优选poly‑A序列。

Description

用于定位和分析生物样品中的单细胞的方法和构建体
技术领域
本发明总体上涉及用于下一代测序的生物样品的制备。特别地，本发明利用微珠的随机组合，所述微珠具有与序列条形码偶联的显微镜可检测或以其他方式可见的标记，用于空间标记和识别源自单个位置的mRNA或DNA产物，并用于定位样品载玻片中的所述单个位置。
背景技术
在复杂的细胞环境中，组织的细胞常常表现出多种表型，这反映在细胞的RNA表达谱中。在现有技术中，RNA表达谱已应用于悬浮液中的单细胞，通常利用微孔或乳滴，其中单细胞与包被有独特细胞条形码序列和捕获裂解细胞的poly-AmRNA的poly-T的微珠封装在一起，在逆转录反应和cDNA合成中用细胞条形码序列标记mRNA的3’端(参见例如Macoskoet al 2015和Broad Institute Inc.的WO 2016040476)。测序后，源自相同原始细胞的mRNA转录本可以基于细胞条形码分组在一起，并生成所有细胞的单独基因表达谱。然而，目前的细胞条形码珠仅针对悬浮细胞。
为了了解组织内的组织结构、细胞功能和细胞间相互作用，需要将RNA表达数据与通过单细胞分辨率和高通量方式检查细胞或组织切片获得的细胞图像和空间信息联系起来。WO 2021046232公开了一种基于光学可读条形码的系统，用于表征单细胞的分子相互作用。该系统依赖于具有多个荧光标记的寡核苷酸探针的使用。仍然需要改进的方法。
发明内容
如所附权利要求中所限定的本发明基于具有可见标记的微珠的新颖设计，该可见标记与标记特异性条形码偶联，使得可以将获得的mRNA或DNA测序数据与生物样品中用于RNA表达分析的细胞的空间坐标联系起来。
本发明的一个目的是提供一种用于检测核酸靶标的构建体，所述构建体包括珠，优选磁珠，其中所述珠包括一种或多种视觉可检测特征和/或所述珠与一种或多种视觉可检测实体偶联，并且其中所述珠包括寡核苷酸，并且所述寡核苷酸包括a)扩增柄(amplification handle)序列，b)对所述视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列和c)3’末端捕获或锚定序列，并且其中所述寡核苷酸被布置为可从所述珠上分离。优选地，所述末端捕获或锚定序列包括poly-A序列，用于与市售细胞条形码珠上的互补poly-T序列杂交。
替代地，细胞条形码序列也可以与可见标记放置在同一构建体上。
本发明的另一个目的是提供一种组合物，其包括如上限定的几种构建体，优选地具有不同的视觉可检测特征或实体的混合物。
本发明的另一个目的是提供孔板或芯片，其包括装载至所述板或芯片的孔的根据本发明的组合物。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，其包括如上文所限定的孔板或芯片和计算机可读实体，所述计算机可读实体包括具有装载至所述板或芯片的孔的本发明组合物的所述板或芯片的照片或扫描文件。
本发明的另一个目的是提供所述构建体或组合物用于鉴定源自生物样品中的单细胞或位置的期望核酸靶标或mRNA测序产物的用途。
本发明的另一个目的是提供一种在单细胞水平上分析生物样品的方法，所述方法包括以下步骤：
-将本发明的构建体或组合物与生物样品一起或以任何顺序依次装载至包括孔的基底，
-在将所述生物样品装载至所述基底之前和/或之后，用显微镜、优选光学显微镜或荧光显微镜对所述基底中的孔进行拍照或扫描；和
-任选地确定装载的基底中具有不同的视觉可检测特征和/或实体或其组合的特定孔的位置或坐标。
附图说明
图1.A.当前的单细胞RNAseq方法，其使用将细胞条形码(CellBC)珠随机装载至孔或液滴中。独特的珠特异性细胞条形码和珠寡核苷酸(oligos)上的polyT序列捕获并标记来自裂解细胞的polyA RNA。然而，图像和数据之间的空间协调是不可能的。B.颜色条形码(颜色BC(ColourBC))微珠与CellBC珠结合的新方法为数据和图像提供空间坐标。多个不同颜色的ColourBC珠被随机装载至孔或液滴中，每个珠都带有可裂解的polyA尾颜色标记寡核苷酸，这些寡核苷酸将与来自细胞中的RNA一起结合到CellBC珠上，并将数据与空间位置联系起来。C.使用ColourBC珠而不使用CellBC珠进行空间条形码的替代方法。CellBC和ColourBC寡核苷酸都位于相同的ColourBC珠上，ColourBC寡核苷酸带有例如可光裂解的连接子。在每孔的多个珠中装载细胞后，ColourBC寡核苷酸从珠中释放出来，并被孔中所有珠中的CellBC寡核苷酸的互补序列捕获。ColourBC和CellBC组合的网络对于每个孔来说都是独特的，并且也由CellBC序列标记的RNA分子可以与基于显微镜扫描图像的空间位置联系起来。
图2.由蓝色(B)、绿色(G)、黄色(Y)、红色(R)四种荧光标记寡核苷酸以及0、1、2、3和4种颜色组合产生的16种不同Colour BC微珠的示例，其组合产生了16种不同类型的微珠。当这16种珠类型的混合物被随机装载至芯片孔，每个孔装配多个珠时，根据排列计算，它们可以在每个孔中形成65535种不同组合中的1种，从而使孔高度独特。附加颜色(荧光和非荧光)、不同的珠尺寸和形状以及Cell BC珠上还附有的颜色标签将进一步增加可能的组合数量。可能的组合数量使用https://stattrek.com/online-calculator/combinations-permutations.aspx上的工具计算。
图3.市售的CellBC条形码珠在其表面寡核苷酸上具有数百万个独特的CellBC序列拷贝，其通常通过拆分和池合成来产生，例如在DropSeq方法中，一段随机12核苷酸条形码产生近1700万个不同的条形码，并且因此产生1700万个不同的微珠(Macosko et al,Cell 2015May21；161(5):1202-1214)。寡核苷酸上的polyT片段将捕获并杂交来自组织切片的细胞的polyA尾RNA。CellBC珠在显微镜下看起来完全相同。在本发明中，来自16种不同类型的混合物的随机数量的ColourBC微珠将与CellBC珠一起装载至微孔中，并且它们的合成的、可光裂解的polyA尾寡核苷酸也将获得与相同微孔中细胞的RNA相同的CellBC序列。
图4.使用ColourBC坐标的替代方法，无需单独的CellBC珠。彩色或其他特征的珠各自携带两种类型的具有相应ColourBC的寡核苷酸，并且至少一种寡核苷酸还携带每个珠独特的CellBC以及任选的唯一分子条形码(UMB)。下图示出了使用该原理的一种方法：将(例如16种中的)3种珠类型随机设置在微孔中，并且通过紫外线或化学地释放它们合成的可(光)裂解的带有ColourBC的polyA末端寡核苷酸，微孔内容物与磁体混合，以及释放的寡核苷酸将与孔中所有3种珠的polyT寡核苷酸杂交，从而将其独特的CellBC与微孔中存在的所有ColourBC集合联系起来。细胞RNA还将获得3种珠的CellBC，并且来自这些映射的3个CellBC的序列数据将汇集在一起。除了所提供的寡核苷酸之外，ColourBC和CellBC的类似网络还可以与文库结构的其他位点形成：使用连接到ColourBC和PCRhandle2的随机引物(而不是合成polyA)，并且一旦释放，就使用其进行与第一链cDNA结合的珠的第2链合成。使用该原理的另一种方法是将CellBC和ColourBC元件放置到索引引物中的Illumina索引读取位置，并在密封的微孔内执行标记和索引PCR，这些引物是从每个微孔中的颜色条形码珠的随机混合中释放出来的。
