CN106687588A - 钙指示基因 - Google Patents

钙指示基因 Download PDF

Info

Publication number
CN106687588A
CN106687588A CN201580038699.3A CN201580038699A CN106687588A CN 106687588 A CN106687588 A CN 106687588A CN 201580038699 A CN201580038699 A CN 201580038699A CN 106687588 A CN106687588 A CN 106687588A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
nucleotide
acid linker
sequences
asp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580038699.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106687588B (zh
Inventor
尾藤晴彦
井上昌俊
竹内敦也
中井淳
中井淳一
大仓正道
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Publication of CN106687588A publication Critical patent/CN106687588A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106687588B publication Critical patent/CN106687588B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11017—Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase (2.7.11.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种显示优异的荧光性质和钙反应性的钙报告蛋白通过提供DNA而获得，在所述DNA中，编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)的核苷酸和编码钙调素的钙结合序列(CaM序列)的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。由该DNA编码的钙报告蛋白由于具有ckkap序列作为结合钙的CaM序列的结合域，因此与现有的钙报告蛋白相比显示出优异的荧光性质和钙反应性。

Description

钙指示基因
技术领域
本发明涉及一种钙指示基因。更具体地说，本发明涉及一种荧光钙指示蛋白，其是具有钙传感器功能的荧光蛋白，并且其荧光特性和钙反应性优异。
背景技术
钙作为诸如肌肉收缩、神经刺激性、荷尔蒙分泌、酶活性改变的各种细胞功能的调节因子，对调节与维持身体机能起到了重要的作用。通常，为了测定体内(细胞外和细胞内)的钙浓度，使用称为钙传感器(钙指示剂)的蛋白。
近年来，为了在细胞水平和胞内结构域水平上分析认知活动(其为大脑高级功能的本质)，需要一种用于对伴随神经活动的钙浓度变化进行超高速成像的技术，亟待开发一种具有优异的钙反应性的荧光钙传感器。
作为实现钙传感器功能的蛋白，已知有将钙调素的部分序列和肌球蛋白轻链激酶的部分序列与荧光蛋白结合的钙指示蛋白。这种钙指示蛋白利用了如下特点：当钙与钙调素的部分序列结合时，蛋白的立体结构发生变化，从而荧光蛋白(GFP或RFP)发射的荧光强度也发生变化。例如，非专利文献1描述了一种使用mApple作为荧光蛋白的钙指示蛋白。另外，专利文献1公开了R-CaMP1.01和R-CaMP1.07，R-CaMP1.01通过改进R-GECO1制备，与R-GECO1相比显示出更大的荧光强度变化；R-CaMP1.07通过改进R-CaMP1.01制备，与R-CaMP1.01相比显示出更大的荧光强度变化和改善的细胞内定位。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2014-1161号公报
非专利文献
非专利文献1：Science,2011,333,1888-1891。
发明内容
发明所解决的技术问题
本发明的主要目的是提供一种钙指示蛋白，其相比于现有钙指示蛋白显示出更优异的荧光特性和钙反应性。
解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明提供如下(1)～(23)。
(1)一种DNA，其中，在编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(以下称为“ckkap序列”)的核苷酸和编码钙调素的钙结合序列(以下称为“CaM序列”)的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
(2)根据(1)中所述的DNA，编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合有编码ckkap序列的核苷酸，3'端侧结合有编码CaM序列的核苷酸。
(3)根据(1)或(2)中所述的DNA，编码ckkap序列的核苷酸的碱基序列可以是序列号1～3所示的任意一种碱基序列。
(4)根据(1)～(3)中所述的DNA，编码ckkap序列的核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸、以及编码荧光蛋白的核苷酸与编码CaM序列的核苷酸分别通过编码氨基酸连接子的核苷酸相结合。
(5)根据(4)中所述的DNA，编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合有编码ckkap序列的核苷酸，3'端侧结合有编码CaM序列的核苷酸，
编码ckkap序列的核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸通过编码氨基酸连接子A的核苷酸相结合，且
编码荧光蛋白的核苷酸与编码CaM序列的核苷酸通过编码氨基酸连接子B的核苷酸相结合，
氨基酸连接子A和氨基酸连接子B的组合可以是下列的任意一种：
氨基酸连接子A(-Pro-Val-)和氨基酸连接子B(-Thr-Arg)，
氨基酸连接子A(-Leu-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Met-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Leu-Glu-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Lys-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Pro-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Ala-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Gln-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，以及
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Asp-)。
(6)根据(1)～(5)任一项所述的DNA，编码CaM序列的核苷酸的碱基序列为序列号7或8所示的碱基序列。
(7)一种载体，包含(1)～(6)任一项所述的DNA。
(8)一种导入了钙指示基因的转化细胞，在该基因的编码ckkap序列的核苷酸和编码CaM序列的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
