TW202338100A - 用於標註生物分子之光反應性及可裂解探針 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包括光反應性及可裂解探針之組成物以及使用該等探針之方法。該等探針可包括可結合至標記之標籤、可連接至誘餌分子之可裂解連接子及光活化彈頭。該等組成物及方法可適用於分析生物分子。

Description

用於標註生物分子之光反應性及可裂解探針
本說明書中提及之所有出版物及專利申請均以引用方式整體併入本文，其程度與各單獨出版物或專利申請具體且單獨地指示以引用方式併入的程度相同。
本文描述了用於識別、標註及分析生物分子之方法及組成物。具體描述了適用於光活化及標註生物分子亞群之可裂解探針。該等方法及組成物可能特別適用於分析生物樣品，諸如識別細胞或組織樣品中之近端生物分子。
細胞由不同類型之生物分子(biological molecule/biomolecule)構成。細胞中之生物分子與亞細胞環境中之相鄰生物分子相互作用，形成複合物、胞器或其他組裝體，且執行各種基本的細胞功能。表徵生物分子在亞細胞環境中相互作用以及生物分子如何一起發揮作用極具挑戰性。生物分子較小，且其存在於具有數千萬個其他分子之細胞環境中。相鄰生物分子之間的相互作用通常較弱，且用於研究生物分子之技術會破壞其相互作用。雖然諸如酵母雙雜交分析及最近的鄰近標記等技術提高了吾人對細胞環境的理解，但此等技術受到各種限制，諸如非特異性結合、反應時間慢及天然細胞環境的破壞，導致假陽性及錯過相互作用。需要更好的工具來確定自然發生的生物分子相互作用。本文描述了更好地分析內源性生物分子相互作用之系統、組成物及方法。
本文描述了更好地分析內源性生物分子相互作用之系統、組成物及方法。該等方法及組成物可適用於識別、標註及分析生物分子。具體描述了適用於光活化及標註生物分子亞群之可裂解探針。該等方法及組成物可特別適用於分析生物樣品，諸如識別細胞或組織樣品中之近端生物分子。此等探針可特別適用於經由顯微鏡系統之選擇性光照明對生物分子進行選擇性標註及鄰近標記。通常，在一個實施例中，光反應性及可裂解探針包括核酸錨定鏈，其中錨定鏈可包括誘餌附接位點；核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構；雙股結構中具可裂解位點，其中錨定鏈及探測鏈係用於裂解子之施加而在可裂解位點斷裂；位於探針中之光活化彈頭，其中光活化彈頭係用以在施加光能時將錨定鏈共價鍵合至探測鏈；及結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。
此實施例及其他實施例可包括以下特徵中之一或多者。錨定鏈及探測鏈包括DNA、RNA或DNA及RNA兩者。錨定鏈比探測鏈長。錨定鏈及探測鏈具有至少6個呈連續一排的互補核苷酸及總共至少20個互補核苷酸。雙股結構之長度至少為10個核苷酸。雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。錨定鏈及探測鏈之長度為至少10個核苷酸、至少20個核苷酸或至少30個核苷酸。錨定鏈及探測鏈之長度不超過40個核苷酸，不超過50個核苷酸，或不超過60個核苷酸。錨定鏈及探測鏈之長度在15個核苷酸與40個核苷酸之間。錨定鏈可包括一級序列，且相對於可裂解位點，標籤與誘餌附接位點位於一級序列之同一側上。探針在誘餌附接位點處附接至誘餌分子。探針共價附接至誘餌分子。誘餌分子包括抗體、CLIP-標籤、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-標籤。誘餌分子包括抗體。誘餌分子包括二級抗體。標籤包括生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。生物素衍生物包括以下之基團： 、 或 。
可裂解位點包括核酸內切酶位點。可裂解位點包括限制酶位點。光活化彈頭包括核鹼基。光活化彈頭包括胸腺嘧啶特異性彈頭。光活化彈頭包含核鹼基特異性補骨脂素，包括 之基團或核鹼基特異性疊氮化物。光活化彈頭包括核鹼基特異性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括 之基團。光活化彈頭包括核鹼基特異性三氧沙林，包括 之基團。如前述技術方案中任一項之光反應性及可裂解探針，其中光活化彈頭包含核鹼基特異性二氮丙啶，包括 之基團。
通常，在一個實施例中，一種用於光活化標記之方法包括將上述光反應性及可裂解探針結合至生物樣品中之生物分子，將誘餌分子結合至生物樣品中之目標生物分子以交聯探針及目標生物分子，遞送光輻射以活化光活化彈頭且將錨定鏈共價鍵合至探測鏈，裂解探針雙股區域中之可裂解位點以自探針之其餘部分移除一部分錨定鏈及探測鏈，且自生物樣品移除經裂解及未結合之探針。
一般而言，在一個實施例中，一種分析方法包括將光反應性及可裂解探針遞送至生物樣品，該探針包括核酸錨定鏈及核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構，選擇性地照明生物樣品之第一區域，從而活化位於探針中之光活化彈頭且將探測鏈共價鍵合至第一區域中之錨定鏈，且不照明生物樣品之第二區域，以使探測鏈及錨定鏈在第二區域中不共價鍵合，裂解第一及第二區域中之探針之雙股區域中的可裂解位點以自探針之其餘部分移除錨定鏈之經裂解部分及探測鏈之經裂解部分，將競爭核酸鏈遞送至第一及第二區域，其中競爭核酸鏈係用以與探測鏈競爭結合至錨定鏈，且用競爭核酸鏈替代在第二區域中之探針之該探測鏈中，但不替代在第一區域中之探針中之探測鏈，其中第一區域中之探測鏈與錨定鏈之間的共價鍵合，以防止競爭鏈替代第一區域中之探測鏈。
此實施例及其他實施例可包括以下特徵中之一或多者。探針可进一步包括結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。將可偵測標記與標籤結合且藉由可偵測標記活性，可偵測地鄰近標記鄰近於目標生物分子之相鄰分子的步驟。可偵測地鄰近標記之步驟可包括光選擇性鄰近標記直徑或最長尺寸小於300nm、小於200nm或小於100nm之區域。在裂解可裂解位點之前雙股結構之解鏈溫度T m可為至少50℃。在裂解可裂解位點之前雙股結構之解鏈溫度T m可為52℃至60℃。該方法可進一步包括其中(i)裂解步驟後探針可包括雙股結構，(ii)替代步驟後探針可包括雙股結構，及(iii)裂解可裂解位點後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m低於第二區域中之替代步驟後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m。裂解可裂解位點後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為26℃至34℃。第二區域中之替代步驟後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為44℃至53℃。替代步驟可在高於裂解可裂解位點後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m且低於替代步驟後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m的溫度下進行。錨定鏈之一級序列、探測鏈之一級序列及/或競爭鏈之一級序列與生物樣品中天然存在之核酸鏈係生物正交的，使得序列在內源性序列與探測鏈或錨定鏈之間匹配不超過10個核苷酸。裂解可裂解位點之步驟可包括用限制性核酸內切酶及/或限制酶切割可裂解位點。選擇性地照明以活化光活化彈頭之步驟可包括活化核鹼基彈頭。選擇性地照明以活化光活化彈頭之步驟可包括活化胸腺嘧啶特異性彈頭。選擇性地照明生物樣品之步驟可包括自影像引導顯微鏡系統之成像光源照明，該方法進一步包括用可控相機對照明樣品進行成像，用相機獲取第一視野中之生物樣品之亞細胞形態的至少一個影像，處理至少一個影像且基於經處理之影像確定樣品中之所關注區域，及獲得所關注區域之座標資訊。自第一及第二區域移除經裂解及未結合之探針的步驟。選擇性地照明之步驟可包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素來照明區域。選擇性地照明之步驟可包括以100 mW至300 mW之功率強度照明。可偵測標記可包括催化標記。生物樣品可包括至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞或經固定細胞。生物樣品可包括經固定細胞、組織、細胞萃取物或組織萃取物。選擇性地照明之步驟可包括照明由點擴散函數定義之區域。將生物樣品置於顯微鏡載物台上，該方法進一步包括自載物台移除生物樣品之照明區域的至少一部分。對樣品進行質譜分析或定序分析之步驟。標籤可包括生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。
一般而言，在一個實施例中，用於標記生物分子之套組包括上述任一者之光反應性及可裂解探針於第一容器中，以及說明材料。
此實施例及其他實施例可包括以下特徵中之一或多者。競爭鏈，其中競爭鏈與錨定鏈互補。當競爭鏈及錨定鏈形成雙股結構時，該結構之解鏈溫度T m為44℃至53℃。
通常，在一個實施例中，用於探針生成之套組包括核酸錨定鏈，其中錨定鏈可包括誘餌附接位點；核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構；可裂解位點位於雙股結構中，其中錨定鏈及探測鏈係用於裂解子之施加而在可裂解位點斷裂；光活化彈頭，其中光活化彈頭係用以在施加光能時將錨定鏈共價鍵合至探測鏈；及結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。
通常，在一個實施例中，光反應性探針包括核酸錨定鏈，其中錨定鏈可包括誘餌附接位點；核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構；位於探針中之光活化彈頭，其中光活化彈頭係用以在施加光能時將錨定鏈共價鍵合至探測鏈；及結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。
此實施例及其他實施例可包括以下特徵中之一或多者。錨定鏈及探測鏈包括DNA、RNA或DNA及RNA。錨定鏈比探測鏈長。錨定鏈及探測鏈具有至少6個呈連續一排的互補核苷酸及總共至少20個互補核苷酸。雙股結構之長度至少為10個核苷酸。雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。錨定鏈及探測鏈之長度為至少10個核苷酸、至少20個核苷酸或至少30個核苷酸。錨定鏈及探測鏈之長度不超過40個核苷酸，不超過50個核苷酸，或不超過60個核苷酸。錨定鏈及探測鏈中之各者之長度在15個核苷酸與40個核苷酸之間。錨定鏈可包括一級序列，且相對於可裂解位點，標籤與誘餌附接位點位於一級序列之同一側上。探針在誘餌附接位點處附接至誘餌分子。探針共價附接至誘餌分子。誘餌分子可包括抗體、CLIP-標籤、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-標籤。誘餌分子可包括抗體。誘餌分子可包括二級抗體。
標籤可包括生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。生物素衍生物包括以下之基團： 、 或 。光活化彈頭可包括核鹼基。光活化彈頭可包括胸腺嘧啶特異性彈頭。光活化彈頭可包括核鹼基特異性補骨脂素，包括 之基團。
光活化彈頭可包括核鹼基特異性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括 之基團。
光活化彈頭可包括核鹼基特異性三氧沙林，包括 之基團。
一般而言，在一個實施例中，一種用於光活化標記之方法包括將上述任何光反應性探針結合至生物樣品中之生物分子，將誘餌分子結合至生物樣品中之目標生物分子以交聯探針及目標生物分子，將光輻射遞送至生物樣品之第一區域以活化光活化彈頭且將錨定鏈共價鍵合至探測鏈，將探測鏈自探針之其餘部分移除且使競爭鏈與生物樣品之未用光輻射處理之第二區域中之錨定鏈雜交，及自生物樣品移除經裂解及未結合之探針。
一般而言，在一個實施例中，一種分析方法包括將光反應性探針遞送至生物樣品，該探針包括核酸錨定鏈及核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構，選擇性地照明生物樣品之第一區域，從而活化位於探針中之光活化彈頭且將探測鏈共價鍵合至第一區域中之錨定鏈，且不照明生物樣品之第二區域，以使探測鏈及錨定鏈在第二區域中不共價鍵合，在第二區域中將探測鏈自探針之其餘部分解鏈，將競爭核酸鏈遞送至第一及第二區域，其中競爭核酸鏈係用以與探測鏈競爭結合至錨定鏈，且用該競爭核酸鏈替代在第二區域中之探針中該探測鏈，但不替代第一區域中之探針中之該探測鏈，其中第一區域中之探測鏈與錨定鏈之間的共價鍵合，以防止競爭鏈替代第一區域中之探測鏈。
此實施例及其他實施例可包括以下特徵中之一或多者。探針可進一步包括結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。將可偵測標記與標籤結合，且藉由可偵測標記活性，可偵測地鄰近標記鄰近於目標生物分子之相鄰分子的步驟。可偵測地鄰近標記之步驟可包括光選擇性鄰近標記直徑或最長尺寸小於300nm、小於200nm或小於100nm之區域。在裂解可裂解位點之前雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。在裂解可裂解位點之前雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。該方法可進一步包括其中(i)裂解步驟後探針可包括雙股結構，(ii)替代步驟後探針可包括雙股結構，及(iii)裂解可裂解位點後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m低於第二區域中之替代步驟後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m。裂解可裂解位點後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為26℃至34℃。第二區域中之替代步驟後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為44℃至53℃。替代步驟係在高於裂解可裂解位點後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m且低於替代步驟後第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m的溫度下進行。錨定鏈之一級序列、探測鏈之一級序列及/或競爭鏈之一級序列與生物樣品中天然存在之核酸鏈係生物正交的，使得序列在內源性序列與探測鏈或錨定鏈之間匹配不超過10個核苷酸。
將探測鏈自第二區域中之探針之其餘部分移除的步驟可包括用核酸外切酶消化探測鏈。將探測鏈自第二區域中之探針之其餘部分移除的步驟可包括用解鏈因子處理樣品。將探測鏈自第二區域中之探針之其餘部分移除的步驟可包括用解鏈因子(包括解旋酶、小分子或升高的溫度)處理樣品。選擇性地照明以活化光活化彈頭之步驟可包括活化核鹼基彈頭。選擇性地照明以活化光活化彈頭之步驟可包括活化胸腺嘧啶特異性彈頭。選擇性地照明生物樣品之步驟可包括自影像引導顯微鏡系統之成像光源照明，該方法進一步包括用可控相機對照明樣品進行成像，用相機獲取第一視野中之生物樣品之亞細胞形態的至少一個影像，處理至少一個影像且基於經處理之影像確定樣品中之所關注區域，及獲得所關注區域之座標資訊。自第一及第二區域移除未結合之探針的步驟。選擇性地照明之步驟可包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素來照明區域。選擇性地照明之步驟可包括以100 mW至300 mW之功率強度照明。可偵測標記可包括催化標記。生物樣品可包括至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞或經固定細胞。生物樣品可包括經固定細胞、組織、細胞萃取物或組織萃取物。選擇性地照明之步驟可包括照明由點擴散函數定義之區域。將生物樣品置於顯微鏡載物台上，該方法進一步包括自載物台移除生物樣品之照明區域的至少一部分。對樣品進行質譜分析或定序分析之步驟。標籤可包括生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。
通常，在一個實施例中，用於標記生物分子之套組包括上述任何光反應性探針於第一容器中，以及說明材料。此實施例及其他實施例可包括以下特徵中之一或多者。競爭鏈，其中競爭鏈與錨定鏈互補。競爭鏈及錨定鏈形成雙股結構，該結構之解鏈溫度T m為44℃至53℃。
通常，在一個實施例中，用於探針生成之套組包括核酸錨定鏈，其中錨定鏈可包括誘餌附接位點；核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構；光活化彈頭，其中光活化彈頭係用以在施加光能時將錨定鏈共價鍵合至探測鏈；及結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。
本文描述了可用於識別、標註、獲得及分析生物分子及其相鄰生物分子的系統、組成物及方法。該等組成物及方法可特別用於分析生物樣品中之生物分子相互作用，諸如分析細胞或組織樣品中之蛋白質、核酸、碳水化合物或脂質。該等組成物及方法利用光反應性及可裂解探針(例如，生物正交或可溫和裂解或酶特異性裂解)，其可標記生物分子及其相鄰生物分子，同時在很大程度上保持生物分子中天然存在之分子結構。本文所述之光反應性及可溫和裂解探針可特別用於使用具有精確照明控制之影像引導顯微鏡(諸如美國專利公開案第2018/0367717號中所述之系統)特異性標記細胞亞細胞區域中之生物分子亞群，以能夠自動標記所關注細胞生物分子。探針可用於 原位標註生物分子，諸如細胞或組織內之蛋白質，且接著可進行標籤轉移或鄰近標記，諸如使用酪胺信號放大(TSA)。可藉由諸如質譜法及定序等分析技術進一步分析生物分子。此等探針可能特別適用於進行體學研究，例如基因體學、蛋白質體學及轉錄體學，以及尋找用於診斷及治療中相關生物標記。
縮寫及定義