图5.使用荧光显微镜扫描带有ColourBC微珠的微孔，保存缝合的数字图像，并通过图像分析程序记录每个微孔中的微珠组合。装载CellBC珠后，来自裂解细胞或组织切片的polyA RNA和通过UV从ColourBC微珠释放的合成polyA尾ColourBC寡核苷酸一起与CellBC条形码寡核苷酸杂交。在反转录、cDNA扩增、测序文库制备和测序后，从读段中确定CellBC序列。在针对靶基因组进行读段比对后，基因读段的计数以及ColourBC序列的读段计数被排序到每个CellBC的矩阵中。通过将ColourBC读段信息与每个微孔的分析的显微镜图像联系起来，可以解释每个CellBC的位置微孔坐标。
图6.将ColourBC珠与也着色的CellBC珠一起使用的替代方法。在此方法中，CellBC珠呈现出与ColourBC珠可区分的额外尺寸和/或颜色特征，并携带掺入至CellBC寡核苷酸中的特征匹配序列信息。由于CellBC珠具有多种特征，因此该方法比图1的方法产生更多数量的可能的珠组合，并且具有比图4的方法更简单的珠条形码合成过程。与图3的方法一样，这需要至少一种CellBC珠和一种ColourBC珠进入孔中。建议使用尺寸比ColourBC珠更大的CellBC珠，以最大化其表面积，从而提供更高的mRNA结合能力。在此实例中，具有(例如12个特征中的)颜色Col1和Col2的2种CellBC珠与具有(例如，16个特征中的)颜色组合B、BG和GYR的3种ColourBC珠位于一个孔中。如图3所示，带有ColourBC的合成(光)可裂解polyA末端寡核苷酸通过UV光或化学地释放，并且释放的寡核苷酸将与两种CellBC珠的polyT寡核苷酸杂交。结合的细胞polyA RNA还将从这些相同的2种CellBC珠中获得独特的条形码，并且可以合并来自这些珠的序列数据。如果芯片包含具有Col1 CellBC珠和相同3个ColourBC珠的孔以及具有Col2 CellBC珠和同样3个ColourBC珠的孔，则即使对珠特异的CellBC序列不同，从这些孔中绘制数据的空间图也具有挑战性。在这种情况下，细胞条形码之间的转录组谱相似性可用于空间预测。此外，ColourBC珠可以具有用于相同颜色或可见特征的多个替代序列标签，以增加序列水平上不同组合的数量，例如视觉上相同的蓝色珠具有B1(GCACTA)、B2(TCTAGG)、B3(CATTGT)序列，所有序列均独立标记蓝色珠。
图7.在孔中使用ColourBC珠的替代方法，其中CellBC寡核苷酸固定在孔底和/或壁表面，而不是珠表面。可以通过多种方式(例如通过桥式扩增)产生CellBC1-CellBC(n)序列的随机集，该序列对于每个孔唯一的，并且每个孔具有至少有一个。首先，将PCRhandle1寡核苷酸(SEQ ID NO:31)与单独的可切割聚A寡核苷酸(SEQ ID NO:32)一起紧密固定到所有孔中，并且然后用作模板寡核苷酸的桥式扩增PCR中的引物，该模板寡核苷酸包含PCRhandle1的反向互补序列、随机CellBC序列，例如N(12)或NNNNNNNNNNNN，和polyA序列(SEQ ID NO:33)。将模板寡核苷酸以非常稀的浓度添加到桥式扩增PCR反应中允许每孔仅对一个或几个不同的CellBC序列进行局部聚集，从而在每孔中产生扩增的细胞条形码的独特集合。PCR后，polyT寡核苷酸被切割并去除，仅将包含mRNA捕获寡核苷酸的单链CellBC留在孔表面。此后，可以向孔阵列装载细胞和随机的ColourBC珠集合，其具有包括PCRhandle2、特征标记条形码和polyA的寡核苷酸，并且对孔阵列进行成像。这种来自ColourBC珠的可裂解寡核苷酸将与来自裂解细胞的mRNA一起与固定的CellBC寡核苷酸结合，为每个细胞和孔提供空间信息，如前面的图中所示。
具体实施方式
下面详细描述的构建体、组合物和方法提供了在单细胞转录组数据中以每次实验数万个细胞的规模生成生物样品诸如组织切片的单细胞的位置数据的手段。通过使用本文描述的组合物可以增强许多诊断技术和用于测定各种疾病状态的应用的效率。本文描述的方法和组合物通过以前所未有的规模组合来自相同单细胞的位置信息和转录物，极大地扩展了单细胞表型分析的能力。
提供以下定义是为了清楚地描述本文的构建体和组合物，并且不旨在限制要求保护的发明。
如本文所用，术语“构建体”是指化学合成的且任选地基因工程化的组装体，其包括通过连接子连接(优选共价地)至至少一个寡核苷酸序列的珠。每个寡核苷酸序列优选地包括多个功能元件：扩增柄序列；条形码序列、位于条形码5’或3’端附近的任选的唯一分子条形码(UMB)序列，以及锚序列，其用于与包括与锚互补的序列的捕获序列杂交。
术语“珠”在本文中是指固体支持物，其可以涵盖由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成的任何类型的固体、多孔或空心球体、球、轴承、圆柱体或其他类似构造，其上可以固定(例如，共价地或非共价地)核酸。珠可以包括离散颗粒，其可以为球形(例如，微球体)或具有非球形或不规则形状，诸如立方体、长方体、金字塔形、圆柱形、圆锥形、长方形或盘形等。
术语“扩增柄”通常指本公开的构建体中的寡核苷酸序列的功能组件，其提供用于扩增寡核苷酸序列的退火位点。在一些实施方式中，当存在于第一或附加寡核苷酸序列中时，扩增柄可以相同或不同，这取决于旨在用于扩增的技术。
术语“条形码”(BC)一般描述限定的寡核苷酸序列，当其是本公开的构建体的功能元件时，其可用于鉴定基底中的特定细胞或孔。
术语“唯一分子条形码”(UMB)一般指随机核苷酸，当其是本公开的构建体的功能元件时，其对该构建体是特异性的。UMB允许鉴定与其缔合的构建体寡核苷酸序列的扩增副本。
“连接子”是指用于将珠附着或缔合至构建体的寡核苷酸序列部分的任何部分。因此，在一种实施方式中，连接子是共价键。在另一种实施方式中，连接子是非共价键。在一种实施方式中，组合物和方法的构建体中使用的连接子是可裂解的。在一种实施方式中，组合物和方法的构建体中使用的连接子是不可切割的。不受限制地，在一种实施方式中，连接子是可裂解连接子，例如二硫键或可光裂解键。在实例中，构建体的各部分通过链霉亲和素-生物素键彼此连接。在另一种实例中，连接子包括生物素通过二硫键与构建体寡核苷酸序列结合的复合物，其中链霉亲和素与珠融合并被包被至珠。在另一种实施方式中，生物素被包被到珠上并且链霉亲和素被融合到构建体寡核苷酸序列上。在另一种实施方式中，珠表面被羧化并且寡核苷酸序列被胺化并通过EDC反应连接至珠。可光裂解的氨基基团可用于利用UV光进行光裂解。
术语“基底”优选是指载玻片、多孔板或芯片。基底是常规的并且可以是玻璃、聚合物或适合于特定测定或诊断方案的任何常规材料。基底可以包括用于定位来自生物样品的细胞的微孔矩阵。基底也可以是具有孔结构并在孔底部具有微孔的膜，以便更容易洗涤和珠装载。
术语“可见的”和“视觉上可检测的”在本文中用于指本发明的构建体的特征或与所述构建体偶联的实体，其可在有或没有预先照明、或化学或酶激活的情况下通过目视检查观察到。在本发明的实施方式中，此类视觉上可检测的特征可以指构建体的颜色、尺寸或形状。替代地，此类视觉上可检测的特征可以吸收和发射在约400至约800nm范围内的光谱区域中的光。出于本发明的目的，通过其可见特性检测本发明的构建体意味着优选地借助基于光学的检测装置，包括但不限于吸收分光光度计、透射光显微镜、荧光显微镜、数码相机和扫描仪，在有或没有照明或化学或酶活化的情况下观察该构建体。