(9)一种导入了钙指示基因的除人类以外的转基因动物，在该基因的编码ckkap序列的核苷酸和编码CaM序列的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
(10)根据(8)的细胞或(9)的转基因动物，所述钙指示基因中编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合有编码ckkap序列的核苷酸，3'端侧结合有编码CaM序列的核苷酸。
(11)根据(8)的细胞或(9)的转基因动物，编码ckkap序列的核苷酸的碱基序列可以是序列号1～3所示的任意一种碱基序列。
(12)根据根据(8)的细胞或(9)的转基因动物，编码CaM序列的核苷酸的碱基序列为序列号7或8所示的碱基序列。
(13)一种蛋白，在ckkap序列和CaM序列中的一个与荧光蛋白的N末端侧结合，另一个与所述荧光蛋白的C末端侧结合。
(14)根据(13)所述的蛋白，荧光蛋白的N末端侧结合有ckkap序列，C末端侧结合有CaM序列。
(15)根据(13)或(14)所述的蛋白，其中ckkap序列可以是序列号4～6、15～19所示的任意一种氨基酸序列。
(16)根据(13)～(15)所述的蛋白，其中CaM序列可以是序列号9或10所示的氨基酸序列。
(17)根据(13)～(16)任一项所述的蛋白，其中ckkap序列与荧光蛋白，以及荧光蛋白与CaM序列分别通过氨基酸连接子结合。
(18)根据(17)所述的蛋白，其中荧光蛋白的N末端侧结合有ckkap序列，C末端侧结合有CaM序列，
ckkap序列与荧光蛋白通过氨基酸连接子A相结合，且
荧光蛋白与CaM序列通过氨基酸连接子B相结合，
氨基酸连接子A和氨基酸连接子B的组合可以是下列的任意一种：
氨基酸连接子A(-Pro-Val-)和氨基酸连接子B(-Thr-Arg)，
氨基酸连接子A(-Leu-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Met-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Leu-Glu-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Lys-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Pro-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Ala-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Gln-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，以及
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Asp-)。
(19)一种细胞动作电位的测定方法，包括荧光检测步骤，该荧光由细胞内表达的钙指示蛋白发射，其特征在于，所述钙指示蛋白为如下钙指示蛋白：在其ckkap序列和CaM序列中的一个与荧光蛋白的N末端侧结合，另一个与所述荧光蛋白的C末端侧结合。
(20)一种细胞内钙离子成像方法，包括荧光检测步骤，该荧光由细胞内表达的钙指示蛋白发射，其特征在于，所述钙指示蛋白为如下钙指示蛋白：在其ckkap序列和CaM序列中的一个与荧光蛋白的N末端侧结合，另一个与所述荧光蛋白的C末端侧结合。
(21)根据(19)所述的细胞动作电位的测定方法或(20)所述的细胞内钙离子成像方法，包括如下步骤：将钙指示基因导入所述细胞内，其中，在所述钙指示基因的编码ckkap序列的核苷酸和编码CaM序列的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
(22)一种用于细胞动作电位的测定和/或细胞内钙离子的成像的钙指示试剂，包括：DNA或包含该DNA的载体，其中，在所述DNA的编码ckkap序列的核苷酸和编码CaM序列的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
(23)根据(22)所述的试剂，所述细胞为神经细胞。
本发明的效果
根据本发明提供一种荧光特性和钙反应性优异的钙指示蛋白。
附图说明
图1是本发明提供的钙指示蛋白R-CaMP2和根据已知技术的钙指示蛋白R-CaMP1.07的结构示意图。
图2-1是本发明提供的钙指示蛋白的ckkap序列的氨基酸序列的一个实施例的示意图。
图2-2是本发明提供的钙指示蛋白的ckkap序列的氨基酸序列的另一个实施例的示意图。
图3是R-CaMP1.07、R-CaMP2以及R-GECO2L的Ca2+滴定曲线的示意图，曲线根据希尔公式拟合。
图4是R-CaMP1.07、R-CaMP2以及R-GECO2L在体外的基线荧光强度和动态范围(Finax/Fmin)的示意图。
图5是表达EGFP以及R-CaMP2(A)或R-GECO2L(B)的海马培养神经元的示意图。比例尺：10μm。
图6是对由海马培养神经元的突触末端记录的域刺激所引起的单相动作电位进行应答的荧光变化的示意图。
图7是对由海马培养神经元的细胞体记录的MNI-谷氨酸的UV释放单脉冲进行应答的荧光变化的示意图。
图8是在用单相动作电位诱发的突触末端的Ca2+成像中，一次试验(灰色)及R-CaMP1.07、R-CaMP2、R-GECO2L的各个试验的平均应答轨迹图的示意图。
图9是在用单相动作电位诱发的突触末端的Ca2+成像中，单相动作电位的振幅、SNR、上升时间、衰减时间常数的示意图。
图10是在海马培养神经元的细胞体中，谷氨酸释放的单脉冲的一次试验(n＝9)以及各个试验的平均应答轨迹的示意图。A显示R-CaMP1.07的结果，B显示R-CaMP2的结果。
图11是在海马培养神经元的细胞体中，谷氨酸释放的单脉冲的振幅、SNR、上升时间、衰减时间常数的示意图。
图12是相比于R-CaMP1.07，R-CaMP2相对于急性切片中的桶状皮层2/3层锥体细胞的动作电位(n＝10细胞)的荧光变化(ΔF/F)的示意图。
图13-1是用急性切片单相动作电位诱发的Ca2+应答的振幅、SNR、上升时间、衰减时间常数的示意图。
图13-2是相比于R-CaMP2，R-CaMP2_LLA相对于急性切片中的桶状皮层2/3层锥体细胞的动作电位(n＝10细胞)的荧光变化(ΔF/F)的示意图。
图13-3是相比于已知技术的钙指示蛋白GCaMP6s和GCaMP6f，X-CaMPGreen相对于急性切片中的桶状皮层2/3层锥体细胞的动作电位(n＝10细胞)的荧光变化(ΔF/F)的示意图。
图14是在急性切片的桶状皮层2/3层锥体细胞中，以20Hz应答1，2，4和8个峰值时，表达R-CaMP1.07和R-CaMP2的神经细胞的典型轨迹(上图)和平均性能(下图)的示意图。
图15-1是在急性切片的桶状皮层2/3层锥体细胞中，固定于5个峰值上，用不同频率刺激时，在1次试验中R-CaMP2应答的示意图(B)。(A)显示了R-CaMP1.07的结果以用于比较。
图15-2是在急性切片的桶状皮层2/3层锥体细胞中，固定于5个峰值上，用不同频率刺激时，在1次试验中R-CaMP2_LLA应答的示意图。
图15-3是在急性切片的桶状皮层2/3层锥体细胞中，固定于5个峰值上，用不同频率刺激时，在1次试验中X-CaMPGreen应答的示意图(A)。(B)显示了GCaMP6f的结果以用于比较。
图16是多个神经细胞通过体内成像记录对空气吹须刺激引起的Ca2+变化结果的示意图。
图17是同时记录体内表达R-CaMP2的新皮质神经细胞的Ca2+变化(上部)与动作电位(下部)的典型轨迹的示意图，各突发峰值数表示在轨迹的下方，比例尺为5μm。
图18是在体内的新皮质神经细胞中，在200毫秒仓(200ミリ秒のビン)内的动作电位数所诱发的Ca2+变化的振幅、SNR、时间积分值(第1、2、3、4、5个动作电位检测出n＝254、115、45、26、13事件。从n＝7只小鼠抽取9个细胞)的示意图。
具体实施方式
以下，参照附图描述实施本发明的优选实施方式。另外，以下描述的实施方式显示了本发明的代表性实施方式的一例，并不以此狭义解释本发明的范围。
