JP2014176363A - 光受容体の光応答解析方法 - Google Patents
光受容体の光応答解析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014176363A JP2014176363A JP2013053886A JP2013053886A JP2014176363A JP 2014176363 A JP2014176363 A JP 2014176363A JP 2013053886 A JP2013053886 A JP 2013053886A JP 2013053886 A JP2013053886 A JP 2013053886A JP 2014176363 A JP2014176363 A JP 2014176363A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- image
- cell
- light
- calcium
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】ステップS1において、光を感知する光受容体遺伝子と、カルシウムを感知する発光レポーターと、カルシウムを感知する蛍光レポーターとを含む細胞を作製する。ステップS2において、細胞からの発光を促して発光画像を撮像する。ステップS3において、細胞からの蛍光を促して蛍光画像を撮像する。ステップS4において、光照射のタイミングであると判定されたとき、ステップS5において、細胞に照射光を照射する。ステップS6において、撮像終了でないと判定されたとき、繰り返し発光画像と蛍光画像との撮像を行う。撮像終了後、ステップS7において、発光画像及び蛍光画像に基づいて、光照射に対する細胞におけるカルシウム濃度の変化を解析する。
【選択図】図1
Description
本発明の第1の実施形態について図面を参照して説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。本実施形態に係る光受容体の光応答解析方法の概略を図1に示す。ステップS1において、光を感知する光受容体遺伝子と、カルシウムを感知する発光レポーターと、カルシウムを感知する蛍光レポーターとを含む細胞が調製される。
ヒト由来のオプシン5遺伝子の全長を合成し、その端部にBamHI制限酵素サイトとEcoRI制限酵素サイトとを設けた。このオプシン5遺伝子を、動物細胞発現用プラスミドであるpcDNA3.1(インビトロジェン社製)のBamHI部位とEcoRI部位の間に挿入し、動物細胞発現用プラスミドpcDNA/OPN5を作製した。
特開2012−051824号公報に記載された方法で、カルシウム感受性発光タンパク質発現用プラスミドpcDNA/cpGL4_C_CaM−M13_Nを作製した。pcDNA/cpGL4_C_CaM−M13_Nの作製方法を簡単に説明する。
[cpNLuc遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
cpNLuc_Fw(配列番号1):5´−ATCAGATCTGAAGATGCCAAAAACATTAAG−3´
cpNLuc_Rv(配列番号2):5´−CTAGAATTCTTAGTCCTTGTCGATGAGAGC−3´
[cpCLuc遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
cpCLuc_Fw(配列番号3):5´−TGTGGATCCAGCCACCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCC−3´
cpCLuc_Rv(配列番号4):5´−CAGCTCGAGCACGGCGATCTTGCCGCCCTT−3´
また、カルモジュリン(CaM)及びM13のクローニングのための、PCRに用いる合成オリゴDNAを以下に示す配列で調製した。
[CaM−M13遺伝子作製用合成オリゴDNA配列]
CaM−M13_Fw(配列番号5):5´−GCCCTCGAGCATGACCAACTGACAGAAGAG−3´
CaM−M13_Rv(配列番号6):5´−CATGGATCCCAGTGCCCCGGAGCTGGAGAT−3´
鋳型としてpGL4.10(プロメガ(株)製)を用いて、ホタルルシフェラーゼの各断片をPCRによりクローニングした。配列番号1及び配列番号2のオリゴDNAを用いて円順列置換センサータンパク質用のN末端側断片遺伝子(cpNLuc:GL4.10遺伝子の1番目から416番目のアミノ酸を含む)を増幅した。また、配列番号3及び配列番号4のオリゴDNAを用いて円順列置換センサータンパク質用のC末端側断片遺伝子(cpCLuc:GL4.10遺伝子の399番目から550番目のアミノ酸を含む)を増幅した。
HEK293細胞における光照射によるカルシウム濃度変動の発光イメージングについて説明する。
HEK293細胞は、ATCC社より入手した。HEK293を、5% CO2インキュベーター内で、10% Fetal Bovine Serum、及び1x Nonessential amino acidsが添加されたEarle's MEM/培地(GIBCO社製)を用いて培養した。
HEK293細胞を直径35mmガラスボトムディッシュに2×105/dishの細胞密度で播種し、5% CO2インキュベーター内で一晩培養した。ヒトのオプシン5発現用プラスミドpcDNA/OPN5、及び記載のカルシウム感受性発光タンパク質発現用プラスミドpcDNA/cpGL4_C_CaM−M13_Nを、FuGENE HD(ロシュ社製)を用いてトランスフェクションした。その後トランスフェクションされた細胞を、5% CO2インキュベーター内で一晩培養した。
一晩培養後の細胞の培地中にルシフェリン(プロメガ社製)を終濃度2mMとなるように、また、11−cis−レチナールを終濃度10μMとなるようにそれぞれ添加した。ルシフェリン及び11−cis−レチナールの添加の後、細胞を1時間静置した。その後、細胞を発光顕微鏡LV(LUMINOVIEW)−200(オリンパス社製)にセットした。撮像装置305として、EM−CCDカメラiXon(アンドール社製)を用いた。対物レンズの倍率は40倍、露出時間は5乃至10秒間、ビニングは1×1とし、5秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。撮像した画像を、解析装置306としてのパーソナルコンピュータに取り込んだ。
タイムラプス撮影開始から5分後にCCDカメラのシャッターを閉じ、ハロゲンランプ光源から光照射(0.15乃至1.0μW、10乃至15秒間)を行った。照射後に再びCCDカメラのシャッターを開き、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。
手順3で撮影した各々の発光画像に対して、複数のROI(Region of Interest:関心領域)を指定した。また、手順4で撮影した各々の発光画像に対して、複数のROIを指定した。指定した各ROIの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定した。発光画像の解析には、Metamorphソフトウェア(ユニバーサルイメージング社製)を用いた。
HEK293細胞における光照射によるカルシウム濃度変動の蛍光イメージングについて説明する。