術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸及合成胺基酸，以及以與天然存在之胺基酸類似的方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸係藉由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構，亦即與氫、羧基、胺基及R基團結合之α碳的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基硫。本文所述之胺基酸可經保守取代，只要保守取代之肽能夠實現所需功能(諸如經蛋白酶識別)。保守取代之實例包括Thr、Gly或Asn取代Ser及His、Lys、Glu、Gln取代Arg。保守取代描述於例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第四版, Green及Sambrook編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2014以及其更正及更新)中。
術語「抗體」係指免疫球蛋白及相關分子，且包括單株抗體、多株抗體、單體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、僅重鏈抗體、三鏈抗體、單鏈Fv、奈米抗體等，且亦包括抗體片段。抗體可為多株或單株或重組抗體。抗體可為鼠類抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或衍生自其他物種之抗體。如本文所用，當抗體或其他實體「特異性識別」或「特異性結合」抗原或表位時，其優先識別蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之抗原且以親和力結合抗原或表位，該親和力顯著高於不顯示抗原或表位之其他實體。
術語「芳基」係指具有單環之芳環系統(例如，苯基或經取代之苯基)。所關注芳基包括但不限於衍生自以下之基團：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、䓛、蔻、熒蒽、芴、2,3,2',3'-蒽并蒽、己芬、己搭烯、二烯并苯、s-二環戊二烯并苯、茚滿、茚、萘、稠八苯、辛芬、辛搭烯、卵苯、戊-2,4-二烯、並五苯、戊搭烯、戊芬、苝、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、吡蒽、葒、三亞苯、三萘及類似基團。在某些實施例中，芳基包括6至20個碳原子。在某些實施例中，芳基包括6至12個碳原子。芳基之實例為苯基及萘基。
術語「誘餌分子」係指與所關注分子特異性相互作用之分子，所關注分子可稱為目標(或獵物)。誘餌分子之實例包括抗體、CLIP-標籤、藥物、核酸、螢光原位雜交(FISH)探針、蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、蛋白A/G/L、另一小分子及SNAP-標籤。
術語「結合」係指第一部分與第二部分物理相互作用，其中第一部分及第二部分彼此物理接觸。
術語「生物正交」係指不干擾生物學或不與生物學相互作用(例如，對生物分子惰性)。
術語「生物正交反應」或「生物正交裂解反應」係指在生理相關條件下進行且與天然存在之官能基相容且通常具有快速動力學、對水性環境之耐受性及高選擇性的反應。生物正交反應在係用以保持天然存在之分子結構，諸如蛋白質折疊或三維結構的條件下進行。生物正交反應不會破壞內源性或樣品蛋白質或肽中多肽鏈之不同區域之間的交聯。例如，生物正交反應不會破壞天然存在之官能基中之共價鍵(例如，半胱胺酸側鏈中之二硫鍵(-S-S-鍵))。生物正交裂解連接子或生物正交裂解探針中之裂解連接子係用以生物正交裂解，諸如與使用酶或鍵特異性化學物質相容，該等酶或鍵特異性化學物質係用以生物正交地進行裂解而不破壞天然存在之官能基中之共價鍵。
術語「生物素衍生物」係指生物素部分，包括生物素及生物素之變體，諸如具有開環或取代之生物素。通常，生物素衍生物可易於經生物素結合實體或蛋白質，諸如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素偵測。
術語「催化報導子沉積」(CARD)係指可偵測分子在目標生物分子(例如，碳水化合物、脂質、核酸或蛋白質)上或附近的酶催化沉積。在一些實施例中，酶催化沉積中之酶為辣根過氧化物酶(HRP)且可偵測分子為酪胺或地高辛(DIG)。
術語「可裂解連接子鍵」係指係用以藉由裂解試劑特異性裂解之可裂解連接子中的化學鍵。通常，可裂解連接子鍵係指單鍵；然而，在一些變體中，可裂解連接子鍵可指多於一條鍵，例如在可經核酸內切酶裂解之雙股DNA可裂解連接子的情況下，其中兩條DNA鏈經裂解。
術語「點擊化學」係指易於接合分子構造區塊之化學方法。通常，點擊化學反應高效、高產、可靠、很少產生或不產生副產物，且與水性環境相容或無需添加溶劑。點擊化學之一個實例為環加成，諸如炔烴及疊氮化物之銅(I)催化之[3+2]-胡伊斯根(Huisgen) 1,3-偶極環加成，形成1,2,3-三唑，或狄爾斯-阿德爾反應(Diels–Adler reaction)。點擊化學亦包括無銅反應，諸如使用經取代環辛炔之變體(參見例如 Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.2007年10月23日, 104 (43), 16793-16797)。其他點擊化學之實例為親核取代；C-C多鍵加成(例如邁克爾加成(Michael addition)、環氧化、二羥基化、氮丙啶化)；及壬醛樣化學反應(例如N-羥基琥珀醯亞胺活性酯偶合)。點擊化學反應可為，但不一定為生物正交反應。
術語「結合」係指兩個或更多個分子特異性相互作用(例如，共價或非共價)之過程。在一些實施例中，標籤及標記結合。在一些實施例中，誘餌及可裂解探針結合。
術語「可結合」係指可與其可結合之另一分子特異性結合的分子。在一些實施例中，誘餌可與所關注生物分子結合。在一些實施例中，可裂解探針可與標記結合。
術語「可偵測標記」係指直接或間接與分子結合或係用以直接或間接與分子結合之化合物或組成物。標記本身可為可偵測的且為可直接偵測的標記(諸如螢光標記，諸如螢光化學加合物、放射性同位素標記等)，或者標記可為間接可偵測的(諸如在酶可偵測標記之情況下，酶可催化受質化合物或組成物之化學改變且反應產物為可偵測的)。可偵測標記之實例包括例如生物素標記、螢光標記、辣根過氧化物酶、免疫學可偵測標記(例如血凝素(HA)標籤、聚組胺酸標籤)、另一發光標記及放射性標記。間接標記之一個實例為生物素，其可使用抗生蛋白鏈菌素偵測方法來偵測。
術語「酶促裂解反應」係指由酶介導之分子中之鍵的裂解或水解。通常，酶介導之反應會裂解共價鍵且形成更小的分子。
術語「免疫球蛋白-結合蛋白」係指免疫球蛋白結合細菌蛋白及免疫球蛋白結合細菌蛋白之變體。實例包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G及蛋白A/G/L。蛋白A及蛋白G為最初分別自金黃色葡萄球菌及G群鏈球菌中獲得之細菌蛋白，且對IgG型抗體之Fc區具有高親和力。蛋白A/G組合了蛋白A及蛋白G之結合域。蛋白A/G/L組合了蛋白A、蛋白G及蛋白L之結合域。免疫球蛋白-結合蛋白與抗體之特定域結合。
術語「說明材料」包括出版物、記錄、圖表、鏈接或任何其他表達媒介，其可用於傳達本發明之一或多種組成物對其指定用途的有用性。例如，本發明之套組之說明材料可貼在含有組成物或組分的容器上，或與含有組成物或組分之容器一起運輸。或者，說明材料可與容器分開運輸，目的為讓接收者協同使用說明材料及組成物或組分。
術語「標記」係指產生或可經誘導以產生可偵測信號之分子。在一些實施例中，標記產生用於偵測相鄰生物分子之信號。可使用之標記的實例包括抗生物素蛋白標記、中性抗生物素蛋白標記、抗生蛋白鏈菌素標記以偵測生物素標籤。
術語「連接子」係指連接兩個或更多個子結構之結構。連接子具有在子結構之間延伸的至少一條不間斷原子鏈。連接子之原子藉由化學鍵、通常係共價鍵而連接。
術語「光活化彈頭」係指具有光活化部分之基團。光活化彈頭之實例包括芳基疊氮化物、二苯甲酮及二氮丙啶。一旦活化，光活化彈頭可結合至結合搭配物。
術語「質譜儀」係指用於量測樣品中一或多個分子之質荷比的儀器。質譜儀通常包括離子源及質量分析儀。質譜儀之實例包括基質輔助雷射解吸電離(MALDI)、連續或脈衝電噴霧(ES)電離、離子噴霧、扇形磁場、熱噴霧、飛行時間及大規模集群轟擊質譜。
術語「質譜法」係指使用質譜儀來偵測氣相離子。
術語「質譜分析」包括線性飛行時間(TOF)、反射器飛行時間、單四重、多四重、單扇形磁場、多扇形磁場、傅立葉變換、離子迴旋共振(ICR)或離子阱。
術語「解鏈溫度」或核酸之T m係指50%之雙股核酸變為單鏈核酸時之溫度。
術語「光活化(photoactivated)」或「光活化(light activated)」係指藉由輻射能(例如藉由特定波長或波長範圍的光、UV光等)激發原子。在一些實例中，光活化分子與另一分子或緊鄰的其自身之另一部分形成共價鍵。
術語「肽」係指其中單體為胺基酸且單體藉由醯胺鍵接合在一起的聚合物。肽之長度通常為至少2個、至少5個、至少10個、至少20個、至少50個、至少100個或至少500個或更多個胺基酸。
術語分子之「一級序列」係指構成分子一級結構之單元的線性序列。核酸之「一級序列」係指構成核酸一級結構之核苷酸的線性序列。
術語「光反應性基團」係指功能部分，其在暴露於光(例如，特定波長或波長範圍的光、UV光等)時被活化。光反應性基團通常與其緊鄰的分子形成共價鍵。
術語「鄰近分子」或相鄰分子係指靠近另一分子之分子。鄰近分子或相鄰分子可與分子結合或相互作用(例如，共價或非共價)或可靠近分子且不與分子共價結合。
術語「獵物」係指誘餌分子之結合搭配物。例如，若抗體為誘餌，則誘餌分子可結合之對應蛋白質為對應獵物。在一些實施例中，誘餌可與單個獵物結合。在一些實施例中，誘餌可與超過一個獵物結合。
術語「蛋白質標籤」係指胺基酸之肽序列。蛋白質標籤通常可與標記結合。蛋白質標籤之實例為「自標記」標籤。自標記標籤之實例包括BL-標籤、CLIP-標籤、共價TMP-標籤、HALO-標籤及SNAP-標籤。SNAP-標籤係一種約20 kDa之DNA修復蛋白O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶變體，其可特異性識別芐基鳥嘌呤(BG)衍生物且與該衍生物快速反應。在標記反應期間，芐基部分與SNAP-標籤共價附接，釋放鳥嘌呤。CLIP-標籤為SNAP-標籤之變體，其係用以與O2-芐基胞嘧啶(BC)衍生物而非芐基鳥嘌呤(BG)發生特異性反應。
術語「小分子」係指低分子量分子，包括碳水化合物、藥物、酶抑制劑、脂質、代謝物、單醣、天然產物、核酸、肽、肽模擬物、第二信使、有機小分子及外源性物質。通常，小分子小於約1000分子量或小於約500分子量。
術語「標籤」係指可實現目標分子偵測之官能基、化合物、分子、取代基及類似物。標籤可實現可偵測的生物或理化信號，該信號允許經由任何方式進行偵測，例如吸光度、化學發光、比色法、螢光、發光、磁共振、磷光、放射性。由於標籤部分(例如，螢光團標籤)之生化或理化特性而可直接偵測到由於標籤而提供之可偵測信號，或由於標籤與另一化合物或試劑之相互作用而可間接偵測到該可偵測信號。通常，標籤為小官能基或小有機化合物。在一些實施例中，所採用之標籤具有小於約1,000 Da、750 Da、500 Da或甚至更小的分子量。
術語「標註」係指將標籤添加至官能基、化合物、分子、取代基及類似物之過程。通常，標註實現目標分子偵測。
術語「酪胺信號放大」(TSA)係指催化報導子沉積(CARD)，一種酶介導之偵測方法，該方法利用酶(例如辣根過氧化物酶)之催化活性將無活性的酪胺催化為高活性的酪胺。放大可在低濃度過氧化氫(H 2O 2)的存在下進行。在一些實例中，酪胺可用可偵測標記，諸如螢光團(諸如生物素或2,4-二硝基苯酚(DNP))進行標記。
除非另有說明，否則本文所述技術之實踐可採用化學、生物化學、細胞生物學、免疫學、分子生物學(包括細胞培養、重組技術、定序技術)及有機化學技術之習知技術及描述，其在該領域之文獻中進行了解釋(例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第四版, Green及Sambrook編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2014以及其更正及更新；John D. Roberts及Marjorie C. Caserio (1977) Basic Principles of Organic Chemistry, 第二版.W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA.)。
組成物
本文描述物質組成物，包括光反應性及可裂解探針(例如，生物正交或可溫和裂解探針)。光反應性及可裂解探針可有利地與顯微鏡系統，諸如本文及美國專利公開案第2018/0367717 A1號中所述之系統一起使用，以實現對所關注生物分子近端之細胞生物分子的自動標記。標記之分子可與所關注生物分子相鄰，或者可靠近但不相鄰，諸如當介入分子位於所關注生物分子與用於捕獲或分析之細胞生物分子之間時。靠近但不與所關注分子相鄰之分子可為細胞結構之一部分或以其他方式有助於所關注細胞微環境。圖1顯示了可用於光選擇性空間標註及標記之系統的示意圖。圖1之底部顯示了基板406，諸如顯微鏡載物台，以及置於基板上之複數個細胞408的單層。在一些實施例中，可使用自動化顯微鏡系統分析整個基板或基板之一部分的表面以識別所關注區域。例如，可對樣品進行染色或標記以識別所關注區域。圖1之頂部顯示了細胞408a之放大圖，該細胞為複數個細胞408之一。細胞408a具有細胞核416及多種不同類型的胞器412，例如細胞膜、粒線體、核糖體及液泡。顯微鏡系統402選擇性地將窄帶光404照射至所關注區域(ROI) 418上以分析所關注區域418。照明可為選擇性的，且細胞及基板之大區域414不被照明。如下文更詳細解釋的，窄帶光404僅在所關注區域418中活化光反應性及可溫和裂解探針。
圖2A示意性地說明多功能探針205 (除非具體上下文另有說明，否則在本文中亦可互換地稱為多功能光反應性及可裂解探針、光反應性及可裂解探針或探針)。圖2A顯示多功能探針205具有多價核心230，其具有複數個附接位點：第一附接位點232、第二附接位點234及第三附接位點236。圖2A之多功能探針具有附接至第一附接位點232之標籤201 (圓形)、附接至第二附接位點234之可裂解連接子203 (矩形)及附接至第三附接位點236之光活化彈頭(三角形)，從而形成三價及三功能探針。誘餌分子204 (圓角正方形)附接至可裂解連接子203。圖2B顯示了標記系統240之實例，該標記系統可與圖2B中所示之多功能探針205一起使用以標記與所關注目標生物分子相鄰的生物分子。標記系統240包括用標記206及酶或催化劑207以及酶/催化劑受質218標記複合物208。在一些實施例中，標記206為中性抗生物素蛋白且酶或催化劑207為過氧化物酶且利用過氧化物(未顯示)實現活性。在此實例中，標籤201及標記206相互識別及結合。酶或催化劑207活化酶/催化劑受質218，且一旦活化，活化之酶/催化劑受質218便可結合且可偵測地標記其附近的生物分子。
圖2C顯示了使用本文所述之多功能光反應性及可裂解探針標記所關注小區域(ROI)中之生物分子，比較直接光化學標記與光輔助酶促標記之結果的示意圖。圖2B顯示了使用本文所述之探針及系統在具有生物分子(A)之樣本上之直接光化學標記(頂部，標記之過程B)及光輔助酶標記(底部，標記之過程C)的比較。在執行過程B或過程C之前，分析包含所關注生物分子210之樣品(例如，細胞或組織樣品) (此處將使用蛋白質作為舉例，但可替代地分析其他生物分子)，且識別所關注區域。樣品可進行預處理，例如固定及染色。例如，樣品可經固定且用細胞染色劑(例如蘇木精及伊紅(H&E)；馬森(Masson)三色染色劑)染色，用識別所關注蛋白質之免疫螢光標記抗體或藉由其他方法進行識別。一旦識別了所關注區域，便分析所關注區域內之相鄰生物分子的複合物。如過程B中所說明，用直接光反應性探針212處理樣品且將圖案化的光引導至樣品且活化直接光反應性探針212以形成經活化直接光反應性探針212’。經活化直接光反應性探針212’能夠與附近的其他分子形成複合物(由過程B中之虛線圓圈示出。經活化直接光反應性探針212’可擴散及標記所關注分子210附近的相鄰分子211。然而，光反應性探針直接光活化之標記直徑(300-600 nm)在空間上受到所用光源之繞射極限的限制。另外，由於光反應性探針可自由擴散，因此圖案化的光路徑中之任何蛋白質可經標記。過程B亦顯示其標記更遠的生物分子231。藉由經活化直接光反應性探針212’標記之區域，或標記之精確度覆蓋約300-600 nm之區域。此區域可包括不緊鄰所關注蛋白質之生物分子，且在一些情況下可導致混淆、誤導或無益的結果。
相反地，在圖2C底部所示之過程C中，與識別所關注生物分子之誘餌分子預結合之多功能探針205 (參見圖2A)遞送至基板209上之樣品。如步驟1中所說明，圖案化的光亦導引至樣品。然而，在此處，圖案化的光活化了與附近的分子或部分結合之光活化彈頭202。除了導引有限活化區域的光之外，光活化彈頭亦受到其與探針205之附接的限制，且光活化彈頭變為附接至所關注生物分子。附接之探針205a現與所關注生物分子雙交聯(或與其接近)。圖2C亦顯示步驟2裂解，且可裂解連接子203經裂解，諸如若可裂解連接物為可裂解肽連接子，則添加蛋白酶。步驟1及步驟2亦顯示如何使用本文所述之探針及方法減少背景或不需要的標記。在步驟1中，探針205’附接至生物分子上；然而，由於探針205’在光傳輸區域之外，因此光活化彈頭202未被活化，且不會與所關注生物分子結合。在步驟2中，探針205’被裂解成兩部分，片段205 frag未結合且在洗滌步驟中被洗掉，且片段205 df因標籤201的移除而斷開(其作為未結合片段205 frag之一部分被洗掉)。探針片段205df或205 frag均不能標記任何生物分子。探針205b經裂解，但藉由雙交聯保持附接至所關注生物分子。在一些變化形式中，探針205c可與誘餌分子或另一近端生物分子交聯；但是，原理保持不變。探針205b含有標籤201以標記相鄰分子，如下文更詳細解釋。
標記系統240包括用標記206及酶或催化劑207以及酶/催化劑受質218標記複合物208。
用洗滌溶液洗去多餘的探針，且經由如上所述之位點特異性裂解移除單交聯探針(例如，在不發光的區域中)。步驟3及4顯示了使用圖2中所示之標記系統240對所關注分子210附近的分子進行標記。亦可使用其他標記系統。例如，複合物208與標籤201結合，酶或催化劑207將酶/催化劑受質218活化為活化之酶/催化劑受質218’。由於探針205b附接至所關注分子210，相鄰分子211經標記，而更遠的分子231未經標記。本文所述之可裂解連接子可使標記能夠自探針轉移至＜10 nm半徑(指三功能(多功能)探針之半徑大小)內之相鄰分子。