1、钙指示基因和钙指示蛋白
以实施例所述的“R-CaMP2”和“R-GECO2L”等为例，对本发明的钙指示基因和钙指示蛋白进行说明。
本发明的钙指示蛋白包括荧光蛋白的氨基酸序列、钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)的钙调素结合序列(以下称为“ckkap序列”)的氨基酸序列、以及钙调素的钙结合序列(以下称为“CaM序列”)的氨基酸序列。同样，本发明的钙指示基因包括编码荧光蛋白的核苷酸、编码ckkap序列的核苷酸、以及编码CaM序列的核苷酸。
另外，本发明的钙指示蛋白可以具有结合ckkap序列与荧光蛋白的氨基酸连接子、以及结合荧光蛋白与CaM序列的氨基酸连接子。同样，本发明的钙指示基因可以具有编码结合ckkap序列与荧光蛋白的氨基酸连接子的核苷酸、以及编码结合荧光蛋白与CaM序列的氨基酸连接子的核苷酸。
在图1中，显示了本发明提供的钙指示蛋白(或钙指示基因)的结构的一个实例。图上部显示了专利文献1所述的作为常规钙指示蛋白的R-CaMP1.07的结构，下部显示了作为本发明提供的钙指示蛋白的R-CaMP2的结构。图中，“ckkap-WL”显示了ckkap序列的一个优选实例。另外，“cpApple”表示红色荧光蛋白。
在本发明的R-CaMP2中，荧光蛋白的氨基酸序列cpApple的N末端侧结合有ckkap序列，C末端侧结合有CaM序列。同样，在R-CaMP2基因中，编码荧光蛋白的核苷酸cpApple的5’端结合有编码ckkap序列的核苷酸，3’端结合有编码CaM序列的核苷酸。该结构相当于在常规R-CaMP1.07的结构中，将“M13”所示的肌球蛋白轻链激酶的钙调素结合序列替换为ckkap序列的结构。另外，本发明的R-GECO2L具有将非专利文献1所述的作为常规钙指示蛋白的R-GECO1的M13序列替换为ckkap序列的结构。R-CaMP2和R-GECO2L的全长氨基酸序列示于序列号11和序列号13中，编码R-CaMP2和R-GECO2L的核苷酸的全长碱基序列示于序列号12和序列号14中。
如专利文献1所述的R-CaMP1.07那样，本发明的R-CaMP2可以在N末端侧和C末端侧分别具有附加序列。图中，“MGS”所示的附加序列(37个氨基酸残基)为纯化蛋白时所使用的标签序列。另外，“F2A”所示的附加序列(21个氨基酸残基)用于将蛋白限定在细胞内的细胞质中。
本发明的钙指示蛋白通过CaM序列结合钙，进而结合钙的CaM序列结合ckkap序列，从而立体结构发生变化。本发明的钙指示蛋白在钙的存在下立体结构发生变化，从而导致荧光蛋白的立体结构变化以及与之伴随的荧光蛋白的荧光特性变化，从而发挥钙传感器的功能。如实施例所述，本发明的R-CaMP2和R-GECO2L等具有ckkap序列作为对钙结合CaM序列的结合域，由此与具有M13序列作为相同结合域的R-CaMP1.07和R-GECO1等常规钙指示蛋白相比，发挥出优异的荧光特性及钙反应性。更具体地说，R-CaMP2和R-GECO2L等在存在与不存在钙之间具有更大的荧光强度的变化量(动态范围)，随着与钙的结合与分离，荧光特性的变化速率也更大，从这一点来看，与常规钙指示蛋白相比具有优越的特性。
R-CaMP2的氨基酸序列如序列号11所示。在序列号11所示的氨基酸序列中，第1～37个为MGS序列、第38～63个为ckkap序列(ckkap-WL)、第66～307个为cpApple序列、第310～456个为CaM序列、第472～492个为F2A序列。MGS序列、ckkap序列、cpApple序列、CaM序列和F2A序列可以通过连接子与相邻的序列结合。连接子只要能够维持钙指示蛋白的功能，则不做特殊限制。
R-CaMP2的优选连接子结构为如下：结合ckkap序列与荧光蛋白的氨基酸连接子A为“-Pro-Val-”，结合荧光蛋白与CaM序列的氨基酸连接子B为“-Thr-Arg”。
除了上述“-Pro-Val-”和“-Thr-Arg”的组合以外，本发明的钙指示蛋白中合适的氨基酸连接子A、B的组合还可以列举如下：
氨基酸连接子A(-Leu-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Met-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Leu-Glu-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Lys-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Pro-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Ala-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Gln-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，以及
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Asp-)。
通过采用这些连接子结构，可以获得在钙存在下具有高的荧光强度、大的动态范围的钙指示蛋白。
另外，R-GECO2L的氨基酸序列如序列号13所示。在序列号13所示的氨基酸序列中，第1～3个为MGS序列、第4～29个为ckkap序列(ckkap-WL)、第32～273个为cpApple序列、第276～422个为CaM序列。MGS序列、ckkap序列、cpApple序列和CaM序列可以通过连接子与相邻的序列结合。
[ckkap序列]
本发明的钙指示蛋白的ckkap序列为钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶(CaMKK)的钙调素结合序列。CaMKK的钙调素结合序列具有α亚基和β亚基，但本发明的ckkap序列可以是来自α亚基的序列(氨基酸序列为序列号4、编码该氨基酸序列的核苷酸为序列号1)、可以是来自β亚基的序列(氨基酸序列为序列号5、编码该氨基酸序列的核苷酸为序列号2)。此外，这些序列来自大鼠的CaMKK，但ckkap序列只要对钙结合的CaM序列具有结合性，则可以来自任意生物物种。
此外，ckkap序列只要对钙结合的CaM序列具有结合性，则可以为序列号4或5所述的氨基酸序列中缺失、取代、插入或附加1个或多个(优选为1～5个)氨基酸的氨基酸序列。作为这种ckkap序列，可以列举上述ckkap-WL(氨基酸序列为序列号6、编码该氨基酸序列的核苷酸为序列号3)。另外，作为ckkap序列，还可以采用通过进一步改变ckkap-WL的氨基酸序列而获得的氨基酸序列(ckkap-WL2～6)。就提高钙指示蛋白的荧光特性和钙反应性而言，ckkap序列的氨基酸序列优选为序列号6、15～19所示的序列，最优选为序列号15～19所示的序列。通过从序列号6、15～19所示的序列中适当地选择ckkap序列的氨基酸序列，可以将钙指示蛋白的荧光特性与钙反应性设定为所需的程度。实施例所述的R-CaMP2和R-GECO2L包含ckkap-WL作为ckkap序列。另外，R-CaMP2_LLA包含ckkap-WL5作为ckkap序列。图2-1显示了来自α亚基的ckkap序列(ckkapα)和来自β亚基的ckkap序列(ckkapβ)以及ckkap-WL的氨基酸序列。图2-2显示了ckkap-WL2～6的氨基酸序列。
此外，ckkap序列并不限于仅由CaMKK的钙调素结合序列构成。也就是说，ckkap序列可以在CaMKK的氨基酸序列中包含钙调素结合序列以外的氨基酸序列，例如，其可以在钙调素结合序列的N末端侧和/或C末端侧包含几个～几十个氨基酸残基。
[CaM序列]
