JP5800462B2 - 光シグナル解析方法 - Google Patents
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Description
受性のイオンチャネルタンパク質であり、ChR2およびNpHRを、哺乳類の神経細胞などに発現させ、特定の波長の光刺激を与えることによって、神経細胞のナトリウムイオンや塩素イオンのチャネルの開閉を制御することができる。そして、光刺激によるイオンチャネルの開閉の応答は、神経細胞の活動電位の変化として電気生理学的に電極からの信号を通して検出される(非特許文献1)。
しているトランスジェニックマウスをつくり、運動中枢などの特定領域のみに光ファイバ
ーを通して光照射できるような外科的手術を加え、光刺激とともにマウスの行動の変化を
観察する(非特許文献2および3)。
しかしながら、開始タンパク質と表現型決定遺伝子との間をつなぐシグナルタンパク質
の発現を解析するためには、新たな標識が必要となる。
な励起波長のものが存在するが、チャネルタンパク質の光刺激に用いる波長域を使用する
ことができず、例えば、DsRedのようなオレンジ色の波長域で励起するものを使用できな
いなど、使用可能な蛍光プローブの種類が著しく限定されてしまう。
<第1の実施形態>
図1は、第1の実施形態における光シグナル解析方法のフローチャートである。
先ず、標的シグナルタンパク質を解析するための発光プローブを発現する遺伝子を、生物試料に導入する(10)。 この導入ステップは、必ずしも、シグナル解析を行う直前である必要はなく、所望の目的で予め導入ステップを行った生物試料を生存可能な条件で保存(例えば培養)され、または別の使用目的(例えば明視野観察等)に使用された後の生物試料をシグナル解析を行うために使用してもよい。
のが存在するが、例えば、環状AMP(cAMP)、イノシトール三リン酸(IP3)、ジアシルグリセロール(DG)、または細胞内遊離カルシウムなどがその代表例である。
内に導入することができる。例えば、プラスミドなどの発現ベクターに発光プローブ遺伝
子を組み込み、該発現ベクターを、リン酸カルシウム法、パーティクルガン法、エレクト
ロポーレーション法、マイクロインジェクション法などを用いて生物試料内に導入しても
よい。また、アデノウイルスやレトロウイルスベクターの感染力を利用して、発光プロー
ブ遺伝子を生物試料内に導入してもよい。さらにまた、発光プローブ遺伝子を発現するト
ランスジェニック生物を作製してもよい。
、光感受性タンパク質遺伝子ともいう)を前記生物試料に導入してもよい。前記光感受性
タンパク質を十分に発現する生物試料を用いて標的シグナルタンパク質の発現を評価する
場合、光感受性タンパク質遺伝子を導入する必要は必ずしもないが、前記光感受性タンパ
ク質を全く発現していない、あるいは発現量が少ない生物試料を用いる場合、標的シグナ
ルタンパク質の発現を評価するのに適した実験系を構築する必要がある。このとき、前記
発光プローブ遺伝子とともに、光感受性タンパク質遺伝子を前記生物試料に導入すること
ができる。光感受性タンパク質遺伝子を新たに導入することで、光刺激に対する開始シグ
ナルが飽和状態となり、下流に位置するシグナル伝達系が十分に促進される。その結果、
シグナル伝達系のイメージングを高感度に行うことができる。
答速度が速く、光刺激後直ちに下流のシグナル伝達系が進行する。したがって、光刺激後
のシグナル伝達系を解析しようとする場合、光刺激系とシグナル解析系とを独立した系と
して構築することはできない。したがって、シグナル遺伝子(セカンド メッセンジャー)の解析系は、表現型決定遺伝子など、光刺激後、相当期間経過後に発現し、それ自体を独立した解析系として構築することができる諸般の遺伝子の解析系とは明らかに相違する。本発明は、光刺激系と重複せざるを得ない、このシグナル遺伝子の解析系について、従来問題であった光干渉の障害を解消するためになされたものである。なお、表現型決定遺伝子の解析系では、それ自体を独立した系として構築することができるので、そもそも光干渉の障害が生じ得ない。
続いて、前記光感受性タンパク質を活性化する刺激光を照射する(20)。
最後に、前記生物試料が発する光シグナルを検出する(30)。
第2の実施形態として、解析対象となるシグナル物質としてのシグナル標的シグナルタンパク質は2以上存在してもよい。
図2は、第1の実施形態において使用する光シグナル解析システム100の模式図である
。