如本文所用，本文描述的方法中所使用的“生物样品”是指包括一种或多种细胞的天然存在的样品或有意制备的样品或文库。在一种实施方式中，样品包含细胞群或细胞碎片，包括但不限于细胞膜组分、外泌体和亚细胞组分。细胞可以是同质细胞群，诸如特定类型的分离细胞，或不同细胞类型的混合物，诸如来自人类或哺乳动物或其他物种受试者的生物流体或组织。用于该方法和组合物的其他样品包括但不限于血液样品，包括血清、血浆、全血和外周血，唾液和尿液。在一种实施方式中，样品是“组织切片”，指从受试者获得、固定、切片并封固在平面表面(例如显微镜载玻片)上的组织的片。组织切片也可被分类为“平面细胞样品”，指的是包含细胞的基本上平面的(即二维的)材料。平面细胞样品可以通过例如将包含细胞的三维组织活检切割成切片并将切片封固到平面表面上来制备。可以使用任意数量的试剂来固定细胞，包括福尔马林、乙醇、甲醇、DSP、多聚甲醛、甲醇:乙酸和其他类似的固定或组织/RNA稳定试剂。
本文描述的构建体和方法可用于分析来自受试者的细胞以确定例如组织中存在何种类型的细胞类型、它们存在在哪些位置和比例、细胞是否正常或确定细胞是否对治疗有反应。在一种实施方式中，该方法可用于确定癌细胞的异型增生程度。在这些实施方式中，细胞可以是来自多细胞生物体的样品。生物样品可以从个体中分离，例如从软组织中分离。在特定情况下，该方法可用于区分新鲜冷冻、冷冻保存和甲醇固定或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品中不同类型的癌细胞。在替代实施方式中，上述方法可以在已经以其他方式固定的平面细胞样品上实施。
在实施方式中，本发明涉及一种用于检测核酸靶标的构建体，所述构建体包括珠，优选磁珠，其中所述珠包括一种或多种视觉可检测特征和/或所述珠与一种或多种视觉可检测实体偶联，并且其中所述珠包括寡核苷酸，并且所述寡核苷酸包括a)扩增柄序列，b)对所述视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列和c)3’末端捕获或锚定序列，并且其中所述寡核苷酸被布置为可从所述珠上分离。
在优选的实施方式中，所述视觉可检测特征是珠的尺寸、珠的颜色、珠的形状或其组合。
在另一优选的实施方式中，所述寡核苷酸通过可裂解键与所述珠连接。
在另一优选的实施方式中，所述可裂解键是可光裂解的链霉亲和素-生物素或羧酸盐-胺键。
在另一优选的实施方式中，所述珠通过链霉亲和素-生物素或羧酸盐-胺键或通过任何其他键与所述一种或多种视觉可检测实体偶联。
在另一优选的实施方式中，所述一种或多种视觉可检测实体包括荧光标记，优选但不限于选自由以下组成的组：花青染料、德克萨斯红染料和荧光素脒染料。
在另一优选的实施方式中，所述珠还偶联至抗原或抗体。
在另一优选的实施方式中，所述扩增柄序列与包括下一代测序兼容衔接子序列的PCR引物互补。
在另一优选的实施方式中，所述构建体包括与所述珠偶联的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括a)第二扩增柄序列，其优选与包括下一代测序兼容的衔接子序列的PCR引物互补，b)对所述珠的视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列，c)对所述珠特异的条形码序列，d)任选的唯一分子条形码序列，以及e)末端poly-T序列。
在另一实施方式中，本发明涉及包括如上所限定的构建体的组合物。
在优选的实施方式中，所述组合物包括提供不同的视觉可检测特征或实体的混合物的几种构建体的混合物。
在优选的实施方式中，所述几种构建体的混合物包括至少2、3、4、5或6种，优选至少16种单独的视觉可检测特征和/或实体。
在优选的实施方式中，所述组合物包括多个所述构建体，所述构建体具有至少15个可变组的视觉可检测特征，诸如与所述构建体偶联的荧光标记，其中
在第一构建体中，所述荧光标记由第一荧光染料组成；
在第二构建体中，所述荧光标记由第二荧光染料组成；
在第三构建体中，所述荧光标记由第三荧光染料组成；
在第四构建体中，所述荧光标记由第四荧光染料组成；
在第五构建体中，所述荧光标记由第一和第二荧光染料的混合物组成；
在第六构建体中，所述荧光标记由第一和第三荧光染料的混合物组成；
在第七构建体中，所述荧光标记由第一和第四荧光染料的混合物组成；
在第八构建体中，所述荧光标记由第二和第三荧光染料的混合物组成；
在第九构建体中，所述荧光标记由第二和第四荧光染料的混合物组成；
在第十构建体中，所述荧光标记由第三和第四荧光染料的混合物组成；
在第十一构建体中，所述荧光标记由第一、第二和第三荧光染料的混合物组成；
在第十二构建体中，所述荧光标记由第一、第三和第四荧光染料的混合物组成；
在第十三构建体中，所述荧光标记由第二、第三和第四荧光染料的混合物组成；
在第十四构建体中，所述荧光标记由第一、第二和第四荧光染料的混合物组成；和
在第十五构建体中，所述荧光标记由第一、第二、第三和第四荧光染料的混合物组成。
在另一优选的实施方式中，所述第一荧光染料为Cy5，第二荧光染料为Cy3，第三荧光染料为Atto425，并且第四荧光染料为FAM。
在另一优选的实施方式中，在具有或不具有荧光染料的珠中使用不同的尺寸、形状或可见(非荧光)颜色，以产生多种不同的珠构建体。
在另一优选的实施方式中，所述组合物还包括第二构建体(即CellBC珠)，其包括与第二寡核苷酸偶联的珠，所述第二寡核苷酸包括a)第二扩增柄序列，b)对珠特异的条形码序列，c)任选的唯一分子条形码序列，和d)用于与互补序列杂交的第二锚定序列，优选poly-T序列。
在另一优选的实施方式中，包括a)第二扩增柄序列，b)对珠特异的条形码序列，c)任选的唯一分子条形码序列，和d)第二锚定序列，优选poly-T序列的所述第二寡核苷酸可以直接附着或固定到基底中的孔的底部和/或壁上(参见例如图7)。
在另一实施方式中，本发明涉及如上定义的构建体或组合物用于鉴定源自单细胞的mRNA测序产物的用途。
在另一实施方式中，本发明涉及一种在单细胞水平上分析生物样品的方法，该方法包括以下步骤：
-将如本公开中定义的构建体或如本公开中定义的组合物与生物样品一起或以任何顺序相继装载至包括孔的基底，
-在将所述生物样品装载至所述基底之前和/或之后，用显微镜、优选光学显微镜或荧光显微镜对所述基底中的孔进行拍照或扫描；和
-任选地确定装载的基底中具有不同的视觉可检测特征和/或实体或其组合的特定孔的位置或坐标。
孔/样品的位置或坐标的确定是通过检查在该方法中获得的照片或扫描图片来实现的，因为本发明的构建体的视觉特性在照片或扫描图片中是可见的，以及因此可以确定每种类型的构建体或其混合物的位置。在优选的实施方式中，在本发明的方法中，对基底中的孔/样品仅进行一次拍照或扫描，即，本方法不需要对具有变化的标记组(诸如标记的寡核苷酸探针或标记的珠)的基底进行连续拍照或扫描。
在优选的实施方式中，该方法包括以下步骤：
-将本发明中所定义的构建体或组合物与生物样品一起或以任何顺序相继装载至包括微孔的基底，
-用显微镜，优选光学显微镜或荧光显微镜拍摄或扫描所述基底中装载的微孔，
-使微孔中的样品经受支持细胞裂解、核酸释放的条件，然后任选地进行逆转录酶反应，