本发明的钙指示蛋白的CaM序列为钙调素的钙结合序列。对于CaM序列，可以使用序列号9或序列号10所示的氨基酸序列。序列号9所示的氨基酸序列为R-CaMP2中的CaM序列，序列号10所示的氨基酸序列为R-GECO2L中的CaM序列。这些CaM序列来自于大鼠钙调素的第2个至第148个氨基酸序列，其为在氨基酸序列中引入了4残基或5残基的氨基酸取代的氨基酸序列。R-CaMP2的编码CaM序列的核苷酸的碱基序列如序列号7所示，R-GECO2L的编码CaM序列的核苷酸的碱基序列如序列号8所示。此外，只要CaM序列对钙具有结合性并且能在钙结合的状态下与ckkap序列相结合，则CaM序列的来源可以是任意生物物种。
此外，只要CaM序列对钙具有结合性并且能在钙结合的状态下与ckkap序列相结合，则CaM序列可以为序列号9或10所述的氨基酸序列中缺失、取代、插入或附加1个或多个(优选为1～5个)氨基酸的氨基酸序列。此外，CaM序列并不限于仅由钙调素的钙结合序列构成。也就是说，CaM序列可以在钙调素的钙结合序列中包含钙结合序列以外的氨基酸序列，例如，其可以在钙结合序列的N末端侧和/或C末端侧包含几个～几十个氨基酸残基。
[荧光蛋白]
对本发明的钙指示蛋白的荧光蛋白不做特殊限制，可以使用蓝色荧光蛋白(例如实施例所述的X-CaMPBlue中的BFP等)、绿色荧光蛋白(例如实施例所述的X-CaMPGreen中的EGFP等)、黄色荧光蛋白(例如实施例所述的X-CaMPYellow中的Venus等)以及红色荧光蛋白。特别地，红色荧光蛋白较为常用，例如使用mApple或其变体。当在通过光刺激操控细胞功能的同时使用钙指示蛋白通过荧光钙成像来测定细胞功能时，优选的是荧光蛋白是红色荧光蛋白，因为其激发波长不会与通常用于细胞功能操控的光刺激探头Channelrhodopsin-2的激发波长重叠。
mApple的变体为如下：其中在影响荧光特性的氨基酸残基的附近切断mApple的氨基酸序列以改变该蛋白质的结构，而且在特定部位处的氨基酸残基被取代。专利文献1中记载有mApple的变体的具体示例。
在本发明的钙指示蛋白(或钙指示基因)中，将ckkap序列、荧光蛋白以及CaM序列按照从N末端侧(或5’端侧)至C末端侧(或3’端侧)的顺序进行排列，在图1中以此为例进行说明。在本发明的钙指示蛋白中，ckkap序列、荧光蛋白以及CaM序列的排列顺序可为如下：从N末端侧至C末端侧为CaM序列、荧光蛋白以及ckkap序列。
本发明的钙指示蛋白通过与钙结合而发生立体结构的变化，该立体结构的变化又会影响钙指示蛋白所包含的荧光蛋白的立体结构，从而使荧光蛋白的荧光特性发生可逆的变化。在本文，荧光特性是指诸如荧光强度、荧光波长、荧光强度比、吸光度、吸光波长等的荧光特性。在本发明中，使用荧光强度作为荧光特性的一例。当荧光特性的变化为荧光强度的变化时，荧光的变化量ΔF/F优选为至少0.3或更多的变化，更优选为0.6或更多的变化。
本发明中的钙指示蛋白的特征在于，通过具有ckkap序列，其相比于常规钙指示蛋白，在与钙结合时可以引起更大的荧光特性的变化。在本文，更大的荧光特性的变化是指当荧光特性的变化为荧光强度的变化时，荧光的变化量ΔF/F比常规钙传感器的ΔF/F更大，优选为常规钙传感器的ΔF/F的3倍以上。
2、载体、转化细胞和转基因动物
本发明的钙指示基因可以采用公知的基因工程方法生成。例如，通过PCR分别扩增编码ckkap序列、荧光蛋白和CaM序列等序列的核苷酸，并结合扩增片段，从而生成本发明的钙指示基因。
可以将得到的钙指示基因引入质粒或病毒等公知载体中。可以通过向所需细胞中导入承载钙指示基因的载体而得到表达钙指示蛋白的转化细胞。承载钙指示基因的载体或钙指示基因本身可以作为后述的用于细胞动作电位的测定或细胞内钙离子的成像的试剂的一部分。
另外，采用公知的基因工程方法，可以生成导入了钙指示基因的转基因动物。可以通过将钙指示基因导入哺乳动物的全能性细胞，使该细胞向个体中发生，并选择体细胞的基因组中导入了钙指示基因的个体，由此生成转基因动物。此时，可以通过在组织特异的促进剂的控制下引入并导入钙指示基因，从而得到仅在例如脑神经细胞中表达钙指示蛋白的转基因动物。
3、细胞动作电位的测定方法和细胞内钙离子的成像方法
本发明的钙指示蛋白可以以高灵敏度检测细胞内钙浓度的变化，并适用于细胞动作电位的测定和细胞内钙的成像。对细胞并不做特殊限制，神经细胞可以作为优选的一例。
例如，将本发明的承载钙指示基因的载体导入待测细胞中以表达钙指示蛋白。或者，制备在待测细胞中表达钙指示蛋白的转基因动物。然后，荧光显微镜或多光子显微镜等将波长对应于钙指示蛋白所包含的荧光蛋白的激发波长的激发光照射在待测细胞上，并检测由钙指示蛋白发射的荧光。可以通过获取随时间推移的荧光强度变化而测定细胞动作电位，并可以通过对荧光强度变化进行实时图像化处理而将细胞内钙成像。
使用本发明的钙指示蛋白的细胞动作电位的测定方法和细胞内钙离子的成像方法可以用于筛选影响细胞动作电位和细胞内钙离子浓度的物质。例如，利用动物来记录细胞内的细胞动作电位等，其中经待检测物质处理的细胞或待测物质以个体水平、组织水平或细胞水平被施用至所述动物。然后，将所记录的细胞动作电位与未经待测物质处理的同样获得的细胞动作电位等进行比较，判定待测物质对细胞动作电位等是否存在影响，选择对细胞动作电位等有促进或抑制功能的物质。待测物质可以为合成或天然的各种化合物、肽或蛋白、以及诸如DNA或RNA的核酸等，当使用核酸时，通过导入基因使由该核酸编码的基因在细胞中表达，并记录细胞动作电位变化等。
实施例
1、材料与方法
[R-CaMP2，R-GECO2L]
按照文献(PLoS One，2012，7，e39933)所述的方法构建R-CaMP1.07表达结构。R-GECO1通过Addgene(http://www.addgene.org/)得到。R-GECO1由来自pEGFP-N1(Clontech)的pCMV载体亚克隆而成。
通过用相当于大鼠CaMKKα的Val438-Phe463的Ca2+/钙调素结合序列(ckkap序列)替换R-CaMP1.07和R-GECO1的M13序列，从而生成R-CaMP2和R-GEC02L(参照图1)。在ckkap序列中，通过位点特异性突变法生成并使用CaMKKα序列(ckkapα、序列号4)与CaMKKβ序列(ckkapβ、序列号5)的杂交序列(ckkap-WL、序列号6)(参照图2-1)。向CaM序列中导入文献(Nature，2013，499，295-300，J.Biol.Chem.，2009，284，6455-6464)所述的氨基酸取代(序列号8，9)。将R-CaMP2和R-GECO2L亚克隆至pCAG载体中。
[R-CaMP2_LLA]
根据位点特异性突变法改变R-CaMP2的ckkap序列(ckkap-WL)，生成以ckkap序列为ckkap-WL5(参照图2-2)的R-CaMP2_LLA。
[X-CaMPBIue，X-CaMPGreen，X-CaMPYellow]
用ckkap序列(ckkap-WL)替换文献(PLos One，2010，Vol.5，No.2，e8897)所述的G-CaMP4.1的M13序列。此外，BFP、EGFP或Venus作为荧光蛋白引入的那些分别指定为X-CaMPBlue，X-CaMPGreen、X-CaMPYellow。
结合ckkap序列与荧光蛋白的氨基酸连接子A以及结合荧光蛋白与CaM序列的氨基酸连接子B采用以下组合：
X-CaMPBlue
氨基酸连接子A(-Leu-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)或
氨基酸连接子A(-Met-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)；
x-CaMPGreen
氨基酸连接子A(-Leu-Glu-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Lys-)，或
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Pro-)；
X-CaMPYellow
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Ala-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Gln-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，或
