KR20180102548A - 삼작용성 가교결합 시약 - Google Patents

삼작용성 가교결합 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (i) 표적 당단백질 수용체 상의 적어도 하나의 결합 부위를 갖는 목적 리간드에 접합시키기 위한 리간드 반응성 기, (ii) 산화된 수용체-당단백질을 포획하기 위한 히드라존 기, 및 (iii) 포획된 당단백질의 검출, 단리 및 정제를 위한, 아지드 및 알킨으로부터 선택되는 친화성 기를 지닌 삼작용성 가교결합 시약, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 리간드와 살아있는 세포 상의 및 생물학적 유체 내의 그의 상응하는 표적 당단백질 사이의 상호작용을 검출, 확인 및 특성화하는 개선된 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에서, 촉매의 새로운 용도를 제공한다.

Description

삼작용성 가교결합 시약
본 발명은 (i) 표적 당단백질 상의 적어도 하나의 결합 부위를 갖는 목적 리간드에 접합시키기 위한 리간드 반응성 기, (ii) 산화된 또는 알데히드 함유 수용체-당단백질을 포획하기 위한 히드라존 기, (iii) 포획된 당단백질의 검출, 단리 및 정제를 위한 친화성 기를 지닌 삼작용성 가교결합 시약, 그의 제조 방법, 및 리간드와 살아있는 세포 상의 및 생물학적 유체 내의 그의 상응하는 당단백질 표적 수용체 사이의 상호작용을 검출, 확인 및 특성화하는 방법에서 그의 용도에 관한 것이다.
글리코실화는 가장 현저한 단백질 변형 중 하나이고, 포유동물 세포에 의해 생성된, 대부분은 아니지만 많은 분비 및 막 결합 단백질은 공유 결합 연결된 글리칸을 함유한다. 복잡한 유기체의 조립에서, 상기 올리고당 부분은 분비된 및 세포 표면 단백질의 폴딩, 세포내 위치(subcellular localization), 전환(turnover), 활성 및 상호작용에 대한 다양한 구조적 및 기능적 역할을 수행한다. 분비된 당단백질은 예를 들어 사이토카인, 호르몬, 성장 및 분화 인자, 효소, 신경 펩티드, 혈관매개제(vasomediator), 항원 인식 분자, 면역 조절 분자, 구조적 당단백질 및 기타 생체 활성 분자를 포함한다. 이들 단백질은 세포-세포 신호전달, 면역 반응, 세포자멸, 숙주-병원체 상호작용 및 많은 질환의 병인과 같은 많은 인식 사건에서 중요하다. 따라서, 특정 표적 수용체에 대한 그러한 당단백질의 특이성은 세포간 소통 조절에 필수적이다. 따라서, 분비된 당단백질과 그의 표적의 리간드 결합 상호작용의 확인 및 특성화는 생물학적 정보 전달의 분자 차원의 이해에 필수적이다.
유사하게, 단백질, 펩티드, 호르몬, 화학 분자, 의약 또는 독소와 같은 리간드에 의한 세포 표면 당단백질 수용체(CSR)의 결합은 세포 미세 환경으로부터 세포 내로의 정보의 전달을 가능하게 한다. 이 세포 표면 신호전달 게이트웨이가 세포 반응에 중요하다는 사실에도 불구하고, 많은 기능성 리간드에 대한 수용체는 알려지지 않았다. 이는 주로 소수성 막 수용체 단백질 확인의 기술적 한계 및 리간드와 그의 대응하는 CSR과의 일시적인 저친화성의 상호작용 때문이다. 따라서, 많은 신호전달 단백질 및 분자는 알려진 1차 분자 표적이 없는 오펀 리간드(orphan ligand)로 남아있고, 신호 전달, 약물 작용, 부정확한(off-target) 효과 또는 질환 관련 신호전달 체계의 각각의 메커니즘의 상세한 분자 이해를 위한 중요한 정보가 현재 누락되어 있다.
유럽 특허 제2670755호는 특정 삼작용성 가교결합 시약 및 (오펀) 리간드와 당단백질 표적 수용체 사이의 상호작용을 확인하는 방법을 개시하고 있다. 개시된 화합물 및 작업 흐름(work flow)은 리간드-수용체 상호작용의 성공적인 확인에 적합하지만, 관련 샘플 처리 작업 흐름뿐만 아니라 화합물도 특정 제약 조건을 갖는다: 첫째, 상기 특허에 개시된 방법은 6.5 또는 훨씬 더 높은 산성의 pH로 제한된다. 이것은 pH가 생리적인 수준이 아니면 리간드-수용체 상호작용이 손상되는 경우에 있어서 문제가 될 수 있다. 둘째, 표적 수용체의 확인은 표적의 N-글리코실화된 펩티드에 전적으로 의존한다. 당단백질 표적 수용체의 비글리코실화된 펩티드에 대한 정보를 수신하는 것은 또한 N-글리코실화되지 않은 다른 표적 수용체의 확인도 가능하게 할 것이고; 표적 수용체의 정확한 단백질형(proteoform)에 대한 정보를 제공하고 전체적으로 표적 수용체 후보의 보다 신뢰가능한 정량화를 가능하게 할 것이다.
이것은 리간드와 표적 당단백질 수용체 사이의 상호작용을 결정하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성 및 상기 방법에 적합한 새로운 화합물을 제공할 필요성을 강조한다.
본 발명은 주로 청구범위 제1항에 정의된 바와 같은 화합물 및 청구범위 제7항에 정의된 바와 같은 방법을 통해 상기 논의된 한계를 극복한다. 본 발명의 추가의 측면은 명세서 및 독립항에 개시되어 있으며, 바람직한 실시양태는 명세서 및 종속항에 개시되어 있다.
본 발명은 이하에서 보다 상세하게 설명될 것이다. 본 명세서에서 제공/개시된 다양한 실시양태, 선호 양태 및 범위는 임의로 조합될 수 있음이 이해된다. 또한, 특정 실시양태에 따라, 선택된 정의, 실시양태 또는 범위가 적용되지 않을 수도 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 삼작용성 가교결합 시약에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 리간드-표적 당단백질 수용체 상호작용을 특성화하고 분석하기 위한, 본 발명의 가교결합 시약의 용도에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 샘플에서 적어도 하나의 탄수화물 잔기를 갖는 표적 당단백질 수용체와 리간드 사이의 특이적인 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 특히 본원에서 설명되는 방법(제3 측면)에서, 살아있는 세포의 생화학적 반응에서 특정 유기 화합물의 비독성 촉매로서의 용도에 관한 것이다.
제5 측면에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 가교결합 시약(제1 측면) 및 임의로 본원에서 설명되는 유기 화합물(제4 측면)을 포함하는 키트에 관한 것이다.
보다 상세한 이해를 위해, 본 발명은 다음의 도면에서 가시화된다.
도 1은 세포 표면 표적 당단백질 수용체의 리간드 기반 수용체 포획(LRC-) 작업 흐름의 개략도를 제시한다. 이 도면은 본 발명의 다양한 측면 및 특히 본 발명의 제3 측면에 개략적으로 나타낸 단계를 구체적으로 보여준다. 이 도면에서, 화학적 엔티티(entity) (I) 내지 (XX) 및 방법 단계 (i) 내지 (xi)가 개략적으로 제시된다: 왼쪽: 작업 흐름; 오른쪽: 대조군 실험. 이 도면은 A가 아지드인 본 발명의 실시양태를 개략적으로 보여준다.
도 2는 pH7.4에서 모델 리간드 표피 성장 인자(EGF)를 사용한 리간드 기반 수용체 포획의 상대적 정량적 평가를 보여준다. 수용체 포획은 H358 세기관지(bronchiole) 세포주에서 EGF-HATRIC 접합체를 사용하여 수행하였다. 그래프는 y축 상의 음의 log2-변형된(negative log2-transformed) 오류 발견율(FDR: false-discovery rate) 조정된 p 값 대 x-축 상의 EGF/대조군 비율의 log2-변형된 변화 배수를 보여준다. 두 조건 전체에 걸쳐 정량된 모든 단백질은 점으로 표시된다. 당단백질 표적 수용체 후보는 0.001 이하의 FDR 조정된 p 값 및 4배 이상의 농축 인자를 갖는 수용체로서 정의된다. 상부 좌측 구석은 대조군에서 당단백질 표적 수용체 후보를 규정하고, 상부 우측 박스는 관심 리간드, 즉 EGF의 당단백질 표적 수용체 후보를 규정한다. 확인된 당단백질 표적 수용체 후보는 검은 점으로 표시된다. 알려진 당단백질 표적 수용체 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 EGF에 대한 표적 수용체로서 상부 우측 표적 박스에서 확인되었다.
도 3은 대체 LRC 작업 흐름의 개략도를 제공하고, A가 알킨인 실시양태에 대해 도 1을 보완한다.
달리 정의되지 않는 한, 다음 정의가 설명 전체에 걸쳐 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "a", "an", "the" 및 본 발명의 측면에서(특히 청구항의 측면에서) 사용되는 유사한 용어는 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥에 의해 분명하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "복수"는 2 이상의 수를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는", "함유하는" 및 "포괄하는"은 본원에서 개방적이고 비제한적인 의미로 사용된다. 용어 "삼작용성"은 "3개의 작용기를 보유함"을 의미한다. 따라서, 삼작용성 (가교결합) 시약은 3개의 작용기를 갖는 (가교결합) 시약을 의미한다. 용어 "헤테로삼작용성(heterotri-functional)"은 "3개의 상이한 작용기를 보유함"을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 " 알킬 "은 1 내지 24개, 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소를 나타낸다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸 및 t-부틸, 펜틸, 헥실을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 용어 "알콕시"는 -O-알킬 기를 나타낸다.
본원에서 사용되는, "알칸디일"로도 언급되는 용어 "알킬렌"은 탄화수소로부터 유래된 2가 라디칼, 예를 들어 -CHR-(CHR)n-이고, 여기서 R은 H 또는 선택되는 치환기이다. 전형적으로, 알킬렌 기는 1 내지 24개의 탄소 원자(즉, n=24), 바람직하게는 10 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "헤테로알킬렌"은 알킬 라디칼에 삽입된 하나 이상의 헤테로 원자, 예컨대 O, N 또는 S, 바람직하게는 0 또는 N을 갖는 알킬렌을 나타낸다.
용어 " 시클로알킬 "은 3 내지 12개의 탄소를 갖는 포화 및 부분 불포화 시클릭 탄화수소 기를 의미한다. 시클로알킬 기의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸 및 시클로옥틸을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
용어 " 헤테로시클로알킬 "은 하나 이상의 헤테로 원자(예컨대, 0, N 또는 S)를 갖는 비방향족 5-8원 모노시클릭, 8-12원 비시클릭 또는 11-14원 트리시클릭 고리 시스템을 나타낸다. 헤테로시클로알킬 기의 예는 피페라지닐, 피롤리디닐, 디옥사닐, 모르폴리닐 및 테트라히드로푸라닐, 글루코실을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴"은 각각의 고리가 비치환되거나 1 내지 4개의 치환기를 가질 수 있는 6 탄소 모노시클릭, 10 탄소 비시클릭, 14 탄소 트리시클릭 방향족 고리 시스템을 나타낸다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 측면에서 사용되는 바와 같이, 페닐렌은 바람직하게는 선택적으로 치환된 1,2-, 1,3- 또는 1,4-페닐렌 기를 나타낸다.
용어 " 헤테로아릴 "은 하나 이상의 헤테로 원자(예컨대, 0, N 또는 S)를 갖는 방향족 5 내지 8원 모노시클릭, 8 내지 12원 비시클릭 또는 11 내지 14원 트리시클릭 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로아릴 기의 예는 피리딜, 푸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴 및 티아졸릴을 포함한다. 피리딜은 2-피리딜, 3-피리딜 및 4-피리딜, 바람직하게는 2-피리딜을 포함한다. 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴 기로 치환된 알킬기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "선택적으로 치환된"은 비치환된 및 치환된 것을 포함한다. 이러한 선택적인 치환기는 바람직하게는 Hal, -OR, -CN, -NO2, -COOR, C(1-8)알킬, C(1-8)알킬렌 및 C(1-8)알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 여기서 R은 1 내지 8개의 탄소 원자이다.
또한, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 기는 1 내지 4개의 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. 치환기의 예는 적어도 하나의 할로, 히드록실, 아미노, 시아노, 니트로, 머캅토, 카르복시, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알케닐, 알킬아미노, 디알킬아미노 또는 알콕시 기로부터 선택된 히드로카르빌 기를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
예시적인 히드로카르빌 치환된 시클로알킬 기는 2-메틸시클로프로필, 2-에틸시클로프로필, 2-메틸시클로부틸, 3-메틸시클로부틸, 2-메틸시클로펜틸, 2,3-디메틸시클로펜틸, 3-이소-프로필시클로펜틸, 2,6-디메틸시클로헥실, 4-(t-부틸)시클로헥실, 2-비닐시클로헥실, 3-알릴시클로펜틸, 3,4-디알릴시클로펜틸, 1-(4-피리디닐)피페리디닐, 1-(4-피리디닐메틸)피페리디닐, 4-(4-피리디닐)피페리디닐, 4-(4-피리디닐)피페라진-1-일 및 비시클로헥실 기를 포함한다.
예시적인 히드로카르빌 치환된 시클로알케닐 기는 3-메틸-3-시클로펜텐-1-일, 3,4-디메틸-3-시클로펜텐-1-일, 2-이소-프로필-2-시클로펜텐-1-일, 2,3-디에틸-2-시클로펜텐-1-일, 4-비닐-1-시클로헥센-1-일, 3,4-디에틸-3-시클로펜텐-1-일 및 3,4-디알릴-3-시클로펜텐-1-일 기를 포함한다.
예시적인 히드로카르빌 치환된 아릴 기는 톨릴, 메시틸, 크실릴, 쿠메닐, 시메닐, 3,5-디(t-부틸)페닐, 2-메틸나프틸, 2-비닐페닐, 2-비닐벤질, 2-비닐나프틸, 4-시클로헥실페닐, 4-(4-피페리디닐)피리디닐 및 p-터페닐기를 포함한다.
예시적인 히드로카르빌 치환된 헤테로아릴 기는 2-메틸피리딘-1-일, 2-에틸피리딘-1-일, 3-비닐이미다졸-1-일, 2-메틸이미다졸-1-일, 2-메틸퀴녹살린-1-일, 1-알릴벤조-트리아졸릴, 2,2'-비피리딜, 4,4'-비피리딜, 4-메틸피라지닐, 4-(피리디닐메틸)-피리디닐, 4-벤질피라지닐, 니코틴아미딜, 2-메틸푸라닐, 5-메틸푸르푸릴아미노, 2-메틸티오펜일, 4-메틸옥사졸릴, 2,5-디페닐-4-메틸옥사졸릴 및 4-메틸-티아졸릴 기를 포함한다.
용어 "할로겐"은 클로로, 플루오로, 브로모 또는 요오도 치환기, 바람직하게는 클로로 또는 플루오로 치환기를 나타낸다.
