KR102227321B1

KR102227321B1 - 생체활성 제제의 세포 표적 포획을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR102227321B1
Application number: KR1020157018280A
Authority: KR
Inventors: 캐롤린 더블유. 히트코; 로빈 허스트; 토마스 커클랜드; 디터 클라우버트; 폰초 마이젠하이머; 니드히 나스; 레이첼 에프. 오하나; 폴 오토; 마제타 어; 해리 테츠오 우에다; 키이스 우드
Original assignee: 프로메가 코포레이션
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2021-03-12
Also published as: JP2019092517A; US9551705B2; US20170115283A1; CA2894432C; EP2931305A4; IL239213B; EP2931305B1; BR112015013715A2; AU2019201035B2; WO2014093671A1; AU2019201035A1; KR20150093222A; AU2013359160A1; KR102272233B1; IL239213A0; US20140199712A1; AU2013359160A2; EP2931305A1; CN104853767A; JP2016502843A

Abstract

본 발명은 생체활성 제제의 세포 표적의 포획 및 확인을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 포획 리간드, 세포 표적(선택적으로 리포터로 태그됨), 포획 단백질(선택적으로 포획 융합물로 존재함), 표면(예로, 포획 리간드, 포획 단백질, 또는 포획 융합물을 디스플레이함)에 속박된 생체활성 제제, 및 생체활성 제제의 세포 표적을 포획 및 확인하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

생체활성 제제의 세포 표적 포획을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR CAPTURE OF CELLULAR TARGETS OF BIOACTIVE AGENTS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2012. 12. 12.에 출원된 U.S. 특허 가출원 일련 번호 61/736,426; 및 2013.09.19.에 출원된 U.S. 특허 가출원 일련 번호 61/883,313을 우선권으로 청구한다; 둘 다 본원에 이들의 전문이 참조로 도입된다.

분야

본 발명은 생체활성 제제의 세포 표적 포획 및 확인을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 포획 리간드, 세포 표적(내인성이거나 선택적으로 리포터로 태그됨), 포획 단백질(선택적으로 포획 융합물로 존재함), 표면(예로, 포획 리간드, 포획 단백질, 또는 포획 융합물을 디스플레이함)에 속박된 생체활성 제제, 및 생체활성 제제의 세포 표적을 포획 및 확인하는 방법이 본원에 제공된다.

세포 기반 표현형 스크리닝은 생체활성 약물 후보의 발견을 위해 점점 더 많이 이용되고 있다. 약물 후보의 표적은 자연적으로 세포 맥락 내에서 작용하며, 이들이 생체활성 분자(예로, 합성 분자)와 어떻게 상호작용하는지는 상기 맥락에 의해 크게 영향을 받는다. 이러한 이유로, 생체활성 분자에 대해 미지의 표적을 확인하려고 시도하는 경우, 확인을 위해 포획되기 전에 표적이 살아있는 세포 내에서 생체활성 분자에 결합하도록 하는 것이 바람직하다. 따라서 포획 전에 세포 용해액에서 결합이 일어나도록 하는 방법은 바람직하지 않다. 이는 원하는 생체활성을 매개하는 일차 표적에 대해, 그리고 경향 또는 간섭을 일으킬 수 있는 오프-표적에 대해 해당된다. 이러한 생체활성 분자에 대한 단백질 표적의 확인 및 검증은 종종 친화도 농축 및 질량 분광측정 방법의 조합을 이용한다. 이러한 방법은 몇몇 어려움에 직면한다. 첫 번째로, 종종 표적 분자 및 단백질 표적 간의 중등 내지 약한 결합은 표적 단백질 또는 단백질 복합체의 포획을 어렵게 만들거나 결과를 고친화도 상호작용체에 대해 편향시킨다. 또한, 친화도 농축 방법은 전형적으로 후보 표적 분자가 고정된 고형 지지체를 이용한다. 고체 표면 상에서의 결합 역학은 용액 기반 역학에 비하면 훨씬 더 느려서, 표적 단백질 또는 단백질 복합체의 포획 기회를 더 감소시킨다. 세포 용해액으로부터의 단백질의 고형 지지체에 대한 비특이적 결합은 질량 분광측정(MS)을 이용한 세포 표적의 확인을 더 복잡하게 만드는 높은 배경을 야기한다. 이러한 방법은 종종 다수의 추정 히트를 생성하여, 잠재적 표적을 검증하기 위해 이차 스크리닝을 수행해야 하도록 만든다. 표적 분자-단백질 상호작용에 대한 고처리량 검증 분석은 추가 개발과 최적화를 필요로 하여, 이를 자원 집약적 절차로 만든다.

요약

일부 구현예에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상(예로 전부)을 포함하는 조성물 및 시스템(예로, 세포, 반응 혼합물, 키트, 용기 등)을 제공한다: (a) 생체활성 제제의 세포 표적; (b) 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 융합물; (c) 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제로서, 제1 포획 리간드는 이들의 상호작용 시 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성함; 및 (d) 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면으로서, 제2 포획 리간드는 이들의 상호작용 시 제2 포획 단백질과 공유 결합을 형성함. 일부 구현예에서, (a)는 생체활성 화합물의 복수의 세포 표적을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포내에서 리포터와의 융합물로 발현된다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 리포터이다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 단백질의 일부, 성분, 또는 서브유닛이다. 일부 구현예에서, 상기 생체발광 리포터는 서열 목록 번호 3과 적어도 70% 서열 동일성(예로, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 단백질은 둘 다 서열 목록 번호 1과 적어도 70% 서열 동일성(예로, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합물은 동종이량체이다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 소분자이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 분자 조합, 예컨대 둘 이상의 단백질, 또는 단백질 및 핵산의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 포획 리간드 및 제2 포획 리간드는 동일한 분자 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 다음으로 구성된 목록으로부터 선택된다: 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등. 일부 구현예에서, 고체 표면은 자성이 있다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 자성이 없다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 결합되며, 제1 포획 단백질은 제1 포획 리간드에 결합되고, 제2 포획 단백질은 고체 표면 상의 제2 포획 리간드에 결합된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 표적의 포획 방법을 제공한다: (a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하는 조건 하에 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 투여하는 단계; (b) 세포를 용해시켜 세포 용해액을 생성하는 단계; (c) 제1 포획 리간드가 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성하는 조건 하에 세포 용해액을 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 융합물과 접촉시키는 단계; (d) 제1 포획 리간드가 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성하는 조건 하에 세포 용해액을 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계; 및 (e) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계. 다른 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 표적의 포획 방법을 제공한다: (a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하는 조건 하에 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 투여하는 단계; (b) 세포를 용해시켜 세포 용해액을 생성하는 단계; (c) 세포 용해액을 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 융합물에 결합된 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계(여기서, 제2 포획 단백질 및 제2 포획 리간드는 공유 결합됨); 및 (d) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 리포터와의 융합물이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 표적의 포획 방법을 제공한다: (a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하는 조건 하에 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 투여하는 단계; (b) 제1 포획 리간드가 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성하는 조건 하에 제1 포획 리간드를 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 융합물과 접촉시키는 단계; (c) 제1 포획 리간드가 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성하는 조건 하에 포획 융합물을 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계; 및 (d) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 용해시켜 용해액을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 표적의 포획 방법을 제공한다: (a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하는 조건 하에 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 투여하는 단계; (b) 제1 포획 리간드를 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 융합물에 결합된 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계(여기서, 제2 포획 단백질 및 제2 포획 리간드는 공유 결합됨); 및 (c) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계. 일부 구현예에서, 방법은 세포를 용해시켜 용해액을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 리포터와의 융합물이다. 일부 구현예에서, 단계 (a) 및/또는 (b)의 산물은 세포 용해 없이 세포에서 배출된다(예로, 분비, 세포외배출, 능동 제거).

일부 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 세포의 세포 용해액, 세포 성분, 또는 세포 분획을 제공한다: (a) 생체활성 제제의 세포 표적, 및 (b) 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제; 세포 용해액은 추가로 다음을 포함한다: (c) 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 융합물(여기서, 제1 포획 리간드는 이들의 상호작용 시 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성함), 및 (d) 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면(여기서, 제2 포획 리간드는 이들의 상호작용 시 제2 포획 단백질과 공유 결합을 형성함). 일부 구현예에서, (a)는 생체활성 화합물의 복수의 세포 표적을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 리포터와의 융합물이다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 리포터이다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 단백질의 일부, 성분, 또는 서브유닛이다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 서열 목록 번호 3과 적어도 70% 서열 동일성(예로, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 단백질은 둘 다 서열 목록 번호 1과 적어도 70% 서열 동일성(예로, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%)을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합물은 동종이량체이다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 소분자이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 분자 조합, 예컨대 둘 이상의 단백질, 또는 단백질 및 핵산의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 포획 리간드 및 제2 포획 리간드는 동일한 분자 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 다음으로 구성된 목록으로부터 선택된다: 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 결합되며, 제1 포획 단백질은 제1 포획 리간드에 결합되고, 제2 포획 단백질은 고체 표면 상의 제2 포획 리간드에 결합된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상(예로 전부)을 포함하는 조성물 및 시스템(예로, 세포, 반응 혼합물, 키트, 용기 등)을 제공한다: (a) 생체활성 제제의 세포 표적; (b) 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제; 및 (c) 포획 단백질을 디스플레이하는 고체 표면(여기서, 포획 단백질은 이들의 상호작용 시 포획 리간드와 공유 결합을 형성함). 일부 구현예에서, (a)는 생체활성 화합물의 복수의 세포 표적을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포내에서 리포터와의 융합물로 발현된다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 리포터이다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 단백질의 일부, 성분, 또는 서브유닛이다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 서열 목록 번호 3과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 단백질은 서열 목록 번호 1과 적어도 70% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 (e) 고체 표면에 결합되거나 이로부터 방출된 생체발광을 측정하는 추가 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 소분자이다. 일부 구현예에서, 소분자는 합성 분자이다. 일부 구현예에서, 소분자는 단백질 기능의 저해제, 예컨대 효소 또는 수용체의 저해제이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 분자 조합, 예컨대 둘 이상의 단백질, 또는 단백질 및 핵산의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 분자 조합, 예컨대 둘 이상의 단백질, 또는 단백질 및 핵산의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 다음으로 구성된 목록으로부터 선택된다: 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 클로로알칸이다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 절단 가능한 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커 및 절단 가능한 링커를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 조성물 및 시스템(예로, 반응 혼합물, 키트, 용기 등)을 제공한다: (a) 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제; 및 (b) 포획 단백질을 디스플레이하는 고체 표면(여기서, 포획 단백질은 이들의 상호작용 시 포획 리간드와 공유 결합을 형성함). 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 세포 표적에 비공유적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포내에서 리포터와의 융합물로 발현된다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 리포터이다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 서열 목록 번호 3과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 단백질은 서열 목록 번호 1과 적어도 70% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 소분자이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 다음으로 구성된 목록으로부터 선택된다: 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 클로로알칸이다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 절단 가능한 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커 및 절단 가능한 링커를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 표적의 포획 방법을 제공한다: (a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하는 조건 하에 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 투여하는 단계; (b) 세포를 용해시켜 세포 용해액을 생성하는 단계; (c) 포획 단백질이 포획 리간드와 공유 결합을 형성하는 조건 하에 세포 용해액을 포획 단백질을 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계; 및 (d) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포내에서 리포터와의 융합물로 발현된다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 리포터이다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 서열 목록 번호 3과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 단백질은 서열 목록 번호 1과 적어도 70% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 소분자이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 다음으로 구성된 목록으로부터 선택된다: 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 클로로알칸이다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 절단 가능한 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커 및 절단 가능한 링커를 포함한다.

일부 구현예에서, 방법은 추가로 다음을 포함한다: (e) 세포 표적을 검출하거나 분석하는 단계. 다른 구현예에서, 방법은 추가로 다음을 포함한다: (e) 세포 표적을 고형 지지체로부터 용출하는 단계 및 (f) 세포 표적을 검출하거나 분석하는 단계. 일부 구현예에서, 세포 표적은 질량 분광측정(MS)을 이용해서 검출되거나 분석된다.