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Asp-)。
[体外Ca2+荧光测定]
使生成的钙指示蛋白在HEK293T细胞中表达，在Ca2+游离缓冲液(20mM MOPS(pH7.5)，100mM氯化钾，1mM DTT，1×蛋白酶抑制剂混合物(完整，不含EDTA，Roche))中回收细胞。回收后，进行超声波破碎，离心后取上清液作为裂解液。将该裂解液用于筛选或体外性能评价。
体外荧光测定在室温下用平板读数仪(Fusionα，Perkin Elmer)和96孔板进行。动态范围以Fmax/Fmin计算。Fmax测定了在0.3mM Ca2+的条件下Ca2+饱和状态时的荧光强度，Fmin为在15mM EGTA存在下的Ca2+为零时测得的荧光强度。Ca2+滴定曲线使用市售的试剂盒(Ca2+校准试剂盒#1、Invitrogen)通过10mM的K2H2EGTA和Ca2EGTA的混合液进行定量。Kd值和Hill系数利用分析软件(Origin Pro7.5、Origin Lab)通过曲线拟合进行计算。
[海马培养神经元中的Ca2+成像]
按照文献(Cell，1996，87，1203-1214，Cell Rep.，2013，3，978-987)所述的方法进行海马分散培养。海马培养神经元从出生当天的SD大鼠(日本SLC)的海马(CA1/CA3区域)中获取。培养后第10～11天，通过脂质体转染将CMV促进剂的编码钙指示蛋白的基因导入神经细胞。基因导入第2～3天后，利用Tyrode溶液(129mM NaCl，5mM KCl，30mM葡萄糖，25mMHEPES-NaOH[pH7.4]，1mM MgCl2和3mM CaCl2)进行场电刺激所引起的Ca2+成像。为防止自燃，在Tyrode溶液中加入10μM CNQX(Tocris Bioscience)和50μM D-AP5(TocrisBioscience)。
利用倒置显微镜(IX81，Olympus)和EM-CCD(C9100-12或C9100-13，浜松光电)进行突触末端(距离轴突起始部分100μm以上且为轴突直径3倍以上的部位)的成像。神经细胞在台式CO2培养箱中维持在37℃。神经细胞用场电刺激(50mA、1msec的电流脉冲)进行刺激。通过利用脉冲刺激装置(Master-8、A.M.P.I.)，该刺激条件足以切实诱导细胞体的峰值。
在UV谷氨酸释放中，用0.4mM的MNI-谷氨酸(Tocris Bioscience)和1μM的TTX处理过的神经细胞在不含有Mg2+的Tyrode溶液中成像。利用在AQUACOSMOS软件平台(浜松光电)上工作的紫外线光分解系统(浜松光电)和由该系统控制的355nm的UV纳秒级脉冲激光(Polaris II，New Wave Research)诱导MNI-谷氨酸的UV释放(Cell Rep.，2013，3，978-987)。
[子宫内电穿孔法]
子宫内电穿孔法按照文献(J.Neurosci.，2009，29，13720-13729)所述的方法进行。在麻醉下向胎生第14.5天的ICR小鼠(SLC日本)的侧脑室中注入约1.0μl纯化质粒溶液，通过电穿孔仪(BTX)施加5次电脉冲(45V、1Hz、50毫秒的持续时间，5次)。为使表达钙指示蛋白的小鼠或细胞可视化，EGFP作为体积控制进行共表达。将出生4～7周后的小鼠用于急性切片标本或体内成像。
[急性脑切片中的Ca2+成像与霍尔元件记录的同时测定]
按照文献(Eur.J.Neurosci.，2014，39，1720-1728)所述的方法进行急性脑切片实验。用CO2将4～7周龄的小鼠深度麻醉，切下头部。利用CAG促进剂或使用TRE-tight促进剂与Tet3G(Clontech和Tet-Systems)的四环素诱导表达系来表达钙指示蛋白。
迅速去除整个脑部，浸泡在冰冷却的人工脑脊髓液(ACSF)(125mM NaCl，2.5mMKCl，1.25mM NaH2PO4，26mM NaHCO3，2mM CaCl2，1mM MgCl2，25mM葡萄糖，用95％O2和5％CO2鼓泡)中。使用切片机(VT1200S，Leica)切割体感区(厚度250μm)的急性冠状脑切片。在将脑切片转移到记录室前，在30℃下在氧饱和ACSF中培养30分钟，然后维持在室温下。
将脑切片装入双光子显微镜平台上的液浸型记录室内，通过明场对桶状皮层的第4层进行鉴定。霍尔元件膜片钳记录在桶状皮层的第2/3锥体细胞中进行。在记录中，记录室中连续灌流30℃的氧饱和ACSF。用垂直拉拔器(PC-10、成茂)将膜片吸管从硼硅酸玻璃毛细管中拉出，当充满细胞内液(133mM K-MeSO3，7.4mM KCl，10mM HEPES，3mM Na2ATP，0.3mMNa2GTP，0.3mM MgCl2)时，具有5～8M欧姆的电阻。霍尔元件电流固定记录使用EPC10放大器(Heka)进行。所有电生理数据在10kHz处滤波，并在20kHz处数字化。
[用于体内成像的头盖骨手术]
为了进行体内成像，向小鼠(4～7周龄)的腹腔内投入聚氨酯(1.5～1.8mg/g)并进行麻醉。用加热垫(FHC，Bowdoin)将体温维持在37℃。用瞬干胶和牙科水泥将不锈钢制的头盖板粘合至右桶状皮层的上头盖骨(距离前囟门横向3.0～3.5mm、后部1.5mm)。制作圆形的开颅孔(直径1.8～2.0mm)，小心摘除硬膜。向开颅孔中填充溶液(150mM NaCl，2.5mM KC1，10mM HEPES，2mM CaCl2，1mM MgCl2，1.5％琼脂糖，pH 7.3)。为了抑制暴露脑部的移动，在将盖玻片放置于琼脂糖上后，将小鼠转移到双光子显微镜的动物用平台上。
[体内双光子Ca2+成像]
表达钙指示蛋白的神经细胞的体内Ca2+成像在右桶状皮层的第2/3层(距离软膜下方约150～300μm)进行。钙指示蛋白的表达通过CAG促进剂进行。通过CAG促进剂进行的永久钙指示蛋白表达不会引起可测定的神经细胞毒性。
用短促的吹气(40～45psi，50ms)将感觉刺激施加给相对侧的胡须。以256×192像素(采样率＝2.3Hz)的分辨率在3分钟内获取神经细胞群的自发感觉诱发活动。为了获得单个神经细胞中的Ca2+变化的高速成像，在皮质神经元的细胞体内进行高速行扫描(采样率＝650～700Hz)。为了获得树状突起成像，选择在1个焦平面上具有尽可能多的可见脊椎和树状突起。成像以22秒、232×64像素的分辨率(采样率＝4.3Hz)获取。
[Ca2+成像和体内非紧密封接细胞粘附电记录法的同时测定]
使用填充包含荧光物质(Alexa488、50μM)的ACSF的玻璃电极(5-7M欧姆)进行体内细胞粘附记录。将双光子目标膜片法(Neuron，2003，39，911-918)用于表达钙指示蛋白的桶状皮层的神经细胞。在建立细胞粘附约10分钟后，在细胞体内进行峰值记录和高速行扫描的Ca2+成像(采样率＝675Hz)的同时测定。电生理数据在夹持模式下用EPC10扩大器(HEKA)进行扩增。在10kHz处滤波，在20kHz处数字化。此外，以离线模式使用100Hz的高通滤波器。使用MATLAB通过阈值处理自动计数峰值的检测。
以上说明的材料和方法也可以参照在本申请的优先权日后公开的文献(NatureMethod，2015，Vo1.12，No.1，p.64-70)。
2、结果
R-CaMP2与R-GECO2L的Kd值在100nM以下(参照图3)。另外，R-CaMP2与R-GEC02L在不存在Ca2+的条件下的基线荧光值(Baseline Fluorescence)与R-CaMP1.07相等或为R-CaMP1.07的2倍以内，其动态范围虽差于R-CaMP1.07，但也在5倍以上(参照图4)。
在初代海马培养神经元内表达R-CaMP2和R-GECO2L。另外，表达作为体积控制的与红色指示剂的荧光光谱分离的EGFP。R-CaMP2显示出特征性的核外定位(图5A)。另一方面，R-GECO2L不仅在细胞质中定位，还在核内定位(图5B)。此外，R-CaMP2和R-GECO2L在树状突起、轴突和突触末端显示出相同的分布。
