CN113174405A - 一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法 - Google Patents

一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法，属于生物技术工程技术领域。所述指示质粒将GCaMP5G的编码基因插入pd2‑EGFP载体EcoR 1和Not 1的多克隆位点处构建；其中，所述GCaMP5G的编码基因如SEQ ID NO：1所示。通过将所述指示质粒引入真核细胞中，并使得所述包含GCaMP5G的载体稳定表达于所述真核细胞中，然后在G418存在的条件下筛选得到细胞系。该细胞系可以稳定表达钙离子指示质粒pd2‑GCaMP5G，并以绿色荧光的形式反应细胞内的钙离子水平，避免了反复的瞬时转染质粒，节省转染试剂等试验耗材、节约时间，为相关试验提供便利，对生物学研究也具有重要意义。

Description

一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术工程检测技术领域，涉及一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法。
背景技术
钙离子是低等生物到高等生物生理功能中的二级信号传递信使，在机体内受到严格的调控以参与调控许多生命活动。机体内的钙离子一旦失控，就会引起机体的各种疾病。因此，细胞内钙离子水平一定程度上可以反映机体的健康状况，这在生理学和病理学上都有重要意义。
对于细胞内钙离子水平的检测，传统方法一般是将钙离子指示质粒通过脂质体转染法瞬时转染进细胞，但此法不能将质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，传代过程中容易造成质粒的丢失，重复操作耗时耗材。稳定细胞系构建是将外源质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，细胞可长期表达目的蛋白，称稳定细胞系。高质量的稳定细胞系在生物学研究中扮演着非常重要的角色，包括基因功能研究、重组抗体、药物开发等。
现有技术中关于如何构建钙离子指示质粒单细胞稳定细胞系的报道还鲜少，因此，开发出一种转染效果好且具有良好传代稳定性的钙离子指示质粒单细胞稳定细胞系对生物学研究具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系构建方法，解决了背景技术中的问题，钙离子指示质粒能够以绿色荧光的形式在细胞中稳定表达，最终节省时间、节约耗材，成为有力的钙离子研究工具。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种指示质粒，将GCaMP5G的编码基因插入pd2-EGFP载体EcoR 1和Not1的多克隆位点处，构建指示质粒pd2-GCaMP5G；其中，所述GCaMP5G的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种所述的指示质粒的构建方法，包括以下步骤：
获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列；
将所述编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列和pd2-EGFP载体分别双酶切后，连接，再转化DH5α感受态细胞，经培养筛选阳性单克隆，获取钙离子指示质粒pd2-GCaMP5G。
优选的是，获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列的引物如下：
上游引物：5’-ATGCGAATTCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3’，
下游引物：5-ATGCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTA-3’。
本发明还提供一种细胞系，所述细胞系稳定表达所述的指示质粒。
本发明还提供一种所述的细胞系的构建方法，包括以下步骤：
将包含编码GCaMP5G的基因的指示质粒引入真核细胞中，并使得所述指示质粒稳定表达于所述真核细胞中，然后在G418存在的条件下筛选得到细胞系。
优选的是，所述真核细胞为人源细胞。
进一步地，人源细胞为A549细胞。
优选的是，所述G418筛选浓度为1400μg/mL。
本发明还提供一种所述的指示质粒的应用，应用于检测细胞系中钙离子含量水平。
本发明还提供一种利用所述的细胞系检测钙离子含量水平的方法，所述细胞系稳定表达指示质粒pd2-GCaMP5G，通过检测所述细胞系中所述pd2-GCaMP5G的荧光表达水平反映钙离子含量水平。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开的稳定表达钙离子指示质粒的细胞系，该细胞系可以稳定表达钙离子指示质粒pd2-GCaMP5G，并以绿色荧光的形式反应细胞内的钙离子水平，避免了反复的瞬时转染质粒，节省转染试剂等试验耗材、节约时间，为相关试验提供便利。
本发明在没有改变遗传稳定性的前提下，通过分子克隆使构建的重组质粒带有G418抗性，筛选后存活下来的细胞再经钙离子刺激，验证荧光表达即可说明构建成功，该重组质粒的获取方法简单易操作，并且对生物学研究具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pCMV-GCaMP5G PCR扩增结果电泳图；M为DL5000 DNA分子量标准；1、2为pCMV-GCaMP5G PCR扩增产物；
图2为目的基因GCaMP5G与载体质粒pd2-EGFP双酶切结果电泳图；M为DL5000 DNA分子量标准；1为载体质粒pd2-EGFP双酶切产物；2、3为目的基因GCaMP5G双酶切产物；
图3为菌落PCR鉴定结果电泳图；1、2为菌液PCR阳性扩增产物；M为DL2000DNA 分子量标准；
图4为测序结果比对图；
图5为质粒pd2-GCaMP5G在真核细胞中表达的荧光检测图；A为转染真核表达质粒pd2-GCaMP5G，静息状态荧光表达情况；B为转染真核表达质粒pd2-GCaMP5G，加入Ca2+刺激，荧光表达激活情况；
图6为表达pd2-GCaMP5G指示质粒的A549细胞株加入Ca2+刺激，检测荧光激活情况的荧光图；
图7为指示质粒pd2-GCaMP5G的图谱。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
以下实施例中所用试验材料和试剂，如无特殊说明均能通过常规商业渠道获取；所用方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员通过常规技术手段获取。
实施例1
1、钙离子指示质粒pd2-GCaMP5G的构建：
以pCMV-GCaMP5G(基因号：MK749392.1)质粒DNA为PCR扩增模板，限制性内切酶EcoR 1、Not 1为酶切位点设计引物，引物具体如下所示：
上游引物：5’-ATGCGAATTCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3’，