일부 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 세포의 세포 용해액을 제공한다: (a) 생체활성 제제의 세포 표적; 및 (b) 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제. 일부 구현예에서, 세포 용해액은 다음을 추가로 포함한다: (c) 포획 단백질을 디스플레이하는 고체 표면(여기서, 포획 단백질은 이들의 상호작용 시 포획 리간드와 공유 결합을 형성함). 일부 구현예에서, (a)는 생체활성 화합물의 복수의 세포 표적을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포에 대해 내인성이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 리포터와의 융합물이다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 리포터이다. 일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 단백질의 일부, 성분, 또는 서브유닛이다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 서열 목록 번호 3과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 단백질은 서열 목록 번호 1과 적어도 70% 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 소분자이다. 일부 구현예에서, 소분자는 합성 분자이다. 일부 구현예에서, 소분자는 단백질 기능의 저해제, 예컨대 효소 또는 수용체의 저해제이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제의 결합 파트너이다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 분자 조합, 예컨대 둘 이상의 단백질, 또는 단백질 및 핵산의 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 고체 표면은 다음으로 구성된 목록으로부터 선택된다: 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 비공유적으로 결합되며, 포획 단백질은 포획 리간드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 클로로알칸이다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 절단 가능한 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커 및 절단 가능한 링커를 포함한다.

도면

도 1은 포획 단백질(예로 HALOTAG)을 이용한 단백질 또는 단백질 복합체와 착화된 포획 리간드(예로, SM-HTL)에 속박된 생체활성 제제의 신속하고 특이적인 포획을 위한 본 발명의 구현예의 모식도를 나타낸다.

도 2는 다양한 방법을 이용한 단백질 복합체의 신속하고 특이적인 용출을 위한 본 발명의 구현예의 모식도를 나타낸다.

도 3은 다양한 포획 분석에서 발광에 대한 비드 부피, 및 SM-HTL의 존재 또는 부재의 효과를 도시하는 그래프를 나타낸다: (A) p38α 및 BIRB-클로로알칸, (B) HDAC6 및 SAHA-클로로알칸; (C) 과발현된 NANOLUC-p38α로의 BIRB-클로로알칸 풀다운; 및 (D) 과발현된 NANOLUC-HDAC6으로의 SAHA-클로로알칸 풀다운.

도 4는 항-p38 용해액을 이용한 웨스턴/은 염색, 이어서 p38α 및 BIRB-클로로알칸 포획 분석을 나타낸다.

도 5는 짧은 수명으로 약물에 결합하는 표적 단백질을 포획하기 위한 본 발명의 구현예의 능력을 도시하는 그래프를 나타낸다.

도 6은 클로로알칸 개질된 소분자를 이용한 세포로부터 표적 단백질의 풀다운을 위한 카르바메이트 클로로알칸 링커의 이용을 도시하는 그래프를 나타낸다.

도 7은 배경 대비 신호에 대한 다양한 방출 방법의 효과를 도시하는 그래프를 나타낸다.

도 8은 (A) 메토트렉세이트-CA로의 DHFR(21kDa)의 특이적 풀다운을 나타내는 웨스턴 블롯, 및 (B) HEK293 세포로부터 메토트렉세이트-CA에 의해 풀다운된 단백질의 질량 분광측정 분석을 나타낸다.

도 9는 (A) BIRB-CA로의 p38(41kDa)의 특이적 풀다운을 나타내는 웨스턴 블롯, 및 (B) HEK293 세포로부터 BIRB-CA에 의해 풀다운된 단백질의 질량 분광측정 분석을 나타낸다.

도 10은 속박된 생체활성 제제, SAHA의 투과도 및 효능에 대한 클로로알칸 개질의 최소 영향을 나타낸다.

도 11은 저친화도 표적(HDAC8) 및 저풍부도 표적(HDAC3)을 포함하여 SAHA의 모든 기지의 표적이 본 발명의 구현예를 이용하여 세포로부터 특이적으로 풀다운될 수 있음을 나타낸다. (A) SAHA-CA를 이용한 모든 기지의 표적의 특이적 풀다운을 나타내는 웨스턴 블롯 및 (B) HEK293 세포로부터 SAHA-CA에 의해 단백질 풀다운의 질량 분광측정 분석.

도 12는 바이오틴 개질에 비해 생체활성 제제, SAHA의 투과도 및 효능에 대한 클로로알칸 개질의 최소 영향을 나타낸다.

도 13은 저친화도 표적(HDAC8) 및 저풍부도 표적(HDAC3)을 포함하여 SAHA-CA에 의해 K562 세포로부터 SAHA의 모든 기지의 표적이 특이적으로 풀다운되는 반면, SAHA-바이오틴에 의해서는 HDAC6만 풀다운됨을 나타내는 웨스턴 블롯을 나타낸다.

정의

본원에서 이용되는 용어 "포획 단백질"은 이들과의 상호작용 시 그 기질 및/또는 리간드와 안정한 공유 결합을 형성하는 단백질을 나타낸다. 포획 단백질은 그 리간드에 결합 시 공유 결합을 형성하는 수용체 또는 그 기질과 공유 결합을 형성하는 효소일 수 있다. 본 발명의 구현예에서 이용하기 위한 적합한 포획 단백질의 예는 U.S. 특허 번호 7,425,436(본원에 그 전문이 참조로 도입됨)에 기재된 HALOTAG 단백질이다.

본원에서 이용되는 용어 "포획 융합물"은 포획 단백질의 둘 이상의 사본의 융합물을 나타낸다. 용어 "포획 이량체"는 또한 두 포획 단백질의 융합물(예로, 이종이량체, 동종이량체 등)을 나타내기 위해 이용될 수 있다. 포획 단백질은 융합물 내의 각각의 포획 단백질이 기질 및/또는 리간드와 공유 결합을 형성할 수 있도록 하는 방식으로 안정하게 연결(예로 공유적으로), 속박, 및/또는 융합된다. 포획 단백질은 서로 직접 부착될 수도 있고 또는 링커(예로, 펩티드 또는 다른 사슬 또는 중합체)에 의해 분리될 수도 있다. 포획 단백질은 융합 단백질(예로, 링커를 포함하거나 포함하지 않음)로 발현될 수도 있고, 또는 발현-후 화학적으로 또는 효소적으로 연결될 수도 있다.

본원에서 이용되는 용어 "포획 리간드"는 이들과 상호작용 시 포획 단백질과 공유 결합을 형성하는 리간드, 기질 등을 나타낸다. 본 발명의 구현예에서 이용하기 위한 적합한 포획 리간드의 예는 U.S. 특허 번호 7,425,436(본원에 그 전문이 참조로 도입됨)에 기재된 HALOTAG 리간드이다.

본원에서 이용되는 용어 "세포 표적"은 단백질, 폴리펩티드, 핵산(예로, DNA 또는 RNA), 다당류 또는 폴리펩티드(들)와 함께 이들 중 임의를 포함하는 복합체를 나타낸다. 세포 표적은 하나 이상의 성분, 서브유닛 또는 폴리펩티드로 이루어질 수 있다, 예로 세포 표적은 단백질 복합체이다. 세포 표적의 예에는 수용체 또는 효소가 포함될 수 있다.

본원에서 이용되는 용어 "생체활성 제제"는 일반적으로 임의의 생리 또는 약리 활성 물질 또는 검출을 위해 적합한 물질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 잠재적인 치료 화합물(예로, 소분자, 펩티드, 핵산 등), 또는 약물-유사 분자이다. 본원에 기재된 구현예에서 이용하기 위한 생체활성 제제는 크기 또는 구조에 의해 제한되지 않는다.

상세한 설명

본 발명은 생체활성 제제의 세포 표적의 포획 및 확인을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 포획 리간드, 세포 표적(내인성 또는 선택적으로 리포터로 태그됨), 포획 단백질(선택적으로 포획 융합물로 존재함), 표면(예로, 포획 리간드, 포획 단백질 또는 포획 융합물을 디스플레이함)에 속박된 생체활성 제제 및 생체활성 제제의 세포 표적을 포획 및 확인하는 방법이 본원에 제공된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 세포에서 생체활성 제제(예로, 소분자 및/또는 약물-유사 분자)의 세포 표적(예로, 단백질 또는 단백질 복합체(들))의 발견 및 검증을 위한 민감한 방법을 제공한다(도 1 참고). 일부 구현예에서, 본 발명은 표현형 스크리닝 분석의 일환으로 또는 이에 동반하는 용도를 구한다. 예를 들어, 표현형 스크리닝에서 원하는 표현형 반응을 나타내는 소분자 세트는 각각 화학적 합성 또는 효소적 수단에 의해 포획 리간드(예로, HALOTAG 리간드)에 속박된다. 세포는 세포 표적(내인성 또는 선택적으로 리포터와 융합됨)이 관여되고 표현형 반응(예로, 동일 반응, 유사 반응(예로, ±1%... ±2%... ±5%... ±10%... ±20%... ±30%... ±50% 등)을 재생성하는 소분자/포획 리간드 콘주게이트(예로, 소분자-HALOTAG 리간드 콘주게이트(SM-HTL))로 처리된다. 일부 구현예에서, 세포는 이어서 용해되고, 이제 생체활성 제제를 통해 포획 리간드에 연결된 세포 표적은 포획 리간드(예로, HALOTAG 리간드)와 포획 융합물(예로, HALOTAG 탈수소효소(예로, 그 기질에 공유 결합하기 위해 개질된 탈수소효소)) 또는 포획 단백질(예로, HALOTAG 탈수소효소(예로, 그 기질에 공유 결합하기 위해 개질된 탈수소효소))이 디스플레이된 표면의 결합에 의해 포획된다. 일부 구현예에서, 포획 융합물은 용액 중에 있다(이후 고체 표면에 결합된다). 다른 구현예에서, 포획 단백질 또는 포획 융합물은 고체 표면(예로, 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등에 결합된다(예로, 포획 융합물은 그 표면 상에 포획 리간드를 디스플레이하는 표면에 결합된다)). 일부 구현예에서, 일단 세포가 용해되면, 이제 생체활성 제제를 통해 포획 리간드에 연결된 세포 표적은 포획 리간드(예로, HALOTAG 리간드)와 고체 표면(예로, 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등) 상에 디스플레이된 포획 단백질(예로, 이량체가 아님)의 결합에 의해 포획된다(도 1, 하부 도식 참고).

일부 구현예에서, 내인성 표적(예로, 소분자의 기지 및 미지의 표적)의 포획 또는 "풀다운"을 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 소분자/포획 리간드 콘주게이트(예로, SM-HTL)에 결합된 내인성 단백질이 이어서 포획 단백질(예로, 표면(예로, 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등) 상에 디스플레이됨)에 의해 공유 결합된다(예로, 풀다운된다). 이러한 풀다운 방법에는 포획된 단백질을 확인하기 위한 분석이 뒤따를 수 있다(예로, 표면으로부터 내인성 표적의 용출 후). 분석 기법에는 웨스턴 블롯팅, 겔 전기영동, 질량 분광측정, 핵 자기 공명 분광측정 등이 포함될 수 있다. 본원에 제공된 시스템, 조성물, 및 방법은 이러한 맥락에서 이용되는 경우, 여러 장점을 제공한다. 특정 구현예에서, 세포 내 클로로알칸-약물 콘주게이트(예로, HTL-SM)의 결합은 특이적 상호작용을 촉진하여 저친화도 표적의 더 높은 포획 개연성으로 이어진다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법의 속도 및 효율(예로, 내인성 표적의 공유 포획을 위해 <30분(예로, <25분, <20분, <15분, <10분, <5분, <1분)은 복합체 붕괴를 최소화하고(예로, 이차 표적(예로, SM-HTL에 의해 결합된 표적과 비공유적으로 상호작용하는 단백질)의 확인을 보존하고 저친화도 상호작용을 보존한다. 다른 구현예에서, 신속한 포획은 비특이적 포획을 최소화한다. 특정 구현예에서, 콘주게이트되지 않은 약물과의 경쟁에 의한 내인성 표적의 방출은 저풍부도 표적의 검출을 증가시키는 배경을 감소시킨다.

특정 구현예에서, 표면-(포획 리간드)-(포획 융합물)-(포획 리간드)-(생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체의 정제(예로, 표면 정제에 의해(예로, 기계적 분리, 세척 등)) 후, 세포 표적이 임의의 적합한 기전에 의해 고체 표면(예로, 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등)으로부터 방출되거나 용출된다(도 2, 상부 도식 참고). 일부 구현예에서, 과량의 속박되지 않은 생체활성 제제가 포획-리간드-속박된 생체활성 제제에서 벗어난 세포 표적과 경쟁하기 위해 시스템에 첨가된다. 다른 구현예에서, (포획 단백질)-(포획 리간드)-(생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체를 방출시키기 위해, 포획 융합물의 두 포획 단백질 간 연결(예로, TEV 프로테아제 절단 부위)이 절단된다(예로, 화학적으로, 효소적으로). 또 다른 구현예에서, (생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체를 방출시키기 위해, 포획 리간드 및 생체활성 제제 간 연결이 절단된다(예로, 화학적으로, 효소적으로). 일부 구현예에서, 링커의 전부 또는 일부는 절단 후 하나 또는 두 방출된 성분에 부착된 채 유지된다.