-扩增释放的核酸或逆转录酶反应产物，以便于制备扩增产物的测序文库，其中扩增产物含有对构建体的一种或多种视觉可检测特征和/或实体特异的条形码序列,
-制备测序文库并对文库进行测序；以及
-任选地通过分析具有对所述构建体的视觉可检测特征和/或实体特异的条形码信息的测序数据来鉴定每个测序的产物源自的特定微孔位置，以将特定的视觉可检测特征和/或实体或其组合与测序的产物联系起来，并确定在该方法中拍摄或扫描的装载基底中具有相应视觉可检测特征和/或实体或其组合的特定微孔的位置。
因此，本发明可用于通过以下来产生单细胞测序文库：将独特条形码的mRNA捕获微珠与微孔中的单细胞合并；裂解细胞，从而将mRNA捕获在微珠上的mRNA捕获寡核苷酸上；在所述微孔中进行逆转录反应以将细胞的mRNA转化为包含所述唯一条形码的第一链cDNA，所述唯一条形码记录微孔板中每个mRNA的位置，并且随后对产生的cDNA进行测序。
在优选的实施方式中，该方法包括以下步骤：
i)提供根据本发明的多个构建体，其中所述构建体包括多个第一珠，其中所述第一珠具有视觉可检测特征和/或实体诸如颜色、标签、特定珠尺寸或形状的特定组合，并且其中所述第一珠通过可光裂解连接子偶联至第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括a)扩增柄序列，b)对所述视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列和c)包括poly-A序列的末端序列；
ii)将步骤i)中获得的多个构建体与包括含有第二寡核苷酸磁珠的捕获构建体以及包括单细胞的生物样品一起随机装载到微孔中，所述第二寡核苷酸包括a)第二扩增柄序列，b)对所述磁珠特异的条形码序列，c)任选的唯一分子条形码序列，和d)包括poly-T序列的第二末端序列，或替代地将细胞或组织切片放置在包括微孔的基底上的载玻片上；以及
iii)用荧光或光学显微镜对装载的基底进行拍照或扫描。
在更优选的实施方式中，该方法还包括以下步骤：
iv)用例如半透膜或另一种多孔材料、油或凝胶层、或表面上携带细胞或组织的载玻片来密封或分隔装载基底的微孔；
v)利用冷冻或加热步骤，或利用通过微孔顶部或底部的膜或多孔密封添加到微孔中的裂解缓冲液，或由凝胶密封携带的裂解剂，裂解所述细胞以在微孔内释放mRNA；
vi)通过使所述基底经受UV光，将所述第一寡核苷酸从所述第一珠分离，并且使微孔中的样品经受支持所释放的mRNA和第二寡核苷酸以及第一和第二寡核苷酸的poly-A和poly-T序列彼此退火的条件，以便将所述mRNA和第一寡核苷酸结合至所述捕获构建体的磁珠；
vii)收集并合并来自所述微孔的样品，并用磁体和离心促进的洗涤步骤将具有附着的mRNA以及结合的第一和第二寡核苷酸的磁珠与样品内容物的其余部分分离；
viii)使具有附着的mRNA以及第一和第二寡核苷酸的分离的磁珠与包括第三扩增柄序列的模板转换寡核苷酸进行逆转录酶反应；替代地，可以在步骤vii)中的收集和合并之前直接在微孔上进行逆转录；
ix)用与第一、第二和第三扩增柄序列或其互补物结合的引物对所述逆转录酶反应的产物进行PCR反应，以产生不附着于所述磁珠的PCR反应产物；
x)使所述PCR产物与所述磁珠分离；
xi)任选地将所述PCR产物按大小选择为具有长度低于约200bp的第一组序列和具有长度高于约200bp的第二组序列；
xii)引入测序索引和衔接子序列(必要时优选使用适当的标签化、片段化、末端修复、A加尾、连接或基于PCR的方法)并对PCR产物进行测序，任选地在步骤xi)中获得的组中；
xiii)通过分析测序数据，优选地通过对存在于相同测序的PCR产物中的源自所述第一寡核苷酸的视觉可检测特征和/或实体或其组合特异的条形码序列和对源自所述第二寡核苷酸的磁珠特异的条形码序列和/或任选地源自所述第二寡核苷酸的唯一分子条形码序列的组合与包括mRNA序列和对源自所述第二寡核苷酸的珠特异的条形码序列和/或任选地源自所述第二寡核苷酸的唯一分子条形码序列的组合的测序PCR产物进行比较，来鉴定单细胞的mRNA产物；
xiv)任选地通过比较对源自所述第一寡核苷酸的视觉可检测特征和/或实体或其组合特异的条形码序列的组合和步骤iii)中用荧光或光学显微镜拍摄的装载基底的照片或扫描来定位所述单细胞或组织位置。
在另一优选的实施方式中，该方法包括以下步骤：
i)提供包括如上定义的第一和第二寡核苷酸的多个构建体，其中所述构建体包括多个第一珠，其中所述第一珠具有视觉可检测特征和/或实体诸如颜色、标签、特定珠尺寸或形状的特定组合，并且其中所述第一珠通过可光裂解连接子偶联至第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括a)扩增柄序列，b)对所述视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列，和c)包括polyA序列的末端序列，并且其中所述第一珠还包括与所述珠偶联的多个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括a)与包括下一代测序兼容的衔接子序列的PCR引物互补的第二扩增柄序列，b)对所述珠的视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列，c)对所述珠特异的条形码序列，d)任选的唯一分子条形码序列，以及e)末端poly-T序列；
ii)将步骤i)中获得的多个构建体随机装载到微孔和包括单细胞的生物样品中，或者替代地将载玻片上的细胞或组织切片放置到包括微孔的基底上；以及
iii)用荧光或光学显微镜对装载的基底进行拍照或扫描。
在本发明的优选实施方式中，本发明构建体的检测不依赖于向所述孔/样品中添加一种或多种寡核苷酸探针，一种或多种所述探针包括光学可读标记并具有与所述第一和/或第二寡核苷酸互补的一种或多种序列。
虽然以下实施例在一个或多个特定应用中说明了本发明的原理，但是对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，可以在不运用创造性能力且不背离本发明的原理和概念的情况下对实施的形式、用途和细节进行多种修改。因此，除了所附权利要求书之外，本发明并不受到限制。
动词“包含”和“包括”在本文中用作开放式限制，其既不排除也不要求还存在未列举的特征。除非另有明确说明，从属权利要求中记载的特征可以相互自由组合。此外，应当理解，在整个本文中使用“一个”或“一种”，即单数形式，并不排除复数形式。
在整个说明书中对一种实施方式或实施方式的引用意味着结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一种实施方式中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“在优选实施方式中”或“在实施方式中”不一定都指同一实施方式。当使用术语诸如，例如大约或基本上来引用数值时，还公开了精确的数值。
实验部分
以下实施例公开了本方法的四种版本，以产生用于单细胞或组织的空间RNAseq分析的视觉珠条形码坐标。这些实施例不应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实施例1
颜色条形码微珠的设计和验证
