JP6999589B2 - 生物活性剤の細胞標的の捕捉のための組成物および方法 - Google Patents
生物活性剤の細胞標的の捕捉のための組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6999589B2 JP6999589B2 JP2019025449A JP2019025449A JP6999589B2 JP 6999589 B2 JP6999589 B2 JP 6999589B2 JP 2019025449 A JP2019025449 A JP 2019025449A JP 2019025449 A JP2019025449 A JP 2019025449A JP 6999589 B2 JP6999589 B2 JP 6999589B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- capture
- protein
- bioactive agent
- ligand
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 CCCCCCCOCCOCCCC(CCC(C(*)=O)NC(c(cc1)ccc1N(C)Cc(cn1)nc2c1nc(N)nc2N)=C)=O Chemical compound CCCCCCCOCCOCCCC(CCC(C(*)=O)NC(c(cc1)ccc1N(C)Cc(cn1)nc2c1nc(N)nc2N)=C)=O 0.000 description 2
- LVTLDOQRVQTBAB-QUJHUBDJSA-N CC(C)(C)c(cc1NC(Nc2ccccc2)=O)n[n]1-c1cccc(CNC(CCCCCOC/C=C(\C(/N=N/c2ccc(C(NCCOCCOCCCCCCCl)O)cc2)=C)/O)=O)c1 Chemical compound CC(C)(C)c(cc1NC(Nc2ccccc2)=O)n[n]1-c1cccc(CNC(CCCCCOC/C=C(\C(/N=N/c2ccc(C(NCCOCCOCCCCCCCl)O)cc2)=C)/O)=O)c1 LVTLDOQRVQTBAB-QUJHUBDJSA-N 0.000 description 1
- OSEWMRIJRMFJAJ-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)c(cc1NC(Nc2ccccc2)=O)n[n]1-c1cccc(CNC(CNC(OCCOCCOCCOC(NCCOCCOCCCCCCCl)=O)=O)=O)c1 Chemical compound CC(C)(C)c(cc1NC(Nc2ccccc2)=O)n[n]1-c1cccc(CNC(CNC(OCCOCCOCCOC(NCCOCCOCCCCCCCl)=O)=O)=O)c1 OSEWMRIJRMFJAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Description
本出願は、2012年12月12日に出願された米国仮特許出願第61/736,426号、および2013年9月19日に出願された米国仮特許出願第61/883,313号に対する優先権を主張し、これらの両方は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「捕捉タンパク質」という用語は、その相互作用に際してその基質および/またはリガンドと安定した共有結合を形成する、タンパク質に言及する。捕捉タンパク質は、その基質と共有結合を形成する、そのリガンドまたは酵素と結合する際、共有結合を形成する受容体であり得る。本発明の実施形態における使用のために適切な捕捉タンパク質の例は、米国特許第7,425,436号(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に記載される、HALOTAGタンパク質である。
本発明は、生物活性剤の細胞標的の捕捉および特定のための組成物および方法を提供する。具体的には、捕捉リガンドに連結した生物活性剤、細胞標的(内在的、またはレポーターで任意にタグ付けされる)、捕捉タンパク質(捕捉融合体として任意に存在する)、表面(例えば、捕捉リガンド、捕捉タンパク質、または捕捉融合体を提示する)、およびそれと共に生物活性剤の細胞標的を捕捉し、特定する方法が本明細書に提供される。
-O(CO)NH(CH2CH2O)y-(CH2)x-ハロゲンを含む、またはこれで構成され、式中、yは1~8であり、xは2~20であり、ハロゲンはCl、Br、またはFである(例えば、-O(CO)NH(CH2CH2O)2(CH2)xCl、O(CO)NH(CH2CH2O)2(CH2)6-ハロゲン、O(CO)NH(CH2CH2O)2(CH2)6-Clなど)。
実施例1
生物活性剤の細胞標的を捕捉する、捕捉リガンド/捕捉融合体法の機能性を実証するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。
表1に示すように、異なる量のHALOTAGタンパク質二量体(配列番号1の二量体)を、BIRB-クロロアルカン(例えば、生物活性-剤/捕捉-リガンド共役体)で処理されている、またはされていないNANOLUC-p38融合体タンパク質(例えば、レポーター/細胞-標的融合体)を発現する細胞溶解物に添加した。15分間のインキュベートの後、HALOTAGリガンド(HALOLINK平板、Promega Corp.)で活性化した白色、96ウェルのポリスチレン平板のウェル内に試料を定置し、更に45分間インキュベートした。その後、ウェルをPBS+0.05%のTween20(PBST)で洗浄した。その後、50ulのPBSに続けて、50ulのNANOGLOルシフェラーゼ検出試薬をウェルに添加し、発光を測定した。
クロロアルカン薬物共役体を使用する、細胞からHALOTAGタンパク質ビーズ上への、標的タンパク質のプルダウンの効率を実証するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。本実施例において、BIRB-クロロアルカン共役体(PBI-4834、下記を参照のこと)を利用して、NANOLUC-p38アルファ融合体タンパク質を生細胞からプルダウンした。