다른 구현예에서, 표면-(포획 단백질)-(포획 리간드)-(생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체의 정제(예로, 표면의 정제에 의해(예로, 기계적 분리, 세척 등) 후, 세포 표적은 임의의 적합한 기전에 의해 고체 표면(예로, 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등)으로부터 방출되거나 용출된다(도 2, 하부 도식 참고). 일부 구현예에서, 과량의 속박되지 않은 생체활성 제제가 포획-리간드-속박된 생체활성 제제에서 벗어난 세포 표적과 경쟁하기 위해 시스템에 첨가된다. 다른 구현예에서, 리포터를 방출시키기 위해, 리포터 및 세포 표적 간 연결(예로, TEV 프로테아제 절단 부위)이 절단된다(예로, 화학적으로, 효소적으로). 다른 구현예에서, (생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체를 방출하기 위해, 포획 리간드 및 생체활성 제제 간 연결이 절단된다(예로, 화학적으로, 효소적으로). 다른 구현예에서, 포획 단백질이 표면으로부터 방출되고, 이에 따라 전체 (포획 단백질)-(포획 리간드)-(생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체가 방출된다. 세포 표적이 리포터에 융합/연결되는 임의의 구현예에서, 달리 명시되지 않는 한(예로, 세포 표적 및 리포터 간 연결의 절단 시), 리포터는 세포 표적을 포함하는 임의의 복합체에 연결된 채 유지된다.

세포 표적이 리포터 분자(예로, 형광단, 루시퍼라아제 등)에 부착/융합되는 일부 구현예에서, 포획 복합체로부터 방출된 세포 표적은 리포터로부터 신호를 생성하고/하거나 검출함으로써 검출된다. 세포 표적이 리포터 분자(예로, 형광단, 루시퍼라아제 등)에 부착/융합되는 다른 구현예에서, 포획 복합체에 여전히 결합된 세포 표적은 리포터로부터 신호를 생성하고/하거나 검출함으로써 검출된다. 일부 구현예에서(예로, 세포 표적이 리포터 분자에 부착/융합되지 않음), 포획 복합체로부터 방출된 세포 표적이 분석되고/되거나 확인된다(예로, 생물리적 및/또는 생화학적 분석(예로, 질량 분광측정, 분광측정 등)에 의해).

생체활성 제제의 세포 표적의 포획은 포획 리간드(예로, 소분자(예로, HALOTAG 리간드))의 포획 단백질(예로, 수용체 단백질, HALOTAG 탈수소효소 등)과의 상호작용(예로, 공유 또는 비-공유)에 의해 촉진된다. 특정 구현예에서, 포획 리간드/포획 단백질 상호작용은 본원에 기재된 포획 시스템 및 방법의 별도 단계에서 2회 일어난다(도 1 참고). 첫 번째로, 포획 리간드가 관심 생체활성 제제에 속박되거나 또는 부착된다. 생체활성 제제가 그 세포 표적에 결합되면(예로, 생체내), 포획 융합물(예로, 포획 대상체의 동종이량체)이 첨가되고, 포획 리간드가 포획 대상체 중 하나에 결합된다. 다음으로, 복수의 동일한 포획 리간드를 디스플레이하는 고형 지지체가 첨가되며, 결합되지 않은 절반의 포획 융합물이 표면에 결합한다. 이제 세포 표적은 두 포획 리간드/포획 단백질 상호작용에 의해 고형 지지체에 속박된다(도 1 참고). 대안적 구현예에서, 포획 융합물은 분석에 첨가하기 전에(그리고 생체활성 제제에 속박된 포획 리간드의 결합 전에) 고형 지지체에 결합된다(예로, 표면 디스플레이된 포획 리간드와의 그 상호작용을 통해). 어느 대안이든 동일한 포획 구조를 생성한다.

다른 구현예에서, 포획 단백질은 포획 융합물이 아닌 포획 단량체로 존재한다. 일부 구현예에서, 그 표면 상에 포획 단량체(예로, HALOTAG 탈수소효소)를 디스플레이하는 고형 지지체(예로, 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등)가 제공된다. 생체활성 제제에 속박된 포획 리간드는 포획 리간드(예로, HALOTAG 리간드) 및 포획 단백질(예로, HALOTAG)이 상호작용하는 경우, 표면 상에 고정된다. 생체활성 제제가 세포 표적(예로, 리포터에 의해 태그됨)과 상호작용한 경우(예로, 안정하게, 평형 시 등), 세포 표적은 고형 지지체에 연결되게 된다(예로, 생체활성 제제, 포획 리간드, 및 포획 단백질을 통해).

특정 구현예에서, 본원에서 조성물, 방법, 및 시스템은 생체활성 제제를 제공한다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제 및 포획 리간드의 콘주게이트가 제공된다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 세포 생물학과 상호작용할 수 있는 임의의 소분자, 거대분자, 또는 분자 복합체이다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제 및 포획 리간드(예로, HALOTAG 리간드)는 임의의 적합한 구조 또는 기전에 의해 융합되거나, 속박되거나, 연결된다(예로, 화학적으로 연결되거나(예로, 직접적으로 또는 간접적으로), 효소적으로 연결되거나, 링커(예로, 펩티드, 핵산, 중합체, 에스테르 결합, PEG 링커, 탄소쇄 등)에 의해 연결됨). 연결의 유형은 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

일부 구현예에서, 포획 리간드는 생체활성 제제를 포함하고/하거나 링커 모이어티에 의해 이에 속박된다. 일부 구현예에서, 링커 모이어티는 포획 리간드의 일부이다. 일부 구현예에서, 링커 모이어티는 생체활성 제제의 부착을 위해 커플링 화학을 통해 포획 리간드에 부가된다. 일부 구현예에서, 링커 모이어티는 포획 리간드의 부착을 위해 커플링 화학을 통해 생체활성 제제에 부가된다. 본 발명은 임의의 특정 링커 모이어티에 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 링커 모이어티가 고려되며, 적합한 링커는 비제한적으로 알킬기, 메틸렌 탄소쇄, 에테르, 폴리에테르, 알킬 아미드 링커, 펩티드 링커, 개질된 펩티드 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 링커, 스트렙타비딘-바이오틴 또는 아비딘-바이오틴 링커, 폴리아미노산(예로 폴리라이신), 관능화된 PEG, 다당류, 글리코사민 올리고글리칸, 수지상 중합체(이들의 전문이 본원에 참조로 도입된 WO93/06868 및 Tomaiia 등. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29: 138-175(1990)), PEG-킬레이트제 중합체(이들의 전문이 본원에 참조로 도입된 W94/08629, WO94/09056 및 WO96/26754), 올리고뉴클레오티드 링커, 인지질 유도체, 알케닐쇄, 알키닐쇄, 디설피드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 임의 조합의 알킬, 알케닐, 알키닐, 페닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 벤질, 할로, 플루오로, 클로로, 브로모, 브로모, 요오도, 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 카르보네이트 에스테르, 카르복실레이트, 카르복실, 에스테르, 히드로페록시, 페록시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 오르소에스테르, 아미드, 아민, 이민, 이미드, 아지드, 아조, 시아네이트, 니트레이트, 니트라이트, 니트릴, 니트로, 니트로소, 피리딘, 티올, 설피드, 디설피드, 설폭시드, 설폰, 설핀산, 설폰산, 티오시아네이트, 티온, 티알, 포스핀, 포스폰산, 포스페이트, 및/또는 포스포디에스테르기를 포함한다. 임의의 적합한 관능기를 이용하는 임의의 적합한 링커는 본 발명의 구현예의 범위 내이다. 특정 구현예에서, 링커는 카르바메이트 링커이다. 일부 구현예에서, 생체활성 제제는 링커에 의해 포획 리간드에 부착되며, 관심 대상체의 부착은 가역적이다(예로, 절단 가능함(예로, 광절단 가능함, 화학적으로 절단 가능함, 효소적으로 절단 가능함)). 일부 구현예에서, 링커는 세포 투과성이다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 본원에 기재된 다른 성분(예로, 포획 단백질)의 부착 또는 속박에서의 용도를 구한다.

일부 구현예에서, 포획 리간드(및 링커)는 -O(CO)NH(CH₂CH₂O)_y-(CH₂)_x-할로겐을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 y는 1-8이고, x는 2-20이고, 할로겐은 Cl, Br, 또는 F이다(예로, -O(CO)NH(CH₂CH₂O)₂(CH₂)_xCl, O(CO)NH(CH₂CH₂O)₂(CH₂)₆-할로겐, O(CO)NH(CH₂CH₂O)₂(CH₂)₆-Cl 등).

특정 구현예에서, 생체활성 제제의 라이브러리(예로, >10 제제, >50 제제, >100 제제, >500 제제, >1000 제제, >5000 제제, >10,000 제제, >50,000 제제 등)가 제공된다. 일부 구현예에서, 표현형 효과 및/또는 활성에 대한 생체활성 제제의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 표현형 효과 및/또는 활성의 생성, 야기, 유도 등에 관여하는 라이브러리 중 임의의 생체활성 제제의 세포 표적의 포획 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 생체활성 제제(예로, 표현형 효과 및/또는 활성에 관여하는 생체활성 제제)의 세포 표적의 포획, 확인, 분석 등의 수단을 제공한다.

일부 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제(예로, 소분자, 단백질, 핵산, 지질 등)에 대해 임의의 적합한 결합/상호작용 파트너(예로, 수용체, 효소)를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포 표적은 생체활성 제제에 결합하거나 달리 상호작용하는(예로, 안정적으로, 특이적으로, 비공유적으로, 평형 시 등) 단백질이다. 보다 구체적인 구현예에서, 세포 표적은 소분자 생체활성 제제에 결합하거나 달리 상호작용하는(예로, 안정적으로, 특이적으로, 비공유적으로, 평형 시 등) 수용체 단백질 또는 효소이다. 본 발명은 세포 표적의 동일성, 유형, 또는 클래스에 의해 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 수백, 수천, 수만 개 초과의 상이한 세포 표적의 라이브러리는 본 발명에서의 용도를 구한다.

일부 구현예에서, 세포 표적은 분석이 수행될 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포 표적에 대해(예로 세포 표적의 과발현이 없음) 내인성 수준(예로 천연 풍부도)이나 그 근처로 발현된다. 일부 구현예에서, 본원에서의 방법은 이들의 천연 또는 내인성 풍부도나 그 근처로 세포에 존재하는 세포 표적의 포획을 허용하며, 이에 따라 분석의 생물학적 관련성을 최대화한다. 특정 구현예에서, 방법이 세포 표적의 내인성 수준에서 포획을 허용하기 때문에, 방법은 생체활성 제제(예로, 과발현하는 것이 적합하게 나타나지 않을 것들)의 미지의 표적의 포획을 위해 유용하다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포에 대해 내인성이다.

특정한 예시적 구현예에서, 포획 단백질은 본원에서 "HALOTAG 탈수소효소"로 나타내는, 그 기질과 공유 결합을 형성하기 위해 개질된 탈수소효소이며(예로, U.S. 특허 번호 7,425,436; U.S. 특허 번호 7,429,472; U.S. 특허 번호 7,867,726; U.S. 특허 번호 7,888,086; U.S. 특허 번호 7,935,803; U.S. 특허 번호 RE42.931; U.S. 특허 번호 8,168,405; U.S. 특허 번호 8,202,700; U.S. 특허 번호 8,257,939 참고; 본원에 이들의 전문이 참조로 도입됨), 포획 리간드는 본원에서 "HALOTAG 리간드"로 나타내는 HALOTAG 탈수소효소에 대한 기질, 예를 들어 할로알칸이다. 일부 구현예에서, 포획 단백질은 서열 목록 번호 1과 적어도 70% 서열 동일성(예로, 75% 동일성, 80% 동일성, 85% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성, 98% 동일성, 99% 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 포획 리간드는 카르바메이트 링커를 갖는 클로로알칸 리간드, 예로 카르바메이트 클로로알칸이다.

일부 구현예에서, 리포터는 특정 조건(예로, 에너지 흡수 시)에 의해 유발되는 경우 신호(예로 형광, 공명 에너지 등)를 생성, 표시, 및/또는 방출할 수 있는 대상체이다. 특정 구현예에서, 본원에서 조성물, 방법, 및 시스템은 세포 표적 및 리포터(예로, 생체발광 리포터(예로, 루시퍼라아제(예로, NANOLUC)))의 융합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포 표적 및 리포터는 임의의 적합한 구조 또는 기전에 의해 융합되거나, 속박되거나, 연결된다(예로, 융합 구축물로 발현되거나(예로, 펩티드 링커를 포함하거나 포함하지 않고), 화학적으로 연결되거나(예로, 직접적으로 또는 간접적으로), 효소적으로 연결되거나, 링커(예로, 펩티드, 핵산, 다른 중합체(예로, 에스테르 결합, PEG 링커, 탄소쇄 등))에 의해 연결됨).