藉由光選擇性地將酶或催化劑207，諸如過氧化物酶定位於所關注分子附近且使用剛剛描述的標註及標記來標記所關注區域中之相鄰分子211，偶聯反應可定位至小至＜100 nm之區域。在一些變化形式中，可標記更大的區域(例如，至多約200 nm、至多約300 nm、至多約400 nm)。此外，樣品中之一些所關注分子具有多於一個定位區域，且因此同時與不同位置的不同分子復合物相互作用。光輔助標籤轉移(例如，標記相鄰分子)可在多於一個位置連續使用。例如，在如圖2B過程C所示地施加光且如所指示地標記相鄰分子之後，可將光選擇性地施加至樣品中之第二(第三、第四等)位置，且此過程可根據需要重複多次。除了在樣品之極小區域中對相對少量的相鄰分子進行標記(沉積標記)，諸如由於使用顯微鏡分析來導引本文所述之光及探針，且如下所述，該過程亦可藉由足夠溫和或柔和的處理進行，以使細胞架構保持完整(例如，反應亦為生物正交的)。
圖3A及圖3B示意性地說明了使用如本文所述之多功能光反應性及可裂解探針及溫和裂解條件(圖3B)與使用具有苛刻裂解反應之探針的結果(圖3A)相比對蛋白質結構的影響。在溫和裂解條件下，保留蛋白質結構，且反應係生物正交，而在苛刻裂解條件下，蛋白質變性且反應係非生物正交。圖3A示意性地說明了相對苛刻的裂解，諸如藉由在裂解反應中使用還原劑，諸如參(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)介導之裂解。除了裂解連接子外，TCEP或DTT亦破壞其他二硫鍵，包括蛋白質中半胱胺酸胺基酸之間常見的天然共價二硫鍵，從而使蛋白質變性。據估計，細胞中超過90%之蛋白質含有至少一個半胱胺酸胺基酸，且真核蛋白質體中約三分之一的蛋白質形成二硫鍵。因此，對樣品進行相對苛刻的裂解以破壞二硫鍵可能會顯著破壞蛋白質結構，破壞整體細胞架構，且改變天然存在之生物分子相互作用。裂解反應可視為非生物正交反應。在一些實施例中，生物正交反應保留了源自活生物體(例如，源自真核生物)之結構且排除了對諸如病毒之非生物實體結構的考慮。
圖4B示意性地說明了與本文所述之多功能探針一起使用之相對溫和的裂解反應。裂解反應使用更溫和的試劑(例如酶或連接子特異性化學品)來裂解可裂解連接子。在一些實施例中，溫和裂解試劑為基本上特異性的。換言之，其基本上及特異性地結合且裂解所關注目標(例如可裂解連接子)，而基本上不結合或裂解其他分子(例如少於1%的時間、少於0.1%的時間等)。在一些實施例中，溫和裂解試劑用於裂解其他鍵，諸如C-C鍵，且使諸如二硫鍵(-S-S-)等鍵保持完整。如圖3B中所說明，由二硫鍵介導之蛋白質的三維結構在如本文所述之溫和裂解後保持完整。由於例如與所關注蛋白質相鄰的天然存在之相鄰分子之標註及鄰近標記取決於相鄰分子與所關注蛋白質之相對接近度，因此維持生物分子之三維結構及整體細胞架構可更準確地標註及標記相鄰分子，減少溫和裂解反應中之假陽性及假陰性。溫和裂解反應可為生物正交，因為其基本上不會破壞天然存在之蛋白質結構或細胞架構。
圖4A至4K顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針中之標籤的實例。標籤係用以與可偵測標記相互作用，以標記與所關注目標分子相鄰之生物分子。圖4A至圖4E顯示了可與探針一起使用之點擊化學標籤的實例。點擊化學標籤可為例如疊氮化物部分或炔烴部分。圖4F至4H顯示了可與探針標籤一起使用之生物素衍生物的實例。圖4I顯示了地高辛基團標籤。圖4J顯示了肽標籤。特定言之，圖4J顯示了具有6個組胺酸之聚His標籤(SEQ ID NO: 1)。然而，組胺酸標籤可替代更少或更多的組胺酸，諸如5個或7-10個或更多。圖4K顯示了SNAP-標籤。圖6K顯示了SNAP-標籤且亦可使用CLIP-標籤或HaloTag。
圖5A至5E顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針之位點特異性可裂解連接子的實例。圖5A顯示了偶氮苯基團。偶氮苯連接子可在裂解步驟中經裂解，諸如用連二亞硫酸鈉或偶氮還原酶。圖5B顯示了硼酸酯基團。硼酸酯可裂解連接子可用亞硫醯氯及吡啶裂解。圖5C顯示了Dde基團。Dde可裂解連接子可使用酶或簡單的小分子進行裂解。圖5D顯示了DNA寡聚體可裂解連接子及可替代使用之其他核酸分子。DNA寡聚體可使用限制酶、核酸酶或使用互補寡聚體之競爭方法來裂解，其取決於所標記之分子。圖5E顯示了肽基團連接子，且肽基團連接子在下文參看圖10A至圖10Q更詳細地論述。肽連接子可在裂解步驟期間使用蛋白酶進行裂解。在一些實施例中，位點特異性可裂解連接子可與誘餌分子結合。例如，與誘餌分子，諸如NHS-酯結合之連接子可與蛋白質誘餌，諸如抗體結合。可出於各種原因，諸如成本或裂解效率來選擇特定裂解連接子及相關裂解試劑。
圖6A至6E顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針中以與樣品中之所關注分子結合之誘餌分子的實例。圖6A顯示了可用作誘餌分子之抗體。可使用任何時間之抗體。圖6B顯示了可用作誘餌分子之核酸基團，諸如螢光原位雜交探針(FISH探針)。圖6C顯示了可用作誘餌分子之功能性蛋白質的示意圖。功能性蛋白質之實例包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G或蛋白質藥物。可用於本文所述之光反應性及可裂解探針的其他誘餌分子包括生物藥物。可用作誘餌之生物藥物的實例包括阿巴西普(abatacept) (Orencia)；阿昔單抗(abciximab) (ReoPro)；阿波毒素A (abobotulinumtoxinA) (Dysport)；阿達木單抗(adalimumab) (Humira)；阿達木單抗-阿托(adalimumab-atto) (Amjevita)；阿多-曲妥珠單抗恩坦新(ado-trastuzumab emtansine) (Kadcyla)；阿柏西普(aflibercept) (Eylea)；阿加糖酶β (agalsidase beta) (Fabrazyme)；阿比魯肽(albiglutide) (Tanzeum)；阿地介白素(aldesleukin) (原介白素)；阿崙單抗( alemtuzumab) (Campath，Lemtrada)；阿糖苷酶α (alglucosidase alfa) (Myozyme，Lumizyme)；阿莫羅布單抗(alirocumab) (Praluent)；阿替普酶(alteplase)，cathflo活化酶(Activase)；阿那白滯素(anakinra) (Kineret)；阿司福酶α (asfotase alfa) (Strensiq)；天冬醯胺酶(Elspar)；天冬醯胺酶菊歐文氏菌(erwinia chrysanthemi) (Erwinaze)；阿特珠單抗(atezolizumab) (Tecentriq)；巴西利昔單抗(basiliximab) (Simulect)；貝卡普勒明(becaplermin) (Regranex)；貝拉西普(belatacept) (Nulojix)；貝利木單抗(belimumab) (Benlysta)；貝伐單抗(bevacizumab) (Avastin)；貝洛托舒單抗(bezlotoxumab) (Zinplava)；博納吐單抗(blinatumomab) (Blincyto)；維布妥昔單抗(brentuximab vedotin) (Adcetris)；卡那單抗(canakinumab) (Ilaris)；卡羅單抗噴地肽(capromab pendetide) (ProstaScint)；賽妥珠單抗(certolizumab pegol) (Cimzia)；西妥昔單抗(cetuximab) (Erbitux)；膠原酶(Santyl)；溶組織梭菌膠原酶(Xiaflex)；達珠單抗(daclizumab) (Zenapax)；達珠單抗(Zinbryta)；達雷妥尤單抗(daratumumab) (Darzalex)；達貝泊汀α (darbepoetin alfa) (Aranesp)；地尼介白素(denileukin diftitox) (Ontak)；地諾單抗(denosumab) (Prolia，Xgeva)；地努妥昔單抗(dinutuximab) (Unituxin)；鏈球菌DNA酶α (dornase alfa) (Pulmozyme)；度拉糖肽(dulaglutide) (Trulicity)；艾卡拉肽(ecallantide) (Kalbitor)；依庫珠單抗(eculizumab) (Soliris)；依洛硫酸酯酶α (elosulfase alfa) (Vimizim)；埃羅妥珠單抗(elotuzumab) (Empliciti)；依泊汀α (epoetin alfa) (Epogen/Procrit)；依那西普(etanercept) (Enbrel)；依那西普-szzs (Erelzi)；依洛尤單抗(evolocumab) (Repatha)；非格司亭(filgrastim) (Neupogen)；非格司亭-sndz (Zarxio)；促卵泡素α (Gonal f)；加硫酶(galsulfase) (Naglazyme)；穀卡匹酶(glucarpidase) (Voraxaze)；戈利木單抗(golimumab) (Simponi)；戈利木單抗(golimumab)注射液(Simponi Aria)；替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan) (Zevalin)；艾達賽珠單抗(idarucizumab) (Praxbind)；艾杜硫酶(idursulfase) (Elaprase)；inco肉毒素A (incobotulinumtoxinA) (Xeomin)；英夫利昔單抗(infliximab) (Remicade)；英夫利昔單抗-dyyb (Inflectra)；干擾素α-2b (內含子A)；干擾素α-n3 (Alferon N Injection)；干擾素β-1a (Avonex，Rebif)；干擾素β-1b (Betaseron，Extavia)；干擾素γ-1b (Actimmune)；易普利姆瑪(ipilimumab) (Yervoy)；依奇珠單抗(ixekizumab) (Taltz)；拉羅尼酶(laronidase) (Aldurazyme)；美泊利單抗(mepolizumab) (Nucala)；甲氧基聚乙二醇-依泊汀β (Mircera)；美曲普汀(metreleptin) (Myalept)；那他珠單抗(natalizumab) (Tysabri)；耐昔妥珠單抗(necitumumab) (Portrazza)；納武單抗(nivolumab) (Opdivo)；奧比妥昔單抗(obiltoxaximab) (Anthim)；奧比妥珠單抗(obinutuzumab) (Gazyva)；奧克纖溶酶(ocriplasmin) (Jetrea)；奧法木單抗(ofatumumab) (Arzerra)；奧拉單抗( olaratumab) (Lartruvo)；奧馬珠單抗(omalizumab) (Xolair)；肉毒桿菌毒素A (Botox)；奧普瑞介白素(oprelvekin) (Neumega)；帕利夫明(palifermin) (Kepivance)；帕利珠單抗(palivizumab) (Synagis)；帕尼單抗(panitumumab) (Vectibix)；甲狀旁腺激素(Natpara)；培門冬醯胺酶(Oncaspar)；培非格司亭(pegfilgrastim) (Neulasta)；聚乙二醇干擾素α-2a (Pegasys)；聚乙二醇干擾素α-2b (PegIntron, Sylatron)；聚乙二醇干擾素β-1a (Plegridy)；培戈洛酶(pegloticase) (Krystexxa)；派姆單抗(pembrolizumab) (Keytruda)；帕妥珠單抗(pertuzumab) (Perjeta)；雷莫蘆單抗(ramucirumab) (Cyramza)；雷珠單抗(ranibizumab) (Lucentis)；拉布立酶(rasburicase) (Elitek)；雷昔庫單抗瑞利珠單抗(raxibacumabreslizumab) (Cinqair)；瑞替普酶(reteplase) (Retavase)；利洛納塞(rilonacept) (Arcalyst)；rima肉毒素B (rimabotulinumtoxinB) (Myobloc)；利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan)；羅米司亭(romiplostim) (Nplate)；沙格司亭(sargramostim) (Leukine)；塞貝利酶α (sebelipase alfa) (Kanuma)；蘇金單抗(secukinumab) (Cosentyx)；西妥昔單抗(siltuximab) (Sylvant)；tbo-非格司亭(filgrastim) (Granix)；替奈普酶(tenecteplase) (TNKase)；托珠單抗(tocilizumab) (Actemra)；曲妥珠單抗(trastuzumab) (Herceptin)；優特克單抗(ustekinumab) (Stelara)；維多珠單抗(vedolizumab) (Entyvio)；齊夫-阿柏西普(ziv-aflibercept) (Zaltrap)。
圖6D亦顯示了可用作誘餌分子之小分子/藥物。例如，顯示了厄洛替尼(erlotinib)。圖6E顯示了CLIP-標籤及可使用自標記部分之其他成員(例如HaloTag或SNAP-Tag)
圖7A至7I顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針中之光活性彈頭的實例。圖7A顯示了二苯甲酮光活性彈頭，其可藉由單光子激發之320-365nm UV-A照射或雙光子激發之720-800nm的UV-A照射來活化。圖7B、7C及7D顯示了基於芳基疊氮化物之彈頭，其可藉由單光子激發之250-365nm照射或雙光子激發之800nm照射來活化。圖7B顯示了苯基疊氮化物光活性彈頭。圖7C顯示了四氟苯基疊氮化物光活性彈頭。圖7D顯示了羥苯基疊氮化物光活性彈頭。圖7E顯示了二氮丙啶光活性彈頭。圖7F顯示了三氟甲基苯基二氮丙啶光活性彈頭。圖7G顯示了核鹼基特異性的3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)光活性彈頭。圖7H顯示了亦為核鹼基特異性的補骨脂素光活性彈頭。補骨脂素與DNA或RNA反應形成共價加合物。在一些實施例中，補骨脂素光活性彈頭可由長波長US光(例如，UVA，310-400 nm)活化。圖7I顯示了依賴於催化劑之苯氧基自由基捕集劑光活性彈頭。特定光活化彈頭之選擇可取決於所需波長及誘餌分子之類型。例如，可選擇多功能探針之成分及用於預探針分析之成分，以便彼此不干擾(或干擾最小)。
圖8A至8G顯示了可用作本文所述之光反應性及可裂解探針中之連接子的連接子之其他實例。圖8A顯示了BCN-NHS連接子。圖8B顯示了DBCO-NHS連接子。圖8C顯示了炔烴-NHS連接子。圖8D顯示了DBCO-PEG3-NHS連接子。圖8E顯示了炔烴-PEG5-NHS連接子。圖8F顯示疊氮基-PEG4-NHS連接子。圖8G顯示了疊氮丁酸-NHS連接子。
圖9A至9G顯示了可用於組成物中且用於實施本文所述方法之光反應性及可裂解探針的實例。探針具有帶有複數個附接位點之多價核心。一個標籤、一個可裂解連接子及一個光活化彈頭與探針上之附接位點結合。在一些實施例中，多價核心包括式(I)之基團。在一些實施例中，n為1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，R1及R2各自獨立地為氫、經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之碳環基、經取代之雜環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基或氮保護基團。在一些實施例中，R3及R4中之一者為－(CH2) x(OCH2CH2) y(CH2) zNR5R6，另一者為附接位點，其中x為1、2、3、4、5或6；y為1、2、3、4、5或6；z為0、1、2、3、4、5或6；且R5及R6中之一者為附接位點，且另一者為氫、經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之碳環基、經取代之雜環基、經取代之芳基、經取代之雜芳基或氮保護基。
圖10A至10B示意性地說明了基於肽之光反應性及可裂解探針。此等探針具有可經肽裂解試劑裂解之肽區域，諸如經識別特定肽序列之蛋白酶裂解，且肽區域係可特異性裂解的(例如經蛋白酶裂解)。圖10A顯示了基於肽之探針224的實例，該探針在肽區域之N末端具有標籤201及光活化彈頭202。圖10B顯示了基於肽之探針225的實例，該探針在肽區域之C末端具有標籤201及彈頭202。圖10A及10B亦顯示了具有額外可撓性連接子222 (本文中亦稱為間隔子)及視情況選用之可點擊胺基酸223的探針。圖10C至10I顯示了可與圖10A及10B中所示之探針一起使用之反應性或可點擊胺基酸的實例。圖10C顯示了疊氮丙胺酸可點擊胺基酸。圖10D顯示了疊氮離胺酸可點擊胺基酸。圖10E顯示炔丙基甘胺酸可點擊胺基酸。圖10F顯示了半胱胺酸可點擊胺基酸。圖10G顯示了NHS活化之C末端可點擊胺基酸。圖10H顯示了NHS活化之天冬胺酸可點擊胺基酸。圖10I顯示了NHS活化之麩胺酸。
圖10J至10Q顯示了圖10A及10B中示意性說明之基於肽之光反應性及可裂解探針的實例。指示了人類鼻病毒3C (HRV 3C)蛋白酶(方格箭頭)、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶(條紋箭頭)及凝血酶(虛線箭頭)之裂解位點。可蛋白水解裂解之肽序列可在裂解步驟期間經蛋白酶特異性裂解。可與本文所述之探針一起使用之可蛋白水解裂解之肽序列的實例包括由活化之凝血因子X腸肽酶(本文中亦稱為因子X腸肽酶或因子Xa)、人類鼻病毒 (HRV) 3C蛋白酶、凝血酶及煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶識別之彼等。在此等蛋白酶中，因子Xa及凝血酶天然存在於血液中。此等蛋白酶可識別及裂解細胞或細胞萃取物中之蛋白質，而非基於肽之探針的可蛋白水解裂解之肽序列。儘管在一些情況下，此可擾亂樣品中天然存在之蛋白質環境且導致一些分析中產生誤導或人為的結果，但亦應注意，此等裂解反應之數量可能會受到足夠的限制，以便對某些目的或在某些情況下適用。不干擾天然存在之生物分子(例如，細胞或組織樣品中之天然存在之蛋白質)的裂解反應視為生物正交的，且在保持天然存在之蛋白質結構之情況下可裂解的探針可視為具有生物正交可裂解肽序列之生物正交可裂解探針。如上所論述，雖然磺基-SBED探針可與本文所述之某些方法一起用於特定應用，但在其他實施例中，磺基-SBED探針用二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇裂解以裂解其S-S鍵亦不利地破壞天然存在之蛋白質(例如，其為非生物正交的)。