용어 "(상호작용적) 결합" 또는 "상호작용"은 상호 친화성 또는 결합 능력을 나타내는 대응하는 분자의 쌍(예를 들어, 리간드/표적 당단백질 수용체) 사이의 임의의 유형의 상호작용적 회합을 의미한다. 예를 들어 상호 반응성을 나타내는 화학 반응 기의 대응하는 쌍(공여자/수용자, 산/염기 등) 사이에서 상호작용적 회합이 발생할 수 있다. 예시적인 결합 사건은 비제한적으로, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 수소 결합, 판 데어 발스(van der Waals) 힘, 이온성 상호작용, 비이온성 상호작용, 정전기 상호작용, 공유 결합 등을 포함한다. 결합 사건의 특성에 따라, 상호작용은 상이한 수준, 즉 일시적이거나 영구적인, 약하거나 강한 결합일 수 있음이 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "당단백질"(또는 "당펩티드")은 하나 이상의 공유 결합 연결된 탄수화물 또는 올리고당 기를 함유하는 단백질(또는 펩티드)을 나타낸다. 전형적으로, 탄수화물 기는 전형적으로 아스파라긴 아미노산의 아민 측쇄 기를 통해(N-연결된 탄수화물을 제공하기 위해) 또는 대체로 세린 또는 트레오닌 아미노산의 히드록실 측쇄 기를 통해(O-연결된 탄수화물을 제공하기 위해), 또는 대체로 트립토판 잔기의 인돌 측쇄 기를 통해(C-연결된 탄수화물을 제공하기 위해) 부착된다. 산화된 당단백질 또는 당펩티드는 적합한 산화제로 처리하여 부착된 탄수화물의 인접한 디올 모이어티(moiety)를 절단함으로써 알데히드 기를 생성하는 당단백질 또는 당펩티드를 나타낸다. 이러한 탄수화물의 산화(디알데히드 탄수화물을 생성하는)는 예를 들어 과요오드산 또는 과요오드산 염, 납(Ⅳ) 염 또는 과망간산염, 바람직하게는 (메타)과요오드산나트륨을 사용하는 통상적인 절차에 따라 수행될 수 있다. 별법으로, 화학적 접근법은 당단백질 수용체 상에 가교결합제에 대한 부착 부위를 생성하기 위해 생물직교성(bioorthogonal) 기(예컨대, 아지드, 알킨, 케톤 또는 알데히드)를 운반하는 글리칸 전구체의 유사체를 사용한 세포의 대사 표지를 이용할 수 있다(Current opinion in chemical biology (2007) vol. 11 (1) pp. 52-8).
본원에서 사용되는 용어 "단백질", "폴리펩티드", " 올리고펩티드 " 및 "펩티드"는 동일한 의미를 갖고, 임의의 길이를 갖는 아미노산 중합체를 지칭한다(전형적으로, 펩티드는 단백질의 단편으로 지칭된다). 이 중합체는 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 사슬일 수 있다. 아미노산은 천연 생성 또는 비천연 생성 아미노산, 또는 변이체 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 용어 "단편"은 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드(길이 n)의 전체 길이에 대해 1 내지 n-1 범위의 서열 길이를 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 단편의 길이는 목적에 따라 적절하게 변경될 수 있다.
본 발명에서, 당단백질은 자연계에서 생성되는 당단백질일 수 있거나, 또는 다르게는 (조작된 당단백질이 글리코실화 부위로서 작용하는 적어도 하나의 펩티드 서열을 함유한다는 조건 하에) 합성 방식으로 조작된 서열을 가질 수 있다. 당단백질은 세포내 당단백질, 세포 표면 당단백질(즉, 세포의 표면에 결합된 당단백질) 또는 용액 내의 당단백질(즉, 배지 내에 분비된 당단백질)일 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 당단백질은 수용체, 항체, 효소, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제 등과 같은 관심을 끌거나 유용한 생물학적 또는 화학적 활성을 갖는, 임의의 제약학적으로 또는 상업적으로 관련된 당단백질일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다음의 당단백질의 목록은 단지 예시적인 것이며, 제한적인 열거를 의도하지 않는다. 통상의 기술자는 임의의 당단백질이 본 방법에 사용될 수 있고 그의 특정 요구에 기초하여 특정 당단백질을 선택할 수 있을 것임을 이해할 것이다.
본원에서 (III)으로도 표시되는 용어 "표적 당단백질 수용체" 또는 "당단백질 수용체"는 하나 이상의 특정 종류의 리간드 또는 신호전달 분자가 결합할 수 있는 당단백질을 지칭한다. 이러한 (표적) 당단백질 수용체는 생물학적 유체 내에 또는 임의의 대상체, 바람직하게는 포유동물 대상체, 예를 들어 인간 또는 동물로부터 유래된 세포 상에 존재할 수 있다. 따라서, 용어 "세포 표면"과 조합하여 사용되는 경우(즉, 세포 표면 당단백질 수용체), 이는 당단백질이 세포의 원형질막과 회합하고 때때로 하나 이상의 특정 종류의 리간드 또는 신호전달 분자가 결합할 수 있는 세포외 공간에 노출되는 적어도 하나의 아미노산을 갖는다는 것을 나타낸다. 용어 "산화된"과 함께 사용되는 경우, 이것은 당단백질의 탄수화물 부분이 적합한 산화 처리에 의해 산화되어 알데히드 기를 형성하거나 알데히드 기가 대사 표지에 의해 도입되었음을 나타낸다.
당단백질 수용체는 임의의 세포 표면 수용체 또는 임의의 분비된 수용체, 예컨대 문헌[Varki, A. et al. Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009] 및 www.uniprot.org에 개시된 것을 포함한다. 당단백질 수용체의 비제한적인 예는 예를 들어 섬유모세포 성장 인자 수용체 1(FGFR1)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9QZ7, Q99AW7, Q9UD50, Q63827), 섬유모세포 성장 인자 수용체 2(FGFR2)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q96KM2, P21802, Q63241), 섬유모세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q95M13, AF487554, Q99052), 섬유모세포 성장 인자 수용체 4(FGFR4)(Swiss-Prot Ass. No: Q91742), 뉴로트로핀 티로신 키나제 타입-2(NTRKT-2)(Swiss-Prot Ass. No: Q8WXJ5), 백혈구 항원 관련 단백질-티로신 포스파타제(LAR-PTPRF)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9EQ17, Q64605, Q64604, Q9QW67, Q9VIS8 P10586), 네프린(Swiss-Prot Ass. Nos: Q925S5, Q9JIX2, Q9ET59, Q9R044, Q9QZS7, Q06500), 단백질-티로신 포스파타제 수용체 타입 S(PTPRS)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q64699, Q13332, O75870), 단백질-티로신 포스파타제 수용체 타입 카파(R-PTP-카파)(Swiss-Prot Ass. No: Q15262), 단백질-티로신 포스파타제 수용체 타입 D(PTPRD)(Swiss-Prot Ass. Nos: QBWX65, Q9IAJ1, P23468, Q64487), 에프린 타입-A 수용체 8(EPHA8/티로신-단백질 키나제 수용체 EEK)(Swiss-Prot Ass. Nos: O09127, P29322), 에프린 타입-A 수용체 3(EPHA8/티로신-단백질 키나제 수용체 ETK-1/GEK4)(Swiss-Prot Ass. No: P29318), 에프린 타입-A 수용체 2(Swiss-Prot Ass. No: Q8N3Z2), 인슐린 수용체 (IR)(Swiss-Prot Ass. No: Q9PWN6), 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체(IGF-1)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9QVW4, P08069, P24062, Q60751, P15127, P15208), 인슐린-관련 수용체(IRR)(Swiss-Prot Ass. No: P14616), 티로신-단백질 키나제 수용체 Tie-1(Swiss-Prot Ass. Nos: 06805, P35590, Q06806), 라운드어바웃(Roundabout) 수용체-1(robo-1)(Swiss-Prot Ass. Nos: O44924, AF041082, Q9Y6N7), 신경원성 니코틴 아세틸콜린 수용체 알파 3 서브유닛(CHRNA3)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q8VHH6, P04757, Q8R4G9, P32297), 신경원성 아세틸콜린 수용체 알파 6 서브유닛(Swiss-Prot Ass. Nos: Q15825, Q9R0W9), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타(PDGFRB)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q8R406, Q05030), 인터류킨-6 수용체(IL-6R)(Swiss-Prot Ass. No: Q00560), 인터류킨-23 수용체(IL-23R)(Swiss-Prot Ass. No: AF461422), IL-3, IL5 및 GmCsf의 베타-공통(common) 사이토카인 수용체(Swiss-Prot Ass. No: P32927), 사이토카인 수용체-유사 분자 3(CRLF1)(Swiss-Prot Ass. No: Q9JM58), 클래스 I 사이토카인 수용체(ZCYTOR5)(Swiss-Prot Ass. No: Q9UHH5), 네트린-1 수용체 DCC(Swiss-Prot Ass. No: P43146), 백혈구 Fc 수용체-유사 단백질 (IFGP2)(Swiss-Prot Ass. Nos: Q96PJ6, Q96KM2), 대식세포 청소(Macrophage Scavenger) 수용체 2(MSR2)(Swiss-Prot Ass. No: Q91YK7), 또는 과립구 콜로니 자극 인자 수용체(G-CSF-R)(Swiss-Prot Ass. No: Q99062), 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 수용체를 포함한다.
다른 실시양태에서, 당단백질 수용체는 프로테오글리칸의 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 프로테오글리칸은 헤파란 술페이트 프로테오글리칸을 포함하는 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 프로테오글리칸은 퍼레칸(perlecan)(Swiss-Prot Ass. No: P98160), 또는 그의 단편 또는 변이체이다.
또 다른 실시양태에서, 당단백질 수용체는 막 고정된 세포 표면 효소의 군으로부터 선택된 수용체이다. 예를 들어, 세포 표면 수용체는 ADAM-8(Swiss-Prot Ass. No: Q05910), ADAM-19(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9H013, O35674), ADAM-8(Swiss-Prot Ass. No: P78325), ADAM-12(Swiss-Prot Ass. Nos: O43184, Q61824), ADAM-28(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9JLN6, Q61824, Q9XSL6, Q9UKQ2), ADAM-33 전구체(Swiss-Prot Ass. Nos: Q8R533, Q923W9), ADAM-9(Swiss-Prot Ass. Nos: Q13433, Q61072), ADAM-7(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9H2U9, O35227, Q63180), ADAM-1A 페르틸린 알파(Swiss-Prot Ass. No: Q8R533), ADAM-15(Swiss-Prot Ass. Nos: Q9QYV0, O88839, Q13444), 메탈로프로테이나제-데스인테그린 도메인 함유 단백질(TECAM)(Swiss-Prot Ass. No: AF163291), 메탈로프로테이나제 1(Swiss-Prot Ass. Nos: O95204, Q9BSI6)를 포함하는 데스인테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAM)의 패밀리, 및 메탈로프로테이나제의 피트릴라이신 패밀리, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 당단백질 수용체는 예를 들어 히드롤라제, 트랜스퍼라제, 이소머라제, 리아제, 리가제, 트랜스퍼라제 및 옥시도리덕타제와 같은 효소일 수 있다. 히드롤라제의 예는 리파제, 콜린에스테라제, 알칼리성 포스파타제, β-아밀라제 데옥시리보뉴클레아제, 글루코아밀라제 A 및 B, α-갈락토시다제 I 및 II, β-프럭토푸라노시다제, β-글루쿠로니다제, N-아세틸-β-글루코사미니다제, 히알루로니다제, 옥시토시나제, 칼리크레인, 브로멜라인, 엔테로키나제, 프로테이나제 a, b 및 c, 펩시노겐 및 펩신을 포함한다. 옥시도리덕타제의 예는 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제 및 클로로퍼옥시다제를 포함한다. 트랜스퍼라제의 예는 γ-글루타밀트랜스펩티다제 및 리보뉴클레아제를 포함한다. 통상의 기술자는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 효소의 다른 공지된 예를 알 것이다.
추가의 실시양태에서, 당단백질 수용체는 성장 인자 또는 다른 신호전달 분자일 수 있다. 성장 인자는 전형적으로 세포에 의해 분비되고 다른 세포 상의 수용체에 결합하고 이를 활성화하여 수용체 세포에서 대사 또는 발달 변화를 개시하는 당단백질이다. 포유동물 성장 인자 및 다른 신호전달 분자의 비제한적인 예는 사이토카인; 표피 성장 인자(EGF); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 섬유모세포 성장 인자(FGF), 예컨대 FGF-5; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-1(뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-I 9; 에리트로포이에틴; 골 유도 인자; 면역 독소; 뼈 형태 형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 대부분의 인터류킨; 종양 괴사 인자(TNF) 베타; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA); 조혈 성장 인자; 및 엔케팔리나제를 포함한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 다른 성장 인자 또는 신호전달 분자를 인식할 것이다.
다른 실시양태에서, 당단백질 수용체는 원형질막 수송체일 수 있다. 원형질막 수송체는 전형적으로 예를 들어 채널, 용질 캐리어 수퍼패밀리, 활성 수송체, 보조 수송 단백질 또는 다른 수송체와 같은 원형질막의 지질 이중층을 통한 용질의 수송을 매개하는 당단백질이다. 채널의 예는 나트륨 채널 서브유닛 베타-1(Swiss-Prot Ass. No: Q07699)을 포함한다. 용질 캐리어 수퍼패밀리의 예는 용질 캐리어 패밀리 2, 촉진된 글루코스 수송체 구성원 1(Swiss-Prot Ass. No: P11166), 용질 캐리어 패밀리 22 구성원 1(Swiss-Prot Ass. No: 015245) 및 용질 캐리어 패밀리 22 구성원 6(Swiss-Prot Ass. No: Q4U2R8)을 포함한다. 활성 수송체의 예는 나트륨/칼륨 수송 ATPase 서브유닛 알파-2(Swiss-Prot Ass. No: P50993)를 포함한다. 통상의 기술자는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 원형질막 수송체의 다른 공지된 예를 알 것이다.
본원에서 (II)로도 표시되는, 특정 표적 당단백질 수용체에 대해 특이적인 "리간드"라는 용어는 본 발명과 측면에서 광범위하게 사용된다. 구체적으로, 이 용어는 막 결합되고 세포막 표면 상에 위치하거나 또는 분비된 형태로 존재하는 표적 당단백질 수용체와 상호작용하거나 이에 결합할 수 있는 임의의 화합물을 의미한다. 각각의 표적 당단백질 수용체는 하나 이상의 특정 리간드 결합 부위를 가질 수 있으며, 이들 부위는 상이한 리간드에 대해 동일하거나 상이하거나 또는 중첩될 수 있고, 리간드 결합이 발생하는 전체 표적 당단백질 수용체 내의 특정 펩티드 도메인(즉, 단백질의 특정 부분)이다. 리간드와 펩티드 도메인 사이의 인식은 서열 특이성, 3차원 구조, 또는 리간드 또는 표적 당단백질 수용체의 번역 후 변형에 의한 것일 수 있다. 리간드의 예는 비제한적으로, 당펩티드, 폴리펩티드를 포함하는 펩티드, 당단백질 또는 인단백질을 포함하는 단백질, 탄수화물, 당지질, 인지질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), 비타민, 항원 및 그의 단편, 합텐, 수용체 효능제, 부분적인 효능제, 혼합된 효능제, 길항제, 약물, 케모카인, 호르몬(예를 들어, LH, FSH, TRH, TSH, ACTH, CRH, PRH, MRH, MSH, 글루카곤 및 프로락틴; 트랜스페린, 락토페린, 안지오텐신, 히스타민, 인슐린, 렉틴), 전달물질, 오토코이드(autocoid); 성장 인자(예를 들어, PDGF, VEGF, EGF, TGFa, TBFβ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, FGF, IGF, 봄베신, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴, 온코스타틴 및 엔도텔린 1), 인터류킨(예를 들어, 인슐린 1 내지 15)를 포함하는 사이토카인, 림포카인 및 세포 신호 분자, 예컨대 종양 괴사 인자(예를 들어, 종양 괴사 인자 α 및 β) 및 인터페론(예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ), 보결분자단(prosthetic group), 보조 효소, 보조 인자, 조절 인자, 또는 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 다른 천연 생성 또는 합성 유기 분자, 및 유사한 결합 특성을 보유하는 그의 단편, 유사체 및 다른 유도체를 포함한다. 특정 세포 표면 표적 당단백질 수용체에 특이적인 리간드는 광범위한 세포 유형 또는 특정 세포 유형을 표적으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 뉴클레오티드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 용어 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드 유도체, 디-, 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 포함 물질을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드 염기 또는 변형된 뉴클레오티드 염기, 당 잔기 또는 변형된 당 잔기 및 모노-, 디-, 트리-, 콰드라- 또는 펜타-에스테르 기를 포함하는 분자로서 정의된다. 예를 들어 단백질의 단편, 즉 펩티드가 사용되는 경우, 이것은 임의의 적당한 길이일 수 있다. 펩티드의 (최소) 길이 및 조성, 즉 아미노산의 수 및 유형은 결합 상호작용의 특성에 의해 결정된다는 것이 이해된다. 펩티드는 전형적으로 예를 들어 3-100개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 항체일 수 있다. 항체는 무거운(~150 kDa) 구형의 혈장 단백질로서, 그의 일부의 아미노산 잔기에 올리고당 사슬이 부가된다. 항체는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 약제 또는 다른 상업적 제제로서 현재 사용 중이거나 조사 중인 매우 많은 항체를 고려할 때, 본 발명의 방법에 따른 특정 리간드와의 결합 상호작용에 대한 분석이 특히 관심의 대상이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 예컨대 치료 항체 트라스투주맙(Trastuzumab) 및 베바치주맙(Bevacizumab)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 친화성 결합제, 예컨대 안키린 반복 결합제, 파지 디스플레이에 의해 생성된 친화성 결합제, 또는 올리고핵산 또는 펩티드 앱타머가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 상기 언급된 당단백질 수용체와 같은 당단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 상기 언급된 세포 표면 당단백질 수용체와 같은 세포 표면 단백질의 도메인일 수 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 미생물 또는 바이러스일 수 있다.