设计了16种不同的颜色条形码微珠构建体，其中直径尺寸为2.8μm的磁性和链霉亲和素包被的Dynabeads(M-280,ThermoFisher Scientific,catalog number 11205D)用作珠骨架。对于珠的单色或多色染色，具有10个C的片段作为间隔物并且每个在3’端具有不同的荧光蓝色(Atto425)、绿色(FAM)、黄色(Cy3)和红色(Cy5)标记的四个短的5’生物素化寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies(SEQ ID NO:22-25)。染色寡核苷酸的序列无关紧要，并且可以用其他序列或间隔分子替换。设计了在5’端具有可光裂解生物素(PCbio)(通过300-350nm波长的UV暴露释放)的另一组16种不同颜色条形码标记寡核苷酸(SEQ IDNO:1-16)，具有以下特征：用于下一代测序文库制备的5’端通用扩增柄(PCR柄2)、每个珠颜色构建体特有的独特条形码序列以及3’端的聚A延伸(图4和图5的表)。制备了16批珠，每批珠具有16种颜色条形码寡核苷酸中的一种。其中15个批次还用1、2、3或4种荧光标记的生物素化寡核苷酸的不同组合进行染色。第16批珠用作非荧光珠，仅用颜色条形码寡核苷酸标记。
链霉亲和素Dynabeads每mg的珠能够结合～200pmol的生物素化DNA寡核苷酸，以及标记和未标记的寡核苷酸以1:1至1:10的比例添加至珠，具体取决于每种荧光染料的信号强度。在滚动管中在RT下孵育15min后，用PBS彻底洗涤珠5次，并在每轮洗涤中通过磁体沉淀。这些步骤中使用了1X Dynabead结合和洗涤(B&W)缓冲液(5mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.5mM EDTA、1M NaCl)。使用Zeiss AxioImager显微镜检查荧光强度和珠完整性。每个用户实验室都需要调整标签的选择、染色强度和暴露时间，以与其荧光显微镜规格兼容。通过以下测试每16个珠批次的颜色条形码寡核苷酸的正确结合和释放：将其与商业细胞条形码珠(MACOSKO 2011-10B，ChemGenes，USA，以下称为CellBC或细胞条形码珠)一起孵育，并进行10min的UV暴露(Bio-Rad ChemiDoc成像系统)以释放寡核苷酸，然后进行20min的polyA与polyT杂交，随后用磁体使非磁性CellBC珠与磁性Color条形码珠分离，CellBC珠的3轮彻底的SSC缓冲液(Sigma Aldrich，目录号S6639)洗涤和离心步骤、批量反应中的PCR扩增(SEQID NO:19和26)以及正确大小(～180bp)产物的凝胶电泳检测。质量检查后，将制备的16个珠批次按等比例混合，并将该储备珠混合物储存在+4的Tris-PBS缓冲液中并避光。
微孔阵列装载
将包括～100 000个珠的ColourBC珠储备混合物的等分试样用磁体沉淀并洗涤一次，以及然后通过用移液器彻底但温和地混合至少20次，将其悬浮于200μl PBS中，以及然后随机装载至1cm x 1cm的微孔阵列区域，该区域由20000个尺寸为20μm直径和20μm深度的微孔组成(由聚二甲基亚砜(PDMS)设计和制造的定制几何结构，但根据Gierahn et al2017的Seq-Well方案进行功能化)。阵列区域周围的可拆卸硅胶框架和缓冲液顶部的玻璃盖玻片用于帮助实现相同的装载效率并防止缓冲液蒸发。将扁平磁体放置在阵列载玻片下方以固定珠装载。在10min的装载过程中，小心地移除磁体两次，并轻轻水平摇动芯片，以增强微孔之间剩余的珠沉降到孔中。还在光学显微镜下检查装载质量。除去额外的缓冲液，将载玻片阵列保持在磁体上，并让载玻片避光干燥至少30min。装载并干燥的阵列在+4℃下避光保存在有盖的培养皿中，直到下一步骤。
坐标的图像分析
荧光显微镜扫描仪Zeiss AxioImager用于扫描整个阵列区域，以用于在珠上使用的4种荧光颜色及其组合，并使用相关的Zen 2.3Lite程序来形成该区域的单个缝合大图像。图像以堆叠多层图像格式保存为4个荧光和1个光学显微镜通道。使用专为显微镜图像分析设计的特定机器学习软件创建、训练和验证图像分析和机器学习算法。算法经过训练，以基于其颜色组合识别16种不同类别的珠(构建体)，识别直径尺寸为20μm的微孔，计算每个微孔内这些珠类别的每种类型的数量，并为每个这样的特征组合给出阵列上的X-Y定位坐标。几乎所有用该装载方案装载的孔每孔包含1至超过10个珠，根据泊松分布(Poissondistribution)预测，大多数微孔具有3-8个珠。在16种可能的特征中，理论上总共有65535种可能的组合(图2)，并且AI算法绘制并记录了具有独特珠特征组成的孔。非唯一组合的列表也被标记到图上。
除非立即进行下一步骤，否则可以预先在储备中制备预装和图像协调的载玻片，并在+4℃干燥条件下保存，如果处理的话，下面有磁体，并避光和防尘。
将Seq-Well方案与本方法相结合的单细胞RNAseq实验
预装载和成像的芯片用PBS润湿2小时，芯片下方有磁体并避光。将在10μm直径的聚苯乙烯珠上定制合成(ChemGenes，MACOSKO-2011-10B，具有SEQ ID NO:17，Macosko etal 2015中描述的合成)的20000个市售细胞条形码(CellBC)珠预洗涤，并将200μl体积的珠装载缓冲液(Gierahn et al2017的配方)装载到所需的微孔区域，轻轻水平摇动30min，并使用硅框架和避光。此后，添加200μl RPMI培养基中的5000个外周血单核细胞，并使细胞以类似方式沉降30min。用半透膜密封孔并用裂解缓冲液裂解细胞，改编自Seq-Well方案(Gierahn et al 2017)。使用5min的UV光暴露，从颜色条形码珠中释放可光裂解的寡核苷酸。孵育20min后，除去膜，收集并洗涤CellBC珠，用模板转换寡核苷酸(SEQ ID NO:18)逆转录进行第1链cDNA合成，随后进行ExoI处理、全长cDNA(SEQ ID NO:19)的PCR扩增和基于标记的Illumina文库制备(SEQ ID NO:20和标准Illumina Nextera i7索引引物)，并遵循DropSeq(Macosko et al 2015)和Seq-Well(Gierahn et al2017)方案，采用适当的洗涤、纯化和定量步骤。遵循ADT(抗体确定标签)文库的CITE-seq方案(Stoeckius et al 2017)，进行<200bp片段的大小选择以及连接至细胞条形码的颜色条形码的单独文库制备(具有SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)。
测序和数据分析
使用Illumina NextSeq500平台和高输出75循环测序试剂盒对文库进行测序。使用定制的读段1测序引物(SEQ ID NO：21)对读段1的20bp进行测序，其覆盖源自CellBC珠的12bp细胞条形码和8bp分子条形码(UMB)。测序盒中包含的标准Illumina读段2测序引物生成源自由CellBC珠捕获的mRNA的基因序列的55bp读段，以及源自同样由CellBC珠捕获的UV分离特征寡核苷酸的颜色珠条码。原始fastq文件的处理遵循公开的Drop-Seq数据分析管道(Macosko et al 2015)，并且对于颜色条形码，遵循CITE-seq管道(Stoeckius et al2017)。根据与参考基因组比对的转录本计数和链接到相同细胞条形码的颜色条形码计数产生组合基因表达矩阵。该矩阵进一步与孔中细胞和珠的空间X-Y坐标的视觉图相匹配，该图是先前通过显微镜扫描仪图像的机器学习算法创建的。