腸激酶識別以裂解肽序列DDDDK| (SEQ ID NO: 2)，其中裂解發生於離胺酸之後的連接子鍵。
因子Xa識別以裂解肽序列LVPR|GS (SEQ ID NO: 3)，其中裂解發生於精胺酸與甘胺酸之間的連接子鍵。
人類鼻病毒(HRV) 3C蛋白酶識別以裂解肽序列LEVLFQ|GP (SEQ ID NO:4)，其中裂解發生於麩醯胺酸與甘胺酸之間的連接子鍵。
TEV蛋白酶優偏好裂解序列ENLYFQ|S (SEQ ID NO: 5)，其中裂解發生於麩醯胺酸與絲胺酸之間的連接子鍵。TEV蛋白酶亦可識別序列ENLYFQ|G (SEQ ID NO:6)用於裂解，其中裂解發生於麩醯胺酸與甘胺酸之間的連接子鍵之間。
凝血酶識別以裂解肽序列LVPR|GS (SEQ ID NO: 7)，其中裂解發生於精胺酸與甘胺酸之間的連接子鍵。
除了用於蛋白水解之特異性識別序列之外，肽部分亦可含有額外胺基酸。光反應性及可裂解探針可具有C末端或N末端標籤(例如生物素化)。
圖10J顯示了C-HRV3C預結合肽探針，其具有HRV 3C可蛋白水解裂解之肽序列GRRRYLEVLFQGP (SEQ ID NO: 8)。
圖10K顯示了N-HRV3C預結合肽探針，其具有HRV 3C蛋白酶切割位點肽序列LEVLFQGPYRRRG (SEQ ID NO: 9)。
圖10L顯示了N-TEV預結合肽探針，其具有TEV蛋白酶切割位點肽序列ENLYFQGGGGS (SEQ ID NO: 10)。
圖10M顯示了N-凝血酶預結合肽探針，其具有凝血酶蛋白酶切割位點肽序列LVRPRGSYRRRG (SEQ ID NO: 11)。
圖10N顯示了SN-凝血酶結合肽探針，其具有凝血酶蛋白酶切割位點肽序列LVPRGS (SEQ ID NO: 12)。
圖10O顯示了PN-HRV3C結合肽探針，其具有HRV 3C蛋白酶切割位點肽序列LEVLFQGPGGGGS (SEQ ID NO: 13)。
圖10P顯示了PN-TEV結合肽探針，其具有TEV蛋白酶切割位點肽序列ENLYFQGGYRRRG (SEQ ID NO: 14)。
圖10Q顯示了C-TEV結合肽探針，其具有TEV蛋白酶切割位點肽序列GGGGSYENLYFQG (SEQ ID NO: 15)。
如上所述，一些探針包括可撓性連接子(在本文中亦稱為間隔子)。可撓性連接子為可撓性分子或分子延伸段，用於將兩個分子或部分連接在一起。連接子可由可撓性基團構成，以便相鄰域可相對於另一者自由移動。可撓性連接子可包括可撓性胺基酸殘基，諸如甘胺酸(G)或絲胺酸(S)。可撓性連接子亦可包括蘇胺酸(T)及丙胺酸(A)殘基。一串胺基酸可在連接子中重複。例如，連接子可包括一段甘胺酸殘基，後跟絲胺酸殘基，諸如形成(GGGGS)n寡聚體，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8或更大，且GGGGS模體係重複的。可撓性連接子亦可包括烷基，諸如聚乙二醇(CH 2CH 2O)m連接子，其中m為1至50，或2-30，或3-6。聚合可撓性連接子之其他實例包括聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚醯胺及聚酯。可撓性連接子可為鏈中至少一或兩個原子之線性分子，且可包括更多原子。
圖11A至11D說明了合成本文所述之光反應性及可裂解探針的方法。該等方法產生帶有標籤、可裂解連接子及光活化彈頭之探針。該等圖亦說明了誘餌分子可結合之區域。三功能分子探針可藉由使用市售分子作為構造塊及常規合成步驟來合成。用於合成探針之圖11A至11D中所示之流程係作為實例給出，且不用於限制目的。圖11A顯示了探針1之合成流程。圖11B顯示了探針2之合成流程。圖11C顯示了探針7之合成流程。圖11D顯示了N-TEV探針之合成流程。
一些實施例提供了一種光反應性及可裂解探針，其包括包含複數個附接位點之多價核心。一些實施例提供了與附接位點之一結合的標籤，其中該標籤係用以與標記結合。一些實施例提供了與第二附接位點結合且係用以連接誘餌分子之可裂解連接子，其中該可裂解連接子包括肽序列。 一些實施例提供了與三分之一的附接位點結合之光活化彈頭，其中多價核心包括式(II)或(III)之基團： (II) (III) 其中m、r及q各自獨立地為1、2、3、4、5或6；其中*包含用於可裂解連接子之複數個附接位點之一的連接位點，其中**包括用於標籤或光反應彈頭之一的複數個附接位點中之不同附接位點；其中***分別包括用於光活化彈頭或標籤之複數個附接位點中之不同附接位點，且R7、R8、R9、R10、R11及R12各自獨立地為氫、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜芳基或氮保護基。
在光反應性及可裂解探針之一些實施例中，其中**包括標籤之附接位點，且***包括光活化彈頭之附接位點。
在光反應性及可裂解探針之一些實施例中，肽序列包括蛋白酶識別序列。
在光反應性及可裂解探針之一些實施例中，其中肽序列包含人類鼻病毒3C (HRV 3C)蛋白酶識別序列、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶識別序列或凝血酶識別序列。
在光反應性及可裂解探針之一些實施例中，可裂解連接子進一步包括可結合胺基酸。
在光反應性及可裂解探針之一些實施例中，可裂解連接子進一步包括半胱胺酸或可點擊胺基酸胺基酸。
在光反應性及可裂解探針之一些實施例中，可裂解連接子包含具有疊氮基或炔烴基團之可點擊胺基酸。
圖12A示意性地說明了與抗體誘餌結合之光反應性及可裂解探針。圖12B及圖12C示意性地說明了使用與抗體誘餌結合之光反應性及可裂解探針對分子進行光選擇性標註，以標記細胞核仁中之蛋白質的反應流程。圖12B說明了反應如何使用受控光進行。圖12B亦說明了可裂解探針如何經裂解以減少非照明區域中之背景。圖12B中所示之反應與圖2C中所示之反應類似，不同之處在於誘餌分子204為抗體244且探針255包括抗體244作為誘餌。當探針255之光活化彈頭經活化時，其結合至誘餌/抗體244，而非細胞分子。然而，探針255仍保留在所關注蛋白質附近，在此情況下為細胞246之細胞核250中之核仁247中的核仁素。在裂解步驟期間，光選區外的探針255仍被裂解成片段255 frag及斷開的探針片段255df，其在洗滌步驟中被洗掉。圖12D顯示了使用圖12A及圖12B中所示之反應流程的結果。核仁蛋白在存在光之情況下經特異性標記(上圖及右圖)，但在不存在光之情況下未經標記(下圖)。與誘餌分子連接之探針經由光活化選擇性保留，接著裂解且與酶(例如此實例中之HRP)結合，用於以約10 nm至約100 nm之半徑進行空間標記，具體取決於所用之特定酶及反應時間。在該方法之一些實施例中，選擇性地照明包括照明由點擴散函數定義之區域。
基於核酸之探針
本文亦提供了具有光活化彈頭之基於核酸之探針。此等探針可用於對生物樣品中之生物分子進行光選擇性標註及標記。此等探針可使用核酸鏈置換來允許選擇性地標記生物分子之子集。圖16A顯示基於核酸之探針365。探針365包括錨定鏈376；探測鏈378；探測鏈378上之標籤201，其係用以與可偵測標記(包括如本文他處所述)結合；以及錨定鏈376上之誘餌附接位點382。探測鏈378與錨定鏈376部分互補，且與錨定鏈378沿互補序列形成雙股結構。錨定鏈可與探測鏈連續互補且沿著錨定鏈或探測鏈之整個長度互補。在一些實施例中，錨定鏈及探測鏈可具有1個核苷酸、2個核苷酸、3個核苷酸、4個核苷酸、5個核苷酸、6個核苷酸、7個核苷酸、8個核苷酸、9個核苷酸、10個核苷酸、11個核苷酸至15個核苷酸、16個核苷酸至20個核苷酸、21個核苷酸至25個核苷酸、26個核苷酸至30個核苷酸、31個核苷酸至40個核苷酸、41個核苷酸至50個核苷酸或51個核苷酸至100個核苷酸之互補區域。在一些實施例中，錨定鏈及探測鏈可具有複數個由非互補區隔開之互補區，且複數個互補區中之互補核苷酸的總數可為至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸、至少30個核苷酸、至少35個核苷酸、至少40個核苷酸、至少45個核苷酸、至少50個核苷酸或至少100個核苷酸。在一些實施例中，一或多個互補區域中之互補核苷酸的總數可為至少15個核苷酸或至少20個核苷酸。錨定鏈及/或探測鏈可為核酸(DNA、RNA或DNA及RNA兩者)。圖16A亦說明了雙股結構中之可裂解位點383，且可裂解位點383係用以使得探針之兩條鏈均可經裂解子斷裂或裂解。裂解子裂解可裂解位點。可裂解位點可為例如內切核酸酶識別位點，諸如具有經酶識別之特定序列的限制性內切核酸酶識別位點，且裂解子可為限制性內切核酸酶，諸如限制酶。圖16A亦顯示了位於探針365中之光活化彈頭372。光活化彈頭372係用以在施加由光活化彈頭372接收之光能時將錨定鏈376結合(例如共價結合)至探測鏈378。光活化彈頭372可為例如光活化核鹼基，諸如胸腺嘧啶特異性彈頭。儘管如圖16A中所示，作為探測鏈之一部分，光活化彈頭可另外或替代地位於錨定鏈中、鏈之間等。探針365係用以附接至任何類型之誘餌，諸如抗體、CLIP-標籤、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA 分子、小分子或SNAP標籤。在一些實例中，探針365可附接至抗體，諸如一級抗體或二級抗體。圖16B顯示了探針-誘餌結合物374，其中探針365附接至抗體244。小分子交聯劑可用於將探針365附接至抗體244。在一些變化形式中，複數個(2、3、4個等)個別探針可附接至單一抗體。個別探針可彼此相同或可不同。
圖16C顯示了使用中之探針-誘餌結合物374 (圖16B中所示)的實例，諸如用於選擇性地標記生物樣品之一部分(如他處所示，諸如在圖1及圖2A至圖2C中)，其藉由選擇性地照明生物樣品之一部分(以活化光活化彈頭)及不照明生物樣品之另一部分(其中光活化彈頭未經活化)。圖16C說明了使用競爭鏈380選擇性地標記光活化區域中之生物分子。競爭鏈380與錨定鏈376互補，且在某些情況下，與探測鏈378競爭結合錨定鏈376。圖16C描繪了當樣品區域被照明(頂部)及樣品區域未被照明(底部)時之探針使用。圖16C(頂部 (b))描繪了共價結合錨定鏈376及探測鏈378之光活化彈頭372’。圖16C亦描繪了將限制酶386添加至樣品中且限制酶386裂解可裂解位點383 (頂部(c))。探測鏈片段378frag及錨定鏈片段376frag不再附接至探針或樣品，且可自樣品中移除(洗掉)。剩餘的(且附接至諸如碳水化合物、脂質、核酸、蛋白質等生物分子上)係剩餘的鏈，即探針-誘餌結合物374”中之切割探測鏈378’及切割錨定鏈376’。(儘管探測鏈378及錨定鏈376之切割為向生物樣品添加裂解子(例如限制酶)之結果，如下文詳細解釋且在圖16C之底部顯示，但添加裂解子(例如限制酶)對於防止樣品之未照明區域中的生物分子被標註特別有用)。如頂部最後一幅圖中所說明，競爭鏈380添加至樣品中；然而，相對較短的切割探測鏈378’及彈頭372’處之共價交聯鏈阻止了競爭鏈380取代切割探測鏈378’且競爭鏈380自光活化區域被洗掉。圖16C之底部說明了本文所述之組成物及方法如何防止標註未照明區域中之生物分子。在不存在光之情況下，光活化彈頭372未活化，且錨定鏈376及探測鏈378未交聯(底部(d))。添加限制酶386，且(如上圖)，限制酶386裂解可裂解位點383 (底部(b至c))。探測鏈片段378frag及錨定鏈片段376frag不再附接至探針或樣品，且可自樣品中移除(洗掉)。探針-誘餌結合物374a與探針-誘餌結合物374’之不同之處在於錨定鏈376’及探測鏈374’未交聯。添加了競爭鏈380。在不存在鏈交聯之情況下，競爭鏈380取代切割探測鏈378’。此亦移動了附接至切割探測鏈378’之標籤201。標籤201在此未照明區域中被洗掉，僅留下標註之照明生物樣品區域。接著可分析此等標記的分子，諸如藉由使用酶級聯、中性抗生物素蛋白等或本文所述之其他方法。
圖17A至17D說明了例示性探針-誘餌結合物及使用競爭鏈自樣品之一些區域移除不需要的標籤。圖17A之上圖顯示了生物素標註之探測鏈(頂部鏈)及錨定鏈(底部鏈)在錨定鏈之5’端附接至抗體。此分子示意性地顯示於圖17B中。胸苷特異性光活性彈頭(X)及其潛在的胸苷殘基結合搭配物(若彈頭(X)經光輻射活化)以粗體顯示。對酶位點加底線。在此實例所代表之樣品區域中，該區域未暴露於光，且光活化彈頭(X)不結合潛在的胸苷殘基結合搭配物。藉由步驟390之限制酶消化，探測鏈及錨定鏈中之核酸鏈經裂解，產生縮短的探測鏈及縮短的錨定鏈。此分子示意性地顯示於圖17B中。競爭鏈添加至樣品中且樣品在步驟392中在所需溫度下培育。所需溫度(Temp)高於具有裂解探測鏈之裂解探針的解鏈溫度T m2，且亦低於 (T m3＞Temp＞T m2)含有競爭鏈之探針複合物的解鏈溫度T m3。裂解探測鏈(包括標籤)因此自探針上移除(變性或消失)。競爭鏈變為與錨定鏈雜交。誘餌(抗體)所結合之分子因此未經標註(例如，在非光照活化區域中)。如技術方案27-30中任一項之方法，其中在裂解可裂解位點之前，雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。在一些實例中，探針及/或競爭鏈之核酸序列與內源性核酸序列充分不同且與其生物正交。例如，探針及/或競爭鏈之序列可具有不超過5、不超過6、不超過7、不超過8、不超過9、不超過10、不超過15個與所關注生物體類型(例如真核序列、哺乳動物序列、人類序列、大鼠序列、小鼠序列等)中之內源核苷酸序列匹配的核苷酸。在本文之一些方法中，錨定鏈之一級序列、探測鏈之一級序列及/或競爭鏈之一級序列與生物樣品中天然存在之核酸序列係生物正交的，因此序列匹配內源序列與探測鏈、錨定鏈或競爭鏈之間長度不超過10個的核苷酸。自樣品之非光活化區域中之分子移除標籤之另一實例說明於圖18A至18D中。探針及方法類似於圖16A至17D中所示之探針及方法，不同之處在於替代核酸內切酶裂解(或與其一起)，使用酶或酶片段自非光活化區域選擇性地移除探測鏈，接著用競爭鏈進行鏈置換及替代。圖18A說明了具有光反應彈頭X (粗體)之光反應性探針474。探針474類似於探針374，但缺少限制性內切酶裂解位點。步驟480說明了一種外切核酸酶，諸如具有5’至3’外切核酸酶活性之 大腸桿菌DNA聚合酶I的N末端片段，用於沿5’至3’方向選擇性地移除探測鏈。彈頭可抑制核酸外切酶活性，且可調整標籤(生物素)與彈頭(X)之間的距離(核苷酸數量)以提供所需的探針解鏈溫度。圖18B示意性地說明了探針，且圖18C及圖18D說明了圖18B中所示及圖18A中所示之探針之改變版本不同版本之不同解鏈溫度可用於自部分樣品中之分子移除標籤。例如，為在37℃下進行反應，T m3’＞37℃＞T m2’。例如，T m1’可為52℃至60℃，T m2’可為26℃至34℃，且T m3’可為44℃-53℃。
圖19A至19C及圖20A至20C示意性地說明了可用於自非光活化樣品區域中之分子移除標籤的另一方法。此探針及方法類似於圖18A至18D中所示之探針及方法，不同之處在於使用解鏈因子而非外切核酸酶移除標籤，且該方法可為不依賴於裂解之解鏈。圖19A示意性地顯示了探針465及解鏈因子404。圖19A示意性地顯示了附接至誘餌(抗體244，其可附接至非光活化的分子)之探針465。圖19C顯示了在樣品之光活化區域中標註分子及自非光活化區域中之分子移除標籤的步驟。此等步驟與圖16C中之步驟類似，不同之處在於探測鏈478及錨定鏈476缺少內切核酸酶位點。在上圖(b)及(c)中，在光活化以活化彈頭472後，探測鏈478’及錨定鏈476’在彈頭472處共價結合。儘管存在解鏈因子404，但共價結合之探測鏈478’及錨定鏈 476’無法分離，且標籤201仍附接至誘餌及所關注分子。在下圖(d)、(e)及(f)中，彈頭472未經活化，且解鏈因子404能夠解鏈(例如，變性)且將探測鏈478與錨定鏈及複合物之其餘部分分離。圖(d)顯示解鏈因子404開始作用於探針474。圖(e)顯示探測鏈478已自探針474a移除。在圖(e)中，競爭鏈380可結合探測鏈478且阻止該探測鏈與探針474b再雜交。解鏈因子可為酶(例如DNA解旋酶、RNA解旋酶)、小分子及/或有機分子(例如甲醯胺、尿素)、加熱/溫度處理、鹽處理或氫氧化鈉處理。圖20A至圖20C進一步說明了圖20A中所示之探針之改變版本的不同解鏈溫度如何可用於在用解鏈因子處理(步驟490)之後促進鏈置換及替換(步驟492)。與上文針對圖17A-18D所描述類似，具有探測鏈之探針474 (參見圖20B)具有與其相關之解鏈溫度T m1” (例如52℃-62℃)，且具有競爭鏈之探針474b具有與其相關之解鏈溫度T m2” (例如59℃-68℃)。在T m2”大於T m1”之情況下，可利用反應之溫度來推動反應以形成圖20C中所示之探針474b。
如本文所述之光選擇性標註及標記可在各種類型之樣品中進行，諸如獲自組織、細胞或粒子，諸如獲自實體(例如人類受試者、小鼠受試者、大鼠受試者、昆蟲受試者、植物、真菌、微生物、病毒)之樣品，或並非來自生物體之組織樣品或細胞樣品，諸如細胞培養樣品或人工組織支架樣品(例如培養之實驗室細胞、活體外發育之心臟組織、3D列印組織等)。使用本文所述之探針、材料及方法進行分析之樣品可為活的(活細胞)或可為非活的(例如經固定的)。用於標記及分層之樣品可包括單層樣品、多層樣品、經固定於基板(例如顯微鏡載玻片)上之樣品、未固定於基板上之樣品、細胞懸浮液或萃取物，諸如活體外細胞萃取物、重組細胞萃取物或合成萃取物。在一些實施例中，樣品未經固定(未固定)。適用於標註活細胞之探針之實例包括彼等利用小分子或有時稱為自標記分子(例如Clip-標籤、Halo-標籤、SNAP-標籤)之探針。在一些實施例中，可使用本文所述之方法及材料自動分析大量細胞(例如至少約1,000個細胞、至少10,000個細胞、至少100,000個細胞、至少100萬個細胞)。在一些實施例中，可分析較少數量的細胞，諸如不超過1,000個細胞、不超過100個細胞或僅幾個細胞或單個細胞。在一些實施例中，樣品係經固定的。例如，可用例如乙酸、丙酮、甲醛(4%)、福馬林(10%)、甲醇、戊二醛或苦味酸固定細胞或組織樣品。固定劑可為相對較強固定劑且可交聯分子，或者可較弱且不交聯分子。用於分析之細胞或組織樣品可在分析之前冷凍，諸如使用乾冰或速凍。在分析之前，可將細胞或組織樣品包埋於固體材料或半固體材料(諸如石蠟或樹脂)中。在一些實施例中，用於分析之細胞或組織樣品可經固定繼之以包埋，諸如福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)。