HEK293細胞を直径35mmガラスボトムディッシュに2×105/dishの細胞密度で播種し、5% CO2インキュベーター内で一晩培養した。ヒトのオプシン5発現用プラスミドpcDNA/OPN5を、FuGENE HD(ロシュ社製)を用いてトランスフェクションした。その後トランスフェクションされた細胞を、5% CO2インキュベーター内で一晩培養した。
(手順2:蛍光画像の撮像)
一晩培養後の細胞の培地中にFluo−4(インビトロジェン)又はCalcium Orange(インビトロジェン)を終濃度5μMとなるように、また、11−cis−レチナールを終濃度10μMとなるようにそれぞれ添加した。蛍光色素と11−cis−レチナールとの添加の後、細胞を1時間静置した。その後、細胞を蛍光顕微鏡IX−81(オリンパス社製)にセットした。撮像装置305として、CCDカメラ(ORCAII;浜松ホトニクス社製)を用いた。対物レンズの倍率は40倍、露出時間は500ミリ秒間、ビニングは1×1とし、10秒間隔で蛍光画像のタイムラプス撮影を行った。撮像した画像を、解析装置306としてのパーソナルコンピュータに取り込んだ。
タイムラプス撮影開始から5分後以降に、ハロゲンランプ光源から光照射(0.15乃至1.0μW、10乃至15秒間)を行った。照射後に引き続き蛍光画像のタイムラプス撮影を行った。
手順2で撮影した各々の蛍光画像に対して、複数のROI(Region of Interest:関心領域)を指定した。また、手順3で撮影した各々の蛍光画像に対して、複数のROIを指定した。指定した各ROIの蛍光強度を各々の蛍光画像に基づいて測定した。蛍光画像の解析には、Metamorphソフトウェア(ユニバーサルイメージング社製)を用いた。
測定1の光照射によるカルシウム濃度変動の発光イメージングの結果を示す。図5に、光照射前の発光画像の一例を示す。また、図6に、光照射後の発光画像の一例を示す。図5及び図6において、四角形は、ROIを示す。また、これら発光画像から得られた発光輝度の継時変化を図7に示す。
Claims (16)
- 光を感知する光受容体遺伝子と、カルシウムを感知する発光レポーターと、カルシウムを感知する蛍光レポーターとを含む対象細胞を作製することと、
前記対象細胞からの発光を促して前記対象細胞の発光画像を繰り返し撮像することと、
前記対象細胞からの蛍光を促して前記対象細胞の蛍光画像を繰り返し撮像することと、
少なくとも1回の前記対象細胞に照射光を照射することと、
繰り返し取得した前記発光画像及び前記蛍光画像に基づいて、前記対象細胞におけるカルシウムの濃度を解析することと、
を具備する光受容体の光応答解析方法。 - 前記光受容体遺伝子は、ヒトのオプシン5遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記発光レポーターは、発光タンパク質である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記発光レポーターは、円順列置換したルシフェラーゼ、カルモジュリン、及びM13ペプチドを含む改変タンパク質である、請求項3に記載の方法。
- 前記発光を促すことは、発光基質を添加することである、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記蛍光レポーターは、蛍光物質である、請求項1乃至5のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記蛍光画像の撮像において、500乃至700nmの波長を含む励起光を照射することにより前記蛍光を促す請求項1乃至6のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記蛍光画像の撮像において、540乃至600nmの波長を含む励起光を照射することにより前記蛍光を促す請求項7に記載の方法。
- 前記発光画像の撮像及び前記蛍光画像の撮像には、発光顕微鏡が用いられる請求項1乃至8のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記発光画像の撮像及び前記蛍光画像の撮像は連続的に行われる、請求項1乃至9のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記照射光の波長は、340乃至600nmである、請求項1乃至10のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記照射光の波長は、360乃至400nmである、請求項11に記載の方法。
- 前記照射光の強度は、
前記発光画像の取得時には、0.1乃至1000μW/mm2であり、
前記蛍光画像の取得時には、1乃至100mW/mm2である、
請求項1乃至12のうち何れか1項に記載の方法。 - 前記照射光の強度は、
前記発光画像の取得時には、0.3乃至3.0μW/mm2であり、
前記蛍光画像の取得時には、3乃至30mW/mm2である、
請求項13に記載の方法。 - カルシウムの濃度の解析は、前記発光画像の輝度及び前記蛍光画像の輝度に基づいて行われる、請求項1乃至14のうち何れか1項に記載の方法。
- 前記対象細胞の明視野画像を撮像することをさらに具備し、
カルシウムの濃度の解析において、前記発光画像及び/又は前記蛍光画像を前記明視野画像に重ね合わせることで、前記発光及び/又は前記蛍光を発している前記対象細胞を同定する、
請求項1乃至15のうち何れか1項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013053886A JP2014176363A (ja) | 2013-03-15 | 2013-03-15 | 光受容体の光応答解析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013053886A JP2014176363A (ja) | 2013-03-15 | 2013-03-15 | 光受容体の光応答解析方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014176363A true JP2014176363A (ja) | 2014-09-25 |
Family
ID=51697064
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013053886A Pending JP2014176363A (ja) | 2013-03-15 | 2013-03-15 | 光受容体の光応答解析方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2014176363A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017192313A (ja) * | 2016-04-18 | 2017-10-26 | 学校法人 工学院大学 | 情報処理装置、方法、及びプログラム |
CN111103272A (zh) * | 2018-10-26 | 2020-05-05 | 山东大学 | 细胞特异性光敏效应的实时筛查与测量系统及方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004061438A (ja) * | 2002-07-31 | 2004-02-26 | Bio Oriented Technol Res Advancement Inst | 化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法 |