본 발명에 따르면, 리간드는 그의 결합 부위를 통해 그의 표적 당단백질 수용체와 상호작용하고, 상기 결합 부위는 표적 당단백질 수용체의 특이적인 펩티드 단편, 예컨대 결합 부위로서 언급되는 표적 당단백질 수용체의 단편의 특정 아미노산 서열 또는 3차원 구조이다. 그의 (세포 표면 또는 분비된) 표적 당단백질 수용체 결합 부위에 대한 리간드 결합과 관련하여 "상호작용하다" 또는 "상호작용"이란 용어는 (세포 표면 또는 분비된) 표적 당단백질 수용체와 리간드 사이의 일시적 또는 영구적인 직접 또는 간접적인 접촉을 포함하고, 리간드는 그의 결합 친화성, 즉 그의 해리 평형 상수 Kd에 의해 특징지을 수 있다. 그의 표적 당단백질 수용체에 대한 리간드의 전형적인 결합 친화성은 적어도 10-5 M, 바람직하게는 10-7 M 이상, 예를 들어 약 10-8 M 내지 약 10-12 M일 수 있다. 본 발명의 방법은 전형적인 결합 친화성뿐만 아니라, 예를 들어 10-5 M 미만의 값을 갖는 Kd에 의해 특징지어지는, (세포 표면 또는 분비된) 표적 당단백질 수용체와 리간드 사이의 보다 낮은 친화성 상호작용 둘 모두의 검출을 허용한다.
따라서, 제1 측면 에서, 본 발명은 삼작용성 가교결합 시약에 관한 것이다. 이들 시약은 하기 화학식 (I)로 표시된다.
Figure pct00001
(I)
상기 식 중에서,
X는 코어 구조를 나타내고;
S1, S2, 및 S3은 서로 독립적으로 스페이서(spacer) 기를 나타내고;
L은 리간드 반응성 기를 나타내고;
A는 친화성 기를 나타내고;
Z는 아릴 또는 헤테로아릴을 나타내고;
R'는 H 또는 알킬 기를 나타내고 R"는 알킬 기를 나타내거나, 또는 R'와 R"는 함께 시클로알킬 기를 형성하는 알칸디일을 나타낸다.
상기 화학식 (I)의 삼작용성 가교결합제는 유익한 효과를 나타내고, (특히 유전자 조작이 없는 그의 자연적인 상호작용 미세환경에서) 살아있는 세포 상의 원형질막 당단백질 또는 분비된 당단백질을 포함하는 표적 당단백질 수용체와 리간드의 상호작용의 편향되지 않은(unbiased) 검출을 위한 간단한 정량적 질량 분광 분석 작업 흐름에 특히 적합하다. 이러한 삼작용성 가교결합제는 또한 생물학적 유체를 분석할 때 이용할 수 있다.
상기 본 발명의 제1 측면인 화학식 (I)의 화합물은 아래에서 보다 상세하게 설명된다.
코어 구조 X: 상기 내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 화합물 (I)은 3개의 가지를 갖는 코어 구조 X를 갖고, 여기서 각각의 가지는 상이한 작용기를 포함한다(따라서, 가교결합 시약은 또한 헤테로삼작용성으로 지칭될 수 있다). 제1 가지는 산화된 당단백질과 반응할 수 있는 히드라존 기(R"R'C=N-NH-)를 포함한다. 제2 가지는 선택된 리간드에 접합될 수 있는 리간드 반응성 기를 포함한다. 제3 가지는 정제 목적, 바람직하게는 제1 및 제2 작용기에 의해 포획된 단백질의 친화성 정제 목적을 위한 친화성 기를 포함한다. 이 시약은 한 분자에서 상기 2개의 상이한 작용기의 조합이 특유하고 리간드 (II)와 표적 당단백질 수용체 (III) 사이의 상호작용의 검출 및 특성화와 같은 다양한 생의학 응용 분야에서 유용하기 때문에 특히 관심의 대상이다. 코어 구조 X는 스페이서 기 S1, S2, 및 S3 및 작용기인 친화성 기, L 및 히드라존 기로 이루어진 3개의 가지 상에 구축할 수 있는 임의의 구조일 수 있다. 따라서, 코어 구조는 바람직하게는 본원에서 정의된 바와 같은 3개의 반응성 작용기를 갖는다. 전형적으로, 코어 구조 및 스페이서 기는 3개의 가지 사이의(및 3개의 작용기 -L, -친화성 기 및 히드라존 기 사이의) 입체 장애가 무시할 수 있거나 또는 없도록 설계된다.
한 실시양태에서, 코어 구조 X는 치환된 탄화수소, 예컨대 치환된 알킬 기, 예를 들어 삼치환된 또는 사치환된 탄소 원자, 예를 들어 α-아미노산 H2N-CHRAA-COOH(RAA는 아미노산 측쇄임)일 수 있다. 따라서, X는 반응성 기를 갖는 측쇄 RAA를 갖는 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 천연 아미노산의 예는 라이신, 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 등을 포함한다. 비천연 아미노산의 예는 예를 들어 상응하는 D-아미노산, 호모세린 등을 포함한다. 이들 실시양태에서, 3개의 스페이서 기 S1, S2, 및 S3은 아미노 기 및 카르복시 기 및 반응성 측쇄 기 RAA에 연결될 수 있다. 유리한 실시양태에서, X는 하기 화학식 (I-I)의 기일 수 있다.
Figure pct00002
(I-I)
여기서, 점선은 W1, W2, W3의 기 S1, S2, 및 S3에 대한 연결을 나타내고;
W1은 -NH-, -O-, -S-를 나타내고;
W2는 -COO-, -00C-, -CONH-, -NHCO-, -NH-, -0-, -S-를 나타내고;
W3은 -COO-, -00C-, -CONH-, -NHCO-, -NH-, -0-, -S-를 나타내고;
s는 1 내지 12의 정수를 나타낸다.
화학식 I-I의 기에서 3개의 작용기 중 임의의 작용기가 3개의 링커 S1, S2, S3 중 임의의 링커에 커플링될 수 있음이 이해된다. 유리한 실시양태에서, W1은 S1에, W2는 S2에, W3은 S3에 연결된다.
유리하게는, W1은 -NH-를 나타낸다.
유리하게는, W2는 -C0NH-를 나타낸다.
유리하게는, W3은 -NHCO-를 나타낸다.
유리하게는, s는 4를 나타낸다.
추가의 실시양태에서, 코어 구조 X는 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기일 수 있으며, 이는 하기 화학식 (I-II)의 적어도 삼치환된, 바람직하게는 삼작용성 6원 아릴 또는 헤테로아릴 기이다.
Figure pct00003
(I-II)
여기서, V1, V2, V3은 서로 독립적으로 카르복시, 아민, 히드록실, 티올과 같은 작용기이고, Ra, Rb, Rc는 서로 독립적으로 O 또는 N이다.
또 다른 실시양태에서, 코어 구조 X는 선형 또는 시클릭 글리세롤 또는 당 모이어티로부터 유래될 수 있다. 본원에서 설명되는 삼작용성 가교결합 시약의 제조에 사용될 수 있는 선택적인 (및 특히 제거 가능한) 보호기를 갖는 다양한 당이 이용 가능하다.
통상의 기술자는 다양한 다른 코어 구조 X가 스페이서 기 및 작용기에 필요한 스캐폴딩(scaffolding)을 제공할 수 있음을 알 것이다.
작용기 L: 삼작용성 가교결합 시약 (I)의 이러한 작용기는 리간드 반응성 기, 예컨대 반응성 작용기 또는 활성화된 작용기이다. 이 기는 스페이서를 선택된 리간드 (II)에 커플링시키고, 따라서 삼작용성 가교결합 시약을 특정 표적 당단백질 수용체 (III)로 향하게 한다. 반응성 작용기 또는 활성화된 작용기는 리간드 상에 존재하는 그의 반응성 대응(counterpart) 기와 반응할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "반응성 작용기"는 (달리 언급되지 않는 한) 비보호된 유리 작용기를 의미한다. 특정 실시양태에서, 반응성 작용기는 -COOH, -NH2, -OH, -SH, -CH=CH- 및 -CH=CH-COOH로 이루어진 군으로부터 선택된다.
반응성 작용기를 활성화하기 위해 사용되는 활성화 시약의 예는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 3-히드록시-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온(HOOBt), N-히드록시숙신이미드(NHS), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 디이소프로필카르보디이미드(DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDAC), 2-(1H-7-아자벤즈트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로 포스페이트(HATU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온-3-옥시 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HDTU), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로 포스페이트(BOP), 벤조트리아졸-1-일옥시트리스-(피롤리디노)-포스포늄 헥사플루오로 포스페이트(PyBop), (3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온-3-옥시)디에틸 포스페이트(DEPBt), 3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진-4-온-3-옥시 트리스-(피롤리디노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PDOP), 2-(벤조트리아졸-1-일옥시)-1,3-디메틸-2-피롤리딘-1-일-1,3,2-디아자포스프-올리디늄 헥사플루오로포스페이트(BOMP), 5-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)-3,4-디히드로-1-메틸 2H-피롤륨 헥사클로로안티모네이트(AOMP), (1H-7-아자벤조트리아졸-1-일옥시) 트리스(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(AOP), 5-(1H-벤조트리아졸-1-일)-3,4-디히드로-1-메틸 2H-피롤리늄 헥사클로로안티모네이트: N-옥시드(BDMP), 2-브로모-3-에틸-4-메틸 티아졸륨 테트라플루오로보레이트(BEMT), 2-브로모-1-에틸 피리디늄 테트라플루오로보레이트(BEP), 2-브로모-1-에틸 피리디늄 헥사클로로안티모네이트(BEPH), N-(1H-벤조트리아졸-1-일메틸렌)-N-메틸메탄아미늄 헥사클로로안티모네이트 N-옥시드(BOMI), N,N'-비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐) 포스피닉 클로라이드(BOP-Cl), 1-(1H-벤조트리아졸-1-일옥시)페닐메틸렌 피롤리디늄 헥사클로로-안티모네이트(BPMP), 1,1,3,3-비스(테트라메틸렌) 플루우로늄 헥사플루오로포스페이트(BTFFH), 클로로(4-모르폴리노)메틸렌 모르폴리늄 헥사플루오로포스페이트(CMMM), 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트(CMBI), 2-플루오로-1-에틸 피리디늄 테트라플루오로보레이트(FEP), 2-플루오로-1-에틸 피리디늄 헥사클로로안티모네이트(FEPH), 1-(1-피롤리디닐-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌)피롤리디늄 헥사플루오로-포스페이트 N-옥시드(HAPyU), O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-비스-(펜타메틸렌)우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBPipU), O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N0,N0-비스(테트라메틸렌)우리늄 헥사플루오로포스페이트(HBPyU), (1H-7-아자벤조트리아졸-1-일옥시) 트리스 (피롤리디노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyAOP), 브로모-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBrOp), 클로로-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyClOP), 1,1,3,3-비스(테트라메틸렌) 클로로우로늄 헥사플루오로포스페이트(PyClU), 테트라메틸플루오로-마미디늄 헥사플루오로포스페이트(TFFH), 트리포스겐, 트리아진계 시약 [염화시아누르, 불화시아누르, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(DMT-MM), 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(CDT)], 비스(2-클로로페닐) 포스포로클로리데이트, 디페닐 포스포로클로리데이트, 디페닐 포스포로아지드(DPPA) 및 이들의 임의의 조합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "활성화된 작용기"는 상응하는 활성화된 작용기를 얻기 위해 커플링제를 사용하는 표준 화학 기술에 의해 활성화된 반응성 작용기를 의미한다.
활성화된 작용기는 그의 특정 반응성에 따라 하위 군으로 나눌 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 활성화된 작용기는 아민 반응성 기, 히드록실 반응성 기, 티올 반응성 기, 알데히도 또는 케토 반응성 기 및 카르복시 반응성 기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"아민 반응성 기"는 (1급 또는 2급) 아민과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 아민 반응성 기는 아릴 또는 알킬 활성화된 카르복실산 에스테르 -COOR, 예컨대 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 그의 유도체(예를 들어, 술포-N-히드록시숙신이미드 에스테르), 페놀계 에스테르 또는 그의 유도체(예를 들어, R은 페놀, p-니트로페놀, 테트라플루오로페놀임)를 포함한다. 다른 아민 반응성 기는 아실 클로라이드(-COCl), 아릴 및 알킬 이미데이트 (-C(NH)OMe) 및 알킬 또는 아릴 이소시아네이트(-NCO) 또는 이소티오시아네이트(-NCS)를 포함한다.
"히드록실 반응성 기"는 히드록실과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 히드록실 반응성 기는 예를 들어 알킬 또는 아릴 이소시아네이트 -NCO, 및 아릴 또는 알킬 활성화된 카르복실산 에스테르 -COOR를 포함한다.
"티올 반응성 기"는 티올과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 티올 반응성 기는 예를 들어 말레이미드 또는 알파-할로아미드(-NH-C0-CH2-Hal)를 포함한다.
"알데히도 또는 케토 반응성 기"는 (1급 또는 2급) 알데히드 또는 케톤과 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 알데히드 또는 케토 반응성 기는 예를 들어 아릴 또는 알킬 히드라진(-NHNH2), 아릴 또는 알킬 아실히드라진(-CO-NHNH2), 알킬 또는 아릴 히드록실아민(-ONH2)을 포함한다.
"카르복시 반응성 기"는 카르복실 기와 반응하는 활성화된 작용기이다. 전형적인 카르복시 반응성 기는 예를 들어 할로겐, 알킬- 또는 아릴술포네이트, 히드록실, 에폭시, 머캅토, 아미노, 이소시아나토 및 카르보디이미도 기를 포함한다.
리간드 반응성 기 및 리간드 상에 존재하는 반응성 기의 많은 쌍이 실행 가능함이 이해되고, 통상의 기술자는 어떤 리간드 반응성 기가 선택되는 리간드와 커플링하도록 선택되는지 알 것이다.