本發明提供了一個實施例，該實施例亦為用於影像引導顯微照明的基於顯微鏡之系統。請參見圖14A及14B。此實施例之基於顯微鏡之系統包含顯微鏡10、成像組件12、照明組件11及處理模組13a。顯微鏡10包含物鏡102及載物台101。載物台101係用以負載樣品S。成像組件12可包含(可控)相機121、成像光源122、聚焦裝置123及第一快門124。請進一步參見圖14B，照明組件11可包含照明光源111及圖案照明裝置117。圖案照明裝置117可包括第二快門112、透鏡模組113 (諸如中繼透鏡113a及113b、四分之一波片113c)、至少一對掃描鏡115及一個掃描透鏡116。或者，數位微鏡裝置(DMD)或空間光調變器(SLM)可用作圖案照明裝置117。
在此實施例中，處理模組13a耦接至顯微鏡10、成像組件12以及照明組件11。處理模組13a可為電腦、工作站或電腦之CPU，其能夠執行為操作此系統而設計之程式。
處理模組13a控制成像組件12以使得相機121獲取第一視野之樣品S的至少一個影像，且一或多個影像傳輸至處理模組13a且由處理模組13a基於預定義標準自動即時處理，從而確定影像S中之所關注區域且從而獲得關於所關注區域之座標資訊。隨後，處理模組13a可根據接收到的關於所關注區域之座標資訊控制照明組件11之圖案照明裝置117照明樣品S之所關注區域。此外，在所關注區域完全照明之後，處理模組13a控制顯微鏡10之載物台101移動至第一視野之後的第二視野。
在此實施例中，成像光源122經由成像光路提供成像光以在對樣品S成像期間照明該樣品。第一快門124沿成像光路置於成像光源122與顯微鏡10之間。可控相機121置於顯微鏡10上或成像光路上。
此外，照明光源111經由照明光路提供照明光以照明樣品S。圖案照明裝置117沿照明光路置於照明光源111與顯微鏡10之間。
本發明提供了另一實施例，該實施例亦為用於影像引導顯微照明的基於顯微鏡之系統。此系統包括一個額外的處理模組以提高照明效能，且將進行詳細描述。請參見圖14A及14B。圖14A係根據本發明之一實施例的影像引導系統的示意圖，且圖14B描繪了圖14A之影像引導系統之光路。
如圖14A及14B中所示，用於影像引導顯微照明之基於顯微鏡之系統1包含顯微鏡10、照明組件11、成像組件12、第一處理模組13及第二處理模組14。基於顯微鏡之系統1經設計以用於拍攝樣品之一或多個顯微鏡影像，且使用此影像或此等影像來確定且照射樣品上之照明圖案，快速完成一個影像之所有步驟(例如在300毫秒內)，且在短時間(例如10小時)內完成蛋白質體學研究之整個照明過程。
顯微鏡10包含載物台101、物鏡102及主體103。載物台係用以負載樣品S。顯微鏡10之載物台101可為高精度顯微鏡載物台。
成像組件12可包括相機121、成像光源122、聚焦裝置123及第一快門124。相機121安裝於顯微鏡10上。詳言之，相機121經由顯微鏡10之主體103耦合至顯微鏡10。聚焦裝置耦合至相機121且經控制以在樣品S成像期間促進自動聚焦過程。成像光源122經由成像光路(如圖14A中描繪成像光之陰影區域中之空心箭頭指示的路徑所示)提供成像光(如圖14A中自成像組件12至物鏡102之陰影區域所示)，以照明樣品S。第一快門124沿成像光路置於成像光源122與顯微鏡10之間。成像光源122可為鹵鎢燈、弧光燈、金屬鹵化物燈、LED燈、雷射，或其中之多者。第一快門之快門時間可隨成像光源121之類型而不同。以LED光源為例，第一快門124之快門時間為20微秒。
若要進行雙色成像，則第一處理模組13關閉第一色光之快門且打開第二色光之快門。此可能需要另外40微秒。相機121接著以另外20毫秒之曝光時間拍攝另一影像。接著第一處理模組13關閉第二色光之快門。
在此實施例中，請進一步參見圖14B，照明組件11包含照明光源111，及圖案照明裝置117，該裝置包括第二快門112、透鏡模組113 (諸如中繼透鏡113a及113b、四分之一波片113c)、至少一對掃描鏡115及掃描透鏡116。或者，DMD或SLM可用作圖案照明裝置117。照明光源111經由照明光路提供照明光(如圖14A中自照明組件11至物鏡102之空心箭頭所示)，以照明樣品S。第二快門112沿照明光路置於照明光源111與顯微鏡10之間。該對掃描鏡115沿照明光路置於第二快門112與顯微鏡10之間。相機121可為高端科學相機，諸如具有高量子效率之sCMOS或EMCCD相機，以使得短曝光時間係可能的。為了獲得足夠的光子進行影像處理，曝光時間例如為20毫秒。
第一處理模組13耦合至顯微鏡10及成像組件12。詳言之，第一處理模組13耦合且因此控制相機121、成像光源122、第一快門、聚焦裝置123及顯微鏡10之載物台101，用於成像、焦點保持及視野改變。第一處理模組13可為電腦、工作站或電腦之CPU，其能夠執行為操作此系統而設計之程式。第一處理模組13接著觸發相機121對特定視野(FOV)之樣品S的影像進行拍攝。此外，相機121可經由USB接口或其上之Camera Link與第一處理模組13連接。此系統之控制及影像處理程序將在以下段落中更詳細地論述。
在此實施例中，第二處理模組14耦合至照明組件11及第一處理模組13。詳言之，第二處理模組14耦合至且因此控制圖案照明裝置117，包括第二快門112，以及該對掃描鏡，用於照明第一處理模組13確定之所關注區域中之目標點。第二處理模組可為FPGA、ASIC板、另一CPU或另一電腦。此系統之控制及影像處理程序將在以下段落中更詳細地論述。
簡言之，基於顯微鏡之系統1如下操作。第一處理模組13控制成像組件12，使得相機121獲取第一視野之樣品S的至少一個影像。接著將一或多個影像傳輸至第一處理模組13，且由第一處理模組13基於預定義標準自動即時處理，從而確定影像中之所關注區域且從而獲得關於所關注區域之座標資訊。影像處理演算法係事先使用諸如閾值、侵蝕、過濾或人工智慧訓練的語義分割方法等影像處理技術獨立開發。隨後，將關於所關注區域之座標資訊傳輸至第二處理模組14。第二處理模組14根據接收到的關於所關注區域之座標資訊控制照明組件12照明樣品S之所關注區域(或者，亦即照射所關注區域中之彼等目標點)。另外，在所關注區域完全照明(或所關注區域中之所有目標點均被照射)後，第一處理模組13控制顯微鏡10之載物台101移動至第一視野之後的下一(亦即第二)視野。在移動至後續視野之後，該方法進一步重複成像-影像處理-照明步驟，直至所有指定視野之所關注區域均照明。
此外，本發明亦提供了另一實施例，其為用於影像引導顯微照明的基於顯微鏡之方法。基於顯微鏡之方法使用上述基於顯微鏡之系統且包含以下步驟(a)至(e)：(a)由第一處理模組13觸發成像組件12之相機121以獲取第一視野之樣品S的至少一個影像，且將樣品S負載於顯微鏡10之載物台101上；(b)將樣品S之影像自動傳輸至第一處理模組13；(c)基於預定義標準，第一處理模組13自動即時對樣品S進行影像處理，以確定影像中之所關注區域，且獲得所關注區域之座標資訊；(d)將關於所關注區域之座標資訊自動傳輸至第二處理模組14；(e)第二處理模組14根據接收到的座標資訊控制照明組件11對樣品S中之所關注區域進行照明。另外，在此實施例中，所關注區域完全照明後，該方法亦可包括以下步驟：藉由第一處理模組13控制顯微鏡10之載物台101移動至第一視野之後的下一(即第二)視野。
此處所用之基於顯微鏡之系統1與上述基本相同，且在此不再贅述組合元件的組成及變化。
此外，如圖13A及13B中所示，照明光路自照明光源111開始。此照明光源111需要第二快門112。為了達到點照明之高切換速度，機械快門可能不夠快。可使用聲光調變器(AOM)或電光調變器(EOM)來達成高速。例如，AOM可達到25奈秒之上升/下降時間，足以用於此實施例中之方法及系統。在第二快門112之後，可藉由一對中繼透鏡113a及113b來調整光束大小。在中繼透鏡113a及113b之後，四分之一波片113c可促進產生圓偏振。接著光到達成對的掃描鏡(即XY掃描鏡) 115以將照明光一次一個地導引至所需點。接著光穿過掃描透鏡116及管透鏡(包括於顯微鏡中，此處未示出)及顯微鏡10之物鏡102以照明樣品S之目標點。具有高數值孔徑(NA)之物鏡102需要有足夠的光強度以進行光化學反應或光轉換。
此外，本發明亦提供了另一實施例，其為另一用於影像引導顯微照明的基於顯微鏡之系統。用於影像引導顯微照明的基於顯微鏡之系統與上述基本相同。請參見圖15A及15B。在此實施例中，基於顯微鏡之系統1包括顯微鏡10、照明組件11、成像組件12、第一處理模組13及第二處理模組14。顯微鏡10包含載物台101、物鏡102及主體103，且載物台10係用以負載樣品S。請進一步參看圖15B，照明組件11包括照明光源111，及圖案照明裝置117，該裝置包括第二快門112、至少一個中繼透鏡(諸如中繼透鏡113a及113b)、四分之一波片113c、至少一對掃描鏡115及掃描透鏡116。或者，DMD或SLM亦可用作圖案照明裝置117。成像組件12可包括相機121、成像光源122、聚焦裝置123及第一快門124。相機121安裝於顯微鏡10上。
前述實施例與此處描述之系統之間的主要區別在於，此處之第一處理模組13耦合至顯微鏡10之載物台101以及成像組件12之成像光源122及第一快門124。然而，此處之第二處理模組14包含記憶單元141，且耦接至相機121、照明組件11及第一處理模組13。換言之，在此實施例中，相機121由第二處理模組14而非第一處理模組(亦即電腦) 13控制。若需要高速影像資料傳輸及處理，則相機121可經由Camera Link連接至第二處理模組14。記憶單元141可為隨機存取記憶體(RAM)、快閃ROM或硬碟，且隨機存取記憶體可為動態隨機存取記憶體(DRAM)、靜態隨機存取記憶體(SRAM)或零電容隨機存取記憶體(Z-RAM)。
因此，在此處實施之系統1中，其操作如下。第一處理模組13控制成像組件12且第二處理模組14控制相機121，使得相機121獲取第一視野之樣品S的至少一個影像。接著將影像自動傳輸至第二處理模組14之記憶單元141。接著由第二處理模組14基於預定義標準自動即時進行影像處理，從而確定影像中之所關注區域且從而獲得關於所關注區域之座標資訊。隨後，第二處理模組14根據接收到的關於所關注區域之座標資訊控制照明組件11照明樣品S之所關注區域。
由於基於顯微鏡之系統1之各細節元件的組成、變化或與其他元件之連接關係可參考先前實施例，因此在此不再贅述。
此外，本發明亦提供了另一實施例，其為用於影像引導顯微照明之另一基於顯微鏡的方法。用於影像引導顯微照明的基於顯微鏡之方法與上述基本相同。請亦參見圖圖15A及15B，用於影像引導顯微照明的基於顯微鏡之方法包含以下(a)至(d)之步驟：(a)由第一處理模組13控制成像組件12且由第二處理模組14觸發成像組件12之相機121獲取第一視野之樣品S的至少一個影像，且將樣品S負載於顯微鏡10之載物台101上；(b)將樣品S之影像自動傳輸至第二處理模組14之記憶單元141；(c)基於預定義標準，第二處理模組14自動即時對樣品S進行影像處理，以確定影像中之所關注區域，且獲得關於所關注區域之座標資訊；及(d)由第二處理模組14根據接收到的座標資訊控制照明組件11照明樣品S中之所關注區域。
在一些實施例中，用於進行彈頭活化或光選擇性標註及標記之光的波長範圍為約200 nm至約800 nm，例如約200 nm至約250 nm、約250 nm至約300 nm、約300 nm至約350 nm、約350 nm至約400 nm、約400 nm至約450 nm、約450 nm至約500 nm、約500 nm至約550 nm、約550 nm至約600 nm、約600 nm至約650 nm、約650 nm至約700 nm、約700 nm至約750 nm、或約750 nm至約800 nm。在一些實施例中，用於進行光選擇性標註及標記之光的波長為短波UV光(例如254nm；265-275nm)；長UV光(例如365 nm；300-460 nm)。在一些實施例中，用於進行彈頭活化或光選擇性標註及標記之光的波長範圍為約800 nm至約2000 nm，例如約800 nm至約900 nm、約900 nm至約1000 nm、約1000 nm至約1100 nm、約1100 nm至約1200 nm、約1200 nm至約1300 nm、約1300 nm至約1400 nm、約1400 nm至約1500 nm、約1500 nm至約1600 nm、約1600 nm至約1700 nm、約1700 nm至約1800 nm、約1800 nm至約1900 nm、或約1900 nm至約2000 nm。在一些實施例中，用於進行光選擇性標註及標記之光的波長為短波UV光(例如254nm；265-275nm)；長UV光(例如365 nm；300-460 nm)。用於光活化彈頭之波長不同於用於成像之波長。在一些實施例中，光活化彈頭活化利用約300-450 nm、550 nm之光輻射(光)進行單光子活化或利用＞720 nm之光輻射(光)進行多光子活化。特定波長取決於特定彈頭。裂解可由酶或化學品(諸如用於裂解偶氮苯之連二亞硫酸鈉)驅動。
在一些實施例中，探針之多價核心(例如核心部分)可為約70 Da至約500 Da。多價核心可包括或可為單個胺基酸或單個核苷酸。在一些實施例中，核心之最大寬度可小於1 nm。
方法
本文亦揭示了光選擇性標註及標記生物分子之方法及分析方法。該等方法可用於單獨或組合地標註及/或標記碳水化合物、脂質、核酸、蛋白質。該等方法可包括用誘餌分子及光反應性及可溫和裂解探針處理生物樣品及將誘餌分子與生物樣品中之獵物結合的步驟。在一些實施例中，探針包括光活化彈頭及標籤且經由可裂解連接子與誘餌分子結合。一些實施例包括用影像引導顯微鏡系統之成像光源照明生物樣品之步驟。一些實施例包括用可控相機對照明樣品進行成像之步驟。一些實施例包括用相機在第一視野中獲取樣品之亞細胞形態之至少一個影像的步驟。一些實施例包括處理至少一個影像且基於經處理之影像確定樣品中之所關注區域的步驟。一些實施例包括獲得所關注區域之座標資訊的步驟。
一些實施例包括基於獲得之座標資訊用交聯光選擇性地照明所關注區域，從而使探針及誘餌雙重交聯之步驟。一些實施例包括進一步包含使用標籤產生可偵測標記且用可偵測標記來標記接近獵物之蛋白質的步驟。一些實施例包括其中可偵測標記包含酪胺標記之步驟。一些實施例包括其中生物樣品包含複數個細胞之步驟。一些實施例包括其中生物樣品包含複數個活細胞之步驟。一些實施例包括其中生物樣品包含細胞萃取物之步驟。一些實施例包括其中選擇性照明包含照明直徑小於300 nm、小於200 nm或小於100 nm之區域之步驟。一些實施例包括進一步包含自顯微鏡載物台移除至少所關注區域之步驟。
一些實施例包括進一步包含對樣品進行質譜分析或定序分析之步驟。一些實施例包括其中標籤包含生物素衍生物、點擊化學標籤、HaloTag、SNAP-標籤、CLIP-標籤、地高辛或肽標籤。一些實施例包括其中點擊化學標籤包含基於炔烴或基於疊氮化物之基團。一些實施例包括其中可裂解連接子為偶氮苯衍生物、Dde衍生物、DNA寡聚體、肽或硼酸酯。一些實施例包括其中誘餌分子包含抗體、蛋白A、蛋白G、蛋白L、SNAP-標籤、CLIP-標籤或小分子。一些實施例包括其中光活化彈頭包含芳基疊氮化物、二氮丙啶或二苯甲酮。
本文亦描述了光選擇性標註、標記及分析方法。該等方法可包括將光反應性及可裂解探針遞送至生物樣品之步驟，其中該探針包含可裂解連接子、光活化彈頭及標籤且附接至探針之核心。該等方法可包括將誘餌分子與生物樣品中之目標生物分子結合的步驟，其中誘餌分子與探針結合。該等方法可包括用影像引導顯微鏡系統之成像光源照明生物樣品之步驟。
該等方法可包括用可控相機對照明樣品進行成像之步驟。該等方法可包括用相機在第一視野中獲取生物樣品之亞細胞形態之至少一個影像的步驟。該等方法可包括處理至少一個影像且基於經處理之影像確定樣品中之所關注區域的步驟。該等方法可包括獲得所關注區域之座標資訊的步驟。該等方法可包括用光輻射選擇性地照明所關注區域以活化光活化彈頭且將彈頭附接至目標生物分子或目標生物分子附近，從而使探針與目標分子雙重交聯的步驟。該等方法可包括裂解探針之可裂解連接子的步驟。該方法可包括移除經裂解及未結合之探針的步驟。
一些實施例包括標記直徑小於300 nm、小於200 nm或小於100 nm之區域。在一些實施例中，生物樣品包括至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞。
一些方法包括使具有目標生物分子之生物樣品與本文所述之探針接觸、使用光輻射空間選擇性地光交聯探針與目標生物分子、裂解探針、洗去未結合之探針或經裂解探針、用標記來標記生物分子/探針複合物及選擇性地鄰近標記生物分子相鄰分子。
亦描述了用於光活化標記之方法，該等方法包括以下步驟：將任何光反應性及可裂解探針(包括任何核酸探針)結合至生物樣品中之生物分子；將誘餌分子結合至生物樣品中之目標生物分子以交聯探針及目標生物分子；遞送光輻射以活化光活化彈頭且將錨定鏈共價鍵合至探測鏈；裂解探針雙股區域中之可裂解位點以自探針之其餘部分移除一部分錨定鏈及探測鏈；自生物樣品中移除經裂解及未結合之探針。在本文之此等及其他方法中，裂解可裂解位點之前的雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。在本文之此等及其他方法中，(i)探針在裂解步驟之後包括雙股結構，(ii)探針在替換步驟之後包括雙股結構，及(iii)裂解可裂解位點之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m低於第二區域中之替換步驟之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m。
在本文之此等及其他方法中，裂解可裂解位點之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為26℃至34℃。在本文之此等及其他方法中，第二區域中之替換步驟之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為44℃至53℃。在本文之此等及其他方法中，替換步驟在高於裂解可裂解位點之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m且低於替換步驟之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m的溫度下進行。