JP2010246534A (ja) * | 2009-03-24 | 2010-11-04 | Olympus Corp | 光シグナル解析方法 |
JP2012196183A (ja) * | 2011-03-22 | 2012-10-18 | Olympus Corp | 紫外光測定方法 |
-
2013
- 2013-03-15 JP JP2013053886A patent/JP2014176363A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004061438A (ja) * | 2002-07-31 | 2004-02-26 | Bio Oriented Technol Res Advancement Inst | 化学発光および蛍光の経時変化測定装置および方法 |
JP2010246534A (ja) * | 2009-03-24 | 2010-11-04 | Olympus Corp | 光シグナル解析方法 |
JP2012196183A (ja) * | 2011-03-22 | 2012-10-18 | Olympus Corp | 紫外光測定方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6016026214; '"Long-Wabelength Calcium Indicators"' Product Information of Molecular Probes, Inc. , 20050915, p. 1-5 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017192313A (ja) * | 2016-04-18 | 2017-10-26 | 学校法人 工学院大学 | 情報処理装置、方法、及びプログラム |
CN111103272A (zh) * | 2018-10-26 | 2020-05-05 | 山东大学 | 细胞特异性光敏效应的实时筛查与测量系统及方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zou et al. | Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET | |
Yang et al. | Coupling optogenetic stimulation with NanoLuc-based luminescence (BRET) Ca++ sensing | |
Zhang et al. | Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations | |
Akerboom et al. | Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics | |
Wu et al. | A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging | |
Lin et al. | Genetically encoded indicators of neuronal activity | |
Inagaki et al. | Genetically encoded bioluminescent voltage indicator for multi-purpose use in wide range of bioimaging | |
Akerboom et al. | Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging | |
Berlin et al. | Photoactivatable genetically encoded calcium indicators for targeted neuronal imaging | |
Gong et al. | Enhanced archaerhodopsin fluorescent protein voltage indicators | |
Liu et al. | Sustained deep-tissue voltage recording using a fast indicator evolved for two-photon microscopy | |
Walker et al. | Functional imaging in the zebrafish retinotectal system using RGECO | |
Lee et al. | Improving a genetically encoded voltage indicator by modifying the cytoplasmic charge composition | |
Kannan et al. | Optimizing strategies for developing genetically encoded voltage indicators | |
US10053492B2 (en) | Red genetically encoded calcium indicators and methods of use | |
JP2013240352A (ja) | 発光タンパクによる長期モニタリング方法および解析方法 | |
Hara-Kuge et al. | An improved inverse-type Ca2+ indicator can detect putative neuronal inhibition in Caenorhabditis elegans by increasing signal intensity upon Ca2+ decrease | |
Ai et al. | Green-to-red photoconversion of GCaMP | |
JP5800462B2 (ja) | 光シグナル解析方法 | |
JP2014176363A (ja) | 光受容体の光応答解析方法 | |
Chien et al. | Two-photon photoactivated voltage imaging in tissue with an Archaerhodopsin-derived reporter | |
Tanwar et al. | Optogenetic modulation of real-time nanoscale dynamics of HCN channels using photoactivated adenylyl cyclases | |
JP5875773B2 (ja) | 紫外光測定方法 | |
JP5893241B2 (ja) | カルシウム解析方法 | |
US20230296649A1 (en) | Voltage indicators |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150806 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20160630 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160712 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160906 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20161018 |