JP5060931B2

JP5060931B2 - カルシウム測定方法

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Publication number: JP5060931B2
Application number: JP2007318834A
Authority: JP
Inventors: 崇杉山; 浩文鈴木; モーティメィ
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2007-12-10
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2027-12-10
Also published as: JP2009139336A

Description

本発明は、細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を測定するカルシウム測定方法に関するものであって、さらにはカルシウムによって誘導される遺伝子発現を１細胞ごと測定する方法に関する。

生物発光を用いた細胞内カルシウムイオン濃度の測定には、これまでエクオリンという発光タンパク質が用いられてきた。エクオリンはアポエクオリンというカルシウム結合タンパク質とセレンテラジンという発光基質から出来ており、これにカルシウムが結合すると極大波長４６０ｎｍの光を発する。これまでエクオリンは、マイクロインジェクション法などにより卵などの細胞に導入され、刺激による細胞内のカルシウムイオン濃度の変化が計測されていた。

細胞内でのカルシウムの伝達に引き続き、核内の遺伝子の発現がどのように調節されていくのかを測定するには、発光酵素であるホタルのルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイ（プロモーターアッセイ）という、カルシウム測定とは全く別の手法を用いなければならない。この測定では、ルミノメーターを用いて細胞全体からの発光シグナルを測定するため、細胞群全体の平均測定であり、個々の細胞についての解析はできない。また、ルシフェラーゼには、その種類に応じて多様な発光色を持つことが知られている。そして、現状では、すり潰された大量の細胞から、異なる各発光色のシグナルをルミノメーターを用いて同一の測定時間で検出している。しかし、各発光色の正確な定量的結果を得ることが難しい。そこで、大量の細胞を１つの溶解溶液にまとめ、複数色の発光酵素を含む細胞中の各発光酵素による相対光量を同時に測定する特許文献１を用いれば、各発光色の正確な定量的結果を得ることが可能となる。

特開２００７−２１８７７４号公報

しかしながら、従来技術では、大量の細胞を１つの溶解溶液にまとめるので、各細胞から各発光色の正確な定量的結果を得ることができず、ゆえに、同一の細胞についての遺伝子の調節発現を画像として観察することができないという問題点があった。すなわち、外界からの刺激を受けた細胞がカルシウムのシグナルとして細胞内に伝え、それを受けてどのような遺伝子の発現が調節されて、いろいろな細胞に分化していくのかという過程を１細胞づつ画像として捉えることは出来なかった。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、各細胞から各発光色の正確な定量的結果を得ることができ、その結果、同一の細胞についてカルシウムイオン濃度の変化を経時的に観察した後に、カルシウムによって誘導される遺伝子の発現過程およびその後の細胞分化の様子を観察することができるカルシウム測定方法を提供することを目的とする。

上述した課題に対し、本発明者らは、生物発光による観察が可能な撮像を行うことにより、エクオリンを用いた細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、その後の特定遺伝子に関する発現過程とのそれぞれを、細胞ごとに画像として解析することによって、課題を解決できた。従って、上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかるカルシウム測定方法は、細胞内のカルシウムイオン濃度の変化を測定するカルシウム測定方法であって、前記カルシウムイオン濃度に依存して発光するよう発光標識された前記細胞を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記細胞の発光画像を、当該細胞に当該細胞外から所定の刺激を所定のタイミングで与えつつ繰り返し撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像に基づいて、前記細胞から発せられる発光の発光強度を経時的に測定する測定工程と、を含むことを特徴とする。

さらに、本発明にかかるカルシウム測定方法は、同一細胞に、カルシウムによって発現が調節される遺伝子群をモニターできるようにする細胞を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記細胞の発光画像を、当該細胞に当該細胞外から所定の刺激を所定のタイミングで与えつつ繰り返し撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像に基づいて、前記細胞から発せられる発光の発光強度を経時的に測定する測定工程と、を含むことを特徴とする。さらに、本発明にかかるカルシウム測定方法は、カルシウム測定に起因する発光シグナルと遺伝子発現の測定に起因する発光シグナルとを分離し、同時に測定できる測定工程を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかるカルシウム測定方法は、前記作製工程が、特定の遺伝子の発現量に依存して発光するよう発光標識された前記細胞を作成する工程を含み、且つ前記撮像工程が、カルシウムイオンに対し標識された細胞と同一の細胞を含む撮像視野において継続的な撮像を行う工程を含むことを特徴とする。また、本発明にかかるカルシウム測定方法は、前記特定の遺伝子が、カルシウムによって発現が調節される遺伝子群から選ばれることを特徴とする。また、本発明にかかるカルシウム測定方法は、前記特定の遺伝子がｃ−ｆｏｓ遺伝子であることを特徴とする。また、本発明にかかるカルシウム測定方法は、前記作製工程に用いる前記特定の遺伝子に対応する発光標識が、カルシウムイオンに対する発光標識とは異なる発光波長を有することを特徴とする。また、本発明にかかるカルシウム測定方法は、前記撮像工程が、前記カルシウム依存性の発光標識を選択的に繰り返し撮像する工程を含んでいることを特徴とする。また、本発明にかかるカルシウム測定方法は、前記撮像工程が複数の異なる細胞について同時に実行され、前記測定工程が複数の発光画像を細胞ごとに照合する工程を含むことを特徴とする。