亦描述一種分析方法，其包括：將光反應性及可裂解探針遞送至生物樣品，該探針包括核酸錨定鏈及核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構；選擇性地照明生物樣品之第一區域，從而活化位於探針中之光活化彈頭且將探測鏈共價鍵合至第一區域中之錨定鏈，且不照明生物樣品之第二部分，以使探測鏈及錨定鏈在第二區域中不共價鍵合；裂解探針雙股區域中之可裂解位點以自第一及第二區域中之探針的其餘部分移除一部分錨定鏈及探測鏈；將競爭核酸鏈遞送至第一及第二區域，其中競爭核酸鏈係用以與探測鏈競爭結合至錨定鏈；用該競爭核酸鏈替代在第二區域中之探針中之探測鏈，但不替代在第一區域中之探針中之探測鏈，其中第一區域中之探測鏈與錨定鏈之間的共價鍵合，以防止競爭鏈替代第一區域中之探測鏈。
此等方法可進一步包括結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。此等方法可進一步包括將可偵測標記與標籤結合，且藉由可偵測標記活性，可偵測地鄰近標記鄰近目標生物分子之相鄰分子。在一些方法中，可偵測地鄰近標記包括光選擇性鄰近標記直徑小於300 nm、小於200 nm或小於100 nm之區域。
在一些方法中，其中裂解可裂解位點之前的雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。在一些方法中，其中裂解可裂解位點之前的雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。在一些方法中，其中探針在裂解步驟之後包括雙股結構，其中裂解可裂解位點之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為52℃至60℃。在一些方法中，其中探針在替換步驟之後包括雙股結構，其中第二區域中之替換步驟之後的第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為44℃至53℃。在一些方法中，其中錨定鏈之一級序列、探測鏈之一級序列及/或競爭鏈之一級序列與生物樣品中天然存在之核酸生物正交。在一些方法中，裂解可裂解位點包括用限制性核酸內切酶及/或限制酶切割可裂解位點。在一些方法中，選擇性地照明以活化光活化彈頭，包括活化核鹼基彈頭。在一些方法中，選擇性地照明以活化光活化彈頭，包括活化胸腺嘧啶特異性彈頭。
在一些方法中，其中選擇性照明生物樣品包括自影像引導顯微鏡系統之成像光源照明，該方法進一步包括用可控相機對照明樣品進行成像；用相機獲取第一視野中之生物樣品之亞細胞形態的至少一個影像；處理至少一個影像且基於經處理之影像確定樣品中之所關注區域；獲得所關注區域之座標資訊；此等及其他方法進一步包括自第一及第二區域移除經裂解及未結合之探針。在此等及其他方法中，選擇性照明包括以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素來照明區域。在此等及其他方法中，選擇性照明包括以100 mW至300 mW之功率強度照明。在此等及其他方法中，可偵測標記包括催化標記。在此等及其他方法中，生物樣品包括至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞或經固定細胞。在此等及其他方法中，生物樣品包括經固定細胞、組織或細胞或組織萃取物。在此等及其他方法中，選擇性照明包括照明由點擴散函數定義之區域。在此等及其他方法中，將生物樣品置於顯微鏡載物台上，該方法進一步包括自載物台移除生物樣品之照明區域的至少一部分。此等及其他方法包括對樣品進行質譜分析或定序分析。在此等及其他方法中，標籤包括生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。
套組
本文亦提供了用於實施本文所述之方法的套組及系統，例如用於生成探針以及分析、標註及標記生物分子。套組通常包括至少一種如本文所述之光反應性及可裂解探針或其組分。在一些實施例中，至少一種光反應性及可裂解探針係用以可溫和裂解(例如生物正交可裂解)。
另外，套組通常將包括說明材料，其揭示了用於產生或修飾一或多種探針之方法，諸如將誘餌部分附接至探針、將探針應用於樣品、將誘餌部分結合至獵物分子(在樣品中)、經由光活化彈頭將探針光交聯至所關注分子、經由可裂解連接子鍵光反應性裂解可裂解連接子、移除(洗掉)非光反應性探針。
套組亦可包括額外組件以促進套組設計之特定應用。因此，例如，當套組含有一或多種用於標註及標記生物分子之光反應性及可裂解探針時，該套組可另外含有一或多種裂解分子(例如化學品、核酸內切酶、蛋白酶)。該套組可另外含有一或多種誘餌分子，諸如本文所述之彼等中之任一者(例如抗體、功能性蛋白質(例如蛋白A、蛋白G、蛋白質藥物等)、自標記蛋白質(例如CLIP-標籤、Halo-Tag、SNAP-標籤)、小分子或藥物。
套組可另外含有偵測樣品及/或偵測標記之工具(例如用於酶標記之酶受質、用於偵測螢光標記之過濾器組、酶或相關偵測試劑，包括用於進行催化報導子沉積(CARD)或信號放大之試劑(例如抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、辣根過氧化物酶(HRP)、酪胺、過氧化氫等)。套組可另外包括用於一或多個步驟(例如在樣品經固定後、在探針裂解後等)之洗滌溶液，諸如阻斷劑、清潔劑、鹽(例如氯化鈉、氯化鉀、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))。套組可包括洗滌溶液之變化形式，諸如用以在使用前稀釋之洗滌緩衝液濃縮物或用於製備一或多種洗滌溶液之組分)及其他常規用於特定方法實踐之試劑。套組可包括固定劑及其他樣品製備材料(例如乙醇、甲醇、福馬林、石蠟等)。
套組可視情況包括教示使用探針、裂解分子、將誘餌分子添加至探針及洗滌溶液及其類似物的說明材料。
用於標記生物分子之套組可包括本文所述之任何光反應性及可裂解核酸探針於第一容器中。套組可另外包括競爭鏈(例如鏈380)於 第二容器中，其中競爭鏈與錨定鏈互補。套組可包括競爭鏈(例如鏈380)，其中當套組之競爭鏈及錨定鏈形成雙股結構時，該結構之解鏈溫度T m為44℃至53℃等，如本文他處所述。
套組亦可包括用於移除探針之酶，諸如核酸內切酶、核酸外切酶或解旋酶。套組亦可包括一或多種解鏈因子，諸如解旋酶、小分子(例如甲醯胺、尿素)或鹽或鹼溶液。
本文亦提供了用於探針生成之套組，諸如用於生成核酸探針，諸如用於自各種所關注誘餌(諸如抗體等)生成探針-誘餌複合物。用於探針生成之套組可包括核酸錨定鏈，其中錨定鏈包含誘餌附接位點；核酸探測鏈，其中探測鏈與錨定鏈沿著互補序列形成雙股結構；雙可裂解位點位於雙股結構中，其中錨定鏈及探測鏈係用於裂解子之施加而在可裂解位點斷裂；光活化彈頭，其中光活化彈頭係用以在施加光能時將錨定鏈共價鍵合至探測鏈；及結合至探測鏈之標籤，其中標籤係用以結合至可偵測標記。
實驗及方法
實例1-使用偶氮探針成功地對核仁素進行局部光選擇性標註的示範。圖12A顯示了核仁素之光選擇性標註的示意圖。核仁素係一種存在於真核細胞核仁中且參與核糖體合成之蛋白質。偶氮-探針1藉由使用BCN-NHS (CAS# 1516551-46-4)作為偶氮-探針1與二級抗體之間的額外連接子而結合至二級抗體。U2OS細胞樣品在玻璃底室載玻片上生長，且用2.4% PFA固定。將與偶氮-探針1結合之抗體應用於用抗核仁素抗體染色之樣品。將樣品暴露於780 nm雙光子照射(200mW，200微秒/像素)以將光活化彈頭光交聯至抗體，且隨後與1M連二亞硫酸鈉在室溫下培育超過16小時，以移除未交聯之探針。添加結合至Alexa Fluor 647染料之中性抗生物素蛋白，且對樣品進行Alexa Fluor 647分析。Alexa Fluor 647係一種明亮的遠紅螢光染料，其非常適合以594 nm 或 633 nm雷射線激發。結果顯示於圖12B之上圖中。近視圖顯示於圖12B之右上角。觀測到特徵性的核仁形狀。側視圖顯示於圖12B之右下角。圖12B之下圖顯示了與上圖中相同處理之對照區域，不同之處在於下圖中所示之樣品未暴露於光活化光。未觀測到明顯染色。
實例2 - BCN-抗體之製備：
1.製備用於100 μl反應的70μl抗體(1.2-1.5μg/μl)溶液。2.添加10μl 1M碳酸氫鈉(或1M硼酸鹽緩衝液，最終50-100mM)及BCN-NHS (Sigma-Aldrich #744867，最終濃度：200μM)。用ddH 2O將最終體積調節至100 μl。3.藉由倒置試管數次輕輕混合且輕輕旋轉。4.在室溫下在振盪器/混合器上培育1小時。必要時避光。5.藉由添加10 μl 1M甘胺酸停止反應，且在室溫下再反應30至60分鐘。6.使用去鹽管柱藉由樹脂過濾移除未結合之小分子。
探針3-抗體結合物之製備：7.將0.5-1 μg/μl抗體與探針3混合(最終濃度：100 μM)，在4℃下反應隔夜。8.使用去鹽管柱藉由樹脂過濾移除未結合之小分子。
光選擇性標記：9.在添加0.1% triton之PBS溶液中用探針3-抗體及DRAQ5 (細胞核標記)處理核仁素染色之細胞60分鐘。10.用添加0.1% Triton之PBS溶液洗滌樣品，且以2.4% PFA固定樣品。11.定義所需區域且以780 nm的160-200 mW脈衝雷射在選定區域內標記探針3-抗體染色之核仁素。12.PBS洗滌經標記之樣品，且在室溫下以1M連二亞硫酸鈉培育隔夜。13.藉由NeutrAvidin-Dy550結合物(1:200)染色來檢查標記。
實例3 - 探針IV N-TEV之製備
將預結合之肽N-TEV溶解於DMSO/水(1/1)中直至1 mM。將4-苯甲醯基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(TCI # S0863)溶解於純的無水DMSO中直至2 mM。將10 µL N-TEV儲備液與10 µL 4-苯甲醯苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯儲備液、10 µL 1M硼酸鈉緩衝液(pH=8.5)、70 µL DMSO/水(1/1)混合，且在室溫下反應2小時。藉由添加10 µL 1M甘胺酸溶液淬滅反應，且使用MALDI-MS進行驗證。
實例4 - 核酸探針之製備
DNA- 抗體結合
1.抗體購自商業供應商(Jackson Immunoresearch，#111-005-003，山羊抗兔)，且最初使用Amicon Ultra Centrifugal Filters (10 kDa MWCO)濃縮至約2.5 mg/ml。可選擇性：移除疊氮化物或任何其他防腐劑，且使用Zeba離心管柱(7000 MWCO)將抗體緩衝液交換為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH 7.4)。對於Jackson之抗體，此儲存緩衝液已不含疊氮化物/胺。2.將200 μg抗體(80 μL)與15 μL 1X PBS及5 μL 2.5 mM SM(PEG)2 (聚乙二醇化SMCC)交聯劑(Thermo，#22102)在二甲基甲醯胺(DMF)中混合。SM(PEG)2與抗體之莫耳比等於9.375。接著將溶液在4℃下培育3小時。3.過量的聚乙二醇化SM(PEG)2交聯劑係藉由G-25管柱移除，且使用Amicon Ultra Centrifugal Filters (10 kDa MWCO)濃縮至＞2 mg/ml。4.並行地，將130μL硫醇修飾之DNA寡核苷酸(100 μM，13 nmol，MW：約11kDa)與30 μL 0.5M二硫蘇糖醇(DTT)及40 μL 5X PBS (添加5 mM EDTA，pH 8.0)在室溫下混合2小時。使用NAP-5無核酸酶管柱(Cytiva/GE Healthcare)純化還原之DNA寡核苷酸。去離子水用作溶離劑。5.使用Amicon Ultra Centrifugal Filters (3 kDa MWCO)將還原之DNA寡核苷酸濃縮至約2μg/μL。6.將68μg (2.72mg/mL，25μL) SM(PEG)2交聯之(順丁烯二醯亞胺活化)抗體與約136μg (1.5μg/μL，91)還原形式之硫醇DNA寡核苷酸(約30 eq，Ref：15eq)在1X PBS溶液中混合(最終體積：125 μL)。使反應在4℃進行12小時。使用Microcon Centrifugal Filters (30 kDa MWCO)純化及濃縮DNA-抗體結合物。
樣品製備程序
帶有4個孔之分室蓋玻片(80427，Ibidi)上的細胞在室溫下用2.4%多聚甲醛/PBS固定10分鐘，且在室溫下用含0.5% Triton X-100之PBS培育10分鐘來透化。接著用3% BSA/0.1% PBST將細胞阻斷1小時，接著在室溫下以含0.002%抗生蛋白鏈菌素之0.1% PBST處理30分鐘以阻斷內源性生物素。用0.1%PBST洗滌三次後，向孔中加入40 μM生物素以阻斷殘留的抗生蛋白鏈菌素。
免疫化學及原位雜交
室溫下在3% BSA/0.1% PBST中用適當濃度(通常為1-10μg/mL)之所需靶標的一級抗體對細胞染色1小時。在3% BSA/0.1% PBST或雜交緩衝液(2×鹽水-檸檬酸鈉(SSC)緩衝液、10%硫酸葡聚糖、1 mg/mL酵母tRNA、5%正常驢血清或BSA)中製備10 μg/mL之DNA結合之二級抗體血清且與樣品一起在室溫下培育1小時或在4℃下培育隔夜培育，以結合一級抗體。製備0.5-1 μg/mL生物素標註/彈頭結合寡核苷酸探針於0.1% PBST或雜交緩衝液中，且在室溫下與樣品一起培育1小時或在4℃下培育隔夜，以與DNA-抗體結合物雜交。
雜交 dsDNA- 抗體結合物之光交聯
另一種二級抗體或帶有螢光團之寡核苷酸探針用於可視化目標蛋白(若需要)，以選擇ROI及共價光交聯雜交鏈。
移除探測寡核苷酸
將樣品與含有序列特異性限制酶及競爭鏈之消化緩衝液(例如：CutSmart®緩衝液)一起培育，以替代消化之DNA-抗體結合物。在37℃下反應60分鐘至隔夜。用0.1% PBST洗滌三次。(其他具有特定反應性之核酸酶亦適用，諸如5’-＞3’核酸外切酶或3’-＞5’核酸外切酶，其取決於錨定DNA與抗體之附接位點)。
光驅動標籤捕獲之驗證
在照明後，使用中性抗生物素蛋白-螢光團結合物(1 μg/mL於3% BSA/PBST中，1小時)探測生物素標記之區域。
實例5 - NHS-(PEG) 2-順丁烯二醯亞胺-Ab結合物之製備
1.抗體購自商業供應商(Jackson Immunoresearch，Dk anti Ms)，且先使用30 kDa過濾器濃縮至2.5至3 mg/ml。2.將適量濃縮抗體與溶解於DMF中之2.50 mM NHS-(PEG) 2-順丁烯二醯亞胺交聯劑(Thermofisher，#22102)混合，且在-20℃下儲存約30天(約4週半)，NHS-(PEG) 2-順丁烯二醯亞胺與抗體之莫耳比在PBS中等於12 (pH=7.2~7.4)。用PBS調節抗體濃度直至等於2至3 mg/ml。3.接著將反應物在4℃下培育3小時。4.過量的NHS-(PEG) 2-順丁烯二醯亞胺交聯劑係藉由G-25管柱移除且使用Amicon Ultra Centrifugal Filters (30kDa MWCO)濃縮至大於2 mg/ml。
NHS-(PEG) 2-順丁烯二醯亞胺結合抗體與還原之硫醇-DNA反應
1.藉由將抗體溶液添加至含有凍乾DNA之試管中，將適當體積之NHS-(PEG) 2-順丁烯二醯亞胺結合抗體(2.5~3mg/mL於1X PBS中)與乾燥的硫醇-DNA寡核苷酸(還原形式)混合，莫耳比等於1:25 (抗體: DNA)。2.渦旋混合反應物幾分鐘，且在大於10,000 RCF下離心。3.使反應在4℃下進行大於12小時。4.使用Microcon® 離心式過濾器(Microcon Centrifugal Filters) (100kDa MWCO)純化及濃縮DNA-抗體結合物。
定量及驗證：1.對於加入初始100 µg抗體，用PBS將抗體結合物之體積調節至150 µL。2.50 µL抗體結合物用於BCA分析。定量後，將結合物之濃度調節至0.5 mg/mL。3.若使用經b-ME處理之IgG，則可使用10%聚丙烯醯胺凝膠藉由SDS-PAGE檢查結合效率。使用15孔梳製備聚丙烯醯胺凝膠，且向各孔中裝載5 μg抗體。
雜交
細胞製備：1.用PFA或PFA/GA固定細胞。2.透化：經固定細胞藉由與0.1至0.5% PBST一起培育10分鐘進行透化。3.用0.1% PBST洗滌3次。4.培育：將細胞用阻斷緩衝液(3% BSA)培育1小時，同時輕輕搖動。5.用0.1% PBST洗滌兩次。6.用0.002%抗生蛋白鏈菌素(在0.1% PBST中)培育30分鐘。7.用0.1% PBST洗滌兩次。8.細胞用40 μM生物素(在0.1% PBST中)培育15分鐘。9.用0.1% PBST洗滌3次。
以Ab-DNA進行免疫螢光
1.使用通用免疫螢光(IF)準則直至第1次抗體處理，且接著用PBST洗滌三次。2.與雜交阻斷緩衝液一起在室溫下培育60分鐘，各蓋玻片30 µL且2孔盤各孔250 µL。若細胞核背景較高，則使用之硫酸葡聚糖最終濃度可為0.02%至0.5%。(儲備液：含5%硫酸葡聚糖之DEPC H 2O)
試劑 體積 附註
10% BSA 50 µL 於DEPC H 2O中
10% Triton-X 100 1 µL 於DEPC H 2O中
10X PBS 10 µL 細胞培養水平或高壓滅菌
鮭魚精子DNA 10 µL
DEPC H 2O 29 µL
總計 100 µL
3.在室溫下用含10~12 μg/mL Ab-DNA之雜交阻斷緩衝液培育60分鐘。用PBST洗滌三次。若細胞核背景較高，則使用之硫酸葡聚糖之最終濃度可為0.02%至0.5%。(儲備液：含5%硫酸葡聚糖之DEPC H 2O)
試劑 體積 附註
10% BSA 50 µL 於DEPC H 2O中
10% Triton-X 100 1 µL 於DEPC H 2O中
10X PBS 10 µL 細胞培養水平或高壓滅菌
鮭魚精子DNA 10 µL
Ab-DNA X µL (對於1/25稀釋，X= 4)
DEPC H 2O 29-X µL
總計 100 µL
4.與1 μM生物素標記之DNA探針(帶或不帶彈頭)及第3 Ab (對於Dk Ab，使用1:100)一起在室溫下以添加3% BSA之PBST中培育60分鐘。5.用PBST洗滌三次，且再用PBS洗滌三次。
去雜化
1.以濕紙巾覆蓋加熱盤表面。2.將加熱盤及加熱之PBS及ddH 2O設定為70至75度。用熱ddH 2O以保持紙巾濕潤。3.在室溫下以預熱之PBS洗滌樣品四次(各洗滌3分鐘)，且用PBST再洗滌2次。4.繼續進行中性抗生物素蛋白染色(通常為1:500)。