일부 구현예에서, 리포터는 생체발광 리포터이다(예로, 세포 표적과의 융합 단백질로 발현된다). 특정 구현예에서, 생체발광 리포터는 루시퍼라아제이다. 일부 구현예에서, 루시퍼라아제는 옴팔로투스 올레아리우스(Omphalotus olearius), 초파리(예로, 포티니니(Photinini)), 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis), 애쿠오리아(Aequoria), 이들의 돌연변이체, 이들의 일부, 이들의 변이체에서 발견된 것들, 및 본원에 기재된 시스템 및 방법에 적합한 임의의 다른 루시퍼라아제 효소에서 선택된다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 오플로포러스(Oplophorus)로부터의 개질되고 증강된 루시퍼라아제 효소이다(예로, Promega Corporation의 NANOLUC 효소, 서열 목록 번호 3 또는 이에 대해 적어도 70% 동일성(예로, >70%, >80%, >90%, >95%)을 갖는 서열). 일부 구현예에서, 단백질 센서는 열안정성 포투리스 펜실바니카(Photuris pennsylvanica) 루시퍼라아제이다. 예시적 생체발광 리포터는, 예를 들어 U.S. 특허 출원 번호 2010/0281552 및 U.S. 특허 출원 번호 2012/0174242에 기재되며, 둘 다 본원에 이들의 전문이 참조로 도입된다.

일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 NANOLUC을 포함한다(본원에 이들의 전문이 참조로 도입된 U.S. 특허 출원 번호 2010/0281552 및 2012/0174242 참고). 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 생체발광 특징을 보유하는 서열 목록 번호 3에 적어도 70% 동일성(예로, >70%, >80%, >90%, >95%)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, NANOLUC 효소, 또는 이들의 변이체의 이용은 포획 세포 표적의 검출을 허용하는(예로, 저농도에서) 특징(예로, 신호 강도, 휘도, 높은 광 출력, 좁은 스펙트럼 등)을 제공한다. 일부 구현예에서, NANOLUC의 높은 광 출력은 저농도(예로, <1μΜ, <100nM, <10nM, <1nM 등)의 분석 성분(예로, NANOLUC의 발현을 위한 DNA)을 생리적 관련 조건 하에서 분석을 수행하기 위해 유용하게 만든다. 일부 구현예에서, NANOLUC은 표현형 스크리닝에서 확인된 포획된 세포 표적의 검출을 가능케 한다.

일부 구현예에서, 생체발광 리포터에 대한 기질이 제공된다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 기질을 반응 산물로 전환하고, 광 에너지, 예로 발광을 부산물로 방출한다. 일부 구현예에서, 기질은 루시퍼라아제 효소에 대한 기질이다. 일부 구현예에서, 기질은 오플로포러스(Oplophorus)로부터의 개질되고 증강된 루시퍼라아제 효소, 예로 Promega Corporation의 NANOLUC 효소(서열 목록 번호 3)에 대한 기질이다. 일부 구현예에서, 기질은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진 유도체, 코엘렌테라진의 구조적 또는 기능적 균등체, 코엘렌테라진과 실질적으로 동등한 분자(예로, 구조적으로 및/또는 기능적으로), 또는 코엘렌테라진과 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 생체발광 리포터는 코엘렌테라진, 코엘렌테라진 유도체, 코엘렌테라진의 구조적 또는 기능적 균등체, 또는 코엘렌테라진의 실질적 균등체를 코엘렌테르아미드, 코엘렌테르아미드 유도체, 코엘렌테르아미드의 구조적 또는 기능적 균등체, 또는 코엘렌테르아미드의 실질적 균등체로 전환시키고 광 에너지를 부산물로 방출한다.

일부 구현예에서, 세포 표적은 부착된 리포터의 특징(예로, 형광, 발광, 질량(예로, 질량 분광측정(MS)에 의해), 방사활성, 효소 활성 등)에 기반하여 검출된다. 일부 구현예에서, 세포 표적은 세포 표적의 특징(예로, 형광, 발광, 질량(예로, 질량 분광측정(MS)에 의해), 방사활성 등)에 기반하여 검출된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 다중(예로 2개의) 포획 단백질의 융합물을 제공한다. 일부 구현예에서, 두 포획 단백질은 융합되는 경우(예로 이량체화되는 경우) 이들의 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 두 포획 단백질은 이들 각각의 포획 리간드에 공유 결합하는 능력을 보유한다. 일부 구현예에서, 포획 융합물은 두 상이한 포획 단백질의 이종이량체이다(예로, 상이한 포획 리간드에 결합한다). 다른 구현예에서, 포획 융합물은 동일한 포획 리간드에 결합하는 동일한 아미노산 서열을 갖는 두 포획 단백질의 동종이량체이다. 일부 구현예에서, 두 포획 단백질은 공유 연결된다. 일부 구현예에서, 포획 단백질은 말단끼리 연결된다(예로, N-C―N-C, N-C―C-N, C-N―N-C, C-N―C-N). 일부 구현예에서, 포획 융합물은 두 융합된 단백질로 발현된다. 일부 구현예에서, 두 포획 단백질은 발현-후 부착되어(예로, 화학적으로, 효소적으로 등) 포획 융합물을 생성한다. 일부 구현예에서, 포획 단백질(예로, HALOTAG 단백질)은 임의의 적합한 구조 또는 기전에 의해 융합되거나, 속박되거나, 연결된다(예로, 융합물로 발현되거나, 화학적으로 연결되거나(예로, 직접적으로 또는 간접적으로), 효소적으로 연결되거나, 링커(예로, 펩티드, 핵산, 중합체, 에스테르 결합, PEG 링커, 탄소쇄 등)에 의해 연결됨). 연결 유형이 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 일부 구현예에서, 두 포획 단백질은 직접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 두 포획 단백질은 링커에 의해 분리된다. 임의의 적합한 링커(예로, 펩티드(예로, 프로테아제 절단 부위(예로, TEV 절단 부위)를 포함함), 다른 중합체, 알킬쇄, 치환된 알킬쇄 등)는 포획 융합물의 포획 단백질 연결에서 용도를 구할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 또는 두 포획 단백질은 서열 목록 번호 1과 70% 이상의(예로, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%) 서열 동일성을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 단량체로(예로, 포획 융합물로가 아니라) 포획 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 포획 단백질은 고체 표면(예로, 웰, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 매트릭스, 수지, 마이크로 유체 채널, 모세관, 비드, 입자(예로, 마이크로입자, 나노입자 등) 등)에 연결된다. 일부 구현예에서, 복수의 포획 단백질(예로, 단량체로)은 표면에 부착된다. 일부 구현예에서, 포획 단백질(예로, HALOTAG 단백질)은 임의의 적합한 구조 또는 기전에 의해 융합되거나, 속박되거나, 연결된다(예로, 융합물로 발현되거나, 화학적으로 연결되거나(예로, 직접적으로 또는 간접적으로), 효소적으로 연결되거나, 링커(예로, 펩티드, 핵산, 중합체, 에스테르 결합, PEG 링커, 탄소쇄 등)에 의해 연결됨). 연결 유형이 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 단백질 또는 단백질 복합체가 세포 내에서 생체활성 소분자의 결합 표적인지에 대한 발견 및 검증을 위한 민감한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법에는 원하는 표현형 반응(예로, 표현형 스크리닝으로부터 결정됨)을 갖는 소분자 라이브러리의 선택 및 임의의 적합한 수단(예로 화학적 합성)에 의한 포획 리간드(예로, HALOTAG 리간드)의 부착이 관여된다. 이어서 세포는 표현형 반응을 재생성하기 위해 소분자/포획 리간드(SM/CL)로 처리된다. 일부 구현예에서, SM/CL 화합물은 세포 투과성이다. 일부 구현예에서, 세포 투과도는 표현형 반응의 재생성을 가능케 한다. 일부 구현예에서, 클로로알칸 및 카르바메이트는 세포 투과도의 보존 및/또는 증강에 매우 적합하다. 일부 구현예에서, 세포가 이어서 용해되고, 단백질 또는 단백질 복합체에 부착된 SM/CL이 포획된다. 일부 구현예에서, 단백질 복합체에 결합된 SM/CL의 포획은 단백질 상호작용체의 해리를 최소화하고/하거나 다른 단백질의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 신속한 포획을 허용하는 두 포획 단백질의 융합물(aka "포획 융합물" 또는 "포획 이량체")에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 포획은 낮은 비특이적 결합 특성을 갖는 고형 지지체 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 단백질(예로, 세포 표적)은 고특이도로 용출되어, 배경을 추가 감소시킴으로써 더 우수한 표적 확인을 가능케 한다.

일부 구현예에서, 포획 융합물(예로, HALOTAG 이량체) 또는 포획 단백질(예로, HALOTAG)은 소분자/HALOTAG 리간드 콘주게이트와 함께 고처리량 포맷으로 양성 상호작용의 검증에 유용하다.

일부 구현예에서, 포획 융합물(예로, HALOTAG 이량체) 또는 포획 단백질(예로, HALOTAG)은 세포 표적(예로, 단백질 또는 단백질 복합체)에 결합된 SM-CL의 신속한 포획을 위해 제공된다. 일부 구현예에서, HALOTAG 이량체 또는 포획 단백질(예로, HALOTAG)은 생체활성 제제의 세포 표적에 결합된 생체활성 제제/HALOTAG 리간드 콘주게이트의 포획을 위해 이용된다. 다른 포획 시스템에 비해 장점을 제공하는 HALOTAG 이량체 및/또는 HALOTAG 단백질의 특징, 예를 들어 a) HALOTAG와 HALOTAG 리간드(예로, 리간드가 큰 단백질 또는 단백질 복합체와 착화되는 경우에도) 반응의 신속한 역학 및 b) 신속한 포획이 두 상이한 포맷을 이용해서 달성된다(도 1). 일부 구현예에서, HALOTAG 이량체(또는 다른 포획 융합물) 또는 HALOTAG 단백질(또는 다른 포획 단백질)이 HALOTAG 리간드(또는 다른 포획 리간드)의 공유 포획을 위한 HALOTAG 단백질 비드(또는 다른 단백질 포획 비드)를 제조하기 위해 이용된다. HALOTAG(또는 다른 포획 단백질)는 기능적 효율성을 보존하기 위해 배향된다. 또한, 비드에 대한 HALOTAG 이량체 결합은 정량적이며, 이에 따라 비드 표면에서 단백질 밀도의 정확한 제어를 허용한다. 다른 구현예에서, HALOTAG 이량체(또는 다른 포획 융합물)가 소분자/HALOTAG 리간드(또는 다른 포획 리간드) 및 단백질 복합체의 결합을 위한 신속한 용액 기반 역학의 장점을 이용하기 위해 소분자/HALOTAG 리간드(또는 다른 포획 리간드)에 대해 특정한 화학양론적 과량으로 용액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 포획 융합물, 포획 단백질, 포획 리간드, 및/또는 최적화된 HALOLINK 비드를 디스플레이하는 표면이 복합체의 특이적 포획을 위해 이용된다. 일부 구현예에서, 하류 검출(예로, 질량 분광측정)을 위해 비드로부터의 단백질 복합체의 용출은 정확한 '히트'를 확인하는데 결정적이다. 일부 구현예에서, 포획 융합물(예로, HALOTAG 이량체)은 임의의 비특이적으로 결합된 단백질을 놔두고 복합체의 선택적인 용출을 허용하는(예로, 배경 대비 신호를 개선하는) TEV 절단 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 리간드(예로, HALOTAG 리간드)로 활성화된 멀티웰 플레이트를 이용함으로써, 분석이 고처리량 포맷(예로, 검증용)으로 전환된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 포획 단백질(예로, HALOTAG, HALOTAG 이량체 등)을 디스플레이하는 표면을 제공한다. 일부 구현예에서, 그 표면 상에 포획 단백질에 대한 리간드(예로, HALOTAG 리간드)를 디스플레이하는 표면이 제공된다. 포획 융합물이 표면에 첨가되고 표면 상에 고정된다. 이어서 그 표면 상에 고정된 포획 융합물을 갖는 표면이 (포획 리간드)-(생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체를 포획하기 위해 이용된다. 다른 구현예에서, 그 표면에 포획 단백질의 고정을 허용하는 관능기를 디스플레이하는 표면이 제공된다. 임의의 적합한 화학이 이러한 고정을 위해 이용될 수 있다. 포획 단백질이 표면에 첨가되고 표면 상에 고정된다(예로, 화학적으로, 효소적으로, 직접적으로, 링커를 통해 등). 이어서 그 표면 상에 고정된 포획 단백질을 갖는 표면이 (포획 리간드)-(생체활성 제제)-(세포 표적) 복합체를 포획하기 위해 이용된다.