由场电刺激产生的单相动作电位(1AP)(图6)和在细胞体附近通过UV脉冲激光的单纳秒级脉冲激发而产生的MNI-谷氨酸释放(图7)引起明显的Ca2+变化，可以用单指数函数进行拟合。
相比于现有的荧光钙指示蛋白，R-CaMP2和R-GECO2L在体外显示出更高的Ca2+亲和性(表1)。并且，相比于R-GECO1和R-CaMP1.07，R-CaMP2和R-GECO2L在活神经细胞中具有更快的反应动力学(图8～11)。此外，R-CaMP2的ΔF/F的振幅应答为R-CaMP1.07的3倍以上，也比R-GECO2L更大(图8、9)。
[表1]
※参照PLOS One，2012，7，e51286。
[表2]
R-CaMP2和R-GECO2L具有接近1的希尔系数(表1)。这与诸如OGB-1(J.Neurosci.，2008，7399-7411)的化学合成的钙指示剂的希尔系数几乎相同。这与如下事实明显不同：现有的大多数荧光钙指示蛋白的希尔系数为2以上(表1)。
为了验证脑组织中的R-CaMP2的实用性，采用子宫内电穿孔法(J.Neurosc1.，2009，29，13720-13729)向桶状皮层第2/3层的神经细胞中导入R-CaMP2，用成年小鼠制作急性切片。用钛蓝宝石激光器激发，在表达R-CaMP2的神经细胞的细胞体和近端的树状突起上，与霍尔元件膜片钳结合使用高速双光子行扫描(700Hz附近)，从而进行Ca2+成像。对R-CaMP2_LLA和X-CaMPGreen也进行相同的实验。
与初代海马培养神经元的结果相同，单一的去分极电流注入所引起的ΔF/F应答振幅在表达R-CaMP2的神经细胞中比在表达R-CaMP1.07的神经细胞中明显更大(图12、13)。在信噪比(SNR：信号/噪声比)(最多大4.0倍)、上升时间(最多快2.6倍)、衰减时间常数(最多快3.4倍)方面，R-CaMP2与R-CaMP1.07相比显示出几倍的改善(图13-1)。R-CaMP2_LLA与R-CaMP2相比显示出更快的上升时间(图13-2)。另外，X-CaMPGreen与现有的绿色荧光钙指示蛋白GCaMP6s，GCaMP6f(Nature，2013，VoL.499，p.295-300)相比显示出更快的上升时间(图13-3)。GCaMP6s和GCaMP6f为采用M13序列的钙传感器。
与这些改善的参数一致，到最大4脉冲的电流注入的连续脉冲为止，R-CaMP2显示出ΔF/F振幅和SNR的改善(图14)。另外，20～40Hz的连续动作电位可以通过单一试验进行判别(图15-1、B)。在相同实验条件下，表达R-CaMP1.07的神经细胞所记录的Ca2+信号显示出更大的基线噪声和更慢的上升时间，并且仅可判别最多5Hz频率的脉冲的动作电位(图15-1、A)。相比于R-CaMP2，R-CaMP2_LLA跟随更高频率的刺激，具有至多50Hz的分辨率(图15-2)。另外，X-CaMPGreen也跟随80～100Hz的超高速频率(图15-3)。
在麻醉下在固定头部的小鼠的桶状皮层第2/3层神经细胞中进行体内Ca2+成像。在标记约30～60％的第2/3层锥体神经细胞的条件下，能够确切地记录自发Ca2+峰值(图16)。触觉信息的表达被稀疏的神经细胞编码(Neuron，2010，67，1048-1061、Neuron，2013，78，28-48、Trends Neurosci.，2012，35，345-355)。与此一致，在对胡须吹气刺激下，Ca2+变化仅在有限的细胞中发生。另外，基于R-CaMP2显示出相对于Ca2+变化的刺激相关活性的活跃神经细胞在连续吹气刺激时发生诱发反应。也就是说，可以鉴定对桶状皮层的感觉刺激进行应答的活跃神经细胞。
为了确认在体内记录的分辨率，高速行扫描的Ca2+成像与非紧密封接细胞粘附电记录法同时进行(图17)。在至多5脉冲的SNR、振幅、振幅的时间积分的各自的应答中，自发的动作电位显示出近似于线性的增加(图18)。通过以上说明清楚可知：R-CaMP2在体内伴随单相动作电位的Ca2+变化的上升与衰减时间的动力学与此前所报告的具有快速动力学的绿色荧光钙指示蛋白(如GCaMP6f(Nature，2013，499，295-300)或快速-GCaMP(Nat.Commun.，2013，4，2170))可相比。
自由序列表
序列号1：编码CaMKK的来自α亚基的ckkap序列(ckkapα)的核苷酸的碱基序列。
序列号2：编码CaMKK的来自β亚基的ckkap序列(ckkapβ)的核苷酸的碱基序列。
序列号3：编码ckkap-WL的核苷酸的碱基序列。
序列号4：CaMKK的来自α亚基的ckkap序列(ckkapα)的氨基酸序列。
序列号5：CaMKK的来自β亚基的ckkap序列(ckkapβ)的氨基酸序列。
序列号6：ckkap-WL的氨基酸序列。
序列号7：R-CaMP2的编码CaM序列的核苷酸的碱基序列。
序列号8：R-GECO2L的编码CaM序列的核苷酸的碱基序列。
序列号9：R-CaMP2的CaM序列的氨基酸序列。
序列号10：R-GECO2L的CaM序列的氨基酸序列。
序列号11：R-CaMP2的氨基酸序列。
序列号12：编码R-CaMP2的核苷酸的碱基序列。
序列号13：R-GECO2L的氨基酸序列。
序列号14：编码R-GECO2L的核苷酸的碱基序列。
序列号15：ckkap-WL2的氨基酸序列。
序列号16：ckkap-WL3的氨基酸序列。
序列号17：ckkap-WL4的氨基酸序列。
序列号18：ckkap-WL5的氨基酸序列。
序列号19：ckkap-WL6的氨基酸序列。

Claims (16)

1.一种DNA，其中，在编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)的核苷酸和编码钙调素的钙结合序列(CaM序列)的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
2.根据权利要求1所述的DNA，编码ckkap序列的核苷酸的碱基序列可以是序列号1～3所示的任意一种碱基序列。
3.根据权利要求1或2所述的DNA，编码ckkap序列的核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸、以及编码荧光蛋白的核苷酸与编码CaM序列的核苷酸分别通过编码氨基酸连接子的核苷酸相结合。
4.根据权利要求3所述的DNA，编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合有编码ckkap序列的核苷酸，3'端侧结合有编码CaM序列的核苷酸，
编码ckkap序列的核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸通过编码氨基酸连接子A的核苷酸相结合，且
编码荧光蛋白的核苷酸与编码CaM序列的核苷酸通过编码氨基酸连接子B的核苷酸相结合，
氨基酸连接子A和氨基酸连接子B的组合可以是下列的任意一种：
氨基酸连接子A(-Pro-Val-)和氨基酸连接子B(-Thr-Arg)，
氨基酸连接子A(-Leu-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Met-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Leu-Glu-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Lys-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Pro-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Ala-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Gln-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，以及
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Asp-)。