实施例2
使用仅组合到单个荧光标记FAM的珠的不同尺寸(3、6、8或10um)和视觉颜色测试实施例1中描述的方案的另一种变体。这种珠组更容易与多种最终用户显微镜一起使用，因为与多荧光激发、发射和滤光片组相比，它们需要更少的优化，并且某些珠可能存在自发荧光限制。许多供应商(例如Spherotech、Bangs Laboratories、PolySciences、Abvigen)提供各种尺寸、颜色和表面涂层或功能化的珠。当使用羧化珠代替链霉亲和素涂层时，订购了具有5’胺基团而不是生物素的FAM标记的染色寡核苷酸，并且分别订购了具有可光裂解的5’末端胺基团的颜色条形码寡核苷酸(GeneLink)。按照试剂提供商(ThermoFisherScientific，目录号22980)的说明，使用EDC活化在珠上的羧基基团和寡核苷酸的伯胺之间形成酰胺键。对于非磁珠，它们在相同的EDC反应中用胺化磁性纳米颗粒(Merck LifeScience，目录号747327)磁化。在混合珠批次之前，将连接的珠彻底洗涤至少3次，以去除未结合的寡核苷酸和标记。除此之外，方案与实施例1类似，使用配备彩色相机的AxioImager荧光显微镜扫描装载的珠，并使用机器学习算法分析与绿色荧光图像(用于FAM标签)堆叠的拼接彩色图像，该算法被教导识别以下20类珠，并从每个微孔中识别和计数它们。20种珠类型池中的随机珠组在每孔中产生超过一百万个独特的珠类型组合(https://stattrek.com/online-calculator/combinations-permutations.aspx)，作为20种珠类型中所有可能的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20种珠组合的总和，每个孔有总计20+190+1140+4845+15504+38760+77520+125970+167960+184756+167960+125970+
77520+38760+15504+4845+1140+190+20+1＝1048575种可能组合。例如，在具有10000个孔并以泊松分布随机装载80000个珠的阵列中，仅具有0、1或2个珠的非信息/非唯一孔的比例可以保持在小于2％。
实施例2中产生的20种珠类型：
蓝色-3um-非荧光
蓝色-6um-非荧光
黄色-3um-非荧光
黄色-6um-非荧光
红色-3um-非荧光
红色-6um-非荧光
无色-3um-非荧光
无色-6um-非荧光
无色-8um-非荧光
无色-10um-非荧光
蓝色-3um-FAM
蓝色-6um-FAM
黄色-3um-FAM
黄色-6um-FAM
红色-3um-FAM
红色-6um-FAM
无色-3um-FAM
无色-6um-FAM
无色-8um-FAM
无色-10um-FAM
实施例3
该方案的另一种变体是没有商业细胞条形码珠的方法，但是相反细胞条形码寡核苷酸与ColourBC寡核苷酸一起由颜色或其他明显特征的珠携带(参见图4)。任选地，特征珠上携带的新CellBC寡核苷酸还携带与珠的颜色或特征组合相匹配的附加ColourBC序列(SEQ ID NO:28)。不过，重要的是，特征珠还携带单独的可裂解ColourBC寡核苷酸，该寡核苷酸被释放并由给定孔中的所有珠随机捕获。使用由PCRhandle1和任选的ColourBC组成的生物素化主链寡核苷酸为每个珠批次产生独特的CellBC寡核苷酸序列。为了产生它们，从根据Macosko et al 2015中描述的方案改编了12bp珠特异性CellBC、8bp完全随机分子条形码和30bp poly-T序列的拆分和池合成。此后，将具有polyA末端和5’上的可光裂解生物素并且与实施例1相同的ColourBC寡核苷酸附着到珠批次上，洗涤5次，并且然后将所有珠特征批次混合并用于微孔实验中。如实施例1中那样装载珠并成像，但在以下步骤中不添加商业CellBC珠。细胞或组织装载和进一步分析另外遵循实施例1和4。每个孔的多个珠产生每个孔的多个细胞条形码，但由于颜色或特征组合是独特的，其允许将多个细胞条形码与每个孔中的单个独特ColourBC组合进行匹配，并且这在该方法版本的生物信息学分析流程中是允许的。
实施例4
该方法的另一种变化是使用珠条形码微孔从冷冻保存或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片中直接空间捕获RNA，而不是悬浮中的解离细胞。为此，使用冷冻切片机将速冻和TissueTek OCT化合物(Sakura)包埋的小鼠乳腺肿瘤组织在标准显微镜载玻片上切成10μm厚的切片，并保存在-80℃直至使用。用甲醇固定切片并用标准苏木精-伊红(HE)染色方案染色，然后进行光学显微镜图像扫描以使组织结构可视化。将先前制备的预装载有ColourBC珠并进行荧光成像(如实施例1和3中所述)的微孔载玻片保持在磁体上并用细胞透化缓冲液(0.1％胃蛋白酶的0.1N HCl溶液)润湿。将润湿的阵列放置在加湿的桌面室上，以防止在以下步骤中少量液体从微孔中蒸发。将载玻片保持在室内，从载玻片顶部除去过量的裂解缓冲液，然后立即将组织切片载玻片放在其顶部，以便裂解缓冲液充满孔并与组织接触。贴在组织载玻片背面的薄金属片有助于通过微孔载玻片下方磁体的力量将其紧紧固定并保持在适当的位置。替代地，可以使用机械夹子。在室温下使细胞裂解并使mRNA在珠上杂交15min。如实施例1中那样，在开始时引入5min UV暴露，以从珠中释放颜色条形码寡核苷酸，并使它们与来自裂解细胞的mRNA一起与细胞条形码寡核苷酸杂交。此后，快速移动组织载玻片，并且在其仍位于磁体上的情况下，立即用SSC缓冲液洗涤微孔阵列4次，以去除过量的未杂交RNA和U释放的寡核苷酸。通过将载玻片倒置至具有SSC缓冲液的载玻片室中并用室下方的磁体将珠拉下，从微孔载玻片收集珠。在使用商业非磁性CellBC珠的实施例1方案的情况下，还需要载玻片离心步骤。将缓冲液中的珠收集到单个Eppendorf管中并沉淀。以下逆转录和文库制备步骤如实施例1中所述在珠上的批量反应中进行，严格遵循Macosko et al 2015、Gierahn et al 2017和Stoeckius et al 2017中描述的方案。数据分析在其他方面与实施例1中描述的类似，但此外，原始HE染色组织切片的显微镜图像覆盖在源自珠协调孔位置的基因表达的空间测序信息之上。匹配覆盖的组织和阵列图像是通过微孔载玻片的测序数据产生区域的形状以及用显微镜记录并与图像对齐的两张载玻片上的内置辅助标记点来引导的。
参考文献
Gierahn TM,Wadsworth MH 2nd,Hughes TK,Bryson BD,Butler A,Satija R,Fortune S,Love JC,Shalek AK.Seq-Well:portable,low-cost RNA sequencing ofsingle cells at high throughput.Nat Methods.2017Apr；14(4):395-398.doi:10.1038/nmeth.4179.Epub 2017Feb 13.PMID:28192419；PMCID:PMC5376227.