PBI4834(BIRBカルバメートクロロアルカン)
クロロアルカン修飾薬物を使用する、カルバメートクロロアルカンリンカーの、標的タンパク質の細胞からHALOTAGタンパク質ビーズ上へのプルダウンのための利点を実証するために、本発明の実施形態の開発中に実験を実施した。本実施例において、メトトレキサート-クロロアルカン共役体PBI-5015(カルバメートクロロアルカンリンカー)およびPBI-4848(O2クロロアルカンリンカー)を、溶解物中のHALOTAG(登録商標)タンパク質に対するそれらの結合効率、細胞内のDHFRに対する結合効率、およびNANOLUC-DHFR融合体タンパク質を生細胞からプルダウンする能力について試験した。
PBI-5015:メトトレキサートカルバメートクロロアルカン
PBI-4890メトトレキサート-TOM
NANOLUC融合体タンパク質の、HALOTAGタンパク質ビーズからの特異的な放出のための方法は、例えば、
1.非共役生物活性剤との競合と、
2.捕捉リガンドに連結した生物活性剤(例えば、クロロアルカンリガンド)の使用であって、捕捉リガンドが、NANOLUC融合体タンパク質の高速の放出を可能にするために、化学的に開裂可能リンカー(例えば、クロロアルカンリンカー)を含有する、使用と、
3.捕捉リガンド固体支持体(例えば、HALOLINK HALOTAG樹脂)の使用であって、捕捉リガンド(HALOTAGリガンド)を固体支持体に結合するリンカーが、化学的に開裂され、捕捉タンパク質-捕捉リガンド-生物活性剤-細胞標的複合体(例えば、HALOTAG-クロロアルカン-薬物共役体-NANOLUC融合体タンパク質複合体)の高速の放出を可能にし得る使用と、
4.レポーターからの、細胞標的のタンパク質分解開裂、例えば、NANOLUCタンパク質を放出したNANOLUC融合体タンパク質、と、を含む。
1.150μMの非共役BIRB796を使用して、NANOLUC-p38アルファ融合体上で共役BIRB796との結合を60分間競合させた。
2.NANOLUC-p38アルファ融合体を、クロロアルカンリンカーの、10mMのヒドロ亜硫酸ナトリウムでの10分間の化学的開裂を通して迅速に放出させた(PBI-5131は、クロロアルカン開裂可能リンカーである)。
2mLのDMF中のメトトレキサート水和物(50mg、110umol)、EDAC(63mg、330umol)およびトリエチルアミン(77uL、550umol)混合物に対して、N-Bocカダベリン(22mg、110umol)を添加した。反応を、90分間撹拌し、その後、水で希釈した2mLの1NのHClで急冷し、調製HPLC(0.1%の水性ギ酸中の20->50%MeCN)に供した。適切な画分を濃縮し、凍結乾燥して、所望の生成物を産出した。M+Hに対する計算値:639.3、実測値639.5。
PBI-5015メトトレキサートカルバメートクロロアルカン
PBI-4890メトトレキサート-TOM
BIRB開裂可能リンカークロロアルカンPBI5131
BIRBカルバメートクロロアルカンPBI4834
7-トリチルオキシカルバモイルヘプタン酸(その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Schaefer et al.Med Chem Lett2008,16,2011-2033.)(200mg、463umol)を、3mLのDMF中の4-[(N-Boc)アミノメチル]アニリン(113mg、510umol)、HBTU(352mg、927umol)およびトリエチルアミン(194uL、1.4mmol)と化合した。反応を一晩撹拌し、その後、セライト上に吸着させ、ヘプタン中の0->100%のEtOAcの勾配で溶出するカラムクロマトグラフィーによって生成物を取得した。M+Hに対する計算値:635.3、実測値635.9。
スベロイル(4-[(N-Boc)アミノメチル]アニリド)ヒドロキサム酸(286mg、450mmol)を、0.25mLのTISが添加された2mLのDCM中で溶解させた。その後、トリフルオロ酢酸(0.9mL)を添加し、反応を30分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗反応生成物は、調製HPLCによって精製してもよく、または更なる精製なしで使用してもよい。
SAHA-カルバメート(SAHA-クロロアルカン)PBI5040
SAHA-ビオチンPBI5474
内在的標的プルダウン(PBI-5015)
以下の実施例は、内在的標的を細胞から単離する、例えば、プルダウンする、クロロアルカン-薬物共役体の能力を実証する。
内在的標的プルダウン(PBI-4834)
以下の実施例は、内在的標的を細胞から単離する、例えば、プルダウンする、クロロアルカン-薬物共役体の能力を実証する。
HALOTAGタンパク質の常磁性ビーズに対するカップリング
A.ステップ4の常磁性樹脂の合成
tert-ブチル(18-((2-シアノベンゾ[d]チアゾール-6-イル)アミノ)-15,18-ジオキソ-4,7,10-トリオキサ-14-アザオクタデシル)カルバメート(2)。化合物1(4.93g、17.9mmol)、tert-ブチル(3-(2-(2-(3-アミノプロポキシ)エトキシ)エトキシ)プロピル)カルバメート(7.40g、23.1mmol)、およびDCM:DMF(10:1、100mL)を、250mLの丸底フラスコ内で、室温で共に撹拌した。EDAC(4.0g、20.9mmol)を添加し、反応を20時間撹拌した。DCM/MeOHを溶媒として有する順相クロマトグラフィーによって、溶媒を蒸発、精製して、6.62gの白色固体(64%)をもたらした。1H-NMR(d3-ACN、300MHz):δ9.21(s、NH)、8.62(d、1H、J=2.0Hz)、8.09(d、1H、J=8.4Hz)、7.63(d、1H、J=8.4Hz)、6.65(bs、NH)、5.40(bs、NH)、3.5(m、12H)、3.28(m、2h)、3.06(m、2h)、2.65(m、2h)、2.51(m、2h)、2.70(m、4h)、1.40(s、9H)。ESI-MS:計算値C27H40N5O7S+:m/z578.7、実測値m/z578.4。