光学設計となっており、観察光感受性タンパク質によって誘導されるシグナル物質を解析するための光シグナル解析システムであって、前記光感受性タンパク質を活性化する刺激光を照射する刺激光照射手段110と、前記生物試料が発する光シグナルを結像した発光画を撮像する発光画像撮像手段120と、を備えている。
ら発せられた刺激光は、分光フィルター102を通して波長領域の異なる複数の刺激光に分離され、分離された各刺激光のうち、対象である光感受性タンパク質を活性化させるために適した波長の刺激光を、光ファイバー103およびコンデンサーレンズ104を通して生物試料A全体にほぼ一様の明るさで照射する。ここで、一様な明るさで照明するための照明に関わる構成は、他の照明装置を採用してもよい。例えば、470nm付近の青色光を細胞に照射することによって、光感受性イオンチャネルタンパク質ChR2が光刺激され、ナトリウムイオンが流入して細胞が脱分極する。脱分極した細胞内ではカルシウム伝達系が働き、c-fos遺伝子の発現が促進される。なお、シャッター105は、光ファイバー103から照射される刺激光を透過または遮断することによって、生物試料Aへの刺激光の照射を切り替える。このシャッター105による刺激光の照射の切り替えは、予め所定のタイミングで1回以上照射するようにパーソナルコンピュータ130により自動制御してもよいし、コンピュータ130に付随するディスプレーと入力手段(キーボード、マウス等)を用いてディスプレーに表示された生物試料に関する画像を見ながら入力手段により使用者が手動で照射を実行するようにしてもよい。
ス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体、多孔性フィルタなどが含まれ、光透過性を有するガラス、プラスチック、樹脂等を材質とする任意の収容手段であり得る。また、サンプル用容器50は、下方からの観察を可能にするための開口部または観察窓を底面に設けた観察用ステージ60上に配置される。生物試料がマウス等の小動物や他の生物個体である場合には、容器の代わりに生物個体の所定の撮像領域が動かないようにするような固定器具を用いて不動化するのが好ましく、この場合には、正立型のように生物試料の上方から撮像を行う構成の方が好ましい。
レンズ113の光学的条件は、「(開口数/倍率)2の値が0.01以上」を満たすものであることが、遺伝子の発現に応じた発光画像を時系列に撮像する上で必要な時間間隔ごとの連続的な撮像を鮮明ないし高感度で且つ短時間に行うことができる点で好ましい。刺激光遮断手段としての発光分光フィルター112は、刺激光照射手段110による生物試料Aへの光刺激に用いた照射光を遮断し、生物試料Aから放出された発光のみを検出手段としてのカメラ(例えばCCDカメラやCMOSカメラ等)へ向けて通過させる。発光分光フィルター112を通過した発光は、結像レンズ113を通過し、CCDカメラ114によって検出される。ここで、刺激光照射手段により生物試料Aがほぼ均一に照明されているので、撮像手段としてのCCDの撮像範囲(撮像視野)全体に亘り光刺激による応答状況を同時に撮像することが可能となる。CCDカメラによって検出された発光シグナルは、パーソナルコンピュータ130に送信され、公知の種々のソフトウェアを用いた画像処理および光量計測が行われ、発光シグナルに連動した標的シグナルタンパク質の挙動性の解析が行われる。解析結果は、コンピュータ130に付随のディスプレーに所望の形式(例えば動画表示、グラフ、数値表等)で表示されることにより出力される。
ルターの切り替えは、手動であっても自動であってもよい。
別々に検出することができる。図4の構成では、バンドパスフィルターの切り替えが不要
であり、発光シグナルを同時に検出することができる。したがって、2つの標的シグナルタンパク質を同時かつ連続的にイメージングすることができる。特に、シグナル伝達系において同じ段階に位置する2以上の標的シグナルタンパク質を検出する場合に有効である。
Claims (16)
- 光感受性タンパク質によって誘導されるシグナル伝達物質を解析する光シグナル解析方法であって、
前記シグナル伝達物質を解析するための発光プローブを発現する遺伝子を導入した生物試料に対して、
発光基質を導入する発光基質導入ステップと、
前記光感受性タンパク質を活性化する刺激光を照射する刺激光照射ステップと、
前記生物試料が発する光シグナルを検出手段により光検出する光シグナル検出ステップと、を含み、