本発明によれば、カルシウムイオン濃度に依存して発光するシステムと、遺伝子の発現量に依存して発光するシステムを併せ持つよう発光標識された細胞を作製し、作製した細胞の発光画像を、当該細胞に当該細胞外から所定の刺激を所定のタイミングで与えつつ繰り返し撮像し、撮像した複数の発光画像に基づいて、細胞から発せられるそれぞれの発光の発光強度を分離して、経時的に測定する。これにより、各細胞から各発光色の正確な定量的結果を得ることができ、その結果、同一の細胞についてカルシウムイオン濃度の変化と、それに引き続く遺伝子の発現の調節および細胞の分化過程を経時的に観察することができるという効果を奏する。

以下に、本発明にかかるカルシウム測定方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。

まず、本発明にかかるカルシウム測定方法で用いる発光観察システム１００の構成について、図１、図２および図３を参照して説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。

図１に示すように、発光観察システム１００は、細胞１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよい。これにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。

細胞１０２は、例えば、カルシウムイオン濃度に依存して発光するよう発光標識された生きた細胞である。細胞１０２には、当該細胞外から所定の刺激（例えば薬物刺激など）が与えられる。

発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、細胞１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）^２の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、細胞１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には細胞１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。

ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、細胞１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された細胞１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、細胞１０２から発せられた発光をフィルタ交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。

記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。

制御部１１２は、ＯＳ（ＯｐｅｒａｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。

発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。制御部１１２は、発光画像撮像指示部１１２ａを制御して、細胞１０２の発光画像および明視野画像を繰り返し撮像する。

画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した複数の発光画像に基づいて、細胞１０２から発せられる発光の発光強度を経時的に測定する。解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。具体的には、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、細胞１０２から発せられる発光の発光強度に関する時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示する。

細胞機能の動態を考える際に、細胞内のイオン濃度の変化、とりわけ、細胞内のカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）の変動は重要なファクターである。外界から刺激を受けると、細胞内Ｃａ^２＋濃度が上昇し、細胞内へ様々な情報を伝達する。Ｃａ^２＋の細胞質伝達経路は主に二つ存在し、一つは細胞膜上のＣａ^２＋チャネルを介した細胞外からの流入経路であり、もう一つは細胞内の小器官から細胞質へと遊離する経路である。

本実施例１では、培養細胞に外部刺激を加えて、細胞質へのＣａ^２＋の誘導を行った。さらに、細胞質Ｃａ^２＋濃度の上昇を発光として検出するために、Ｃａ^２＋と結合すると発光する性質を持つエクオリン類似発光タンパク質“オベリン”を用いて、発光イメージングシステム“ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ”（オリンパス（株）製）によるカルシウムイメージングを行った。つまり、細胞内にオベリンタンパク質を発現させて発光イメージングを行うことで、細胞内カルシウムイオンの変動を観察した。

本実施例１における実験の流れ（手順）について、以下に説明する。
［手順１］ＨｅＬａ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／オベリン発現ベクターを遺伝子導入し、一晩培養する。
［手順２］一晩培養したＨｅＬａ細胞の発光観察を行う。
［手順３］ＨｅＬａ細胞にセレンテラジン（最終濃度６０μＭ）を加えて、４時間静置する。
［手順４］ＨｅＬａ細胞をＡＴＰ（最終濃度５００μＭ）で刺激する。
［手順５］手順４の直後、ＨｅＬａ細胞をＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷにセットし、３０秒間隔で発光画像および明視野画像のタイムラプス撮影を行う。発光観察条件として、対物レンズの倍率は２０倍、露出時間は２５秒、ｂｉｎｎｉｎｇは２×２、ＣＣＤカメラはｉＸｏｎ（ＡＮＤＯＲ社製）、である。
［手順６］タイムラプス撮像開始から２０分後、Ｉｏｎｏｍｙｓｉｎ（最終濃度１μＭ）で再刺激を行う。
［手順７］引き続き、ＨｅＬａ細胞の発光画像および明視野画像のタイムラプス撮像を行う。
［手順８］手順５で撮影した各々の発光画像とそれに対応する明視野画像とを重ね合わせ、その重ね合わせた画像に対して複数のＲＯＩ（ＲｅｇｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定する（図５参照）。また、手順７で撮影した各々の発光画像とそれに対応する明視野画像とを重ね合わせ、その重ね合わせた画像に対して複数のＲＯＩを指定する（図６参照）。そして、指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、その発光強度の経時変化をグラフで表示する（図７参照）。