실험

실시예 1

생체활성 제제의 세포 표적을 포획하는 포획 리간드/포획 융합 방법의 기능성을 나타내기 위해, 본 발명의 구현예 개발 동안 실험을 수행하였다.

HEK239T 세포를 96-웰 또는 6-웰 플레이트의 웰에서 성장시켰다. 세포를 NANOLUC-p38 알파 또는 NANOLUC-HDAC6(히스톤 데아세틸라아제 6) 융합 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA로 일시적으로 전달감염시키고, 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이어서 10μΜ의 클로로알칸-약물 콘주게이트 BIRB-클로로알칸(p38을 위해) 또는 SAHA-클로로알칸(HDAC6을 위해)을 세포에 첨가하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군은 클로로알칸-약물 콘주게이트가 없는 세포를 함유하였다. 이어서 배지를 제거하고, 세포를 1xPBS 중에 세척하였다. 세포를 10분 동안 HALOTAG 단백질 이량체(서열 목록 번호 1의 이량체) 및 DNase I을 함유하는 포유류 용해 완충액(Promega Corp.)으로 용해시켰다. 그 뒤, MAGNE HALOLINK 비드(1㎕ 층 부피)를 용해된 세포에 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션한다. 용해액 및 비드를 세척 완충액(25mM Tris pH 7.5; 100mM NaCl; 0.005% IGEPAL) 중 진탕하면서 3분 동안 3회 세척한다. 이어서 복합체를 1시간 동안 150μΜ의 콘주게이트되지 않은 약물을 이용해서 비드로부터 용출하고, 용출액 중 NANOLUC 루시퍼라아제로부터의 발광을 검출하기 위해 발광을 측정하였다(도 3a-d). 항-p38을 이용한 용해액의 웨스턴/은 염색 분석도 수행하였다(도 4).

실시예 2

상이한 양의 HALOTAG 단백질 이량체(서열 목록 번호 1의 이량체)를 표 1에 나타낸 바와 같이 BIRB-클로로알칸(예로, 생체활성-제제/포획-리간드 콘주게이트)으로 처리되었거나 처리되지 않은 NANOLUC-p38 융합 단백질(예로, 리포터/세포-표적 융합물)을 발현하는 세포 용해액에 첨가하였다. 15분 인큐베이션 후, 표본을 HALOTAG 리간드로 활성화된 백색의 96웰 폴리스티렌 플레이트(HALOLINK 플레이트; Promega Corp.)의 웰 내로 넣고 45분 동안 추가 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 PBS+0.05% Tween-20(PBST)으로 세척하였다. 그 다음, 50㎕의 PBS에 이어 50㎕의 NANOGLO 루시퍼라아제 검출 시약을 웰에 첨가하고, 발광을 측정하였다.

표 2는 NanoLuc-p38 융합 단백질의 특이적 풀다운을 나타내는 HALOTAG 이량체(예로, 서열 목록 번호 1의 이량체)를 포함하는 및 포함하지 않는 표본 중 발광의 차이를 나타낸다.

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
약물로 처리된 p38-Nluc 발현 세포					약물 처리 없음
HALOTAG 이량체 없음	2㎍/웰	4㎍/웰	6㎍/웰	8㎍/웰	HALOTAG 이량체 없음	2㎍/웰	4㎍/웰	6㎍/웰	8㎍/웰

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
278085	236900	290173	401205	395510	223779	198295	185512	157721	178179
275690	397958	462596	538956	526903	286611	338811	183151	265931	324898
443682	431167	587826	596504	610628	378080	301971	318238	298925	232258

실시예 3

클로로알칸 약물 콘주게이트를 이용하여 HALOTAG 단백질 비드 상으로 세포로부터 표적 단백질의 풀다운 효율을 나타내기 위해, 본 발명의 구현예 개발 동안 실험을 수행하였다. 상기 실시예에서, 살아있는 세포로부터 NanoLuc-p38 알파 융합 단백질을 풀다운하기 위해 BIRB-클로로알칸 콘주게이트(PBI-4834, 아래 참고)를 이용하였다.

PBI4834(BIRB 카르바메이트 클로로알칸)

96-웰 플레이트의 웰 내 HEK293 세포를 NANOLUC-p38 융합물을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 PEI를 이용해서 전달감염시켰다. 전달감염 24시간 후, 세포를 최종 농도 10μΜ의 PBI-4834와 인큐베이션한 반면, 대조군 세포는 콘주게이트된 약물로 처리하지 않았다. 2시간의 평형 결합 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 신속히 세척하고 10분 동안 세제 기반 용해 완충액 중에서 용해시켰다. 이어서 세포 용해액을 0.5㎕의 침강된 상자성 HALOTAG 단백질 비드(Promega Corp.)를 함유하는 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 15-45분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 결합 후, 결합되지 않은 분획을 제거하고, HALOTAG 단백질 상자성 비드를 세척하였다. 이어서 150μM의 콘주게이트되지 않은 BIRB796을 첨가하고, 포획된 NANOLUC-p38 알파 융합물을 60분 동안 콘주게이트되지 않은 BIRB796과의 경쟁에 의해 비드로부터 특이적으로 방출시켰다. 방출된 NANOLUC-p38 알파 융합 단백질(+PBI-4834) 및 대조군(-PBI4834)을 NANOGLO 루시퍼라아제 시약(Promega Corp.)을 이용해서 검출하였다.

HALOTAG 단백질 비드 상에서 15분 포획 내에 달성된 높은 배경 대비 신호는 포획 방법의 효율성, 및 낮은 내지 중등 친화도로 약물에 결합하는 표적 단백질을 포획하기 위한 그 능력을 나타낸다(도 5). 상기 실시예에서, 발현된 융합물의 1%만이 비드에 특이적으로 포획되었다. 그러나 NANOLUC 루시퍼라아제의 높은 민감성으로 인해, 포획 수준은 배경 대비 특이적 포획의 검출을 위해 충분한 것 이상이다.

실시예 4

클로로알칸 개질된 약물을 이용하여 HALOTAG 단백질 비드 상에서 세포로부터 표적 단백질의 풀다운을 위한 카르바메이트 클로로알칸 링커의 장점을 나타내기 위해, 본 발명의 구현예 개발 동안 실험을 수행하였다. 상기 실시예에서, 메토트렉세이트-클로로알칸 콘주게이트 PBI-5015(카르바메이트 클로로알칸 링커) 및 PBI-4848(O2 클로로알칸 링커)을 용해액 중 HaloTag® 단백질에 대한 이들의 결합 효율, 세포 내 DHFR에 대한 결합 효율 및 살아있는 세포로부터 NANOLUC-DHFR 융합 단백질을 풀다운하는 능력에 대해 평가하였다.

PBI-5015: 메토트렉세이트 카르바메이트 클로로알칸

PBI-4848: 메토트렉세이트-O2 클로로알칸

용해액 중 HALOTAG 단백질에 대한 결합 효율을 HALOTAG 단백질을 발현하는 세포로부터의 용해액에 메토트렉세이트-클로로알칸 콘주게이트(최종 농도 1μM)를 첨가함으로써 측정하였다. 0-60분 결합 후, 반응을 1μΜ 형광 HALOTAG 리간드로 추적하였다. 미결합 HALOTAG 단백질을 형광 HALOTAG 리간드에 대한 결합에 이어 SDS-PAGE 상의 분석 및 형광 겔 스캐너 상에서의 검출을 통해 검출하였다. 결과는 두 링커가 HaloTag® 단백질에 대해 빠른 표지 역학을 제공함을 나타낸다(도 6a).

살아있는 세포에서 DHFR에 대한 결합 친화도를 BRET을 이용해서 평가하였다. 96-웰 플레이트의 웰 내 HEK293 세포를 NANOLUC-DHFR 융합물을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 PEI를 이용해서 전달감염시켰다. DNA를 웰 당 최종 농도 80ng의 총 DNA로 프로모터가 없는 캐리어 DNA 플라스미드(PSI)를 이용해서 1:50으로 희석하였다. 전달감염 24시간 후, 세포에서 추가 24시간 동안 혈청을 제거한 뒤, 1μΜ PBI-4890(TOM-메토트렉세이트 유도체)의 존재 하에 연속 희석된 PBI-4848 또는 PBI-5015로 처리하였다. 평형 결합 2시간 후, 푸리마진(코엘렌테라진 유도체; Promega Corp.)을 최종 농도 20μΜ로 첨가하고, BRET을 Varioskan 발광측정계 상에서 측정하였다. 용량-반응 BRET 곡선은 PBI-4848이 DHFR에 더 높은 친화도를 가짐을 나타낸다(도 6b).

살아있는 세포에서 NANOLUC:DHFR(Nluc:DHFR)을 특이적으로 풀다운하는 능력을 나타내기 위해, 96-웰 플레이트의 웰 내 HEK293 세포를 NANOLUC-DHFR 융합물을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 PEI를 이용해서 전달감염시켰다. DNA를 웰 당 최종 농도 80ng의 총 DNA로 프로모터가 없는 캐리어 DNA 플라스미드(PSI)를 이용해서 1:50으로 희석하였다. 전달감염 24시간 후, 세포에서 추가 24시간 동안 혈청을 제거한 뒤, 10μΜ PBI-4848 또는 PBI-5015와 인큐베이션한 반면, 대조군 세포는 콘주게이트된 약물로 처리하지 않았다. 평형 결합 2시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 신속히 세척하고, 10분 동안 세제 기반 용해 완충액 중에 용해시켰다. 이어서 세포 용해액을 0.5㎕의 침강된 상자성 HALOTAG 단백질 비드를 함유하는 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고 45분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 결합 후, 미결합 분획을 제거하고, HALOTAG 단백질 상자성 비드를 세척하고, 150μΜ의 콘주게이트되지 않은 메토트렉세이트를 첨가하고, 포획된 NANOLUC:DHFR을 60분 동안 콘주게이트되지 않은 메토트렉세이트와의 경쟁에 의해 비드로부터 특이적으로 방출시켰다. 방출된 NANOLUC:DHFR(+PBI5015 또는 +PBI4848) 및 대조군 표본을 NANOGLO 루시퍼라아제 검출 시약으로 검출하였다. PBI-4848 및 PBI-5015가 모두 HALOTAG에 대해 유사한 결합 효율을 갖지만 PBI-5015(DHFR에 대해 더 낮은 친화도를 가짐)만 Nluc:DHFR 융합물을 효율적으로 풀다운시킴으로써 풀다운 적용에서 카르바메이트 링커의 장점을 나타내었다(도 6c).

PBI-4890 메토트렉세이트-TOM

실시예 5

HALOTAG 단백질 비드로부터 NANOLUC 융합 단백질의 특이적 방출을 위한 방법에는, 예를 들어 다음이 포함된다:

1. 콘주게이트되지 않은 생체활성 제제와의 경쟁;

2. 포획 리간드(예로, 클로로알칸 리간드)에 속박된 생체활성 제제의 이용으로, 포획 리간드는 NANOLUC 융합 단백질의 신속한 방출을 허용하기 위해 화학적으로-절단 가능한 링커(예로, 클로로알칸 링커)를 함유함;

3. 포획 리간드 고형 지지체(예로, HALOLINK HALOTAG 수지)의 이용으로, 포획 리간드(HALOTAG 리간드)를 고형 지지체에 부착하는 링커는 화학적으로 절단되어 포획 단백질-포획 리간드-생체활성 제제-세포 표적 복합체(예로, HALOTAG-클로로알칸-약물 콘주게이트-NANOLUC 융합 단백질 복합체)의 신속한 방출을 허용할 수 있음; 및

4. 리포터로부터 세포 표적의 단백분해 절단, 예로 NANOLUC 융합 단백질은 NANOLUC 단백질을 방출함.