N1-(3-(2-(2-(3-アミノプロポキシ)エトキシ)エトキシ)プロピル)-N4-(2-シアノベンゾ[d]チアゾール-6-イル)サクシナミド塩酸塩(3)。化合物2(6.62g、11.5mmol)を、DCM(200mL)およびトリイソプロピルシラン(1mL)と共に、500mLの丸底フラスコ内で撹拌した。ジオキサン(30mL、120mmol)中のHClの4.0Mの溶液を、添加し、室温で3時間かけて撹拌した。溶媒を蒸発させ、6.4gの黄色吸湿性固体(98%)をもたらした。1H-NMR(d6-DMSO,300MHz):δ10.62(s、1H)、8.74(d、1H、J=2.0Hz)、8.15(d、1H、J=8.4Hz)、7.77(d、1H、J=8.4Hz)、3.4(m、16H)、3.28(m、2H)、3.08(m、2H)、2.80(m、2H)、2.61(m、2H)、2.41(m、2H)、1.80、(m、2H)、1.60(m、2H)。ESI-MS:計算値C22H32N5O5S+:m/z478.59、実測値m/z478.2。
固定したシアノベンゾチアゾール-磁性セルロース(4)。カルボキシメチル磁性セルロース(7.24g、30~50μM、Iontosorb MG CM)を、DMF(100mL)中の化合物3(800mg、1.53mmol)と共に、250mLの丸底フラスコ中に吸収した。EDAC(387mg、2.01mmol)を添加し、反応を室温で20時間撹拌した。粒子をフリット上で濾過し、まずDMF(200mL)で、その後25%のEtOH(300mL)で濯ぎ、50%の懸濁液として4℃で保管した。
HALOTAG(登録商標)タンパク質常磁性ビーズを作製するために、HALOTAG(登録商標)タンパク質を、N末端システインを通して常磁性STEP4樹脂上に固定した。HALOTAG(登録商標)タンパク質を、HALOTAG(登録商標)タンパク質とminiGroEL配列との間のTEVプロテアーゼ認識部位(EDLYFQC)を有するHisタグ-miniGroE-HALOTAG(登録商標)融合体として大腸菌内で発現させた。融合体を、Hisタグを使用して精製し、その後、2mMのTCEPの存在下で、TEVプロテアーゼで開裂させて、N末端低減システインを曝した。STEP4樹脂上の反応性シアノ基は、低減N末端システインと反応して、HALOTAG(登録商標)タンパク質ビーズに由来する非常に安定した結合を形成する。
以下の実施例は、クロロアルカン修飾の、連結した生物活性剤の透過性および力価に対する最小限の影響を実証する。
以下の実施例は、低存在度および低親和性標的を含む内在的標的を細胞からプルダウンする、クロロアルカン-共役薬物の能力を実証する。
以下の実施例は、連鎖法(クロロアルカンまたはビオチン)の薬物力価に対する効果を実証する。
以下の実施例は、本発明の実施形態におけるビオチン連鎖と比較して、クロロアルカン連鎖によって媒介される高効率プルダウンを実証する。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔1〕(a)生物活性剤の細胞標的と、
(b)第1の捕捉タンパク質および第2の捕捉タンパク質の二量体と、
(c)第1の捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤であって、前記第1の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第1の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、前記生物活性剤と、
(d)第2の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、前記第2の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第2の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、
を含む、システム。
〔2〕前記細胞標的が、細胞内でレポーターとの融合体として発現する、前記〔1〕に記載のシステム。
〔3〕前記レポーターが、生物発光レポーターである、前記〔2〕に記載のシステム。
〔4〕前記生物発光レポーターが、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔3〕に記載のシステム。
〔5〕前記第1および第2の捕捉タンパク質の両方が、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を含む、前記〔1〕に記載のシステム。
〔6〕前記二量体が、ホモ二量体である、前記〔5〕に記載のシステム。
〔7〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔1〕に記載のシステム。
〔8〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔1〕に記載のシステム。
〔9〕前記第1の捕捉リガンドおよび第2の捕捉リガンドが、同一の分子構造を含む、前記〔1〕に記載のシステム。
〔10〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔1〕に記載のシステム。
〔11〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔10〕に記載のシステム。
〔12〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記第1の捕捉タンパク質が前記第1の捕捉リガンドに結合し、前記第2の捕捉タンパク質が前記固体表面上で、前記第2の捕捉リガンドに結合する、前記〔1〕に記載のシステム。
〔13〕細胞標的を捕捉する方法であって、
(a)第1の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
(b)前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
(c)前記細胞溶解物を、第1の捕捉タンパク質および第2の捕捉タンパク質の二量体と、前記第1の捕捉リガンドが前記第1の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