擴增
1.以1/1000生物素-HRP(含3% BSA之PBST或PBS)培育細胞30分鐘。2.以PBS洗滌且立即移除。接著再次用PBS洗滌，更換5次，每10~12分鐘更換一次洗滌緩衝液。3.將BP及H 2O 2混合至500 μM BP及0.012% H 2O 2中且培育細胞3分鐘。4.製備2X及1X amp淬滅劑。2X amp淬滅劑：含0.04% NaN 3、20 mM抗壞血酸鈉(SA)及10 mM Trolox (Tx)之PBS。1X amp淬滅劑：含0.02% NaN 3、10 mM抗壞血酸鈉(SA)及5 mM Trolox (Tx)之PBST。5.直接添加等量的2X amp淬滅劑且接著移除。6.  用1X amp淬滅劑洗滌3次。7.用PBS洗滌3次。
當一個特徵或元件在本文中稱為「在」另一特徵或元件「上」時，其可直接在另一特徵或元件上，或亦可存在介於中間的特徵及/或元件。相比之下，當一個特徵或元件稱為「直接在」另一特徵或元件「上」時，則不存在介於中間的特徵或元件。亦應理解，當一個特徵或元件稱為「連接」、「附接」或「耦合」至另一特徵或元件時，其可直接連接、附著或耦合至另一特徵或元件或可存在介於中間的特徵或元件。相比之下，當一個特徵或元件稱為「直接連接」、「直接附接」或「直接耦合」至另一特徵或元件時，則不存在介於中間的特徵或元件。儘管關於一個實施例進行描述或顯示，但如此描述或顯示之特徵及元件可應用於其他實施例。熟習此項技術者亦應理解，對與另一特徵「相鄰」安置之結構或特徵的參考可具有與相鄰特徵重疊或位於其下方之部分。
本文所用之術語僅用於描述特定實施例之目的，且不旨在限制本發明。例如，如本文所用，單數形式「一」及「該」旨在亦包括複數形式，除非上下文另有明確指示。亦應理解，當在本說明書中使用時，術語「包含」及/或「含有」指定了所陳述特徵、步驟、操作、元件及/或組件的存在，但並不排除一或多個其他特徵、步驟、操作、元件、組件及/或其組的存在或添加。如本文所用，術語「及/或」包括一或多個相關聯列出之項目之任何及所有組合，且可縮寫為「/」。
為了便於描述，在本文中可使用空間相對術語，諸如「在......之下」、「下方」、「以下」、「在......之上」、「上方」等，以便於描述一個元件或特徵與另一元件或特徵之關係，如圖式中所說明。應理解，除了圖式中所描繪之方向之外，空間相對術語亦旨在涵蓋裝置在使用或操作中之不同方向。例如，若圖式中之裝置係倒置的，則描述為在其他元件或特徵「之下」或「下方」的元件將定向為在其他元件或特徵「之上」。因此，例示性術語「在......之下」可涵蓋上方及下方兩個方向。可以其他方式定向裝置(旋轉90度或其他方向)，且據此解釋本文使用之空間相對描述符。類似地，除非另有明確說明，否則術語「向上」、「向下」、「垂直」、「水平」等在本文中僅用於解釋目的。
儘管本文可使用術語「第一」及「第二」來描述各種特徵/元件(包括步驟)，但除非上下文另有說明，否則此等特徵/元件不應受此等術語限制。此等術語可用於將一個特徵/元件與另一特徵/元件區別開來。因此，在不脫離本發明之的教示的情況下，下文論述之第一特徵/元件可稱為第二特徵/元件，且類似地，下文論述之第二特徵/元件可稱為第一特徵/元件。
在整個本說明書及隨後的申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則字語「包含」及變化形式，諸如「包括」及「具有」意謂可在方法及物品中共同使用各種組分(例如組成物及設備，包括裝置及方法)。例如，術語「包含」將理解為暗示包括任何所陳述元件或步驟，但不排除任何其他元件或步驟。
一般而言，本文所述之任何設備及方法應理解為包容性的，但組件及/或步驟之全部或子集可替代地為排他性的，且可表示為「由」各種組件、步驟、子組件或子步驟「組成」或者「基本上由」其「組成」。
如在說明書及申請專利範圍本文中所用，包括在實例中所用，且除非另有明確規定，否則所有數字均可理解為如同由字語「約」或「大約」開頭，即使該術語未明確出現亦如此。當描述幅度及/或位置時，可使用字語「約」或「大約」來指示所述值及/或位置在值及/或位置之合理預期範圍內。例如，數值可具有規定值(或值範圍)之+/- 0.1%、規定值(或值範圍)之+/- 1%、規定值(或值範圍)之+/- 2%、規定值(或值範圍)之+/- 5%、規定值(或值範圍)之+/- 10% 等。除非上下文另有說明，否則本文給出之任何數值亦應理解為包括約或近似該值。例如，若揭示值「10」，則亦揭示「約10」。本文中引用之任何數值範圍旨在包括其中包含之所有子範圍。亦應理解，當揭示「小於或等於」該值之值時，亦揭示「大於或等於該值」以及值之間的可能範圍，如熟習此項技術者所適當理解。例如，若揭示值「X」，則亦揭示「小於或等於X」以及「大於或等於X」(例如，其中X為數值)。亦應理解，在整個本申請中，資料係以多種不同格式提供，且此資料表示終點及起點，以及資料點之任何組合的範圍。例如，若揭示特定資料點「10」及特定資料點「15」，則應理解，認為揭示了大於、大於或等於、小於、小於或等於、及等於10及15，以及在10與15之間。亦應理解，亦揭示兩個特定單元之間的各單元。例如，若揭示10及15，則亦揭示11、12、13及14。
儘管上文描述了各種說明性實施例，但可對各種實施例作出多種改變中之任一者而不脫離如申請專利範圍所述之本發明之範疇。例如，在替代實施例中，可經常改變執行各種所述方法步驟的順序，且在其他替代實施例中，可完全跳過一或多個方法步驟。各種裝置及系統實施例之視情況選用之特徵可包括於一些實施例中且不包括於其他實施例中。因此，提供前述描述主要係為了例示性目的，且不應解釋為限制闡述於申請專利範圍中之本發明之範疇。
本文包括之實例及說明係藉由說明而非限制的方式顯示可實施主題之特定實施例。如所提及，可利用其他實施例且由此衍生出其他實施例，從而可在不背離本發明之範疇的情況下進行結構及邏輯替換及改變。本發明主題之此類實施例可在本文中單獨地或共同地由術語「發明」來指代，僅為方便起見，且若實際上揭示超過一個發明或發明概念，則無意將本申請之範疇自願限制於任何單個發明或發明概念。因此，儘管本文已說明及描述了特定實施例，但任何經計算以達成相同目的之佈置均可替代所示之特定實施例。本發明意圖涵蓋各種實施例之任何及所有修改或變化。上述實施例及本文未具體描述之其他實施例之組合在熟習此項技術者回顧以上描述後將為顯而易見的。
1:顯微鏡之系統 10:顯微鏡 11:照明組件 12:成像組件 13a:處理模組 13:第一處理模組 14:第二處理模組 17:信號轉換器 101:載物台 102:物鏡 103:主體 111:照明光源 112:第二快門 113:透鏡模組 113a及113b:中繼透鏡 113c:四分之一波片 115:掃描鏡 116:掃描透鏡 117:圖案照明裝置 121:相機 122:成像光源 123:聚焦裝置 124:第一快門 141:記憶單元 201:標籤 202:光活化彈頭 203:可裂解連接子 204:誘餌分子 205:多功能探針 205a、205’、205b、205c、255、255’、365、465:探針 205 frag、205df、255a、255frag、255df:片段 206:標記 207:催化劑 208:複合物 209:基板 210:所關注生物分子 211:相鄰分子 212、212’、212a、474、474a、474b、474’、474’’:光反應性探針 218、218’、218’’:酶/催化劑受質 221:可裂解區域 222:可撓性連接子 223:可點擊胺基酸 224、225:基於肽之探針 230:多價核心 231:生物分子 232:第一附接位點 234:第二附接位點 236:第三附接位點 240:標記系統 244:抗體 247:核仁 372、372’、472:光活化彈頭 374、374’、374” 、374a、374b:探針-誘餌結合物 376、376’、476、476’:錨定鏈 376frag:錨定鏈片段 378、378’、378’’、478、478’:探測鏈 378frag:探測鏈片段 380:競爭鏈 382:誘餌附接位點 383:可裂解位點 386:限制酶 390、392、480、492:步驟 402:顯微鏡系統 404:窄帶光 404:解鏈因子 406:基板 408:複數個細胞 408a、246:細胞 412:胞器 414:大區域 416、250:細胞核 418:關注區域(ROI) S:樣品
藉由參考闡述說明性實施例之以下詳細描述及隨附圖式，將獲得對本文所述方法及裝置之特徵及優點的更好理解，其中：
圖1顯示了可用於對基板上之細胞進行光選擇性空間標註及鄰近標記之系統的示意圖。
圖2A顯示了多功能光反應性及可裂解探針之示意圖。光反應性及可裂解探針具有帶有複數個附接位點之多價核心。一個標籤、一個可裂解連接子及一個光活化彈頭與探針上之附接位點結合。圖2B示意性地說明了鄰近標記系統，該系統可用於使用圖2A中所示之探針標記所關注小區域中之生物分子。
圖2C顯示了使用本文所述之多功能光反應性及可裂解探針以標記小關注區域(ROI)中之生物分子，比較直接光化學標記與光輔助酶促鄰近標記之結果的示意圖。探針示於圖2B中。
圖3A及圖3B示意性地說明了使用如本文所述之多功能光反應性及可裂解探針及溫和裂解條件(圖3B)與使用具有苛刻裂解反應之探針的結果(圖3A)相比對蛋白質結構的影響。在溫和裂解條件下，蛋白質結構保留，且反應係生物正交的，而在苛刻裂解條件下，蛋白質變性，且反應係非生物正交的。
圖4A至4K顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針中之標籤的實例。標籤係用以與標記相互作用，用於標記與所關注目標分子相鄰之生物分子。圖4A至圖4E顯示了可與探針一起使用之點擊化學標籤的實例。圖4F至4H顯示了可與探針一起使用之生物素衍生物的實例。圖4I顯示了地高辛基團。圖4J顯示了肽標籤。圖4K顯示了SNAP-標籤。
圖5A至5E顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針之位點特異性可裂解連接子的實例。圖5A顯示了偶氮苯基團。圖5B顯示了硼酸酯基團。圖5C顯示了Dde基團。圖5D顯示了DNA寡聚體。圖5E顯示了肽基團。
圖6A至6E顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針中以與樣品中之所關注分子結合(例如共價或非共價)之誘餌分子的實例。圖6A顯示了可用作誘餌分子之抗體。圖6B顯示了可用作誘餌分子之核酸部分。圖6C顯示了可用作誘餌分子之功能性蛋白質的示意圖。圖6D顯示了可用作誘餌分子之小分子/藥物。例如，顯示了厄洛替尼(erlotinib)。圖6E顯示了CLIP-標籤及可使用自標記部分之其他成員(例如HaloTag或SNAP-Tag)。
圖7A至7I顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針中之光活性彈頭的實例。
圖8A至8G顯示了可用於本文所述之光反應性及可裂解探針中之連接子的其他實例。
圖9A至9G顯示了光反應性及可裂解探針之實例。探針具有帶有複數個附接位點之多價核心。一個標籤與一個附接位點結合，一個可裂解連接子與另一附接位點結合，且一個光活化彈頭與探針上之另一附接位點結合。
圖10A至10B示意性地說明了基於肽之光反應性及可裂解探針。此等探針具有可經肽裂解試劑裂解，諸如經識別特定肽序列之蛋白酶裂解的肽區域。圖10A顯示了基於肽之探針的實例，該探針在肽區域之N末端具有標籤及彈頭。圖10B顯示了基於肽之探針的實例，該探針在肽區域之C末端具有標籤及彈頭。圖10A及10B亦顯示了具有額外可撓性連接子及視情況選用之可點擊胺基酸的探針。額外連接子(亦稱為間隔子)可在橋接誘餌分子與光反應性及可裂解探針之間的附接位點中發揮作用。探針與誘餌之間的距離可藉由應用具有不同空間長度之連接子來控制。
圖10C至10I顯示了可與圖10A及10B中所示之探針一起使用之反應性或可點擊胺基酸的實例。點擊胺基酸可用於附接誘餌分子，諸如抗體。
圖10J至10Q顯示了圖10A-10B中示意性說明之基於肽之光反應性及可裂解探針的實例。人類鼻病毒3C (HRV 3C)蛋白酶、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶及凝血酶之裂解位點用箭頭表示。
圖11A至11D說明了用於合成本文所述之光反應性及可裂解探針的方法及步驟。該等方法產生帶有標籤、可裂解連接子及光活化彈頭之探針。
圖12A示意性地說明了與抗體誘餌結合之光反應性及可裂解探針。
圖12B及圖12C示意性地說明了使用與抗體誘餌結合之光反應性及可裂解探針對分子進行光選擇性標註，以標註細胞核仁中之蛋白質的反應流程。圖12B說明了反應如何使用受控光進行。圖12B說明了可裂解探針如何經裂解以減少非照明區域中之背景。
圖12D顯示了使用圖12A及圖12B中所示之反應流程的結果。核仁蛋白在存在光之情況下經特異性標記(上圖及右圖)，但在不存在光之情況下未經標記(下圖)。
圖13A為成像引導系統之示意圖。
圖13B描繪了圖13A之影像引導系統之光路。
圖14A為另一成像引導系統之示意圖。
圖14B描繪了圖14A之影像引導系統之光路。
圖15A為另一成像引導系統之示意圖。
圖15B描繪了圖15A之影像引導系統之光路。
圖16A示意性地說明了具有核酸錨定鏈、核酸探測鏈、光活化彈頭及標籤之光反應性及可裂解探針。
圖16B示意性地說明了與抗體結合之圖16A中之探針。
圖16C示意性地說明了圖16B中說明之探針-抗體結合物之用途，諸如用於標記樣品中之目標生物分子。
圖17A說明了圖16C中所示之探針及方法的實例。圖17B至17D示意性地說明了圖17A中所示之探針結構以及不同探針結構之解鏈溫度。
圖18A說明了用於自樣品之非光活化區域中之分子移除標籤的步驟。使用酶處理移除標籤，接著進行鏈置換及替代。
圖18B至18D顯示了另一光反應性探針。圖18B示意性地說明了探針，且圖18C及圖18D說明了圖18B中所示探針之改變版本。不同版本之不同解鏈溫度可用於自部分樣品中之分子移除標籤。
圖19A及圖19B示意性地說明了可用於自部分樣品中之分子移除標籤的另一光反應性探針。解鏈因子用於移除標籤。
圖19C顯示了在樣品之光活化區域中標註分子及自非光活化區域中之分子移除標籤的步驟。
圖20A說明了用於自樣品之非光活化區域中之分子移除標籤之方法中的步驟。該方法使用解鏈因子、鏈置換及鏈替代來移除標籤。圖20B及圖20B C說明了圖20A所示探針之改變版本的不同解鏈溫度。不同解鏈溫度有利於鏈置換及替代。
無
TW202338100A_111135321_SEQL.xml
201:標籤
244:抗體
372、372’:光活化彈頭
374、374’、374”、374a、374b:探針-誘餌結合物
376、376’:錨定鏈
376frag:錨定鏈片段
378、378’:探測鏈
378frag:探測鏈片段
380:競爭鏈
382:誘餌附接位點
383:可裂解位點
386:限制酶

Claims (110)

  1. 一種光反應性及可裂解探針，其包含： 一核酸錨定鏈，其中該錨定鏈包含一誘餌附接位點； 一核酸探測鏈，其中該探測鏈與該錨定鏈沿一互補序列形成一雙股結構； 一可裂解位點位於該雙股結構中，其中該錨定鏈及該探測鏈於一裂解子之施加而在該可裂解位點處斷裂； 一光活化彈頭，位於該探針中，其中該光活化彈頭於施加光能時將該錨定鏈共價鍵合至該探測鏈；及 一標籤，結合至該探測鏈，其中該標籤係用以結合至一可偵測標記。
  2. 如請求項1所述之光反應性及可裂解探針，其中該錨定鏈及該探測鏈包含DNA、RNA或DNA及RNA兩者。
  3. 如請求項1或2所述之光反應性及可裂解探針，其中該錨定鏈及該探測鏈具有至少6個呈連續一排的互補核苷酸及總共至少20個互補核苷酸。
  4. 如請求項1至2任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該雙股結構之長度為至少10個核苷酸。
  5. 如請求項1至4任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。
  6. 如請求項1至4任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。
  7. 如請求項1至6任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該錨定鏈及該探測鏈之長度為至少10個核苷酸、至少20個核苷酸或至少30個核苷酸。
  8. 如請求項1至7任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該錨定鏈及該探測鏈之長度為不超過40個核苷酸、不超過50個核苷酸或不超過60個核苷酸。
  9. 如請求項1、2或4至6中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該錨定鏈及該探測鏈中之各者的長度在15個核苷酸與40個核苷酸之間。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該錨定鏈包含一級序列，且相對於該可裂解位點，該標籤與該誘餌附接位點位於該一級序列之同一側上。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該探針在該誘餌附接位點處附接至一誘餌分子。
  12. 如請求項11所述之光反應性及可裂解探針，其中該探針共價附接至該誘餌分子。
  13. 如請求項11或12所述之光反應性及可裂解探針，其中該誘餌分子包含抗體、CLIP-標籤、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-標籤。
  14. 如請求項11或12所述之光反應性及可裂解探針，其中該誘餌分子包含抗體。
  15. 如請求項11或1 2所述之光反應性及可裂解探針，其中誘餌分子包含二級抗體。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該標籤包含生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。
  17. 如請求項16所述之光反應性及可裂解探針，其中該生物素衍生物包括以下之基團： 、 或 。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該可裂解位點包含一內切核酸酶位點。
  19. 如請求項1至17中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該可裂解位點包含一限制酶位點。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基。
  21. 如請求項1至19中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該光活化彈頭包含一胸腺嘧啶特異性彈頭。
  22. 如請求項1至19中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基特異性補骨脂素，包括 之基團或一核鹼基特異性疊氮化物。
  23. 如請求項1至19中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基特異性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括 之基團。
  24. 如請求項1至19中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基特異性三氧沙林，包括 之基團。
  25. 如前述請求項中任一項所述之光反應性及可裂解探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基特異性二氮丙啶，包括 之基團。
  26. 一種光活化標記之方法，其包含： 將如請求項1至25中任一項之光反應性及可裂解探針結合至一生物樣品中之一生物分子； 將一誘餌分子結合至該生物樣品中之一目標生物分子以交聯該探針及該目標生物分子； 遞送光輻射以活化該光活化彈頭且將該錨定鏈共價鍵合至該探測鏈； 裂解該探針之雙股區域中之可裂解位點，以自該探針之其餘部分移除一部分該錨定鏈及該探測鏈；及 自該生物樣品中移除經裂解及未結合之探針。
  27. 一種分析方法，其包含： 將一光反應性及可裂解探針遞送至一生物樣品，該探針包含一核酸錨定鏈及一核酸探測鏈，其中該探測鏈與該錨定鏈沿一互補序列形成一雙股結構； 選擇性地照明該生物樣品之一第一區域，從而活化位於該探針中之光活化彈頭且將該探測鏈共價鍵合至該第一區域中之該錨定鏈，且不照明該生物樣品之一第二區域，以使該探測鏈及該錨定鏈在該第二區域中不共價鍵合； 裂解該第一區域及該第二區域中之該探針之該雙股區域中的一可裂解位點，以自該探針之其餘部分移除該錨定鏈之經裂解部分及該探測鏈之經裂解部分； 將一競爭核酸鏈遞送至該第一區域及該第二區域，其中該競爭核酸鏈係用以與該探測鏈競爭結合至該錨定鏈；及 用該競爭核酸鏈替代在該第二區域中之探針中之該探測鏈，但不替代在該第一區域中之探針中之該探測鏈，其中該第一區域中之該探測鏈與該錨定鏈之間的該共價鍵合，以防止該競爭鏈替代該第一區域中之該探測鏈。
  28. 如請求項27所述之方法，其中該探針進一步包含結合至該探測鏈之一標籤，其中該標籤係用以結合至可偵測標記。
  29. 如請求項28所述之方法，其進一步包含將一可偵測標記與該標籤結合，且藉由可偵測標記活性，可偵測地鄰近標記鄰近該目標生物分子之相鄰分子。
  30. 如請求項29所述之方法，其中可偵測地鄰近標記包含光選擇性鄰近標記直徑或最長尺寸小於300 nm、小於200 nm或小於100 nm之區域。
  31. 如請求項27至30中任一項所述之方法，其中在裂解該可裂解位點之前該雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。
  32. 如請求項27至30中任一項所述之方法，其中在裂解該可裂解位點之前該雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。
  33. 如請求項27至32中任一項所述之方法，其中(i)該探針在該裂解步驟之後包含雙股結構，(ii)該探針在該替換步驟之後包含雙股結構，以及(iii)裂解該可裂解位點之後的該第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m低於該第二區域中之該替換步驟之後的該第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m。
  34. 如請求項33所述之方法，其中裂解該可裂解位點之後的該第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為26℃至34℃。
  35. 如請求項33或34所述之方法，其中該第二區域中之該替換步驟之後的該第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m為44℃至53℃。
  36. 如請求項33至35中任一項所述之方法，其中該替換步驟係在高於裂解該可裂解位點之後的該第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m且低於該替換步驟之後的該第二區域中之雙股結構的解鏈溫度T m的溫度下進行。
  37. 如請求項27至36中任一項所述之方法，其中該錨定鏈之一級序列、該探測鏈之一級序列及/或該競爭鏈之一級序列與該生物樣品中天然存在之核酸鏈係生物正交的，使得序列在內源性序列與該等探測鏈或該等錨定鏈之間匹配不超過10個核苷酸。
  38. 如請求項27至37中任一項所述之方法，其中裂解該可裂解位點包含用一內切核酸酶及/或一限制酶切割該可裂解位點。
  39. 如請求項27至38中任一項所述之方法，其中選擇性地照明以活化光活化彈頭包含活化一核鹼基彈頭。
  40. 如請求項27至39中任一項所述之方法，其中選擇性地照明以活化光活化彈頭包含活化一胸腺嘧啶特異性彈頭。
  41. 如請求項27至40中任一項所述之方法，其中選擇性地照明該生物樣品包含自影像引導顯微鏡系統之成像光源照明，該方法進一步包含： 用可控相機對該照明樣品進行成像； 用該相機在一第一視野中獲取該生物樣品之亞細胞形態之至少一個影像； 處理該至少一個影像且基於該經處理之影像確定該樣品中之所關注區域；及 獲得該所關注區域之座標資訊。
  42. 如請求項27至41中任一項所述之方法，其進一步包含自該第一區域及該第二區域移除經裂解及未結合之探針。
  43. 如請求項27至42中任一項所述之方法，其中選擇性地照明包含以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素來照明一區域。
  44. 如請求項27至43中任一項所述之方法，其中選擇性地照明包含以100 mW至300 mW之功率強度照明。
  45. 如請求項29所述之方法，其中該可偵測標記包含一催化標記。
  46. 如請求項27至45中任一項所述之方法，其中該生物樣品包含至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞或經固定細胞。
  47. 如請求項27至45中任一項所述之方法，其中該生物樣品包括經固定細胞、組織、細胞萃取物或組織萃取物。
  48. 如請求項27至47中任一項所述之方法，其中選擇性地照明包括照明由點擴散函數定義之一區域。
  49. 如請求項27至48中任一項所述之方法，其中該生物樣品係置於一顯微鏡載物台上，該方法進一步包含自該載物台移除該生物樣品之該照明區域的至少一部分。
  50. 如請求項27至49中任一項所述之方法，其進一步包含對該樣品進行質譜分析或定序分析。
  51. 如請求項28至50中任一項所述之方法，其中該標籤包含生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。
  52. 一種標記生物分子之套組，其包含： 如請求項1至25中任一項之光反應性及可裂解探針於一第一容器中；及 一說明材料。
  53. 如請求項52所述之套組，其進一步包含一競爭鏈，其中該競爭鏈與錨定鏈互補。
  54. 如請求項53所述之套組，其中當該競爭鏈及該錨定鏈形成一雙股結構時，該結構之解鏈溫度T m為44℃至53℃。
  55. 一種用於探針生成之套組，其包含： 一核酸錨定鏈，其中該錨定鏈包含一誘餌附接位點； 一核酸探測鏈，其中該探測鏈與該錨定鏈沿一互補序列形成一雙股結構； 一可裂解位點位於該雙股結構，其中該錨定鏈及該探測鏈係用於一裂解子之施加而在該可裂解位點處斷裂； 一光活化彈頭，其中該光活化彈頭係用以在施加光能時將該錨定鏈共價鍵合至該探測鏈；及 一標籤，結合至該探測鏈，其中該標籤係用以結合至一可偵測標記。
  56. 一種光反應性探針，其包含： 一核酸錨定鏈，其中該錨定鏈包含一誘餌附接位點； 一核酸探測鏈，其中該探測鏈與該錨定鏈沿一互補序列形成一雙股結構； 一光活化彈頭，位於該探針中，其中該光活化彈頭係用以在施加光能時將該錨定鏈共價鍵合至該探測鏈；及 一標籤，結合至該探測鏈，其中該標籤係用以結合至一可偵測標記。
  57. 如請求項56所述之光反應性探針，其中該錨定鏈及該探測鏈包含DNA、RNA或DNA及RNA。
  58. 如請求項56或57所述之光反應性探針，其中該錨定鏈比該探測鏈長。
  59. 如請求項56或57所述之光反應性探針，其中該錨定鏈及該探測鏈具有至少6個呈連續一排的互補核苷酸及總共至少20個互補核苷酸。
  60. 如請求項56至59中任一項所述之光反應性探針，其中該雙股結構之長度為至少10個核苷酸。
  61. 如請求項56至60中任一項所述之光反應性探針，其中該雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。
  62. 如請求項56至60中任一項所述之光反應性探針，其中該雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。
  63. 如請求項56至62中任一項所述之光反應性探針，其中該錨定鏈及該探測鏈之長度為至少10個核苷酸、至少20個核苷酸或至少30個核苷酸。
  64. 如請求項56至63中任一項所述之光反應性探針，其中該錨定鏈及該探測鏈之長度為不超過40個核苷酸、不超過50個核苷酸或不超過60個核苷酸。
  65. 如請求項56至62中任一項所述之光反應性探針，其中該錨定鏈及該探測鏈中之各者的長度在15個核苷酸與40個核苷酸之間。
  66. 如請求項56至65中任一項所述之光反應性探針，其中該錨定鏈包含一級序列，且相對於該可裂解位點，該標籤與該誘餌附接位點位於該一級序列之同一側上。
  67. 如請求項56至66中任一項所述之光反應性探針，其中該探針在該誘餌附接位點處附接至誘餌分子。
  68. 如請求項67所述之光反應性探針，其中該探針共價附接至該誘餌分子。
  69. 如請求項67或68所述之光反應性探針，其中該誘餌分子包含抗體、CLIP-標籤、HaloTag、蛋白A、蛋白G、蛋白L、RNA分子、小分子或SNAP-標籤。
  70. 如請求項67至69中任一項所述之光反應性探針，其中該誘餌分子包含抗體。
  71. 如請求項67至69中任一項所述之光反應性探針，其中誘餌分子包含二級抗體。
  72. 如請求項56至71中任一項所述之光反應性探針，其中該標籤包含生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。
  73. 如請求項72所述之光反應性探針，其中該生物素衍生物包括以下之基團： 、 或 。
  74. 如請求項56至73中任一項所述之光反應性探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基。
  75. 如請求項56至73中任一項所述之光反應性探針，其中該光活化彈頭包含一胸腺嘧啶特異性彈頭。
  76. 如請求項56至73中任一項所述之光反應性探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基特異性補骨脂素，包括 之基團或一核鹼基特異性疊氮化物。
  77. 如請求項56至73中任一項所述之光反應性探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基特異性3-氰基乙烯基咔唑核苷(CNVK)，包括 之基團。
  78. 如請求項561至73中任一項所述之光反應性探針，其中該光活化彈頭包含一核鹼基特異性三氧沙林，包括 之基團。
  79. 一種光活化標記之方法，其包含： 將如請求項1至25中任一項之光反應性探針結合至一生物樣品中之一生物分子； 將一誘餌分子結合至該生物樣品中之一目標生物分子以交聯該探針及該目標生物分子； 將光輻射遞送至該生物樣品之第一區域以活化該光活化彈頭且將該錨定鏈共價鍵合至該探測鏈， 將該探測鏈自該探針之其餘部分移除且使一競爭鏈與該生物樣品之未用光輻射處理之第二區域中之該錨定鏈雜交；及 自該生物樣品中移除經裂解及未結合之探針。
  80. 一種分析方法，其包含： 將一光反應性探針遞送至一生物樣品，該探針包含一核酸錨定鏈及一核酸探測鏈，其中該探測鏈與該錨定鏈沿互補序列形成雙股結構； 選擇性地照明該生物樣品之一第一區域，從而活化位於該探針中之光活化彈頭且將該探測鏈共價鍵合至該第一區域中之該錨定鏈，且不照明該生物樣品之一第二區域，以使該探測鏈及該錨定鏈在該第二區域中不共價鍵合； 在該第二區域中將該探測鏈自該探針之其餘部分解鏈； 將一競爭核酸鏈遞送至該第一區域及該第二區域，其中該競爭核酸鏈係用以與該探測鏈競爭結合至該錨定鏈；及 用該競爭核酸鏈替代在該第二區域中之探針中之該探測鏈，但不替代該第一區域中之探針中之該探測鏈，其中該第一區域中之該探測鏈與該錨定鏈之間的該共價鍵合，以防止該競爭鏈替代該第一區域中之該探測鏈。
  81. 如請求項80所述之方法，其中該探針進一步包含結合至該探測鏈之一標籤，其中該標籤係用以結合至可偵測標記。
  82. 如請求項81所述之方法，其進一步包含將一可偵測標記與該標籤結合，且藉由可偵測標記活性，可偵測地鄰近標記鄰近該目標生物分子之相鄰分子。
  83. 如請求項82所述之方法，其中可偵測地鄰近標記包含光選擇性鄰近標記直徑或最長尺寸小於300 nm、小於200 nm或小於100 nm之區域。
  84. 如請求項80至83中任一項所述之方法，其中在裂解該可裂解位點之前該雙股結構之解鏈溫度T m為至少50℃。
  85. 如請求項80至83中任一項所述之方法，其中在裂解該可裂解位點之前該雙股結構之解鏈溫度T m為52℃至60℃。
  86. 如請求項80至85中任一項所述之方法，其中(i)該探針在該裂解步驟之後包含雙股結構，(ii)該探針在該替換步驟之後包含雙股結構，以及(iii)裂解該可裂解位點之後的該第二區域中之該雙股結構的解鏈溫度T m低於該第二區域中之該替換步驟之後的該第二區域中之該雙股結構的解鏈溫度T m。
  87. 如請求項86所述之方法，其中裂解該可裂解位點之後的該第二區域中之該雙股結構的該解鏈溫度T m為26℃至34℃。
  88. 如請求項86或87所述之方法，其中該第二區域中之該替換步驟之後的該第二區域中之該雙股結構的該解鏈溫度T m為44℃至53℃。
  89. 如請求項86至88中任一項所述之方法，其中該替換步驟在高於裂解該可裂解位點之後的該第二區域中之雙股結構的該解鏈溫度T m且低於該替換步驟之後的該第二區域中之雙股結構的該解鏈溫度T m的溫度下進行。
  90. 如請求項80至89中任一項所述之方法，其中該錨定鏈之一級序列、該探測鏈之一級序列及/或該競爭鏈之一級序列與該生物樣品中天然存在之核酸鏈係生物正交的，使得序列在內源性序列與該等探測鏈或該等錨定鏈之間匹配不超過10個核苷酸。
  91. 如請求項80至90中任一項所述之方法，其中將該探測鏈自該第二區域中之該探針的其餘部分移除，包含用一核酸外切酶消化該探測鏈。
  92. 如請求項80至90中任一項所述之方法，其中將該探測鏈自該第二區域中之該探針的其餘部分移除，包含用一解鏈因子處理該樣品。
  93. 如請求項80至90中任一項所述之方法，其中將該探測鏈自該第二區域中之該探針的其餘部分移除包含使用包含一解旋酶、一小分子或升高的溫度之解鏈因子處理該樣品。
  94. 如請求項80至91中任一項所述之方法，其中選擇性地照明以活化光活化彈頭包含活化一核鹼基彈頭。
  95. 如請求項80至94中任一項所述之方法，其中選擇性地照明以活化光活化彈頭包含活化一胸腺嘧啶特異性彈頭。
  96. 如請求項82至95中任一項所述之方法，其中選擇性地照明該生物樣品包含自影像引導顯微鏡系統之成像光源照明，該方法進一步包含： 用可控相機對該照明樣品進行成像； 用該相機在第一視野中獲取該生物樣品之亞細胞形態之至少一個影像； 處理該至少一個影像且基於該經處理之影像確定該樣品中之所關注區域； 獲得該所關注區域之座標資訊。
  97. 如請求項82至96中任一項所述之方法，其進一步包含自該第一區域及該第二區域移除未結合之探針。
  98. 如請求項82至97中任一項所述之方法，其中選擇性地照明包含以25微秒/像素至400微秒/像素、50微秒/像素至300微秒/像素或75微秒/像素至200微秒/像素來照明一區域。
  99. 如請求項82至98中任一項所述之方法，其中選擇性地照明包含以100 mW至300 mW之功率強度照明。
  100. 如請求項82所述之方法，其中該可偵測標記包含一催化標記。
  101. 如請求項82至100中任一項所述之方法，其中該生物樣品包含至少一個、至少100個、至少1000個或至少10,000個活細胞或經固定細胞。
  102. 如請求項82至100中任一項所述之方法，其中該生物樣品包括經固定細胞、組織、細胞萃取物或組織萃取物。
  103. 如請求項82至102中任一項所述之方法，其中選擇性地照明包括照明由點擴散函數定義之一區域。
  104. 如請求項82至103中任一項所述之方法，其中該生物樣品係置於顯微鏡載物台上，該方法進一步包含自該載物台移除該生物樣品之該照明區域的至少一部分。
  105. 如請求項82至104中任一項所述之方法，其進一步包含對該樣品進行質譜分析或定序分析。
  106. 如請求項83至105中任一項所述之方法，其中該標籤包含生物素衍生物、CLIP-標籤、點擊化學標籤、地高辛、HaloTag、肽標籤或SNAP-標籤。
  107. 一種標記生物分子之套組，其包含： 如請求項56至80中任一項之光反應性探針於一第一容器中；及 一說明材料。
  108. 如請求項107所述之套組，其進一步包含一競爭鏈，其中該競爭鏈與錨定鏈互補。
  109. 如請求項108所述之套組，其中當該競爭鏈及該錨定鏈形成一雙股結構時，其中該結構之解鏈溫度T m為44℃至53℃。
  110. 一種用於探針生成之套組，其包含： 一核酸錨定鏈，其中該錨定鏈包含一誘餌附接位點； 一核酸探測鏈，其中該探測鏈與該錨定鏈沿一互補序列形成一雙股結構； 一光活化彈頭，其中該光活化彈頭係用以在施加光能時將該錨定鏈共價鍵合至該探測鏈；及 一標籤，結合至該探測鏈，其中該標籤係用以結合至一可偵測標記。
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