以上の実験の結果、各刺激に対する応答の変化をシングルセルレベルで検出することができた（図５および図６参照）。また、個々の細胞における発光強度の変化を見ると、ＡＴＰ刺激では刺激後２０分の間、細胞間の応答に大きなばらつきがあるのに対し、Ｉｏｎｏｍｙｓｉｎ刺激ではばらつきが少ないことが分かった（図７参照）。これまでのカルシウムイメージング法を用いた研究から、Ｃａ^２＋濃度変化の細胞内分布あるいは時間経過が異なると、シグナルの意味が異なることが明らかにされている。しかし、従来のルミノメーターを用いた解析では、細胞集団全体の観測に留まり、個々の細胞の応答までは解析できなかった。ところが、ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷでは、生体内の変化を１細胞毎にリアルタイムに観察することができ、細胞内シグナルの働きを詳細に研究することができた。

カルシウムは、細胞内のシグナル伝達の１つの手段になっている。オベリンを用いたカルシウムのイメージングを行うことによって、どの細胞が外界からの刺激を受けて細胞内にシグナルを伝達したのかが分かる。そのシグナルは核に届き、ある遺伝子の発現が調節される。

本実施例２では、カルシウム応答があった特定の一細胞を、ｃ−ｆｏｓの遺伝子発現まで継続的に発光イメージで観察する。カルシウム測定によりカルシウムが充分量産出されている細胞を特定して、その後、所望の遺伝子（例えばｃ−ｆｏｓ）発現を発光イメージングで観察することにより、同一細胞の発現量の変化を追跡する。この観察系によって、細胞の刺激の受容から細胞内シグナル伝達、遺伝子の発現調節、その後の細胞の振る舞いを調べることができる。

本実施例２における実験の流れ（手順）について、以下に説明する。
［手順１］ＨｅＬａ細胞をf３５‐ｍｍガラスボトムディッシュ（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）にまいて、１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養する。
［手順２］ＨｅＬａ細胞がガラスボトムディッシュの底に張り付いたのを確認した後、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のプロモーターで発現が誘導されるオベリン遺伝子の発現ベクターおよびヒトのｃ−ｆｏｓプロモーターで発現が誘導されるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターを、ＦｕＧＥＮＥＨＤ（ロシュ社製）を用いて添付のマニュアル通りにＨｅＬａ細胞に遺伝子導入する。
［手順３］遺伝子導入を行ったＨｅＬａ細胞をＣＯ_２インキュベーター内で一晩培養する。
［手順４］培養液を、１ｍＭのルシフェリン（プロメガ社製）および１／１００容量のＲｅｎｉｌｌａＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ社製）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ）に交換して、引き続きＣＯ_２インキュベーター内で４時間静置する。
［手順５］遺伝子導入したＨｅＬａ細胞を培養したディッシュを、発光イメージングシステム“ＬＶ−２００”（オリンパス社製）のステージに設置し、２０倍の対物レンズを用いてその細胞を観察する。手順６に示す刺激を行う前の１分間のオベリン遺伝子の発光を３０秒おきに発光画像として取得する。発光画像および明視野画像は、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（ＩＸＯＮ、Ａｎｄｏｒ社製）を用いて撮像した後、それら画像をパーソナルコンピュータに取り込んだ。各画像の解析および保存は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いて行った。
［手順６］ＡＴＰ（和光純薬社製）を終濃度５００mＭとなるように培地へ加えることでＨｅＬａ細胞への刺激を行う。
［手順７］刺激を行った直後から１９分間、オベリン遺伝子の発光を３０秒おきに発光画像として取得する。なお、発光した細胞をオベリン遺伝子発現細胞として同定した。さらに、刺激を行った２０分後から１２時間後まで、ルシフェラーゼ遺伝子の発光を１２分おきに発光画像として取得する。なお、発光した細胞をルシフェラーゼ遺伝子発現細胞として同定した。なお、ルシフェラーゼ遺伝子の発光画像を取得する際には、オベリン遺伝子の発光を遮断するために６１０ＡＬＰフィルター（オメガ社製）を用いた。
［手順８］手順５および手順７で取得した画像を市販の画像処理用ソフトウェアであるＭｅｔａｍｏｒｐｈを用いて解析を行い、画像の輝度値を発光強度と見做してグラフを作成する。オベリン遺伝子の発光画像とルシフェラーゼ遺伝子の発光画像を重ね合わせて、両方の発光が得られた細胞を、オベリン遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を共発現する細胞として同定し発光強度変化の解析を行う。オベリン遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子の両方の発光が得られた３個の細胞（Ｃｅｌｌ１，２，３と命名）を選択し、それぞれの発光画像を図８、図９および図１０に示した。また、選択した各細胞においてＡＴＰによる刺激前後のオベリン遺伝子の発光強度を経時的にプロットし、グラフを作成した（図１１、図１２および図１３参照）。さらに、選択した各細胞においてＡＴＰによる刺激後のルシフェラーゼ遺伝子の発光強度を経時的にプロットし、グラフを作成した（図１４、図１５および図１６参照）。