(d)前記細胞溶解物を、第2の捕捉リガンドを提示する固体表面と、前記第1の捕捉リガンドが前記第1の捕捉タンパク質と共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
(e)前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
〔14〕細胞標的を捕捉する方法であって、
(a)第1の捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
(b)前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
(c)前記細胞溶解物を、第1の捕捉タンパク質および第2の捕捉タンパク質の二量体に結合した第2の捕捉リガンドを提示する固体表面と接触させるステップであって、前記第2の捕捉タンパク質および前記第2の捕捉リガンドが共有的に結合する、ステップと、
(d)前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
〔15〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔13〕および〔14〕のいずれか一項に記載の方法。
〔16〕(a)生物活性剤の細胞標的と、
(b)第1の捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、
を含む細胞の、細胞溶解物であって、
前記細胞溶解物が、
(c)第1の捕捉タンパク質および第2の捕捉タンパク質の二量体であって、前記第1の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第1の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、二量体と、
(d)第2の捕捉リガンドを提示する固体表面であって、前記第2の捕捉リガンドが、その相互作用に際して前記第2の捕捉タンパク質と共有結合を形成する、固体表面と、
を更に含む、細胞溶解物。
〔17〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔18〕前記レポータータンパク質が、生物発光レポーターである、前記〔17〕に記載の細胞溶解物。
〔19〕前記生物発光レポーターが、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔18〕に記載の細胞溶解物。
〔20〕前記第1および第2の捕捉タンパク質の両方が、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を含む、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔21〕前記二量体が、ホモ二量体である、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔22〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔23〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔24〕前記第1の捕捉リガンドおよび第2の捕捉リガンドが、同一の分子構造を含む、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔25〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔26〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔25〕に記載の細胞溶解物。
〔27〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記第1の捕捉タンパク質が前記第1の捕捉リガンドに結合し、前記第2の捕捉タンパク質が前記固体表面上で、前記第2の捕捉リガンドに結合する、前記〔16〕に記載の細胞溶解物。
〔28〕(a)生物活性剤の細胞標的と、
(b)捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤と、
(c)捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、前記捕捉タンパク質が、その相互作用に際して前記捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、
を含むシステム。
〔29〕前記細胞標的が、細胞内でレポーターとの融合体として発現する、前記〔28〕に記載のシステム。
〔30〕前記レポーターが、生物発光レポーターである、前記〔29〕に記載のシステム。
〔31〕前記生物発光レポーターが、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔30〕に記載のシステム。
〔32〕前記捕捉タンパク質が、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を含む、前記〔28〕に記載のシステム。
〔33〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔28〕に記載のシステム。
〔34〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔28〕に記載のシステム。
〔35〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔28〕に記載のシステム。
〔36〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔35〕に記載のシステム。
〔37〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドに結合する、前記〔28〕に記載のシステム。
〔38〕細胞標的を捕捉する方法であって、
(a)捕捉リガンドに連結した生物活性剤を、前記生物活性剤の細胞標的を含む細胞に、前記細胞標的が前記生物活性剤に結合するような条件下で投与するステップと、