Macosko EZ,Basu A,Satija R,Nemesh J,Shekhar K,Goldman M,Tirosh I,Bialas AR,Kamitaki N,Martersteck EM,Trombetta JJ,Weitz DA,Sanes JR,Shalek AK,Regev A,McCarroll SA.Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.2015May21；161(5):1202-1214.doi:10.1016/j.cell.2015.05.002.PMID:26000488；PMCID:PMC4481139.
Stoeckius M,Hafemeister C,Stephenson W,Houck-Loomis B,ChattopadhyayPK,Swerdlow H,Satija R,Smibert P.Simultaneous epitope and transcriptomemeasurement in single cells.Nat Methods.2017Sep；14(9):865-868.doi:10.1038/nmeth.4380.Epub 2017Jul 31.PMID:28759029；PMCID:PMC5669064。
寡核苷酸序列及其修饰的列表：
SEQ ID NO:1:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCAATCACG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:2:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCATTAGGCBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:3:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TGACCABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:4:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA ACAGTGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:5:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCCAATBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:6:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCACAGATCBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:7:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCAACTTGABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:8:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TGAACGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:9:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA CTGAGABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:10:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCATAGCTGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:11:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCAAATACGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:12:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCATTCCAGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:13:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA ATCTGTBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:14:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCAACTTGABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:15:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TAACAGBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:16:/5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA GATGTG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:17:TTTTTTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACBCBCBCBCBCBCNNNN NNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(DropSeq Cell细胞条形码寡核苷酸，商业，其中BC的片段表示细胞条形码，并且N表示唯一分子条形码UMB)
SEQ ID NO:18:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATrGrGrG(DropSeq-TSO)
SEQ ID NO:19:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(DropSeq-SMART-PCR引物)
SEQ ID NO:20:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTGTCCGCGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT*A*C(DropSeq-New-P5-SMART-PCR-杂交-寡核苷酸)
SEQ ID NO:21:GCCTGTCCGCGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC
(DropSeq-CustomRead1测序引物)
SEQ ID NO:22:/Atto425/CCCCCCCCCC/3bio/(颜色珠荧光标记寡核苷酸)
SEQ ID NO:23:/56-FAM/CCCCCCCCCC/3bio/(颜色珠荧光标记寡核苷酸)
SEQ ID NO:24:/5Cy3/CCCCCCCCCC/3bio/(颜色珠荧光标记寡核苷酸)
SEQ ID NO:25:/5Cy5/CCCCCCCCCC/3bio/(颜色珠荧光标记寡核苷酸)
SEQ ID NO:26:CCTTGGCACCCGAGAATT*C*C(颜色珠PCR柄2扩增引物)
SEQ ID NO:27:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(用于ColourBC产物索引的Illumina Small RNA RPI1引物,本文以i7索引1为例)
SEQ ID NO:28:
/5bio/TTTTTTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACNNNNNNBCBCBCBCBCBCNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(与颜色条形码寡核苷酸一起用在ColourBC珠中的改良的DropSeq细胞条形码寡核苷酸，包括用第一NNNNNN序列指示的任选颜色标记序列)
SEQ ID NO:31:
/5bio/TTTTTTTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(用于桥式扩增的固定化PCR柄寡核苷酸，如图7中所示)
SEQ ID NO:32
/5PCbio/AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(用于桥式扩增的可光裂解的固定化polyA寡核苷酸，如图7中所示)
SEQ ID NO:33
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNNNNNGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT(用于图7中的桥接扩增的模板，包括产生孔特异性的CellBC簇的N/12随机序列)。
序列表
<110> 斯切尔莱克斯有限公司(SCellex Oy)
<120>用于定位和分析生物样品中的单细胞的方法和构建体
<130> SCELL1PCT
<150> EP 21175329.8
<151> 2021-05-21
<160> 33
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 1
ccttggcacc cgagaattcc aatcacgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 2
ccttggcacc cgagaattcc attaggcbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 3
ccttggcacc cgagaattcc atgaccabaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 4
ccttggcacc cgagaattcc aacagtgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
ccttggcacc cgagaattcc agccaatbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 6
ccttggcacc cgagaattcc acagatcbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 7
ccttggcacc cgagaattcc aacttgabaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 8
ccttggcacc cgagaattcc atgaacgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 9
ccttggcacc cgagaattcc actgagabaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 10
ccttggcacc cgagaattcc atagctgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 11
ccttggcacc cgagaattcc aaatacgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 12
ccttggcacc cgagaattcc attccagbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 13
ccttggcacc cgagaattcc aatctgtbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 14
ccttggcacc cgagaattcc aacttgabaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 15
ccttggcacc cgagaattcc ataacagbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 16
ccttggcacc cgagaattcc agatgtgbaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 17
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> 33..44
<223> /note="可变单元条形码的条形码序列槽
，每个n可以是a、c、g或t"
<220>
<221> misc_feature
<222> 45..52
<223> /note="独特分子条形码“UMB”的条形码序列槽
，每个n可以是a、c、g或t"
<400> 17
tttttttaag cagtggtatc aacgcagagt acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tt 82
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> /note="组合 DNA/RNA 分子"
/note="寡核苷酸"
<220>
<221> misc_RNA
<222> 28..30
<400> 18
aagcagtggt atcaacgcag agtgaatggg 30
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 19
aagcagtggt atcaacgcag agt 23
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> /note="组合 DNA/RNA 分子"
/note="寡核苷酸"
<220>
<221> misc_RNA
<222> 64..66
<400> 20
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctgtccgcg gaagcagtgg tatcaacgca 60
gagtac 66
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 21
gcctgtccgc ggaagcagtg gtatcaacgc agagtac 37
<210> 22
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 22
cccccccccc 10
<210> 23
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 23
cccccccccc 10
<210> 24
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 24
cccccccccc 10
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 25
cccccccccc 10
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> /note="组合 DNA/RNA 分子"
/note="寡核苷酸"
<220>
<221> misc_RNA
<222> 18..20
<400> 26
ccttggcacc cgagaattcc 20
<210> 27
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 27
caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttccttggca cccgagaatt 60
cca 63
<210> 28
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> 33..38
<223> /note="任选的颜色标记序列槽，每个n可以是a、
c、g或t"
<220>
<221> misc_feature
<222> 51..58
<223> /note="与ColourBC一起使用的寡核苷酸中条形码的序列槽
每个n可以是a、c、g或t"
<400> 28
tttttttaag cagtggtatc aacgcagagt acnnnnnnbc bcbcbcbcbc nnnnnnnntt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttt 88
<210> 29
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸 (部分序列)
<400> 29
tttttttttt 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸 (部分序列)
<400> 30
aaaaaaaaaa 10
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 31
tttttttaag cagtggtatc aacgcagagt ac 32
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 32
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 30
<210> 33
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> 31..42
<223> /note="唯一分子条形码UMB，每个n可以是a、
c、g或t"
<400> 33
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa nnnnnnnnnn nngtactctg cgttgatacc 60
actgctt 67

Claims (21)

1.一种用于检测核酸靶标的构建体，所述构建体包括珠，优选磁珠，其中所述珠包括一种或多种视觉可检测特征和/或所述珠与一种或多种视觉可检测实体偶联，并且其中所述珠包括寡核苷酸，并且所述寡核苷酸包括a)扩增柄序列，b)对所述视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列和c)3’末端捕获或锚定序列，并且其中所述寡核苷酸被布置为可从所述珠上分离。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中，所述3’末端捕获或锚定序列包括poly-A序列、通用扩增柄序列或模板转换兼容序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建体，其中，所述视觉可检测特征是所述珠的尺寸、所述珠的颜色、发光或荧光、所述珠的形状或其组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建体，其中，所述寡核苷酸通过可裂解键，优选可光裂解、可化学裂解或可酶促裂解键与所述珠连接。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建体，其中，所述珠还与化学化合物、抗原或抗体偶联。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建体，其中，所述珠通过链霉亲和素-生物素或羧酸盐-胺键或通过任何其他键与所述一种或多种视觉可检测实体偶联。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的构建体，其中，所述扩增柄序列与PCR引物互补，所述引物优选地包括下一代测序兼容的衔接子序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的构建体，其中，所述构建体包括与所述珠偶联的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括a)第二扩增柄序列，其优选与包括下一代测序兼容的衔接子序列的PCR引物互补，b)对所述珠的视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列，c)对所述珠特异的条形码序列，d)任选的唯一分子条形码序列，以及e)末端poly-T序列或模板转换兼容序列。
9.一种组合物，包括根据权利要求1-8中任一项所述的构建体。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物包括至少2种根据权利要求1-8中任一项所述的构建体的混合物，其提供不同的视觉可检测特征或实体的混合物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，至少2种构建体的所述混合物包括至少6种、优选至少16种单独的视觉可检测特征和/或实体。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，视觉上不同的构建体类型的数量为16，并且所述构建体中的所述视觉可检测特征选自由所述珠的形状、尺寸、颜色、发光和荧光组成的组。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其被装载至孔板或芯片。
14.一种孔板或芯片，包括装载至所述板或芯片的孔的根据权利要求9-12中任一项所述的组合物。
15.一种试剂盒，包括根据权利要求14所述的孔板或芯片和计算机可读实体，所述计算机可读实体包括所述板或芯片的照片或扫描的文件，其中根据权利要求9-12中任一项所述的组合物被装载至所述板或芯片的孔。
16.根据权利要求1-8中任一项所述的构建体或根据权利要求9-13中任一项所述的组合物用于鉴定源自单细胞、位置或坐标的期望核酸靶标或mRNA测序产物的用途。
17.一种用于检测生物样品的位置的方法，所述方法包括以下步骤：
-将根据权利要求1-8中任一项所述的构建体或根据权利要求9-13中任一项所述的组合物与生物样品一起或以任何顺序依次装载至包括孔的基底，
-在将所述生物样品装载至所述基底之前和/或之后，用显微镜、优选光学显微镜或荧光显微镜对所述基底中的孔进行拍照或扫描；以及
-任选地确定装载的基底中具有不同的视觉可检测特征和/或实体或其组合的特定孔的位置或坐标。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括以下步骤：
-将所述孔中的样品置于支持细胞裂解、核酸释放的条件下，以及然后进行逆转录酶反应，
-扩增所述逆转录酶反应产物，其中扩增产物包含对所述构建体的视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列，
-从扩增的逆转录酶反应产物制备测序文库并对所述文库进行测序；以及
-任选地通过分析具有对所述构建体的视觉可检测特征和/或实体特异的条形码信息的测序数据来鉴定每个测序的产物源自的特定孔位置，以将特定的视觉可检测特征和/或实体或其组合与测序的产物联系起来，并确定在该方法中拍摄或扫描的装载基底中具有相应视觉可检测特征和/或实体或其组合的特定孔的位置。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
i)提供根据权利要求1-7中任一项所述的多个构建体，其中所述构建体包括多个第一珠，其中所述第一珠具有视觉可检测特征和/或实体诸如颜色、标签、特定珠尺寸或形状的特定组合，并且其中所述第一珠通过可光裂解连接子偶联至第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括a)扩增柄序列，b)对所述视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列和c)包括poly-A序列的末端序列；
ii)将步骤i)中获得的多个构建体与包括含有第二寡核苷酸磁珠的捕获构建体以及包括单细胞的生物样品一起随机装载到孔中，所述第二寡核苷酸包括a)第二扩增柄序列，b)对所述珠特异的条形码序列，c)任选的唯一分子条形码序列，和d)包括poly-T序列的第二末端序列，或替代地将细胞或组织切片放置在包括孔的基底上的载玻片上；以及
iii)用荧光或光学显微镜对装载的基底进行拍照或扫描。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括以下步骤：
iv)任选地密封或分隔装载基底的孔，优选使用半透膜或另一种多孔材料、油或凝胶层，或密封或分隔表面上携带细胞或组织的载玻片；v)利用冷冻或加热步骤，或利用通过孔的顶部或底部的膜或多孔密封添加到孔中的裂解缓冲液，或由凝胶密封携带的裂解剂，裂解所述细胞以在孔内释放mRNA；
vi)通过使所述基底经受UV光，将所述第一寡核苷酸从所述第一珠分离，并且使孔中的样品经受支持所释放的mRNA和第二寡核苷酸以及第一和第二寡核苷酸的poly-A和poly-T序列彼此退火的条件，以将所述mRNA和第一寡核苷酸结合至所述捕获构建体的磁珠；
vii)收集并合并来自所述孔的样品，并用磁体和离心促进的洗涤步骤将具有附着的mRNA以及结合的第一和第二寡核苷酸的磁珠与样品内容物的其余部分分离；
viii)使具有附着的mRNA以及第一和第二寡核苷酸的分离磁珠与包括第三扩增柄序列的模板转换寡核苷酸进行逆转录酶反应；
ix)用与第一、第二和第三扩增柄序列或其互补物结合的引物对所述逆转录酶反应的产物进行PCR反应，以产生不附着于所述磁珠的PCR反应产物；
x)使所述PCR产物与所述磁珠分离；
xi)任选地将所述PCR产物按大小选择为具有长度低于约200bp的第一组序列和具有长度高于约200bp的第二组序列；
xii)引入测序索引和衔接子序列，并对所述文库进行测序，任选地在步骤xi)中获得的组中进行；
xiii)通过分析测序数据，优选地通过对存在于相同测序的PCR产物中的源自所述第一寡核苷酸的视觉可检测特征和/或实体或其组合特异的条形码序列和对源自所述第二寡核苷酸的磁珠特异的条形码序列和/或任选地源自所述第二寡核苷酸的唯一分子条形码序列的组合与包括mRNA序列和对源自所述第二寡核苷酸的珠特异的条形码序列和/或任选地源自所述第二寡核苷酸的唯一分子条形码序列的组合的测序PCR产物进行比较，来鉴定单细胞的mRNA产物；
xiv)任选地通过比较对源自所述第一寡核苷酸的视觉可检测特征和/或实体或其组合特异的条形码序列的组合和步骤iii)中用荧光或光学显微镜拍摄的装载基底的照片或扫描来定位所述单细胞或组织位置。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
i)提供根据权利要求8所述的多个构建体，其中所述构建体包括多个第一珠，其中所述第一珠具有视觉可检测特征和/或实体诸如颜色、标签、特定珠尺寸或形状的特定组合，并且其中所述第一珠通过可光裂解连接子偶联至第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括a)扩增柄序列，
b)对所述视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列，和c)包括poly-A序列的末端序列，并且其中所述第一珠还包括与所述珠偶联的多个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括a)与包括下一代测序兼容的衔接子序列的PCR引物互补的第二扩增柄序列，b)对所述珠的视觉可检测特征和/或实体中的一种或多种特异的条形码序列，c)对所述珠特异的条形码序列，d)任选的唯一分子条形码序列，以及e)末端poly-T序列；
ii)将步骤i)中获得的多个构建体随机装载到孔和包括单细胞的生物样品中，或者替代地将载玻片上的细胞或组织切片放置到包括孔的基底上；以及
iii)用荧光或光学显微镜对装载的基底进行拍照或扫描。
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