유리한 실시양태에서, L은 아민 반응성 기, 히드록실 반응성 기, 티올 반응성 기, 알데히도 또는 케토 반응성 기, 바람직하게는 아민 반응성 기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 활성화된 작용기이다. 특히 바람직한 기는 아릴 또는 알킬 활성화된 카르복실산 에스테르 -COOR, 예컨대 하기 화학식의 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.
Figure pct00004
또 다른 유리한 실시양태에서, L은 -COOH, -NH2 , -OH, -SH, -CH=CH- 및 -CH=CH-COOH로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성 작용기이다.
스페이서 기: 상기 나타낸 바와 같이, 3개의 스페이서 기는 입체 군집(steric crowding)이 최소화되고 3개의 작용기의 반응성이 손상되지 않도록 선택될 수 있다. 히드라존 기 및 리간드 반응성 기 L을 갖는 링커 S2 및/또는 S3의 변이는 결합 부위의 근접성을 스캔하고 관심 표적 수용체 단백질 자체 상에 또는 최종적으로는 심지어 이웃 분자에 위치할 수 있는 상이한 탄수화물 구조를 포획할 수 있게 할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 " 스페이서 "는 전형적으로 단일 결합 또는 직쇄 또는 분지쇄의 치환 또는 비치환된 C(1-24)알킬렌이고, 여기서 하나 이상의, 바람직하게는 비인접 -CH2- 기는 서로 독립적으로 하나 이상의 가교(bridging) 기 및/또는 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴에 의해 치환될 수 있고; 단, 0 및 N과 같은 헤테로 원자는 서로 직접 연결되지 않는다. 가교 기는 알킬렌 사슬 내의 -CH2- 기 또는 말단 -CH2- 기를 치환할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가교 기"는 -CH(OH)-, -O-, -CO-, -CH2(CO)-, -SO-, -CH2(SO)-, -SO2-, -CH2(SO2)-, -COO-, -OCO-, -S-CO-, -CO-S-, -SOO-, -OSO-, -SOS-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-, -NR1-CO-O-, -O-CO-NR1-, -NR1-CO-NR1-, -CH=CH-, -C≡C-, -CH=CH-COO-, -OCO-CH=CH-, -CH=N-, -C(CH3)=N-, -N=N-으로부터 선택되고, 여기서 R1은 수소 원자 또는 C(1-6)알킬, 또는 이들의 조합을 나타낸다. 바람직한 가교 기는 -CH(OH)-, -O-, -CO-, -CH2(CO)-, -COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-, -NR1-CO-O-, -O-CO-NR1-, -NR1-CO-NR1-, -CH=CH-, -CH=N-, -C(CH3)=N-을 포함하고, 여기서 R1은 H 또는 C(1-6)알킬, 또는 이들의 조합을 나타낸다. 보다 바람직한 가교 기는 -CH(OH)-, -0-, -C0-, -CH2(C0)-, -C00-, -0C0-, -0-C0-0-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-을 포함하고, 여기서 R1은 H 또는 C(1-6)알킬, 또는 이들의 조합을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 스페이서 기는 6 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌 기, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 기(선형 구조의 2 내지 24개의 에틸렌글리콜 단량체를 가짐), 다가알콜 기, 폴리아민 기(예를 들어, 스페르민, 스페르미딘 및 그의 중합체 유도체), 폴리에스테르 기(예를 들어 선형 구조의 3 내지 15개의 에틸 아크릴레이트 단량체를 갖는 폴리(에틸 아크릴레이트)), 폴리아미노산 기 또는 이들의 조합일 수 있다.
보다 바람직하게는, 스페이서 기는 1 내지 8개의 아미노산을 포함하는 폴리아미노산(즉, 하나의 아미노산 또는 디-, 트리-, 테트라-, 펜타-, 헥사-, 헵타- 또는 옥타펩티드) 또는 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 또는 헥사에틸렌글리콜인 폴리에틸렌글리콜 기, 또는 상기 폴리아미노산과 폴리에틸렌글리콜의 조합물일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 스페이서 기 S1, S2, S3은 서로 독립적으로 하기 화학식 (a) 및/또는 (b)의 하나 이상의 반복 단위, 또는 이들의 조합을 포함하는 직쇄를 나타낸다.
(a) -[Y1-(CH2)n]p-
(b) -[Y2-(CH2)m-Y3]q-
여기서,
Y1, Y2, Y3은 서로 독립적으로 -0-, -CO-, C00-, -0C0-, -O-C0-0-, -OCH2-, -CH2O-, NR1-, -NR1-C0-, -C0-NR1-이고, 여기서 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고, n, m, p 및 q는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
상기 기의 조합(표현 "그의 조합"으로 표시되는)은 (a) 및 (b)의 조합을 교번(alternating) 또는 블록 형태로 포함하고, 따라서 하기 화학식 중의 하나를 가질 수 있다:
-[Y1-(CH2)n]p-[Y2-(CH2)m-Y3]q-,
-[Y2-(CH2)m-Y3]q-[(CH2)-Y1]p-,
-[Y1-(CH2)n]p-[Y1-(CH2)m-Y2]q-[(CH2)n-Y1]P-
여기서, Y1, Y2, Y3은 서로 독립적으로 -O-, -CO-, COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-로부터 선택되는 기이고, 여기서 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬이고, n, m, p 및 q는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
따라서, 바람직한 반복 단위는 -CO-NR1-(CH2)n1-, -NR1-CO-(CH2)n2-, -(CH2)n3-CO-NR1-, -(CH2)n4-NR1-CO-, -CO-NR1-(CH2)n5-NR1-CO-, -NR1-CO-(CH2)n6-CO-NR1-, -COO-(CH2)m1-, -OCO-(CH2)m2-, -(CH2)m3-COO-, -(CH2)m4-OCO-, -COO-(CH2)m5-OCO-, -OCO-(CH2)m6-COO-, -O-(CH2)p1-, -(CH2)p2-O-를 포함하고 이로 제한되지 않고, 여기서, R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고, n1, n2, n3, n4, n5, n6, m1, m2, m3, m4, m5, m6, p1 및 p2는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
상기 기의 다른 조합은 또한 예를 들어 하기 화학식을 갖는, 다양한 반복 단위 (a)의 조합을 포함할 수 있다:
-[Y1-(CH2)n]p-[Y1'-(CH2)n']q'-[Y1"-(CH2)n"]q"-
여기서, Y1, Y1', Y1"는 서로 독립적으로 -O-, -CO-, COO-, -OCO-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-로부터 선택되는 기이고, 여기서 R1은 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고, n, n', n"는 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.
유리한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이고, 여기서
S1은 C(1-24) 알킬렌을 나타내고;
S2는 C(1-24) 알킬렌을 나타내고;
S3은 C(1-2) 알킬렌을 나타내고;
상기 알킬렌은 직쇄 또는 분지쇄이고, 상기 알킬렌은 치환 또는 비치환되고, 상기 알킬렌의 하나 이상의, 바람직하게는 비인접 -CH2- 기는 서로 독립적으로 하나 이상의 가교 기 Y 및/또는 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴에 의해 치환될 수 있고; 단, 0 및 N과 같은 헤테로 원자는 서로 직접 연결되지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이고, 여기서 Y는 기 -CH(OH)-, -O-, -CO-, -CH2(CO)-, -SO-, -CH2(SO)-, -SO2-, -CH2(SO2)-, -COO-, -OCO-, -S-CO-, -CO-S-, -SOO-, -OSO-, -SOS-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-, -NR1-CO-O-, -O-CO-NR1-, -NR1-CO-NR1-, -CH=CH-, -C≡C-, -CH=CH-COO-, -OCO-CH=CH-, -CH=N-, -C(CH3)=N-, -N=N-을 나타내고; R1은 서로 독립적으로 수소 또는 C(1-6)알킬을 나타낸다.
특히 유리한 실시양태에서, 본 발명은 Y가 -NH-C0-를 나타내는, 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 삼작용성 가교결합제의 제조에 사용하기 위해, 스페이서 기에는 바람직하게는 X 또는 작용기 A, L 및 방향족 히드라진 기 중 하나에 대한 부착을 위해 선택적으로 보호되거나 활성화될 수 있는 말단 작용기가 제공되는 것이 이해된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 스페이서 기는 가교 기를 통해, 바람직하게는 -COO-, -CO-NR1-, -0-, -NR1-, -NR1-COO- 및 -S-S- 연결로부터 선택된 기를 통해 X 및 각각의 작용기(A, L 또는 방향족 히드라진 기)에 커플링될 수 있다. 코어 구조, 스페이서 및 3개의 작용기 A, L 및 방향족 히드라진 기 중 하나의 조합시에 바람직한 순서는 없다는 것이 또한 이해된다. 통상의 기술자는 다양한 기의 특성에 따라 특정 조립 순서가 바람직할 수 있음을 알 것이다.
히드라존 기: 본 발명의 삼작용성 가교결합 시약의 추가의 작용기는 하기 화학식의 히드라존 기이다.
Figure pct00005
이 기는 세포 표면 상의 당단백질 또는 분비된 당단백질의 산화된 탄수화물 기과 공유 결합을 선택적으로 형성할 수 있다. 상기 산화된 당단백질은 세포 표면 또는 분비된 당단백질 그 자체에 위치할 수 있거나, 또는 표적 당단백질 수용체와 상호작용하는 공간적으로 근접한 분자 상에 위치할 수 있다. 스페이서 S2 및 S3의 길이는 리간드 결합 부위와 상기 산화된 당단백질 사이의 거리를 결정한다. 따라서, 스페이서 S2 및 S3의 길이를 변경하면, 리간드 결합 부위의 즉각적인 환경 또는 확장된 환경을 스캔하거나 프로빙할 수 있다. 용어 "히드라존 기"는 수소, 치환된 (C1-C6)알킬, 치환된 아릴 및 치환된 헤테로아릴로부터 선택된 치환기를 갖는 알데히드 또는 케톤 히드라존을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 치환기 R', R"의 선택은 가교결합 시약의 의도되는 용도에 의존할 수 있음이 이해된다.
유리한 실시양태에서, 본 발명은 R'가 C(1-6)-알킬을 나타내고, R"가 C(1-6)-알킬을 나타내는, 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.
유리한 실시양태에서, 본 발명은 R' 및 R"가 메틸을 나타내는, 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.
유리한 실시양태에서, 본 발명은 Z가 비치환 또는 치환된 페닐, 나프틸 및 안트라세닐로부터 선택된 아릴기를 나타내는, 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.
유리한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이고, 여기서 Z는 비치환 또는 치환된 피리딜, 푸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴 및 티아졸릴로부터 선택된 헤테로아릴 기를 나타내고, 특히 바람직하게는 Z는 피리딜이다.
친화성 기: 본원에서 사용되는 용어 "친화성 기"는 검출, 확인 및 정제를 위해 또 다른 조성물(고체 지지체, 예컨대 비드, 필터, 플레이트, 막, 크로마토그래피 수지 등에 선택적으로 부착되거나 연결된)에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 확인 가능한 태그, 기, 또는 모이어티를 의미한다. 많은 상이한 종류의 친화성 기가 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 대해 개별적으로 또는 하나 이상의 상이한 친화성 기의 조합으로 사용될 수 있음이 이해된다. 특히 적합한 친화성 기는 고체 지지체에 대한 공유 결합을 허용한다. 이러한 공유 결합은 용해물로부터 산화된 당단백질 수용체의 단리를 용이하게 한다.
특히 바람직한 친화성 기는 아지드(-N3), 및 예를 들어 하기 화학식 (Id)의 화합물이다.
Figure pct00006
(Id)
상기 친화성 기(즉, 아지드 기)는 화학식 (I)의 화합물의 간단한 합성 및 정제를 가능하게 하기 때문에 특히 유용하다.
추가의 특히 바람직한 친화성 기는 알킨 기 -CCH, 및 예를 들어 하기 화학식 (Ie)의 화합물이다.
Figure pct00007
(Ie)
상기 친화성 기(즉, 알킨 기)는 화학식 (I)의 화합물에서 매우 다양한 리간드 반응성 기 L로부터의 선택을 가능하게 하기 때문에 특히 유용하다.
상기 논의 내용에 비추어, 화학식 (I)의 특정 화합물은 리간드-표적 당단백질 상호작용의 특성화 및 분석에 사용될 때 특히 유용하다는 것이 밝혀졌다. 화합물은하기 화학식 (Ia), (Ib) 및 (Ic)에 의해 정의된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (Ia)의 화합물에 관한 것이다.
Figure pct00008
(Ia)
여기서,
L, S1, S2, S3, Z, R', R", s는 본원에서 정의된 바와 같고,
W1은 -NH-, -O-, -S-이고,
W2는 -COO-, -OOC-, -C0NH-, -NHCO, -NH-, -O-, 및 -S-로부터 선택되는 기이고,
W3은 -C00-, -00C-, -C0NH-, -NHCO, -NH-, -0-, -S-로부터 선택되는 기이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (Ib)의 화합물에 관한 것이다.
Figure pct00009
(Ib)
여기서, 치환기들은 제1항에서 정의된 바와 같다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (Ic)의 화합물에 관한 것이고, 이 화합물은 그의 별칭 "HATRIC"으로 알려져 있다.
Figure pct00010
(Ic)
추가의 유리한 실시양태에서, 가교결합 시약은 수용성 및/또는 생체적합성이다. "수용성"이라는 용어는 전형적으로 24℃에서 물질 및 물의 총 중량을 기준으로 1 중량%를 초과하는, 물 내에서의 물질의 용해도를 지칭한다. 수용해도는 본 발명의 가교결합제의 친수성 특성에 의해, 보다 구체적으로는 A, L, X, Z, S1, S2, S3 및 RN 중 하나 이상의 기의 친수성 특성에 의해 부여되는 것으로 이해된다. 통상의 기술자는 충분히 친수성인 가교결합제를 얻기 위해 어떤 화학 기를 선택해야 하는지 알 것이다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 스페이서 기 S1, S2, 및 S3은 생성되는 가교결합 시약의 친수성을 증가시키기 위해 보다 친수성이 큰 작용기를 포함할 수 있다. "생체적합성"이란 용어는 인간 세포, 조직 또는 체액에 대한 화학적 불활성 및 상기 생체에 대한 가교결합 시약의 최소의 독성 영향을 지칭한다.
제2 측면 에서, 본 발명은 리간드 (II)와 표적 당단백질 (III) 사이의 상호작용을 특성화하고 분석하기 위한, 본 발명의 삼작용성 가교결합 시약의 용도에 관한 것이다. 도 1 및 3을 참조한다.
간단히 설명하면, 위에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 가교결합제는 삼작용성 분자에서 2개의 상이한 화학 반응성 기 및 친화성 기를 조합한다. 제1 화학 반응성 기는 (세포 표면 또는 분비된) 관심 표적 당단백질 수용체 (III)에 후에 결합하는 관심 리간드 (II)에 가교결합제를 커플링시키기 위해 사용되는 리간드 반응성 기, 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드이다. 제2 화학 반응성 기는 산화된 표적 당단백질을 포획하기 위한 방향족 히드라존, 바람직하게는 아세톤 보호된 히드라지노니코티네이트 기이다. 관심 리간드에 접합된, 본 발명의 친화성 태그 부착된 가교결합제는 산화된 살아있는 세포 상의 또는 용액 내의 상호작용하는 표적 당단백질 수용체의 탄수화물 유도 포획, 및 후속 질량 분광 분석을 위한 친화성 기, 바람직하게는 아지드를 통한 포획된 당단백질의 전체 서열의 후속 친화성 농후화를 허용한다. 유도되지 않은 대조군 샘플과의 정량적 비교를 통해, 리간드와 그의 상응하는 표적 당단백질 수용체의 상호작용으로부터 유래한 친화성 태그 부착 사건(예를 들어, 아지딜화)은 무작위의 (세포 표면 또는 분비된) 단백질의 비특이적인 확률적(stochastic) 친화성 태그 부착 사건(예를 들어, 아지딜화)과 분명하게 구분될 수 있다. 이에 의해, 심지어 저 친화성 및 일시적인 리간드-표적 당단백질 수용체 상호작용뿐만 아니라, 그의 원래의 세포 환경에서 막 결합된 형태로 또는 생물학적 유체 내에 분비된 형태로 존재하는 농후화가 낮은 당단백질에 대한 리간드의 표적을 벗어난 효과를 검출할 수 있다.
이것은 세포 표면 표적 당단백질 수용체의 경우 도 1에 개략적으로 제시되어있다: 관심 리간드 (II)는 리간드 상용성 버퍼 용액 내에서 삼작용성 가교결합제와 커플링된다. 별개의 대조군 반응에서, 등몰량의 가교결합제는 대조군 단백질에 커플링되거나 또는 순수한 버퍼 용액에서 켄칭된다(도 1(iii)). 세포 표면 탄수화물 상에 알데히드 기를 생성하기 위해, 살아있는 세포가 산화된다(도 1(ii)). 이어서, 산화된 세포 표면의 탄수화물 구조를 포획할 수 있도록 이전에 커플링된 리간드가 산화된 세포에 첨가된다(도 1(iv a)). 이에 의해, 무작위의 세포 표면 당단백질은 확률적 사건을 통해 표지되고, 관심 리간드에 대한 표적 세포 표면 당단백질 수용체는 직접적인 리간드-수용체 상호작용을 통해 보다 효율적으로 포획된다. 이와 병행하여, 대조군 프로브를 동등한 수의 산화된 세포에 첨가하여, 확률적 표지 사건만을 일으킨다. 다음 단계 모두에 대해, 두 프로브는 병렬로 처리된다. 표지 반응 후에, 세포는 용해된다(v). 남은 분획은 씻어내고, 아지드 태그 부착된 세포 표면 당단백질은 구리 촉매화된 아지드-알킨 고리 첨가 반응(cycloaddition)에 의해 알킨-매트릭스로 포획된다(도 1(vi)). 전체 서열 당단백질의 공유 포획시, 이들은 환원되고 알킬화된다. 매트릭스와 당단백질 사이의 공유 결합은 비공유 결합된 화합물을 제거하기 위한 거친 세척을 허용한다. 세척 후, 포획된 전체 서열 당단백질은 프로테아제, 전형적으로는 아르기닌 또는 라이신의 C 말단을 절단하지만 프롤린 앞에서는 전혀 절단하지 않거나 낮은 빈도로 절단하는 세린 프로테아제 트립신에 의해 분해된다(도 1(vii a)). 생성된 트립신 분해 펩티드는 HATRIC을 통해 매트릭스(X)에 여전히 공유 결합된 글리코실화된 펩티드와 글리코실화되지 않은 펩티드 또는 매트릭스(IX)로부터 유리된 HATRIC과 상호작용하지 않은 펩티드 사이에서 상이하다. 유리된 펩티드(IX)는 탈염되고, 세포 표면 당단백질의 확인을 위해 고 질량 정확도 질량 분광 분석을 거치게 된다(도 1(viii)). 세포 표면 당단백질의 트립신 분해 당펩티드는 매트릭스에 공유 결합 연결된 상태로 유지된다(도 1(vii b)). 프로테아제를 세척한 후, N-당펩티드(XI)는 PNGase F를 사용한 효소 처리 단계를 통해 비드로부터 특이적으로 유리되며, 상기 효소는 펩티드의 N-X-S/T 글리코실화 모티프(여기서, N은 아스파라긴을 의미하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 의미하고, S/T는 세린 또는 트레오닌을 각각 의미한다)에서 당펩티드의 아스파라긴과 올리고당 구조의 가장 안쪽 성분 사이를 절단한다. 이렇게 함으로써, PNGaseF는 아스파라긴을 탈아미드화하고, 이전에 글리코실화된 펩티드에 특이적 N115-X-S/T 시그니처를 도입한다(도 1(ix)). 유리된 펩티드를 탈염하고, 고 질량 정확도 질량 분광 분석기로 분석하기 위해 적합한 버퍼 용액에 재현탁한다. 2개의 상이한 펩티드 분획(IX 및 XI)의 분석을 위해, 질량 분광 분석기는 데이터 의존 모드에서 작동하고, 여기서 미리 결정된 임계값 초과의 이온 신호는 펩티드의 충돌 유도 해리(CID: collision-induced dissociation) 또는 고 에너지 충돌 해리(HCD: higher energy collisional dissociation) 스펙트럼을 생성하기 위해 기기가 MS로부터 MS/MS 모드로 전환되도록 자동으로 촉발한다. 모든 MS/MS 스펙트럼은 표준 단백질 데이터베이스에 대해 검색된다. N-당펩티드 분획으로부터의 MS/MS 스펙트럼을 N115-X-S/T 모티프의 존재에 대해 추가로 필터링한다. 상이한 두 펩티드 분획물(IX 및 XI)에 기초하여, 리간드 샘플 내의 세포 표면 펩티드의 농도를, 세포 표면 수용체의 특이적 농도를 검출하기 위해 대조군 샘플과 정량적으로 비교한다. 세포 표면 단백질로부터의 확률적으로 태그 부착된 펩티드의 경우, 비율은 약 1이어야 하고, 리간드 기반 방식으로 특이적으로 포획된 당단백질 수용체 펩티드는 대조군 샘플보다 리간드 샘플에서 더 높은 값을 갖는다. 단백질이 둘 이상의 펩티드로 확인되면, 존재비 정보는 2개의 상이한 펩티드 분획으로부터 조합될 수 있다.
MS 분석은 다른 분석 방법으로 대체될 수 있음이 고려된다. 이러한 다른 방법은 본 방법의 일부로서 포함된다.
따라서, 제3 측면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물의 사용에 의해 샘플에서 리간드 (II)와 표적 당단백질 수용체 (III) 사이의 특이적인 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 표적 (III)이 당단백질 수용체이고; 리간드 (II)가 표적 (III) 상의 리간드 특이적 도메인을 인식하고; 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 화합물, 리간드 (II) 및 표적 (III)을 포함하는 표적-리간드-시약-복합체 (VI)가 형성되고, 여기서 리간드 (II)는 화학식 (I)의 기 L에 공유 결합되고 표적 (III)은 화학식 (I)에 존재하는 히드라존 기에 공유 결합되는 것인 상기 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 측면은 아래에서 보다 상세히 설명될 것이다.
상기 나타낸 바와 같이, 표적 당단백질 수용체 (III)는 용액 내에 또는 세포의 표면 상에 존재할 수 있음(도 1에 도시된 바와 같이)이 이해된다.
상기 나타낸 바와 같이, 화합물 (I)은 본 발명의 제1 측면에서 개관된 바와 같이 많은 유도체를 포함하는 것이 이해된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 상기 방법은 화학식 (Ia), (Ib) 또는 (Ic)에 따른 화합물을 사용하여 수행된다.
이 측면에 따르면, 본 발명은 세포 집단을 포함하는 샘플에서 적어도 하나의 알데히드 작용기 (III)를 갖는 세포 표면 수용체와 리간드 (II) 사이의 특이적인 상호작용을 확인하는 방법에 관한 것으로, 여기서 리간드 (II)는 표적 당단백질 수용체 (III) 상의 리간드 특이적 펩티드 도메인을 인식한다. 이러한 알데히드 작용기는 본원에서 설명되는 바와 같이 화학적으로 유도되거나, 대사적으로 조작되거나, 효소 적으로 생산될 수 있다.
유리한 실시양태에서, 본 발명의 방법은
(i) 상기 표적 (III)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 표적 (III)에 산화 처리를 실시하여 적어도 하나의 탄수화물 잔기에 알데히드 작용기를 생성함으로써 산화 표적 (IV)를 얻는 단계;
(iii) 본원에서 설명되는 화학식 (I)의 삼작용성 가교결합 시약을 제공하고, 그의 리간드 반응성 기 L를 상기 리간드 (II)에 접합시켜 리간드-시약-복합체 (V)를 얻는 단계;
(iv) 단계 (ii)의 샘플을 단계 (iii)의 복합체 (V)와, (a) 복합체 (V)가 산화 표적 (Ⅳ) 상의 리간드 특이적 도메인에 결합할 수 있고 (b) 상기 복합체 (V)의 히드라존 기(R'R"C=N-NH-)가 그의 유리 형태로 전환되고 산화 탄수화물 표적 (Ⅳ)에 공유 결합하도록 허용되는 조건 하에, 접촉시켜 공유 결합된 리간드 및 공유 결합된 표적을 포함하는 표적-리간드-시약 복합체 (VI)를 얻는 단계;
(v) 단계 (iv)의 샘플을 용해시켜 막 임베딩된(membrane-embedded) 세포 표면 단백질 및 상기 복합체 (Ⅵ)를 이용 가능하게 만들고 매트릭스 (VII)와 반응시켜 매트릭스 결합된 복합체 (VIII)를 얻는 단계;
(vi) 친화성 매트릭스 (VII)를 사용하여 샘플로부터 상기 복합체 (VI)를 농후화하여 매트릭스 결합된 복합체 (VIII)를 단계;
(vii) 상기 매트릭스 결합된 복합체 (VIII)를 분해하여 (a) 유리된 펩티드 (IX) 및 (b) 매트릭스 (X) 상에 결합된 당펩티드를 얻는 단계,
(viii) 임의로, 상기 매트릭스 (VIII)로부터 결합된 당펩티드 (X)를 유리시켜 유리된 당펩티드 (XI)을 얻는 단계,
(ix) 유리된 펩티드 (IX), (XI)을, 바람직하게는 고 질량 정확도 질량 분광 분석에 의해 분석 및 정량하는 단계, 및
(x) 리간드와 표적 당단백질 수용체 사이의 상호작용을, 바람직하게는 대조군 반응과의 정량적 비교를 통해, 확인하는 단계
를 포함한다.
따라서, 본 발명의 전형적인 방법에서, 단계 (i) 내지 (x)가 수행된다. 이러한 방법 단계는 "HATRIC 기반 LRC에 대한 작업 흐름"으로도 언급되고, 아래에서 보다 상세하게 설명된다:
단계 (i): 상기 본원에서 정의된 바와 같은 세포 표면 당단백질 수용체의 경우, 샘플은 그의 적어도 하나가 상기 세포 표면 당단백질 수용체를 발현하는 세포 또는 조직의 집단을 포함한다. 상기 정의된 바와 같은 분비된 당단백질의 경우, 샘플은 적어도 하나의 분비된 당단백질을 포함하는 생물학적 유체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 조직 배양물, 생물 반응기, 인간 또는 동물 조직, 식물, 과일, 채소, 단세포 미생물(예컨대, 박테리아 및 효모) 및 다세포 유기체를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 살아있는 세포 또는 유기체로부터 얻거나, 이에 의해 배설되거나, 이에 의해 분비되는 임의의 고체 또는 유체 샘플을 의미한다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 담즙, 정액, 뇌척수액, 수성 또는 유리체액으로부터 얻은 생물학적 유체, 또는 임의의 신체 분비물, 누출액, 삼출액(예를 들어, 농양 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 얻은 유체), 또는 관절(예를 들어, 정상 관절 또는 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 패혈성 관절염에 걸린 관절)로부터 얻은 유체일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 예를 들어 임의의 장기 또는 조직(생검 또는 부검 표본 포함)으로부터 얻은 샘플일 수 있고, 세포(1차 세포 또는 배양된 세포), 임의의 세포, 조직 또는 장기에 의해 조건화된 배지, 조직 배양물을 포함할 수 있다.
용어 "표적"은 당단백질 수용체 (III)를 지칭하고, 상기 정의된 바와 같다.
단계 (ii): 이 단계에서, 샘플은 산화 처리에 적용되어 표적 당단백질 수용체 상에 존재하는 탄수화물 상에 알데히드 기를 생성한다. 이것은 예를 들어 과요오드산염(예를 들어, 1-2 mM NaIO4)을 사용하여 수행할 수 있다.
도 1은 빈 다이아몬드 구조를 표시함으로써 이 단계의 개요를 보여준다.
단계 (iii): 이 단계에서, 가교결합제 (I)의 리간드 반응성 기 L, 바람직하게는 활성화된 작용기, 보다 바람직하게는 N-히드록시숙신이미드 기는 리간드에 적합한 조건 하에서 1급 아민을 통해 리간드에 효율적으로 커플링할 수 있게 하고, 히드라존 기능을 잃지 않으면서 리간드-가교결합제 복합체 (V)를 수득할 수 있게 한다.
도 1은 공유 결합된 리간드(회색 원)를 포함하는 화합물 (VI)에 의해 이 단계의 개략적으로 설명한다.
별개의 대조군 반응에서, 등몰량의 가교결합제 (I)을 대조군 단백질에 커플링시키거나 또는 활성화된 작용기, 예를 들어 NHS 에스테르 또는 리간드 반응성 기, 즉 아민 반응성 기의 가수분해를 위한 순수한 버퍼 용액에서 인큐베이팅되고, 또 다른 규정된 화합물로 켄칭된다.
도 1은 좌측 컬럼에서 공유 결합된 리간드(회색 원) 또는 우측 컬럼에서 켄칭된 잔류물(흑색 사선)을 포함하는 화합물 (VI)에 의해 상기 단계를 개략적으로 설명한다.
단계 (iv)(a): 이 단계에서, 리간드-가교결합제 복합체 (V)는 산화된 표적 당단백질 수용체 (IV)를 포함하는 세포(들), 조직(들) 또는 용액(들)을 포함하는 샘플과 조합되어, 리간드-가교결합제 복합체의 히드라존 기가 (IV)의 산화된 탄수화물 기와 반응할 수 있게 한다.
리간드-가교결합제 복합체가 산화된 표적 당단백질 수용체와 상호작용할 때, 가교결합제 (I)의 히드라존 기는 이들 산화된 부위와 반응하여 공유 결합을 형성할 것이다(도 1, 2: 채워진 다이아몬드 참조). 당단백질 상의 탄수화물 구조의 산화는 대체로 몇 개의 잠재적인 산화된 부착 부위를 생성하지만(도 1에서 볼 수 있듯이), 리간드-가교결합 시약-복합체의 히드라존 기에 의해 포획된 당단백질은 동일하게 유지된다.
무작위의 당단백질은 확률적 사건을 통해 포획된다. 이론에 구애됨이 없이, 수용체 상의 리간드 결합 부위에 근접한 알데히드 기는 직접적인 리간드-표적 당단백질 수용체 상호작용에 의해 야기되는 국소 농축으로 인해 보다 효율적으로 포획된다고 생각된다. 삼작용성 가교결합 시약당 상기 이중 표지 사건은 이중 결합된 표적-리간드-시약 복합체 (VI)를 생성한다. 이 복합체의 형성은 본원에서 설명되는 전체 방법의 핵심 사항이다.
유사하게, 대조군 프로브(예컨대, 켄칭된 가교결합제 또는 비특이적 분자와 접합된 가교결합제 또는 별개의 수용체 특이성을 갖는 리간드 분자와 접합된 가교결합제)를 동일한 수의 세포에 첨가하여 확률적 표지 사건만을 유도한다. 유리하게는, 모든 후속 단계에 대해, 대조군 프로브는 병렬로 처리될 수 있다.
전형적인 반응 조건은 pH 6.5-7.4, 예컨대 6.5; 온도 0-10℃, 예컨대 4℃, 10-240분, 예컨대 90분을 포함한다. 이러한 조건 하에서, 보호된 히드라존 기(R'R"C=N-NH-)는 그의 유리 형태로 전환되고, 당단백질 표적 수용체(및 다른 당단백질 수용체)의 산화된 탄수화물에 공유 결합할 수 있게 된다.
단계 (iv)(b): 선택적인 단계인 이 단계에서, 리간드-가교결합제 복합체 (V)와, 산화된 표적 당단백질 수용체 (IV)를 포함하는 세포(들), 조직(들) 또는 용액(들)을 포함하는 샘플의 조합물에 촉매 (XX)가 첨가된다. 이것은 리간드-가교결합제 복합체의 히드라존 기가 생리학적 pH에서 (Ⅳ)의 산화된 탄수화물 기와 반응할 수 있도록 한다.
적합한 촉매 (XX)는 아래에서 확인된다.
유리하게는, 리간드와 당단백질 표적 수용체 사이의 생리학적 반응을 허용하는 버퍼의 군으로부터의 적절한 버퍼, 즉 포스페이트 완충 염수가 제공된다. 유리하게는, 촉매의 양은 5 mM의 범위 내이다. 유리하게는, pH는 6.5 내지 7.4이며, 이는 생리학적 조건과 유사하다.
생리학적 pH 하에서 본 발명의 방법을 수행하는 것이 주요 이점으로 고려된다. 촉매 (XX)에 대한 세부 사항은 하기 제4 측면에서 제공된다.
단계 (v): 이 단계에서, 이중 결합 표적-리간드-시약 복합체 (VI) 및 무작위의 당단백질-시약 복합체 (VIR)가 세포 및 막의 용해에 의해 샘플로부터 유리된다. 단계 (iv)의 샘플의 용해는 매트릭스 결합된 복합체 (VIII)을 얻기 위해 막 임베딩된 세포 표면 단백질 및 상기 복합체 (Ⅵ)을 이용 가능하게 하고 매트릭스 (VII)과 반응하도록 만든다.
표적 당단백질 수용체가 세포 표면 당단백질, 예컨대 세포 표면 수용체인, 리간드와 표적 당단백질 수용체 사이의 특이적 상호작용을 확인하는 방법의 경우, 세포를 포함하는 샘플을 먼저 용해 단계에 적용하여 이중 단백질 결합된 복합체를 포함하는 처리된 세포 샘플을 얻는다.
이중 결합된 표적-리간드-시약 복합체는 친화성 기인 그의 제3 작용기를 사용하여 친화성 정제된다. 예를 들어, 아지드가 친화성 기로 사용되면, 이중 결합 표적-리간드-시약 복합체는 알킨 함유 매트릭스, 즉 알킨 아가로스 또는 알킨 자기 비드와의 구리 촉매 고리 첨가 반응에서 알킨 비드를 사용하여 친화성 정제된다. 이것은 매트릭스에 공유 결합된 삼중 결합된 표적-리간드-시약 복합체를 생성한다. 예를 들어, 구리 촉매 고리 첨가 반응에서 알킨 아가로스 비드가 적합하다. 일반적인 반응 조건은 알려져 있고, 10-30℃, 예를 들어 실온에서 6 - 24시간, 예를 들어 18시간 동안 1 mM CuSO4, 6.25 mM THPTA 및 2 mM 아스코르브산나트륨을 포함한다.
단계 (vi): 이 단계에서, 표적-리간드-시약 복합체 (VI)는 친화성 매트릭스에 공유 결합되고, 샘플로부터 정제된다.
용해된 샘플로부터, 주로 세포 내 공간으로부터의 다른 단백질은 단백질에 적합한 버퍼를 사용하여 씻어낸다. 적합한 버퍼는 당단백질의 일차 아미노산 서열을 변경하지 않는다. 이러한 버퍼는 공지되어 있고, 1% 나트륨 도데실 술페이트, 8M 우레아, 20% 아세토니트릴, 5M 염화나트륨, 80% 이소프로판올, 100 mM 중탄산나트륨, pH 11의 조합을 포함한다.
단계 (vii)a: 이 단계에서, 샘플을 처리하고, 태그 부착된 당단백질에 의해 매트릭스에 공유 결합되지 않은 글리코실화된 단백질의 펩티드를 유리시키는 효소적 또는 화학적 분해에 적용한다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 프로테아제는 예를 들어 트립신, 키모트립신, 엔도프로테이나제 AspN, 엔도프로테이나제 Lys C 등과 같은 효소, 또는 이들의 조합물에 대한 노출에 의해, 바람직하게는 트립신을 사용하여 사용된다. 트립신은 단백질을 아르기닌 또는 라이신의 C 말단에서 절단하지만, 프롤린 앞에서는 전혀 절단하지 않거나 낮은 빈도로 절단한다.
단계 (vii)b: 이 단계에서, 단계 (vi)a에서 매트릭스에 공유 결합된 상태로 유지되는 N-당펩티드를 세척하여 단계 (vii)a로부터 잔류하는 프로테아제를 제거한다.
단계 (vii)a의 프로테아제가 제거되지 않는다면, 엔도- 및 엑소글루코시다제를 사용한 후속 분해 단계가 후자의 단백질 분해에 의해 방해될 수 있다.
단계 (viii): 이 단계에서는, 이와 같이 수득되는 유리된 펩티드 (IX)를 분석한다. 현장에서 이용 가능한 상기 화합물을 분석하는 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 바람직한 방법은 질량 분광 분석이다. 질량 분광 분석 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Yates, J. Mass Spect. 33:1-19 (1998)]; [Kinter and Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, John Wiley and Sons, New York (2000)]; [Aebersold and Goodlett, Chem. Rev. 101:269-295 (2001)] 참조). 고분해능 폴리펩티드 단편 분리를 위해, 분리 방법으로서 모세관 역상 크로마토그래피를 이용하는 액체 크로마토그래피 ESI-MS/MS 또는 자동화된 LC-MS/MS를 사용할 수 있다(Yates et al., Methods Mol. Biol. 112:553-569 (1999)). 바람직하게는, 동적 배제(dynamic exclusion)와 함께 데이터 의존성 충돌 유도 해리(CID) 또는 고 에너지 충돌 해리(HCD)가 질량 분광 분석 방법으로 선택되어 사용될 것이다(Goodlett et al., Anal. Chem. 72:1112-1118 (2000)). 이러한 분석을 위해 질량 분광 분석기는 일반적으로 미리 결정된 임계값 초과의 이온 신호가 펩티드의 충돌 유도 해리(CID) 또는 고 에너지 충돌 해리(HCD) 스펙트럼을 생성하기 위해 기기가 MS로부터 MS/MS 모드로 전환되도록 자동으로 촉발하는 데이터 의존 모드에서 작동한다.
유리하게는, 모든 MS/MS 스펙트럼은 표준 알고리즘(예를 들어, SEQUEST, Mascot, X!tandem, OMSSA)을 사용하여 표준 단백질 데이터베이스에 대해 검색되며, 위양성 단백질 확인 비율을 1% 미만으로 제한하기 위해 일반적으로 필터링된다.
추가로, 유추된 모든 당단백질은 세포 표면 주석(annotation)을 위해 필터링된다.
유리하게는, 단계 (viii)은 단계 (vii)(a)에서 수득되는 유리된 펩티드를 정량적 질량 분광 분석에 의해 분석하여 리간드 (II)와 표적 (III) 사이의 상호작용을 확인하는 단계를 포함한다.
유리하게는, 리간드 샘플 내의 당단백질의 농도를 대조군 샘플과 정량적으로 비교할 수 있다.
이것은 표적 당단백질 수용체의 특정 농축물을 검출할 수 있게 한다. 이 무표지(label-free) 질량 분광 분석 정량을 위해, 질량 분광 분석 직전의 역상 크로마토그래피는 특징부(feature)의 체류 시간이 그의 질량/전하 비율에 대해 플로팅된 MS 특징부 지도로서 제시될 수 있다. 질량 분광 분석기에 의해 검출된 바와 같이, 상기 지도에서의 펩티드는 규정된 시간에 걸쳐 샘플 내의 그의 존재비에 따라 규정된 이온 전류 강도를 사용하여 별개의 동위원소 패턴으로 나타난다. 일단 펩티드가 단편화 및 MS/MS 분석을 통해 확인되면, 이 정보는 MS 지도의 특정 펩티드 특징부에 할당될 수 있으며, 오픈 소스 또는 Superhirn(Mueller et al. Proteomics (2007) vol. 7 (19) pp. 3470-3480), 또는 Progenesis LC-MS(비선형 동역학(Nonlinear Dynamics))과 같은 상업적 알고리즘을 사용하여 반정량적 데이터와 조합될 수 있다. 이어서, 펩티드 존재비에 대한 비율을 얻기 위해 상이한 샘플(예를 들어, 샘플 대 대조군)의 MS 특징부 지도를 중첩하여 비교할 수 있다. 당단백질로부터 확률적으로 태그 부착된 펩티드에 대해, 상기 비율은 약 1이어야 하고, 리간드 기반 방식으로 특이적으로 포획된 당단백질 수용체 펩티드는 대조군에 비해 리간드 샘플에서 더 높은 값을 갖는다. 단백질이 하나 초과의 펩티드로 확인되면, 존재비 정보는 조합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 예컨대 다음과 같은 대안적인 질량 분광 분석 기반 정량 방법이 사용될 수 있다:
· 단일 반응 모니터링(SRM: single reaction monitoring);
· 세포 배양에서 아미노산을 사용한 안정한 동위원소 표지(SILAC; 예를 들어, 문헌 [Nilsson et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nat Methods (2010) vol. 7 (9) pp. 681-5] 참조);
· 데이터 독립적인 질량 스펙트럼 획득(SWATH MS; 예를 들어, 문헌 [Gillet et al. Targeted Data Extraction of the MS/MS Spectra Generated by Data-independent Acquisition: A New Concept for Consistent and Accurate Proteome Analysis] 참조);
· 탠덤 질량 태그(TMT: Tandem Mass Tag; 예를 들어, 문헌 [Dayon et al. Relative Quantification of Proteins in Human Cerebrospinal Fluids by MS/MS using 6-Plex Isobaric Tags] 참조)
단계 (ix): 이 단계에서, 단계 (vi) b에서 매트릭스에 결합된 상태로 유지되는 N-당펩티드는 탄수화물 구조를 절단함으로써 비드로부터 특이적으로 유리된다.
본 방법의 한 실시양태에서, 글리카나제는 바람직하게는 PNGaseF, PNGaseA 등과 같은 효소에 대한 노출에 의해, 바람직하게는 PNGaseF를 사용하여 사용된다. PNGaseF 처리는 펩티드의 N-X-S/T 글리코실화 모티프(여기서, N은 아스파라긴을 의미하고, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 의미하고, S/T는 세린 또는 트레오닌을 각각 의미한다)에서 당펩티드의 아스파라긴과 올리고당 구조의 가장 안쪽 성분 사이를 절단하여, 펩티드 유리(및 동시에 아스파라긴의 탈아미드화)를 유발한다.
본원에서 N 연결된 글리코실화 부위로 예시되었지만, 본 발명의 방법은 다른 유형의 인증된 글리코실화 부위, 예컨대 O 연결된 글리코실화 부위 또는 가능하게는 다른 유형의 번역 후 변형(예를 들어, 글리코실포스파티딜이노시톨의 펩티드의 C 말단에 대한 부착) 또는 단백질 이외의 다른 글리코실화된 유기 화합물, 예컨대 당지질 등을 사용하여 이용될 수 있음이 이해된다.
따라서, 상기 방법의 단계 (ⅴ)는 바람직하게는 유리된 펩티드를 수득하기 위해 단계 (iv)에서 수득된 정제된 이중 펩티드 결합 복합체를 글리코시다제 처리, 바람직하게는 상이한 엔도- 및 엑소글루코시다제 처리에 적용함으로써 상기 복합체로부터 포획된 펩티드를 분리하는 단계를 포함한다. 별법으로, 절단 가능 링커, 예를 들어 환원제 또는 과요오드산염으로 각각 절단될 수 있는 디술피드 결합 또는 시스-디올 함유 링커가 사용될 수 있다.
단계 (x): 이 단계에서, 이와 같이 수득되는 유리된 펩티드 (XI)을 분석한다. 현장에서 이용 가능한 상기 화합물을 분석하는 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 바람직한 방법은 질량 분광 분석이다. 질량 분광 분석 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌 [Yates, J. Mass Spect. 33:1-19 (1998)]; [Kinter and Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, John Wiley and Sons, New York (2000)]; [Aebersold and Goodlett, Chem. Rev. 101:269-295 (2001)] 참조). 고분해능 폴리펩티드 단편 분리를 위해, 분리 방법으로서 모세관 역상 크로마토그래피를 이용하는 액체 크로마토그래피 ESI-MS/MS 또는 자동화된 LC-MS/MS를 사용할 수 있다(Yates et al., Methods Mol. Biol. 112:553-569 (1999)). 바람직하게는, 동적 배제와 함께 데이터 의존성 충돌 유도 해리(CID) 또는 고 에너지 충돌 해리(HCD)가 질량 분광 분석 방법으로 선택되어 사용될 것이다(Goodlett et al., Anal. Chem. 72:1112-1118 (2000)). 이러한 분석을 위해 질량 분광 분석기는 일반적으로 미리 결정된 임계값 초과의 이온 신호가 펩티드의 충돌 유도 해리(CID) 또는 고 에너지 충돌 해리(HCD) 스펙트럼을 생성하기 위해 기기가 MS로부터 MS/MS 모드로 전환되도록 자동으로 촉발하는 데이터 의존 모드에서 작동한다.
유리하게는, 모든 MS/MS 스펙트럼은 표준 알고리즘(예를 들어, SEQUEST, Mascot, X!tandem, OMSSA)을 사용하여 표준 단백질 데이터베이스에 대해 검색되고, 위양성 단백질 확인 비율을 1% 미만으로 제한하기 위해 일반적으로 필터링된다. 추가로, 모든 펩티드는 이전에 글리코실화된 펩티드의 N115-X-S/T 모티프에 대해 추가로 필터링된다.
유리하게는, 단계 (x)는 단계 (ix)(a)에서 수득되는 유리된 펩티드를 정량적 질량 분광 분석 방법(이 방법은 단계 (viii)에 대해 상기 논의됨)에 의해 분석하여, 리간드 (II)와 표적 (III) 사이의 상호작용을 확인하는 단계를 포함한다.
유리하게는, 리간드 샘플 내의 당단백질의 농도는 대조군 샘플과 정량적으로 비교될 수 있고, 그 상세한 내용은 상기 단계 (viii)에 제시된 바 있다.
다른 실시양태에서, 대안적인 질량 분광 분석 기반 정량 방법이 상기 단계 (viii)에서 논의된 바와 같이 사용될 수 있다.
대조군 반응: 대조군 반응을 수행하는 것은 통상의 기술자의 지식 내에 있다. 이러한 대조군 반응은 가수분해 반응(리간드가 첨가되지 않은 경우) 또는 켄칭 반응(공지된 수용체 선호도를 갖는 리간드가 첨가된 경우)일 수 있다. 원칙적으로, 이러한 반응은 본원에서 논의된 작업 흐름(단계 (ⅰ) 내지 (ⅹ))과 유사하게 수행하되, 도 1 및 3의 우측에 또한 개략적으로 도시된 바와 같이 다음과 같이 변형하였다(켄칭된 잔기는 흑색 사선으로 표시됨):
LRC 실험에서, 대조군 샘플은 일반적으로 샘플 내의 당단백질 존재비를 대조군과 비교할 수 있도록 병렬로 생성된다. 이 샘플을 사용하여, 주어진 세포주, 조직 또는 생물학적 유체 상의 무작위의 세포 표면 당단백질에 대한 가교결합제 (I)의 확률적 결합을 추정할 수 있다. 이를 위해, 가교결합제 (I)는
· 활성화된 작용기 L의 가수분해(예를 들어, NHS 에스테르가 가수분해됨)를 위해 순수한 버퍼 용액에서 인큐베이팅되거나, 또는
· 리간드 반응성 기 L(예를 들어, NHS 에스테르가 안정한 아미드 결합을 생성하기 위해 리간드의 1급 아민과 반응함)은 알려진 결합 선호도를 갖는 리간드로 켄칭된다.