(b)前記細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成するステップと、
(c)前記細胞溶解物を、捕捉タンパク質を提示する固体表面と、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドと共有結合を形成する条件下で接触させるステップと、
(d)前記固体表面を前記細胞溶解物から分離するステップと、
を含む、方法。
〔39〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔38〕に記載の方法。
〔40〕(a)生物活性剤の細胞標的と、
(b)捕捉リガンドに連結した生物活性剤と、
を含む細胞の細胞溶解物であって、
前記細胞溶解物が、
(c)捕捉タンパク質を提示する固体表面であって、前記捕捉タンパク質が、その相互作用に際して前記捕捉リガンドと共有結合を形成する、固体表面と、
を更に含む、細胞溶解物。
〔41〕前記細胞標的が、レポータータンパク質との融合体である、前記〔40〕に記載の細胞溶解物。
〔42〕前記レポータータンパク質が、生物発光レポーターである、前記〔41〕に記載の細胞溶解物。
〔43〕前記生物発光レポーターが、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔42〕に記載の細胞溶解物。
〔44〕前記捕捉タンパク質が、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を含む、前記〔40〕に記載の細胞溶解物。
〔45〕前記生物活性剤が、小分子である、前記〔40〕に記載の細胞溶解物。
〔46〕前記細胞標的が、前記生物活性剤の結合パートナーである、前記〔40〕に記載の細胞溶解物。
〔47〕前記固体表面が、ウェル、チューブ、スライド、平板、マトリックス、樹脂、またはビーズからなるリストから選択される、前記〔40〕に記載の細胞溶解物。
〔48〕前記固体表面が、磁性または常磁性である、前記〔47〕に記載の細胞溶解物。
〔49〕前記細胞標的が前記生物活性剤に結合し、前記捕捉タンパク質が前記捕捉リガンドに結合する、前記〔40〕に記載の細胞溶解物。
〔50〕カルバメートリンカーを含む、捕捉リガンド。
〔51〕クロロアルカンを更に含む、前記〔50〕に記載の捕捉リガンド。
Claims (5)
- 細胞の溶解物であって、
(a)(i)生物活性剤の結合パートナーである生物活性剤の細胞標的と(ii)生物発光レポーターとの融合体であって、前記細胞内で発現した、融合体、及び
(b)ハロアルカン捕捉リガンドに連結した生物活性剤であって、前記ハロアルカン捕捉リガンドに連結した前記生物活性剤が、細胞透過性であり、細胞内条件下でその相互作用に際して前記細胞標的と結合することができ、前記細胞を溶解する前に前記細胞外に添加された、前記ハロアルカン捕捉リガンドに連結した生物活性剤、
を含む、細胞の溶解物。 - 前記生物発光レポーターが、配列番号3と90%を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1に記載の細胞の溶解物。
- 前記ハロアルカン捕捉リガンドが、クロロアルカン基である、請求項1に記載の細胞の溶解物。
- 前記ハロアルカン捕捉リガンドと、その相互作用により共有結合を形成することができるデハロゲナーゼ捕捉タンパク質を更に含む、請求項1に記載の細胞の溶解物。
- 前記デハロゲナーゼ捕捉タンパク質が、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を含む、請求項4に記載の細胞の溶解物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261736426P | 2012-12-12 | 2012-12-12 | |
US61/736,426 | 2012-12-12 | ||
US201361788313P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
US61/788,313 | 2013-03-15 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015547559A Division JP6484178B2 (ja) | 2012-12-12 | 2013-12-12 | 生物活性剤の細胞標的の捕捉のための組成物および方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019092517A JP2019092517A (ja) | 2019-06-20 |
JP6999589B2 true JP6999589B2 (ja) | 2022-02-04 |
Family
ID=50934961
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015547559A Active JP6484178B2 (ja) | 2012-12-12 | 2013-12-12 | 生物活性剤の細胞標的の捕捉のための組成物および方法 |
JP2019025449A Active JP6999589B2 (ja) | 2012-12-12 | 2019-02-15 | 生物活性剤の細胞標的の捕捉のための組成物および方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015547559A Active JP6484178B2 (ja) | 2012-12-12 | 2013-12-12 | 生物活性剤の細胞標的の捕捉のための組成物および方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9551705B2 (ja) |
EP (1) | EP2931305B1 (ja) |
JP (2) | JP6484178B2 (ja) |
KR (2) | KR102227321B1 (ja) |
CN (1) | CN104853767B (ja) |
AU (2) | AU2013359160B2 (ja) |
BR (1) | BR112015013715A2 (ja) |
CA (1) | CA2894432C (ja) |
IL (1) | IL239213B (ja) |
SG (1) | SG11201504520XA (ja) |
WO (1) | WO2014093671A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9056885B2 (en) * | 2011-11-21 | 2015-06-16 | Promega Corporation | Carboxy X rhodamine analogs |
CN104853767B (zh) | 2012-12-12 | 2017-04-05 | 普洛麦格公司 | 用于捕获生物活性剂的细胞标靶的组合物和方法 |
US10168323B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-01-01 | Promega Corporation | Compositions and methods for capture of cellular targets of bioactive agents |
JP6604938B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-11-13 | プロメガ コーポレイション | タンパク質を官能基または固体表面に共有結合的に係留するための基質 |
WO2016196956A1 (en) | 2015-06-05 | 2016-12-08 | Promega Corporation | Cell-permeable, cell-compatible, and cleavable linkers for covalent tethering of functional elements |
US10458988B2 (en) * | 2017-03-03 | 2019-10-29 | Musc Foundation For Research Development | Biotinylated luminescent probe |
US11709156B2 (en) | 2017-09-18 | 2023-07-25 | Waters Technologies Corporation | Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis |
US11709155B2 (en) | 2017-09-18 | 2023-07-25 | Waters Technologies Corporation | Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes |
EP3941195A4 (en) | 2019-03-20 | 2023-03-22 | Promega Corporation | PHOTOAFFINITY PROBES |
US11918936B2 (en) | 2020-01-17 | 2024-03-05 | Waters Technologies Corporation | Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding |
JP2022182394A (ja) * | 2021-05-28 | 2022-12-08 | 独立行政法人国立病院機構 | 抗原固相化デバイス |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009296973A (ja) | 2008-06-16 | 2009-12-24 | Olympus Corp | タンパク質相互作用解析方法、ポリヌクレオチド、および、組成物 |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5914095A (en) | 1989-04-07 | 1999-06-22 | Salutar, Inc. | Polychelants containg amide bonds |
US5344926A (en) | 1992-06-22 | 1994-09-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing staurosporine derivatives |
AU5323794A (en) | 1992-10-14 | 1994-05-09 | Sterling Winthrop Inc. | Chelating polymers |
US5756688A (en) | 1992-10-14 | 1998-05-26 | Sterling Winthrop Inc. | MR imaging compositions and methods |
GB9503969D0 (en) | 1995-02-28 | 1995-04-19 | Sams Bernard | Incrementing mechanism |
CA2398010A1 (en) * | 2000-01-24 | 2001-07-26 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | An in vivo screen using chemical inducers of dimerization |
US20020168737A1 (en) * | 2001-01-24 | 2002-11-14 | Cornish Virginia W. | Binding and catalysis screen for high throughput determination of protein function using chemical inducers of dimerization |
ATE516818T1 (de) * | 2002-07-31 | 2011-08-15 | Seattle Genetics Inc | Auristatin-konjugate und ihre verwendung zur behandlung von krebs, einer autoimmunkranheit oder einer infektionskrankheit |