下游引物：5’-ATGCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTA-3’。
采用50μL体系，反应体系如下表1所示：
表1
Figure BDA0003041202180000051
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，重复34个循环，72℃延伸10min。
扩增反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，1253bp处扩增出亮条带，与预期结果一致。
再使用清洁回收试剂盒对目的片段进行清洁回收，然后用限制性内切酶EcoR 1和Not 1同时双酶切目的片段和pd2-EGFP载体，结果如图2所示；使用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段和载体片段进行切胶回收，用T4 liages连接酶连接GCaMP5G目的片段和pd2载体片段，然后转化DH5α感受态细胞，涂抹在含卡那霉素的LB固体培养基上，置于37℃细菌培养箱中过夜培养。从平板上随机挑取单克隆，进行PCR菌落鉴定(如图3)，鉴定结果为阳性的单克隆提取质粒进行测序，其测序结果100％匹配(如图4)，说明钙离子指示质粒pd2-GCaMP5G(质粒图谱如图7所示)构建成功。
2、pd2-GCaMP5G的转染：
转染前一天将A549细胞铺板，第二天待细胞密度达到90％时开始转染。将质粒和转染试剂按体积比1：2混匀静置后进行瞬时转染，6h后换液，再经37℃培养24h在荧光显微镜下观察荧光表达。
结果如图5所示，转染A549细胞后静置状态时，仅有极少量的绿色荧光出现，而当加入Ca2+刺激时，出现大量的绿色荧光，这说明质粒pd2-GCaMP5G能够作为钙指示剂反应Ca2 +含量水平，并且pd2-GCaMP5G呈现的绿色荧光和Ca2+含量呈正相关。
3、G418的最佳筛选浓度
将A549细胞传代铺板，取2×104个细胞铺于24孔板中，放入37℃含5％的CO2细胞培养箱中，过夜培养；观察目的细胞的生长状态，待其生长至70-80％左右进行G418的筛选；加入G418，使六组G418浓度分别为600、800、1000、1200、1400、1600μg/mL，放入37℃含5％的CO2细胞培养箱中培养48h；G418处理48h后，以细胞全部死亡的最低G418浓度为该细胞最佳筛选浓度；A549细胞最佳G418筛选浓度为1400μg/mL。
4、稳转细胞的筛选：
将A549传代铺板，用脂质体转染法转染构建好的真核质粒pd2-GCaMP5G，具体试验步骤与上述2的转染过程相同；转染24h后将培养液换成1400μg/mL的G418的筛选培养液，连续培养；每24h进行观察，当细胞死亡量较大时，进行筛选培养液的更换；待细胞生长起来后，进行传代、冻存；将构建的细胞株命名为A549-GCaMP5G；构建的细胞的传代与冻存的试验方法与普通细胞传代冻存方法相同。
5、稳转细胞的检测：
将连续传代的A549-GCaMP5G细胞单独传至35mm2的细胞培养皿中，在荧光倒置显微镜下，观察细胞绿色荧光表达情况，以及钙离子刺激后荧光表达情况。
结果如图6所示，经过连续传代的A549-GCaMP5G细胞单独培养后，用钙离子刺激后，明显能够显示出大量的绿色荧光，说明pd2-GCaMP5G成功转染A549细胞，并且能够稳定表达。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atgggttctc atcatcatca tcatcatggt atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 60
ggtcgggatc tgtacgacga tgacgataag gatctcgcca ccatggtcga ctcatcacgt 120
cgtaagtgga ataagacagg tcacgcagtc agagctatag gtcggctgag ctcactcgag 180
aacgtctata tcaaggccga caagcagaag aacggcatca aggcgaactt caagatccgc 240
cacaacatcg aggacggcgg cgtgcagctc gcctaccact accagcagaa cacccccatc 300
ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcgtgcagtc caaactttcg 360
aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 420
atcactctcg gcatggacga gctgtacaag ggcggtaccg gagggagcat ggtgagcaag 480
ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 540
ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggt gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 600
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 660
ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 720
ttcaagtccg ccatgcccga aggctacatc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 780
ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 840
gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 900
aacctgccgg accaactgac tgaagagcag atcgcagaat ttaaagaggc tttctcccta 960
tttgacaagg acggggatgg gacaataaca accaaggagc tggggacggt gatgcggtct 1020
ctggggcaga accccacaga agcagagctg caggacatga tcaatgaagt agatgccgac 1080
ggtgacggca caatcgactt ccctgagttc ctgacaatga tggcaagaaa aatgaaatac 1140
acagacagtg aagaagaaat tagagaagcg ttccgtgtgt ttgataagga tggcaatggc 1200
tacatcagtg cagcagagct tcgccacgtg atgacaaacc ttggagagaa gttaacagat 1260
gaagaggttg atgaaatgat cagggaagca gacatcgatg gggatggtca ggtaaactac 1320
gaagagtttg tacaaatgat gacagcgaag tga 1353

Claims (9)

1.一种指示质粒，其特征在于，将GCaMP5G的编码基因插入pd2-EGFP载体EcoR 1和Not1的多克隆位点处，构建指示质粒pd2-GCaMP5G；其中，所述GCaMP5G的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的指示质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列；
将所述编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列和pd2-EGFP载体分别双酶切后，连接，再转化DH5α感受态细胞，经培养筛选阳性单克隆，获取钙离子指示质粒pd2-GCaMP5G。
3.如权利要求2所述的指示质粒的构建方法，其特征在于，获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列的引物如下：
上游引物：5’-ATGCGAATTCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3’，
下游引物：5’-ATGCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTA-3’。
4.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系稳定表达权利要求1所述的指示质粒。
5.一种如权利要求4所述的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将包含编码GCaMP5G的基因的指示质粒引入真核细胞中，并使得所述指示质粒稳定表达于所述真核细胞中，然后在G418存在的条件下筛选得到细胞系。
6.如权利要求5所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述真核细胞为人源细胞。
7.如权利要求5所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述G418筛选浓度为1400μg/mL。
8.一种如权利要求1所述的指示质粒的应用，其特征在于，应用于检测细胞系中钙离子含量水平。
9.一种利用权利要求4所述的细胞系检测钙离子含量水平的方法，其特征在于，所述细胞系稳定表达指示质粒pd2-GCaMP5G，通过检测所述细胞系中所述pd2-GCaMP5G的荧光表达水平反映钙离子含量水平。
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