가교결합제 (I)의 리간드 반응성 기가 가수분해되거나 1급 아민을 함유하는 화합물, 예를 들어 글리신으로 켄칭되는 경우, 주어진 세포주, 조직 상의 또는 생물학적 유체 내의 무작위 세포 표면 당단백질의 상대 존재비에 의해 가교결합제 (I)의 배경 결합을 추정할 수 있다. 가교결합제 (I)의 리간드 반응성 기가 공지된 당단백질 표적 수용체를 갖는 리간드에 커플링되는 경우, 당단백질 표적 수용체의 확인은 실험의 품질 대조군으로서의 역할을 할 수 있다. 켄칭은 화합물 (II)가 존재하지 않는 도 1 및 3의 우측에 제시되어 있고; 화합물 (I)에 부착된 켄칭 분자는 흑색 사선으로 표시된다.
리간드 대 대조군 샘플 내의 주어진 당단백질의 양의 비를 비교하면, 확률적으로 태그 부착된 당단백질은 약 1의 비율을 갖는다. 1보다 더 높은 비율을 갖는 당단백질 표적 수용체 펩티드는 리간드 의존적 방식으로 특이적으로 포획된다.
반응과 대조군 반응을 비교하면, 도 1 및 3에서 가시화된 바와 같이, 신호 Δ를 확인할 수 있다.
제4 측면 에서, 본 발명은 생화학적 반응, 특히 본원에서 설명되는 방법(제3 측면)에서 촉매로서 특정 유기 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 상기 측면은 아래에서 보다 상세하게 설명될 것이다:
본 발명의 상기 측면에서 유기 화합물은 하기 화학식 (XX)으로 표시된다.
Figure pct00011
(XX)
여기서, n은 1 또는 2를 나타내고; m은 0, 1 또는 2를 나타내고; R4는 NH2를 나타내고; R5는 C(1-6)알킬 또는 C(1-6)알콕시를 나타낸다.
유리하게는, R4는 오르토 위치에 존재하고, n은 1이다.
유리하게는, R5는 메톡시를 나타내고, m은 1이다.
생화학적 반응이라는 용어는 공지되어 있고, 특히 세포 표면 단백질 상의 탄수화물 구조와 같은 생체 분자가 화학적으로 전환되고, 특히 산화되는 반응에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 생화학적 반응이라는 용어는 살아있는 세포 상의 생화학적 반응을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 생화학적 반응이란 용어는 본 발명의 제3 측면에서 설명된 바와 같은 단계 (iv)를 의미한다. 놀랍게도, 화학식 (XX)의 수용성 유기 화합물을 단계 (iv) b에 포함시킴으로써, 삼작용성 가교결합 시약의 히드라존 기와, 세포 표면 상의 탄수화물 구조의 산화를 통해 생성된 알데히드 사이의 히드라존 형성이 포화될 때까지 pH 7.4에서 나타나는 것으로 밝혀졌다.
제5 측면 에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 삼작용성 가교결합 시약(제1 측면) 및 선택적으로 본원에서 설명되는 유기 화합물(제4 측면)을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예 에 의해 추가로 설명된다:
일반적인 사항
달리 명시하지 않는 한, 모든 반응은 주위 대기 하에서 수행되었고, 모든 시약은 상업적 공급자로부터 구입하였고, 추가의 정제 없이 사용되었다. 분석용 박층 크로마토그래피(TLC)를 머크(Merck) 실리카 겔 60 F254 TLC 유리판에서 수행하고, 254 nm의 빛 및 p-아니스알데히드(Anisaldehyde) 염색 용액으로 가시화한 다음 가열하였다. 반응 생성물의 정제는 0.3-0.5 bar 압력 하에 브룬쉬비크(Brunschwig) 실리카 32-63, 60Å을 사용하는 플래시 크로마토그래피에 의해, 아크로스 오개닉스 실리카 겔(Acros Organics Silica gel), C18-RP, 23% C, 40-63 μm를 사용하는 역상 크로마토그래피에 의해 또는 알드리치 세파덱스(Aldrich Sephadex) LH-20을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다.
일보호된 디아민 7[1], 6-(2-(tert-부톡시카르보닐)히드라지닐 니코틴산[2] 및 γ-아지도부티르산[3]은 공개된 절차에 따라 제조되었다.
1H NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) AV 600 MHz 분광 분석기에 기록하고, 내부 표준물질(2.50 ppm의 DMSO)로 사용되는 용매 공명으로 ppm으로 보고된다. 피크는 (s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, m = 다중선 또는 비분해(unresolved), br = 넓은 신호, 커플링 상수(Hz), 적분)로서 보고된다. 13C NMR 스펙트럼은 브루커 AV 151 MHz 분광 분석기에서 1H-디커플링으로 기록하고, 내부 표준물질(39.52 ppm의 DMSO-d6)로 사용되는 용매 공명으로 ppm으로 보고된다.
적외선 스펙트럼은 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) UATR Two 분광 분석기에서 순물질(neat) 상태로 측정되었다. 피크는 흡수 최대치(n, cm-1)로 보고된다.
고분해능 질량 스펙트럼 데이터는 바리안 이온스펙 (Varian IonSpec) 분광 분석기(ESI)에서 얻었고, (m/z)로 보고된다.
선광도(optical rotation)는 Jasco P-2000 편광계, 10 cm, 1.0 mL 셀로 측정하였다.
[1] W. Liu, F. Li, X. Chen, J. Hou, L. Yi, Y.-W. Wu J. Am. Chem . Soc . 2014, 136, 4468-4471.
[2] B. Teng, Y. Bai, Y. Chang, Y. Chen, Z. Li Bioorg . & Med . Chem . Lett . 2007, 17, 3440-3444.
[3] T.-B-Yu, J.-Z. Bai, Z. Guan Angew . Chem . Int . Ed. 2009, 48, 1097-1101.
실시예 1: 가교결합제 " HATRIC "의 합성
1. 6-(6-((tert-부톡시카르보닐)아미노)헥산아미도)헥산산 (3)의 합성
Figure pct00012
DMF(150 mL) 중의 화합물 2(6.59 g, 50.2 mmol, 1.1 당량)의 용액을 트리에틸아민(5.08 g, 50.2 mmol, 1.1 당량) 및 화합물 1(15.0 g, 45.7 mmol, 1.0 당량)으로 처리하였다. 실온에서 3시간 후, 반응 혼합물을 물(250 mL)로 희석하고, EtOAc(3 x 250 ml)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 5% LiCl 수용액(3 x 250 mL)으로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 증발시켜 백색 고체를 수득하였다. 생성물을 에틸 아세테이트/헥산(1:1, 350 ml)으로부터 재결정화하여 화합물 3(17.5 g, 90%)을 백색 결정으로 수득하였다.
2. tert-부틸 6-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)헥사노에이트 (5)의 합성
Figure pct00013
DMF(100 mL) 중의 화합물 4(15.0 g, 56.5 mmol, 1.0 당량)을 DMAP(2.76 g, 22.6 mmol, 0.4 당량), tert-부탄올(12.6 g, 170 mmol, 3.0 당량), EDC·HCl(15.2 g, 79.0 mmol, 1.4 당량) 및 휘니히(Huenig) 염기(23.7 mL, 136 mmol, 2.4 당량)으로 처리하였다. 실온에서 14시간 후, 반응 혼합물을 DCM(300 mL)으로 희석하고, 10% 시트르산 수용액(3 x 250 ml)으로 세척하였다. 유기 상을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 생성물을 컬럼 크로마토그래피(200 g SiO2; 에틸 아세테이트/헥산 5:95, 이어서 에틸 아세테이트/헥산 25:75)에 의해 정제하여 화합물 5(14.6 g, 81%)를 무색 오일로서 수득하였다.
3. 4-((6-(tert-부톡시)-6-옥소헥실)아미노)-4-옥소부탄산 ( 6)의 합성
Figure pct00014
THF/물(5:1, 100 mL) 중의 화합물 5(14.0 g, 43.6 mmol, 1.0 당량)의 용액을 아세트산(2.64 g, 44.0 mmol, 1.0 당량) 및 10 중량% Pd/C(1.85 g, 1.74 mmol, 4 mol%)로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 H2 분위기 하에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 원심분리하고, 상청액을 셀라이트를 통해 여과하고, 감압 하에 농축하고, 생성된 오일을 진공 하에 건조하였다. 이 오일을 DCM(150 mL) 중에 용해시키고, 트리에틸아민(15.2 mL, 109 mmol, 2.5 당량) 및 숙신산 무수물(4.79 g, 47.9 mmol, 1.1 당량)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, DCM(350 mL)으로 희석하고, 10% 시트르산 수용액(3 x 250 mL)으로 세척하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(150 g SiO2; DCM, 이어서 DCM/MeOH 90:10)로 정제하여 화합물 6(11.7 g, 94%)을 백색 고체로서 수득하였다.
4. 알릴 tert-부틸(((옥시비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시)비스(프로판-3,1-디일))디카르바메이트 (8)의 합성
Figure pct00015
DCM(400 mL) 중의 화합물 7(10.8 g, 30.3 mmol, 1.0 당량)의 용액을 4℃에서 트리에틸아민(5.29 mL, 37.9 mmol, 1.3 당량), 이어서 알릴 클로로포르메이트(3.56 mL, 33.4 mmol, 1.1 당량)으로 처리하였다. 15분 후, 반응물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물(3 x 250 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(200 g SiO2; 에틸 아세테이트/헥산 1:1, 이어서 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 8(11.0 g, 90%)을 무색 오일로서 얻었다.
5. (S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸 알릴 tert-부틸(15-옥소-4,7,10-트리옥사-14-아자이코산-1,16,20-트리일)트리카르바메이트 (10)의 합성
Figure pct00016
DCM(10 mL) 중의 화합물 8(2.83 g, 7.00 mmol, 1.2 당량)의 용액을 TFA(9 mL)로 처리하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 톨루엔(20 mL)을 첨가하고, 혼합물을 증발시켰다. 톨루엔(3 x 30 mL)과 함께 증발시켜 갈색 오일을 얻고, 이를 진공 건조하였다. 잔류물을 DMF(20 mL)에 용해시키고, 화합물 9(2.85 g, 6.09 mmol, 1.0 당량)를 첨가한 후, 휘니히 염기(3.40 mL, 24.4 mmol, 4.0 당량) 및 HATU(2.55 g, 6.70 mmol, 1.1 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 에틸 아세테이트(100 mL)로 희석하고, 포화 NaCl 수용액(3 x 100 mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(100 g SiO2; DCM, 이어서 DCM/MeOH 96:4)로 정제하여 화합물 10(4.53 g, 99%)을 정치시에 고화되는 무색 오일로서 수득하였다.
6. (S)-(9H-플루오렌-9-일)메틸 알릴 tert-부틸(15,22,29-트리옥소-4,7,10-트리옥사-14,21,28-트리아자테트라트리아콘탄-1,16,34-트리일)트리카르바메이트 (11)의 합성
Figure pct00017
DCM(25 mL) 중의 화합물 10(6.00 g, 7.95 mmol, 1.0 당량)의 용액을 TFA(15 mL)로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 톨루엔(30 mL)을 첨가하고, 혼합물을 증발시켰다. 톨루엔(3 x 30 mL)과 함께 증발시켜 오일을 수득하고, 이를 진공 건조하였다. 잔류물을 DMF(20 mL)에 용해시키고, 화합물 3(3.01 g, 8.74 mmol, 1.1 당량)을 첨가한 후, 휘니히 염기(6.25 mL, 35.8 mmol, 4.5 당량) 및 HATU(3.32 g, 8.74 mmol, 1.1 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 에틸 아세테이트(150 mL)로 희석하고, 물(3 x 100 mL), 5% 수성 LiCl(150 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(100 g SiO2 ; DCM, 이어서 DCM/MeOH 90:10)로 정제하여 화합물 11(5.90 g, 76%)을 무색 오일로서 수득하였다.
7. (S)-tert-부틸 2-(5-((22-(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-5,21,28,35-테트라옥소-4,10,13,16-테트라옥사-6,20,27,34-테트라아자테트라콘트-1-엔-40-일)카르바모일)피리딘-2-일)히드라진카르복실레이트 (12)의 합성
Figure pct00018
DCM(12 mL) 중의 화합물 11(5.85 g, 5.96 mmol, 1.0 당량)의 용액을 TFA(9 mL)로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 톨루엔(30 mL)을 첨가하고, 혼합물을 증발시켰다. 톨루엔(3 x 30 mL)과 함께 증발시켜 오일을 수득하고, 이를 진공 건조하였다. 잔류물을 DMF(25 mL)에 용해시키고, 6-(2-(tert-부톡시카르보닐) 히드라지닐)니코틴산(1.79 g, 7.06 mmol, 1.2 당량), 휘니히 염기(4.69 mL, 26.8 mmol, 4.5 당량) 및 HATU(2.49 g, 6.56 mmol, 1.1 당량)으로 처리하였다. 실온에서 30분 후, 반응 혼합물을 DCM(150 mL)으로 희석하고, 물(3 x 100 mL)로 세척하였다.
생성물을 플래시 크로마토그래피(100 g SiO2; DCM, 이어서 DCM/MeOH 90:10)에 의해 정제하여 화합물 12(5.01 g, 75%)를 무색 포말상(foamy) 고체로서 수득하였다.
8. (S)-tert-부틸 22-(4-(6-(6-(6-(2-(tert-부톡시카르보닐)히드라지닐)니코틴아미도)헥산아미도)헥산아미도)부틸-5,21,24,27-테트라옥소-4,10,13,16-테트라옥사-6,20,23,28-테트라아자테트라트리아콘트-1-엔-34-오에이트 (13)의 합성
Figure pct00019
DMF(15 mL) 중의 화합물 12(4.99 g, 4.47 mmol, 1.0 당량)의 용액을 피페리딘(2 mL)으로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 톨루엔(15 mL)을 첨가하고, 혼합물을 증발시켰다. 톨루엔(3 x 15 ml)과 함께 증발시켜 오일을 수득하고,이를 진공 건조하였다. 잔류물을 DMF(15 mL) 중에 용해시키고, 화합물 6(1.54 g, 5.36 mmol, 1.2 당량), 트리에틸아민(2.65 mL, 19.0 mmol, 4.3 mmol) 및 HATU(1.87 g, 4.92 mmol, 1.1 당량)으로 처리하였다. 실온에서 30분 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(300 mL)로 희석하고, 물(3 x 300 mL) 및 5% 수성 LiCl(1 x 300 mL)로 세척하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(75 g SiO2; DCM, 이어서 DCM/MeOH 15:1, 이어서, DCM/MeOH 9:1)에 의해 정제하여 화합물 13(4.69 g, 90%)을 무색 포말상 고체로서 수득하였다.
9. (S)-tert-부틸 1-아지도-21-(4-(6-(6-(6-(2-(tert-부톡시카르보닐)히드라지닐)니코틴아미도)헥산아미도)헥산아미도)부틸)-4,20,23,26-테트라옥소-9,12,15-트리옥사-5,19,22,27-테트라아자트리트리아콘탄-33-오에이트 (14)의 합성
Figure pct00020
MeOH(4 mL) 중의 화합물 13(1.41 g, 1.17 mmol, 1.0 당량)의 용액을 디에틸아민(0.54 mL, 5.27 mmol, 4.5 당량), 이어서 DCM(8 mL) 중의 Pd(PPh3)4(67.6 mg, 0.0585 mmol, 5 mol%) 및 PPh3(33.8 mg, 0.129 mmol, 10 mol%)의 용액으로 처리하였다. 실온에서 30분 후, 반응 혼합물을 증발시켰다. 톨루엔(3 x 15 mL)과 함께 증발시켜 오일을 수득하고, 이를 진공 건조하였다. 잔류물을 DMF(5 mL)에 용해시키고, γ-아지도부티르산(0.201 g, 1.55 mmol, 1.3 당량), 트리에틸아민(0.25 mL, 1.76 mmol, 1.5 당량) 및 HATU(0.489 g, 1.29 mmol, 1.1 당량)으로 처리하였다. 실온에서 1시간 후, 반응 혼합물을 톨루엔(30 mL)으로 희석하고, 증발시켰다. 톨루엔(3 x 30 ml)과 함께 증발시켜 어두운 오일을 수득하였다. 생성물을 플래시 크로마토그래피(15 g SiO2; DCM, 이어서 DCM/MeOH 90:10, 이어서 DCM/MeOH 80:20)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 역상 C-18 크로마토그래피(물/아세토니트릴 75:25, 이어서 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50)에 의해 추가로 정제하여 화합물 14(0.94 g, 62%)를 수득하였다.
10. (S)-1-아지도-4,20,23,26-테트라옥소-21-(4-(6-(6-(6-(2-(프로판-2-일리덴)히드라지닐)니코틴아미도)헥산아미도)헥산아미도)부틸)-9,12,15-트리옥사-5,19,22,27-테트라아자-트리트리아콘탄-33-오산 (15)의 합성
Figure pct00021
6 M HCl 수용액(10 mL)을 화합물 14(0.85 g, 0.71 mmol)에 첨가하고, 용액을 실온에서 교반하였다. 20분 후, 맑은 용액을 빙조에서 냉각하고, 2 M NaOH 수용액(31 mL, 이전에 HCl 용액에 대해 적정됨)을 첨가하고, 중화된 용액을 동결건조하였다. 잔류물을 MeOH/아세톤 1:1(50 ml)에 현탁하고, 휘발성 물질을 40℃에서 감압 하에 증발시켰다. 이 과정을 2회 더 반복하였다. 이어서, 현탁액을 여과하고, 고체를 MeOH/아세톤 1:1(100 ml)로 세척하고, 여액을 증발시켰다. 생성물을 역상 C-18 크로마토그래피(물/아세톤/트리에틸아민 90:10:1, 이어서 물/아세톤/아세토니트릴 85:10:5)에 의해 정제하여 화합물 15(0.39 g, 51%)을 연회색 고체 포말로서 수득하였다.
11. HATRIC (16)의 합성
Figure pct00022
DMF(15 mL) 중 화합물 15(300 mg, 0.28 mmol)의 현탁액을 휘니히 염기(100 μL, 0.56 mmol, 2.0 당량), N-히드록시숙신이미드(65 mg, 0.56 mmol, 2.0 당량) 및 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트(143 mg, 0.56 mmol, 2.0 당량)로 처리한 후, 40℃에서 90분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 톨루엔(50 ml)으로 처리하고, 증발시켰다. 톨루엔(3 x 50 ml)과 함께 증발시켜 오일을 수득하고, 이를 진공 건조하였다. 생성물을 세파덱스 LH-20(DCM/아세톤/MeOH 8:1:1)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피로 정제하여 화합물 16(295 mg, 90%)을 오렌지색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
ESI -MS: C55H90N14NaO14 [M+Na+]에 대한 계산치: 1193.6653; 관찰치 1193.6668
[α] 25 D = -4.0 (c=0.2, MeOH)
실시예 2: pH 7.4에서 H358 세기관지 세포에서 HATRIC(실시예 1로부터 얻음)에 접합된 표피 성장 인자를 사용한 리간드 기반 수용체 포획
샘플 반응에서, 300 ㎍의 EGF를 70 ㎍의 삼작용성 가교결합제 HATRIC(실시예 1로부터 얻음)에 커플링시켰다. 대조군 반응에서, 70 ㎍의 HATRIC의 리간드 반응성 작용기를 등몰량의 글리신으로 켄칭하였다. 이 절차는 단계 (i)에 대응한다. 글리신 켄칭된 HATRIC으로 처리하기 위해 3개의 반복시험체를 제조하고, EGF 켄칭된 HATRIC으로 처리하기 위해 3개의 반복시험체를 제조하였다. 제조는 6개의 샘플 각각에 대해, 단계 (i) 및 (ii)에 따라 H358 세기관지 세포주의 1500만개의 세포를 1.5 mM NaIO4로 15분 동안 pH6.5, 4℃에서 산화시켜 세포 표면 당단백질의 탄수화물 구조 상에 알데히드를 생성시키는 것을 의미한다. 산화된 세포를 단계 (iv b)에 및 제16항에서 설명된 바와 같이, pH 7.4, 4℃에서 90분 동안 5 mM 2-아미노-5-메톡시벤조산 (XX)의 존재 하에 EGF 접합된 또는 글리신 켄칭된 HATRIC와 함께 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 단계 (ⅴ)에 따라 프로테아제 억제제를 함유하는 8M 우레아, 0.1% 라피제스트(Rapigest) 내에서의 초음파 처리에 의해 용해시켰다. HATRIC 태그 부착된 전체 서열 당단백질은 구리 촉매화된 알킨-아지드 고리 첨가 반응(실온에서 18시간 동안 1 mM CuSO4, 6.25 mM THPTA 및 2 mM 아스코르브산나트륨)에서 알킨 아가로스 비드로 포획하였다. 단백질의 환원 및 알킬화시에, 1% SDS, 8M 우레아, 5M NaCl, 100 mM NaHCO3, pH 11, 100 mM NH4HCO3 및 20% 아세토니트릴로 아가로스 매트릭스를 세척하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 여기에는 절차의 단계 (vi)이 요약되어 있다. 마지막으로, 37℃에서 16시간 동안 트립신 분해에 의해 세포 표면 당단백질의 펩티드가 유리되었다. 탈염시, 펩티드를 MS/MS 분석에 적용하였다. 생성되는 질량 분광 분석 데이터는 MS1-피크 강도를 기초로 하여 상대적으로 정량하였다. 이것은 절차의 단계 (vii) 및 (ix)의 개요를 보여준다. 간단히 설명하면, 확인된 펩티드의 존재비는 반복시험체 전체에 걸쳐 각각의 당단백질 수용체에 대해 합산되었고, 대조군 반응의 반복시험체에서의 존재비와 쌍을 지어 비교되었다. 이 비교는 p 값을 보고하기 위해 통계적 유의성에 대해 시험되었다. p 값은 실험 전반의 오류 발견율(FDR)을 제어하는 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg) 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 조정되었다. 당단백질 표적 수용체 후보는 0.001 이하의 FDR 조정된 p 값 및 4배 이상의 리간드 샘플 내의 농축 인자를 갖는 수용체로 정의된다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 EGF에 대한 당단백질 표적 수용체로서 상부 우측 표적 박스에서 확인되었다. 이 발견은 이전에 발표된 연구 결과에 대응하고, 접근 방식의 유용성을 입증한다.
실시예 3: 가교결합제 "TRICEPS 4.0"의 합성
1. TRICEPS 중간체의 합성
Figure pct00026
표제 화합물은 각각의 출발 물질을 사용하여 실시예 1에서 설명된 절차와 유사하게 수득하였다.
2. TRICEPS 4.0의 합성
Figure pct00027
표제 화합물을 실시예 3.1의 화합물 및 각각의 출발 물질을 사용하여 실시예 1에서 설명된 절차와 유사하게 수득하였다.
실시예 4: 가교결합제 "TRICEPS 5.0"의 합성
Figure pct00028
표제 화합물을 실시예 3.1의 화합물 및 각각의 출발 물질을 사용하여 실시예 1에서 설명된 절차와 유사하게 수득하였다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물:
    Figure pct00029
    (I)
    식 중에서,
    X는 코어 구조를 나타내고;
    S1, S2, 및 S3은 서로 독립적으로 스페이서 기를 나타내고;
    L은 리간드 반응성 기를 나타내고;
    A는 친화성 기를 나타내고;
    Z는 아릴 또는 헤테로아릴을 나타내고;
    R'는 H 또는 C(1-6)-알킬을 나타내고;
    R"는 C(1-6)-알킬을 나타내고; 여기서
    A는 아지드 -N3 및 알킨 -CCH로부터 선택되고;
    X는 하기 화학식 (I-I)의 기를 나타내고;
    Figure pct00030
    (I-I)
    점선은 W1, W2, W3의 기 S1, S2, 및 S3에 대한 연결을 나타내고;
    s는 1 내지 12의 정수, 바람직하게는 4를 나타내고;
    W1은 -NH-를 나타내고;
    W2는 -CONH-를 나타내고;
    W3은 -NHCO-를 나타내고;
    L은 아민 반응성 기, 히드록실 반응성 기, 티올 반응성 기, 알데히도 또는 케토 반응성 기, 및 카르복시 반응성 기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 활성화된 작용기, 바람직하게는 히드록시숙신이미드 에스테르를 나타내고;
    S1은 C(1-24)알킬렌을 나타내고;
    S2는 C(1-24)알킬렌을 나타내고;
    S3은 C(1-24)알킬렌을 나타내고;
    상기 알킬렌은 직쇄 또는 분지쇄이고;
    상기 알킬렌은 치환 또는 비치환되고;
    상기 알킬렌의 하나 이상의, 바람직하게는 비인접 -CH2- 기는 서로 독립적으로 하나 이상의 가교 기 Y 및/또는 비치환 또는 치환된 시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴에 의해 치환될 수 있고; 단, 0 및 N과 같은 헤테로 원자는 서로 직접 연결되지 않고;
    Y는 기 -CH(OH)-, -O-, -CO-, -CH2(CO)-, -SO-, -CH2(SO)-, -SO2-, -CH2(SO2)-, -COO-, -OCO-, -S-CO-, -CO-S-, -SOO-, -OSO-, -SOS-, -O-CO-O-, -OCH2-, -CH2O-, -NR1-, -NR1-CO-, -CO-NR1-, -NR1-CO-O-, -O-CO-NR1-, -NR1-CO-NR1-, -CH=CH-, -C≡C-, -CH=CH-COO-, -OCO-CH=CH-, -CH=N-, -C(CH3)=N-, -N=N-을 나타내고;
    R1은 서로 독립적으로 H 또는 C(1-6)알킬을 나타내고;
    Z는 비치환 페닐, 나프틸 및 안트라세닐로부터 선택된 아릴 기 또는 비치환 피리딜, 푸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴 및 티아졸릴로부터 선택된 헤테로아릴 기를 나타내는 것을 특징으로 한다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (Ia)의 화합물:
    Figure pct00031
    (Ia)
    식 중에서, 치환기들은 제1항에서 정의된 바와 같다.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (Ib)의 화합물:
    Figure pct00032
    (Ib)
    식 중에서, 치환기들은 제1항에서 정의된 바와 같다.
  4. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (Ic)의 화합물:
    Figure pct00033
    (Ic)
  5. 당단백질 수용체의 군으로부터 선택되는 표적과 리간드 사이의 상호작용을 특성화 및 분석하기 위한, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  6. 제5항에 있어서,
    · 상기 표적 당단백질 수용체가 세포 표면 또는 분비된 당단백질 수용체이고/이거나;
    · 리간드가 단백질, 펩티드, 소분자(예를 들어, 약물) 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 오펀 리간드(orphan ligand)인 용도.
  7. 샘플에서 리간드 (II)와 표적 (III) 사이의 특이적인 상호작용을 확인하는 방법으로서,
    · 표적 (III)이 당단백질 수용체이고;
    · 리간드 (II)가 표적 (III) 상의 리간드 특이적 도메인을 인식하고;
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화학식 (I)의 화합물, 리간드 (II) 및 표적 (III)을 포함하는 표적-리간드-시약-복합체 (VI)가 형성되고, 여기서 리간드 (II)가 화학식 (I)의 기 L에 공유 결합되고, 표적 (III)이 화학식 (I)에 존재하는 히드라존 기에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    (i) 상기 표적 (III)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 표적 (III)에 산화 처리를 실시하여 적어도 하나의 탄수화물 잔기 상에 알데히드 작용기를 생성함으로써 산화 표적 (IV)을 얻는 단계;
    (iii) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 화학식 (I)의 삼작용성 가교결합 시약을 제공하고, 그의 리간드 반응성 기 L을 상기 리간드 (II)에 접합시켜 리간드-시약-복합체 (V)를 얻는 단계;
    (iv) 단계 (ii)의 샘플을 단계 (iii)의 복합체 (V)와, (a) 복합체 (V)가 산화 표적 (Ⅳ) 상의 리간드 특이적 도메인에 결합할 수 있고 (b) 상기 복합체 (V)의 히드라존 기(R'R"C=N-NH-)가 그의 유리 형태로 전환되고 산화 탄수화물 표적 (Ⅳ)에 공유 결합하도록 허용되는 조건 하에, 접촉시켜 공유 결합된 리간드 및 공유 결합된 표적을 포함하는 표적-리간드-시약 복합체 (VI)를 얻는 단계;
    (v) 단계 (iv)의 샘플을 용해하여 막 임베딩된 세포 표면 단백질 및 상기 복합체 (Ⅵ)를 이용 가능하게 만들고 매트릭스 (VII)와 반응시켜 매트릭스 결합된 복합체 (VIII)를 얻는 단계;
    (vi) 친화성 매트릭스 (VII)를 사용하여 샘플로부터 상기 복합체를 농후화하여 매트릭스 결합된 복합체 (VIII)를 얻는 단계;
    (vii) 상기 매트릭스 결합된 복합체 (VIII)를 분해하여 (a) 유리된 펩티드 (IX) 및 (b) 매트릭스 (X) 상에 결합된 당펩티드를 얻는 단계;
    (viii) 임의로, 상기 매트릭스 (VIII)로부터 결합된 당펩티드 (X)를 유리시켜 유리된 당펩티드 (XI)를 얻는 단계;
    (ix) 유리된 펩티드 (IX), (XI)를, 바람직하게는 고 질량 정확도 질량 분광법으로, 분석 및 정량하는 단계; 및
    (x) 리간드와 표적 당단백질 수용체 사이의 상호작용을, 바람직하게는 대조군 반응과의 정량적 비교를 통해, 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 표적 (III)은 용액 중에 또는 세포의 표면 상에 존재하는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    단계 (iv)에서,
    · (a)의 반응 조건이 pH 6.5-7.4; 온도 0-10℃; 10-240분이고;
    · 단계 (b)의 반응 조건이 pH 6.5-7.4에서 아미노-벤조산의 군으로부터 선택된 유효량의 촉매 (XX)를 제공하는 것을 포함하고;
    단계 (v)에서, 이중 결합된 표적-리간드-시약 복합체 (VI) 및 무작위의 당단백질-시약 복합체가 세포 및 막의 용해에 의해 샘플로부터 유리되고;
    단계 (vi)에서, 정제가 1% 나트륨 도데실 술페이트, 8M 우레아, 20% 아세토니트릴, 5M 염화나트륨, 80% 이소프로판올, 100 mM 중탄산나트륨을 함유하는 pH 11의 단백질 상용성 버퍼를 사용하여 달성되는 것인 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 살아있는 세포 상의 생화학적 반응에서 촉매로서의 하기 화학식 (XX)의 화합물의 용도:
    Figure pct00034
    (XX)
    식 중에서,
    n은 1 또는 2를 나타내고;
    m은 0, 1 또는 2를 나타내고;
    R4는 NH2를 나타내고;
    R5는 C(1-6)알킬 또는 C(1-6)알콕시를 나타낸다.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 삼작용성 가교결합 시약 (I), 및 임의로 제11항에 기재된 촉매 (XX)를 포함하는 키트.
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