US7429472B2 (en) | 2003-01-31 | 2008-09-30 | Promega Corporation | Method of immobilizing a protein or molecule via a mutant dehalogenase that is bound to an immobilized dehalogenase substrate and linked directly or indirectly to the protein or molecule |
CA2514564A1 (en) | 2003-01-31 | 2005-07-26 | Promega Corporation | Covalent tethering of functional groups to proteins |
KR100507796B1 (ko) * | 2003-04-03 | 2005-08-17 | 한미약품 주식회사 | 생체내 반감기가 증가된 peg-생리활성 폴리펩티드 동종이량체 결합체 및 이의 제조방법 |
US7425436B2 (en) | 2004-07-30 | 2008-09-16 | Promega Corporation | Covalent tethering of functional groups to proteins and substrates therefor |
EP1989548A2 (en) * | 2006-02-08 | 2008-11-12 | Promega Corporation | Compositions and methods for capturing and analyzing cross-linked biomolecules |
KR100891456B1 (ko) * | 2008-11-06 | 2009-04-01 | 씨지케이 주식회사 | 생리활성물질에 대한 세포내 표적물질을 검출하는 방법 및 장치 |
BRPI1010019B1 (pt) | 2009-05-01 | 2019-02-05 | Promega Corp | polipeptídeo de luciferase modificada, vetor e kit compreendendo os mesmos |
ES2567410T3 (es) | 2010-11-02 | 2016-04-22 | Promega Corporation | Nuevos sustratos de coelenterazina y métodos de uso |
CN104853767B (zh) | 2012-12-12 | 2017-04-05 | 普洛麦格公司 | 用于捕获生物活性剂的细胞标靶的组合物和方法 |
JP6604938B2 (ja) * | 2013-03-15 | 2019-11-13 | プロメガ コーポレイション | タンパク質を官能基または固体表面に共有結合的に係留するための基質 |
US10168323B2 (en) * | 2013-03-15 | 2019-01-01 | Promega Corporation | Compositions and methods for capture of cellular targets of bioactive agents |
WO2016196956A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | Promega Corporation | Cell-permeable, cell-compatible, and cleavable linkers for covalent tethering of functional elements |
-
2013
- 2013-12-12 CN CN201380064237.XA patent/CN104853767B/zh active Active
- 2013-12-12 EP EP13862430.9A patent/EP2931305B1/en active Active
- 2013-12-12 US US14/104,814 patent/US9551705B2/en active Active
- 2013-12-12 JP JP2015547559A patent/JP6484178B2/ja active Active
- 2013-12-12 CA CA2894432A patent/CA2894432C/en active Active
- 2013-12-12 KR KR1020157018280A patent/KR102227321B1/ko active IP Right Grant
- 2013-12-12 KR KR1020207024366A patent/KR102272233B1/ko active IP Right Grant
- 2013-12-12 WO PCT/US2013/074756 patent/WO2014093671A1/en active Application Filing
- 2013-12-12 SG SG11201504520XA patent/SG11201504520XA/en unknown
- 2013-12-12 BR BR112015013715A patent/BR112015013715A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-12-12 AU AU2013359160A patent/AU2013359160B2/en active Active
-
2015
- 2015-06-04 IL IL239213A patent/IL239213B/en active IP Right Grant
-
2017
- 2017-01-10 US US15/402,879 patent/US10976312B2/en active Active
-
2019
- 2019-02-14 AU AU2019201035A patent/AU2019201035B9/en active Active