5.一种包含权利要求1～4任一项所述的DNA的载体。
6.一种导入了钙指示基因的转化细胞，在该基因的编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)的核苷酸和编码钙调素的钙结合序列(CaM序列)的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
7.一种导入了钙指示基因的除人类以外的转基因动物，在该基因的编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)的核苷酸和编码钙调素的钙结合序列(CaM序列)的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
8.一种蛋白，其中，在钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)和钙调素的钙结合序列(CaM序列)中的一个与荧光蛋白的N末端侧结合，另一个与所述荧光蛋白的C末端侧结合。
9.根据权利要求8所述的蛋白，其中ckkap序列可以是序列号4～6、15～19所示的任意一种氨基酸序列。
10.根据权利要求8或9所述的蛋白，其中ckkap序列与荧光蛋白，以及荧光蛋白与CaM序列分别通过氨基酸连接子结合。
11.根据权利要求10所述的蛋白，其中荧光蛋白的N末端侧结合有ckkap序列，C末端侧结合有CaM序列，
ckkap序列与荧光蛋白通过氨基酸连接子A相结合，
荧光蛋白与CaM序列通过氨基酸连接子B相结合，
氨基酸连接子A和氨基酸连接子B的组合可以是下列的任意一种：
氨基酸连接子A(-Pro-Val-)和氨基酸连接子B(-Thr-Arg)，
氨基酸连接子A(-Leu-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Met-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Leu-Glu-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Lys-)，
氨基酸连接子A(-Arg-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Pro-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Ala-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，
氨基酸连接子A(-Gln-Asp-)和氨基酸连接子B(-Thr-Asp-)，以及
氨基酸连接子A(-Phe-Asp-)和氨基酸连接子B(-Phe-Asp-)。
12.一种细胞动作电位的测定方法，包括荧光检测步骤，该荧光由细胞内表达的钙指示蛋白发射，其特征在于，所述钙指示蛋白为如下钙指示蛋白：在其钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)和钙调素的钙结合序列(CaM序列)中的一个与荧光蛋白的N末端侧结合，另一个与所述荧光蛋白的C末端侧结合。
13.一种细胞内钙离子成像方法，包括荧光检测步骤，该荧光由细胞内表达的钙指示蛋白发射，其特征在于，所述钙指示蛋白为如下钙指示蛋白：在其钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)和钙调素的钙结合序列(CaM序列)中的一个与荧光蛋白的N末端侧结合，另一个与所述荧光蛋白的C末端侧结合。
14.根据权利要求12所述的细胞动作电位的测定方法或权利要求13所述的细胞内钙离子成像方法，包括如下步骤：将钙指示基因导入所述细胞内，其中，在所述钙指示基因的编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)的核苷酸和编码钙调素的钙结合序列(CaM序列)的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
15.一种用于细胞动作电位的测定和/或细胞内钙离子的成像的钙指示试剂，包括：DNA或包含该DNA的载体，其中，在所述DNA的编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶激酶的钙调素结合序列(ckkap序列)的核苷酸和编码钙调素的钙结合序列(CaM序列)的核苷酸中的一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的5'端侧结合，另一个核苷酸与编码荧光蛋白的核苷酸的3'端侧结合。
16.根据权利要求15所述的试剂，所述细胞为神经细胞。
CN201580038699.3A 2014-06-11 2015-06-08 钙指示基因 Active CN106687588B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014120828 2014-06-11
JP2014-120828 2014-06-11
PCT/JP2015/002869 WO2015190083A1 (ja) 2014-06-11 2015-06-08 カルシウム指示遺伝子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106687588A true CN106687588A (zh) 2017-05-17
CN106687588B CN106687588B (zh) 2021-06-08

Family

ID=54833197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580038699.3A Active CN106687588B (zh) 2014-06-11 2015-06-08 钙指示基因

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10836802B2 (zh)
EP (1) EP3156482B1 (zh)
JP (1) JP6462684B2 (zh)
CN (1) CN106687588B (zh)
CA (1) CA2951780C (zh)
WO (1) WO2015190083A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020107564A1 (zh) * 2018-11-28 2020-06-04 深圳先进技术研究院 一种用于指示钙离子的小分子蛋白质及其应用
CN112725342A (zh) * 2021-02-02 2021-04-30 中国科学院深圳先进技术研究院 一种启动子pCALM2及其应用
CN113227405A (zh) * 2018-10-31 2021-08-06 昱星生物科技股份有限公司 光遗传控制下的遗传编码荧光指示剂及其应用
CN113219033A (zh) * 2021-04-30 2021-08-06 福州大学 一种电化学适配体传感器的免校正定量测量方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210002467A (ko) * 2018-03-02 2021-01-08 더 거버너스 오브 더 유니버시티 오브 알버타 흥분성 및 비흥분성 세포 내의 Ca2+를 이미지화하기 위한 저친화도 적색 형광 지표
CN113174405A (zh) * 2021-04-27 2021-07-27 青岛农业大学 一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014001161A (ja) * 2012-06-19 2014-01-09 Saitama Univ 赤色蛍光蛋白質を用いたカルシウムセンサー蛋白質