HALOTAG 단백질 비드로부터 NANOLUC 융합 단백질의 특이적 방출을 위한 방법을 나타내기 위해, 본 발명의 구현예 개발 동안 실험을 수행하였다. 이 실시예에서, BIRB-클로로알칸 콘주게이트(PBI-4834) 및 절단 가능한 링커를 함유하는 BIRB 클로로알칸 콘주게이트(PBI-5131)를 HEK293 세포 용해액으로부터 NANOLUC-p38 알파 융합 단백질을 풀다운하기 위해 이용하였다. NANOLUC-p38 융합물을 발현하는 세포의 용해액을 1μΜ PBI-4834 또는 PBI-5131(최종 농도)과 인큐베이션한 반면, 대조군 용해액은 콘주게이트된 약물로 처리하지 않았다. 평형 결합 2시간 후, 용해액을 0.5㎕의 침강된 상자성 HALOTAG 단백질 비드를 함유하는 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고 45분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 결합 후, 미결합 분획을 제거하고, HALOTAG 단백질 상자성 비드를 3회 세척하고, 포획된 NANLUC-p38 알파 융합물을 다음 두 방법 중 하나에 의해 비드로부터 특이적으로 방출시켰다:

1. 150μΜ의 콘주게이트되지 않은 BIRB796을 60분 동안 NANOLUC-p38 알파 융합물 상에서 콘주게이트된 BIRB796과의 결합에 대해 경쟁하기 위해 이용하였다.

2. NANOLUC-p38 알파 융합물을 10mM의 나트륨 히드로설파이트로 클로로알칸 링커의 10분 화학적 절단을 통해 신속히 방출하였다(PBI-5131은 클로로알칸 절단 가능한 링커임).

방출된 NANOLUC-p38 알파(+PBI4834/+PBI5131) 및 대조군(-약물)을 NANOGLO 루시퍼라아제 검출 시약으로 검출하였다. PBI-4834(카르바메이트 링커)의 풀다운 효율이 PBI-5131에 비해 상당히 크지만, 이 실시예는 배경 최소화를 위해 화학적 절단을 이용하여 특이적 포획의 상당한 증가를 야기하는 신속 방출의 장점을 나타낸다(도 7).

실시예 6

다음은 본 발명의 구현예에서 용도를 구하는 예시적 화합물에 대한 합성 방식을 제공한다.

PBI-4848: 메토트렉세이트-O2 클로로알칸

50mg의 메토트렉세이트 수화물을 3mL의 DMF 중에 교반하고 EDAC(63mg, 330umol) 및 트리에틸아민(77uL, 550umol)으로 처리하였다. 10분 후, 12-클로로-3,6-디옥소-도데실아민 히드로콜라이드(21.5mg, 83umol)를 첨가하였다. 3h 후, 산물을 제조용 HPLC(0.1% 수성 포름산 중 2→50% MeCN)에 의해 단리하였다. 적절한 분획을 농축하고 동결건조하여 오렌지색 고체를 산출하였다. M+H 계산치: 660.3; 실측치 660.7

메토트렉세이트 펜틸아민 중간체

2mL의 DMF 중 메토트렉세이트 수화물(50mg, 110umol), EDAC(63mg, 330umol) 및 트리에틸아민(77uL, 550umol)의 혼합물에, N-Boc 카다베린(22mg, 110umol)을 첨가하였다. 반응물을 90분 동안 교반한 뒤, 물로 희석된 2mL의 1N HCl로 켄칭하고 제조용 HPLC(0.1% 수성 포름산 중 20→50% MeCN)를 거쳤다. 적절한 분획을 농축하고 동결건조하여 원하는 산물을 산출하였다. M+H 계산치: 639.3; 실측치 639.5.

메토트렉세이트 N-Boc-카다베린 부가물(24mg, 38umol)을 RT에서 디옥산 중 4M HCl(0.5mL)로 처리하였다. 반응 종료 시, 용매를 감압 하에 제거하고, 생성 잔류물을 디에틸 에테르와 함께 교반하여 원심분리에 의해 단리되는 황색 침전물을 형성하였다. 히드로클로라이드염을 추가 분석 없이 이용하였다.

PBI-5015 메토트렉세이트 카르바메이트 클로로알칸

메토트렉세이트 수화물 펜틸아민 HCl염(8mg, 14umol)을 2mL DMF 중 2-(2-(2-(((4-니트로페녹시)카르보닐)옥시)에톡시)에톡시)에틸, (2-(2-((6-클로로헥실)옥시)에톡시)에틸카르바메이트(12mg, 21umol) 및 트리에틸아민과 조합하였다. 2h 후, 반응물에 1N HCl을 첨가하여 켄칭하고, 산물을 0.1% 수성 포름산 중 10→50% MeCN으로 용출하는 제조용 HPLC에 의해 단리하였다. 농축 후, 생성된 황색 고체를 DCM 중에 취하고, 포화 NaHCO₃로 세척하였다. 유기층의 증발로 1.9mg의 황색 고체가 산출되었다. M+H 계산치: 964.5, 실측치 964.5.

PBI-4890 메토트렉세이트-TOM

메토트렉세이트 수화물 펜틸아민 히드로클로라이드염(6mg, 10umol)을 1mL의 DMF 중 5.4mg의 TOM 숙신이미딜 에스테르(8.2umol)와 조합하고, 5방울의 TEA를 첨가하였다. 45분 후, 반응물을 H₂O 및 MeCN으로 희석하고 제조용 HPLC(0.1% 수성 포름산 중 25→75% MeCN)를 거친 뒤 동결건조하여 6mg의 청색 고체를 산출하였다. M+H 계산치: 1083.5; 실측치 1083.5

BIRB 절단 가능한 링커 클로로알칸 PBI 5131

레소르시놀(3.31g, 30mmol)을 10mL의 DMF 중에 용해시키고, K₂CO₃(3.32g, 24mmol)을 첨가하였다. 모든 고체가 용해되고 반응물이 진갈색으로 변할 때까지 혼합물을 교반하였다. 6-브로모헥사노에이트 에틸 에스테르(4.69g, 21mmol)를 한 번에 첨가하고, 반응물을 하룻밤 동안 교반한 뒤 1M HCl 내로 부어 3x50mL EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척한 뒤 셀라이트 상에 흡착시키고 헵탄 중 0→50% EtOAc로 용출하는 컬럼 크로마토그래피를 거쳤다. M+H 계산치: 254.1; 실측치 253.8.

에틸 6-(3-히드록시페녹시)헥사노에이트(0.96g, 3.8mmol)를 MeOH 및 H₂O의 혼합물 중에 용해시키고 LiOH 수화물(639mg, 15.2mmol)을 첨가하였다. 2h 후, 반응물을 감압 하에 농축한 뒤 1M HCl로 산성화하여 백색 침전물을 얻고, 여과 및 진공 하 건조 후 550mg의 백색 고체를 산출하였다. M+H 계산치: 225.1; 실측치 225.2 에틸 4-아미노벤조에이트(405mg, 2.45mmol)를 빙냉조에서 아세톤/2N HCl의 7.7mL 혼합물 중에 교반하였다. 8mL의 H₂O 중에 용해된 나트륨 니트라이트(215mg, 3.12mmol) 용액을 10분에 걸쳐 적가하고, 반응물을 추가 20분 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 20분에 걸쳐 빙냉조에서 18mL의 1N NaOH 중 6-(3-히드록시페녹시)헥사노에이트의 교반 용액에 적가하여 진적색을 얻었다. 교반 및 냉각을 40분 동안 계속한 뒤 반응물을 1N HCl로 중화하고 물로 희석하였다. 생성된 갈색 침전을 여과에 의해 수집하고, 다음 단계로 직접 진행하였다.

DMF(4mL) 중 이전 단계로부터의 카르복실산 용액(50mg, 0.12mmol)에 1-(1-(4-(아미노메틸)페닐)-3-tert부틸-1H-피라졸-5-일)-3-(나프탈렌-1-일)우레아(50mg, 0.14mmol), 에틸 디메틸아미노프로필카르보디이미드(EDAC, 30mg, 0.16mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 22mg, 0.16mmol)을 첨가하였다. 40h 동안 교반 후, 반응물을 EtOAc 및 NaHCO₃(포화 수용액) 간에 분획화하고, 층을 분리하고 유기층을 물 및 NaCl(포화 수용액)로 세척하고, 건조하고 농축하였다. 생성된 적색 고체를 제조용 HPLC(0.1% 수성 TFA 중 10%→100% ACN)로 정제하고 후속 농축하여 44mg의 오렌지색 고체를 산출하였다. M+H 계산치: 745, 실측치 745.

THF(3mL) 중 이전 반응으로부터의 에스테르 용액(44mg, 0.06mmol)에 NaOH(1N, 1mL)를 첨가하였다. 8일 동안 교반 후, 반응물을 산성화하고 제조용 HPLC(0.1% 수성 TFA 중 10%→100% ACN)로 정제한 뒤 농축하여 25mg의 오렌지색 고체를 산출하였다. M+H 계산치: 717, 실측치 717.

DMF(2mL) 중 이전 반응으로부터의 카르복실산 용액(14mg, 0.02mmol)에 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)유로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU, 12mg, 0.04mmol) 및 디이소프로필에틸아민(17㎕, 0.1mmol)을 첨가하였다. 30분 동안 교반 후, 2-[2-(6-클로로-헥실옥시)-에톡시]-에틸암모늄 히드로클로라이드(Promega, 10mg, 0.04mmol)를 첨가하였다. 36h 동안 교반 후, 반응물을 산성화하고 제조용 HPLC(0.1% 수성 TFA 중 10%→100% ACN)로 정제한 뒤 농축하여 25mg의 PBI 5131을 오렌지색 고체로 산출하였다. M+H 계산치: 923, 실측치 923.

BIRB 카르바메이트 클로로알칸 PBI 4834

1-(1-(4-((2-아미노아세트아미도)메틸)페닐)-3-tert-부틸-1H-피라졸-5-일)-3-페닐우레아(10mg, 18umol)를 2mL DMF 중 2-(2-(2-(((4-니트로페녹시)카르보닐)옥시)에톡시)에톡시)에틸(2-(2-((6-클로로헥실)옥시)에톡시)에틸카르바메이트(12mg, 21umol) 및 디이소프로필에틸아민(0.01mL, 0.06mmol)과 조합하였다. 2h 후, 반응물을 1N HCl의 첨가에 의해 켄칭하고, 산물을 수성 0.1% 프리플루오로아세트산 중 10→100% MeCN으로 용출하는 제조용 HPLC로 단리하였다. 유기층의 증발로 1.9mg의 황색 고체를 산출하였다. M+ 계산치: 846, 실측치 846.

Boc-보호된 SAHA 아민

7-트리틸옥시카르바모일 헵탄산(Schaefer 등. Med Chem Lett 2008, 16, 2011-2033.; 본원에 그 전문이 참조로 도입됨)(200mg, 463umol)을 3mL의 DMF 중 4-[(N-Boc)아미노메틸]아닐린(113mg, 510umol), HBTU(352mg, 927umol) 및 트리에틸아민(194uL, 1.4mmol)과 조합하였다. 반응물을 하룻밤 동안 교반한 뒤 셀라이트 상에 흡착시키고, 산물을 헵탄 중 0→100% EtOAc 구배로 용출하는 컬럼 크로마토그래피로 수득하였다. M+H 계산치: 635.3; 실측치 635.9

SAHA 아민

수베로일(4-[(N-Boc)아미노메틸]아닐리드)히드록삼산(286mg, 450mmol)을 0.25mL의 TIS가 첨가된 2mL의 DCM 중에 용해시켰다. 이어서 트리플루오로아세트산(0.9mL)을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 조정제 반응 산물을 제조용 HPLC로 정제하거나 추가 정제 없이 이용할 수 있었다.

SAHA-카르바메이트(SAHA-클로로알칸) PBI5040

수베로일[4-(아미노메틸)아닐리드]히드록삼산 TFA염(9mg, 22umol)을 1방울의 TEA를 포함하는 1mL의 DMF 중에 교반하였다. 이어서 0.5mL의 DMF 중 2-(2-(2-(((4-니트로페녹시)카르보닐)옥시)에톡시)에톡시)에틸(2-(2-((6-클로로헥실)옥시)에톡시)에틸카르바메이트(23umol)의 13-mg 부분을 첨가하였다. 90분 후 반응물을 H₂O의 첨가에 의해 켄칭하고 소량의 TFA로 산성화하고, 원하는 산물을 0.1% 수성 TFA 중 5→60% MeCN으로 용출하는 제조용 HPLC로 단리하였다. M+H 계산치: 719.4; 실측치 719.