- 2019-02-15 JP JP2019025449A patent/JP6999589B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009296973A (ja) | 2008-06-16 | 2009-12-24 | Olympus Corp | タンパク質相互作用解析方法、ポリヌクレオチド、および、組成物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ACS Chem. Biol.,2012年08月15日,Vol.7,pp.1848-1857 |
Science,2005年,Vol.307,pp.1621-1625 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20200103867A (ko) | 2020-09-02 |
EP2931305A1 (en) | 2015-10-21 |
CN104853767A (zh) | 2015-08-19 |
AU2013359160B2 (en) | 2018-11-15 |
JP2019092517A (ja) | 2019-06-20 |
JP2016502843A (ja) | 2016-02-01 |
AU2013359160A1 (en) | 2015-07-09 |
CN104853767B (zh) | 2017-04-05 |
JP6484178B2 (ja) | 2019-03-13 |
EP2931305B1 (en) | 2018-11-28 |
CA2894432A1 (en) | 2014-06-19 |
AU2019201035A1 (en) | 2019-03-07 |
US10976312B2 (en) | 2021-04-13 |
BR112015013715A2 (pt) | 2017-09-26 |
US9551705B2 (en) | 2017-01-24 |
IL239213B (en) | 2020-03-31 |
AU2019201035B2 (en) | 2020-09-03 |
KR20150093222A (ko) | 2015-08-17 |
CA2894432C (en) | 2022-06-07 |
KR102272233B1 (ko) | 2021-07-01 |
SG11201504520XA (en) | 2015-07-30 |
IL239213A0 (en) | 2015-07-30 |
US20170115283A1 (en) | 2017-04-27 |
US20140199712A1 (en) | 2014-07-17 |
AU2013359160A2 (en) | 2015-11-12 |
AU2019201035B9 (en) | 2021-02-11 |
WO2014093671A1 (en) | 2014-06-19 |
KR102227321B1 (ko) | 2021-03-12 |
EP2931305A4 (en) | 2016-08-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6999589B2 (ja) | 生物活性剤の細胞標的の捕捉のための組成物および方法 | |
US20210340593A1 (en) | Substrates for covalent tethering of proteins to functional groups or solid surfaces | |
US11667648B2 (en) | Cell-permeable, cell-compatible, and cleavable linkers for covalent tethering of functional elements | |
US10168323B2 (en) | Compositions and methods for capture of cellular targets of bioactive agents | |
EP2670755B1 (en) | Trifunctional crosslinking reagents | |
KR102656471B1 (ko) | 삼작용성 가교결합 시약 | |
US10557852B2 (en) | Fluorescent molecular sensor for targeting changes in protein surfaces, and methods of use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190318 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190318 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200302 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200602 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200731 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200827 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210128 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210421 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210721 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211122 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211222 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6999589 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |