JP5420198B2

JP5420198B2 - タンパク質相互作用解析方法、ポリヌクレオチド、および、組成物

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Inventors: 崇杉山
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Priority date: 2008-06-16
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Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2028-06-16
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Description

本発明は、細胞内のタンパク質間相互作用を非侵襲的に解析する、タンパク質相互作用解析方法、ポリヌクレオチド、および、組成物に関するものである。

従来、細胞内でのタンパク質の相互作用を観察するために、ルシフェラーゼ等の発光酵素を分割して、対象となる２つのタンパク質にそれぞれ融合させ、細胞内で発現させた融合タンパク質が、対象タンパク質間の相互作用により互いに結合することにより、回復した発光酵素活性を観察・測定していた。

例えば、非特許文献１および２では、分割したスプリットルシフェラーゼをＭｙｏＤとＩｄにそれぞれ結合させて融合タンパクとして細胞内で発現させ、スプリットルシフェラーゼ同士の結合により回復したルシフェラーゼ活性を観察することにより、細胞内におけるＭｙｏＤ−Ｉｄ相互作用やその局在を解析する方法（スプリットルシフェラーゼアッセイ）が開発されている。

Ｒ．Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ，Ｙ．Ｕｍｅｚａｗａ，Ｓ．Ｓ．Ｇａｍｂｈｉｒ， "Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｉｍａｇｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｌｉｖｉｎｇｓｕｂｊｅｃｔｓｂｙｕｓｉｎｇｒｅｐｏｒｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ"，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ｖｏｌ．９９，ｎｏ．２４，ｐｐ．１５６０８−１５６１３，２００２ＫａｔｈｒｙｎＥ．Ｌｕｋｅｒ，ＭａｔｔｈｅｗＣ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，ＧａｒｙＤ．Ｌｕｋｅｒ，ＳｅｔｈＴ．Ｇａｍｍｏｎ，ＨｅｌｅｎＰｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，ＤａｖｉｄＰｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ， "Ｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｒｅｖｅａｌｅｄｗｉｔｈｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｍａｇｉｎｇｉｎｃｅｌｌｓａｎｄｌｉｖｉｎｇａｎｉｍａｌｓ"，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ｖｏｌ．１０１，ｎｏ．３３，ｐｐ．１２２８８−１２２９３，２００４ＪｏｄｙＭ．Ｌｉｎｇｂｅｃｋ，ＪｕｌｉｅＳ．Ｔｒａｕｓｃｈ−Ａｚａｒ，ＡａｒｏｎＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，ＡｌａｎＬ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ， "ＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆＮｕｃｌｅａｒａｎｄＣｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＵｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＭｙｏＤ"，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７８，Ｎｏ．３，ｐｐ．１８１７−１８２３，２００３ＪｕｌｉｅＳ．Ｔｒａｕｓｃｈ−Ａｚａｒ，ＪｏｄｙＬｉｎｇｂｅｃｋ，ＡａｒｏｎＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，ＡｌａｎＬ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ， "Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＩｄ１ｉｓｍｏｄｕｌａｔｅｄｂｙＭｙｏＤ"，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７９，Ｎｏ．３１，ｐｐ．３２６１４−３２６１９，２００４

しかしながら、例えば、上述のＭｙｏＤやＩｄには、核局在シグナル（ＮＬＳ：ＮｕｃｌｅａｒＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＳｉｇｎａｌ）配列が存在することが、非特許文献３，４等において報告されているが、従来の方法では、対象タンパク質に核局在シグナル配列が存在する場合、対象タンパク質が核に局在するため分割されたルシフェラーゼが効率よく再構成されず、発光強度が弱いという問題がある。

また、同一の検出装置で同時に複数の対象を色別で検出する場合等では、発光強度差が過大とならないよう発光強度を調節して漏れ込みを防ぐ必要があるが、従来の方法では、ルシフェラーゼ遺伝子を改変させるか種類の異なるルシフェラーゼを用いて調整しなければならなかった。また、同時に検出しない場合であっても、発光強度差がある場合は、検出装置等の感度をその都度、切り換えて設定しなければならず煩雑であり、再現性などにおいても問題があった。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、対象タンパク質が核局在シグナル配列を含む場合であっても、タンパク質間相互作用の動態を精度よく解析することができ、その結果、実験の再現性を改善することができる、タンパク質相互作用解析方法、ポリヌクレオチド、および、組成物を提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法は、細胞内においてタンパク質の相互作用を解析するタンパク質相互作用解析方法であって、互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させたＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素を調整し、前記Ｎ末側発光酵素と融合させた一方の前記タンパク質、および、前記Ｃ末側発光酵素と融合させた他方の前記タンパク質を含む前記細胞を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記タンパク質の相互作用の動態を解析する解析工程と、を含み、前記作製工程において、少なくとも一方の前記タンパク質の核局在シグナル配列を変異させること、を特徴とする。

また、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法は、上記記載のタンパク質相互作用解析方法において、前記作製工程は、前記核局在シグナル配列のリシン残基および／またはアルギニン残基を、非荷電アミノ酸に置換すること、を特徴とする。

また、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法は、上記記載のタンパク質相互作用解析方法において、前記非荷電アミノ酸は、アラニンまたはグリシンであること、を特徴とする。

また、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法は、上記記載のタンパク質相互作用解析方法において、一方の前記タンパク質は、野生型Ｉｄタンパク質であり、他方の前記タンパク質は、前記核局在シグナル配列に対応する、アミノ酸番号１０２番目、１０４番目、１１２番目のリシン残基、および、１０３番目、１１０番目、１１１番目のアルギニン残基を、アラニン残基に変異させた変異型ＭｙｏＤタンパク質であること、を特徴とする。

また、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法は、上記記載のタンパク質相互作用解析方法において、一方の前記タンパク質は、前記核局在シグナル配列に対応する、アミノ酸番号７０番目、８１番目、８４番目のリシン残基、および、６８番目、８０番目のアルギニン残基を、アラニン残基に変異させた変異型Ｉｄタンパク質であり、他方の前記タンパク質は、野生型ＭｙｏＤタンパク質であること、を特徴とする。

また、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法は、上記記載のタンパク質相互作用解析方法において、前記Ｎ末側発光酵素は、ホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含むＮ末側スプリットルシフェラーゼであり、前記Ｃ末側発光酵素は、前記ホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含むＣ末側スプリットルシフェラーゼであること、を特徴とする。

また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、Ｃ末側スプリットルシフェラーゼと、核局在シグナル配列を含むＭｙｏＤタンパク質と、の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、前記ＭｙｏＤタンパク質の前記核局在シグナル配列におけるリシン残基およびアルギニン残基が、アラニン残基またはグリシン残基をコードするよう変異されたこと、を特徴とする。

また、本発明にかかる組成物は、上記記載のポリヌクレオチドと、Ｎ末側スプリットルシフェラーゼと野生型Ｉｄタンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、を少なくとも含む組成物であること、を特徴とする。

また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、Ｎ末側スプリットルシフェラーゼと、核局在シグナル配列を含むＩｄタンパク質と、の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、前記Ｉｄタンパク質の前記核局在シグナル配列におけるリシン残基およびアルギニン残基が、アラニン残基またはグリシン残基をコードするよう変異されたこと、を特徴とする。

また、本発明にかかる組成物は、上記記載のポリヌクレオチドと、Ｃ末側スプリットルシフェラーゼと野生型ＭｙｏＤタンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、を少なくとも含む組成物であることを特徴とする。

本発明によれば、対象タンパク質が核局在シグナル配列を含む場合であっても、タンパク質間相互作用の動態を精度よく解析することができ、その結果、実験の再現性を改善することができる。

以下に、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。

まず、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法（具体的には撮像工程および解析工程）で用いる発光観察システム１００の構成について、図１〜図４を参照して説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。図２および図３は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示すブロック図である。図４は、発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。

図１に示すように、発光観察システム１００は、細胞１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。

ここで、発光画像撮像ユニット１０６は、ステージ１０４の下側に配置してもよい。蛍光よりも微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６を下側に配置することにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。なお、この構成の場合、容器１０３の底部は光透過性を有する素材を用い、ステージ１０４には光を透過させるよう穴を有していてもよい。

細胞１０２は、例えば、分割されたＮ末側発光酵素（例えばＮ末側スプリットルシフェラーゼなど）と融合させた対象タンパク質（例えばＩｄタンパク質など）、および、分割されたＣ末側発光酵素（例えばＣ末側スプリットルシフェラーゼ）と融合させた他方の対象タンパク質（例えばＭｙｏＤタンパク質など）を含む生きた細胞であり、少なくとも一方の対象タンパク質の核局在シグナル配列には、核局在化を防ぐよう所定の変異が導入されている。例えば、核局在シグナル配列のリシン残基および／またはアルギニン残基は、非荷電アミノ酸（例えば、アラニンやグリシン）に置換されていてもよい。また、ここで、細胞１０２に、上記融合タンパク質がそれぞれ発現されるよう構成した、当該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することにより、両融合タンパク質が細胞１０２内で発現されるよう構成してもよい。なお、細胞１０２には、当該細胞の撮像時に、当該細胞外から所定の発光基質（例えばルシフェリンなど）が与えられる。

発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）^２の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には細胞１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。

ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料（細胞１０２等）の発光画像（スプリットイメージ）および明視野画像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、生体試料（細胞１０２等）から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料（細胞１０２等）の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、生体試料（細胞１０２等）から発せられた発光をフィルター交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

再び図１に戻り、画像解析装置１１０は、例えば、パーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入力装置１２２や出力装置１２４に接続された入出力インターフェース部１２０と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。

上記構成において、記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。

制御部１１２は、ＯＳ（ＯｐｅｒａｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。

発光画像撮像指示部１１２ｃは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。

画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した複数の発光画像に基づいて、対象タンパク質の相互作用状態の変動や動態を解析する。換言すると、画像解析部１１２ｃは、複数の発光画像に基づいて、対象タンパク質間の相互作用の状態や、相互作用を行っている対象タンパク質が細胞１０２内でどのように移動していくのか等を解析する。また、画像解析部１１２ｃは、複数の発光画像に基づいて、対象タンパク質の相互作用状態がどのように変化していくのかを数値化して解析する。解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた対象タンパク質間の相互作用状態の変動についての時系列の数値データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。

本実施の形態における実施例について以下に図５〜図９を用いて説明する。ここで、図５は、スプリットルシフェラーゼアッセイの検出原理を示す図である。

スプリットルシフェラーゼアッセイとは、ホタルルシフェラーゼやウミシイタケルシフェラーゼ等のルシフェラーゼを、特定の位置で分割して発光酵素活性（生物発光能）を失活させた後、そのフラグメント（断片）であるＮ末側ルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）とＣ末側ルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ）を再構成させ発光酵素活性を回復させる手法であり、タンパク質間相互作用の検出や、タンパク質の細胞内小胞体移行検出等に用いられる。

図５は、相互作用を起こすタンパク質として、ＩｄとＭｙｏＤを用いた例を示している。すなわち、細胞内で発現させた、ＮＬｕｃ−Ｉｄ融合タンパク質中のＩｄ遺伝子部位と、ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ融合タンパク質中のＭｙｏＤ遺伝子部位とが相互作用して結合すると、ＮＬｕｃ遺伝子部位とＣＬｕｃ遺伝子部位とが結合して発光酵素活性が回復し、検出可能なシグナルを発する。本実施例においては、このスプリットルシフェラーゼアッセイ系において、ＩｄまたはＭｙｏＤ遺伝子中の核局在シグナル配列に変異を導入させた実施の形態について説明する。ここで、本実施例における実験の流れ（手順）は、以下の通りである。

［スプリットルシフェラーゼ遺伝子の作製およびＭｙｏＤ遺伝子とＩｄ遺伝子のクローニング］
［手順１］
まず、スプリットルシフェラーゼ遺伝子（ＮＬｕｃ／ＣＬｕｃ）の作製のために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調整した。
（ＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＮＬｕｃ＿Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号１）：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴ−３’
ＮＬｕｃ＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２）：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴ−３’
（ＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＣＬｕｃ＿Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３）：５’−ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ−３’
ＣＬｕｃ＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号４）：５’−ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴ−３’

また、ＭｙｏＤ遺伝子およびＩｄ遺伝子のクローニングのために、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調整した。
（ＭｙｏＤ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＭｙｏＤ＿Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号５）：５’−ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣ−３’
ＭｙｏＤ＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号６）：５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＧＣＡＴＴ−３’
（Ｉｄ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
Ｉｄ＿Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７）：５’−ＧＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＧＧＡＧＣＡＡＡＧＣ−３’
Ｉｄ＿Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号８）：５’−ＧＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＡＧＡＴＧＣＧＡＴ−３’

［手順２］
そして、ｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を鋳型として、Ｎ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＮＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む。）、および、Ｃ末側ルシフェラーゼ遺伝子（ＣＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。

［手順３］
そして、マウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ（株）製）を鋳型として、ＭｙｏＤ遺伝子（マウスのＭｙｏＤ遺伝子の１番目から３１８番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む。）、および、Ｉｄ遺伝子（マウスのＩｄ遺伝子の２９番目から１４８番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む。）を、上記合成オリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。

［手順４］
そして、ＰＣＲで増幅させたＮＬｕｃ遺伝子およびＭｙｏＤ遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした後、ＮＬｕｃ遺伝子の下流に存在するＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位の間にＩｄ遺伝子を、ＭｙｏＤ遺伝子の下流に存在するＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位の間にＣＬｕｃ遺伝子をそれぞれ挿入して、融合遺伝子（ＮＩ：ＮＬｕｃ−Ｉｄ、および、ＭＣ：ＭｙｏＤ−ＣＬｕｃ）を作製した。

［手順５］
そして、それぞれの融合遺伝子を哺乳類細胞の発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ（株）製）へ組み込んだ。

［Ｍｙｏ遺伝子およびＩｄ遺伝子への変異導入］
つづいて、ＭｙｏＤおよびＩｄ遺伝子の核局在シグナル配列に変異を以下の手順で導入した。

［手順１］
まず、それぞれの遺伝子に変異を導入するため、合成オリゴＤＮＡを以下に示す塩基配列で調整した。
（ＭｙｏＤ遺伝子への変異導入用合成オリゴＤＮＡ配列）
Ｍｙｏ＿ｍｕｔ＿Ａ＿ｄｅｓ（配列番号９）：５’−ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣ−３’
Ｍｙｏ＿ｍｕｔ＿Ａ＿ｏｐｐ（配列番号１０）：５’−ＧＣＧＴＴＧＧＴＧＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧ−３’
Ｍｙｏ＿ｍｕｔ＿Ｂ＿ｄｅｓ（配列番号１１）：５’−ＣＣＡＡＣＧＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣ−３’
Ｍｙｏ＿ｍｕｔ＿Ｂ＿ｏｐｐ（配列番号１２）：５’−ＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＧＴＴＧＧ−３’
（Ｉｄ遺伝子への変異導入用合成オリゴＤＮＡ配列）
Ｉｄ＿ｍｕｔ＿Ａ＿ｄｅｓ（配列番号１３）：５’−ＧＧＣＴＧＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣ−３’
Ｉｄ＿ｍｕｔ＿Ａ＿ｏｐｐ（配列番号１４）：５’−ＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＣ−３’
Ｉｄ＿ｍｕｔ＿Ｂ＿ｄｅｓ（配列番号１５）：５’−ＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＧ−３’
Ｉｄ＿ｍｕｔ＿Ｂ＿ｏｐｐ（配列番号１６）：５’−ＣＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧ−３’
Ｉｄ＿ｍｕｔ＿Ｃ＿ｄｅｓ（配列番号１７）：５’−ＧＣＣＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣ−３’
Ｉｄ＿ｍｕｔ＿Ｃ＿ｏｐｐ（配列番号１８）：５’−ＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣ−３’

［手順２］
そして、上述のように作製したＮＩ遺伝子およびＭＣ遺伝子の発現ベクター（ＮＩ、および、ＭＣ）を鋳型として、上記の合成オリゴＤＮＡを用いて、ＭｙｏＤ遺伝子およびＩｄ遺伝子の変異型遺伝子発現ベクター（ＮＩ＿ｍ、および、ＭＣ＿ｍ）を作製した。なお、変異型作製には、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、作製はキットのマニュアルに従って行った。

［手順３］
そして、作製した野生型および変異型ＤＮＡの配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。ここで、図６〜図９は、それぞれ、作製した各融合遺伝子（ＮＩ、ＮＩ＿ｍ、ＭＣ、および、ＭＣ＿ｍ）の構成を示す図である。以上の操作を行うことにより、図６に示すようにＮ末側スプリットルシフェラーゼＮＬｕｃと野生型Ｉｄ遺伝子との融合遺伝子ＮＩ（配列番号１９，２０）、図７に示すようにＮ末側スプリットルシフェラーゼＮＬｕｃと変異型Ｉｄ遺伝子との融合遺伝子ＮＩ＿ｍ（配列番号２１，２２）、図８に示すように野生型ＭｙｏＤ遺伝子とＣ末側スプリットルシフェラーゼＣＬｕｃとの融合遺伝子ＭＣ（配列番号２３，２４）、および、図９に示すように変異型ＭｙｏＤ遺伝子とＣ末側スプリットルシフェラーゼＣＬｕｃとの融合遺伝子ＭＣ＿ｍ（配列番号２５，２６）を有する発現ベクターが得られた。なお、配列番号１９，２１，２３，２５の配列は、ＤＮＡ配列であり、配列番号２０，２２，２４，２６の配列は、アミノ酸配列である。ここで、図１０および図１１は、ＭｙｏＤ遺伝子とＩｄ遺伝子の核局在シグナルの野生型および変異型アミノ酸配列を示す図である。

図１０に示すように、本実施例では、野生型ＭｙｏＤのアミノ酸配列の１０２番目、１０４番目、１１２番目のリシン残基、および、１０３番目、１１０番目、１１１番目のアルギニン残基を、アラニン残基に置換した。また、図１１に示すように、野生型Ｉｄのアミノ酸配列の７０番目、８１番目、８４番目のリシン残基、および、６８番目、８０番目のアルギニン残基をアラニン残基に置換した。これにより、核内移行に関与する領域である核局在シグナルの変異によって、ＭｙｏＤタンパク質およびＩｄタンパク質が細胞質に留まるので、スプリットルシフェラーゼが細胞質に留まることができる。

［スプリットルシフェラーゼ融合遺伝子のトランスフェクションと発光測定］
以上のように作製した融合遺伝子発現ベクター（ＮＩ、ＮＩ＿ｍ、ＭＣ、および、ＭＣ＿ｍ）を、以下の手順で細胞にトランスフェクションし、その発光を測定した。

［手順１］
ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣ社より入手し、５％ＣＯ２インキュベーター内で低グルコースＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養した。

［手順２］
そして、９６−ｗｅｌｌｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ社製）に、１ｘ１０^４／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、一晩培養した。

［手順３］
そして、ＮＩ融合遺伝子とＭＣ融合遺伝子、ＮＩ融合遺伝子とＭＣ＿ｍ融合遺伝子、ＮＩ＿ｍ融合遺伝子とＭＣ融合遺伝子、ＮＩ＿ｍ融合遺伝子とＭＣ＿ｍ融合遺伝子の組み合せで、発現ベクターを混合してＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン（株）製）を用いて、マニュアルにしたがってトランスフェクションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。

［手順４］
終濃度０．５ｍＭのルシフェリン（プロメガ（株）製）を加えて、ルミノメーター（ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒＪＮＲ−２０００（アトー（株）製））で発光量を測定した。図１２は、各発現ベクターを導入した細胞において、ルミノメーターで測定した発光量を示すグラフ図である。

［スプリットルシフェラーゼを用いた発光イメージング］
［手順１］
細胞を直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに、２ｘ１０^５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。

［手順２］
そして、ＮＩ融合遺伝子とＭＣ融合遺伝子、ＮＩ融合遺伝子とＭＣ＿ｍ融合遺伝子、ＮＩ＿ｍ融合遺伝子とＭＣ融合遺伝子、ＮＩ＿ｍ融合遺伝子とＭＣ＿ｍ融合遺伝子の組み合せで発現ベクターを混合して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン（株）製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。

［手順３］
そして、培地中にルシフェリン０．５ｍＭ（プロメガ（株）製）を加えて発光顕微鏡ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００（オリンパス（株）製）にセットし、ＣＣＤカメラＯＲＣＡ−ＥＲ（浜松ホトニクス（株）製）を用いて発光イメージを、画像解析装置１１０として構成したパーソナルコンピュータに取り込んだ。発光イメージの解析は、画像解析部１１２ｃとして機能するＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。ここで、図１３〜図１６は、各発現ベクターの組合せ（ＮＩ＋ＭＣ，ＮＩ＿ｍ＋ＭＣ，ＮＩ＋ＭＣ＿ｍ，ＮＩ＿ｍ＋ＭＣ＿ｍ）を導入したＨＥＫ２９３細胞において取得した発光イメージを示す図である。

以上の実験の結果、図１２に示すように、ＮＩ＿ｍとＭＣの組合せで導入した場合（図１４）では、両方とも野生型であるＮＩとＭＣの組合せで導入した場合（図１３参照）に比べて、約１０分の１倍の発光量を示し、ＮＩとＭＣ＿ｍの組合せ（図１５参照）では、両野生型ＮＩとＭＣの組合せ（図１３参照）に比べて約４倍強い発光量を示した。なお、両方とも変異型であるＮＩ＿ｍとＭＣ＿ｍの組合せ（図１６参照）では、両野生型ＮＩとＭＣの組合せと同程度の発光量を示していた。これにより、少なくとも一方の核局在シグナル配列を変異させれば、野生型の組合せ（ＮＩ＋ＭＣ）よりも、それぞれ約１０分の１倍、４倍、同程度の感度で測定が可能となり、実験系に応じて感度を調整することが可能となることが判った。

例えば、発光量が約４倍高くなる変異型のスプリットルシフェラーゼの組合せを用いれば、細胞質に留まったルシフェラーゼが効率よく再構成され、従来の方法より４倍強いシグナルが得られる。また、発光量が約１０倍低くなる変異型のスプリットルシフェラーゼの組合せを用いることによって、従来より１０倍弱いシグナルが得られ、発光強度差が過大とならないよう発光強度を調節することができる。

以上、本実施例によれば、対象タンパク質が核局在シグナル配列を含む場合であっても、タンパク質間相互作用の動態を精度よく解析することができ、その結果、実験の再現性を改善することができる。

［他の実施の形態］
上述した実施の形態においては、主に、分割された発光酵素をスプリットルシフェラーゼとして説明を行ったが、本発明はこれに限られず、スプリットルシフェラーゼに替えてスプリットＧＦＰを用いてもよい。なお、この場合、細胞へのルシフェリン添加に替えて励起光を照射することができる。

以上のように、本発明にかかるタンパク質相互作用解析方法、ポリヌクレオチド、および、組成物は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。

発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示すブロック図である。発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示すブロック図である。発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。スプリットルシフェラーゼアッセイの検出原理を示す図である。作製した融合遺伝子ＮＩの構成を示す図である。作製した融合遺伝子ＮＩ＿ｍの構成を示す図である。作製した融合遺伝子ＭＣの構成を示す図である。作製した融合遺伝子ＭＣ＿ｍの構成を示す図である。ＭｙｏＤ遺伝子の核局在シグナルの野生型および変異型アミノ酸配列を示す図である。Ｉｄ遺伝子の核局在シグナルの野生型および変異型アミノ酸配列を示す図である。各発現ベクターを導入した細胞において、ルミノメーターで測定した発光量を示すグラフ図である。ＮＩ発現ベクターとＭＣ発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞において取得した発光イメージを示す図である。ＮＩ＿ｍ発現ベクターとＭＣ発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞において取得した発光イメージを示す図である。ＮＩ発現ベクターとＭＣ＿ｍ発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞において取得した発光イメージを示す図である。ＮＩ＿ｍ発現ベクターとＭＣ＿ｍ発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞において取得した発光イメージを示す図である。

符号の説明

１００発光観察システム
１０３容器（シャーレ）
１０４ステージ
１０６発光画像撮像ユニット
１０６ａ対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂダイクロイックミラー
１０６ｃＣＣＤカメラ
１０６ｄスプリットイメージユニット
１０６ｅフィルターホイール
１０６ｆ結像レンズ
１１０画像解析装置
１１２制御部
１１２ａ発光画像撮像指示部
１１２ｂ発光画像取得部
１１２ｃ画像解析部
１１２ｄ解析結果出力部
１１４クロック発生部
１１６記憶部
１１８通信インターフェース部
１２０入出力インターフェース部
１２２入力装置
１２４出力装置

Claims

細胞内においてタンパク質の相互作用を解析するタンパク質相互作用解析方法であって、
互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させたＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素とを調整し、前記Ｎ末側発光酵素と融合させた一方の前記タンパク質、および、前記Ｃ末側発光酵素と融合させた他方の前記タンパク質を含む前記細胞を作製する作製工程と、
前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、
前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を複数枚撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記タンパク質の相互作用の動態を解析する解析工程と、
を含み、
前記作製工程では、少なくとも一方の前記タンパク質の核局在シグナル配列を変異させ、
一方の前記タンパク質は、ＭｙｏＤタンパク質であり、
前記変異は、前記ＭｙｏＤタンパク質の核局在シグナル配列に対応する、アミノ酸番号１０２番目、１０４番目および１１２番目のリシン残基、ならびに、１０３番目、１１０番目および１１１番目のアルギニン残基をアラニンに置換し、
前記解析工程では、複数枚の発光画像に基づき、細胞内での前記タンパク質の移動および相互作用状態の変動を解析すること、
を特徴とするタンパク質相互作用解析方法。
細胞内においてタンパク質の相互作用を解析するタンパク質相互作用解析方法であって、
互いに結合することにより発光酵素活性が回復するよう分割させたＮ末側発光酵素とＣ末側発光酵素を調整し、前記Ｎ末側発光酵素と融合させた一方の前記タンパク質、および、前記Ｃ末側発光酵素と融合させた他方の前記タンパク質を含む前記細胞を作製する作製工程と、
前記作製工程で作製した前記細胞に当該細胞外から所定の発光基質を添加する添加工程と、
前記添加工程で前記所定の発光基質が与えられた前記細胞の発光画像を複数枚撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、前記細胞内における前記タンパク質の相互作用の動態を解析する解析工程と、
を含み、
前記作製工程では、少なくとも一方の前記タンパク質の核局在シグナル配列を変異させ、
一方の前記タンパク質は、Ｉｄタンパク質であり、
前記変異は、前記Ｉｄタンパク質の核局在シグナル配列に対応する、アミノ酸番号７０番目、８１番目および８４番目のリシン残基、ならびに、６８番目および８０番目のアルギニン残基をアラニンに置換し、
前記解析工程では、複数枚の発光画像に基づき、細胞内での前記タンパク質の移動および相互作用状態の変動を解析すること、
を特徴とするタンパク質相互作用解析方法。
請求項１に記載のタンパク質相互作用解析方法において、
他方の前記タンパク質は、野生型Ｉｄタンパク質であること、
を特徴とするタンパク質相互作用解析方法。
請求項２に記載のタンパク質相互作用解析方法において、
他方の前記タンパク質は、野生型ＭｙｏＤタンパク質であること、
を特徴とするタンパク質相互作用解析方法。
請求項１乃至４のいずれか一つに記載のタンパク質相互作用解析方法において、
前記Ｎ末側発光酵素は、ホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号１番目から４１６番目のアミノ酸配列を含むＮ末側スプリットルシフェラーゼであり、
前記Ｃ末側発光酵素は、前記ホタルルシフェラーゼのアミノ酸番号３９９番目から５５０番目のアミノ酸配列を含むＣ末側スプリットルシフェラーゼであること、
を特徴とするタンパク質相互作用解析方法。
Ｃ末側スプリットルシフェラーゼと、核局在シグナル配列を含むＭｙｏＤタンパク質と、の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、
前記ＭｙｏＤタンパク質の前記核局在シグナル配列に対応する、アミノ酸番号１０２番目、１０４番目および１１２番目のリシン残基、ならびに、１０３番目、１１０番目および１１１番目のアルギニン残基が、アラニン残基をコードするよう変異されたこと、
を特徴とするポリヌクレオチド。
請求項６に記載のポリヌクレオチドと、
Ｎ末側スプリットルシフェラーゼと野生型Ｉｄタンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
を少なくとも含む組成物。
Ｎ末側スプリットルシフェラーゼと、核局在シグナル配列を含むＩｄタンパク質と、の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、
前記Ｉｄタンパク質の前記核局在シグナル配列に対応する、アミノ酸番号７０番目、８１番目および８４番目のリシン残基、ならびに、６８番目および８０番目のアルギニン残基が、アラニン残基をコードするよう変異されたこと、
を特徴とするポリヌクレオチド。
請求項８に記載のポリヌクレオチドと、
Ｃ末側スプリットルシフェラーゼと野生型ＭｙｏＤタンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
を少なくとも含む組成物。