SAHA-바이오틴 PBI 5474

비스-카르바메이트 용액에, 디클로로메탄(5mL) 중 "PBI J1902T"(50.0mg, 104μmol) 및 디클로로메탄(5mL) 중 4-(아미노메틸)아닐린(3.8mg, 31μmol) 용액을 천천히(10분에 걸쳐) 첨가하였다. 첨가 종료 시, 생성되는 황색 용액을 12시간 동안 22℃에 방치하였다. 반응 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피(0→5% MeOH/DCM)로 정제하여 8.0mg(55% 수율)의 카르바메이트 SL_1337_39를 황색 오일로 제공하였다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) 8.26(d, J = 9.1, 2H), 7.36(d, J = 9.1, 2H), 7.05(d, J = 8.3, 2H), 6.64(d, J = 8.3, 2H), 5.06(s, 1H), 4.51 - 4.35(m, 2H), 4.27 - 4.20(m, 4H), 3.87 - 3.74(m, 2H), 3.74 - 3.53(m, 6H) 1; HRMS(SI) C₂₁H₂₆N₃O₉ ⁺ [M+H]⁺ 계산치 464.17, 실측치 464.35.

디클로로메탄(5mL) 중 SL_1337-39(8.0mg, 17μmol)의 용액에 DMF(5mL) 중 "Thermo EZ-Link 아민-PEG2-바이오틴"(7.1mg, 19μmol)의 용액을 첨가하였다. 투명한 황색 반응물을 20시간 동안 22℃에서 교반하였고, 이 시점에서의 LCMS 분석은 원료의 완전 소비를 나타내었다. 반응물을 진공 중에 농축하고, 잔류물을 5mL DCM 중에 용해하고 실리카 겔 크로마토그래피(0→30% MeOH/DCM)로 정제하여 12.0mg(99% 수율)의 아닐린 SL_1337-49를 투명 오일로 제공하였다. HRMS(SI) C₃₁H₅₁N₆O₁₀S⁺ [M+H]⁺ 계산치 699.34, 실측치 699.48

DMF(2mL) 중 SL_1337-49(12.0mg, 17μmol)의 용액에, DMF(1mL) 중 8-옥소-8-((트리틸옥시)아미노)옥탄산(7.4mg, 17μmol), HATU(8.0mg, 21μmol) 및 NEt3(8.7mg, 86μmol)의 용액을 첨가하였다. 투명한 황색 반응물을 17시간 동안 22℃에서 교반하였고, 이 시점에서의 LCMS 분석은 원료의 완전 소비를 나타내었다. 반응물을 진공 중에 농축하고, 잔류물을 5mL DCM 중에 용해하고 실리카 겔 크로마토그래피(0→30% MeOH/DCM)로 정제하여 11.5mg(60% 수율)의 아닐리드 SL_1337-53을 투명 오일로 제공하였다. HRMS(SI) C₅₈H₇₈N₇O₁₃S⁺ [M+H]⁺ 계산치 1112.54, 실측치 1112.61.

DMF(1mL) 중 SL_1337-53(11.5mg, 10μmol)의 용액에, 트리이소프로필실란(81.9mg, 517μmol)에 이어 TFA(25㎕)를 첨가하였다. 반응물을 20분 동안 22℃에서 교반하였고, 이 시점에서의 TLC 분석은 원료의 완전 소비를 나타내었다. 반응물을 진공 중에 농축하고, 잔류물을 제조용 HPLC(45분에 걸쳐 3→95%의 0.1% TFA 함유 MeOH/H₂O)로 정제하여 9mg(100% 수율)의 히드록삼산 SL_1337-57을 동결건조 후 백색 고체로 제공하였다. HRMS(SI) C₃₉H₆₄N₇O₁₃S⁺ [M+H]⁺ 계산치 870.43, 실측치 870.48.

다음 참고문헌은 상기 합성 방식의 하나 이상에 관련되며, 본원에 이들의 전문이 참조로 도입된다: Hong 등. Am J Transl Res 2011, 3, 392.; Murakata 등. US 특허 5,344,926 Sept 6 1994.; Tecle 등. J. M. Chem Biol Drug Des 2009, 74, 547-549.; Hong 등. Am J Transl Res 2011, 3, 392; ¹ J. Med. Chem. 2002, 45, 3296-3309.

실시예 7

내인성 표적 풀다운(PBI-5015)

다음 실시예는 세포로부터 내인성 표적을 단리하기 위한, 예로 풀다운하기 위한 클로로알칸-약물 콘주게이트의 능력을 나타낸다.

HEK293 세포를 6-웰 플레이트(2.5x10⁵ 세포/웰)의 웰 내에 접종하였다. 접종 48시간 후, 최종 농도 10uM의 메토트렉세이트 클로로알칸(PBI-5015)을 2개 웰에 첨가한 반면, 대조군 세포는 약물 콘주게이트로 처리하지 않았다. 2h 동안 평형 결합 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 신속히 세척하고 10분 동안 세제 기반 용해 완충액 중에 용해시켰다. 이어서 세포 용해액을 12.5㎕의 침강된 상자성 HaloTag® 단백질 비드를 함유하는 Eppendorf® 튜브로 옮기고 15분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 결합 후, 미결합 분획을 제거하고, HaloTag 상자성 비드를 3회 세척하고, 포획된 표적을 60분 동안 150μΜ의 콘주게이트되지 않은 메토트렉세이트와의 경쟁에 의해 비드로부터 특이적으로 방출시켰다. 방출된 표적을 항-DHFR 항체(Sigma)를 이용한 웨스턴 블롯뿐만 아니라 질량 분광측정 분석을 거쳤다.

도 1a의 결과는 메토트렉세이트의 기지의 표적인 DHFR이 특이적으로 단리될 수 있음을, 예로 세포로부터 풀다운될 수 있음을 나타낸다. 또한 세포 내 DHFR의 발현 수준이 매우 낮지만(웨스턴 블롯 분석에 의해서는 용해액 중에 검출되지 않음), 웨스턴 블롯 분석(도 8a) 및 질량 분광측정 분석(도 8b)에 의해 나타난 바와 같이 여전히 효율적으로 포획되었다. 또한, 질량 분광측정 데이터는 상기 방법이 매우 낮은 배경을 가짐을 나타낸다.

실시예 8

내인성 표적 풀다운(PBI-4834)

HEK293 세포를 6웰 플레이트에 접종하였다(2.5x10⁵ 세포). 접종 48시간 후, 최종 농도 10uM의 BIRB-클로로알칸(PBI-4834)을 2개 웰에 첨가한 반면, 대조군 세포는 약물 콘주게이트로 처리하지 않았다. 2h 동안 평형 결합 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 신속히 세척하고 10분 동안 세제 기반 용해 완충액 중에 용해시켰다. 이어서 세포 용해액을 12.5㎕의 침강된 상자성 HaloTag® 단백질 비드를 함유하는 Eppendorf® 튜브로 옮기고 15분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 결합 후, 미결합 분획을 제거하고, HaloTag® 단백질 상자성 비드를 3회 세척하고, 포획된 표적을 60분 동안 150μΜ의 콘주게이트되지 않은 BIRB796과의 경쟁에 의해 비드로부터 특이적으로 방출시켰다. 방출된 표적을 항-p38 알파 항체(Abcam)를 이용한 웨스턴 블롯 분석뿐만 아니라 질량 분광측정 분석을 거쳤다. 도 9a의 결과는 웨스턴 블롯 분석(도 2a) 및 질량 분광측정 분석(도 9b)에 의해 나타난 바와 같이, BIRB796의 기지의 표적인 p38 알파가 t 세포로부터 특이적으로 단리될 수 있음을, 예로 풀다운될 수 있음을 나타낸다. 또한, 질량 분광측정 데이터는 상기 방법이 매우 낮은 배경을 가짐을 나타낸다.

실시예 9

상자성 비드에 대한 HALOTAG 단백질의 커플링

A. 단계4 상자성 수지의 합성

4-((2-시아논벤조[d]티아졸-6-일)아미노)-4-옥소부탄산(1). 6-아미노벤조[d]티아졸-2-카르보니트릴(2.0g, 11.4mmol), 숙신산 무수물(1.3g, 13mmol) 및 THF(15mL)를 25mL 용기에 두고, 110℃에서 90분 동안 마이크로파 합성기에서 가열하였다. 냉각 시, 반응 혼합물을 Et₂O로 분쇄 및 여과하고, 건조하고 증발시켜 3.1g의 산물을 담황색 고체로 얻었다(99%). 1H-NMR(d6-DMSO, 300 MHz): δ 12.15(s, 1H), 10.45(s, 1H), 8.71(s, 1H), 8.16(d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.70(d, 1H, J = 8.2 Hz), 2.62(m, 2H), 2.55(m, 2H). ESI-MS: C12H10N3O3S+ 계산치: m/z 276.3; 실측치 m/z 276.

tert-부틸(18-((2-시아노벤조[d]티아졸-6-일)아미노)-15,18-디옥소-4,7,10-트리옥사-14-아자옥타데실)카르바메이트(2). 화합물 1(4.93g, 17.9mmol), tert-부틸(3-(2-(2-(3-아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프로필)카르바메이트(7.40g, 23.1mmol) 및 DCM:DMF(10:1, 100mL)를 실온에서 250mL의 둥근 바닥 플라스크에서 함께 교반하였다. EDAC(4.0g, 20.9mmol)를 첨가하고, 반응물을 20h 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 DCM/MeOH를 용매로 하는 일반상 크로마토그래피로 정제하여 6.62g의 백색 고체를 얻었다(64%). 1H-NMR(d3-ACN, 300 MHz): δ 9.21(s, NH), 8.62(d, 1H, J = 2.0 Hz), 8.09(d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.63(d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.65(bs, NH), 5.40(bs, NH), 3.5(m, 12H), 3.28(m, 2H), 3.06(m, 2H), 2.65(m, 2H), 2.51(m, 2H), 2.70(m, 4H), 1.40(s, 9H). ESI-MS: C27H40N5O7S+ 계산치: m/z 578.7; 실측치 m/z 578.4.

N1-(3-(2-(2-(3-아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프로필)-N4-(2-시아노벤조[d]티아졸-6-일)숙신아미드 히드로클로라이드(3). 화합물 2(6.62g, 11.5mmol)을 DCM(200mL) 및 트리이소프로필실란(1mL)이 있는 500mL 둥근 바닥 플라스크에서 교반하였다. 디옥산 중 HCl의 4.0M 용액(30mL, 120mmol)을 첨가하고, 3h 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 증발시켜 6.4g의 황색 흡습성 고체를 얻었다(98%). 1H-NMR(d6-DMSO, 300 MHz): δ 10.62(s, 1H), 8.74(d, 1H, J = 2.0 Hz), 8.15(d, 1H, J = 8.4Hz), 7.77(d, 1H, J = 8.4Hz), 3.4(m, 16H), 3.28(m, 2H), 3.08(m, 2H), 2.80(m, 2H), 2.61(m, 2H), 2.41(m, 2H), 1.80(m, 2H), 1.60(m, 2H). ESI-MS: C22H32N5O5S+ 계산치: m/z 478.59; 실측치 m/z 478.2.

고정된 시아노벤조티아졸-자성 셀룰로오스(4). 카르복시메틸 자성 셀룰로오스(7.24g, 30-50㎛, Iontosorb MG CM)를 DMF(100mL) 중 화합물 3(800mg, 1.53mmol)이 있는 250mL 둥근 바닥 플라스크에 취했다. EDAC(387mg, 2.01mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 20h 동안 교반하였다. 입자를 프릿 상에서 여과하고, 먼저 DMF(200mL), 이어서 25% EtOH(300mL)로 헹구고 4℃에서 50% 현탁액으로 보관하였다.

B. HaloTag® 단백질 상자성 비드의 합성

HaloTag® 단백질 상자성 비드를 생성하기 위해, HaloTag® 단백질을 N-말단 시스테인을 통해 상자성 단계4 수지 상에 고정하였다. HaloTag® 단백질을 HaloTag® 단백질 및 miniGroEL 서열 간에 TEV 프로테아제 인식 부위(EDLYFQC)를 갖는 HisTag-miniGroEL-HaloTag® 융합물로 대장균에서 발현시켰다. 융합물을 HisTag을 이용해서 정제한 뒤 2mM TCEP의 존재 하에 TEV 프로테아제로 절단하여 N-말단의 환원된 시스테인을 노출시켰다. 단계4 수지 상의 반응성 시아노기가 환원된 N-말단 시스테인과 반응하여 HaloTag® 단백질 비드와 매우 안정한 결합을 형성하였다.

실시예 10

다음 실시예는 속박된 생체활성 제제의 투과도 및 효능에 대한 클로로알칸 개질의 최소 영향을 나타낸다.

HEK293 세포를 DMEM + 10% 혈청 중 1x10⁵ 세포/ml로 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교체하였다. K562 세포를 2x10⁵ 세포/ml로 96-웰 플레이트의 웰 내로 무혈청 RPMI 1640 배지 중에 접종하였다. 세포를 2시간 동안 SAHA 또는 PBI-5040(SAHA-클로로알칸)의 연속 희석액으로 처리한 뒤 제조업체의 지침에 따라 비용해성 HDAC-Glo™ I/II 분석(Promega Corporation)을 이용하여 세포내 HDAC 활성에 대해 평가하였다. 도 10의 결과는 SAHA 및 PBI-5040에 의한 HDAC 활성의 유사한 저해를 나타낸다. 클로로알칸 개질로 인한 SAHA 효능의 ~2-배 감소는 세포 투과도 또는 효능에 대한 클로로알칸의 최소 영향을 시사한다.

실시예 11

다음 실시예는 저풍부도 및 저친화도 표적을 포함하여 세포로부터 내인성 표적을 풀다운하기 위한 클로로알칸-콘주게이트된 약물의 능력을 나타낸다.

HEK293 세포를 2x10⁵ 세포/ml로 100mm 디쉬에 접종하였다. 접종 48시간 후, 최종 농도 20uM의 SAHA-클로로알칸(PBI-5040)을 3개 디쉬(1x10⁷ 세포/디쉬)에 첨가한 반면, 3개의 다른 디쉬에는 콘주게이트된 약물을 처리하지 않았다(대조군). 2시간 동안 평형 결합 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 신속히 세척하고, 10분 동안 세제 기반 용해 완충액 중에 용해시키고 1분 동안 3000xg로 원심분리하였다. 이어서 투명 용해액을 75㎕의 침강된 상자성 HALOTAG 비드에 첨가하고 15분 동안 진탕하며 인큐베이션하였다. 결합 후, 미결합 분획을 제거하고, HALOTAG 상자성 비드를 3회 세척하고(세척 완충액 - 50mM HEPES pH7.5, 150mM NaCl 및 0.01% IGEPAL), 포획된 표적을 60분 동안 400μΜ의 콘주게이트되지 않은 SAHA와의 경쟁에 의해 비드로부터 특이적으로 방출시켰다. 방출된 표적을 항HDAC1 항체(ABCAM); 항HDAC2 항체(ABCAM); 항HDAC6 항체(Millipore); 항HDAC3 항체(Thermo Fisher) 및 항HDAC8 항체(Rockland/Promega)를 이용한 웨스턴 블롯 분석(도 1-a)뿐만 아니라 질량 분광측정 분석(도 11b)을 거쳤다. 도 11의 결과는 저친화도 표적(HDAC8) 및 저풍부도 표적(HDAC3)을 포함하여 SAHA의 모든 기지의 표적이 본 발명의 구현예를 이용하여 세포로부터 특이적으로 풀다운될 수 있음을 시사한다.

실시예 12

다음 실시예는 약물 효능에 대한 연결 방법(클로로알칸 또는 바이오틴)의 효과를 나타낸다.

K562 세포를 2x10⁵ 세포/ml로 96-웰 플레이트의 웰 내에 무혈청 RPMI 1640 배지 중에 접종하였다. 이어서 세포를 2시간 동안 SAHA, PBI-5040(SAHA-클로로알칸) 또는 PBI 5475(SAHA-바이오틴)의 연속 희석액으로 처리한 뒤 제조업체의 지침에 따라 비용해성 HDAC-Glo™ I/II 분석(Promega Corporation)을 이용해서 세포내 HDAC 활성에 대해 평가하였다. 도 12의 결과는 바이오틴 개질에 있어서 효능의 ~16배 감소에 비해 클로로알칸 개질에 있어서 효능의 ~2배 감소를 시사한다. 이들 결과는 생체활성 제제와 이용되는 경우, 세포 투과도 또는 효능에 대한 클로로알칸 연결의 최소 영향을 추가로 나타낸다.

실시예 13

다음 실시예는 본 발명의 하나의 구현예에서 바이오틴 연결에 비해 클로로알칸 연결에 의해 매개되는 매우 효율적인 풀다운을 나타낸다.

K562 세포를 5x10⁷ 세포/디쉬로 150mm 디쉬에 접종하였다. 최종 농도 20uM의 SAHA 클로로알칸(PBI-5040) 또는 PBI-5475(SAHA-바이오틴)을 세포의 2개 디쉬로 첨가한 반면, 2개의 다른 세포 디쉬에는 콘주게이트된 약물을 처리하지 않았다(대조군). 2시간 동안 평형 결합 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 신속히 세척하고, 10분 동안 세제 기반 용해 완충액 중에 용해시키고 1분 동안 3000xg로 원심분리하였다. 이어서 대조군 세포의 투명 용해액뿐만 아니라 PBI-5040으로 처리된 투명 용해액을 75㎕의 침강된 상자성 HALOTAG 비드에 첨가하였다. 대조군 세포의 투명 용해액뿐만 아니라 PBI-5475로 처리된 투명 용해액을 75㎕의 침강된 상자성 스트렙타비딘 비드(GE)에 첨가하였다. 15분 결합 후, 미결합 분획을 제거하고, 비드를 3회 세척하고, 포획된 표적을 60분 동안 400μΜ의 콘주게이트되지 않은 SAHA와의 경쟁에 의해 비드로부터 특이적으로 방출시켰다. 방출된 표적을 항HDAC1 항체(ABCAM); 항HDAC2 항체(ABCAM); 항HDAC6 항체(Millipore); 항HDAC3 항체(Thermo Fisher) 및 항HDAC8 항체(Rockland/Promega)를 이용한 웨스턴 블롯 분석(도 13)을 거쳤다. 도 13의 결과는 저친화도 표적(HDAC8) 및 저풍부도 표적(HDAC3)을 포함하여 SAHA의 모든 기지의 표적이 SAHA-클로로알칸에 의해 특이적으로 풀다운된 반면, HDAC6만이 SAHA-바이오틴에 의해 풀다운되었음을 시사한다. 이들 결과는 또한 본 발명의 구현예에서 내인성 표적의 풀다운을 위한 클로로알칸 연결의 장점을 나타낸다.

본 출원에서 언급된 모든 공보 및 특허는 본원에 참조로 도입된다. 본 발명의 기재된 방법 및 조성물의 다양한 개질 및 변형은 발명의 범위 및 요지로부터 벗어나지 않고 당분야 숙련가에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 구현예에 대해 기재되었으나, 청구되는 발명이 이러한 특정 구현예로 부당하게 제한되어서는 안 됨이 이해되어야 한다. 실제로 관련 분야의 숙련가에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 양식의 다양한 개질은 다음 특허청구범위의 범위 내에 속하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Hitko, Carolyn W. Hurst, Robin Kirkland, Thomas Klaubert, Dieter Meisenheimer, Poncho Nath, Nidhi Ohana, Rachel F. Otto, Paul Urh, Marjeta Uyeda, Tetsuo Wood, Keith <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR CAPTURE OF CELLULAR TARGETS OF BIOACTIVE AGENTS <130> PRMG-33030/US-1/PRO <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu 1 5 10 15 Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly 20 25 30 Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp 35 40 45 Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro 50 55 60 Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe 65 70 75 80 Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly 85 90 95 Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly 100 105 110 Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe 115 120 125 Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe 130 135 140 Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys 145 150 155 160 Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly 165 170 175 Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro 180 185 190 Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu 195 200 205 Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu 210 215 220 Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp 225 230 235 240 Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala 245 250 255 Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn 260 265 270 Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg 275 280 285 Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly 290 295 <210> 2 <211> 891 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 atggcagaaa tcggtactgg ctttccattc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag 60 cgcatgcact acgtcgatgt tggtccgcgc gatggcaccc ctgtgctgtt cctgcacggt 120 aacccgacct cctcctacgt gtggcgcaac atcatcccgc atgttgcacc gacccatcgc 180 tgcattgctc cagacctgat cggtatgggc aaatccgaca aaccagacct gggttatttc 240 ttcgacgacc acgtccgctt catggatgcc ttcatcgaag ccctgggtct ggaagaggtc 300 gtcctggtca ttcacgactg gggctccgct ctgggtttcc actgggccaa gcgcaatcca 360 gagcgcgtca aaggtattgc atttatggag ttcatccgcc ctatcccgac ctgggacgaa 420 tggccagaat ttgcccgcga gaccttccag gccttccgca ccaccgacgt cggccgcaag 480 ctgatcatcg atcagaacgt ttttatcgag ggtacgctgc cgatgggtgt cgtccgcccg 540 ctgactgaag tcgagatgga ccattaccgc gagccgttcc tgaatcctgt tgaccgcgag 600 ccactgtggc gcttcccaaa cgagctgcca atcgccggtg agccagcgaa catcgtcgcg 660 ctggtcgaag aatacatgga ctggctgcac cagtcccctg tcccgaagct gctgttctgg 720 ggcaccccag gcgttctgat cccaccggcc gaagccgctc gcctggccaa aagcctgcct 780 aactgcaagg ctgtggacat cggcccgggt ctgaatctgc tgcaagaaga caacccggac 840 ctgatcggca gcgagatcgc gcgctggctg tcgacgctcg agatttccgg c 891 <210> 3 <211> 169 <212> PRT <213> Oplophorus gracilirostris <400> 3 Phe Thr Leu Ala Asp Phe Val Gly Asp Trp Gln Gln Thr Ala Gly Tyr 1 5 10 15 Asn Gln Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Leu Ser Ser Leu Phe Gln 20 25 30 Ala Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Lys Val Val Leu Ser Gly 35 40 45 Glu Asn Gly Leu Lys Ala Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly 50 55 60 Leu Ser Gly Phe Gln Met Gly Leu Ile Glu Met Ile Phe Lys Val Val 65 70 75 80 Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Ile Ile Leu His Tyr Gly Thr 85 90 95 Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg 100 105 110 Pro Tyr Pro Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr 115 120 125 Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Tyr Asp Glu Arg Leu Ile Asn 130 135 140 Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly 145 150 155 160 Trp Arg Leu Cys Glu Asn Ile Leu Ala 165 <210> 4 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 atggtgttta ccttggcaga tttcgttgga gactggcaac agacagctgg atacaaccaa 60 gatcaagtgt tagaacaagg aggattgtct agtctgttcc aagccctggg agtgtcagtc 120 accccaatcc agaaagttgt gctgtctggg gagaatgggt taaaagctga tattcatgtc 180 atcatccctt acgagggact cagtggtttt caaatgggtc tgattgaaat gatcttcaaa 240 gttgtttacc cagtggatga tcatcatttc aagattattc tccattatgg tacactcgtt 300 attgacggtg tgacaccaaa catgattgac tactttggac gcccttaccc tggaattgct 360 gtgtttgacg gcaagcagat cacagttact ggaactctgt ggaacggcaa caagatctat 420 gatgagcgcc tgatcaaccc agatggttca ctcctcttcc gcgttactat caatggagtc 480 accggatggc gcctttgcga gaacattctt gcc 513

Claims

세포 표적의 포획 방법으로서,
(a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하는 조건 하에 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 투여하는 단계;
(b) 세포를 용해시켜 세포 용해액을 생성하는 단계;
(c) 제1 포획 리간드가 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성하는 조건 하에 세포 용해액을 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 이량체와 접촉시키는 단계;
(d) 제1 포획 리간드가 제1 포획 단백질과 공유 결합을 형성하는 조건 하에 세포 용해액을 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계; 및
(e) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계를 포함하는 세포 표적의 포획 방법.
세포 표적의 포획 방법으로서,
(a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하는 조건 하에 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 제1 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 투여하는 단계;
(b) 세포를 용해시켜 세포 용해액을 생성하는 단계;
(c) 세포 용해액을 제1 포획 단백질 및 제2 포획 단백질의 이량체에 결합된 제2 포획 리간드를 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계(여기서, 제2 포획 단백질 및 제2 포획 리간드는 공유 결합됨); 및
(d) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계를 포함하는 세포 표적의 포획 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 표적은 리포터 단백질과의 융합물인 방법.
세포 표적의 포획 방법으로서,
(a) 세포 표적이 생체활성 제제에 결합하도록 하는 조건 하에 생체활성 제제의 세포 표적을 포함하는 세포에 포획 리간드에 속박된 생체활성 제제를 투여하는 단계;
(b) 세포를 용해시켜 세포 용해액을 생성하는 단계;
(c) 포획 단백질이 포획 리간드와 공유 결합을 형성하는 조건 하에 세포 용해액을 포획 단백질을 디스플레이하는 고체 표면과 접촉시키는 단계; 및
(d) 고체 표면을 세포 용해액에서 분리하는 단계을 포함하는 세포 표적의 포획 방법.
제4항에 있어서, 세포 표적은 리포터 단백질과의 융합물인 방법.
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