「オベリン遺伝子はカルシウムイオン濃度依存的に発光する」ことから、オベリン遺伝子の発光強度が強くなったときに細胞内のカルシウムイオン濃度が上がったと想定することが出来る。上記の実験結果より、細胞によってＡＴＰ投与からカルシウムイオン濃度の上昇までの時間が異なっていることがわかった。一方、ルシフェラーゼ遺伝子はｃ−ｆｏｓプロモーターで発現が誘導されるので、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度が強くなったときにｃ−ｆｏｓプロモーターの活性があがったと想定することが出来る。実験結果より、細胞によってＡＴＰ投与からｃ−ｆｏｓプロモーター活性上昇までの時間が異なっていることがわかった。また、ＡＴＰの刺激によりカルシウムイオン濃度が上昇してからｃ−ｆｏｓプロモーター活性上昇までの時間は細胞によりまちまちであり、時間的な相関関係は見られなかった。

以上のように、本発明にかかるカルシウム測定方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。

発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。ＡＴＰ刺激１６分後の発光画像と明視野画像との重ね合わせ画像を示す図である。Ｉｏｎｏｍｙｓｉｎ刺激５分後の発光画像と明視野画像との重ね合わせ画像を示す図である。外部刺激によるオベリンタンパク質の発光強度の変化を示す図である。オベリン遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子の発光が見られた細胞の発光画像を示す図である。オベリン遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子の発光が見られた細胞の発光画像を示す図である。オベリン遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子の発光が見られた細胞の発光画像を示す図である。選択した細胞でのＡＴＰ刺激によるオベリン遺伝子の発光強度の経時変化を示した図である。選択した細胞でのＡＴＰ刺激によるオベリン遺伝子の発光強度の経時変化を示した図である。選択した細胞でのＡＴＰ刺激によるオベリン遺伝子の発光強度の経時変化を示した図である。選択した細胞でのルシフェラーゼ遺伝子の発光強度の経時変化を示した図である。選択した細胞でのルシフェラーゼ遺伝子の発光強度の経時変化を示した図である。選択した細胞でのルシフェラーゼ遺伝子の発光強度の経時変化を示した図である。

符号の説明

１００発光観察システム
１０３容器（シャーレ）
１０４ステージ
１０６発光画像撮像ユニット
１０６ａ対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂダイクロイックミラー
１０６ｃＣＣＤカメラ
１０６ｄスプリットイメージユニット
１０６ｅフィルターホイール
１０６ｆ結像レンズ
１１０画像解析装置
１１２制御部
１１２ａ発光画像撮像指示部
１１２ｂ発光画像取得部
１１２ｃ画像解析部
１１２ｄ解析結果出力部
１１４クロック発生部
１１６記憶部
１１８通信インターフェース部
１２０入出力インターフェース部
１２２入力装置
１２４出力装置

Claims

細胞内のカルシウムイオン濃度に依存して発光するよう発光標識された前記細胞を作製する作製工程と、
前記作製工程で作製した前記細胞の発光画像を、当該細胞に当該細胞外から所定の刺激を所定のタイミングで与えつつ繰り返し撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した複数の前記発光画像に基づいて、前記細胞から発せられる発光の発光強度を経時的に測定する測定工程と、
を含み、
前記撮像工程は、複数の異なる細胞について同時に実行され、
前記測定工程は、複数の発光画像を細胞ごとに照合することを特徴とするカルシウム測定方法。
前記作製工程が、特定の遺伝子の発現量に依存して発光するよう発光標識された前記細胞を作成する工程を含み、且つ前記撮像工程が、カルシウムイオンに対し標識された細胞と同一の細胞を含む撮像視野において継続的な撮像を行う工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のカルシウム測定方法。
前記特定の遺伝子が、カルシウムによって発現が調節される遺伝子群から選ばれることを特徴とする請求項２に記載のカルシウム測定方法。
前記特定の遺伝子がｃ−ｆｏｓ遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載のカルシウム測定方法。
前記作製工程に用いる前記特定の遺伝子に対応する発光標識が、前記カルシウムイオンに対する発光標識とは異なる発光波長を有することを特徴とする請求項２または３に記載のカルシウム測定方法。
前記撮像工程が、カルシウム依存性の発光標識を選択的に繰り返し撮像する工程を含んでいることを特徴とする請求項２から５のいずれか１つに記載のカルシウム測定方法。