前記光シグナル検出ステップは、前記生物試料から前記検出手段へ向かう光のうち刺激光を遮断し発光を通過させることで、光刺激と光検出とを同時に行うことを特徴とする光シグナル解析方法。 - 第1および第2の光感受性タンパク質によってそれぞれ誘導される第1および第2のシグナル伝達物質を解析する光シグナル解析方法であって、
前記第1のシグナル伝達物質を解析するための第1の発光プローブを発現する遺伝子と、前記第2のシグナル伝達物質を解析するための第2の発光プローブを発現する遺伝子とを導入した生物試料に対して、前記第1および第2の光感受性タンパク質を活性化する刺激光を照射する刺激光照射ステップと、
前記生物試料が発する光シグナルのうち、第1のシグナル伝達物質に由来する光シグナルと第2のシグナル伝達物質に由来する光シグナルとを検出する光シグナル検出ステップと、
を含み、
前記光シグナル検出ステップは、前記生物試料から前記検出手段へ向かう光のうち刺激光を遮断し発光を通過させることで、光刺激と光検出とを同時に行うことを特徴とする光シグナル解析方法。 - 前記生物試料が、前記光感受性タンパク質を発現する遺伝子を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記光感受性タンパク質がチャネルタンパク質である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記シグナル伝達物質が細胞内シグナル伝達物質である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記光シグナル検出ステップが、前記生物試料が発する光シグナルを結像した発光画像を撮像する発光画像撮像ステップである、請求項1に記載の方法。
- 前記光シグナル検出ステップが、前記生物試料が発する光シグナルのうち、第1のシグナル物質に由来する光シグナルと、第2のシグナル物質に由来する光シグナルとを別々に結像した発光画像を撮像する発光画像撮像ステップである、請求項2に記載の方法。
- 前記刺激光照射ステップが、前記発光画像撮像ステップにおける撮像視野全体をほぼ一様に照射する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記光シグナル検出ステップが、刺激光照射ステップで照射された刺激光を遮断するステップをさらに含む請求項1、6、7、8の何れかに記載の方法。
- 前記生物試料が、動物(ヒトを除く)、植物、菌類、真核単細胞生物、および原核生物からなる群から選択された生物体である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生物試料が、生物体の器官またはその組織片である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生物試料が、細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 光感受性タンパク質によって誘導されるシグナル伝達物質を解析する光シグナル解析システムであって、
前記光感受性タンパク質を活性化する刺激光を生物試料に対し照射する刺激光照射手段と、
前記生物試料が発する光シグナルを結像した発光画像を撮像する発光画像撮像手段と、
前記生物試料から前記発光画像撮像手段へ向かう光に対し、前記刺激光照射手段からの刺激光を遮断し発光を通過させる発光分光フィルタを設けたことを特徴とする光シグナル解析システム。 - 光感受性タンパク質によって誘導される第1および第2のシグナル伝達物質を解析する光シグナル解析システムであって、
前記光感受性タンパク質を活性化する刺激光を生物試料に対し照射する刺激光照射手段と、
前記生物試料が発する光シグナルのうち、第1のシグナル伝達物質に由来する光シグナルと
、第2のシグナル伝達物質に由来する光シグナルとを別々に結像した発光画像を撮像する発光画像撮像手段と、
前記生物試料から前記発光画像撮像手段へ向かう光に対し、前記刺激光照射手段からの刺激光を遮断し発光を通過させる発光分光フィルタを設けたことを特徴とする光シグナル解析システム。 - 前記刺激光照射手段が、前記発光画像撮像手段による撮像視野全体をほぼ一様に照射する手段である、請求項13から14の何れかに記載の光シグナル解析システム。
- 前記刺激光照射手段は光ファイバであることを特徴とする請求項15に記載の光シグナル解析システム。
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