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000071565A2 (en) * 1999-05-21 2000-11-30 The Regents Of The University Of California Fluorescent protein indicators

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014001161A (ja) * 2012-06-19 2014-01-09 Saitama Univ 赤色蛍光蛋白質を用いたカルシウムセンサー蛋白質

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "NM_031338.1", 《GENBANK》 *
ISAAC T.S. LI ET AL.: "Sequence Reversed Peptide From CaMKK Binds to Calmodulin in Reversible Ca2+-Dependent Manner", 《BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN ACTIONS》 *
MASATOSHI INOUE ET AL.: "Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2", 《NATURE METHODS》 *
PHAM ELIZABETH: "Development of Protein-based Tools to Image and Modulate Ca2+ Signaling", 《HTTPS://TSPAC.LIBRARY.UTORONTO.CA/HANDLE/1807/31898》 *
SACHIKO OKUNO ET AL.: "Evidence for the Existence of Ca2+/calmodulin-dependent Protein Kinase IV Kinase Isoforms in Rat Brain", 《J BIOCHEM》 *
YONGXIN ZHAO ET AL.: "An Expanded Palette of Genetically Encoded Ca2+ Indicators", 《SCIENCE》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113227405A (zh) * 2018-10-31 2021-08-06 昱星生物科技股份有限公司 光遗传控制下的遗传编码荧光指示剂及其应用
WO2020107564A1 (zh) * 2018-11-28 2020-06-04 深圳先进技术研究院 一种用于指示钙离子的小分子蛋白质及其应用
CN111234028A (zh) * 2018-11-28 2020-06-05 深圳先进技术研究院 一种用于指示钙离子的小分子蛋白质及其应用
CN112725342A (zh) * 2021-02-02 2021-04-30 中国科学院深圳先进技术研究院 一种启动子pCALM2及其应用
CN112725342B (zh) * 2021-02-02 2024-05-17 中国科学院深圳先进技术研究院 一种启动子pCALM2及其应用
CN113219033A (zh) * 2021-04-30 2021-08-06 福州大学 一种电化学适配体传感器的免校正定量测量方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2951780A1 (en) 2015-12-17
US10836802B2 (en) 2020-11-17
CN106687588B (zh) 2021-06-08
CA2951780C (en) 2020-02-11
EP3156482A4 (en) 2017-11-22
US20170152295A1 (en) 2017-06-01
EP3156482B1 (en) 2019-09-25
JP6462684B2 (ja) 2019-01-30
WO2015190083A1 (ja) 2015-12-17
JPWO2015190083A1 (ja) 2017-04-20
EP3156482A1 (en) 2017-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10196431B2 (en) Light-activated chimeric opsins and methods of using the same
CN106687588A (zh) 钙指示基因
Walker et al. Functional imaging in the zebrafish retinotectal system using RGECO
JP2018529335A (ja) 光応答性ポリペプチド及びその使用方法
Zou et al. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications
Richie et al. Near-infrared fluorescent protein iRFP713 as a reporter protein for optogenetic vectors, a transgenic Cre-reporter rat, and other neuronal studies
Shelton et al. Single neurons and networks in the claustrum integrate input from widespread cortical sources
Nwokafor et al. Imaging cell-type-specific dynamics of mRNAs in living mouse brain
Ishii et al. Transgenic approach to express the channelrhodopsin 2 gene in arginine vasopressin neurons of rats
AU2015203097B2 (en) Light-activated chimeric opsins and methods of using the same
US20210246185A1 (en) Inverted transporter polypeptides and methods of using
Shelton Investigating the organizing principles of the mouse claustrum
Zou Connectivity, plasticity, and function of neuronal circuits in the zebrafish olfactory forebrain
Soloperto Engineering mechanobiology: the bacterial exclusively-mechanosensitive ion channel MscL as a future tool for neuronal stimulation technology
Varani Sensory information processing in mouse barrel cortex
Liu Horizontal and vertical profiles of mouse barrel cortex activity revealed by in vivo imaging of genetically encoded calcium indicators
Soloperto PhD course in Neuroscience and Neurotechnology

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant