CN108136197A - 光响应性多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了变体光响应性多肽和包含编码所述光响应性多肽的核苷酸序列的核酸。本公开提供了用于控制表达本公开的变体光响应性多肽的细胞的活动的方法、装置和系统。

Description

光响应性多肽及其使用方法
交叉引用
本申请要求2015年9月15日提交的美国临时专利申请第62/218,971号的权益，该申请通过引用整体并入本文。
作为文本文件提供的序列表通过引用并入
在此以2015年9月14日创建并且具有172KB大小的文本文件“STAN-1250PRV_SeqList_ST25.txt”的形式提供序列表。所述文本文件的内容通过引用整体并入本文。
引言
光遗传学涉及使用光活化蛋白质在暴露于各种波长的光下时改变可兴奋细胞(诸如神经元)的膜电压电位。在神经元中，膜去极化导致瞬态电信号(也称为动作电位或“棘波”)的激活，这是神经元通讯的基础。相反，膜超极化导致此类信号的抑制。通过在神经元或其它可兴奋细胞中表达改变膜电位的光活化蛋白，可以利用光作为触发手段来诱导抑制或兴奋。
概述
本公开提供了变体光响应性多肽和包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸。本公开提供了用于控制表达本公开的变体光响应性多肽的细胞的活动的方法、装置和系统。
本公开提供了变体光活化多肽，其包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的E163S取代，并且其中所述变体光活化多肽相较于SEQ ID NO:1的光活化多肽表现出增加至至少5倍的动力学。本公开提供了变体光活化多肽，其包含与EQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含异源膜运输信号。在一些情况下，异源膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDIN(SEQ ID NO:62)。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含内质网(ER)输出信号。在一些情况下，ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV(SEQID NO:61)。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含膜运输信号和ER输出信号。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽按从N末端至C末端的顺序包含：a)包含与SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的变体光响应性多肽；b)膜运输信号；和c)ER输出信号。在一些情况下，本公开的变体光活化多肽包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的变体光活化多肽包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的变体光活化多肽当存在于真核细胞中时并且当被600nm至700nm的波长的光活化时以5Hz至20Hz的频率诱发动作电位。在一些情况下，本公开的变体光活化多肽相较于SEQ ID NO:1的光活化多肽表现出增加至至少10倍的动力学。
本公开提供了包含编码如上文或本文其它地方所述的变体光活化多肽的核苷酸序列的核酸(例如，分离的核酸)。在一些情况下，核苷酸序列可操作地连接至在真核细胞中有功能的转录控制元件。在一些情况下，转录控制元件是组成型启动子。在一些情况下，转录控制元件是诱导型启动子。在一些情况下，转录控制元件是神经元特异性启动子。
本公开提供了包含如上文或本文其它地方所述的核酸的重组表达载体，其中重组表达载体包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列。在一些情况下，表达载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。
本公开提供了包含变体光活化多肽的哺乳动物细胞，如上文或本文其它地方所述，其中变体光活化多肽存在于细胞膜中，其中变体光活化多肽响应于光，并且其中当细胞用红光(例如，波长为约600nm至约700nm的光)照射时，变体光活化多肽能够介导细胞内的去极化电流。在一些情况下，细胞是神经元细胞。
本公开提供了响应于光刺激而调节哺乳动物细胞的电压电位的方法，所述方法包括将如上文或本文其它地方所述的在细胞的质膜中包含变体光活化多肽的哺乳动物细胞暴露，其中响应于对光刺激的暴露，细胞的电压电位被调节。在一些情况下，细胞是神经元细胞。在一些情况下，细胞是心脏细胞。在一些情况下，细胞是干细胞。在一些情况下，细胞在体外。在一些情况下，细胞在体内。在一些情况下，光具有600nm至700nm的波长。
本公开提供调节哺乳动物细胞的活动的方法，所述哺乳动物细胞包含如上文或本文其它地方所述的变体光活化多肽，所述方法包括用光(例如，红光)激活变体光活化多肽。在一些情况下，光具有600nm至700nm的波长。在一些情况下，细胞是神经元细胞、心脏细胞或干细胞。在一些情况下，细胞在体内。在一些情况下，细胞表达遗传编码的钙指示剂(GECI)。在一些情况下，GECI包含与SEQ ID NO:7-28中任一个所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，细胞还包含超极化光响应性多肽。在一些情况下，超极化光响应性多肽包含与SEQ ID NO:42-48中任一个所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本公开提供了装置，其包括：a)容器，其包含如上文或本文其它地方所述的变体光响应性多肽、包含编码变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸或包含编码变体光响应性多肽的核苷酸序列的重组载体；和b)光源。在一些情况下，所述装置是植入式。在一些情况下，光源是光纤。
本公开提供了系统，其包括：a)容器，其包含如上文或本文其它地方所述的变体光响应性多肽、包含编码变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸或包含编码变体光响应性多肽的核苷酸序列的重组载体；b)植入式光学照射器(optical applicator)，其被配置来在植入邻近靶组织结构的位置之后将光递送至靶组织；c)光源，其被可操作地耦合至植入式光学照射器；d)控制器；e)电源；和f)植入式照度传感器，其中所述控制器至少部分地基于来自所述植入式照度传感器的输出信号，使所述电源允许电流流至所述光源，以使光子发射至所述植入式光致动器，其中所述植入式照度传感器被配置使得其可被定位来捕获至少一部分由所述植入式光照射器引导朝向所述靶组织的光子。在一些情况下，植入式照度传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。在一些情况下，植入式输入传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。在一些情况下，所述系统包括生理传感器，其被配置来产生输出信号，所述输出信号与被认为至少部分地响应于所述靶组织结构的光输入而可变的生理参数相关。在一些情况下，生理传感器选自由以下组成的组：肌电图传感器、神经电图传感器、脑电图传感器、心电图传感器、压力传感器、温度传感器、化学计量传感器、运动传感器、加速度计，陀螺仪、应变传感器、阻抗传感器和电容传感器。
本公开提供了治疗方法，其包括将具有激活波长的光递送至有此需要的个体中的靶细胞或组织，其中所述靶细胞或组织在所述靶细胞的质膜或靶组织中的细胞的质膜中包含如上文或本文中其它地方所述的变体光响应性多肽，其中所述递送激活变体光活化多肽并使靶细胞或靶组织中的细胞去极化。在一些情况下，所述去极化治疗个体中的神经学疾病或病症。
本公开提供了用于照射个体的靶组织的方法，其中靶组织结构在靶组织中的细胞的质膜中包含如上文或本文中其它地方所述的变体光响应性多肽，所述方法包括：a)提供被配置来在植入邻近所述靶组织的位置之后将光递送至所述靶组织的植入式光学照射器；以及b)将所述植入式光学照射器可操作地耦合至光源、控制器、电源和植入式照度传感器，使得所述控制器至少部分地基于来自植入式照度传感器的输出信号，使所述电源允许电流流至所述光源以使光子发射至植入式光致动器，其中植入式照度传感器被定位而使得其捕获至少一部分由植入式光照射器引导朝向靶组织的光子。在一些情况下，所述方法还包括提供被配置来产生输出信号的植入式输入传感器，所述输出信号与此类光子和靶组织相交之前的植入式光学照射器在光子发射位置处的照度相关。在一些情况下，所述方法还包括将控制器可操作地耦合至植入式输入传感器，使得其可比较来自植入式输入传感器和植入式照度传感器两者的输出信号以确定是否正在经历意外的损失。在一些情况下，植入式照度传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。在一些情况下，植入式输入传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。
本公开提供了诱导哺乳动物受试者的情境记忆提取的方法，所述方法包括在哺乳动物受试者中将具有600nm至700nm的波长的光递送至神经元的单突触前额叶向海马的投射，其中该投射包含如上文或本文其它地方所述的变体光响应性多肽，其中将光递送至投射使投射去极化并诱导情境记忆提取。在一些情况下，前额叶向海马的投射是前额叶向海马的投射。在一些情况下，前额叶向海马的投射是前扣带向海马的投射。在一些情况下，投射是朝向海马的锥体CA3/CA1细胞。在一些情况下，前扣带的神经元包含变体光响应性多肽。本公开提供了调节背景记忆提取的方法，所述方法包括在哺乳动物受试者中将光递送至神经元的单突触前额叶向海马的投射，其中所述投射包括：i)如上文或本文其它地方所述的变体光响应性多肽，其中将具有第一激活波长(例如，红光)的光递送至投射使投射去极化并诱导情境记忆提取；和ii)超极化视蛋白，其中递送具有第二激活波长的光使所述投射超极化，其中超极化所述投射减弱(例如，抑制)情境记忆提取。
附图简述
图1A-1E描绘bReaChE-S的设计和表征。
图2A-2B描绘在内侧前额叶皮质中的注射部位附近的细胞体中以及在杏仁核中的下游轴突纤维中的视蛋白表达的共焦图像。
图3A-3F描绘bReachES的全细胞记录分析。
图4A-4F提供ReaChR和变体光响应性多肽(例如，bReachES)的氨基酸序列。
图5A-5S提供单荧光蛋白遗传编码的钙指示剂的氨基酸序列。
图6A-6C提供多荧光蛋白遗传编码的钙指示剂的氨基酸序列。
图7A-7U提供各种光响应性多肽的氨基酸序列。
图8提供光学刺激系统的第一实例。
图9提供光学刺激系统的第二实例。
图10提供光学刺激系统的第三实例。
图11A-11J描绘AC-CA单突触投射的表征。
图12A-12C描绘AC-CA投射的解剖特征。
图13A-13G描绘了AC-CA投射的光遗传学操作。
图14A-14L描绘了AC-CA投射对记忆提取的影响。
图15A-15L描绘记忆形成产生代表情境的高度相关的HC神经元。
图16A-16F描绘表达GCaMP6m的CA3神经元的生理学特性。
图17A-17F描绘AC-CA投射在记忆提取期间优先募集HC神经元。
图18A-18F描绘3D海马体积中的神经集成(neural ensembles)的实时成像。
图19A-19J描述提取期间海马中恐惧和中性网络的细胞群体和图谱特性。
图20A-20C描绘恐惧情境定义的HC神经元在恐惧对比中性情境中出现时的功能关系。
图21A-21C描绘HC神经元的空间和时间组织。
图22A-22E描绘使用快速非负去卷积和相关对分析对事件开始的估计。
图23A-23E描述恐惧对比中性情境中群体迹线的PCA。
图24A-24L描绘bReaChE-S的设计和表征。
定义
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”可互换使用，并且还可分别包括各自的复数，这取决于使用术语的上下文。它们指具有任何长度的核苷酸(无论是脱氧核糖核苷酸(DNA)还是核糖核苷酸(RNA)，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连锁分析定义的多个基因座(单个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA、核酶、小干扰RNA、(siRNA)、微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA(A、B和Z结构)、PNA、锁核酸(LNA)、TNA(苏糖核酸)具有任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。LNA通常被称为不可接近的RNA，是一种经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用连接2'与4'碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内结构构象中，这通常见于DNA或RNA的A型中，这可以显著提高热稳定性。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指具有任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。所述术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，例如与标记组分的缀合。如本文中所用，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文中所用，在两个核酸序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行最大对应性比对时相同的两个序列中的指定残基的百分比，如通过序列比较算法或目视检查所测量的。当关于蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置经常因保守性氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基取代具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不会改变分子的功能性质。当序列的不同之处在于保守性取代时，可以向上调整百分比序列同一性以校正取代的保守性质。不同之处在于此类保守性取代的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。可使用用于进行该调整的任何合适手段。这可涉及将保守性取代评分为部分错配，而不是完全错配，从而增加百分比序列同一性。因此，例如，在相同的氨基酸被赋予1分并且非保守性取代被赋予0分的情况下，保守性取代被赋予0与1之间的分数。计算保守性取代的评分，例如，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中实现的。
如本文中所用，“序列同一性的百分比”意指通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包括添加或缺失(即，缺口)来与参考序列(其不包含添加或缺失)进行比较以获得两个序列的最佳比对。通过以下过程计算百分比：测定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
可以采用用于比较的任何合适的序列比对方法。因此，任何两个序列之间的百分比同一性的测定可使用数学算法来完成。此类数学算法的实例是Myers和Miller,CABIOS,4:11(1988)(其在此通过引用整体并入)的算法；Smith等，Adv.Appl.Math.,2:482(1981)(其在此通过引用整体并入)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol,48:443(1970)(其在此通过引用整体并入)的同源性比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444(1988)(其在此通过引用整体并入)的相似性搜索方法；Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264(1990)(其在此通过引用整体并入)的算法；如Karhn和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873(1993)(其在此通过引用整体并入)修改。
这些数学算法的计算机实现可用于比较序列以测定序列同一性。此类实现包括但不限于：PC/Gene程序(可从Intelligenetics,Mountain View,Calif.获得)中的CLUSTAL；Wisconsin Genetics软件包，第8版(可从Genetics Computer Group(GCG),575ScienceDrive,Madison,Wis.,USA获得)中的ALIGN程序(第2.0版)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数来执行。Higgins等，Gene,73:237(1988),Higgins等，CABIOS,5:151(1989)；Corpet等，Nucl.Acids Res.,16:10881(1988)；Huang等，CABIOS,8:155(1992)；和Pearson等，Meth.Mol.Biol.,24:307(1994)(所述文献在此通过引用整体并入)中详尽地描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序基于Myers和Miller(同上)的算法。Altschul等，JMB,215:403(1990)；Nucl.Acids Res.,25:3389(1990)(所述文献在此通过引用整体并入)的BLAST程序基于Karlin和Altschul(同上)的算法。
用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI；worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。氨基酸序列中相对于参考氨基酸序列的氨基酸取代可以是“保守性的”或“非保守性的”，并且此类取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学上相似的侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代(即，用具有碱性侧链的另一种氨基酸替代具有碱性侧链的氨基酸)。“非保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学上不同的侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代(即，用具有芳香侧链的氨基酸替代具有碱性侧链的氨基酸)。标准的(编码的)二十个氨基酸根据其侧链的化学性质被分成化学家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香基的侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
术语“遗传修饰”是指在将异源核酸(例如，对于细胞是外源的核酸)引入细胞后，在细胞中诱导的永久或瞬时遗传变化。遗传变化(“修饰”)可以通过将异源核酸整合至宿主细胞的基因组中或通过将异源核酸作为染色体外元件进行短暂或稳定维持来完成。当细胞是真核细胞时，通过将核酸引入细胞的基因组可以实现永久的遗传变化。合适的遗传修饰方法包括病毒感染、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。
如本文中所用，术语“启动子”是指指导基因表达(转录)的DNA序列。启动子可指导原核或真核基因的转录。启动子可以是“可诱导的”，响应于诱导剂起始转录，或者相反，启动子可以是“组成型的”，由此诱导剂不调节转录速率。启动子可以以组织特异性或组织优选的方式进行调节，使得其仅在一种或多种特定组织类型中具有转录可操作连接的编码区的活性。
术语“可操作地连接的”是指调控序列与编码序列之间的功能性连接。所描述的组件因此处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。例如，将编码序列置于启动子的调节控制下意味着定位编码序列，使得编码序列的表达受启动子控制。
如本文中所用，“个体”、“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，包括人类。哺乳动物包括但不限于有蹄类动物、犬科动物、猫科动物，牛科动物、绵羊、非人类灵长类动物、兔类动物和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。一方面，个体是人。另一方面，个体是非人哺乳动物。
如本文中所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指获得有益或期望的结果，包括临床结果。为了本公开的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下的一项或多项：减轻由疾病引起的症状(改善不良症状)，提高患有疾病的人的生活质量，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，延迟疾病的进展和/或延长患有疾病的个体的存活。
在进一步描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应该理解的是，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解的是，除非本文另外清楚地规定，否则该范围的上限与下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在所述较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受所述范围内任何具体排除的限值的约束。如果所述范围包含所述限值的一个或两个，则排除这些所含限值任一者或两者的范围也包括在本发明内。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料也可用于实践或检验本发明，但现在描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与所引述的出版物相关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另有明确指出，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个光活化多肽”包括多个此类多肽，而提及“该GECI”包括提及一种或多种GECI以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。要进一步指出的是，可以起草权利要求书以排除任何可选元素。因此，该陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排它性术语如“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative)”限制的在先基础。
应该认识到，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。反之，为简明起见而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的多个特征也可以分开或以任何合适的子组合提供。与本发明相关的实施方案的所有组合都被本发明具体包含并且在本文中被公开，就如同每个和每一个组合被单独和明确地公开一样。另外，各种实施方安和其要素的所有子组合也被本发明特别包含并且在本文中公开，就如同每个和每一个此类子组合在本文中被单独地和明确地公开。
本文所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开内容而提供。本文的任何信息都不应解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于此类出版物。另外，所提供的公开日期可能不同于实际的公开日期，这可能需要独立地进行确认。
详述
本公开提供变体光响应性多肽和包含编码光响应性多肽的核苷酸序列的核酸。本公开提供了用于控制表达本公开的变体光响应性多肽的细胞的活动的方法、装置和系统。
变体光活化多肽
本公开提供变体光响应性多肽。本公开的变体光响应性多肽也称为“变体光活化多肽”。本公开的变体光响应性多肽当在真核细胞(例如，哺乳动物细胞；例如，可兴奋细胞诸如神经元细胞)表达，并且当暴露于具有激活波长的光时，诱导细胞膜的去极化。
与SEQ ID NO:1的光活化多肽相比，本公开的变体光响应性多肽表现出增加至至少5倍的动力学。SEQ ID NO:1(并且在图1A中描绘)的光活化多肽称为“ReaChR”。ReaChR的通道闭合具有682毫秒(ms)的单指数动力学的τ值，如在培养的大鼠海马神经元中所测量的。反之，当在培养的大鼠海马神经元中测量时，本公开的变体光响应性多肽表现出具有小于300ms、小于200ms或小于100ms的τ值的通道闭合。本公开的变体光响应性多肽表现出具有比ReaChR的通道闭合动力学快至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍，至少13倍或至少15倍的通道闭合动力学的通道闭合。
例如，在一些情况下，当在培养的大鼠海马神经元中测量时，本公开的变体光响应性多肽表现出具有约25ms至约50ms、约50ms至约75ms、约75ms至约100ms、约100ms至约125ms、约125ms至约150ms、约150ms至约200ms、约150ms至约200ms、约200ms至约250ms或约250ms至约300ms的τ值的通道闭合。在一些情况下，当在培养的大鼠海马神经元中测量时，本公开的变体光响应性多肽表现出具有约25ms至约50ms，约50ms至约75ms或约75ms至约100ms的τ值的通道闭合。在一些情况下，当在培养的大鼠海马神经元中测量时，本公开的变体光响应性多肽表现出具有为约40ms至约60ms的τ值的通道闭合。
当暴露于激活波长的光时，本公开的变体光响应性多肽可以以比由ReaChR诱发的动作电位的频率更高的频率诱发动作电位，例如当在哺乳动物神经元中表达时。ReaChR以1-2赫兹(Hz)的频率在体外培养的大鼠海马神经元中诱导神经元放电(诱发动作电位)。当暴露于激活波长的光时，本公开的变体光响应性多肽可以以大于2Hz、大于5Hz、大于10Hz、大于15Hz或大于20Hz的频率在表达所述变体光响应性多肽的细胞中诱发动作电位。例如，当暴露于激活波长的光时，本公开的变体光响应性多肽可以以3Hz至5Hz、5Hz至7Hz、7Hz至10Hz、10Hz至12Hz、12Hz至15Hz、15Hz至17Hz、17Hz至20Hz或大于20Hz的频率诱发动作电位。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽当暴露于激活波长的光时可以以15Hz至20Hz的频率诱发动作电位。
本公开的变体光响应性多肽由具有激活波长的光，例如具有600nm至700nm，例如600nm至625nm，625nm至650nm、650nm至675nm或675nm至700nm的波长的光激活。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽由具有625nm至650nm的波长的光激活。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽由具有630nm的波长的光激活。
本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的位置163处包含谷氨酸至丝氨酸的取代。
在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的氨基酸52至345具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的位置163处包含谷氨酸至丝氨酸的取代。
在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:2所示的和图4B中所描绘的氨基酸序列的编号的位置163处包含丝氨酸。
在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽的信号序列相对于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的信号序列被修饰。例如，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的信号序列是MVSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHER(SEQ ID NO:50)。在一些情况下，信号序列被不同的信号序列替换。例如，信号序列可以是MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:51)。因此，例如，在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:3中所示的和图4C中所描绘的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编号的位置123处具有丝氨酸。
在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:5所示的和图4E中所描绘的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的位置112处具有丝氨酸。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的位置112处具有丝氨酸，并且包括以下的1项、2项、3项、4项、5项、6项、7或全部：a)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸48处的Val；b)基于SEQID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸79处的Glu；c)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸90处的Glu；d)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸106处的Val；e)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸123处的His；f)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸231处的Pro；g)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸235处的Ala；和h)基于SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸247处的Asn。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的位置112处具有丝氨酸，并且包括：a)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸48处的Val；b)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸79处的Glu；c)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸90处的Glu；d)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸106处的Val；e)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸123处的His；f)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸231处的Pro；g)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸235处的Ala；和h)基于SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编号的氨基酸247处的Asn。在一些情况下，变体光响应性多肽包含信号序列(例如，MDYGGALSAVG(SEQ ID NO:51)或其它合适的信号序列)。在一些情况下，变体光响应性多肽包含ER输出信号。在一些情况下，变体光响应性多肽包含ER输出信号和膜运输信号。
在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:6所示的和图4F中所描绘的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的位置112处具有丝氨酸。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的位置112处具有丝氨酸；并且包括以下的1项、2项、3项、4项、5项、6项、7项或全部：a)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸48处的Val；b)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸79处的Glu；c)基于SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的编号的氨基酸90处的Glu；d)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸106处的Val；e)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸123处的His；f)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸231处的Pro；g)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸235处的Ala；和h)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸247处的Asn。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的位置112处具有丝氨酸；并且包括：a)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸48处的Val；b)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸79上的Glu；c)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸90处的Glu；d)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸106处的Val；e)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸123上的His；f)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸231处的Pro；g)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸235处的Ala；和h)基于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编号的氨基酸247处的Asn。
在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的位置163处包含谷氨酸至丝氨酸的取代。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的编号的位置163处包含谷氨酸至丝氨酸的取代，并且包括以下的1项、2项、3项、4项、5项、6项、7项或全部：a)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸99处的Val；b)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸130处的Glu；c)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸141处的Glu；d)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸157处的Val；e)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸174处的His；f)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸282上的Pro；g)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸286处的Ala；和h)基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸298处的Asn。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且在基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的位置163处包含谷氨酸至丝氨酸的取代，并且包括基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸99处的Val，基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸130处的Glu，基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸141处的Glu，基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸157处的Val，基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸174处的His，基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸282处的Pro，基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸286处的Ala，以及基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编号的氨基酸298处的Asn。
本公开的变体光响应性多肽可以与选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸序列基序融合：信号肽、内质网(ER)输出信号、膜运输信号和N末端高尔基输出信号。可以将增强蛋白质转运至哺乳动物细胞质膜的一个或多个氨基酸序列基序与蛋白质的N末端、C末端或N末端和C末端融合以促进蛋白质在细胞质膜中的最佳表达和/或定位。任选地，本公开的变体光响应性多肽和一个或多个氨基酸序列基序可通过接头分隔。在一些实施方案中，可通过添加增强蛋白质向细胞质膜的转运的运输信号(ts)来修饰本公开的变体光响应性多肽。在一些实施方案中，运输信号可以来源于人内向整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在其它实施方案中，运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:52)。在一些实施方案中，异源膜运输信号可包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDIN(SEQ ID NO:62)。
适合使用的运输序列可包含与氨基酸序列诸如人内向整流钾通道Kir2.1的运输序列(例如，KSRITSEGEYIPLDQIDINV(SEQ ID NO:52))具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
运输序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸，例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸的长度。
适合使用的信号序列可包含与氨基酸序列(诸如以下序列之一)具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
1)hChR2的信号肽(例如，MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS(SEQ ID NO:53))
2)神经元烟碱乙酰胆碱受体的β2亚基信号肽(例如，MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF(SEQ ID NO:54))；
3)烟碱乙酰胆碱受体信号序列(例如，MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG(SEQ ID NO:55))；和
4)烟碱乙酰胆碱受体信号序列(例如，MRGTPLLLVVSLFSLLQD(SEQ ID NO:56))。
信号序列可具有约10个氨基酸至约50个氨基酸，例如约10个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸的长度。
适合与本公开的变体光响应性多肽一起使用的内质网(ER)输出序列包括例如VXXSL(其中X为任意氨基酸)(例如，VKESL(SEQ ID NO:57)；VLGSL(SEQ ID NO:58)等)；NANSFCYENEVALTSK(SEQ ID NO:59)；FXYENE(SEQ ID NO:60)(其中X为任意氨基酸)，例如FCYENEV(SEQ ID NO:61)等。ER输出序列可具有约5个氨基酸至约25个氨基酸，例如约5个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸或约20个氨基酸至约25个氨基酸的长度。
本公开的变体光响应性多肽还可包含一种或多种另外的多肽。例如，本公开的变体光响应性多肽可包括接头、表位标签、荧光蛋白、提供纯化的容易性的肽、可切割的接头肽等。
合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)或其变体、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(ECFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、去稳定EGFP(dEGFP)、去稳定ECFP(dECFP)、去稳定EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed-单体、J-Red、dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、海肾GFP(Renilla GFP)、MonsterGFP、paGFP、Kaede蛋白和激发蛋白(kindling protein)、藻胆蛋白和藻胆蛋白缀合物(包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白)。荧光蛋白的其它实例包括mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrape1、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner等(2005)Nat.Methods 2:905-909)等。来自珊瑚虫物种的各种荧光和有色蛋白质中的任一种，如Matz等(1999)Nature Biotechnol.17:969-973中所述的，适合使用。
核酸、表达载体和宿主细胞
本公开提供了包含编码本文所述的一种或多种主题蛋白(例如，如上所述的一种或多种变体光响应性多肽)的核苷酸序列的核酸。本公开还提供了包含含有本公开的变体光响应性多肽的核酸的重组表达载体。本公开还提供了经遗传修饰以包含本公开的核酸或本公开的重组表达载体的宿主细胞。
核酸和重组表达载体
本公开提供了包含编码本文所述的一种或多种主题蛋白(例如，如上所述的一种或多种变体光响应性多肽)的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，主题多核苷酸包含表达盒，其中表达盒包含用于在靶细胞中表达由所述多核苷酸编码的一种或多种蛋白质的多个组分(例如，多个编码序列)。
在一些情况下，编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件，例如启动子。在靶细胞中起作用的任何合适的启动子都适合使用。在某些实施方案中，启动子可以是对特定靶细胞类型或特定组织类型特异的启动子，例如特定神经元或泛神经元启动子。可用于驱动多核苷酸在特定动物细胞中表达的启动子的起始控制区是众多的并且为本领域技术人员所熟悉的。实际上可以使用能够驱动主题多核苷酸表达的任何启动子。在一些实施方案中，用于驱动本公开的变体光响应性多肽表达的启动子可以是Thy1启动子(参见，例如Llewellyn等，2010,Nat.Med.,16(10):1161-1166)。在一些实施方案中，用于驱动本公开的变体光响应性多肽表达的启动子是人突触蛋白(hSyn)启动子、人延伸因子1-α(EF1α)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子、突触蛋白-I启动子(例如，人突触蛋白-I启动子)、人突触核蛋白1启动子、人Thy1启动子、钙/钙调蛋白依赖性激酶IIα(CAMKIIα)启动子、囊泡γ-氨基丁酸(VGAT)启动子、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、Pet1启动子、神经肽Y(NPY)启动子、生长抑素(SST)启动子、精氨酸加压素(AVP)启动子、下丘泌素(Hcrt)启动子或能够驱动编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列在靶细胞中表达的任何其它启动子。
在一些情况下，合适的启动子是诱导型启动子。例如，启动子可由对外源施用的药物作出反应的反式作用因子诱导。诱导型启动子的实例包括但不限于四环素-开或四环素-关启动子或他莫昔芬诱导的CreER。
在一些情况下，合适的启动子是组成型启动子。此类组成型启动子在所有情况下都具有活性，并且不受调控。
在一些实施方案中，主题多核苷酸可包含可用于从同一转录物产生两种单独的蛋白质的核糖体跳过序列。在此类情况下，主题多核苷酸通常将包括编码光活化蛋白以及响应蛋白质的编码序列。在这些实施方案中，可在两个编码序列之间放置核糖体跳过序列以从同一转录物产生两种不同的蛋白质(即，光激活蛋白和响应蛋白)。
本文还提供了包含本文所述的主题多核苷酸(包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列)或其任何变体的重组表达载体。根据本公开的载体还包括包含编码RNA(例如，mRNA)的核苷酸序列的载体，所述RNA在从载体的多核苷酸转录时将导致本公开的变体光响应性多肽在靶细胞的质膜上积累。可使用的载体包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体。慢病毒载体包括但不限于基于人类免疫缺陷病毒(例如，HIV-1，HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)的载体。慢病毒可用其它病毒的包膜蛋白进行假型化，所述其它病毒包括但不限于水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、杆状病毒和埃博拉病毒。此类载体可使用本领域中的标准方法来制备。逆转录病毒包括但不限于鼠白血病病毒、脾坏死病毒，以及来源于逆转录病毒，例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳腺瘤病毒等的载体。
在一些情况下，合适的载体是重组AAV载体。AAV载体是尺寸相对较小的DNA病毒，其可以以稳定且位点特异性的方式整合至其感染的细胞的基因组中。它们能够感染广泛的细胞而不会对细胞生长、形态或分化诱导任何影响，并且它们似乎不参与人病理学。AAV基因组已被克隆，测序和表征。其包含约4700个碱基，并且在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复(ITR)区，其用作病毒的复制起始点。基因组的其余部分分为具有衣壳化功能的两个基本区域：包含参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组的左侧部分；和包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组的右侧部分。
AAV载体可使用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒都是合适的(参见，例如，Blacklow，“Parvoviruses and Human Disease"J.R.Pattison，编辑(1988)的第165-174页；Rose,Comprehensive Virology 3:1,1974；P.Tattersall“The Evolution ofParvovirus Taxonomy"In Parvoviruses(JR Kerr,SF Cotmore.ME Bloom,RM Linden,CRParrish，编辑)第5-14页，Hudder Arnold,London,UK(2006)；和DE Bowles,JERabinowitz,RJ Samulski“The Genus Dependovirus"(JR Kerr,SF Cotmore.ME Bloom,RMLinden,CR Parrish，编辑)第15-23页，Hudder Arnold,London,UK(2006)，其每一篇的公开内容在此通过引用整体并入本文)。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利第6,566,118号、第6,989,264号和第6,995,006号以及WO/1999/011764(标题为“Methods forGenerating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”)，所述专利和国际专利公开的公开内容通过引用整体并入本文。在例如WO 2008/024998中描述了用于在杆状病毒系统中制备AAV载体的方法。AAV载体可以是自身互补的或单链的。杂交载体的制备描述于例如PCT申请第PCT/US2005/027091号中，其公开内容通过引用整体并入本文。已经描述了源自AAV的载体用于体外和体内转移基因的用途(参见，例如国际专利申请公开第91/18088号和WO93/09239；美国专利第4,797,368号、第6,596,535号和第5,139,941号；和欧洲专利第0488528号，所述专利全部在此通过引用整体并入本文)。这些出版物描述了各种AAV衍生的构建体，其中将rep和/或cap基因删除并用目标基因替换，并且使用这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转移目标基因。根据本公开的复制缺陷型重组AAV可通过将含有侧接两个AAV反向末端重复(ITR)区的目标核酸序列的质粒和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染入感染了人辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系中来制备。然后通过标准技术纯化产生的AAV重组体。
在一些实施方案中，将用于本公开的方法的载体包裹入病毒颗粒(例如AAV病毒颗粒，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)。因此，本公开包括包含本文所述的任何载体的重组病毒颗粒(重组的，因为其含有重组多核苷酸)。产生此类颗粒的方法在本领域中是已知的，并且在美国专利第6,596,535号中进行了描述，所述专利的公开内容在此通过引用整体并入本文。
在一些情况下，编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列可以可操作地连接至各种启动子以靶向哺乳动物大脑中的特定神经元群体。合适的重组表达构建体的非限制性实例包括例如：AAV-CamKII-bReaCh-ES、AAV-hSyn-bReaCh-ES、AAV-mThy1-bReaCh-ES、AAV-hThy1-bReaCh-ES、AAV-GFAP-bReaCh-ES、AAV-VGAT-bReaCh-ES、AAV-PET1-bReaCh-ES、AAV-NPY-bReaCh-ES、AAV-SST-bReaCh-ES、AAV-AVP5.5-bReaCh-ES、AAV-Ef1a-bReaCh-ES、AAV-FLEX-rev-bReaCh-ES、AAV-CAG-bReaCh-ES、AAV-CAG-FLEX-bReaCh-ES，其中“bReaCh-ES”是编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列，其中“CamKII”是CamKII启动子，其中“hSyn”是人突触蛋白启动子，其中“mThy1”是小鼠Thy1启动子，其中“hThy1”是人Thy1启动子，“GFAP”是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(参见，例如，Lee等(2008)Glia56:481)，其中“VGAT”是囊泡γ氨基丁酸转运蛋白(VGAT)启动子，其中“PET1”是PET1启动子(参见，例如，Liu等，(2010)Nat.Neurosci.13:1190)，其中“NPY”是神经肽Y(NPY)启动子，其中“SST”是生长抑素(SST)启动子，其中“AVP5.5”是精氨酸加压素启动子(参见，例如，Pak等(2007)148:3371)，其中“Ef1a”是Ef1a启动子，其中“CAG”是巨细胞病毒早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)启动子(参见，例如，Alexopoulou等(2008)MBC Cell Biol.9:2)，其中“FLEX-for”是FLEX-for开关，并且其中“FLEX-rev”是FLEX-rev开关。对于翻转-切除(flip-excision)(FLEX)开关，参见，例如，Atasoy等(2008)J.Neurosci.28:7025。包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的重组表达载体还可包含编码荧光蛋白的核苷酸序列(XFP)。例如，可使用(但不限于)以下腺相关载体(AAV)及其组分：AAV-CamKII-bReaCh-ES-XFP、AAV-hSyn-bReaCh-ES-XFP、AAV-mThy1-bReaCh-ES-XFP、AAV-hThy1-bReaCh-ES-XFP、AAV-GFAP-bReaCh-ES-XFP、AAV-VGAT-bReaCh-ES-XFP、AAV-PET1-bReaCh-ES-XFP、AAV-NPY-bReaCh-ES-XFP、AAV-SST-bReaCh-ES-XFP、AAV-AVP5.5-bReaCh-ES-XFP、AAV-Ef1a-bReaCh-ES-XFP、AAV-FLEX-rev-bReaCh-ES-XFP、AAV-CAG-bReaCh-ES-XFP、AAV-CAG-FLEX-bReaCh-ES-XFP，其中“bReaCh-ES”是编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列，其中“CamKII”是CamKII启动子，其中“hSyn”是人突触蛋白启动子，其中“mThy1”是小鼠Thy1启动子，其中“hThy1”是人Thy1启动子，“GFAP”是GFAP启动子，其中“VGAT”是VGAT启动子，其中“PET1”是PET1启动子，其中“NPY”是NPY启动子，其中“SST”是SST启动子，其中“AVP5.5”是AVP5.5启动子，其中“Ef1a”是Ef1a启动子，其中“CAG”是CAG启动子，其中“FLEX”是FLEX-for开关，并且其中“FLEX-rev”是FLEX-rev开关。可以与多核苷酸结合使用的其它AAV载体包括具有双敲除的反向阅读框(double floxed inverted reading frames)(DIO)的那些载体，其允许在重组酶诸如Cre和Flp的控制下表达蛋白质：AAV-Ef1a-DIO(Cre)-bReaCh-ES(Cre-依赖性表达)、AAV-Ef1a-DIO(Flp)-bReaCh-ES(Flp依赖性表达)、AAV-Ef1a-DIO(Cre)-DIO(Flp)-bReaCh-ES(Cre和Flp依赖性表达)，其任选地与编码荧光蛋白的核苷酸序列(XFP)可操作地键联，例如AAV-Ef1a-DIO(Cre)-bReaCh-ES-XFP(Cre依赖性表达)、AAV-Ef1a-DIO(Flp)-bReaCh-ES-XFP(Flp依赖性表达)、AAV-Ef1a-DIO(Cre)-DIO(Flp)-bReaCh-ES-XFP(Cre和Flp依赖性表达)，其中“bReaCh-ES”是编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列。
另一种主要的病毒转导系统利用包括以下潜在表达载体的慢病毒。在一些情况下，编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列可以可操作地连接至各种慢病毒表达启动子。合适的慢病毒表达启动子的非限制性实例包括例如：pLenti-CamKII-bReaCh-ES、pLenti-Ef1a-bReaCh-ES、pLenti-mThy1-bReaCh-ES、pLenti-hThy1-bReaCh-ES、pLenti-hSyn-bReaCh-ES、pLenti-VGAT-bReaCh-ES、pLenti-Hcrt-bReaCh-ES，其中“bReaCh-ES”是编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列，其中“CamKII”是CamKII启动子，其中“hSyn”是人突触蛋白启动子，其中“mThy1”是小鼠Thy1启动子，其中“hThy1”是人Thy1启动子，其中“VGAT”是VGAT启动子，其中“Ef1a”是Ef1a启动子，其中“Hcrt”是下丘泌素神经肽(Hcrt)启动子。可操作地连接至各种慢病毒表达启动子的编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列还可包含编码荧光蛋白的核苷酸序列(XFP)，例如：pLenti-CamKII-bReaCh-ES-XFP、pLenti-Ef1a-bReaCh-ES-XFP、pLenti-mThy1-bReaCh-ES-XFP、pLenti-hThy1-bReaCh-ES-XFP、pLenti-hSyn-bReaCh-ES-XFP、pLenti-VGAT-bReaCh-ES-XFP、pLenti-Hcrt-bReaCh-ES-XFP，其中“CamKII”是CamKII启动子，其中“hSyn”是人突触蛋白启动子，其中“mThy1”是小鼠Thy1启动子，其中“hThy1”是人Thy1启动子，其中“VGAT”是VGAT启动子，其中“Ef1a”是Ef1a启动子，其中“Hcrt”是Hcrt启动子。可以利用单纯疱疹病毒(HSV)在突触上转运目标蛋白质(顺行)，所述单纯疱疹病毒包括以下表达载体：HSV-EF1a-bReaCh-ES和HSV-EF1a-DIO-bReaCh-ES，任选地与编码荧光蛋白的核苷酸序列(XFP)可操作地键联，例如，HSV-EF1a-bReaCh-ES-XFP和HSV-EF1a-DIO-bReaCh-ES-XFP，其中“EF1a”是EF1a启动子，“DIO”意指载体包含具有双敲除的反向阅读框的多核苷酸。狂犬病毒和伪狂犬病毒可用于在突触上使用以下表达载体进行逆向转运：SAD(δ)G-bReaCh-ES-XFP和SAD(δ)G-DIO-bReaCh-ES-XFP，其中“SAD(δ)G”是G基因缺陷型重组狂犬病毒(参见，例如，Etessami等(2000)J.Gen.Virol.81:2147-2153)，并且“DIO”意指该载体包含具有双敲除的反向阅读框的多核苷酸。其它哺乳动物表达载体包括：pcDNA3.1-CMV-bReaCh-ES和pCAGGS-bReaCh-ES，其任选地与编码荧光蛋白的核苷酸序列(XFP)可操作地键联，例如pcDNA3.1-CMV-bReaCh-ES-XFP和pCAGGS-bReaCh-ES-XFP，其中“CMV”是CMV启动子。
神经元特异性启动子和其它控制元件(例如，增强子)在本领域中是已知的。合适的神经元特异性控制序列包括但不限于神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(参见，例如，EMBL HSENO2,X51956；也参见，例如美国专利第6,649,811号、美国专利第5,387,742号)；芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)启动子；神经丝启动子(参见，例如，GenBank HUMNFL,L04147)；突触蛋白启动子(参见，例如，GenBank HUMSYNIB,M55301)；thy-1启动子(参见，例如Chen等(1987)Cell 51:7-19；和Llewellyn等(2010)Nat.Med.16:1161)；5-羟色胺受体启动子(参见，例如GenBank S62283)；酪氨酸羟化酶启动子(TH)(参见，例如Nucl.Acids.Res.15:2363-2384(1987)和Neuron 6:583-594(1991))；GnRH启动子(参见，例如Radovick等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3402-3406(1991))；L7启动子(参见，例如Oberdick等，Science 248:223-226(1990))；DNMT启动子(参见，例如Bartge等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3648-3652(1988))；脑啡肽启动子(参见，例如，Comb等，EMBOJ.17:3793-3805(1988))；髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子；CMV增强子/血小板源性生长因子-β启动子(参见，例如，Liu等(2004)Gene Therapy 11:52-60)；运动神经元特异性基因Hb9启动子(参见，例如，美国专利第7,632,679号；和Lee等(2004)Development 131:3295-3306)；Ca(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKIIα)启动子的α亚基(参见，例如，Mayford等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13250)；甲基-CpG结合蛋白-2(MeCP2)；Pax6启动子；Nkx6.1启动子；潜伏期相关启动子2(LAP2)启动子；ETS结构域转录因子PET1启动子(参见，例如，Liu等(2011)Nat.Neurosci.13(10):1190-1198)；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(参见，例如，Brenner等(1994)J.Neurosci.14:1030-1037)；囊泡GABA转运蛋白(VGAT)启动子(参见，例如，Ebihara等(2003)Brain Res.Mol.Brain Res.110:126-139)；神经肽酪氨酸(NPY)启动子(参见，例如，Andersson等(1994)Cell Growth Differ.5:27-36)；生长抑素(SST)启动子(参见，例如，Grosser等(2014)Neurosci.Lett.566:241-246)；精氨酸加压素(AVP)启动子(例如，AVP5.5启动子；参见，例如，Pak等(2007)Endocrinology.148:3371-3382)；延伸因子1a(EF1a)启动子(参见，例如，Zhu等(2001)Biochim.Biophys.Acta.1521:19-29)；下丘泌素神经肽前体(HCRT)启动子(参见，例如，Dong等(2013)Sleep Med.14:482-487)等。
在一些情况下，本公开的重组表达载体可包含控制元件，诸如Cre-依赖性遗传开关(FLEX开关)，其在Cre存在的情况下将可操作地连接的基因的表达“开启”或“关闭”，这取决于基因的定向(参见，例如，Atasoy等(2008)J.Neurosci.28:7025-7030)。在一些情况下，在Cre存在的情况下，本公开的FLEX开关将“开启”具有正向定向(例如，FLEX-for开关)的可操作地连接的基因的表达。在其它情况下，在Cre存在的情况下，本公开的FLEX开关将“关闭”具有反向取向(例如FLEX-rev开关)的可操作地连接的基因的表达。
在一些情况下，本公开的重组表达载体可包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列和编码钙指示剂例如遗传编码的钙指示剂(GECI)的核苷酸序列。在一些情况下，在两个单独的表达载体上编码本公开的变体光响应性多肽和GECI。
本公开的变体光响应性多肽可用作用于脑区域之间功能连接的有效映射的工具。在一些实施方案中，功能连接的有效映射是与GECI结合实现的。通常地，GECI是可响应细胞内钙离子水平的荧光分子，因此在各种细胞类型中的钙信号传导(例如，神经元活动)的研究中具有广泛的用途。GECI可被容易地靶向特定细胞类型或亚细胞区室，并且当与变体光响应性多肽一起表达时，可提供细胞活动的长期重复体内测量。GECI包含荧光蛋白、钙结合结构域(例如，钙调蛋白、肌钙蛋白C等)和结合钙结合结构域的结构域(例如，肌球蛋白轻链激酶的M13结构域，其结合钙调蛋白)。GECI的实例包括Pericams、Cameleons、GCaMP、TN-XXL和Twitch。
适合用于GECI的荧光多肽包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、Venus、GFPS65T、Emerald、Topaz、GFPuv、去稳定EGFP(dEGFP)、去稳定ECFP(dECFP)、去稳定EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、mCherry、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、mEos、pocilloporin、海肾GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白或藻胆蛋白或其任一种的生物活性变体或片段。
GECI包含与一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种或更多种)荧光蛋白(FP)融合的钙结合结构域诸如钙调蛋白或肌钙蛋白C。在单-FP GECI中，在钙结合后，循环排列(circularly permutated)FP(cpFP)的荧光强度可通过发色团环境中钙结合依赖性变化来调节。在多-FPGECI(例如，2-FP GECI、3-FP GECI、4-FP GECI)中，钙结合调节FP之间的共振能量转移(FRET)。
例如，在一些情况下，单-FP GECI可与变体光响应性多肽组合用作用于脑区域之间的功能连接的有效映射的工具。可用于本公开的单FP GECI可以是荧光蛋白、钙调蛋白和M13肽序列的融合产物(例如，GFP钙调蛋白-M13GECI(GCaMP))，包括但不限于GCaMPK(SEQID NO:7)、GCaMP2(SEQ ID NO:8)、GCaMP2.1(SEQ ID NO:9)、GCaMP2.2a(SEQ ID NO:10)、GCaMP2.2b(SEQ ID NO:11)、GCaMP2.3(SEQ ID NO:12)、GCaMP2.4(SEQ ID NO:13)、GCaMP3(SEQ ID NO:14)、GCaMP5g(SEQ ID NO:15)、GCaMP6m(SEQ ID NO:16)、GCaMP6s(SEQ ID NO:17)、GCaMP6f(SEQ ID NO:18)等。可用于本公开的其它单-FP GECI包括用于光学成像的遗传编码的钙指示剂(GECO)，诸如绿色荧光指示剂G-GECO1(SEQ ID NO:23)、G-GECO1.1(SEQID NO:24)和G-GECO1.2(SEQ ID NO:25)、红色荧光指示剂R-GECO1(SEQ ID NO:21)、蓝色荧光指示剂B-GECO1(SEQ ID NO:22)、发射比率计量指示剂GEM-GECO1(SEQ ID NO:19)和激发比率计量GEX-GECO1(SEQ ID NO:20)等。
适合使用的单-FP GECI包括但不限于包含与图5A-图5S中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:7-25)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的那些。
例如，在一些情况下，多-FP GECI(例如，2-FP GECI、3-FP GECI、4-FP GECI)可以与变体光响应性多肽组合用作用于脑区域之间的功能连接的有效映射的工具。可用于本公开的多-FP GECI包括但不限于TN-XXL(SEQ ID NO:26)、Yellow Cameleons(例如，YC3.6(SEQ ID NO:27))、D3CPVenus(SEQ ID NO:28)等。
适合使用的多-FP GECI包含与图6中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:26-28)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
宿主细胞
本公开提供了用本公开的核酸或本公开的重组表达载体遗传修饰的经遗传修饰的宿主细胞(例如，分离的经遗传修饰的宿主细胞；经体外遗传修饰的宿主细胞；经体内遗传修饰的宿主细胞)。在一些情况下，主题分离的经遗传修饰的宿主细胞可产生本公开的变体光响应性多肽。在一些情况下，本公开的经遗传修饰的宿主细胞产生本公开的变体光响应性多肽，使得变体光响应性多肽存在于细胞膜中。
合适的宿主细胞包括真核宿主细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞；和原核细胞，诸如细菌细胞。可以例如通过磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其它已知方法将主题核酸引入宿主细胞。
合适的哺乳动物细胞包括原代细胞系和永生化细胞系。在一些情况下，哺乳动物细胞是神经元，例如非永生化(原代)神经元。在其它情况下，哺乳动物细胞是永生化细胞系。在一些情况下，细胞是人原代细胞。在一些情况下，细胞是人神经元。在一些情况下，细胞是心脏细胞。在一些情况下，细胞是干细胞(例如，神经干细胞；造血干细胞；多能干细胞；胚胎干细胞)。
合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、人胚胎肾(HEK)细胞(ATCC编号CRL1573)、HLHepG2细胞等。
在一些实施方案中，细胞是神经元细胞或神经元样细胞。细胞可以是人、非人灵长类动物、小鼠或大鼠来源的，或来源于除人、非人灵长类动物、大鼠或小鼠外的哺乳动物。合适的细胞系包括，但不限于人神经胶质瘤细胞系，例如，SVGp12(ATCC CRL-8621)、CCF-STTG1(ATCC CRL-1718)、SW 1088(ATCC HTB-12)、SW 1783(ATCC HTB-13)、LLN-18(ATCCCRL-2610)、LNZTA3WT4(ATCC CRL-11543)、LNZTA3WT11(ATCC CRL-11544)、U-138MG(ATCCHTB-16)、U-87MG(ATCC HTB-14)、H4(ATCC HTB-148)和LN-229(ATCC CRL-2611)；人髓母细胞瘤源性细胞系，例如D342Med(ATCC HTB-187)、Daoy(ATCC HTB-186)、D283Med(ATCC HTB-185)；人肿瘤源性神经元样细胞，例如，PFSK-1(ATCC CRL-2060)、SK-N-DZ(ATCCCRL-2149)、SK-N-AS(ATCC CRL-2137)、SK-N-FI(ATCC CRL-2142)、IMR-32(ATCC CCL-127)等；小鼠神经元细胞系，例如，BC3H1(ATCC CRL-1443)、EOC1(ATCC CRL-2467)、C8-D30(ATCC CRL-2534)、C8-S(ATCC CRL-2535)、Neuro-2a(ATCC CCL-131)、NB41A3(ATCC CCL-147)、SW10(ATCCCRL-2766)、NG108-15(ATCC HB-12317)；大鼠神经元细胞系，例如，PC-12(ATCC CRL-1721)、CTX TNA2(ATCC CRL-2006)、C6(ATCC CCL-107)、F98(ATCC CRL-2397)、RG2(ATCC CRL-2433)、B35(ATCC CRL-2754)、R3(ATCC CRL-2764)、SCP(ATCC CRL-1700)、OA1(ATCC CRL-6538)。
合适的酵母细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、毕赤酵母属皮杰普氏酵母(Pichiaguercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、酵母属的一个种(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酵母属的一个种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母属的一个种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属的一个种(Fusarium sp.)、禾谷镰孢(Fusarium gramineum)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)等。酵母细胞可用于产生本公开的变体光响应性多肽。
合适的原核细胞包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、乳杆菌属的一个种(Lactobacillus sp.)、沙门氏菌属的一个种(Salmonella sp.)、志贺菌属的一个种(Shigella sp.)等的多种实验室菌株中的任一种。参见，例如，Carrier等(1992)J.Immunol.148:1176-1181；美国专利第6,447,784号；和Sizemore等(1995)Science 270:299-302。可用于本发明的沙门氏菌属菌株的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。合适的志贺氏菌属菌株包括但不限于福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和痢疾志贺氏菌(Shigella disenteriae)。通常，实验室菌株是非致病性菌株。其它合适的细菌的非限制性实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonaspudita)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、红球菌属的一个种(Rhodococcussp.)等。原核细胞可用于扩增本公开的核酸。
在一些情况下，本公开的经遗传修饰的哺乳动物宿主细胞用包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)进行遗传修饰；并且还用包含编码GECI的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)进行遗传修饰，其中合适的GECI是如上所述的。
在一些情况下，本公开的经遗传修饰的哺乳动物宿主细胞用包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)进行遗传修饰；并且还用包含编码第二光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)进行遗传修饰。在一些情况下，第二光响应性多肽是去极化光响应性多肽。在一些情况下，第二光响应性多肽是响应于具有与激活本公开的变体光响应性多肽的光的波长不同的波长的光而被激活的去极化光响应性多肽。在一些情况下，第二光响应性多肽是超极化光响应性多肽。下文中描述合适的第二光响应性多肽。
调节细胞活动的方法
本公开提供了用于靶细胞中动作电位的光遗传学调节的方法。主题方法总体涉及将本公开的变体光响应性多肽引入靶细胞中并用激活波长的光照射靶细胞。用具有激活波长的光照射靶细胞使得光活化通道蛋白允许一个或多个阳离子穿过靶细胞的质膜。阳离子穿过靶细胞质膜具有期望的作用，诸如，例如调节质膜的膜电位。在一些情况下，阳离子种类穿过质膜可用于调节患者的一种或多种神经反应或过程，并因此可用于治疗患者的疾病或病状。在一些情况下，主题方法涉及使用本文提供的系统和装置来治疗患者的病状，诸如神经病状。现在在下面更详细地描述主题方法。
在一些情况下，用于调节靶细胞活动的本公开的方法包括将本公开的变体光响应性多肽引入靶细胞，或将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)引入靶细胞，由此产生在其质膜中包含变体光响应性多肽的经修饰的靶细胞；并将所述经修饰的靶细胞暴露于具有激活所述变体光响应性多肽的波长的光(例如，红光)。将经修饰的靶细胞暴露于具有在600nm至700nm，例如600nm至625nm、625nm至650nm、650nm至675nm或675nm至700nm的范围内的波长的光。在一些情况下，将经修饰的靶细胞暴露于具有625nm至650nm的波长的光。在一些情况下，将经修饰的靶细胞暴露于具有630nm的波长的光。
在一些情况下，用于调节靶细胞活动的本公开的方法包括将本公开的变体光响应性多肽引入靶细胞，由此产生在其质膜中包含变体光响应性多肽的经修饰的靶细胞；并将经修饰的靶细胞暴露于具有激活所述变体光响应性多肽的波长的光(例如，具有在600nm至700nm的范围内的光；例如具有625nm至650nm的波长的光)。
在一些情况下，用于调节靶细胞活动的本公开的方法包括将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸引入靶细胞，由此产生在其质膜中包含所述变体光响应性多肽的经修饰的靶细胞；并将经修饰的靶细胞暴露于具有激活变体光响应性多肽的波长的光(例如，具有600nm至700nm的范围内的波长的光；例如具有625nm至650nm的波长的光)。在一些情况下，靶细胞是神经元，并且核苷酸序列可操作地连接至神经元特异性启动子。
在一些情况下，用于调节靶细胞活动的本公开的方法包括将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的重组表达载体引入靶细胞，由此产生在其质膜中包含所述变体光响应性多肽的经修饰的靶细胞；并将经修饰的靶细胞暴露于具有激活变体光响应性多肽的波长的光(例如，具有在600nm至700nm的范围内的波长的光；例如具有625nm至650nm的波长的光)。在一些情况下，靶细胞是神经元，并且核苷酸序列可操作地连接至神经元特异性启动子。
在一些情况下，靶细胞是体内细胞，例如存在于多细胞生物(例如，哺乳动物)中的细胞。哺乳动物包括例如人；非人灵长类动物；啮齿类动物，例如大鼠、小鼠；兔类动物，例如兔；有蹄类动物，例如，山羊、马、绵羊、牛科动物等；猫；狗等。在一些情况下，哺乳动物是人。在一些情况下，哺乳动物是非人灵长类动物。在一些情况下，哺乳动物是啮齿类动物。
当靶细胞是体内细胞，例如存在于个体(例如，哺乳动物)中的细胞时，包含编码本公开的变体光响应性多肽的重组表达载体(例如，重组病毒载体)可通过施用所述重组表达载体来向个体进行递送。施用重组表达载体可通过将包含重组表达载体的组合物注射至个体中来进行。例如，可在靶细胞或包含靶细胞的靶组织处或其附近(例如，在约5cm内、在约4cm内、在约3cm内、在约2cm内、在约1cm内或在约0.5cm内)注射重组表达载体。在一些情况下，可使用如下所述的装置或系统来施用重组表达载体，所述装置或系统包括包含含有重组表达载体的组合物的容器。容器可以是注射器。容器可被完全或部分地植入个体内。靶组织结构可用包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸进行遗传修饰，诸如通过病毒介导的基因递送、电穿孔、超声波、流体动力学递送或裸DNA的引入(通过直接注射或如补充以另外的促进剂如阳离子脂质或聚合物)。
在一些情况下，将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸引入至靶细胞的基因组中。例如，在一些情况下，使用CRISPR/Cas9系统将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸引入至靶细胞的基因组中。例如，将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的供体多核苷酸与Cas9多肽和引导RNA组合使用，以实现编码变体光响应性多肽的核苷酸序列至靶细胞的基因组中的引入。供体多核苷酸可包括例如靶细胞中的靶基因的开放阅读框(ORF)和编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列，其中ORF和编码变体光响应性多肽的核苷酸序列由内部核糖体进入位点或编码2A肽的核苷酸序列分开；并且引导RNA可包括例如与启动子序列的3'末端杂交的核苷酸序列，所述启动子序列可操作地连接至靶细胞基因组中的ORF。在一些情况下，供体多核苷酸可包括例如与靶细胞的基因组中的非编码区同源的序列，将这样的包含与神经元特异性启动子可操作地键联的编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸引入靶细胞(例如，神经元)而不影响任何内源基因表达。
靶细胞通常是携带或传输电脉冲的细胞，诸如神经细胞。靶细胞包括神经元、心脏细胞和干细胞。在一些情况下，靶细胞是神经元。在一些情况下，靶细胞是感觉神经元、运动神经元或中间神经元。靶细胞可包括中枢神经系统的细胞和/或周围神经系统的细胞。靶细胞可存在于靶组织中。在一些情况下，靶组织可包括多个神经纤维、神经、神经细胞神经节、神经肌肉接点、受神经支配的组织，包括但不限于肌肉、皮肤或内分泌组织，或解剖学区域，诸如脑或脊髓的一部分或子部分。在一些情况下，靶组织可以是单个细胞的一部分，例如神经细胞的特定轴突。
调节靶细胞的膜电位
本公开提供了用于例如通过调节靶细胞中的膜电位来调节靶细胞(例如，靶哺乳动物细胞)的活动的方法。在一些情况下，将编码本公开的变体光响应性多肽的核酸引入靶细胞中，使得靶细胞表达所述变体光响应性多肽，例如其中所述变体光响应性多肽被表达并且存在于靶细胞的质膜中。然后使用光产生装置用具有激活波长的光照射靶细胞。变体光响应性多肽的照射导致一个或多个阳离子响应光而移动通过细胞的质膜。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽的光活化导致表达所述变体光响应性多肽的细胞的去极化。在某些实施方案中，变体光响应性多肽的激活导致神经细胞膜的去极化和动作电位的触发。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽的光活化导致内源电压门控转运蛋白诸如钠通道或钙通道的激活，其中内源电压门控转运蛋白的激活诱发动作电位。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽的光活化导致内源电压门控钠通道的激活，其中内源电压门控钠通道的激活诱发一个或多个动作电位。在一些情况下，本公开的变体光响应性多肽的光激活导致内源电压门控钙通道的激活，其中内源电压门控钙通道的激活诱发一个或多个动作电位。在一些实施方案中，用于调节靶细胞活动的本公开的方法牵涉本公开的系统或装置的使用。
沿轴突投射的活动的特异增加
在一些实施方案中，主题方法涉及沿神经细胞的一部分(例如，沿神经细胞的轴突或在神经细胞的轴突投射的末端处)激活和/或增加活动。在一些实施方案中，主题方法涉及使用主题系统和装置沿神经细胞的一部分(例如，沿着神经细胞的轴突，或在神经细胞的轴突投射的末端)激活和/或增加活动。在一些情况下，本公开的方法涉及将本公开的变体光活化多肽引入神经细胞。将编码本公开的变体光活化多肽的核酸(或重组表达载体)引入神经细胞中，并且所述变体光活化多肽由神经细胞表达并被插入神经细胞的质膜中。
然后，定位光产生装置，使得当激活光产生装置时，神经细胞的目标部分(例如，神经细胞的轴突或轴突的一部分)被具有激活波长的光照射。然后，激活光产生装置以将光递送至期望的神经细胞或其部分，以使光激活的多肽允许阳离子流过神经细胞的质膜。
神经细胞质膜的去极化触发动作电位。因此，主题方法可用于通过将具有激活波长的光递送至神经细胞或神经细胞的特定部分来触发和/或增加特定神经细胞或其部分(例如，轴突或其部分)中的动作电位。重要的是，动作电位仍然可传播通过神经细胞或轴突的其它部分并表现为正常，所述部分或轴突没有被具有激活本公开的变体光活化多肽的波长的光照射。这样，在靶细胞或其特定部分中实现了特异性。
靶细胞和组织
如上所概述的，本公开的方面包括将包含编码本公开的变体光活化多肽的核苷酸序列的核酸或重组表达载体递送至靶细胞。靶细胞通常是携带或传输电脉冲的细胞，如神经细胞。在一些情况下，靶细胞是感觉神经元、运动神经元或中间神经元。靶细胞可包括中枢神经系统的细胞和/或周围神经系统的细胞。靶细胞可存在于靶组织中。在一些情况下，靶组织可包括多个神经纤维、神经、神经细胞、神经节、神经肌肉接点、受神经支配的组织，包括但不限于肌肉、皮肤或内分泌组织，或解剖学区域，诸如脑或脊髓的一部分或子部分。在一些情况下，靶组织可能是单个细胞的一部分，诸如神经细胞的特定轴突。
一旦主题多核苷酸已被递送至靶细胞或组织，多核苷酸就进入靶细胞并被表达。在一些实施方案中，主题多核苷酸可含有组织特异性启动子，使得表达仅发生在其中组织特异性启动子具有活性的靶细胞中。这样，如果主题多核苷酸被递送至除靶细胞外的细胞中，则该多核苷酸将不在非靶细胞中表达，因为组织特异性启动子在那些细胞中将是无活性的。在一些实施方案中，主题多核苷酸可含有诱导型启动子，使得多核苷酸的表达仅在外源性施用的药物以在细胞内足以激活启动子的浓度存在时才发生。
另外的多肽
在一些情况下，用于调节靶细胞活动的本公开的方法包括将本公开的变体光响应性多肽引入靶细胞，或将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)引入靶细胞，由此产生在其细胞膜中表达所述变体光响应性多肽的经修饰的靶细胞；并将经修饰的靶细胞暴露于具有激活变体光响应性多肽的波长的光(例如，具有在600nm至700nm范围内的波长的光；例如，具有625nm至650nm的波长的光)，其中经修饰的靶细胞表达另外的异源多肽，诸如GECI、第二种光响应性多肽等。
GECI
在一些情况下，用于调节靶细胞活动的本公开的方法包括将本公开的变体光响应性多肽引入靶细胞或将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)引入靶细胞，由此产生在其细胞膜中表达所述变体光响应性多肽的经修饰的靶细胞；并且将经修饰的靶细胞暴露于具有激活变体光响应性多肽的波长的光(例如，具有在600nm至700nm的范围内的波长的光；例如具有625nm至650nm的波长的光)，其中经修饰的靶细胞表达GECI。在经修饰的靶细胞表达GECI的情况下，该方法可包括检测经修饰的靶细胞的细胞膜中存在的光响应性多肽的光活化后经修饰的靶细胞中的细胞内钙的水平。
GECI包含荧光蛋白、钙结合结构域(例如，钙调蛋白、肌钙蛋白C等)和结合钙结合结构域的结构域(例如，肌球蛋白轻链激酶的M13结构域，其结合钙调蛋白)。GECI的实例包括Pericams、Cameleons、GCaMP、TN-XXL和Twitch。
适合用于GECI的荧光多肽包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、Venus、GFPS65T、Emerald、Topaz、GFPuv、去稳定EGFP(dEGFP)、去稳定ECFP(dECFP)、去稳定EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、mCherry、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、mEos、pocilloporin、海肾GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白或藻胆蛋白，或其任一个的生物活性变体或片段。
GECI包含与一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种或更多种)荧光蛋白(FP)融合的钙结合结构域，诸如钙调蛋白或肌钙蛋白C。在单-FP GECI中，在钙结合后，循环排列的FP(cpFP)的荧光强度可通过发色团环境中钙结合依赖性变化来调节。在多-FP GECI(例如，2-FP GECI、3-FP GECI、4-FP GECI)中，钙结合调节FP之间的共振能量转移(FRET)。
例如，在一些情况下，单-FP GECI可以与变体光响应性多肽组合用作用于脑区域之间的功能连接的有效映射的工具。可用于本公开的单-FP GECI可以是荧光蛋白、钙调蛋白和M13肽序列的融合产物(例如，GFP钙调蛋白-M13GECI(GCaMP))，包括但不限于GCaMPK(SEQ ID NO:7)、GCaMP2(SEQ ID NO:8)、GCaMP2.1(SEQ ID NO:9)、GCaMP2.2a(SEQ ID NO:10)、GCaMP2.2b(SEQ ID NO:11)、GCaMP2.3(SEQ ID NO:12)、GCaMP2.4(SEQ ID NO:13)、GCaMP3(SEQ ID NO:14)、GCaMP5g(SEQ ID NO:15)、GCaMP6m(SEQ ID NO:16)、GCaMP6s(SEQID NO:17)、GCaMP6f(SEQ ID NO:18)等。可用于本公开的其它单-FP GECI包括用于光学成像的遗传编码的钙指示剂(GECO)，诸如绿色荧光指示剂G-GECO1(SEQ ID NO:23)、G-GECO1.1(SEQ ID NO:24)和G-GECO1.2(SEQ ID NO:25)、红色荧光指示剂R-GECO1(SEQ IDNO:21)、蓝色荧光指示剂B-GECO1(SEQ ID NO:22)、发射比率计量指示剂GEM-GECO1(SEQ IDNO:19)和激发比率计量GEX-GECO1(SEQ ID NO:20)等。
适合使用的单-FP GECI包括但不限于包含与图5A-图5S中描绘的氨基酸序列(SEQID NO:7-25)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的那些氨基酸序列。
例如，在一些情况下，多-FP GECI(例如，2-FP GECI、3-FP GECI、4-FP GECI)可以与变体光响应性多肽组合用作用于大脑区域之间的功能连接的有效映射的工具。可用于本公开的多-FP GECI包括但不限于TN-XXL(SEQ ID NO:26)、Yellow Cameleons(例如，YC3.6(SEQ ID NO:27))、D3CPVenus(SEQ ID NO:28)等。
适合使用的多-FP GECI包含与图6中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:26-28)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
光响应性多肽
在一些情况下，用于调节靶细胞活动的本公开的方法包括将本公开的变体光响应性多肽引入靶细胞，或将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)引入靶细胞，由此产生在其细胞膜中表达所述变体光响应性多肽的经修饰的靶细胞；并将经修饰的靶细胞暴露于具有激活变体光响应性多肽的波长的光(例如，具有在600nm至700nm的范围内的波长的光；例如具有625nm至650nm的波长的光)，其中经修饰的靶细胞也被遗传修饰以表达第二光响应性多肽。在一些情况下，第二光响应性多肽是去极化光响应性多肽。在一些情况下，第二光响应性多肽是去极化光响应性多肽，其被具有与用于激活本公开的变体光响应性多肽的光的波长不同的波长的光激活，例如其中第二光响应性多肽是被蓝光、黄光、绿光、橙光等激活的去极化光响应性多肽。在一些情况下，第二光响应性多肽是超极化光响应性多肽。在一些情况下，第二光响应性多肽是被具有与用于激活本公开的变体光响应性多肽的光的波长不同的波长的光激活的超极化光响应性多肽，例如，其中第二光响应性多肽是被蓝光、黄光、绿光、橙光等激活的超极化光响应性多肽。
在一些实施方案中，去极化光响应性多肽是来源于莱茵衣藻的通道视紫红质(ChR1-NCBI GENE ID:5724518,ChR2-NCBI GENE ID:5727376)，其中当用光照射细胞时所述多肽能够将阳离子转运穿过细胞膜。用于激活来自莱茵衣藻的光响应性阳离子通道蛋白的光可具有约460至约495nm之间的波长或可具有约480nm的波长。另外，可使用具有约100Hz的时间频率的光脉冲来激活光响应性蛋白。在一些实施方案中，利用具有约100Hz的时间频率的光脉冲激活来自莱茵衣藻的光响应性阳离子通道可引起表达所述光响应性阳离子通道的可兴奋细胞(例如，神经元)的去极化。光响应性阳离子通道蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低光响应性阳离子通道蛋白调节细胞质膜极化状态的能力。另外，光响应性阳离子通道蛋白可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的光响应性质子泵蛋白适当地保留了将阳离子转运穿过细胞膜的能力。在一些情况下，合适的通道视紫红质是ChR1多肽，其包含与图7A中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的通道视紫红质是ChR2多肽，其包含与图7B中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或100％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，光响应性多肽是阶跃函数视蛋白(SFO)蛋白质或稳定的阶跃函数视蛋白(SSFO)蛋白质，其可在ChR2的氨基酸序列的视黄醛结合口袋中的关键位置处具有特定氨基酸取代。关于SFO或SSFO蛋白的进一步公开内容可见于国际专利申请公开第WO2010/056970号，其公开内容在此通过引用整体并入。在一些情况下，合适的ChR2SFO包含与图7C中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的ChR2SSFO包含与图7D中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，合适的光响应性多肽是源自强壮团藻(Volvox carteri)(VChR1-NCBI GENE ID:9619570)的阳离子通道并且通过用波长为约500nm至约600nm(例如约525nm至约550nm，例如545nm)的光照射来激活。光响应性离子通道蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长光的灵敏度，和/或增强或降低光响应离子通道蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，光响应性离子通道蛋白可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入的光响应性离子通道蛋白适当地保留了响应于光而将离子转运穿过可兴奋细胞的质膜的能力。在一些情况下，来源于强壮团藻的合适的阳离子通道是VChR1多肽，其包含与图7E中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，光响应性多肽是基于VChR1的SFO或SSFO。在一些实施方案中，当用蓝光照射细胞时，SFO或SSFO蛋白能够介导细胞内的去极化电流。在一些实施方案中，光具有约560nm的波长。另外，在一些实施方案中，由于SFO和SSFO光电流的长期稳定性，可以将光作为单脉冲的光或作为间隔脉冲的光传送。在一些实施方案中，用单脉冲或间隔脉冲的光激活SFO或SSFO蛋白可引起表达SFO或SSFO蛋白的可兴奋细胞(例如，神经元)的去极化。在一些实施方案中，每个公开的阶跃函数视蛋白和稳定的阶跃函数视蛋白可具有用于响应于光而使可兴奋细胞的膜去极化的特定性质和特征。在一些情况下，合适的VChR1SFO包含与图7F中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的VChR1SSFO包含与图7G中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，光响应性阳离子通道蛋白是来源于强壮团藻的VChR1蛋白和来自莱茵衣藻的ChR1蛋白的C1V1嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一和第二跨膜螺旋被ChR1的第一和第二跨膜螺旋替代的VChR1的氨基酸序列；响应于光；并且当用光照射细胞时能够介导细胞内的去极化电流。在一些实施方案中，C1V1蛋白还包含位于嵌合光响应性蛋白的第二与第三跨膜螺旋之间的胞内环结构域内的替代，其中胞内环结构域的至少一部分被来自ChR1的相应部分替代。在另一个实施方案中，C1V1嵌合蛋白的细胞内环结构域的部分可用延伸至ChR1的氨基酸残基A145的ChR1的相应部分替代。在其它实施方案中，C1V1嵌合蛋白还包含嵌合光响应性蛋白的第三跨膜螺旋内的替代，其中第三跨膜螺旋的至少一部分被ChR1的相应序列替代。在另一个实施方案中，C1V1嵌合蛋白的胞内环结构域的部分可用延伸至ChR1的氨基酸残基W163的ChR1的相应部分替代。
在一些实施方案中，当用绿光照射细胞时，C1V1蛋白介导细胞内的去极化电流。在一些实施方案中，光具有约540nm至约560nm之间的波长。在一些实施方案中，光可具有约542nm的波长。在一些实施方案中，当用紫光照射细胞时，C1V1嵌合蛋白不能介导细胞内的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长约405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白不能介导细胞内的去极化电流。另外，在一些实施方案中，可使用具有约100Hz的时间频率的光脉冲来激活C1V1蛋白。
在一些方面，合适的光响应性多肽包含取代或突变的氨基酸序列，其中所述突变多肽保留前体C1V1嵌合多肽的特征性光可激活性质，但在一些特定方面也可具有改变的性质。例如，本文所述的突变体光响应性C1V1嵌合蛋白可在动物细胞内或在动物细胞质膜上表现出升高的表达水平；当暴露于不同波长的光，尤其是红光时，响应性改变；和/或性状的组合，由此嵌合C1V1多肽具有低脱敏、快速失活、对于与其它光响应性阳离子通道最小交叉激活的低紫光激活和/或在动物细胞中强表达的性质。
因此，合适的光响应性蛋白包括C1V1嵌合光响应性蛋白，其可在嵌合多肽的VChR1部分的整个视黄醛结合口袋中的关键位置处具有特定的氨基酸取代。在一些情况下，合适的C1V1嵌合光响应性蛋白包含与图7H中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:36)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，光响应性阳离子通道蛋白是源自ChR1的C1C2嵌合蛋白和来自莱茵衣藻的ChR2蛋白，其中所述蛋白响应于光并且当用光照射细胞时能够介导细胞中的去极化电流。光响应性阳离子通道蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低光响应性阳离子通道蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，光响应性阳离子通道蛋白包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。含有引入至天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入的光响应性质子泵蛋白适当地保留了将阳离子转运穿过细胞膜的能力。在一些情况下，合适的C1C2嵌合光响应性蛋白包含与图7I中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，去极化光响应性多肽是源自绿色鞭毛藻(Scherffelia dubia)的SdChR多肽(Genbank登录号：AHH02138)，其中当用光照射细胞时，SdChR多肽能够将阳离子转运穿过细胞膜。用于激活SdChR多肽的光可具有约440nm至约490nm之间的波长或可具有约460nm的波长。SdChR蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低SdChR蛋白质来调节细胞质膜的极化状态的能力。在一些情况下，SdChR蛋白包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。含有引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的SdChR蛋白适当地保留了将阳离子转运穿过细胞膜的能力。在一些情况下，合适的SdChR蛋白包含与图7J中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:38)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，去极化光响应性多肽可以是例如CnChR2(Genbank登录号：AHH02139)，其源自夜配衣藻(Chlamydomonas noctigama)，其中当用光照射细胞时，CnChR2多肽能够将阳离子转运穿过细胞膜。用于激活CnChR2多肽的光可具有约560nm至约630nm之间的波长或可具有约600nm的波长。CnChR2蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低CnChR2蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。在一些情况下，CnChR2蛋白包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。含有引入至天然氨基酸序列的取代、缺失和/或插入的CnChR2蛋白适当地保留了将阳离子转运穿过细胞膜的能力。在一些情况下，合适的CnChR2蛋白包含与图7K中所描绘的氨基酸序列(SEQ IDNO:39)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，光响应性阳离子通道蛋白是源自Chloromonas subdivisa的CsChR(Genbank登录号：AHH02144)蛋白和来自夜配衣藻的CnChR1蛋白的CsChrimson嵌合蛋白，其中所述蛋白的N末端包含CsChR的氨基酸序列的残基1-73，接着是CnChR1的氨基酸序列的残基79-350；响应于光；并且当用光照射细胞时能够介导细胞内的去极化电流。CsChrimson蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低CsChrimson蛋白质调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，CsChrimson蛋白可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的CsChrimson蛋白适当地保留了将阳离子转运穿过细胞膜的能力。在一些情况下，合适的CsChrimson蛋白包含与图7L中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，去极化光响应性多肽可以是例如源自淡黄毛枝藻(Stigeocloniumhelveticum)的ShChR1(Genbank登录号：AHH02106)，其中当用光照射细胞时，ShChR1多肽能够将阳离子转运穿过细胞膜。用于激活来自淡黄毛枝藻的ShChR1蛋白的光可具有约480nm至约510nm之间的波长或者可以具有约500nm的波长。ShChR1蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低ShChR1蛋白质调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，ShChR1蛋白可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。含有引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的ShChR1蛋白适当地保留了将阳离子转运穿过细胞膜的能力。在一些情况下，合适的ShChR1蛋白包含与图7M中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，合适的超极化光响应性多肽是古紫质(Arch-Genbank登录号：ADB03111)质子泵(例如，源自苏打盐红菌(Halorubrum sodomense)的质子泵)，当用光照射细胞时，其可将一个或多个质子转运穿过细胞的质膜。Arch蛋白可额外地具有引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低Arch蛋白将离子转运穿过靶细胞的质膜的能力。另外，Arch蛋白可以包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的Arch蛋白适当地保留了响应光而将离子转运穿过靶细胞的质膜的能力。在一些情况下，合适的Arch蛋白包含与图7N中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，合适的光活化蛋白是古紫质(ArchT-Genbank登录号：ABT17417)质子泵(例如，来源于盐红菌属的一个种(Halorubrum sp.)TP009的质子泵)，当用光照射细胞时，其可将一个或多个质子转运穿过细胞的质膜。光可具有约530nm至约595nm之间的波长或可具有约560nm的波长。ArchT蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低ArchT蛋白将离子转运穿过靶细胞的质膜的能力。另外，ArchT蛋白可以包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的ArchT蛋白适当地保留了响应于光而将离子转运穿过靶细胞的质膜的能力。在一些情况下，合适的ArchT蛋白包含与图7O中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，光响应性多肽响应于蓝光并且是源自蓝隐藻(Guillardiatheta)的质子泵蛋白，其中当用蓝光照射细胞时，所述质子泵蛋白能够介导所述细胞中的超极化电流；这种蛋白质在本文中被称为“GtR3蛋白质”或“GtR3多肽”。GtR3(NCBI GENEID：17301498)蛋白质可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低GtR3蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，GtR3蛋白可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。含有引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的GtR3蛋白适当地保留了响应于光而使可兴奋细胞(例如，神经元)的质膜超极化的能力。在一些情况下，合适的GtR3蛋白包含与图7P中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，光活化蛋白是尖尾藻(Oxyrrhis marina)(Oxy-Genbank登录号：ADY17806)质子泵，当用光照射细胞时，其可将一个或多个质子转运穿过所述细胞的质膜。光可具有约500nm至约560nm之间的波长或可具有约530nm的波长。Oxy蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低Oxy蛋白将离子转运穿过靶细胞的质膜的能力。另外，Oxy蛋白可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的Oxy蛋白适当地保留了响应于光而将离子转运穿过靶细胞的质膜的能力。在一些情况下，合适的Oxy蛋白包含与图7Q中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:45)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，光响应性质子泵蛋白(在本文中称为“Mac蛋白”-NCBI GENEID：13287905)响应于光并且源自斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans)，其中当用520nm至560nm的光照射细胞时，Mac质子泵蛋白质能够将质子泵送穿过细胞的膜。Mac蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性和/或增强或降低Mac蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，Mac蛋白可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的Mac蛋白适当地保留了响应于光而将质子泵送穿过可兴奋细胞(例如，神经元)的质膜的能力。在一些情况下，合适的Mac蛋白包含与图7R中描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，合适的光响应性氯泵蛋白来源于盐碱古菌(Natronomonaspharaonis)；这种蛋白质在本文中被称为“NpHR蛋白”或“NpHR多肽”。在一些实施方案中，NpHR(NCBI GENE ID：3702828)蛋白可响应于琥珀光以及红光并且当用琥珀光或红光照射NpHR蛋白时，其可介导可兴奋细胞(例如，神经元)中的超极化电流。可激活NpHR蛋白质的光的波长可在约580nm与630nm之间。在一些实施方案中，光可以在约589nm的波长处，或者光可具有大于约630nm的波长(例如，小于约740nm)。在另一个实施方案中，光具有约630nm的波长。在一些实施方案中，当暴露于连续光脉冲时，NpHR蛋白可使神经膜超极化至少约90分钟。另外，NpHR蛋白可包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的敏感性，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低NpHR蛋白调节细胞质膜的极化状态的能力。在一些实施方案中，NpHR蛋白包含一个或多个保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，NpHR蛋白包含一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的NpHR蛋白适当地保留了响应于光而使可兴奋细胞的质膜超极化的能力。在一些情况下，合适的NpHR蛋白包含与图7S中所描绘的氨基酸序列(SEQID NO:47)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
涉及光响应性氯泵蛋白的进一步公开内容可见于美国专利申请公开第2009/0093403号和第2010/0145418号以及国际专利申请第PCT/US2011/028893号，所述每一个美国专利申请公开或国际专利申请的公开内容在此通过引用整体并入。
在一些实施方案中，合适的光响应性离子通道蛋白是例如源自盐生杜氏藻(Dunaliella salina)的DsChR蛋白(Genbank登录号：AEY68833)，其中当用光照射细胞时，所述离子通道蛋白能够介导细胞中的超极化电流。光可具有约470nm至约510nm的波长或可具有约490nm的波长。DsChR蛋白可额外地包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入，以增强或降低对光的灵敏度，增强或降低对特定波长的光的敏感性，和/或增强或降低DsChR蛋白质调节细胞质膜的极化状态的能力。另外，DsChR蛋白可以包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或一个或多个非保守性氨基酸取代。包含引入至天然氨基酸序列中的取代、缺失和/或插入的DsChR蛋白适当地保留了响应于光而将离子转运穿过可兴奋细胞(例如，神经元)的质膜的能力。在一些情况下，合适的DsChR蛋白包含与图7T中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，光响应性蛋白质是包含Arch-TS-p2A-ASIC 2a-TS-EYFP-ER-2的嵌合蛋白(Champ)。本公开的Champ蛋白包含Arch结构域和酸敏感离子通道(ASIC)-2a结构域。Champ的光激活激活质子泵(Arch结构域)，其激活ASIC-2a质子激活的阳离子通道(ASIC-2a结构域)。在一些情况下，合适的Champ蛋白包含与图7U中所描绘的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，超极化光响应性离子通道基于去极化光响应性离子通道，如在例如PCT申请第PCT/US2015/23087号(其通过引用并入本文)中所述的。在一些实施方案中，光响应性阴离子通道多肽基于C1C2蛋白质(Genbank登录号：AHA49646)。在一些实施方案中，合适的超极化光响应性多肽基于蛋白质ChR2(Genbank登录号：AER29835)的氨基酸序列。在一些实施方案中，合适的超极化光响应性多肽基于蛋白质C1V1(Genbank登录号：ALE28924)的氨基酸序列。
指示剂染料的使用
在一些情况下，修饰靶细胞以使其在其细胞膜中表达本公开的变体光响应性多肽；其中经修饰的靶细胞包含指示剂染料。指示剂染料可用于检测细胞内钙离子浓度的变化、细胞内钠离子浓度的变化等。
在一些情况下，指示剂染料是荧光染料。在此类情况下，目标荧光染料包括荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、异硫氰酸四亚甲基罗丹明(TRITC)、磺酰罗丹明101酰氯(Texas )、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白、藻红蛋白-Texas (PETR)、4-甲基伞形酮等。
在一些情况下，指示剂染料是钙指示剂染料。合适的钙指示剂染料包括例如Indo-1、Fura-2和Fluo-3、Calcium Fluo-4等
在一些情况下，指示剂染料是钠指示剂染料。合适的钠指示剂染料包括例如钠结合苯并呋喃间苯二甲酸酯(SBFI)、Sodium GreenTM、CoroNaTM Green、CoroNaTM Red等)；和质子指示剂染料(2',7'-双-(羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素(BCECF)等。
诱导记忆提取的方法
本公开提供了在哺乳动物受试者中诱导情境记忆提取的方法，所述方法包括将具有600nm至700nm的波长的光递送至哺乳动物受试者中神经元的单突触前额叶向海马的投射，其中所述投射包含本公开的变体光响应性多肽，并且其中将光递送至投射使投射去极化并诱导情境记忆提取。在一些情况下，前额叶向海马的投射是前额叶向海马的投射。在一些情况下，前额叶至海马的投射是前扣带向海马的投射。在一些情况下，投射是朝向海马的锥体CA3/CA1细胞。在一些情况下，前扣带的神经元包含变体光响应性多肽。
装置
本公开提供了可用于实施主题方法(调节靶细胞活动的方法；治疗方法)的方面的系统和装置。在一些情况下，本公开的系统包括如上所述的本公开的变体光活化多肽以及用于将具有激活波长的光递送至靶组织或细胞的一个或多个装置。可用于实施本公开的方法的装置包括可用于将包含编码本公开的变体光活化多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)递送至靶细胞和组织的递送装置；可用于将本公开的变体光活化多肽递送至靶细胞和组织的递送装置；可用于照射表达本公开的变体光活化多肽的靶细胞的光产生装置；和可用于控制光至特定靶细胞或组织的递送的控制装置。下文进一步描述这些组件中的每一个。
递送装置
本公开的方面包括可用于将本公开的变体光活化多肽或包含编码本公开的变体光活化多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)递送至靶细胞的递送装置。本公开的递送装置可向一个或多个靶细胞提供常规、非常规、程序化的或临床医师或患者激活的剂量的本公开的变体光活化多肽或包含编码本公开的变体光活化多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)，以确保靶细胞继续表达所述变体光活化多肽达所需的时间段。
主题递送装置通常可包括各种组件，诸如储库、泵、致动器、管道组件、针、导管以及用于将主题药物组合物递送至患者的靶细胞或组织的任何其它合适的组件。递送装置还可包括便于计算机化操作的组件，诸如电源、包括存储器的处理器、用户输入装置和/或图形用户界面。在一些实施方案中，递送装置可以完全或部分植入患者体内。在一些实施方案中，递送装置可由护理人员操作，其中将所述装置引入至患者体内的一部分中，例如引入至患者的脑中，并且将主题药物组合物递送至靶组织，例如患者大脑的一部分。在一些实施方案中，在递送药物组合物后，可以移除该装置。在其它实施方案中，可将装置保持在适当位置以用于稍后递送另外的药物组合物。
光产生装置
本公开的方面包括可用于将光递送至表达本公开的变体光活化多肽的靶细胞的光产生装置。术语“光产生装置”、“光学照射器”和“光照射器”在本文中可互换使用。根据本公开的实施方案的光产生装置通常可从所述装置上的一个或多个光源产生各种不同波长的光。在一些实施方案中，光产生装置可包括可放置在表达本公开的变体光活化多肽的靶细胞周围或附近的光套或套管。在一些情况下，一部分光源或整个光源是植入式的。主题光产生装置可具有用于刺激本文公开的光活化蛋白的任何有用构造。在一些实施方案中，例如，光产生装置(即，光学照射器)可包括促进靶细胞或组织的专用照明的组件。例如，在一些实施方案中，光产生装置可专门将光引导至靶细胞、靶细胞的一部分(诸如，神经细胞的特定轴突)或特定解剖结构(诸如，一束神经纤维、一种靶组织或一部分脊髓)。“专用直接光”意指光产生装置仅将光递送至特定靶结构，而不照射其它结构。例如，在一些实施方案中，光产生装置可被配置来照射神经细胞的轴突，但不照射神经细胞的任何其它部分。这样，来自光产生装置的光仅影响被照射的特定靶结构中的光活化蛋白。
本公开的方面包括光递送装置(即，光学照射器)，其包括一个或多个光源，所述光源被配置来将一个或多个二维和/或三维模式的光递送至一个或多个靶位置，包括但不限于靶组织和/或解剖结构的一个或多个部分(例如，多个层)。在某些实施方案中，光递送装置可包括多个光源(例如，多个激光光源、发光二极管(LED)等)以及任何合适数量的光导，所述光导被配置来以期望的方式弯曲光或为光塑形。在美国专利第8,545,543号(其公开内容在此通过引用整体并入)中提供了光递送装置的实例。
在一些实施方案中，光产生装置(即，光学照射器)可以不完全包围含有表达光活化蛋白的靶细胞的区域，而是可以具有U形。在一些情况下，光产生装置可具有可用于将光产生装置引导至特定区域或靶结构(例如特定神经元区域)的附接臂。附接臂可在植入光产生装置之后移除，或者可以留在原位以将光产生装置的位置固定在目标靶细胞附近。
在一些情况下，主题光产生装置可包含内部主体，内部主体具有至少一个产生光的装置，该装置与电源连接。在一些实施方案中，电源可以是为光产生装置供电的内置电池。在另一个实施方案中，植入式光产生装置可包括用于接收来自外源的无线传输的电磁能的外部天线，来为所述装置供电。无线传输的电磁能可以是无线电波、微波或可从外源传输以为光产生装置供电的任何其它电磁能源。在一个实施方案中，光产生装置由例如使用半导体或本领域熟知的其它方法制成的集成电路控制。
在一些方面，光产生装置包含发光二极管(LED)。在一些实施方案中，LED可产生蓝光和/或绿光。在其它实施方案中，LED可产生琥珀光和/或黄光。在一些实施方案中，若干微LED被嵌入到光产生装置的内部主体中。在其它情况下，光产生装置为固态激光二极管或任何其它能够产生光的装置。光产生装置可产生具有足以激活本公开的变体光活化多肽的波长和强度的光。在一些情况下，光产生装置产生具有以下任一种强度的光：约0.05mW/mm2、0.1mW/mm2、0.2mW/mm2、0.3mW/mm2、0.4mW/mm2、0.5mW/mm2、约0.6mW/mm2、约0.7mW/mm2、约0.8mW/mm2、约0.9mW/mm2、约1.0mW/mm2、约1.1mW/mm2、约1.2mW/mm2、约1.3mW/mm2、约1.4mW/mm2、约1.5mW/mm2、约1.6mW/mm2、约1.7mW/mm2、约1.8mW/mm2、约1.9mW/mm2、约2.0mW/mm2、约2.1mW/mm2、约2.2mW/mm2、约2.3mW/mm2、约2.4mW/mm2、约2.5mW/mm2、约3mW/mm2、约3.5mW/mm2、约4mW/mm2、约4.5mW/mm2、约5mW/mm2、约5.5mW/mm2、约6mW/mm2、约7mW/mm2、约8mW/mm2、约9mW/mm2或约10mW/mm2，包括端值，包括这些数字之间的值。在一些实施方案中，光产生装置产生频率为至少约5Hz，诸如高达约20Hz，至少约10Hz，诸如高达约25Hz，诸如高达约50Hz，诸如高达约75Hz，诸如高达约100Hz的光。
主题光产生装置通常能够产生具有在以下范围内的波长的光：约350nm至高达约360nm、高达约370nm、高达约380nm、高达约390nm、高达约400nm、高达约410nm、高达约420nm、高达约430nm、高达约440nm、高达约450nm、高达约460nm、高达约470nm、高达约475nm、高达约480nm、高达约490nm、高达约500nm、高达约510nm、高达约520nm、高达约530nm、高达约540nm、高达约550nm、高达约560nm、高达约570nm、高达约580nm、高达约590nm、高达约600nm、高达约610nm、高达约620nm、高达约630nm、高达约635nm、高达约640nm、高达约650nm、高达约660nm、高达约670nm、高达约680nm、高达约690nm、高达约700nm、高达约710nm、高达约720nm、高达约730nm、高达约740nm和/或高达约750nm。本公开的主题光产生装置能够产生具有足以激活主题光活化蛋白的波长的光。此类光产生装置能够产生具有在约550nm至约650nm、约600nm至约700nm、约650nm至约750nm范围内的波长的光。
在一些实施方案中，光产生装置可产生具有在约600nm至约775nm的范围内的波长的红光。例如，光产生装置可产生具有在约600nm至约650nm、约625nm至约675nm、约650nm至约700nm、约675nm至约725nm、700nm至约750nm、约725nm至约775nm、约600nm至约700nm的范围内的波长的红光。
在一些实施方案中，合适的光产生装置可包括一个或多个光纤，其可传输来自光源的光并且将该光传递至靶结构。光纤可包括塑料或玻璃材料，并且在一些实施方案中可以适当地为柔性的，以便于将光产生装置放置在不能被刚性结构容纳的位置中。例如，在一些实施方案中，光产生装置可包括产生光的光源以及可以放置在患者身体上或患者身体内的不同位置中的一个或多个光纤。来自光源的光可以通过光纤，环绕通过光纤中的拐角和弯曲部分，并且在光纤的末端出现以将光递送至靶结构。
在一些实施方案中，本发明的光产生装置可包括多个光源，其可用于用不同波长的光照射靶组织。例如，在一些实施方案中，光产生装置可包括产生具有第一波长的光(例如，红光)的第一光源和产生具有第二波长的光(例如，蓝光)的第二光源。此类光产生装置可用于利用两种波长的光同时照射同一靶组织，或者可用第一波长的光和第二波长的光交替地照射靶组织。在一些实施方案中，此类光产生装置可用于将来自同一光源的光递送至不同的靶组织。例如，在一些实施方案中，光产生装置可将第一波长的光递送至第一靶组织，并且可将第二波长的光递送至不同的靶组织。
合适的光产生装置可包括被配置来将光递送至靶区域的植入式光学照射器，以及被配置来产生具有特定强度和波长的光的可操作地耦合的光源。
控制装置
本公开的方面包括控制器、处理器(例如，计算机)和计算机可读介质，其被配置来或适用于控制或操作主题系统的一个或多个组件。在一些实施方案中，系统包括控制器，其与系统的一个或多个组件通讯(如本文中所述)，并且被配置来控制系统的方面和/或执行主题系统的一个或多个操作或功能。在一些实施方案中，系统包括处理器和计算机可读介质，其可包括内存介质和/或存储介质。在计算机可读存储器上体现为计算机可读指令的应用程序和/或操作系统可由处理器执行以提供本文所述的功能中的一些或全部。
在一些实施方案中，系统包括用户界面，诸如图形用户界面(GUI)，其适于或被配置来从用户接收输入，并执行如本文所述的方法中的一个或多个。在一些实施方案中，GUI被配置来向用户显示数据或信息。
本公开的方面包括能够控制或调制从主题光产生装置发射的光量的控制装置。在一些实施方案中，控制装置可被配置来调制从光产生装置递送至靶组织的光的波长和/或强度。在一些实施方案中，控制装置可被配置来调制从光产生装置递送至靶组织的光的频率和/或持续时间。例如，在一些实施方案中，控制装置可被配置来将来自光产生装置的光脉冲递送至靶组织。控制装置可根据用户输入等调制光脉冲的频率和/或持续时间，使得靶组织被来自光产生装置的光例如以规律或无规律的频率照射。在一些实施方案中，控制装置可从光产生装置产生光脉冲，其具有在约1毫秒或更少至高达约1秒、高达约10秒、高达约20秒、高达约30秒、高达约40秒、高达约50秒、高达约60秒或更多的范围内的持续时间。在一些实施方案中，控制装置可从光产生装置产生具有每毫秒1个脉冲至每秒约1个脉冲、至每分钟约1个脉冲、至每10分钟约1个脉冲、至每20分钟约1个脉冲、至每30分钟约1个脉冲的频率的光脉冲。
在一些实施方案中，主题控制装置可包括可被安装到发射线圈的电源。在一些实施方案中，电池可被连接到电源以向其供电。开关可被连接到电源，从而允许操作人员(例如，患者或护理人员)手动启动或停用电源。在一些实施方案中，在开关被启动时，电源可通过控制装置上的发射线圈与植入式光产生装置的外部天线(诸如光套或套管)之间的电磁耦合向光产生装置供电。发射线圈可在其附近与植入式光产生装置的外部天线建立电磁耦合，以用于向光产生装置供电并用于将一个或多个控制信号发射到光产生装置。在一些实施方案中，控制装置的发射线圈与植入式光产生装置的外部天线之间的电磁耦合可以是射频磁电感耦合。当使用射频磁电感耦合时，无线电波的操作频率可介于约1MHz与20MHz之间，包括端值，包括这些数字之间的任何值(例如，约1MHz、约2MHz、约3MHz、约4MHz、约5MHz、约6MHz、约7MHz、约8MHz、约9MHz、约10MHz、约11MHz、约12MHz、约13MHz、约14MHz、约15MHz、约16MHz、约17MHz、约18MHz、约19MHz或约20MHz)。然而，可以使用其它耦合技术，诸如光学接收器、红外线或生物医学遥测系统(参见，例如，Kiourti,"Biomedical Telemetry:Communication between Implanted Devices and the External World,Opticon1826,(8):Spring,2010)。
系统
本公开的系统是光学刺激系统，其包括递送装置、光产生装置、控制装置。在一些情况下，主题系统包含容器，所述容器包含本公开的核酸或重组表达载体(其中所述核酸或重组表达载体包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列)、植入式光学照射器、可操作地耦合至植入式光学照射器的光源、控制器(即，控制装置)、电源和植入式照度传感器。在一些情况下，主题系统包括包含本公开的变体光响应性多肽的容器、植入式光学照射器、可操作地耦合至植入式光学照射器的光源、控制器(即，控制装置)、电源和植入式照度传感器。在一些情况下，植入式光学照射器被配置来在于邻近靶组织结构的位置植入后将光递送至靶组织结构。主题系统的控制器使得电源允许电流流至光源，以至少部分地基于来自植入式照度传感器的输出信号来向植入式光致动器发射光子。
在一些实施方案中，本公开的系统包括植入式照度传感器，所述植入式照度传感器被定位而使得其捕获至少一部分由植入式光照射器引导朝向靶组织结构的光子。该系统还可包括被配置来产生输出信号的植入式输入传感器，所述输出信号在所述光子与所述靶组织结构交汇之前在光子发射位置处与所述植入式光学照射器的照度相关。控制器(即，控制装置)可以可操作地耦合至植入式输入传感器，使得其可以比较来自植入式输入传感器与植入式照度传感器两者的输出信号，以确定是否正在经历意外的损失。控制器可被配置来对超过预定阈值损失水平的损失水平做出反应。控制器可被配置来通过在由控制器维护的软件日志文件中标记损失水平超过预定水平的事件来作出反应。控制器可被配置来停止使电源允许电流流向光源。
本公开的系统的植入式照度传感器和输入传感器可以是光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管或光电传感器。
该系统还可包括被配置来产生输出信号的生理传感器，所述输出信号与被认为至少部分响应于向靶组织结构的光输入而可变的生理参数相关。生理传感器可以是例如肌电图传感器、神经电图传感器、脑电图传感器、心电图传感器、压力传感器、温度传感器、化学计量传感器、运动传感器、加速度计、陀螺仪、应变传感器、阻抗传感器或电容传感器。
本公开的系统的控制器可被配置来对超过某个预定阈值的生理传感器的输出做出反应。控制器可被配置来通过在由控制器维护的软件日志文件中标记损失水平超过预定水平的事件来作出反应。控制器可被配置来停止使电源允许电流流向光源。
现在转到图8，描绘了光学刺激系统100的第一实例。光学刺激系统100包括递送装置101，用于将本公开的变体光响应性多肽或包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸或重组表达载体递送至靶组织，例如患者的脑组织107。还提供了光产生装置102、控制装置103以及用于将由光产生装置102生成的光传送到位于光套106上的光阵列105的光纤104。
现在转到图9，描绘了光学刺激系统110的第二实例。光学刺激系统110包括导管112，用于将本公开的变体光响应性多肽或包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸或重组表达载体递送至靶组织，例如患者的脑组织107。还提供了光产生装置102、控制装置103和用于将由光产生装置102产生的光传送至光纤104的端部的光纤104。
现在转向图10，描绘了光学刺激系统120的第三实例。光学刺激系统120包括光产生装置102、控制装置103和用于将由光产生装置102产生的光沿着患者的脊髓121传送至各个位置的光纤104。
效用
用于调节靶细胞活动的本公开的方法在各种研究、诊断、成像和治疗应用中是有用的。主题方法通常涉及将本公开的变体光活化多肽或包含编码本公开的变体光活化多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)引入靶细胞中，使得靶细胞表达光活化阳离子通道蛋白并将其插入膜中；并用具有激活波长的光照射靶细胞。用具有激活波长的光照射靶细胞使得光活化阳离子通道蛋白允许一个或多个阳离子穿过所述靶细胞的质膜。阳离子穿过靶细胞的质膜具有期望的效果，诸如例如调节质膜的膜电位。在一些实施方案中，阳离子种类穿过质膜可用于调节患者的一种或多种神经反应或过程，并因此可用于治疗患者的疾病或病状。这样，在一些实施方案中，主题方法涉及治疗患者的病状，诸如神经病状。在一些实施方案中，主题方法涉及使用本文提供的系统和装置治疗患者的病状，诸如神经病状。
通过使用主题方法，本领域普通技术人员将能够进行可兴奋细胞(例如，神经元)活动的体内记录和成像。在一些实施方案中，对于每个神经元，可以以30Hz或更高的频率对100个或更多个神经元基本上同时进行体内钙成像。
主题方法也可用于分析或绘制靶组织(诸如脑)中神经元的连通性。例如，主题方法可用于测量靶组织块中多个神经元响应于刺激(响应于正在分析的靶组织的局部区域中的一个或多个神经元，或响应于位于测量部位远端的部位)的个体活动。刺激可以是感觉刺激、通过电极的电刺激或光学刺激。通过观察测量的神经元响应于各种刺激和其它操作的活动模式，可以推断靶组织的观察区域中的神经元的连通性。
在一些实施方案中，用于通过主题方法测量或刺激的靶向的神经元区域包括任何新皮层区域。在适当的组织暴露下，合适的靶神经区域通常包括：下丘脑、内嗅区和海马形成皮层、乳头体、隔膜、终纹床核、背侧和腹侧纹状体、丘脑、杏仁核、伏隔、脑干和皮质下结构。靶位置可以包括：细胞、细胞的一部分、多个细胞、一束神经纤维、神经肌肉接点、中枢神经系统(CNS)组织、周围神经系统(PNS)组织、肌肉或心脏组织或解剖区域。
涉及动作电位的疾病或病状的建模
在一些实施方案中，主题方法可用于对受试者中的某些疾病或病状进行研究和/或建模，诸如涉及细胞内增加的动作电位形成和/或动作电位形成的不适当促进或由此引起的病状。例如，主题方法可用于特异性增加靶细胞(诸如，特定靶神经细胞)中动作电位的形成，以研究促进动作电位形成在那些细胞中的作用。在一些实施方案中，主题方法可用于选择性增加靶细胞的某些部分(诸如靶神经细胞的轴突)中动作电位的形成，以研究促进动作电位形成在靶细胞的选定部分中的作用。此类方法可用作其中动作电位在靶细胞或其部分中以异常高的频率发放，或者其中在靶细胞或其部分中错误地形成动作电位的疾病或病状的模型。
在一些实施方案中，主题方法可用于疾病或病状的动物模型(包括但不限于转基因动物模型)，所述疾病或病状与靶细胞或其部分内的动作电位的异常形成相关，或与靶细胞或其部分内增加的动作电位形成相关。例如，在一些实施方案中，可将动物的靶细胞(诸如神经细胞，例如啮齿类动物的脑细胞)与编码主题工程化光活化阳离子通道蛋白的核酸接触，使得阳离子通道蛋白由靶细胞表达。然后，利用具有激活波长的光照射靶细胞以促进靶细胞中动作电位的形成。然后可检查靶细胞或其部分内的动作电位形成的促进对动物的作用。过表达一种或多种基因产物的转基因动物的使用或不能表达一种或多种基因产物的“敲除”转基因动物的使用，可用于研究特定基因产物在于靶细胞中形成动作电位中的作用。
筛选方法
在一些实施方案中，可使用主题方法，例如用于筛选可有效治疗涉及靶细胞中动作电位的形成或靶细胞中增加的动作电位形成的疾病或病状的化合物。在一些实施方案中，筛选方法涉及体外培养细胞，其中培养的细胞包含本公开的变体光活化多肽。将表达本公开的变体光活化多肽的培养细胞与测试化合物接触；然后将细胞暴露于具有激活波长的光下以促进细胞或其部分内动作电位的形成。在促进动作电位形成的同时，所述测试化合物从细胞诱发期望的效应或反应的能力可用于治疗特定疾病或病状。
在一些实施方案中，主题方法可用于在体内非人动物模型中筛选用于神经精神疾病的诊断或病因性的神经元回路元件。例如，可修饰非人动物以在一个或多个神经元细胞、在特定神经元组织等中表达本公开的变体光响应性多肽。目标神经精神疾病可包括情绪和情感的病症、焦虑症、精神病、人格等。动物模型可以是任何合适的模型，包括但不限于啮齿类动物、猫、狗、猴子和非人灵长类动物。用于对神经精神疾病建模的扰动包括神经或精神疾病诸如自闭症的遗传模型；慢性诱导的模型，如红藻氨酸盐或毛果芸香碱诱导的癫痫或慢性应激诱导的抑郁症；和急性诱导的模型，如用致幻剂或致精神病剂诸如氯胺酮或苯环利定(PCP)诱导的。通过比较正常靶组织中的神经元与异常靶组织中的神经元之间的活动模式的差异，可以鉴定神经精神障碍的神经相关性。靶组织中神经元的光学控制因此可允许鉴定特定神经精神障碍的病因性神经元活动模式。这些操作可潜在地提供新颖的治疗靶标。
在一些实施方案中，主题方法用于鉴定对一组神经元具有期望活性的治疗(例如，治疗性治疗)的方法中。如果期望的结果是已知的，则本系统和方法可用于筛选治疗，包括但不限于药理学试剂、基于非化学试剂的治疗性治疗；行为治疗；基于电、磁或光学的神经调制治疗等，这将带来所需的神经元活动模式。筛选可以在任何合适的动物模型中进行，所述动物模型是正常的，或是神经病症的模型，诸如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)和帕金森病(Parkinson's disease)、轻度认知障碍、其它痴呆和唐氏综合症(Down'sSyndrome)，以及精神分裂症、自闭症、情绪、情感、焦虑和人格/发育障碍。
治疗方法
在一些情况下，主题方法涉及体内调节靶细胞的活动。在一些情况下，将包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)引入至靶细胞中，其中在靶细胞中产生编码的变体光响应性多肽；并且通过暴露于具有激活波长的光来激活变体光响应性多肽。在一些情况下，向有需要的个体施用包含编码本公开的变体光响应性多肽的核苷酸序列的核酸(或重组表达载体)，使得所述变体光响应性多肽在靶细胞中产生(例如，使得变体光响应性多肽存在于靶细胞的质膜上)，从而允许靶细胞的活动被具有激活波长的光调制。在一些情况下，将本公开的变体光响应性多肽施用于有此需要的个体，使得变体光响应性多肽被引入至靶细胞中(例如，使得变体光响应性多肽存在于靶细胞的质膜上)，从而允许靶细胞的活动被具有激活波长的光调制。一旦本公开的变体光响应性多肽存在于个体中的靶细胞的质膜中，则将靶细胞暴露于具有激活波长的光，从而使靶细胞去极化。
在一些实施方案中，主题方法用于通过光遗传学调节患者体内靶细胞的动作电位来治疗患者的病状或病症，诸如神经病状或病症。在一些实施方案中，主题方法涉及将本公开的变体光响应性多肽引入患者体内的靶组织。在一些实施方案中，使用受试者递送装置完成将本公开的变体光响应性多肽引入至靶组织中。将编码本公开的变体光响应性多肽的多核苷酸(例如，重组表达载体)引入至靶组织中，并且所述变体光响应性多肽由靶组织中的靶细胞(例如，神经细胞)表达并被插入至靶细胞的质膜中。
然后，将光产生装置定位，以当光产生装置被激活时用具有激活波长的光照射靶组织。激发(通过患者或护理人员(例如，医护人员))光产生装置以将光递送至靶组织以使本公开的变体光响应性多肽允许阳离子(例如，钠阳离子)穿过质膜并使质膜去极化，从而促进靶组织的细胞内的动作电位形成。
这样，细胞内动作电位的形成在光脉冲效应和所造成的质膜去极化的持续时间内增加。因此，通过将本公开的变体光响应性多肽引入神经细胞中并用来自光产生装置的具有激活波长的光照射神经细胞，可将主题方法用于促进神经细胞中动作电位的形成。由于可调整动作电位增加的持续时间以超过光脉冲的持续时间，所以可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现动作电位形成的增加。
在一些情况下，本公开的方法包括通过促进靶组织中动作电位的形成来治疗受试者的病症。因此，在一些情况下，主题方法涉及通过将本公开的变体光响应性多肽引入靶细胞来治疗受试者。将编码这些蛋白质的多核苷酸引入至靶细胞中，并且所述蛋白质由所述靶细胞表达并被插入到靶细胞的质膜中。然后，利用来自光产生装置的具有激活波长的光照射靶细胞，以使光活化阳离子通道蛋白质允许阳离子(例如，钠阳离子)从细胞外部流过质膜流至细胞内部。
一旦进入细胞内，阳离子使膜去极化以促进动作电位的形成。膜的去极化促进动作电位的形成，从而允许细胞例如在周围细胞(例如，相邻神经细胞)中产生动作电位；介导神经递质、调节剂或激素的释放；介导肌肉收缩等，直至膜去极化的效应消失。因此，主题方法可用于通过促进靶细胞内动作电位的形成来治疗受试者的病症。由于可调整膜去极化的持续时间以超过光脉冲的持续时间，因此可使用脉冲光递送而非连续光递送来实现动作电位形成的促进。
本公开的治疗方法可用于治疗任何疾病或病状，在靶细胞中或沿着靶细胞的特定部分促进或增加动作电位的形成将对患者具有治疗效果。主题方法的治疗应用的实例包括但不限于神经病症诸如阿尔茨海默病和帕金森病、轻度认知障碍、其它痴呆和唐氏综合症，以及精神分裂症、自闭症、情绪障碍、情感障碍、焦虑症和人格/发育障碍等。可如上通过促进轴突分枝(axonal arborization)或细胞的特定子域或部分的动作电位形成获得特异性。
在一些实施方案中，主题方法可用于使用光遗传学控制(闭环控制)治疗病状或病症，诸如神经或精神病状。当使用主题方法监测神经元的实时活动时，控制器可被配置来响应于成像的活动信号，以例如在行为和/或生理水平上治疗或减轻病状或病症的症状的方式调节神经元的活动。
实施例
提供下列实施例为本领域普通技术人员提供如何产生和使用本发明的完整公开内容和说明，并且无意限制本发明者视为它们的发明的范围，它们也无意表示下面的实验是全部实验或所实施的唯一实验。已努力确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当解释一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则部分是按重量计的部分，分子量是重均分子量，温度以摄氏度表示，压力是大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内(地)；i.p.，腹膜内(地)；s.c.，皮下(地)；等等。
实施例1：bReach-ES的表征
图1A-1K描绘ReaChR和bReach-ES的特性。图1A显示ReaChR和bReach-ES的原理图设计。两种构建体均为通道视紫红质1(ChR1)、Volvox通道视紫红质1和2(VChR1、VChR2)的杂交体。箭头描绘每个区段中的潜在通道视紫红质，分别对最后一个氨基酸(aa)进行了编号。ReaChR含有额外的突变Leu171Ile。在bReach-ES中，ReachR的前51个n-末端残基被来自通道视紫红质-2(ChR2)的前11个n-末端残基替代，并且最后5个c-末端残基被完全截短。另外，bReach-ES含有突变Glu123Ser和Leu171Ile。图1B显示在来自大鼠海马的培养的神经元中在0.65mW/mm2下，在400nm与650nm之间的波长下测量的C1V1-TT、bReach-ES和ChR2的光谱(每个n＝6)。图1C显示了在575nm(左：C1V1-TT＝630pA,s.e.m.＝109,ReaChR＝963pA,s.e.m.＝113,bReaChR＝1365pA,s.e.m.＝128)和632nm(右：C1V1-TT＝315pA,s.e.m.＝111,ReaChR＝1003pA,s.e.m.＝95,bReaChR＝841pA,s.e.m.＝102)下的稳态光电流。分别在-80mV和5mW/mm2的光强度下在培养的大鼠海马神经元中测量电流幅度。图1D显示描绘为单指数闭合动力学的τ值的通道闭合的速度(C1V1-TT＝79ms,s.e.m.＝3.7,ReaChR＝682ms,s.e.m.＝86,bReaChR＝49ms,s.e.m.＝4.4)。P<0.0005。误差条代表平均值的标准误差(s.e.m.)。C1V1-TT:n＝26,ReaChR:n＝6,bReaCh-ES:n＝25。图1E显示用633nm光脉冲(5ms，5mW/mm2)激发的表达ReaChR和bReaCh-ES的培养的神经元的代表性电压迹线。ReaChR动力学是如此缓慢，以至于可靠的动作电位产生只在低频下才可能。bReaChR-ES的加速通道关闭允许可靠的棘波产生高达20Hz。
实施例2：
图2A显示在内侧前额叶皮质中的注射部位附近的细胞体中以及在杏仁核中的下游轴突纤维中的视蛋白表达的共焦图像。比例尺：100μm。图2B显示突触后细胞响应于表达C1V1-TT的突触前末梢的光脉冲刺激(条)的代表性电压和电流钳迹线。脉冲长度是5ms。光波长设定为575/25nm，光功率密度为5mW/mm2。
实施例3：
图3A描绘全细胞记录模式的示意图。图3B显示突触后细胞响应于表达bReaCh-ES的突触前末端的光脉冲刺激(条)的代表性电压和电流钳迹线。脉冲长度是5ms。图3C显示表达视蛋白的mPFC细胞中的稳态光电流的概括条形图(C1V1-TT:n＝11,bReaCh-ES:n＝10)。图3D显示表达视蛋白的mPFC细胞中的光诱发的棘波概率的概括条形图(C1V1-TT:n＝11,bReaCh-ES:n＝10)。图3E显示光诱发的EPSC幅度的概括条形图(C1V1-TT:n＝10,bReaCh-ES:n＝18)。图3F显示突触后细胞中的光诱发的棘波概率的概括条形图(C1V1-TT:n＝10,bReaCh-ES:n＝17)。光波长设定为575/25nm，光功率密度为5mW/mm2。数据表示为平均值±s.e.m，p<0.05。
实施例4：来自新皮质的投射介导记忆提取的自顶向下的控制
以下呈现的数据表明在小鼠中存在单突触前额叶(主要是前扣带)向海马(CA3/CA1)的投射，并且该投射的光遗传学操作(在此称为AC-CA)能够诱发情境记忆提取。
材料和方法
动物
将野生型C57B16/J雄性小鼠分组饲养(每笼子3至5只)并且在颠倒的12小时光/暗周期中保持，随意给予食物和水(除了在其中限制水分的虚拟现实行为实验中；在下文中详述)。实验方案获得斯坦福大学IACUC批准并符合美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用指南。每个实验中使用的受试者的目标数量基于公布的研究中报告的数字来确定。未使用统计方法来预先确定样本大小。
解剖追踪和组织学
病毒注射在斯坦福大学IACUC批准的方案下进行，并使用立体定位装置(KopfInstruments)在用1-2％异氟烷麻醉的小鼠中进行。对于逆行追踪，在UMP3注射泵(WPI)的控制下，利用1μl Hamilton注射器和35号斜口针头(World Precision Instruments)在背侧海马(A/P:-1.5mm；M/L:+1.75mm；D/V:-1.8mm)，用少量(200nl)高度浓缩的标记有tdTomato(RV-tdTomato)22的糖蛋白缺失型狂犬病毒(RV)缓慢(50nl/分钟)注射4-5周龄野生型雄性小鼠。注射后，使用Vetbond组织粘合剂(Fischer)将切口封闭，使小鼠恢复并将其圈养5天以允许表达，然后收集它们的脑用于组织学分析。在顺行追踪的情况下，用500nlAAV5-CaMKIIα::EYFP(滴度：2x 1012vg/ml)在背侧前扣带中注射(150nl/分钟)4-5周龄野生型雄性小鼠(A/P:+1；M/L:-0.35；D/V:+1.2)，并将小鼠圈养30天以允许在末端中表达，然后收集脑以用于组织学分析。
对于组织学分析，用冰冷的1x PBS经心脏灌注经注射的小鼠，然后立即灌注4％多聚甲醛(PFA)。将脑在PFA中固定过夜，然后转移至30％蔗糖/磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中。收集使用冷冻切片机(Leica)制备的40μm(用于利用RV的逆行追踪)的冠状切片或使用振动切片机(Leica)制备的300μm(用于利用AAV5的顺行追踪)的冠状切片，并将其储存在冷冻保护剂溶液(25％甘油、30％乙二醇，于PBS中)中直至进一步处理。对于4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，将切片在PBS中洗涤，与DAPI以1:50,000孵育20分钟，再次于PBS中洗涤，然后用PVA-DABCO(Sigma)进行固定。使用扫描共焦显微镜(TCS SP5,Leica)和LAS AF软件(Leica)来获取和分析图像。
用于PFC-至-海马突触表征的急性切片电生理学
在用AAV5-CaMKIIα::ChR2(H134R)-EYFP病毒注射后6-8周从小鼠制备急性脑切片，以允许足够的时间来让通道视紫红质在轴突末端中表达。在致死性麻醉后，在断头前将小鼠用冷蔗糖切片溶液(参见下文)进行经心脏灌注，然后快速提取脑并浸入冰冷的基于蔗糖的切片溶液(234mM蔗糖、26mM NaHCO3、11mM葡萄糖、10mM MgSO4.7H2O、2.5KCl、1.25mMNaH2PO4.H2O、0.5mM CaCl2.2H2O)中。将冠状海马切片(300μm厚)在蔗糖溶液中于Leica振动切片机(Leica VT1000S)上进行切割，然后将其在33℃下浸没在高渗回收溶液(渗透压增加8％的人工脑脊液(ACSF))中15分钟，然后在33℃下转移至标准ACSF(123mM NaCl、26mMNaHCO3、11mM葡萄糖、3mM KCl、2mM CaCl2.2H2O、1.25mM NaH2PO4.H2O、1mM MgCl2.6H2O)中再进行45分钟，此时将它们转移至室温。
在立式Leica DM-LFSA显微镜上进行来自CA3/CA1海马神经元的全细胞膜片钳记录。将硼硅玻璃(Sutter Instruments)移液管电阻拉至3-6MΩ，并用葡萄糖酸钾细胞内溶液(130mM KGluconate、10mM KCl、10mM HEPES、10mM EGTA、2mM MgCl2，用KOH调节pH至7.3)进行填充。使用pClamp(Axon Instruments)进行电压和电流钳记录。排除漏电流大于-200pA或串联电阻大于35MΩ的电池。使用具有用于蓝光的外部滤波器(以nm表示的波长/以nm表示的带宽：470/20)的300W DG-4灯(Sutter Instruments,Novato,CA,USA)进行光刺激。将光脉冲(2-5ms脉冲宽度)以4-10mW/mm2的光功率密度递送通过40x,0.8NA水浸物镜。潜伏期测量为光脉冲开始至EPSC起始。
光遗传学和行为
如图14和图13中所述，在适当位置(例如扣带、海马或内侧隔核)注射所示病毒(例如，表达ChR2、eNpHR3.0或EYFP的CAV或RV)后，如先前所述36，在注射部位(通常为注射部位背部约0.2mm)或在末端将IFL(植入式光纤光导)植入4-5周龄野生型雄性小鼠以进行如所指示的刺激实验，所述IFL由直径为2.5mm的金属套圈和切割成所需长度的0.22NA和200μm厚的突出劈开的裸光纤(Thorlabs)组成。对于抑制实验，使用间隔0.7mm的具有200μm厚度和0.22NA的双光纤插管双侧靶向前扣带，并且将间隔3mm的双套圈插管用于双侧靶向海马。通常使小鼠恢复并圈养1个月，以使其在行为测试之前充分表达。使所有经历行为实验的动物适应颠倒的12小时光/暗周期，处理数天，并且在行为测试之前，使其在将要进行实验的房间适应至少30分钟。
恐惧条件化装置由方形条件化笼(18x18x30cm)组成，该条件化笼的网格地板通过电线连接到电击发生器和扰频器，该扰频器的周围是隔音室(Coulburn instruments,PA,USA)。该装置经过改进，使得能在提取测试期间实现光递送。通过将小鼠置于条件化笼中(视觉暗示：裸露的墙壁，触觉暗示：网格地板，气味暗示：70％乙醇)6分钟，同时接受四次7mA的2秒电击脉冲(每次间隔1分钟，在将小鼠置于条件化情境中后2分钟提供第一次电击)来进行情境恐惧条件化。同一组群的一小部分动物不进行恐惧条件化，而是用作对照组，仅将其暴露于条件化情境相同的时间量(6分钟)，但其不接受任何相关的电击。第二天，在不同的“中性”笼(视觉暗示：彩色形状，触觉暗示：光滑纸巾覆盖的有机玻璃地板，气味暗示：1％乙酸)中测试所有小鼠的光介导的恐惧提取。
对于刺激实验，通过在30秒亮灯/1分钟熄灯期中将光递送通过连接至473nm激光器的接插线来施用光纤连接器的光刺激。在亮灯期间，刺激以20Hz，15ms的脉冲递送，在纤维尖端具有8-10mW的功率。在第三天，然后将所有小鼠恢复到原始的条件化情境持续2.5分钟以评估完整的自然恐惧记忆提取。在一些情况下，通过将小鼠连续三天放置在原始条件化室中来进行恐惧记忆的随后消除，每次持续五分钟，没有电击。通过在最后一次消除训练期后24小时在中性情境中测试光诱导的恐惧提取。通过将动物再次放置回条件化情境中进行一次6分钟的时间间隔并提供四次7mA的2秒电击脉冲(每次间隔1分钟)来进行随后的重新安置。如上所述，24小时后进行最终的光诱导的恐惧提取测试。
对于功能丧失实验，通过将光递送通过连接至589nm激光器的双接插线来施用通过光纤连接器的光学抑制。在纤维尖端使用8-10mW的恒定光以在细胞体或末端处传递抑制。在第一天，eNpHR3.0和eYFP对照组都接受了如上所述的情境恐惧条件化训练，并且在第二天，在熄灯期间的前两分钟内照常让小鼠进行提取，以评估每只动物中的基线木僵行为。然后在接下来的30秒内(不能更长，因为消除相关的非木僵行为的可能性可与继典型的2-3分钟提取方案之后的时间点上的光相关的非木僵行为混淆)打亮灯。将30秒光时间期间的木僵评分与紧接的前一熄灯期的30秒期间的木僵行为百分比进行比较。在第三天，所有小鼠在条件化情境中经历提取(通过熄灯)，进行2分钟，以测试光诱导的行为的逆转。在情境条件化和提取后，所有小鼠随后经历听觉暗示条件化(暗示条件化与情境条件化分开进行，以确保对情境和暗示的稳健条件化，因为当一起进行时，小鼠常常对音调(更显著的暗示)产生稳健条件化并且只对情境产生弱条件化)。为了进行听觉暗示的FC，将小鼠放置在不同的情境中(具有彩色形状(作为视觉暗示)和光滑的地板)，持续6分钟，其中在前两分钟之后，以1分钟的间隔播放四次由2.9kHz音调组成的20秒听觉暗示，每次听觉暗示后接着进行2秒的7mA电击。在随后的天，通过以1分钟的间隔呈现音调四次(两次在熄灯期间以及两次在亮灯期间)进行提取，并且在20秒的音调后期间与在音调期间紧接的前20秒相比，针对熄灯和亮灯条件评估木僵行为百分比。使用相同的组群，将潜伏期测量作为单独的实验来进行；在完成情境和暗示的条件化后，这些小鼠被重新训练(情境恐惧条件化)至第一条件化情境。在第二天，在整个时间内在亮灯的条件化情境中进行2分钟提取，以测试木僵行为的潜伏期，其中将潜伏期定义为动物连续5秒不动的第一时间实例。所有实验中的木僵行为由不知晓治疗组的实验者评分。动物至实验组和对照组的随机化由实验者进行，没有使用明确的随机化算法。所有结果均通过学生氏t检验或双因素ANOVA来进行分析，然后根据情况进行事后检验。
海马颅窗
向C57BL/6J雄性小鼠注射500nL CA3中的AAVdj-CaMKIIα::GCaMP6m(A/P:-1.7,M/L:+1.9,D/V:-1.9)，并使其恢复至少1周，然后再将上述CA3手术植入颅窗，以进行类似于先前描述的海马制备物24的光接入。简言之，向小鼠腹膜内注射80mg/6mg/kg氯胺酮/甲苯噻嗪，并且在整个过程中维持在1.0-2.0％异氟醚。对于接入CA3的最佳窗口放置，使小鼠的头在手术期间成角度，使得CA3注射部位处的颅骨位置是水平的并且恰好垂直于头部的背侧视图。将圆形钛制头板(直径7mm)放置在CA3的中央，并用胶浆(Metabond；Parkell)粘附在颅骨上，并使用环钻(Fisher)在中心进行约3mm的穿颅术。对部分皮质区S1和部分顶叶联合皮层进行真空抽吸，小心避开脑室，直至海马上方可见白质。用27号钝针进行真空抽吸，同时用冷冻的1x PBS冲洗。通过用31号钝针进行真空抽吸进一步去除海马上方的白质顶层，但小心保存外囊和海马槽的深层(以保护至海马传入和传出)。使用镊子手动插入圆柱形硼硅玻璃植入物，直至植入物的底部靠在海马上。植入物由切割成1.5mm长的直径为3.0mm的玻璃毛细管(Friedrich&Dimmock)定制物构成，使用UV固化光学胶(Norland Products)将一端粘附至#0厚度的直径为3.0mm的盖玻片(Warner Instruments)上。然后使用Metabond胶浆将从开颅术挤出的植入物的顶部固定至头盖骨上。手术后，给小鼠皮下注射5mg/kg卡洛芬(carprofen)，并使其恢复至少1周，然后进行行为训练。
为了确保上述操作(包括GCaMP6m病毒注入CA3、GCaMP6m表达和皮层的某些区域的外科手术挖除)不影响海马的正常生理特性，进行对照实验以在体外评估弱表达CA3神经元对比强表达CA3神经元中的Ca2+依赖性生理学，体内评估弱表达CA3神经元对比强表达CA3神经元中的自发活动，以及放置套管之前和之后的行为测量(图16)。
虚拟现实行为
使用从先前报告的版本24,51改进的定制的虚拟现实环境。通过以下方式轴向固定直径为200mm的聚苯乙烯泡沫球(Graham Sweet Studios)：使用直径为6mm的装配杆(Thorlabs)穿过球的中心并且将每一端放置在90°柱支座(Thorlabs)上，允许球自由向前和向后转动。使用头板支架将小鼠头部固定在球的中心上方。虚拟环境是在游戏开发软件Unity3d(unity3d.com)中设计的。通过背投至于放置在小鼠中心前方约20cm的直径为14英寸的透明丙烯酸半球上方展开的投影屏幕织布上来显示虚拟环境。屏幕涵盖约220°的小鼠视野。使用两台激光扫描投影仪(Microvision)将虚拟环境背投至该屏幕上，每台投射仪覆盖屏幕的一半。为了在3d屏幕上创建平面图像，使用视频处理软件(Madmapper)对虚拟环境的2d图像进行了扭曲。游戏引擎允许使用JavaScript或C#编写的脚本通过TCP套接字与定制的Python控制软件进行通讯，基于小鼠与虚拟环境的交互触发外部事件。将LabJackU6(http://labjack.com)用于时间锁定虚拟环境事件和成像帧时间，以利用来自舔食测试器(lickometer)(Island Motion)的传入TTL脉冲记录小鼠的舔行为，并发送TTL脉冲以递送螺线管门控的水奖励(从附接至连接至舔食测试器的管道的重力辅助注射器递送)和厌恶的空气喷吹(从压缩空气罐至终止于面对小鼠鼻子的吸管尖端的管)。将触觉和气味暗示直接固定在代表两个单独情境的两个聚苯乙烯泡沫塑料球的每一个球上。听觉刺激通过置于动物后面的音箱呈现。使用与虚拟环境软件接口的光学计算机鼠标(Logitech)记录小鼠在球上的移动。
为了在虚拟环境中进行恐惧条件化，在球上，使小鼠受到水限制(>80％的剥夺前体重)并且习惯于处理、头部固定和虚拟环境至少2周，并且自由获得少量水奖励(约0.5μl/10次舔食)。在两周结束时(一次5分钟的一段时间/天)，小鼠在球上显得很舒适且很警觉。习惯后，小鼠经历了为期4天的恐惧条件化训练和测试方案。在第1天，将小鼠暴露于在视觉暗示(蓝色三角形对粉红色垂直条纹)、触觉暗示(固定至滚动球上的Velcro的光滑侧面对比Velcro的锋利侧面)、气味暗示(乙酸对比乙醇)和听觉暗示(8kHz阶段性音调对比3kHz纯音调)上不同的两种情境下，每次5分钟。在第二天，在恐惧情境下，在整个5分钟内，以随机的时间间隔向小鼠的鼻子提供8次厌恶的空气喷吹(500ms，10psi)，但在中性情境下不提供厌恶的空气喷吹，持续5分钟。在第3天和第30天，将小鼠放回两种情境中的每一种中，持续5分钟以进行提取。
成像
在暴露、训练和提取期间，在5分钟的一段时间中，在所有天中对5只小鼠进行成像。使用谐振电流计双光子显微镜(Prairie Technologies)。遗传编码的钙指示剂GCaMP6m用于所有实验中(通过聚合酶链式反应(PCR)从Addgene质粒#40754扩增GCaMP 6m，并将其在CaMKIIa启动子控制下亚克隆至AAV骨架中)。所有实验均使用调谐至920nm(以通过经几滴蒸馏水与植入的插管交接的20x 0.5LUMPlanFL/N(Olympus)水浸物镜激发GCaMP6m)的相干Ultra II Ti-蓝宝石脉冲激光器进行。使用PrairieView采集软件通过砷化镓磷化物(GaAsP)光电倍增管(PMT)检测荧光。通过将30Hz快速共振扫描(x-y)耦合至Z-压电以获得约6Hz/体积，来跨越约100μm(3-7z切片，彼此相隔约10-20μm)的深度，以512x 512像素(覆盖每个500μm x 500μm的x-y平面)在绿色通道(使用520/44带通滤波器，Semrock)中收集高速z叠堆。
数据分析
在下文中，提供了提取细胞(预处理)，获得细胞水平活动(dF/F)度量(处理)和评估群体水平活动度量(后处理)的方法。在对处理后的数据进行统计分析时，适当采用参数测试和非参数测试。在无法评估正常性(低样本容量)的情况下，确保没有显著的异常值(通过Grubbs'检验)，以及组间差异没有显著差异(通过Levene's检验)。
1.预处理(细胞提取)
时间序列数据集是使用刚体变换，利用ImageJ插件堆栈寄存器(ImageJ plug-inStack Reg)校正的x-y运动。然后依次进行细胞提取，首先自动计算细胞区段，然后对遗漏细胞、非细胞或结合在一起的细胞进行人工质量控制。对于初始自动提取，使用基于图像阈值强度、方差和偏度的度量。具有高对比度噪声比的图像(其中最大强度的清晰阈值分离细胞与背景)被前者完全分割。在其余情况下，基于跨时间的标准偏差(对于活动细胞为高)或跨时间的强度的偏度(不对称)，将细胞与背景区分开来。这导致了在每个体素位置(i,j,k)定义细胞掩模的一般数学标准：
M(i，j，k)＝αI(Fmax(i，j，k)＞Fc)+βI(σF(i，j，k)＞σc)+γI(sF(i，j，k)＞sc)
其中I是指标函数(如果条件满足，则＝1)；σF(i,j,k)是强度随时间变化的标准偏差，其被定义为：
并且偏度被定义为
E是期望算子；Fc，σc和sc分别代表图像强度、标准偏差和偏度的截止值。系数α，β和γ基于特定图像来选择；如果阈值是足够的，β和γ被选择为零，否则将系数迭代以获得包含最大活跃细胞群(通过检查评估的)的细胞掩模。
然后在进行自动细胞提取后，进行手动逐个细胞淘选(curation)以鉴定未使用自动算法提取的细胞。这可能是当由于原始成像中的非平移运动伪像和/或缺乏区分细胞与背景的明确的截止值Fc、σc和Sc而未捕获细胞边界时发生的。对于这些情况，通过手动编辑步骤进行细胞检测，包括将自动细胞掩模与原始图像数据进行比较，并且在编辑图像上应用高斯滤波器以使边缘平滑，并使用边缘检测定义细胞边界。使所得的细胞内部填满，并且侵蚀最终的细胞掩模以使来自神经毡信号的污染最小化。每个细胞都标有用于下一阶段的唯一细胞标识符；将自定义编写的MATLAB脚本用于所有步骤。
2.处理
dF/F的计算：
对于在步骤1中鉴定的每个细胞，强度值F是通过对ROI内的所有像素进行平均以计算每个帧(对应于单个时间点)的空间平均值而获得的。这些被用来在每个细胞中将dF/F定义为
其中是基线荧光(计算为给定细胞的荧光值的平均值)，在20秒移动时间窗内连续采集以解释荧光的缓慢时间尺度变化。考虑到数据集中神经元的稀疏发放，将平均值作为基线活动(荧光)的准确估计。此外，研究的主要结果不受使用中位数或第8百分位数作为基线的影响(并且相关性与基线定义无关)。
神经元响应的统计分析：
将类似于Dombeck等(2007)24中概述的方法的方法用于鉴定每个神经元中的重要瞬变，以及估计和消除可能与运动伪像相关的效应。简言之，为了估计信号中潜在的运动相关荧光变化的发生率，假设dF/F迹线中的所有负偏转都是由于运动引起的。因为运动相关的荧光变化应该同等可能地产生正向或负向变化，因此dF/F曲线中可归因于运动的正和负偏转应该以相同的频率发生，并且可以通过使用负向瞬变发生率作为运动相关的正向瞬变速率的估计来从信号中扣除掉。
为了确定统计上显著的瞬变，首先计算使用迭代方法对每个细胞的噪声的估计-(i)初始化分离信号和噪声的截止值，(ii)计算落在截止值下方的所有dF/F值的标准偏差(σ)，以及(iii)比较截止值的3σ。在本分析中，目的是找到噪声的标准偏差(σ)的估计值，定义为不太可能包含神经事件的时间段(即，使用迭代方法来估计噪声的σ，而不是计算包含真实事件的整个时刻的标准偏差)。对于分析的每个迭代，如果|截止值-3σ|<公差，则终止程序(其中公差＝0.02)。如果截止值>3σ，则程序将截止值增加10％并返回到步骤1。如果截止值<3σ，则将截止值减少10％并返回到步骤1。该方法有助于确保dF/F中的神经元活动产生的事件不包括在噪声估计中，并且避免了为了估计噪声而不包含事件的逐个细胞基础上地手动选择时间间隔的需要。
随后，分析正向和负向瞬变以进一步确定假阳性率。瞬变开始被定义为dF/F超过2σ时的时间，偏移被定义为给定瞬变低于0.5σ3时的时间。提取对于每个σ阈值(即>2σ，>3σ，>4σ)存在的瞬变数量针对不同持续时间的直方图，其中负向瞬变在纵坐标的左侧并被绘制成红色(图18C-图18F)。针对三个幅度水平(2σ、3σ、4σ)中的不同瞬变持续时间计算负向对正向瞬变的数量比例，并用作假阳性率的估计。根据上述推理，当基于运动的噪声明显超过信号时，该比例将为50％。绘制上述不同情况的假阳性率，选择将假阳性率降低至5％以下所需的幅度(σ)和持续时间截止值(图18C-图18F)。正如Dombeck等，2007中所提及的那样，重要的是要注意，这种噪声估计代表了一个上限，并且可能受到运动之外的其它噪声源(即光子散粒噪声)的影响。
神经元对之间的相关系数的计算：
将每对细胞a与b之间的皮尔逊相关系数计算为：
该度量测量两个细胞中的信号之间的线性相关性，并且在细胞信号的缩放或幅度平移方面是不变的。定义了大小为N细胞xN细胞的相关系数矩阵，其中每个条目对应于由对应的行和列标识的细胞之间的相关性。为了避免由于缓慢漂移(例如，GCaMP6m的长衰减曲线)导致的相关信号的累积，将位于显著瞬变(如上所定义的)的窗口之外的所有dF/F值设置为0。
3.后处理
细胞活动相关性的直方图：
通过查找皮尔逊相关系数高于0.3的相关神经元的数量(将为0.3的皮尔逊相关系数用作连通性的保守估计，因为使用体内双光子钙成像和随后配对全细胞记录的先前研究报道，当Ca2+信号的相关性在体内超过0.3时，连通性的可能性大于50％)来测试每个神经元中的高相关性(HC)的性质。通过以5为步幅对跨越神经元的该数字进行分箱(binning)并计算落入每个分箱的神经元数量来获得直方图，所得直方图表示网络中所有神经元的程度分布。HC神经元被定义为具有比相同体积中的平均神经元的相关伴侣多>1个标准偏差的相关伴侣的那些神经元。
最佳分离超平面：
为了鉴定最能区分恐惧与中性情境的网络群体活动度量，使用了一个空间的图论参数(下文所述的)，可将所述参数一起用于定义两个情境之间的最佳分离超平面。在数学上，这被认为是一个约束优化问题，其目标函数寻求在每个情境中最大化超平面至最近数据点的距离之和，并且约束是超平面分离两个情境。使用拉格朗日乘子解决了该约束优化问题。
超前-滞后的同步和定量：
为了分析整个网络的自发活动，针对每个神经元计算每个活动瞬变的开始和持续时间(其中，如上所述计算事件开始和偏移)，然后将来自所有细胞的瞬变组合成栅格图，并且将这些栅格图折叠成活动直方图，其表示作为时间的函数的活动细胞的百分比。
为了鉴定包括比在每一帧偶然预期的更多的活跃细胞的同步活动的时刻，使用间隔改组(每个细胞的事件之间的间隔的随机重新排序)，对每个情境中的每只小鼠执行1,000次，使得为每次改组构建替代直方图。对应于P<0.05(仅出现在直方图的5％中)的显著性水平的活动神经元的阈值百分比被认为是单帧中被认为是同步事件所需的共活动细胞的百分比，并且该阈值介于所有小鼠和视野中每帧2.5％与5％的活动神经元之间。至少有三个活动高于显著性阈值的连续帧需要被认为是一个同步事件，并且高于该阈值的所有后续连续帧被一起分组至同一个同步事件中。为了绘制同步事件期间HC和非HC神经元事件开始的累积分布函数，鉴定了所有小鼠的所有同步事件，并且将HC与非HC神经元的开始时间按每帧进行分箱并且累积绘制为在同步窗口期间过去的时间的百分比的函数。
为了定量HC神经元的活动是领先还是滞后于它们的相关对，首先将HC神经元的事件开始(定义为当信号对于两个连续帧超过3σ时的第一实例)在t＝0处固定。然后将所有相关对的事件开始分箱至紧接中枢神经元在t＝0时的开始之前或之后的0.167秒的时间窗中。
主成分分析(PCA)：
使用PCA来描述每种情境下随时间推移的所有神经元的群体活动并使其可见。这通过将在给定情境中的所有时间点(通常为1800帧)上的每一个细胞(通常为约500个细胞/小鼠/情境)的转化为由线性独立特征向量表征的不同坐标系统来实现，其中每个特征向量表示不同细胞的加权组合。特征值按降序排序，以揭示最有活力的(贡献性)特征向量以及其总体贡献的量值。使用相关矩阵的特征值分解来进行PCA。使用自定义MATLAB脚本来计算相应的特征值和特征向量。
图论参数的估计：
基于群体中的细胞相关性来定义无向图。如果神经元的相关性超出上述阈值，则将边E定义在神经元之间。使用由V(顶点)和E(边)表示的所有细胞来定义无向神经元图G(V，E)。使用所有测量相关性的总体平均值和最大值计算平均和最大细胞相关性。在相关数量(n校正)和n频率(上述程度分布)之间拟合指数分布，以定量该图形模拟以幂律度分布为特征的小世界网络的接近程度
n频率＝a(n校正)-b
通过将上述方程式转换成对数标度并执行最小二乘法拟合来计算幂律参数a和b。
对于每个细胞将邻域定义为半径为30微米的球体。将顶点的聚簇系数定义为其邻域内边缘数量对可能的最大连接数量之比。如果邻域中有k个节点，则k(k-1)/2是可能连接的最大数目9。整个网络的聚簇系数被定义为所有顶点的平均聚簇系数。平均路径长度被定义为图的任意两个随机选择的顶点之间的平均路径。平均路径长度是通过首先构造邻接矩阵来计算的，该邻接矩阵是n细胞xn细胞矩阵，并且所有相关的顶点对在相应的行和列中被赋值为1，否则为0。从i到j的最小路径可以使用以下方程式来递归计算：
mpli，j＝min(mpli，k+mplk，j)
小世界网络的特征在于高聚簇系数和低平均路径长度，使用聚簇系数与平均路径长度的比率来定量，其中每个项被标准化为具有相同顶点数量的纯随机图。中间中心性是衡量网络中节点的中心性的一个度量，并指示节点在所有节点对之间的通讯中所处的中心程度。中间中心性是通过计算两个节点之间的所有可能路径并计算通过给定节点的那些路径的数量来计算的。图的强度定量图的不同子分量的连接强度，并且是图的对抗对其边缘攻击的抗性的度量。设P＝(V1、V2、……Vn)表示图G至互斥的一组顶点V1、V2、……Vn的所有可能分区，使得所有顶点的并集为V。设Er表示需要从G除去以创建分区P的边的数量。因此强度被定义为
其中在所有可能的分区P上计算最小值。换句话说，强度定量如何去除最小边以在图的顶点之间创建最大分离。使用基于前述算法(Tarjan,R.E.Depth firstsearch and linear graph algorithms.SIAM Journal Computing 1972,2:146–160；Sedgewick,R.Algorithms in C++，第5部分Graph Algorithms(Addison-Wesley).2002)的MATLAB代码计算强度。
快速非负反卷积算法实现
反卷积算法使得能够根据荧光数据估计棘波速率序列。此处，反卷积被用来估计活动事件开始，而不是检测单个棘波，因为假定GCaMP6m既不具有线性响应动力学也不具有检测来自海马中的爆发神经元的单个棘波所需的灵敏度。该分析用于帮助证实我们关于高度相关神经元的同步事件和时间安排的主要结果，因为这些分析提供了替代方法来鉴定事件开始，同时帮助从分析中消除噪音(例如，长Ca2+信号衰减)。
存在许多反卷积算法。对荧光数据进行反卷积的早期方法使用阈值来推断事件开始或优化以匹配选定的棘波特征谱。更强大的算法诸如维纳线性滤波器是有前景的(Holekamp等，Neuron,2008,57:661-672)，但由于允许负向棘波，所以实用价值减小。Vogelstein等在2010年提供了一种快速非负反卷积方法，所述方法除了对棘波序列施加非负约束外，还可在大量神经元上进行扩展32。由于成像涉及多个情境中和数天内的数百个神经元，因此来自Vogelstein等的算法被用于对荧光信号进行反卷积。
在该算法中优化以下三类参数以拟合数据：(a)GCaMP相关参数，即荧光对细胞内Ca2+浓度的升高(α)和基线浓度(β)的敏感性；(b)采集参数，即dF/F信号中的时间分箱(δ)和噪声(σ)的大小；和(c)系统(海马/CA3)相关参数，即预期的棘波率/秒和时间常数(τ)或Ca2+浓度衰减所花的时间长度。对于GCaMP相关参数，如上所述将β设为dF/F迹线的基线，并将α设为1作为默认值(因为围绕该值广泛地改变α不会影响反卷积结果)。将δ设为1/3秒，因为图像采集为至少3Hz/光学切片，如前面所解释的，σ估计为0.16。主要挑战在于选择和τ的参数，因为1)预期的棘波率(平均接近0.1Hz，但是当爆发时，>10Hz)是双模态的，并且未被如由该模型假定的棘波的泊松分布充分捕获，以及2)针对海马中的Ca2+信号所预期的时间常数尚未被完全了解。因此，这两个参数通过在时间常数与预期的棘波率的多个组合上进行迭代来进行优化，以产生与数据的良好拟合一致的棘波事件(图22)。选择的最终参数为：α＝1；β＝基线；δ＝0.33秒；σ＝0.16；τ＝2s。这些值与皮质区中由其他人报告的值不完全相同，但相当。重要的是，在相当宽的范围内(和τ～0.67-2)变化和τ并不会显著改变随后分析的主要结论。对所有小鼠的dF/F信号、情境和天数进行反卷积。计算关于反卷积信号的相关系数，并重新计算依赖于事件开始的准确估计的度量，诸如同步性、超前-滞后和HC神经元的鉴定。与之前描述的方法的唯一区别在于没有附加的噪声滤波器，因为在寻找最佳棘波率(此类为事件率)的过程中噪声被过滤，并且开始时间的特征在于信号变成非零的第一情况。对各种特定反卷积参数的进一步分析将是有意义的，但可能需要结合体内成像和单细胞修补实验(single cell patching experiments)，超出当前研究的范围，并且考虑到结果对广泛的参数的稳健性，不太可能显著影响此处应用的具体分析。此外，进行上述分析仅有助于确保从使用原始dF/F进行依赖于精确时间安排的测量(相关性、超前对比滞后以及同步性)获得的结果的稳健性。
虚拟现实行为分析
在存储行为数据的时间戳的XML日志文件中捕获球上的舔率和移动。然后使用自定义Python脚本对其进行解析并输入至MATLAB中，以便与具有kHz精度的显微镜成像帧同步，并用于后续分析。为了定量提取过程中恐惧与中性情境之间的舔的差异，将所述情境的前两分钟内的每秒钟的舔次数(每次引起光束中断的舔导致至少1V的TTL脉冲输出)积分。将总舔量针对从任何情境中的任何小鼠观察的最高舔率进行标准化，并且表示为每只小鼠以及每种情境的该值的分数。舔抑制数据表示为每个实验组中所有小鼠的平均值；通过学生氏t-检验评估情境之间差异的显著性值。光遗传学刺激实验期间的舔率通过在15秒的光递送期间的定量来进行评分，然后将其针对来自正好在光递送之前15秒的相应值进行标准化。使用学生氏t-检验评估了恐惧对比中性情境以及中性/刺激对比单独中性情境的舔的显著差异。在同步群体活动期间，通过比较在同步事件开始时开始的5秒的窗口中舔的数量和行进距离，然后针对在同步事件之前的5秒的窗口中舔的数量和行进距离进行标准化，来计算同步群体活动事件期间球上的舔率和速度。对于设置为同步后1-10秒的该时间窗口与对于同步前的相比观察到类似的定量结果，同步期间对比同步前的舔率和速度没有显著差异。
同时的1P体内刺激和2P体内成像
通过经由AAV8(在扣带中)注射具有改善的运输和动力学的新的红移视蛋白(bReaChES)和经由AAVdj(在CA3中)注射GCAMP6m进行同时的1-光子(1P)刺激(594nm)和2-光子(2P)成像(920nm)，并且将颅窗口定位在CA2/CA3上方以进行光接入。双光子(2P)成像和全视野光遗传学刺激设置示于图17B中：绿色(GCaMP6m信号)；红色(刺激伪像)；多模光纤(MMF)、光纤耦合(FC)、25mm平凸透镜(L)、680nm短通二向色性(D1)、管透镜(TL)、594波段/NR长通二色性(D2)、物镜(Obj)、NIR阻挡滤波器(BF)、555nm长通二向色性(D3)、520±22nm滤波器(F1)、624±20nm滤波器(F2)和GaAsP PMT(PMT1和PMT2)。简言之，将使用设置为920nm的NIR脉冲激光的共振检流计2P显微镜与使用594nm连续波激光的同时全视野刺激结合，该激光通过光纤、透镜和二向色分束器耦合至系统中。在2P成像过程中，使用2P兼容性NIR反射二向色性(经设计具有另外的594nm带通滤波器)进行1P黄光刺激。使用标准2P共振扫描成像记录GCaMP6m信号(绿色通道)和刺激伪像(红色通道-用于精确地消隐刺激时间点)。亚毫秒PMT快门用于防止在成像过程中收集刺激伪像。在没有应用PMT快门的情况下，从2P图像脱机移除1P刺激伪像。刺激参数：物镜后样品上的591nm光，20Hz，15ms脉冲，15s，8-10mW/mm2的激光功率。总共4只小鼠(将组群与仅用于成像实验的组群分开)用于组合的刺激和成像实验。捕获相同的细胞和相同的FOV用于训练前刺激试验以及训练后刺激试验(5-7天后进行)。对于被认为对刺激响应(由其募集)的神经元而言，在刺激窗口期间需要至少发生一个如上定义的显著瞬变。对于图17中提供的潜伏期测量，事件开始被定义为响应超过噪声3个标准偏差，并且至少连续2帧增加时的第一时间帧；如果发生在第一帧内，则仅考虑响应从前一帧增加的神经元，以排除衰减进入刺激窗口的响应。响应神经元被分配到333ms的潜伏期分箱。
DSI电生理学
DSI依赖于突触后细胞内Ca2+的增加以抑制GABA从表达大麻素受体的突触前抑制性神经元释放。进行来自表达GCaMP6m的CA3神经元的膜片钳记录，并检查使脉冲去极化以诱导Ca2+流入之前和之后的自发抑制性突触后电流(sIPSC)。在AAVdj-CaMKIIα::GCaMP6m注入CA3(在4-5周龄小鼠中)后4-6周进行电生理记录。用冰冷的含蔗糖的人造脑脊液溶液(ACSF；以mM计)：85NaCl、75蔗糖、2.5KCl、25葡萄糖、1.25NaH2PO4、4MgCl2、0.5CaCl2和24NaHCO3心内灌注后，制备注射小鼠的冠状切片(300μm)。将切片在32-34℃下恢复1小时，然后在室温下转移至充氧的记录ACSF溶液(以mM计)：123NaCl、3KCl、26NaHCO3、2CaCl2、1MgCl2、1.25NaH2PO4和11葡萄糖。添加兴奋性突触传递阻滞剂(D-2-氨基-5-膦酰基戊酸(APV；25μM)和2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX；10μM)以分离GABA能突触后电流，将5μM卡巴胆碱用于增强sIPSC频率以促进DSI的检测。在32-34℃在恒定灌注充氧的记录ACSF溶液的条件下进行记录。使用立式显微镜(BX61WI,Olympus)在红外微分干涉对比(IR-DIC)光学器件下使切片可视化，并将Spectra X Light引擎(Lumencor)用于观察GCaMP6m表达。在鉴定GCaMP6m表达后进行CA3神经元的记录，并且通过观察在用于诱导DSI的去极化脉冲期间GCaMP6m荧光的增强，功能性GCaMP6m活性是可鉴定的(在无BAPTA的细胞中)。以下细胞内溶液用于膜片钳电极(以mM计)：40CsCl、90K-Gluconate、1.8NaCl、1.7MgCl2、3.5KCl、10HEPES、2MgATP、0.4Na2GTP、10磷酸肌酸(pH 7.2,270-290mOsm)。对于BAPTA实验，将40mM BAPTA添加至细胞内溶液中。监测串联电阻的稳定性，如果串联电阻显著改变(>20％)或达到20MΩ，则丢弃记录。在静止状态下获取静息膜电位，所报道的值包含+11.2mV的液接电位。从100pA脉冲计算输入电阻。使用MiniAnalysis(Synaptosoft)和pClamp10.3(Molecular Devices)计算电荷转移(sIPSC下面积)并分析数据。在4秒的脉冲前期期间测量基线电荷转移，在去极化脉冲后4秒期间检查DSI，并且在4秒的窗口期间测量从DSI恢复后的电荷转移。用于诱发DSI的脉冲是从-65mV的保持电位至0mV的500ms步幅。
bReaChES的设计及测试
ReaChR和bReaChES的克隆和单一诱变
合成(GenScript)ReachR和bReaCh的DNA序列并将其克隆入含有CamKIIα启动子的AAV载体中以在神经元中表达。通过荧光显微术将所有构建体与eYFP DNA(增强型黄色荧光蛋白)融合以检测神经元中的蛋白质表达。使用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Agilent)引入Glu123Ser突变。在大肠杆菌(E.coli)中转化并扩增后，用QIAprepTM Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化质粒DNA。
培养的海马神经元中的电生理记录
如所描述的64，制备神经元培养物中的电生理记录。使用水平拉伸器(P-2000,Sutter Instruments)从玻璃毛细管(Sutter Instruments)中拉出膜片移液管(4-6MΩ)，以在电压和电流钳中进行全细胞记录。使用MultiClamp700B放大器(Molecular Devices)进行记录。外部记录溶液含有(以mM计)：127NaCl、10KCl、10HEPES、2CaCl2、2MgCl2、30D-葡萄糖,pH 7.3，包括突触阻断剂(25μM D-APV,10μM NBQX)。膜片移液管溶液含有(以mM计)：140K-葡萄糖酸盐、10HEPES、10EGTA、2MgCl2,pH 7.3。将所有测量针对+15mV的液接电位进行了校正。在整个记录中监测串联电阻的稳定性。使用Spectra X光引擎(Light engine)(Lumencor)激发eYFP并将光用于视蛋白激活。用575/25或632/22带通滤波器(Chroma)过滤黄色和红色刺激光，并通过40X物镜(Olympus)以5mW/mm2的光强度施加所述激光。用功率计(ThorLabs)测量光功率密度。通过将-80mV下的稳态光电流与1秒的连续光脉冲相比较来测定所有构建体的功能性。以电流钳模式，和以633nm、5mW/mm2和1-20Hz递送的光脉冲(5ms)光学诱发棘波。通过在-80mV和每个波长0.65mW/mm2的光强度下记录电压钳模式中的稳态光电流来测量C1V1、bReaCH-ES和ChR2的激活光谱。以(以nm计)：400、420、440、460、470、480、490、500、520、540、560、570、580、590、600、620、630、650将光递送通过20nm带通滤波器(Thorlabs)。将光电流分别标准化为最大值：480nm(对于ChR2)、560nm(对于C1V1)、570nm(对于bReaCh-ES)。通过将熄灯后光电流的衰减与单指数函数拟合来测定通道闭合的动力学。通道动力学分别通过相应的τ闭合值来定量。使用pClamp10.3(Molecular Devices)和OriginLab8(OriginLab)软件记录和分析数据。
bReaCh-ES的立体定向病毒注射
在斯坦福神经科学基因载体和病毒中心(Stanford Neuroscience Gene Vectorand Virus Core)中产生以下具有血清型DJ的腺相关病毒(AAV)：
AAVDJ-CaMKII::bReach-E162S-TS-eYFP
AAVDJ-CaMKII::C1V1(E122T/E162T)-TS-eYFP
利用1μl的任一种病毒以下述坐标(从前囱点开始)：A/P:+1.7mm；M/L:+0.3mm；D/V:-2.5mm，在内侧前额叶皮层中两侧注射4-6周龄的小鼠。对于两种病毒，在1.5×1012vg/ml下匹配滴度。
用于mPFC和BLA中的bReaCh-ES表征的切片电生理学
在注射后12-14周对mPFC末端处的视蛋白表达进行电生理记录。在用冰冷的含蔗糖的人造脑脊液溶液(ACSF；以mM计)：85NaCl、75蔗糖、2.5KCl、25葡萄糖、1.25NaH2PO4、4MgCl2、0.5CaCl2和24NaHCO3心内灌注后，制备注射小鼠的冠状切片(300μm)。将切片在32-34℃下恢复1小时，然后在室温下转移至充氧的记录ACSF溶液(以mM计)：123NaCl、3KCl、26NaHCO3、2CaCl2、1MgCl2、1.25NaH2PO4和11葡萄糖。在32-34℃下在充氧的记录ACSF溶液的恒定灌注下进行电生理记录。对于mPFC记录，将突触传递阻断剂(D-2-氨基-5-膦酰基戊酸(APV；25μM)、2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX；10μM)和gabazine(10μM))添加至记录ACSF溶液中。使用立式显微镜(BX61WI,Olympus)在红外微分干涉对比(IR-DIC)光学器件下观察切片。使用Spectra X Light引擎(Lumencor)来观察荧光蛋白表达并递送光脉冲以激活视蛋白。用功率计(Thorlabs)获取光功率密度。在首次鉴定eYFP+表达的区域后，记录mPFC神经元，并在确认mPFC和BLA处的mPFC轴突纤维中均有eYFP+表达后获取突触后基底外侧杏仁核(BLA)神经元的记录。全细胞电压钳记录在-65mV下进行，电流钳记录在静止状态下进行。膜片钳移液管含有下列内部溶液(以mM计)：125K-葡萄糖酸盐、10KCl、10HEPES、4Mg3-ATP、0.3Na-GTP、10磷酸肌酸、1EGTA。使用MultiClamp700B放大器和pClamp10.3软件(Molecular Devices)进行记录。使用pClamp10.3、OriginLab8(OriginLab)和SigmaPlot(SPSS)分析数据。在电压钳模式中在1秒的光脉冲结束时测量视蛋白的稳态光电流。将mPFC神经元和突触后BLA神经元中的光诱发的棘波概率计算为在各种光刺激频率下记录的神经元中诱发的成功动作电位的分数。突触后BLA神经元中光诱发的EPSC幅度经测量在对表达视蛋白的mPFC纤维的光刺激的诱发响应的峰值处。监测串联电阻的稳定性，如果串联电阻显著改变(>20％)或达到20MΩ，则丢弃记录。用双尾t检验进行统计分析，其显著性设定为P<0.05(如*所示)。
结果
AC-CA：直接自顶向下的投射
为了鉴定向海马的直接自顶向下的输入，将能够用tdTomato(RV-tdT22)标记传入神经元的逆行示踪剂注射至海马中。在具有已知的对海马的输入的脑区域(包括内侧隔核、对侧CA3和内嗅区皮层)中观察到稳健的tdT标记(图11A；图12A)。另外，鉴定了以前未表征的输入；来自背侧前扣带皮层(AC)和相邻额叶皮质联合皮层(FrC)的输入，其两者均与丘脑背内侧核互相连接—啮齿类动物中前额皮层(PFC)的定义特征(图11A；也用另一逆行示踪剂犬腺病毒或CAV23进行了确认；图12B)。在AC中注射RV-tdT也在背侧海马中双侧稀疏地标记了神经元，这与AC与海马之间的潜在双向通讯相符(图12C)。为了进一步验证该新颖的前额叶向海马的投射的存在，将顺行标记物(AAV5-EYFP)注射至背侧前扣带中(图12B)，并且在纹状体中双侧地以及在背内侧丘脑核中同侧地(已知两个区域接受来自PFC的投射)检测到充满荧光的投射末端，而且还在海马中双侧地检测到所述充满荧光的投射末端。
为了确定这些前额叶投射是否引起海马神经元的直接单突触驱动，用编码通道视紫红质的AAV转导前扣带，并对CA1/CA3细胞体(图11C)中光驱动的兴奋性突触后电流(EPSC)进行膜片钳记录。CA1(图11D)和CA3(图11F)中的细胞可靠地响应于光脉冲序列，并产生足以驱动动作电位的诱发的EPSC幅度(图11H和图11I)。反应(当存在时)非常快，在CA1(n＝26，图11E)中平均潜伏期为3.2ms，在CA3(n＝13，图11G)中为2.7ms；该发现与10Hz刺激后的持续诱发的棘波的观察(图11H和图11I)一起，与从前扣带至海马的锥体细胞CA3/CA1的直接且有效的单突触连接(所述连接相应地被称为AC-CA投射)的存在相符。在齿状神经元中未观察到响应(图11J)。
图11A-图11J.AC-CA单突触投射的表征。a，在海马(指定的坐标)中注射RV-tdT后5天，在AC(箭头)中检测到逆行标记的神经元。注射没有在海马下方泄漏到为PFC的已知投射靶标的背内侧丘脑核(星号)内。比例尺：5x：300μm；10x:100μm(共焦)。b，在AC(指定的坐标)中注射AAV5-CaMKIIα::EYFP后5周，投射纤维在双侧纹状体(箭头)、CA1(一个星号)和CA3(两个星号)的起层和辐射层处的双侧海马、同侧背内侧丘脑核(箭头)中可见，而在CA2和齿状神经元(括号)中稀少。注射没有泄漏到内侧隔核(已知的至海马的输入(脱字符号))中。比例尺：5x：300μm；20x:60μm(100μm最大投射)。c，将AAVdj-CaMKIIα::ChR2(H134R)-EYFP注射入背侧AC；从急性切片中的CA1锥体记录的突触后响应。d，CA1响应幅度(n＝26个神经元，n＝6只小鼠)；插图：原始迹线。e，CA1响应潜伏期(平均3.2ms)。f，CA3响应幅度(n＝13个神经元，n＝2只小鼠)；插图原始迹线。g，CA3响应潜伏期(平均2.7ms)。h，CA1和CA3(i)电流钳迹线，说明10Hz时的棘波追踪可靠性。比例尺：10mV，250/500ms。j，在齿状神经元中未检测到响应(n＝5)。
图12A-图12C.AC-CA投射的解剖特征。a，在海马中(指定的坐标)注射RV-tdT后5天，在对侧海马(箭头)、内侧隔核(括号)和AC(图11A)中检测到逆行标记的神经元。比例尺：5x:300μm；10x:100μm(共焦)。b，在于海马中注射CAV-Cre和于前扣带(指定的坐标)中注射DIO-EYFP后8周，在前扣带(箭头)中检测到传入细胞体。共焦图像；放大10倍；比例尺：100μm。c，利用RV-tdTomato从前扣带逆行追踪以绘制来自海马的相互连接。括号内注明了注射部位，左侧和右侧海马(主要在下托中(箭头))，以及如所预期的也在背内侧丘脑核(星号)中存在传入细胞体的稀疏标记。共焦5x，比例尺：200μm；10x图像，比例尺：100μm。
AC-CA：情境记忆中的因果作用
为了探讨该投射的功能意义，进行了一系列光遗传学实验，以在情境恐惧条件化之前和之后，以及还在记忆消退和恢复的背景中操作该途径。向背侧海马中注射RV-ChR2-EYFP(或RV-EYFP)，并将光-递送靶向AC中逆行标记的细胞体(图13A)。在第1天，ChR2和EYFP小鼠在一种情境下接受情境恐惧条件化，而将表达ChR2的对照组暴露于没有电击的情境中。在第2天，将所有小鼠置于不同的情境中，其中表达ChR2的恐惧条件组(n＝8)，与未条件化的ChR2(无电击，n＝6)或电击对照组(EYFP，n＝6，p<0.001，具有重复测量的双因素ANOVA，图13B)相比，仅在光刺激过程中显示出明显的恐惧行为(木僵)。通过亮灯/熄灯切换产生的木僵时间和解僵时间在动物间基本一致。在第3天，将小鼠放回原始情境中，在ChR2和EYFP恐惧条件化组群中验证强记忆编码和提取，与无电击对照相比，具有显著更高水平的木僵(图13C，P<0.001，非配对t检验)。
使用互补的顺行投射-靶向策略复制和扩展促成AC-CA投射的细胞可激活情境条件化的恐惧行为的这一观察。将AAVdj-ChR2-EYFP(或在平行组群中AAVdj-EYFP)注射至前扣带中，并将光刺激靶向海马中的末端(图14A)。与无电击和EYFP对照相比(图14B，所有组n＝8；p<0.001，具有重复测量的双因素ANOVA)，仅在ChR2组中观察到在中性情境中针对光学刺激产生的显著木僵。这些动物表现出与先前实验中相同的针对木僵的特征潜伏期。测试了这种一致的行为响应是否确实是由于恐惧记忆的重新激活而非由于恐惧行为的直接非特异性驱动所致。通过将对应于图14A和图14B的相同小鼠暴露于没有电击(方法)的情境A来使其经历数天的应急退化，之后用光刺激未能在ChR2动物中产生显著的木僵，如同无电击和EYFP对照一样(图14C)。然后在新的情境下在这些小鼠中重新开始恐惧条件化，之后与无电击和EYFP对照相比，光刺激再次可靠地在ChR2小鼠中产生木僵(图14D，所有组n＝8；p<0.001，具有重复测量的双因素ANOVA)。确认了在第3天保持情境恐惧记忆和在第14天恐惧记忆成功消退(图14E)。虽然这些数据表明促成AC-CA投射的细胞可以驱动恐惧记忆回忆，但海马的任何驱动仍然可能在海马中诱发最近强烈呈现的记忆的提取。然而，对于两个另外的对照实验(直接驱动不同的(膈-海马)投射(图14F和图14G)或直接驱动海马本身(图14H和图14I))，未发现该可能性的证据。如前一样，确认了正常情境恐惧记忆在这些小鼠中的保存(图13D和图13E，n＝8，P<0.001，配对t检验)。
来自靶向由产生AC-CA投射的细胞介导的靶向海马依赖性记忆形成的有效功能丧失实验(图14A-图14L)的发现的扩展：对记忆表达开始的速度的显著影响。实验设计：在背侧海马中注射CAV-Cre，在AC中注射DIO-eNpHR3.0(或DIO-eYFP)，并在AC中将光传递到细胞体上方。所有小鼠均在情境A(第1天)中进行恐惧条件化，仅在(第2天)用光照测试情境提取的潜伏期，然后仅在(第3天)在熄灯的情况下测试情境提取的潜伏期。第2天：在亮灯期间，66.1±18.1s(对于eNpHR3.0(n＝12))对比43.8±11.1s(对于EYFP(n＝8))；第3天：在熄灯期间，53.8±13.7s(对于eNpHR3.0)对比48.8±7.7s(对于EYFP)；P<0.05，具有重复测量的双因素ANOVA)。
图13A-图13G.AC-CA投射的光遗传学操作。a，实验设计：在背侧海马中注射RV-ChR2-EYFP(或单独的EYFP)，并在前扣带的细胞体上方递送光。注射后5天，将ChR2和EYFP小鼠在情境A中进行恐惧条件化，而仅将无电击对照暴露于情境A(第1天)。在情境B(第2天)中通过亮灯和熄灯期来测试所有小鼠，然后在情境A(第3天)中测试情境记忆提取。在20Hz、15ms脉冲、30s持续时间的训练中，光遗传学刺激是使用473nm的光，在纤维尖端处利用8-10mW激光功率。b，在情境B(左)中在150s内以5s的时间分箱绘制第2天期间的木僵(观察不到头部运动)。ChR2/电击(FC)：黑色；ChR2/无电击(NS)：红色；EYFP/电击(EYFP)：蓝色。显示了FC组中的个体(每只动物具有不同的颜色)(中间)。概述(右)：亮灯前20s(较暗的阴影)对比亮灯后20s(较浅的阴影)的木僵时间％(平均值±s.d.)；FC：亮灯时的60.9±7.4％对比熄灯时的6.5±4.4％，n＝8；NS：亮灯时的2.7±0.65％对比熄灯时的3.4±0.95％，n＝6；EYFP：亮灯时的2.9±0.75％对比熄灯时的3.6±1％，n＝6；P<0.001，具有重复测量的双因素ANOVA)。c，原始情境中第3天的情境恐惧记忆(木僵时间％)的保持(平均值±s.d.，P<0.001，非配对t检验)。d，内侧隔核注射小鼠中情境记忆的保持(图11F)；原始情境中第3天的木僵时间％(平均值±s.d.，P<0.001，显示的比较，非配对t检验)。e，海马注射的小鼠中情境记忆的保持(图h)；原始情境中第3天的木僵时间％(平均值±S.D.，n＝8只小鼠，P<0.001，配对t-检验)。f，由引起AC-CA投射的细胞介导的靶向海马依赖性记忆形成的成功的功能丧失实验(在图14A-图14L中报道的)被设计来允许对该回路元件进行最有力的抑制。如此处所示的，也开发了替代设计(试图靶向投射域，尽管海马形成的时空跨度宽而长)，但如所预期的，其是无效的；将AAV5-eNpHR3.0-EYFP(或在平行组群中为AAV5-EYFP)双侧注入前扣带，并将光刺激双侧靶向海马中的轴突末端。注射后8周，将所有小鼠针对情境(第1天)进行恐惧条件化，并在亮灯/熄灯期期间(第2天)测试其情境提取，并且仅(在第3天)在熄灯中再次测试情境提取。光遗传学抑制是在589nm的光持续照明下持续30秒，在光纤尖端利用8-10mW激光功率。g，观察到记忆提取期间由于AC-CA投射的光学抑制而导致的朝向木僵减少的趋势。在光照之前(左侧较暗的条块)对比光照之后(右侧较淡的条纹)的第2天期间的情境A中的木僵时间％。eNpHR3.0：熄灯时的73.5±8.5％对比亮灯时的55.5±11.4％，n＝10；EYFP：熄灯时的74±7.4％对比亮灯时的74±11.3％，n＝10；虚线之后显示了第3天期间在熄灯的情况下(黑条块)情境A中的木僵时间％。eNpHR3.0：67.5±7.2％，n＝10；EYFP：66.5±9.1％，n＝10(P＝0.067，双因素ANOVA)。如所预期的，点照明对于抑制广泛的轴突末端域体积可能不太有效。
图14A-图14L.AC-CA投射控制自顶向下的记忆提取。a，在AC中注射AAVdj-CaMKIIα::ChR2-EYFP(或单独的EYFP)，注射后5周将光靶向背侧海马。显示的时间线。b-d，第2、15、17天的木僵时间％：5s的时间分箱(n＝8；P<0.001，具有重复测量的双因素ANOVA)；下面的概括条形图是平均值±s.d.光照之前20s(深色条块)对比光照之后20s(浅色条块)。e，情境记忆(第3天)和情境消退(第14天)、原始情境A的保持(平均值±s.d.，n＝8，P<0.001，配对t检验)。f，在内侧隔核中注射AAVdj-CaMKIIα::ChR2-EYFP(或单独的EYFP)；在注射后5周将光刺激靶向背侧海马。g，第2天期间的木僵时间％：10s的时间分箱。右边的概括条形图(n.s.非配对t检验)。h，AAVdj-ChR2-EYFP(或单独的EYFP)注射，并在注射后5周将光靶向背侧海马。i，第2天期间的木僵时间％，5s的时间分箱。右边的概括条形图(n＝8，n.s.，配对t检验)。j，在背侧海马中注射CAV-Cre，在AC中注射DIO-eNpHR3.0(或DIO-eYFP)，注射后8周将光递送至AC中的细胞体上方。k，光照前(深色条块)对比光照后(浅色条块)的第2天的情境A中的木僵时间％。该影响在第3天(虚线后)是可逆的。(eNpHR3.0：n＝12；EYFP：n＝8；P<0.001，具有重复测量的双因素ANOVA)。l，在第一天进行暗示条件化，然后在第2天在亮灯/熄灯期期间进行对音调的提取。
上述实验证明激活AC-CA投射细胞足以诱发情境记忆提取；接下来通过将抑制性视蛋白eNpHR3.0靶向产生投射的细胞(图13F和图13G)，将光局部地和双侧地靶向AC-CA细胞体(图14J)来测试必要性。观察到eNpHR3组相较于EYFP对照中的恐惧响应的潜伏期和强度的令人惊讶的缺陷(图14K，eNpHR3.0组，n＝12，eYFP组，n＝8，p<0.001，具有重复测量的双因素ANOVA)。该效应是完全可逆的(图14K)。发现eNpHR3.0小鼠表现出完整的听觉暗示的记忆回忆(图14L，所有组n＝8，n.s.，配对t检验)，证实了上述功能丧失实验代表了AC-CA投射细胞的海马特异性效应。
综上所述，这些解剖学、电生理学和行为学数据揭示了先前未表征的单突触前额叶向海马的投射的存在。当该回路被抑制时，恐惧条件化的小鼠不能以与对照对应物相同的强度或速度提取恐惧记忆，这表明记忆提取的内在重要性。相反地，该回路的激活足以在最近条件化的小鼠中获得稳健的恐惧记忆提取，但在初次进行实验的未经条件化的小鼠、其中记忆已经被消除的小鼠、不表达视蛋白的小鼠或接受其它类型的海马的直接或间接驱动的小鼠中不存在该现象。
学习期间出现高度相关的神经元
为了观察AC-CA投射对海马网络活动的实时影响，对在双光子显微镜24下轴向固定的迹线球上的虚拟环境(VE)中航行的头部固定的小鼠的恐惧条件化范例进行了调整。将舔-抑制，而不是不动，用作恐惧行为的量度25-27(图15A；方法)；小鼠在恐惧情境中提取期间获知该任务并表现出显著的舔抑制，从而表明成功的记忆提取(图15B，n＝12，P<0.01，配对t检验)。对于行为期间的成像，给小鼠注射遗传编码的Ca2+指示剂GCaMP6m28，在CA3上方植入颅窗(图15C，图16A-图16F中显示的这些小鼠中的正常海马生理学和行为的确认)，并且在训练和提取期间每天在两个情境中进行成像(图18A)。在所有情况下，进行快速体积(500x500μm x/y，100μm z)双光子成像，提供对>400个神经元的访问(图18B)。
图15A-图15L。记忆形成产生代表情境的高度相关的HC神经元。a，头部固定的虚拟现实设置。通过舔的抑制(方法)定量恐惧。b，恐惧(黑色)对比中性(灰色)情境中的舔率(平均值±s.d.；n＝12，P<0.001，配对t检验)。第3天样品的原始的恐惧(顶部)对比中性(底部)情境中的舔概况(比例尺：1V，20s)。c，在注射/手术植入后4周进行的组织学显示在表达GCaMP6m的神经元上方的植入物。左：10x；比例尺：200μm。右：20x；比例尺：50μm。d，直方图显示代表性小鼠在恐惧对比中性情境中的每个神经元的相关伴侣的数量(参见图19)。e，恐惧情境(红色)中的HC神经元在中性情境中具有少数几个相关的伴侣(f)，n＝4只小鼠(60±18.2(s.d.)恐惧对比中性情境中的18±15.8；P<0.01，配对t检验；参见图20)。g，在一只老鼠的记忆提取期间的栅格图(上图)和折叠的活动直方图(下图)；代表性HC神经元时间序列覆盖(红色)。h，与其相关对的活动开始相比的HC神经元活动开始(时间0)(n＝67个HC神经元，60.3±6％超前对比23.2±10％滞后；P<0.01，非配对t检验)。i，同步活动(方法)定量(n＝5，恐惧中的8.1±4个事件对比中性情境中的4.2±1.6个事件；P<0.01，配对t检验)，并且没有伴随速度(j)或舔率(k)的显著变化(n＝5只小鼠；n.s.，配对t检验)。l，来自代表性小鼠的主成分分析(图23用于其它数据集)。恐惧中(红色)对比中性情境(蓝色)的群体迹线投射至各自的前3个主成分。右：参与每次偏转的HC神经元及其相关神经元的dF/F迹线。比例尺：400％dF/F，20s。
图16A-图16F.表达GCaMP6m的CA3神经元的生理特性。a，为了确保GCaMP6m的表达不改变Ca2+-相关的生理过程，追踪称为DSI(去极化诱导的对抑制的阻抑)的内源性大麻素介导的短期可塑性形式。显示了DSI的示意图；DSI取决于突触后细胞内Ca2+的增加以触发内源性大麻素的合成和释放，所述内源性大麻素然后以逆行方式发出信号以抑制表达大麻素受体的突触前抑制性神经元中的GABA释放(改编自Lee等，(2011)J Neurosci.31:10993-1002)。表达GCaMP6m的CA3细胞的内在膜特性类似于之前报道的CA3的值(Kohara等，NatNeurosci.2014 17:269-79)；平均静息电位：-72.1±1.6mV，平均输入电阻：161.8±26.4MΩ，n＝7)。b，说明应用去极化电流步骤(从-65mV至0mV持续500ms)后表达GCaMP6m的CA3细胞中sIPSC的DSI的样品迹线。c，显示sIPSC的DSI缺乏的样品迹线，在膜片移液管中包含细胞内BAPTA。d，利用标准细胞内溶液(左，在相同的固定时间间隔内与脉冲前基线相比的DSI后sIPSC的标准化电荷转移：电荷减少至基线电荷的46.9±6.7％；n＝7；与针对非GCaMP表达细胞所报导的电荷转移(Varga等Nat Neurosci.2010,13:822-24)相当)和在添加细胞内BAPTA的情况下(右，n＝6；误差条表示s.e.m；p<0.05，配对t检验)的表达GCaMP6m的细胞中标准化的电荷转移的摘要图。e，作为每个细胞中的基线GCaMP6m荧光强度(跨越事件发生率群体数据可被可靠地定量的范围的任意单位)的函数的表达GCaMP6m的神经元的自发事件发生率(在线方法中描述的检测)(在所有FOV中，从所有小鼠汇集所有具有>＝1的显著瞬变的神经元)。未观察到事件发生率作为GCaMP6m表达水平的函数显著变化(Spearman等级相关系数：0.48，P＝0.3)。f，来自GCaMP6m病毒注射和在海马上方植入套管之前的小鼠的行为评分；提供了恐惧(黑色)对比中性(灰色)情境中的前2分钟的舔率。通过对注射/植入前第3天的提取的舔抑制评估的学习水平(第3天恐惧的平均值0.5±0.3对比第3天中性的平均值2.7±0.3；n＝10，P<0.001，配对t检验)可与相应于注射/植入后的水平相当(与图15B比较)。
图17A-图17F.AC-CA投射优选在记忆提取期间招募HC神经元。a，左：在AC中注射AAV8-CaMKII::bReaChES-EYFP或AAV8-CaMKII::C1V1-EYFP；纤维末端在CA2/CA3(红色)中可见。(20x)；比例尺：60μm。右：在AC中注射AAV8-CaMKII::tdTomato，以及在CA3中注射AAVdj-CaMKII::GCAMP6m。套管植入后8周的组织学显示在表达GCaMP6m的神经元(绿色)附近保留AC-CA投射(红色)。20x。比例尺：50μm。b，2P成像和全视野光遗传学刺激设置(方法)。c，在训练之前和之后的代表性小鼠在两个深度(相距40μm)处的Z-投射图像(随时间推移的平均值)。比例尺：60μm。d，作为潜伏期的函数的对AC-CA刺激的CDF(响应细胞的比例)(n＝4只小鼠；12次试验，p＝0.002，Kolmogorov-Smirnov双尾测试，κ＝0.2673)。插图中的样品迹线(红框：刺激持续时间)。连续试验重叠。e，中性情境中的光学刺激在训练后引起显著的舔抑制(n＝4只小鼠，总共12次试验，平均值±s.d.，P<0.01，配对t检验)。训练前无舔抑制(n.s.配对t检验)。f，训练前光学刺激(n＝3只小鼠，总共10次试验)和训练后光学刺激(n＝4只小鼠，共12次试验，P<0.001，单因素ANOVA)期间招募的恐惧和中性情境HC和非HC神经元的分数(显示平均值、四分位数、最小值和最大值)。
首先寻找在几天或情境中一致地不同的功能网络的特性的鉴定。许多特性是不可区分的，包括活动神经元的平均响应幅度、平均活动事件发生率、平均活动事件持续时间和活动神经元的空间分布(图18C-图18F，图19A-图19J)。然而，注意到在恐惧情境中的记忆提取期间活跃的神经元数目显著增加(图19B，n＝5只小鼠)；有趣的是，这伴随着平均相关活动的显著减少。尽管之前的研究报道了学习后的相关活动增加29-31；一个简练的统一解释可能是，平均相关网络活动的减少反映了学习后更加稀少的状态，其中很少神经元参与显著更高的相关活动，而大多数变为去相关。事实上，将每个神经元的相关伴侣的数量分箱并且将直方图与分布ae-bx拟合揭示了随着网络中一小群显示高度相关活动的神经元(HC神经元)的出现，出现了从学习之前的随机组织的泊松类相关分布至学习后更有序的、幂律分布的显著分布偏移(图15D，图19D)。事实上，在单神经元水平上，在恐惧情境中看到了最高水平的逐个细胞相关性(图15D，图19D；n＝5；P<0.01，配对t-检验)。就恐惧和中性情境的差异表现评估额外的定量特性(图19D-图19I)，揭示幂律指数b对该情境分离提供了最大贡献(图19C，n＝5，P<0.01)，与代表恐惧记忆提取方面的HC神经元的出现一致。有趣的是，恐惧情境中的HC神经元(图15E；以黑点显示的)倾向于是在中性情境下具有低度相关伴侣的神经元(图15F；图20)，表明学习后HC神经元的出现并不仅仅源于预先存在的相关细胞结集的加强。
图18A-图18F.3D海马块中神经结集的实时成像：神经源的提取和重要瞬变的鉴定。a，头部固定的虚拟现实设置。小鼠在轴向固定的迹线球31上运行，同时通过光学鼠标和舔食测试器(两者都与虚拟现实游戏软件相接)分别测量运动和舔行为。对于情境恐惧条件化，将限制水分的小鼠暴露于两种具有不同视觉、嗅觉、触觉和听觉暗示的情境中(第1天)，并且在一种情境中提供厌恶的空气喷吹(恐惧情境)，但在另一情境(中性情境)中不提供厌恶的空气喷吹(第2天)。通过舔抑制定量两种情境中的恐惧记忆提取(第3、30天)。b，来自原始视频的样品平均强度z投射(比例尺：50μm)，以及针对每个光学部分的来自CA2/CA3的提取的神经源(分段的细胞)以及前50个时间序列的迹线。比例尺：300％dF/F，30s。c，dF/F迹线中的显著瞬变的鉴定。直方图显示在一系列以秒为单位的事件持续时间中，以高于噪声(以每个细胞为基础计算的噪声)2σ的幅度发生的事件的分布。将每个幅度和持续时间处的负向瞬变的数量在纵坐标的左侧绘制为红色，并且将每个幅度和持续时间处的正向瞬变在右侧绘制为蓝色。d，针对以3σ的幅度发生的事件重复上述分析，以及e，4σ。f，2-、3-和4-σ□事件的假阳性率(汇集在所有FOV中的所有小鼠的所有神经元中)。通过将该水平上的负事件数量除以该水平上的正事件数量(在线方法)，计算每个σ□水平的假阳性率曲线。事件开始被定义为对应于dF/F超过2σ的时间，并且偏移被定义为对应于dF/F下降至0.5σ以下的时间。用最小二乘法拟合衰减指数，以计算假阳性率值，从而可以测定不同置信水平下每个σ水平的最小瞬变持续时间。
图19A-图19J.在提取期间海马中的恐惧和中性网络的细胞群体和图表特性。a，检测到总事件幅度或发生率没有情境依赖性变化。顶图：针对恐惧和中性情境中的小鼠(n＝5只小鼠，n.s.于配对t检验中)跨天数绘制平均检测到GCaMP6m的事件幅度(所有显著事件的平均dF/F；如方法中所述的每个神经元的显著事件的定义)。底图：针对恐惧和中性情境中的小鼠(n＝5只小鼠，n.s.于配对t检验中)跨天数绘制的检测到GCaMP6m的事件的平均发生率。b，观察到个体神经元和相关行为的情境依赖性变化。顶图：针对恐惧和中性情境绘制的活动神经元的数量(在情境的前两分钟内检测到的至少一个显著GCaMP6m瞬时)(n＝5只小鼠，第3天恐惧情境的378±64对比第3天中性情境的257±39；P<0.05，配对t检验，平均值±s.d.)。底图：针对恐惧和中性情境绘制的每个神经元的相关对(其中成对皮尔逊相关系数>0.3)的平均数(n＝5只小鼠，第2天恐惧情境的18.5±1.8对比第2天中性情境的13.4±1.4；第3天恐惧情境的11.3±0.8对比第3天中性情境的13.6±0.5；P<0.05，配对t检验)。c，将来自图15D的直方图与ae-bx形式的指数分布拟合显示了与第3天的中性情境(b<1；绿点)相比较的第3天的恐惧情境(每个红点代表一只小鼠)中的幂律(b>1)分布，这在所有小鼠中是一致的(n＝5只小鼠；P<0.01，配对t检验)。许多图的性质是针对恐惧对比中性情境计算的，但程度分布的幂律指数最有力地区分恐惧(红色)与中性(绿色)(显示的判定式：幂律指数的系数＝0.78，聚簇系数的系数＝0.61，平均路径长度系数＝0.11，90％置信区间分别为[0.74,1.0]、[0.1,0.65]和[0.01,0.23])。这些置信区间是使用1000个自举样品获得的；显示的是使用线性支持向量机分类器的最佳3D超平面分离。d，小鼠间第3天的恐惧对比中性情境(提取测试)中的对于每个神经元存在的相关伴侣神经元的数量的直方图。红色虚线表示相关阈值(自动设置为网络中相关对的数量的平均值+1标准偏差)，其右侧(根据定义)是高度相关的神经元或HC神经元。计算小鼠间恐惧对比中性情境中的类似目标度量，并在此处将其提供用于其它图的不变性质：e，中间中心性；f，g，团块性质(clique properties)；h，强度；i，聚簇系数(cluster coefficient)；以及j，平均路径长度(全部在在线方法中定义)。对于上述计算，当成对皮尔逊相关系数超过0.3(在线方法)时，两个神经元之间的相关性被定义为存在。数据表示为对应于每只小鼠的单个数据点，平均值±S.D.(*)＝p<0.05；(**)＝p<0.01；(***)＝p<0.001，使用配对t检验。
图20.在恐惧对比中性情境中出现的恐惧情境定义的HC神经元的功能关系。a-c，来自所有其它小鼠的数据(超出图15E、图15F的示例)证明当处于中性情境时，具有高度相关伴侣(灰色边缘)的恐惧情境中的HC神经元(红色圆圈)具有低得多程度的相关伴侣(n＝4只小鼠，包括图15E、图15F中的实例)；平均值＝恐惧情境中的60个相关对(标准偏差为19.4)对比平均值＝中性情境中的18个相关对(标准偏差为14.2)；p<0.01，通过配对t检验)。此处只分析了4只小鼠，因为在一只小鼠的恐惧对比中性情况中没有捕获完全相同的FOV(具有细胞身份)。
为了更好地理解这些HC神经元的意义，分析集中在HC神经元活跃时的整个网络的活动。HC神经元倾向于超前于而不是滞后于它们的相关对(图15H)，其在空间上分布于整个体积中(图21A和图21B)。此外，虽然在恐惧提取测试期间总体的逐个细胞的相关活动降低，但在恐惧情境中发生显著更多的群体范围的同步事件(图15G和图15I)，所述同步事件经证实与运动无关(图15J和图15K)并且基本上由神经元的正交群组成(图15L，图23A-图23E)；发现HC神经元超前于这些广泛的同步事件(图21C，p<0.001，Kolmogorov-Smirnov双尾测试)，78％的HC神经元活动发生在前20％的同步事件中。该事件超前性质可与HC神经元在招募网络活动中的作用一致。
重要的是，上述分析被设计来限制信号缓慢波动(例如，GCaMP6m和Ca2+动力学)对神经元之间相关性的潜在混淆的效应。另外，快速非负反卷积分析32，用于检测活动的开始，同时消除缓慢的衰减动力学，得出与上文针对恐惧对比中性情境中的增加的成对关系所述的一致的结果，在恐惧对比中性情境中观察到HC神经元相较于它们的相关对的事件超前性质以及增加的同步事件(图22A-图22D)。
图21A-图21C.HC神经元的空间和时间组织。a，在来自所有五只小鼠的所有FOV(所有天和所有情境)上进行平均的平均成对相关性对比平均成对距离的曲线图。有可能检测平均相关性和距离之间的显著但弱的关系(斯皮尔曼相关系数＝-0.66，P＝0.01)，这可能是精细尺度空间聚簇的反映，如可能对于CA2/CA3中的循环回路所预期的那样，但也可能包括由于大脑运动引起的ROI与共同的神经毡信号之间的残余串扰，这是预期的，并且与先前在海马中观察到的没有显著差异。3b，所有神经元(黑色线)和仅HC神经元(灰线)的相关对的数目对比成对距离的曲线图。对于HC神经元在距离较远处发现更多相关对(Spearman's＝0.84，对于HC神经元，P＝0.002；Spearman相关＝0.23，对于所有神经元，P＝0.43)。c，累积分布，其显示与非HC神经元的响应潜伏期相比的，横跨在所有小鼠中平均的同步事件的时间进程(x-轴)的对应于各种潜伏期的开始时间的HC神经元的分数(y轴)。在同步事件期间，HC神经元活动显著早于非HC神经元(p<0.001，Kolmogorov-Smirnov双尾测试，κ＝0.664；注意曲线图的水平分辨率与同步窗口的长度成反比，并且取决于帧持续时间；例如，具有333ms的帧持续时间的10秒长的同步窗口对应于每帧3.33％的分辨率)。
图22A-图22E.附加分析：使用快速非负反卷积和相关对分析来估计事件开始。a，原始GCaMP6m迹线(顶部迹线)与去卷积迹线(底部迹线)的示例性配对显示了对来自反卷积数据(反卷积算法和参数进一步详述于在线方法中)的事件开始的可靠估计。比例尺：150％dF/F，10s。b，来自一只动物中的代表性同步事件(左)的原始GCaMP6m迹线，与该同一同步事件的反卷积迹线(右)配对。比例尺：300％dF/F，10s。c，第3天的恐惧情境中的最高度节点(具有最多数量的相关对的神经元)具有比第3天的中性情境中的最高度节点显著更多的相关对，在n＝5只小鼠中是显著的(58.8对对比33.2对，P<0.01，配对t检验)。d，与相关对的活动开始(在HC活动之前或之后分箱至333ms中)相比的HC神经元活动开始(设定为时间0)的时间关系；n＝48个HC神经元。HC更可能超前而非滞后于它们的相关对(58.5±20％超前对比24.4±10％滞后；P<0.01，非配对t检验)。e，在5只小鼠中定量的显著同步活动：恐惧情境中的同步事件的数量显著大于中性情境中的同步事件的数量(恐惧情境下5.8±2.9例事件对比中性情境下的1.2±1.1例；P<0.01，配对t检验)。
在提取期间AC-CA投射靶向HC神经元
记忆提取期间的这些体积成像研究表明出现了一组稀疏的HC神经元，其特征在于高相关性和局部同步事件的超前。如果优先在记忆提取期间通过自顶向下的投射招募，此类神经元可以作为高效的访问点。为了测试这个想法，试图刺激AC-CA投射，同时对突触后海马网络进行成像以直接观察局部动态。通过广泛地修饰ReaChR以包括基于ChETA35的突变和其它突变，生成了具有强光电流、高棘波保真度(图24A-图24K)和远程投射中的强劲运输(图17A)的称为bReaChES的红移视蛋白。
给小鼠注射GCaMP6m(在CA3中)和bReaChES(在前扣带中)，并在CA3上方植入套管(图17A)，以通过同一窗口同时进行投射末端的1P刺激和CA3锥体神经元的2P成像(图17B)。为了测试投射的因果效应，在恐惧条件化之前和之后进行多次光刺激试验，同时跨情境和天数追踪相同的神经元(图17C)。虽然在激活的神经元的数量和身份上存在试验间的变化性，但发现恐惧条件化持续增加被时间锁定至自顶向下投射的光遗传学刺激开始的细胞分数(图17D，P＝0.002，Kolmogorov-Smirnov双尾测试)。最后，直接测试通过该投射进行的记忆相关HC神经元的招募。为此，首先确定的是，与先前的结果一致，头部固定的小鼠能够学习情境恐惧条件化任务，并且AC-CA投射的刺激仅在训练之后而非之前诱导了恐惧记忆提取(图17E)。对许多试验进行定量表明，AC-CA投射的刺激在训练前在恐惧或中性情境中招募相对少(～5％)的HC神经元，然而训练后招募的HC神经元的分数显著增加(～20％)；在恐惧情境中非HC神经元的招募和在中性情境中任何神经元的招募，保持不变和较低(图17F)。这些结果进一步证明了AC-CA投射的功能影响的迅速重组织，优先招募与最近形成的情境恐惧记忆相关的HC神经元。这些发现一起揭示了自顶向下的回路影响可籍以组织和参与突出的记忆表现以使得能够进行高效提取的手段。
图23A-图23E.恐惧对比中性情境中的群体迹线的PCA。a，分别针对恐惧和中性情境进行小鼠2的所有活动细胞的dF/F迹线的PCA。恐惧情境中的群体迹线与中心之间存在大的、几乎正交的偏差，而中性情境迹线仍然接近原点。b，神经元群体的3D重建显示参与每个同步事件{红圆圈(t＝39)，绿圆圈(t＝92)，蓝圆圈(t＝200)}的神经元大部分不重叠并且在解剖学上均匀分布整个体积中。有一小部分神经元参与所有三个事件(黑色圆圈)。c，d，显示另一只代表性小鼠的数据。在所有其它小鼠中都观察到类似的结果。e，显示了随机选择的一组参与三个事件中的每一个的30个神经元的dF/F迹线，其中在t＝65与t＝210之间观察到最大量的重叠。比例尺：400％dF/F，20s。
图24A-图24K.bReaChES：工程化用于强大的投射靶向的红移视蛋白。a，ReaChR31和bReaChES的原理图。ReaChR是来自视紫红质-1(蓝色，氨基酸(aa)：1-95)、Volvox-视紫红质-1(红色，aa：96-246、279-350)和Volvox-视紫红质-2(绿色，aa：247-278)的区段的杂交体。VChR1区段含有点突变Leu171Ile。ReaChR在此处被修饰用于增强的表达和膜运输以及加速的通道动力学，导致如下的bReaChES：前51个N末端残基被来自视紫红质-2的前11个N末端残基(黄色，aa：1-11)替换，并且最后5个C-末端残基被去除。谷氨酸-123至丝氨酸的突变增加了通道闭合的速度。b，在来自大鼠海马的培养的神经元中(各自n＝6)，在0.65mW/mm2下在400nm与650nm之间测量的C1V1TT、bReaChES和ChR2的光谱。c，575nm处的稳态光电流(C1V1TT 630±109pA(整个图中的s.e.m.)，ReaChR 963±113pA，bReaChES 1365±128pA)和632nm(C1V1TT 315±111pA，ReaChR 1003±95pA，bReaChES 841±102pA)。分别在-80mV和5mW/mm2的光强下测量电流幅度。d，通道闭合速度：单指数闭合动力学的τ值(C1V1TT 79±3.7ms，n＝26；ReaChR682±86ms，n＝6；bReaChES 49±4.4ms，n＝25；P<0.0005)。e，f，用633nm的光激发(5ms，5mW/mm2)的表达ReaChR或bReaChES的培养的神经元的代表性电流钳迹线。ReaChR动力学足够慢，使得只有在非常低的频率(e)下才可能产生可靠的动作电位，而bReaChES的加速通道闭合允许高达20Hz(f)的可靠棘波生成。突触后细胞的g，代表性电压钳和h，电流钳迹线对应于表达bReaChES的突触前末端的光刺激(橙色)。脉冲长度：5ms。急性切片中的表达视蛋白的mPFC细胞中的i，稳态光电流和j，光诱发的棘波概率(C1V1TT：n＝11，bReaChES：n＝10)。突触后细胞中的k，光诱发的EPSC幅度和l，棘波概率(C1V1TT：n＝10，bReaChES：n＝18)。光波长为575nm(25nm带宽)，并且功率密度为5mW/mm2。
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尽管已经参照其具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下进行各种改变以及可替换等同物。另外，可进行许多修改来适应特定情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤，以适应本发明的目标、精神和范围。所有此类修改旨在在其所附的权利要求的范围内。
序列表
<110> K·A·狄塞罗斯
A·博尔恩特
S·Y·李
C·拉马克里施南
<120> 光响应性多肽及其使用方法
<130> STAN-1250PRV
<160> 62
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 1
Met Val Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val
20 25 30
Pro Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His
35 40 45
Glu Arg Met Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser
50 55 60
Val Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu
65 70 75 80
Lys Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln
85 90 95
Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr
100 105 110
Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu
115 120 125
Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg
145 150 155 160
Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser
165 170 175
Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu
180 185 190
Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met
195 200 205
Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr
210 215 220
Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe
225 230 235 240
His Thr Val Pro Lys Gly Leu Cys Arg Gln Leu Val Arg Ala Met Ala
245 250 255
Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu
260 265 270
Gly Pro Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly
275 280 285
His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly
290 295 300
Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp
305 310 315 320
Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val
325 330 335
Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp Lys Tyr Glu Ser Ser
340 345 350
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 2
Met Val Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val
20 25 30
Pro Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His
35 40 45
Glu Arg Met Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser
50 55 60
Val Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu
65 70 75 80
Lys Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln
85 90 95
Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr
100 105 110
Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu
115 120 125
Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg
145 150 155 160
Tyr Gly Ser Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser
165 170 175
Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu
180 185 190
Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met
195 200 205
Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr
210 215 220
Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe
225 230 235 240
His Thr Val Pro Lys Gly Leu Cys Arg Gln Leu Val Arg Ala Met Ala
245 250 255
Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu
260 265 270
Gly Pro Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly
275 280 285
His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly
290 295 300
Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp
305 310 315 320
Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val
325 330 335
Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp Lys Tyr Glu Ser Ser
340 345 350
<210> 3
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 3
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Leu Phe Gln Thr Ser
1 5 10 15
Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser Val Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly
20 25 30
Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu Lys Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu
35 40 45
Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val
50 55 60
Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser
100 105 110
Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg Tyr Gly Ser Trp Leu Leu Thr Cys
115 120 125
Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp
130 135 140
Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile
145 150 155 160
Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu
165 170 175
Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala
180 185 190
Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe His Thr Val Pro Lys Gly Leu Cys
195 200 205
Arg Gln Leu Val Arg Ala Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly
210 215 220
Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly His Ile
225 230 235 240
Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala
245 250 255
Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His
260 265 270
Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr
275 280 285
Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu
290 295 300
Asp
305
<210> 4
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 4
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Leu Phe Gln Thr Ser
1 5 10 15
Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser Val Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly
20 25 30
Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu Lys Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu
35 40 45
Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val
50 55 60
Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser
100 105 110
Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg Tyr Gly Ser Trp Leu Leu Thr Cys
115 120 125
Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp
130 135 140
Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile
145 150 155 160
Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu
165 170 175
Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala
180 185 190
Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe His Thr Val Pro Lys Gly Leu Cys
195 200 205
Arg Gln Leu Val Arg Ala Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly
210 215 220
Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly His Ile
225 230 235 240
Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala
245 250 255
Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His
260 265 270
Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr
275 280 285
Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu
290 295 300
Asp Ala Ala Ala Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly Glu Tyr Ile Pro
305 310 315 320
Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Val
325 330 335
<210> 5
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 5
Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser Val Ile Cys
1 5 10 15
Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu Lys Ser Asn
20 25 30
Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln Trp Val Val
35 40 45
Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp
50 55 60
Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu Ile Glu Met
65 70 75 80
Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser Pro Ala Thr
85 90 95
Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg Tyr Gly Ser
100 105 110
Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr
115 120 125
Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser
130 135 140
Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Cys Thr Gly
145 150 155 160
Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr Gly Met Tyr
165 170 175
Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe His Thr Val
180 185 190
Pro Lys Gly Leu Cys Arg Gln Leu Val Arg Ala Met Ala Trp Leu Phe
195 200 205
Phe Val Ser Trp Gly Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu Gly Pro Glu
210 215 220
Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly His Ser Ile
225 230 235 240
Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly Asn Tyr Leu
245 250 255
Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp Ile Arg Lys
260 265 270
Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val Glu Thr Leu
275 280 285
Val Ala Glu Glu Glu Asp
290
<210> 6
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 6
Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser Val Ile Cys
1 5 10 15
Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu Lys Ser Asn
20 25 30
Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln Trp Val Val
35 40 45
Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp
50 55 60
Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu Ile Glu Met
65 70 75 80
Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser Pro Ala Thr
85 90 95
Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg Tyr Gly Ser
100 105 110
Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr
115 120 125
Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser
130 135 140
Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Cys Thr Gly
145 150 155 160
Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr Gly Met Tyr
165 170 175
Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe His Thr Val
180 185 190
Pro Lys Gly Leu Cys Arg Gln Leu Val Arg Ala Met Ala Trp Leu Phe
195 200 205
Phe Val Ser Trp Gly Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu Gly Pro Glu
210 215 220
Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly His Ser Ile
225 230 235 240
Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly Asn Tyr Leu
245 250 255
Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp Ile Arg Lys
260 265 270
Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val Glu Thr Leu
275 280 285
Val Ala Glu Glu Glu Asp Ala Ala Ala Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu
290 295 300
Gly Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val Phe Cys Tyr
305 310 315 320
Glu Asn Glu Val
<210> 7
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 7
Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Leu
20 25 30
Ala Thr Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His
35 40 45
Ala Val Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr Ile
50 55 60
Lys Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg
65 70 75 80
His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln Gln
85 90 95
Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr
100 105 110
Leu Ser Val Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp
115 120 125
His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly
130 135 140
Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser Lys
145 150 155 160
Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp
165 170 175
Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
180 185 190
Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly
195 200 205
Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly
210 215 220
Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe
225 230 235 240
Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe
245 250 255
Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
260 265 270
Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys
275 280 285
Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Thr Arg Asp
290 295 300
Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu
305 310 315 320
Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr
325 330 335
Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp
340 345 350
Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro
355 360 365
Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Tyr Thr Asp Ser Glu
370 375 380
Glu Glu Ile Gly Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu
405 410 415
Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile
420 425 430
Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr
435 440 445
Ala Lys
450
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 8
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp
20 25 30
Leu Ala Thr Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly
35 40 45
His Ala Val Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr
50 55 60
Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile
65 70 75 80
Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln
85 90 95
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
100 105 110
Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
115 120 125
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu
130 135 140
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser
145 150 155 160
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu
165 170 175
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu
180 185 190
Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
195 200 205
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr
210 215 220
Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp
225 230 235 240
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile
245 250 255
Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
260 265 270
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
275 280 285
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Thr Arg
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<220>
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 17
Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Leu
20 25 30
Ala Thr Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His
35 40 45
Ala Val Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr Ile
50 55 60
Lys Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe His Ile Arg
65 70 75 80
His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln Gln
85 90 95
Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr
100 105 110
Leu Ser Val Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp
115 120 125
His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly
130 135 140
Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser Lys
145 150 155 160
Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp
165 170 175
Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
180 185 190
Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly
195 200 205
Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly
210 215 220
Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe
225 230 235 240
Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe
245 250 255
Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
260 265 270
Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys
275 280 285
Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Leu Pro Asp
290 295 300
Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu
305 310 315 320
Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr
325 330 335
Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp
340 345 350
Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro
355 360 365
Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Tyr Arg Asp Thr Glu
370 375 380
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Gly Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu
405 410 415
Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile
420 425 430
Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr
435 440 445
Ala Lys
450
<210> 18
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 18
Met Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Leu
20 25 30
Ala Thr Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His
35 40 45
Ala Val Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr Ile
50 55 60
Lys Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg
65 70 75 80
His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln Gln
85 90 95
Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr
100 105 110
Leu Ser Val Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp
115 120 125
His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly
130 135 140
Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser Lys
145 150 155 160
Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp
165 170 175
Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
180 185 190
Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly
195 200 205
Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly
210 215 220
Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe
225 230 235 240
Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe
245 250 255
Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
260 265 270
Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys
275 280 285
Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Leu Pro Asp
290 295 300
Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Glu Phe Ser Leu
305 310 315 320
Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr
325 330 335
Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp
340 345 350
Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro
355 360 365
Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Tyr Arg Asp Thr Glu
370 375 380
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Gly Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu
405 410 415
Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile
420 425 430
Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr
435 440 445
Ala Lys
450
<210> 19
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 19
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Pro Glu Asn Val Tyr Ile Lys Ala
20 25 30
Asp Glu Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Tyr Phe Lys Ile Arg His Asn
35 40 45
Ile Glu Gly Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln Gln Ile Thr
50 55 60
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Val Gln Ser Ile Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
85 90 95
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
100 105 110
Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu
115 120 125
Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Gln Val Glu Leu Asp Gly Asp Val
130 135 140
Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro
165 170 175
Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Val Gln Cys
180 185 190
Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser
195 200 205
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210 215 220
Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr
225 230 235 240
Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Ser Thr Arg Asp Gln Leu Thr
260 265 270
Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys
275 280 285
Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg
290 295 300
Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn
305 310 315 320
Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe Leu
325 330 335
Thr Met Met Ala Pro Lys Met Gln Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile
340 345 350
Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Gly
355 360 365
Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr
370 375 380
Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile Asp Gly Asp
385 390 395 400
Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys
405 410 415
<210> 20
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 20
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr Ile Lys Ala
20 25 30
Asp Glu Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
35 40 45
Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln Gln Asn Thr
50 55 60
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Val Gln Ser Ile Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
85 90 95
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
100 105 110
Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu
115 120 125
Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Gln Val Glu Leu Asp Gly Asp
130 135 140
Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala
145 150 155 160
Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu
165 170 175
Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Val Gln
180 185 190
Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys
195 200 205
Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys
210 215 220
Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp
225 230 235 240
Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp
245 250 255
Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Thr Arg Asp Gln Leu
260 265 270
Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Leu Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met
290 295 300
Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile
305 310 315 320
Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Leu Pro Glu Phe
325 330 335
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340 345 350
Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile
355 360 365
Gly Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu
370 375 380
Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile Asp Gly
385 390 395 400
Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys
405 410 415
<210> 21
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 21
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Ala Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Pro Val Val Ser Glu Arg Met Tyr
20 25 30
Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Ser Glu Ile Lys Lys Gly Leu Arg Leu
35 40 45
Lys Asp Gly Gly His Tyr Ala Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala
50 55 60
Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Ile Val Asp Ile Lys Leu
65 70 75 80
Asp Ile Val Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Cys Glu
85 90 95
Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
100 105 110
Gly Gly Thr Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met
115 120 125
Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser
130 135 140
Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro
145 150 155 160
Tyr Glu Ala Phe Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro
165 170 175
Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser
180 185 190
Lys Ala Tyr Ile Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Leu
195 200 205
Ser Phe Pro Glu Gly Phe Arg Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp
210 215 220
Gly Gly Ile Ile His Val Asn Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val
225 230 235 240
Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly
245 250 255
Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Thr Arg Asp Gln
260 265 270
Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe
275 280 285
Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val
290 295 300
Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met
305 310 315 320
Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Phe Asp Phe Pro Glu
325 330 335
Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Asn Asp Thr Asp Ser Glu Glu
340 345 350
Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr
355 360 365
Ile Gly Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asp Leu Gly Glu Lys
370 375 380
Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile Asp
385 390 395 400
Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala
405 410 415
Lys
<210> 22
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 22
Met Val Asp Ser Pro Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Pro Glu Asn Val Tyr Ile Lys Ala
20 25 30
Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
35 40 45
Ile Glu Gly Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln Gln Asn Thr
50 55 60
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Val Gln Ser Ile Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
85 90 95
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
100 105 110
Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Glu Ser Met Val Ser Lys
115 120 125
Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Gln Val Glu Leu Asp
130 135 140
Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
145 150 155 160
Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly
165 170 175
Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser His Gly
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Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe
195 200 205
Phe Lys Ser Ala Met Pro Gly Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe
210 215 220
Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
225 230 235 240
Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys
245 250 255
Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Thr Arg Gly
260 265 270
Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu
275 280 285
Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr
290 295 300
Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp
305 310 315 320
Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro
325 330 335
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340 345 350
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
355 360 365
Tyr Ile Gly Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu
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Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile
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Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr
405 410 415
Ala Lys
<210> 23
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 23
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr Ile Lys Ala
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Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn
35 40 45
Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Tyr His Tyr Gln Gln Asn Thr
50 55 60
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Val Gln Ser Ile Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
85 90 95
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
100 105 110
Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu
115 120 125
Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Gln Val Glu Leu Asp Gly Asp
130 135 140
Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala
145 150 155 160
Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu
165 170 175
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Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys
195 200 205
Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys
210 215 220
Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp
225 230 235 240
Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp
245 250 255
Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Thr Arg Asp Gln Leu
260 265 270
Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met
290 295 300
Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile
305 310 315 320
Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe
325 330 335
Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu
340 345 350
Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile
355 360 365
Gly Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu
370 375 380
Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile Asp Gly
385 390 395 400
Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys
405 410 415
<210> 24
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 24
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr Ile Lys Ala
20 25 30
Asp Glu Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Tyr Phe Lys Ile Arg His Asn
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50 55 60
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65 70 75 80
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Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Gln Val Glu Leu Asp Gly Asp
130 135 140
Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala
145 150 155 160
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165 170 175
Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln
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Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys
195 200 205
Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys
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Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp
225 230 235 240
Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp
245 250 255
Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Thr Arg Asp Gln Leu
260 265 270
Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met
290 295 300
Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile
305 310 315 320
Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro Glu Phe
325 330 335
Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Asn Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu
340 345 350
Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile
355 360 365
Gly Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu
370 375 380
Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile Asp Gly
385 390 395 400
Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys
405 410 415
<210> 25
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 25
Met Val Asp Ser Ser Arg Arg Lys Trp Asn Lys Thr Gly His Ala Val
1 5 10 15
Arg Ala Ile Gly Arg Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Tyr Ile Lys Ala
20 25 30
Asp Glu Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Tyr Phe Lys Ile Arg His Asn
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Gln Ser Met Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met
85 90 95
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp
100 105 110
Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Glu Ser Met Val Ser Lys
115 120 125
Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Gln Val Glu Leu Asp
130 135 140
Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly
145 150 155 160
Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly
165 170 175
Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly
180 185 190
Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe
195 200 205
Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe
210 215 220
Phe Lys Gly Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu
225 230 235 240
Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys
245 250 255
Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Thr Arg Asp
260 265 270
Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu
275 280 285
Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr
290 295 300
Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp
305 310 315 320
Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ile Asp Phe Pro
325 330 335
Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu
340 345 350
Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly
355 360 365
Tyr Ile Gly Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu
370 375 380
Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Val Ala Asp Ile
385 390 395 400
Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr
405 410 415
Ala Lys
<210> 26
<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 26
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Arg Met Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ala Asn Cys Phe
225 230 235 240
Arg Ile Phe Asp Lys Asp Ala Asn Gly Phe Ile Asp Ile Glu Glu Leu
245 250 255
Gly Glu Ile Leu Arg Ala Thr Gly Glu His Val Thr Glu Glu Asp Ile
260 265 270
Glu Asp Leu Met Lys Asp Ser Asp Lys Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp
275 280 285
Phe Asp Glu Phe Leu Lys Met Met Glu Gly Val Gln Gly Thr Ser Glu
290 295 300
Glu Glu Leu Ala Asn Cys Phe Arg Ile Phe Asp Lys Asp Ala Asn Gly
305 310 315 320
Phe Ile Asp Ile Glu Glu Leu Gly Glu Ile Leu Arg Ala Thr Gly Glu
325 330 335
His Val Thr Glu Glu Asp Ile Glu Asp Leu Met Lys Asp Ser Asp Lys
340 345 350
Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp Phe Asp Glu Phe Leu Lys Met Met Glu
355 360 365
Gly Val Gln Glu Leu Met Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln
370 375 380
Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
385 390 395 400
Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg
405 410 415
Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu
420 425 430
Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser
435 440 445
Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu
450 455 460
Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu
465 470 475 480
Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr
485 490 495
Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr
500 505 510
Gly Leu Met Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp
515 520 525
Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile
530 535 540
Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe
545 550 555 560
Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe
565 570 575
Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn
580 585 590
Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys
595 600 605
Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp
610 615
<210> 27
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 27
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Arg Met His Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala
225 230 235 240
Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr
245 250 255
Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn
260 265 270
Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp
275 280 285
Gly Asn Gly Thr Ile Tyr Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg
290 295 300
Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg
305 310 315 320
Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Gln Leu Arg
325 330 335
His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp
340 345 350
Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr
355 360 365
Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys Gly Gly Lys Arg Arg Trp
370 375 380
Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg Phe Lys Lys Ile
385 390 395 400
Ser Ser Ser Gly Ala Leu Glu Leu Met Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala
405 410 415
Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu
420 425 430
Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro
435 440 445
Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala
450 455 460
Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly
465 470 475 480
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
485 490 495
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
500 505 510
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile
515 520 525
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
530 535 540
Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
545 550 555 560
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
565 570 575
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
580 585 590
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
595 600 605
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
610 615 620
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
625 630 635 640
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Leu Ser Arg
645 650 655
Gly Pro Gly Thr Ser Ala Glu Ile Tyr Ala Cys Arg Leu Glu Ile Ser
660 665 670
Asn
<210> 28
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 28
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Arg Met His Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala
225 230 235 240
Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Leu Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr
245 250 255
Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Ala Leu Arg Ser Leu Gly Gln Asn
260 265 270
Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp
275 280 285
Gly Asn Gly Thr Ile Tyr Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg
290 295 300
Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg
305 310 315 320
Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg
325 330 335
His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp
340 345 350
Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr
355 360 365
Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys Gly Gly Lys Arg Arg Trp
370 375 380
Gln Lys Thr Gly His Ala Val Arg Ala Phe Gly Arg Leu Lys Lys Ile
385 390 395 400
Ser Ser Ser Gly Ala Leu Glu Leu Met Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala
405 410 415
Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu
420 425 430
Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro
435 440 445
Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala
450 455 460
Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly
465 470 475 480
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
485 490 495
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
500 505 510
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Ile
515 520 525
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
530 535 540
Leu Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
545 550 555 560
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
565 570 575
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
580 585 590
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
595 600 605
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
610 615 620
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn
625 630 635 640
Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu
645 650
<210> 29
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 29
Met Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val Pro
20 25 30
Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His Glu
35 40 45
Arg Met Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser Val
50 55 60
Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln Trp
85 90 95
Ile Thr Phe Ala Leu Ser Ala Leu Cys Leu Met Phe Tyr Gly Tyr Gln
100 105 110
Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly Trp Glu Glu Ile Tyr Val Ala Thr Ile
115 120 125
Glu Met Ile Lys Phe Ile Ile Glu Tyr Phe His Glu Phe Asp Glu Pro
130 135 140
Ala Val Ile Tyr Ser Ser Asn Gly Asn Lys Thr Val Trp Leu Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn
165 170 175
Leu Thr Gly Leu Ala Asn Asp Tyr Asn Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu
180 185 190
Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile Val Trp Gly Thr Thr Ala Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Gly Tyr Val Arg Val Ile Phe Phe Leu Met Gly Leu Cys Tyr Gly
210 215 220
Ile Tyr Thr Phe Phe Asn Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Tyr His
225 230 235 240
Thr Val Pro Lys Gly Ile Cys Arg Asp Leu Val Arg Tyr Leu Ala Trp
245 250 255
Leu Tyr Phe Cys Ser Trp Ala Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu Gly
260 265 270
Pro Glu Gly Phe Gly His Ile Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Ala His
275 280 285
Ala Ile Leu Asp Leu Ala Ser Lys Asn Ala Trp Ser Met Met Gly His
290 295 300
Phe Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp Ile
305 310 315 320
Arg Lys Lys Gln Lys Val Asn Val Ala Gly Gln Glu Met Glu Val Glu
325 330 335
Thr Met Val His Glu Glu Asp Asp
340
<210> 30
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 30
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asp
20 25 30
Gln Cys Tyr Cys Ala Gly Trp Ile Glu Ser Arg Gly Thr Asn Gly Ala
35 40 45
Gln Thr Ala Ser Asn Val Leu Gln Trp Leu Ala Ala Gly Phe Ser Ile
50 55 60
Leu Leu Leu Met Phe Tyr Ala Tyr Gln Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Ile Tyr Val Cys Ala Ile Glu Met Val Lys Val Ile Leu
85 90 95
Glu Phe Phe Phe Glu Phe Lys Asn Pro Ser Met Leu Tyr Leu Ala Thr
100 105 110
Gly His Arg Val Gln Trp Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys
115 120 125
Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Ser Asn Asp
130 135 140
Tyr Ser Arg Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile
145 150 155 160
Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Ala Thr Gly Tyr Val Lys Val Ile
165 170 175
Phe Phe Cys Leu Gly Leu Cys Tyr Gly Ala Asn Thr Phe Phe His Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Tyr Ile Glu Gly Tyr His Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys
195 200 205
Arg Gln Val Val Thr Gly Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly
210 215 220
Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu
225 230 235 240
Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser
245 250 255
Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His Tyr Leu Arg Val Leu Ile His
260 265 270
Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn
275 280 285
Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala
290 295 300
Glu Ala Gly Ala Val Pro
305 310
<210> 31
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 31
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asp
20 25 30
Gln Cys Tyr Cys Ala Gly Trp Ile Glu Ser Arg Gly Thr Asn Gly Ala
35 40 45
Gln Thr Ala Ser Asn Val Leu Gln Trp Leu Ala Ala Gly Phe Ser Ile
50 55 60
Leu Leu Leu Met Phe Tyr Ala Tyr Gln Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Ile Tyr Val Cys Ala Ile Glu Met Val Lys Val Ile Leu
85 90 95
Glu Phe Phe Phe Glu Phe Lys Asn Pro Ser Met Leu Tyr Leu Ala Thr
100 105 110
Gly His Arg Val Gln Trp Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Ser
115 120 125
Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Ser Asn Asp
130 135 140
Tyr Ser Arg Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile
145 150 155 160
Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Ala Thr Gly Tyr Val Lys Val Ile
165 170 175
Phe Phe Cys Leu Gly Leu Cys Tyr Gly Ala Asn Thr Phe Phe His Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Tyr Ile Glu Gly Tyr His Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys
195 200 205
Arg Gln Val Val Thr Gly Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly
210 215 220
Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu
225 230 235 240
Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser
245 250 255
Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His Tyr Leu Arg Val Leu Ile His
260 265 270
Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn
275 280 285
Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala
290 295 300
Glu Ala Gly Ala Val Pro
305 310
<210> 32
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 32
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asp
20 25 30
Gln Cys Tyr Cys Ala Gly Trp Ile Glu Ser Arg Gly Thr Asn Gly Ala
35 40 45
Gln Thr Ala Ser Asn Val Leu Gln Trp Leu Ala Ala Gly Phe Ser Ile
50 55 60
Leu Leu Leu Met Phe Tyr Ala Tyr Gln Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly
65 70 75 80
Trp Glu Glu Ile Tyr Val Cys Ala Ile Glu Met Val Lys Val Ile Leu
85 90 95
Glu Phe Phe Phe Glu Phe Lys Asn Pro Ser Met Leu Tyr Leu Ala Thr
100 105 110
Gly His Arg Val Gln Trp Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Ser
115 120 125
Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Ser Asn Asp
130 135 140
Tyr Ser Arg Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Ala Ile Gly Thr Ile
145 150 155 160
Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Ala Thr Gly Tyr Val Lys Val Ile
165 170 175
Phe Phe Cys Leu Gly Leu Cys Tyr Gly Ala Asn Thr Phe Phe His Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Tyr Ile Glu Gly Tyr His Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys
195 200 205
Arg Gln Val Val Thr Gly Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly
210 215 220
Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu
225 230 235 240
Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser
245 250 255
Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His Tyr Leu Arg Val Leu Ile His
260 265 270
Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn
275 280 285
Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala
290 295 300
Glu Ala Gly Ala Val Pro
305 310
<210> 33
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 33
Met Asp Tyr Pro Val Ala Arg Ser Leu Ile Val Arg Tyr Pro Thr Asp
1 5 10 15
Leu Gly Asn Gly Thr Val Cys Met Pro Arg Gly Gln Cys Tyr Cys Glu
20 25 30
Gly Trp Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ala Ile
35 40 45
Thr Leu Gln Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp
50 55 60
Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr
65 70 75 80
Val Ala Leu Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu
85 90 95
Phe Asp Ser Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val
100 105 110
Trp Met Arg Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Leu Leu Ile
115 120 125
His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr
130 135 140
Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr
145 150 155 160
Ser Ala Met Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser
165 170 175
Leu Ser Tyr Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile
180 185 190
Glu Ala Phe His Thr Val Pro Lys Gly Ile Cys Arg Glu Leu Val Arg
195 200 205
Val Met Ala Trp Thr Phe Phe Val Ala Trp Gly Met Phe Pro Val Leu
210 215 220
Phe Leu Leu Gly Thr Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser
225 230 235 240
Ala Ile Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly
245 250 255
Val Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu
260 265 270
Tyr Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu
275 280 285
Met Glu Val Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp
290 295 300
<210> 34
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 34
Met Asp Tyr Pro Val Ala Arg Ser Leu Ile Val Arg Tyr Pro Thr Asp
1 5 10 15
Leu Gly Asn Gly Thr Val Cys Met Pro Arg Gly Gln Cys Tyr Cys Glu
20 25 30
Gly Trp Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ala Ile
35 40 45
Thr Leu Gln Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp
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65 70 75 80
Val Ala Leu Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu
85 90 95
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100 105 110
Trp Met Arg Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Ser Pro Val Leu Leu Ile
115 120 125
His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr
130 135 140
Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr
145 150 155 160
Ser Ala Met Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser
165 170 175
Leu Ser Tyr Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile
180 185 190
Glu Ala Phe His Thr Val Pro Lys Gly Ile Cys Arg Glu Leu Val Arg
195 200 205
Val Met Ala Trp Thr Phe Phe Val Ala Trp Gly Met Phe Pro Val Leu
210 215 220
Phe Leu Leu Gly Thr Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser
225 230 235 240
Ala Ile Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly
245 250 255
Val Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu
260 265 270
Tyr Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu
275 280 285
Met Glu Val Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp
290 295 300
<210> 35
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 35
Met Asp Tyr Pro Val Ala Arg Ser Leu Ile Val Arg Tyr Pro Thr Asp
1 5 10 15
Leu Gly Asn Gly Thr Val Cys Met Pro Arg Gly Gln Cys Tyr Cys Glu
20 25 30
Gly Trp Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ala Ile
35 40 45
Thr Leu Gln Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp
50 55 60
Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr
65 70 75 80
Val Ala Leu Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu
85 90 95
Phe Asp Ser Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val
100 105 110
Trp Met Arg Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Leu Leu Ile
115 120 125
His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr
130 135 140
Met Gly Leu Leu Val Ser Ala Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr
145 150 155 160
Ser Ala Met Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser
165 170 175
Leu Ser Tyr Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile
180 185 190
Glu Ala Phe His Thr Val Pro Lys Gly Ile Cys Arg Glu Leu Val Arg
195 200 205
Val Met Ala Trp Thr Phe Phe Val Ala Trp Gly Met Phe Pro Val Leu
210 215 220
Phe Leu Leu Gly Thr Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser
225 230 235 240
Ala Ile Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly
245 250 255
Val Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu
260 265 270
Tyr Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu
275 280 285
Met Glu Val Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp
290 295 300
<210> 36
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 36
Met Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val Pro
20 25 30
Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His Glu
35 40 45
Arg Met Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser Val
50 55 60
Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln Trp
85 90 95
Ile Thr Phe Ala Leu Ser Ala Leu Cys Leu Met Phe Tyr Gly Tyr Gln
100 105 110
Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly Trp Glu Glu Ile Tyr Val Ala Thr Ile
115 120 125
Glu Met Ile Lys Phe Ile Ile Glu Tyr Phe His Glu Phe Asp Glu Pro
130 135 140
Ala Val Ile Tyr Ser Ser Asn Gly Asn Lys Thr Val Trp Leu Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Leu Leu Ile His Leu Ser Asn
165 170 175
Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu
180 185 190
Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Cys
195 200 205
Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr Gly
210 215 220
Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe His
225 230 235 240
Thr Val Pro Lys Gly Ile Cys Arg Glu Leu Val Arg Val Met Ala Trp
245 250 255
Thr Phe Phe Val Ala Trp Gly Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu Gly
260 265 270
Thr Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly His
275 280 285
Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly Asn
290 295 300
Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp Ile
305 310 315 320
Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val Glu
325 330 335
Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp
340
<210> 37
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 37
Met Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val Pro
20 25 30
Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His Glu
35 40 45
Arg Met Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser Val
50 55 60
Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu Lys
65 70 75 80
Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln Trp
85 90 95
Ile Thr Phe Ala Leu Ser Ala Leu Cys Leu Met Phe Tyr Gly Tyr Gln
100 105 110
Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly Trp Glu Glu Ile Tyr Val Ala Thr Ile
115 120 125
Glu Met Ile Lys Phe Ile Ile Glu Tyr Phe His Glu Phe Asp Glu Pro
130 135 140
Ala Val Ile Tyr Ser Ser Asn Gly Asn Lys Thr Val Trp Leu Arg Tyr
145 150 155 160
Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn
165 170 175
Leu Thr Gly Leu Ala Asn Asp Tyr Asn Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu
180 185 190
Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile Val Trp Gly Thr Thr Ala Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Gly Tyr Val Arg Val Ile Phe Phe Leu Met Gly Leu Cys Tyr Gly
210 215 220
Ile Tyr Thr Phe Phe Asn Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Tyr His
225 230 235 240
Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys Arg Gln Val Val Thr Gly Met Ala Trp
245 250 255
Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu Gly
260 265 270
Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His
275 280 285
Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His
290 295 300
Tyr Leu Arg Val Leu Ile His Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile
305 310 315 320
Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu
325 330 335
Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala Glu Ala Gly Ala Val
340 345
<210> 38
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 38
Met Gly Gly Ala Pro Ala Pro Asp Ala His Ser Ala Pro Pro Gly Asn
1 5 10 15
Asp Ser Ala Gly Gly Ser Glu Tyr His Ala Pro Ala Gly Tyr Gln Val
20 25 30
Asn Pro Pro Tyr His Pro Val His Gly Tyr Glu Glu Gln Cys Ser Ser
35 40 45
Ile Tyr Ile Tyr Tyr Gly Ala Leu Trp Glu Gln Glu Thr Ala Arg Gly
50 55 60
Phe Gln Trp Phe Ala Val Phe Leu Ser Ala Leu Phe Leu Ala Phe Tyr
65 70 75 80
Gly Trp His Ala Tyr Lys Ala Ser Val Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val
85 90 95
Cys Ser Val Glu Leu Ile Lys Val Ile Leu Glu Ile Tyr Phe Glu Phe
100 105 110
Thr Ser Pro Ala Met Leu Phe Leu Tyr Gly Gly Asn Ile Thr Pro Trp
115 120 125
Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His
130 135 140
Leu Ser Asn Ile Thr Gly Leu Ser Glu Glu Tyr Asn Lys Arg Thr Met
145 150 155 160
Ala Leu Leu Val Ser Asp Leu Gly Thr Ile Cys Met Gly Val Thr Ala
165 170 175
Ala Leu Ala Thr Gly Trp Val Lys Trp Leu Phe Tyr Cys Ile Gly Leu
180 185 190
Val Tyr Gly Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Ala Gly Ile Ile Tyr Val Glu
195 200 205
Ser Tyr Tyr Ile Met Pro Ala Gly Gly Cys Lys Lys Leu Val Leu Ala
210 215 220
Met Thr Ala Val Tyr Tyr Ser Ser Trp Leu Met Phe Pro Gly Leu Phe
225 230 235 240
Ile Phe Gly Pro Glu Gly Met His Thr Leu Ser Val Ala Gly Ser Thr
245 250 255
Ile Gly His Thr Ile Ala Asp Leu Leu Ser Lys Asn Ile Trp Gly Leu
260 265 270
Leu Gly His Phe Leu Arg Ile Lys Ile His Glu His Ile Ile Met Tyr
275 280 285
Gly Asp Ile Arg Arg Pro Val Ser Ser Gln Phe Leu Gly Arg Lys Val
290 295 300
Asp Val Leu Ala Phe Val Thr Glu Glu Asp Lys Val
305 310 315
<210> 39
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 39
Met Glu Pro Val Leu Gly Leu Ala Ser Thr Ala Val Arg Glu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Gly Gly Ser Gly Asn Pro Tyr Glu Ser Tyr Lys Pro Pro Glu Asp
20 25 30
Pro Cys Ala Leu Thr Pro Phe Gly Cys Leu Thr Asn Phe Trp Cys Asp
35 40 45
Pro Gln Phe Gly Leu Ala Asp Ala Lys Tyr Asp Tyr Cys Tyr Val Lys
50 55 60
Ala Ala Tyr Gly Glu Leu Ala Ile Val Glu Thr Ser Arg Leu Pro Trp
65 70 75 80
Leu Tyr Ser His Gly Ser Asp Ala Glu His Gln Gly Ala Leu Ala Met
85 90 95
Gln Trp Met Ala Phe Ala Leu Cys Ile Ile Cys Leu Val Phe Tyr Ala
100 105 110
Tyr His Ser Trp Lys Ala Thr Thr Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Cys
115 120 125
Val Val Glu Leu Val Lys Val Leu Leu Glu Ile Tyr Lys Glu Phe Glu
130 135 140
Ser Pro Ala Ser Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Asn Ala Ala Leu Trp Leu
145 150 155 160
Arg Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu
165 170 175
Ser Asn Ile Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Asn Lys Arg Thr Met Gln
180 185 190
Leu Leu Val Ser Asp Ile Gly Cys Val Val Trp Gly Ile Thr Ala Ala
195 200 205
Phe Ser Val Gly Trp Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Tyr Gly Ser Asn Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ser
225 230 235 240
Tyr His Thr Val Pro Lys Gly His Cys Arg Leu Ile Val Arg Leu Met
245 250 255
Ala Tyr Cys Phe Tyr Val Ala Trp Thr Met Tyr Pro Ile Leu Phe Ile
260 265 270
Leu Gly Pro Glu Gly Leu Gly His Met Ser Ala Tyr Met Ser Thr Ala
275 280 285
Leu His Gly Val Ala Asp Met Leu Ser Lys Gln Ile Trp Gly Leu Leu
290 295 300
Gly His His Leu Arg Val Lys Ile Phe Glu His Ile Leu Ile His Gly
305 310 315 320
Asp Ile Arg Lys Thr Thr Thr Met Gln Val Gly Gly Gln Met Val Gln
325 330 335
Val Glu Glu Met Val Asp Glu Glu Asp Glu Asp Thr Ile
340 345
<210> 40
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 40
Met Ser Arg Leu Val Ala Ala Ser Trp Leu Leu Ala Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Gly Ile Thr Ser Thr Thr Thr Ala Ser Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser
20 25 30
Thr Asp Gly Thr Ala Ala Ala Ala Val Ser His Tyr Ala Met Asn Gly
35 40 45
Phe Asp Glu Leu Ala Lys Gly Ala Val Val Pro Glu Asp His Phe Val
50 55 60
Cys Gly Pro Ala Asp Lys Cys Tyr Cys Ser Ala Trp Leu His Ser Arg
65 70 75 80
Gly Thr Pro Gly Glu Lys Ile Gly Ala Gln Val Cys Gln Trp Ile Ala
85 90 95
Phe Ser Ile Ala Ile Ala Leu Leu Thr Phe Tyr Gly Phe Ser Ala Trp
100 105 110
Lys Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Cys Cys Val Glu Val
115 120 125
Leu Phe Val Thr Leu Glu Ile Phe Lys Glu Phe Ser Ser Pro Ala Thr
130 135 140
Val Tyr Leu Ser Thr Gly Asn His Ala Tyr Cys Leu Arg Tyr Phe Glu
145 150 155 160
Trp Leu Leu Ser Cys Pro Val Ile Leu Ile Lys Leu Ser Asn Leu Ser
165 170 175
Gly Leu Lys Asn Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Ile Val Ser
180 185 190
Cys Val Gly Met Ile Val Phe Gly Met Ala Ala Gly Leu Ala Thr Asp
195 200 205
Trp Leu Lys Trp Leu Leu Tyr Ile Val Ser Cys Ile Tyr Gly Gly Tyr
210 215 220
Met Tyr Phe Gln Ala Ala Lys Cys Tyr Val Glu Ala Asn His Ser Val
225 230 235 240
Pro Lys Gly His Cys Arg Met Val Val Lys Leu Met Ala Tyr Ala Tyr
245 250 255
Phe Ala Ser Trp Gly Ser Tyr Pro Ile Leu Trp Ala Val Gly Pro Glu
260 265 270
Gly Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Ala Asn Ser Ile Gly His Ser Ile
275 280 285
Cys Asp Ile Ile Ala Lys Glu Phe Trp Thr Phe Leu Ala His His Leu
290 295 300
Arg Ile Lys Ile His Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys
305 310 315 320
Thr Thr Lys Met Glu Ile Gly Gly Glu Glu Val Glu Val Glu Glu Phe
325 330 335
Val Glu Glu Glu Asp Glu Asp Thr Val
340 345
<210> 41
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 41
Met Glu Thr Ala Ala Thr Met Thr His Ala Phe Ile Ser Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Ala Glu Ala Thr Ile Arg Gly Leu Leu Ser Ala Ala Ala Val Val
20 25 30
Thr Pro Ala Ala Asp Ala His Gly Glu Thr Ser Asn Ala Thr Thr Ala
35 40 45
Gly Ala Asp His Gly Cys Phe Pro His Ile Asn His Gly Thr Glu Leu
50 55 60
Gln His Lys Ile Ala Val Gly Leu Gln Trp Phe Thr Val Ile Val Ala
65 70 75 80
Ile Val Gln Leu Ile Phe Tyr Gly Trp His Ser Phe Lys Ala Thr Thr
85 90 95
Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Cys Val Ile Glu Leu Val Lys Cys Phe
100 105 110
Ile Glu Leu Phe His Glu Val Asp Ser Pro Ala Thr Val Tyr Gln Thr
115 120 125
Asn Gly Gly Ala Val Ile Trp Leu Arg Tyr Ser Met Trp Leu Leu Thr
130 135 140
Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu His Glu
145 150 155 160
Glu Tyr Ser Lys Arg Thr Met Thr Ile Leu Val Thr Asp Ile Gly Asn
165 170 175
Ile Val Trp Gly Ile Thr Ala Ala Phe Thr Lys Gly Pro Leu Lys Ile
180 185 190
Leu Phe Phe Met Ile Gly Leu Phe Tyr Gly Val Thr Cys Phe Phe Gln
195 200 205
Ile Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ser Tyr His Thr Leu Pro Lys Gly Val
210 215 220
Cys Arg Lys Ile Cys Lys Ile Met Ala Tyr Val Phe Phe Cys Ser Trp
225 230 235 240
Leu Met Phe Pro Val Met Phe Ile Ala Gly His Glu Gly Leu Gly Leu
245 250 255
Ile Thr Pro Tyr Thr Ser Gly Ile Gly His Leu Ile Leu Asp Leu Ile
260 265 270
Ser Lys Asn Thr Trp Gly Phe Leu Gly His His Leu Arg Val Lys Ile
275 280 285
His Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Thr Ile
290 295 300
Asn Val Ala Gly Glu Asn Met Glu Ile Glu Thr Phe Val Asp Glu Glu
305 310 315 320
Glu Glu Gly Gly Val
325
<210> 42
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 42
Met Asp Pro Ile Ala Leu Gln Ala Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Asp Gly
1 5 10 15
Arg Pro Glu Thr Leu Trp Leu Gly Ile Gly Thr Leu Leu Met Leu Ile
20 25 30
Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Val Arg Gly Trp Gly Val Thr Asp Lys Asp
35 40 45
Ala Arg Glu Tyr Tyr Ala Val Thr Ile Leu Val Pro Gly Ile Ala Ser
50 55 60
Ala Ala Tyr Leu Ser Met Phe Phe Gly Ile Gly Leu Thr Glu Val Thr
65 70 75 80
Val Gly Gly Glu Met Leu Asp Ile Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
85 90 95
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Ala Lys
100 105 110
Val Asp Arg Val Thr Ile Gly Thr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Met
115 120 125
Ile Val Thr Gly Leu Ile Gly Ala Leu Ser His Thr Ala Ile Ala Arg
130 135 140
Tyr Ser Trp Trp Leu Phe Ser Thr Ile Cys Met Ile Val Val Leu Tyr
145 150 155 160
Phe Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Ala Ala Lys Glu Arg Gly Pro Glu
165 170 175
Val Ala Ser Thr Phe Asn Thr Leu Thr Ala Leu Val Leu Val Leu Trp
180 185 190
Thr Ala Tyr Pro Ile Leu Trp Ile Ile Gly Thr Glu Gly Ala Gly Val
195 200 205
Val Gly Leu Gly Ile Glu Thr Leu Leu Phe Met Val Leu Asp Val Thr
210 215 220
Ala Lys Val Gly Phe Gly Phe Ile Leu Leu Arg Ser Arg Ala Ile Leu
225 230 235 240
Gly Asp Thr Glu Ala Pro Glu Pro Ser Ala Gly Ala Asp Val Ser Ala
245 250 255
Ala Asp
<210> 43
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 43
Met Asp Pro Ile Ala Leu Gln Ala Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Asp Gly
1 5 10 15
Arg Pro Glu Thr Leu Trp Leu Gly Ile Gly Thr Leu Leu Met Leu Ile
20 25 30
Gly Thr Phe Tyr Phe Ile Val Lys Gly Trp Gly Val Thr Asp Lys Glu
35 40 45
Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Ile Thr Ile Leu Val Pro Gly Ile Ala Ser
50 55 60
Ala Ala Tyr Leu Ser Met Phe Phe Gly Ile Gly Leu Thr Glu Val Thr
65 70 75 80
Val Ala Gly Glu Val Leu Asp Ile Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
85 90 95
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Ala Lys
100 105 110
Val Asp Arg Val Ser Ile Gly Thr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Met
115 120 125
Ile Val Thr Gly Leu Ile Gly Ala Leu Ser His Thr Pro Leu Ala Arg
130 135 140
Tyr Ser Trp Trp Leu Phe Ser Thr Ile Cys Met Ile Val Val Leu Tyr
145 150 155 160
Phe Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ala Ala Ala Lys Glu Arg Gly Pro Glu
165 170 175
Val Ala Ser Thr Phe Asn Thr Leu Thr Ala Leu Val Leu Val Leu Trp
180 185 190
Thr Ala Tyr Pro Ile Leu Trp Ile Ile Gly Thr Glu Gly Ala Gly Val
195 200 205
Val Gly Leu Gly Ile Glu Thr Leu Leu Phe Met Val Leu Asp Val Thr
210 215 220
Ala Lys Val Gly Phe Gly Phe Ile Leu Leu Arg Ser Arg Ala Ile Leu
225 230 235 240
Gly Asp Thr Glu Ala Pro Glu Pro
245
<210> 44
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 44
Ala Ser Ser Phe Gly Lys Ala Leu Leu Glu Phe Val Phe Ile Val Phe
1 5 10 15
Ala Cys Ile Thr Leu Leu Leu Gly Ile Asn Ala Ala Lys Ser Lys Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Val Leu Phe Pro Ala Thr Phe Val Thr Gly Ile Ala Ser
35 40 45
Ile Ala Tyr Phe Ser Met Ala Ser Gly Gly Gly Trp Val Ile Ala Pro
50 55 60
Asp Cys Arg Gln Leu Phe Val Ala Arg Tyr Leu Asp Trp Leu Ile Thr
65 70 75 80
Thr Pro Leu Leu Leu Ile Asp Leu Gly Leu Val Ala Gly Val Ser Arg
85 90 95
Trp Asp Ile Met Ala Leu Cys Leu Ser Asp Val Leu Met Ile Ala Thr
100 105 110
Gly Ala Phe Gly Ser Leu Thr Val Gly Asn Val Lys Trp Val Trp Trp
115 120 125
Phe Phe Gly Met Cys Trp Phe Leu His Ile Ile Phe Ala Leu Gly Lys
130 135 140
Ser Trp Ala Glu Ala Ala Lys Ala Lys Gly Gly Asp Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Tyr Ser Lys Ile Ala Gly Ile Thr Val Ile Thr Trp Phe Cys Tyr Pro
165 170 175
Val Val Trp Val Phe Ala Glu Gly Phe Gly Asn Phe Ser Val Thr Phe
180 185 190
Glu Val Leu Ile Tyr Gly Val Leu Asp Val Ile Ser Lys Ala Val Phe
195 200 205
Gly Leu Ile Leu Met Ser Gly Ala Ala Thr Gly Tyr Glu Ser Ile
210 215 220
<210> 45
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 45
Met Ala Pro Leu Ala Gln Asp Trp Thr Tyr Ala Glu Trp Ser Ala Val
1 5 10 15
Tyr Asn Ala Leu Ser Phe Gly Ile Ala Gly Met Gly Ser Ala Thr Ile
20 25 30
Phe Phe Trp Leu Gln Leu Pro Asn Val Thr Lys Asn Tyr Arg Thr Ala
35 40 45
Leu Thr Ile Thr Gly Ile Val Thr Leu Ile Ala Thr Tyr His Tyr Phe
50 55 60
Arg Ile Phe Asn Ser Trp Val Ala Ala Phe Asn Val Gly Leu Gly Val
65 70 75 80
Asn Gly Ala Tyr Glu Val Thr Val Ser Gly Thr Pro Phe Asn Asp Ala
85 90 95
Tyr Arg Tyr Val Asp Trp Leu Leu Thr Val Pro Leu Leu Leu Val Glu
100 105 110
Leu Ile Leu Val Met Lys Leu Pro Ala Lys Glu Thr Val Cys Leu Ala
115 120 125
Trp Thr Leu Gly Ile Ala Ser Ala Val Met Val Ala Leu Gly Tyr Pro
130 135 140
Gly Glu Ile Gln Asp Asp Leu Ser Val Arg Trp Phe Trp Trp Ala Cys
145 150 155 160
Ala Met Val Pro Phe Val Tyr Val Val Gly Thr Leu Val Val Gly Leu
165 170 175
Gly Ala Ala Thr Ala Lys Gln Pro Glu Gly Val Val Asp Leu Val Ser
180 185 190
Ala Ala Arg Tyr Leu Thr Val Val Ser Trp Leu Thr Tyr Pro Phe Val
195 200 205
Tyr Ile Val Lys Asn Ile Gly Leu Ala Gly Ser Thr Ala Thr Met Tyr
210 215 220
Glu Gln Ile Gly Tyr Ser Ala Ala Asp Val Thr Ala Lys Ala Val Phe
225 230 235 240
Gly Val Leu Ile Trp Ala Ile Ala Asn Ala Lys Ser Arg Leu Glu Glu
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Arg Ala
260
<210> 46
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 46
Met Ile Val Asp Gln Phe Glu Glu Val Leu Met Lys Thr Ser Gln Leu
1 5 10 15
Phe Pro Leu Pro Thr Ala Thr Gln Ser Ala Gln Pro Thr His Val Ala
20 25 30
Pro Val Pro Thr Val Leu Pro Asp Thr Pro Ile Tyr Glu Thr Val Gly
35 40 45
Asp Ser Gly Ser Lys Thr Leu Trp Val Val Phe Val Leu Met Leu Ile
50 55 60
Ala Ser Ala Ala Phe Thr Ala Leu Ser Trp Lys Ile Pro Val Asn Arg
65 70 75 80
Arg Leu Tyr His Val Ile Thr Thr Ile Ile Thr Leu Thr Ala Ala Leu
85 90 95
Ser Tyr Phe Ala Met Ala Thr Gly His Gly Val Ala Leu Asn Lys Ile
100 105 110
Val Ile Arg Thr Gln His Asp His Val Pro Asp Thr Tyr Glu Thr Val
115 120 125
Tyr Arg Gln Val Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Trp Ala Ile Thr Thr
130 135 140
Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Gly Leu Leu Ala Gly Met Ser Gly Ala
145 150 155 160
His Ile Phe Met Ala Ile Val Ala Asp Leu Ile Met Val Leu Thr Gly
165 170 175
Leu Phe Ala Ala Phe Gly Ser Glu Gly Thr Pro Gln Lys Trp Gly Trp
180 185 190
Tyr Thr Ile Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Phe Val Val Trp His Leu Val
195 200 205
Leu Asn Gly Gly Ala Asn Ala Arg Val Lys Gly Glu Lys Leu Arg Ser
210 215 220
Phe Phe Val Ala Ile Gly Ala Tyr Thr Leu Ile Leu Trp Thr Ala Tyr
225 230 235 240
Pro Ile Val Trp Gly Leu Ala Asp Gly Ala Arg Lys Ile Gly Val Asp
245 250 255
Gly Glu Ile Ile Ala Tyr Ala Val Leu Asp Val Leu Ala Lys Gly Val
260 265 270
Phe Gly Ala Trp Leu Leu Val Thr His Ala Asn Leu Arg Glu Ser Asp
275 280 285
Val Glu Leu Asn Gly Phe Trp Ala Asn Gly Leu Asn Arg Glu Gly Ala
290 295 300
Ile Arg Ile Gly Glu Asp Asp Gly Ala
305 310
<210> 47
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 47
Val Thr Gln Arg Glu Leu Phe Glu Phe Val Leu Asn Asp Pro Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ser Ser Leu Tyr Ile Asn Ile Ala Leu Ala Gly Leu Ser Ile Leu
20 25 30
Leu Phe Val Phe Met Thr Arg Gly Leu Asp Asp Pro Arg Ala Lys Leu
35 40 45
Ile Ala Val Ser Thr Ile Leu Val Pro Val Val Ser Ile Ala Ser Tyr
50 55 60
Thr Gly Leu Ala Ser Gly Leu Thr Ile Ser Val Leu Glu Met Pro Ala
65 70 75 80
Gly His Phe Ala Glu Gly Ser Ser Val Met Leu Gly Gly Glu Glu Val
85 90 95
Asp Gly Val Val Thr Met Trp Gly Arg Tyr Leu Thr Trp Ala Leu Ser
100 105 110
Thr Pro Met Ile Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Gly Ser Asn Ala
115 120 125
Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Thr Phe Asp Ile Ala Met Cys Val Thr
130 135 140
Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Thr Ser Ser His Leu Met Arg Trp Phe
145 150 155 160
Trp Tyr Ala Ile Ser Cys Ala Cys Phe Leu Val Val Leu Tyr Ile Leu
165 170 175
Leu Val Glu Trp Ala Gln Asp Ala Lys Ala Ala Gly Thr Ala Asp Met
180 185 190
Phe Asn Thr Leu Lys Leu Leu Thr Val Val Met Trp Leu Gly Tyr Pro
195 200 205
Ile Val Trp Ala Leu Gly Val Glu Gly Ile Ala Val Leu Pro Val Gly
210 215 220
Val Thr Ser Trp Gly Tyr Ser Phe Leu Asp Ile Val Ala Lys Tyr Ile
225 230 235 240
Phe Ala Phe Leu Leu Leu Asn Tyr Leu Thr Ser Asn Glu Ser Val Val
245 250 255
Ser Gly Ser Ile Leu Asp Val Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Ala Asp
260 265 270
Asp
<210> 48
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 48
Met Arg Arg Arg Glu Ser Gln Leu Ala Tyr Leu Cys Leu Phe Val Leu
1 5 10 15
Ile Ala Gly Trp Ala Pro Arg Leu Thr Glu Ser Ala Pro Asp Leu Ala
20 25 30
Glu Arg Arg Pro Pro Ser Glu Arg Asn Thr Pro Tyr Ala Asn Ile Lys
35 40 45
Lys Val Pro Asn Ile Thr Glu Pro Asn Ala Asn Val Gln Leu Asp Gly
50 55 60
Trp Ala Leu Tyr Gln Asp Phe Tyr Tyr Leu Ala Gly Ser Asp Lys Glu
65 70 75 80
Trp Val Val Gly Pro Ser Asp Gln Cys Tyr Cys Arg Ala Trp Ser Lys
85 90 95
Ser His Gly Thr Asp Arg Glu Gly Glu Ala Ala Val Val Trp Ala Tyr
100 105 110
Ile Val Phe Ala Ile Cys Ile Val Gln Leu Val Tyr Phe Met Phe Ala
115 120 125
Ala Trp Lys Ala Thr Val Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Asn Ile Ile
130 135 140
Glu Leu Val His Ile Ala Leu Val Ile Trp Val Glu Phe Asp Lys Pro
145 150 155 160
Ala Met Leu Tyr Leu Asn Asp Gly Gln Met Val Pro Trp Leu Arg Tyr
165 170 175
Ser Ala Trp Leu Leu Ser Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn
180 185 190
Leu Thr Gly Leu Lys Gly Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Leu
195 200 205
Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile Val Phe Gly Thr Ser Ala Ala Leu Ala
210 215 220
Pro Pro Asn His Val Lys Val Ile Leu Phe Thr Ile Gly Leu Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Leu Phe Thr Phe Phe Thr Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Tyr
245 250 255
His Thr Val Pro Lys Gly Gln Cys Arg Asn Leu Val Arg Ala Met Ala
260 265 270
Trp Thr Tyr Phe Val Ser Trp Ala Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu
275 280 285
Gly Arg Glu Gly Phe Gly His Ile Thr Tyr Phe Gly Ser Ser Ile Gly
290 295 300
His Phe Ile Leu Glu Ile Phe Ser Lys Asn Leu Trp Ser Leu Leu Gly
305 310 315 320
His Gly Leu Arg Tyr Arg Ile Arg Gln His Ile Ile Ile His Gly Asn
325 330 335
Leu Thr Lys Lys Asn Lys Ile Asn Ile Ala Gly Asp Asn Val Glu Val
340 345 350
Glu Glu Tyr Val Asp Ser Asn Asp Lys Asp Ser Asp Val
355 360 365
<210> 49
<211> 1084
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 49
Met Asp Pro Ile Ala Leu Gln Ala Gly Tyr Asp Leu Leu Gly Asp Gly
1 5 10 15
Arg Pro Glu Thr Leu Trp Leu Gly Ile Gly Thr Leu Leu Met Leu Ile
20 25 30
Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Val Arg Gly Trp Gly Val Thr Asp Lys Asp
35 40 45
Ala Arg Glu Tyr Tyr Ala Val Thr Ile Leu Val Pro Gly Ile Ala Ser
50 55 60
Ala Ala Tyr Leu Ser Met Phe Phe Gly Ile Gly Leu Thr Glu Val Thr
65 70 75 80
Val Gly Gly Glu Met Leu Asp Ile Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ala Asp Trp
85 90 95
Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Ala Lys
100 105 110
Val Asp Arg Val Thr Ile Gly Thr Leu Val Gly Val Asp Ala Leu Met
115 120 125
Ile Val Thr Gly Leu Ile Gly Ala Leu Ser His Thr Ala Ile Ala Arg
130 135 140
Tyr Ser Trp Trp Leu Phe Ser Thr Ile Cys Met Ile Val Val Leu Tyr
145 150 155 160
Phe Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Ala Ala Lys Glu Arg Gly Pro Glu
165 170 175
Val Ala Ser Thr Phe Asn Thr Leu Thr Ala Leu Val Leu Val Leu Trp
180 185 190
Thr Ala Tyr Pro Ile Leu Trp Ile Ile Gly Thr Glu Gly Ala Gly Val
195 200 205
Val Gly Leu Gly Ile Glu Thr Leu Leu Phe Met Val Leu Asp Val Thr
210 215 220
Ala Lys Val Gly Phe Gly Phe Ile Leu Leu Arg Ser Arg Ala Ile Leu
225 230 235 240
Gly Asp Thr Glu Ala Pro Glu Pro Ser Ala Gly Ala Asp Val Ser Ala
245 250 255
Ala Asp Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly Glu Tyr Ile Pro Leu Asp
260 265 270
Gln Ile Asp Ile Asn Val Gly Ala Pro Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
275 280 285
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
290 295 300
Asp Leu Lys Glu Ser Pro Ser Glu Gly Ser Leu Gln Pro Ser Ser Ile
305 310 315 320
Gln Ile Phe Ala Asn Thr Ser Thr Leu His Gly Ile Arg His Ile Phe
325 330 335
Val Tyr Gly Pro Leu Thr Ile Arg Arg Val Leu Trp Ala Val Ala Phe
340 345 350
Val Gly Ser Leu Gly Leu Leu Leu Val Glu Ser Ser Glu Arg Val Ser
355 360 365
Tyr Tyr Phe Ser Tyr Gln His Val Thr Lys Val Asp Glu Val Val Ala
370 375 380
Gln Ser Leu Val Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Leu Asn Ser Gly
385 390 395 400
Phe Arg Phe Ser Arg Leu Thr Thr Asn Asp Leu Tyr His Ala Gly Glu
405 410 415
Leu Leu Ala Leu Leu Asp Val Asn Leu Gln Ile Pro Asp Pro His Leu
420 425 430
Ala Asp Pro Thr Val Leu Glu Ala Leu Arg Gln Lys Ala Asn Phe Lys
435 440 445
His Tyr Lys Pro Lys Gln Phe Ser Met Leu Glu Phe Leu His Arg Val
450 455 460
Gly His Asp Leu Lys Asp Met Met Leu Tyr Cys Lys Phe Lys Gly Gln
465 470 475 480
Glu Cys Gly His Gln Asp Phe Thr Thr Val Phe Thr Lys Tyr Gly Lys
485 490 495
Cys Tyr Met Phe Asn Ser Gly Glu Asp Gly Lys Pro Leu Leu Thr Thr
500 505 510
Val Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp Ile Gln
515 520 525
Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Ile Trp Gly Glu Thr Glu Glu Thr Thr Phe
530 535 540
Glu Ala Gly Val Lys Val Gln Ile His Ser Gln Ser Glu Pro Pro Phe
545 550 555 560
Ile Gln Glu Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln Thr Phe Val
565 570 575
Ala Thr Gln Glu Gln Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Pro Pro Trp Gly Glu
580 585 590
Cys Arg Ser Ser Glu Met Gly Leu Asp Phe Phe Pro Val Tyr Ser Ile
595 600 605
Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Ile Val Glu Asn Cys
610 615 620
Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala Pro Phe Cys Thr Pro
625 630 635 640
Glu Gln His Lys Glu Cys Ala Glu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Ala Glu
645 650 655
Lys Asp Ser Asn Tyr Cys Leu Cys Arg Thr Pro Cys Asn Leu Thr Arg
660 665 670
Tyr Asn Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro Ser Lys Thr Ser Ala
675 680 685
Lys Tyr Leu Glu Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu Lys Tyr Ile Ser Glu
690 695 700
Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Ala Leu Asn Tyr Glu Thr
705 710 715 720
Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Val Ala Ala Leu Leu Gly Asp Ile
725 730 735
Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser Leu Leu Thr Ile Leu
740 745 750
Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Tyr Glu Leu Ile Lys Glu Lys Leu Leu Asp
755 760 765
Leu Leu Gly Lys Glu Glu Glu Glu Gly Ser His Asp Glu Asn Met Ser
770 775 780
Thr Cys Asp Thr Met Pro Asn His Ser Glu Thr Ile Ser His Thr Val
785 790 795 800
Asn Val Pro Leu Gln Thr Ala Leu Gly Thr Leu Glu Glu Ile Ala Cys
805 810 815
Ala Ala Ala Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly Glu Tyr Ile Pro Leu
820 825 830
Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr
835 840 845
Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His
850 855 860
Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys
865 870 875 880
Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp
885 890 895
Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg
900 905 910
Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro
915 920 925
Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn
930 935 940
Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn
945 950 955 960
Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Arg Glu Asp Gly Asn Ile Leu
965 970 975
Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met
980 985 990
Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His
995 1000 1005
Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln
1010 1015 1020
Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His
1025 1030 1035
Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys
1040 1045 1050
Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile
1055 1060 1065
Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Phe Cys Tyr Glu Asn Glu
1070 1075 1080
Val
<210> 50
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 50
Met Val Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val
20 25 30
Pro Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His
35 40 45
Glu Arg
50
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 51
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly
1 5 10
<210> 52
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 52
Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile
1 5 10 15
Asp Ile Asn Val
20
<210> 53
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 53
Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser
20 25
<210> 54
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 54
Met Ala Gly His Ser Asn Ser Met Ala Leu Phe Ser Phe Ser Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Cys Ser Gly Val Leu Gly Thr Glu Phe
20 25
<210> 55
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 55
Met Gly Leu Arg Ala Leu Met Leu Trp Leu Leu Ala Ala Ala Gly Leu
1 5 10 15
Val Arg Glu Ser Leu Gln Gly
20
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 56
Met Arg Gly Thr Pro Leu Leu Leu Val Val Ser Leu Phe Ser Leu Leu
1 5 10 15
Gln Asp
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 57
Val Lys Glu Ser Leu
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 58
Val Leu Gly Ser Leu
1 5
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 59
Asn Ala Asn Ser Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Val Ala Leu Thr Ser Lys
1 5 10 15
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 60
Phe Xaa Tyr Glu Asn Glu
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 61
Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Val
1 5
<210> 62
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 62
Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile
1 5 10 15
Asp Ile Asn

Claims (51)

1.一种变体光活化多肽，其包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列包含E163S取代，并且其中所述变体光活化多肽与SEQ ID NO:1的光活化多肽相比表现出增加至至少5倍的动力学。
2.如权利要求1所述的变体光活化多肽，所述变体光活化多肽包含异源膜运输信号。
3.如权利要求1所述的变体光活化多肽，其中所述异源膜运输信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDIN(SEQ ID NO:62)。
4.如权利要求1所述的变体光活化多肽，所述变体光活化多肽包含内质网(ER)输出信号。
5.如权利要求4所述的变体光活化多肽，其中所述ER输出信号包含氨基酸序列FCYENEV(SEQ ID NO:61)。
6.如权利要求1所述的变体光活化多肽，其中所述变体光活化多肽包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的变体光活化多肽，其中所述变体光活化多肽包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的变体光活化多肽，其中变体光活化多肽，当存在于真核细胞中时并且当以具有600nm至700nm的波长的光激活时，以5Hz至20Hz的频率诱发动作电位。
9.如权利要求1所述的变体光活化多肽，其中所述变体光活化多肽与SEQ ID NO:1的光活化多肽相比表现出增加至至少10倍的动力学。
10.一种核酸，其包含编码权利要求1-8中任一项所述的变体光活化多肽的核苷酸序列。
11.如权利要求10所述的核酸，其中所述核苷酸序列可操作地连接至在真核细胞中具有功能的转录控制元件。
12.如权利要求11所述的核酸，其中所述转录控制元件是组成型启动子。
13.如权利要求11所述的核酸，其中所述转录控制元件是诱导型启动子。
14.如权利要求11所述的核酸，其中所述转录控制元件是神经元特异性启动子。
15.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求10-14中任一项所述的核酸。
16.如权利要求13所述的重组表达载体，其中所述表达载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。
17.一种哺乳动物细胞，所述细胞在细胞膜中包含权利要求1-9中任一项所述的变体光活化多肽，其中所述变体光活化多肽响应于光，其中所述变体光活化多肽能够在用具有约600nm至约700nm的波长的光照射所述细胞时介导所述细胞中的去极化电流。
18.如权利要求17所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是神经元细胞。
19.一种响应于光刺激而调节哺乳动物细胞的电压电位的方法，所述方法包括暴露在所述细胞的质膜中包含权利要求1-9中任一项所述的变体光活化多肽的哺乳动物细胞，其中响应于对光刺激的暴露，所述细胞的电压电位被调节。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述细胞是神经元细胞、心脏细胞或干细胞。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述细胞在体外。
22.如权利要求19或20所述的方法，其中所述细胞在体内。
23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述光具有600nm至700nm的波长。
24.一种调节哺乳动物细胞的活动的方法，所述哺乳动物细胞包含权利要求1-9中任一项所述的变体光活化多肽，所述方法包括用光激活所述变体光活化多肽。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述光具有600nm至700nm的波长。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是神经元细胞、心脏细胞或干细胞。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞在体内。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞表达遗传编码的钙指示剂(GECI)。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述GECI包含与SEQ ID NO:7-28中任一个所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
30.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞还包含超极化光响应性多肽。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述超极化光响应性多肽包含与SEQ ID NO:42-48中任一个所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
32.一种装置，所述装置包括：
a)容器，其包含权利要求1-9中任一项所述的变体光响应性多肽、权利要求10-14中任一项所述的核酸或权利要求15或16所述的重组载体；以及
b)光源。
33.如权利要求32所述的装置，其中所述装置是植入式。
34.如权利要求32或权利要求33所述的装置，其中所述光源是光纤。
35.一种系统，所述系统包括：
a)容器，其包含权利要求1-9中任一项所述的变体光响应性多肽、权利要求10-14中任一项所述的核酸或权利要求15或16所述的重组载体；
b)植入式光学照射器，其被配置来在植入邻近被靶向的组织结构的位置之后将光递送至所述被靶向的组织结构；以及
c)可操作地耦合至所述植入式光学照射器的光源；
d)控制器；
e)电源；以及
f)植入式照度传感器，
其中所述控制器至少部分地基于来自所述植入式照度传感器的输出信号，使所述电源允许电流流至所述光源，以使光子发射至所述植入式光致动器，
其中所述植入式照度传感器被配置使得其可被定位来捕获至少一部分由所述植入式光照射器引导朝向所述靶组织结构的光子。
36.如权利要求35所述的系统，其中所述植入式照度传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。
37.如权利要求35所述的系统，其中所述植入式输入传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。
38.如权利要求35所述的系统，所述系统还包括生理传感器，其被配置来产生输出信号，所述输出信号与被认为至少部分地响应于所述靶组织结构的光输入而可变的生理参数相关。
39.如权利要求38所述的系统，其中所述生理传感器选自由以下组成的组：肌电图传感器、神经电图传感器、脑电图传感器、心电图传感器、压力传感器、温度传感器、化学计量传感器、运动传感器、加速度计，陀螺仪、应变传感器、阻抗传感器和电容传感器。
40.一种治疗方法，其包括将具有激活波长的光递送至有需要的个体中的靶细胞或组织，其中所述靶细胞或组织在所述靶细胞的质膜或所述靶组织中的细胞的质膜中包含权利要求1-9中任一项所述的变体光活化多肽，其中所述递送激活所述变体光活化多肽并使所述靶细胞或所述靶组织中的细胞去极化。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述去极化治疗所述个体中的神经学疾病或病症。
42.一种用于照射个体的靶组织的方法，其中所述靶组织结构在所述靶组织中的细胞的质膜中包含权利要求1-9中任一项所述的变体光活化多肽，所述方法包括：
a)提供被配置来在植入邻近所述靶组织的位置之后将光递送至所述靶组织的植入式光学照射器；以及
b)将所述植入式光学照射器可操作地耦合至光源、控制器、电源和植入式照度传感器，使得所述控制器至少部分地基于来自所述植入式照度传感器的输出信号，使所述电源允许电流流至所述光源以使光子发射至所述植入式光致动器，其中所述植入式照度传感器被定位而使得其捕获至少一部分由所述植入式光照射器引导朝向所述靶组织的光子。
43.如权利要求42所述的方法，所述方法还包括提供被配置来产生输出信号的植入式输入传感器，所述输出信号在所述光子与所述靶组织交汇之前在光子发射位置处与所述植入式光学照射器的照度相关。
44.如权利要求43所述的方法，所述方法还包括将所述控制器可操作地耦合至所述植入式输入传感器，使得其可比较来自所述植入式输入传感器和所述植入式照度传感器两者的输出信号以确定是否正在经历意外的损失。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述植入式照度传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述植入式输入传感器选自由以下组成的组：光电池、光电二极管、热电传感器、光敏电阻器、光电导体、光电晶体管和光电传感器。
47.一种诱导哺乳动物受试者的情境记忆提取的方法，所述方法包括在所述哺乳动物受试者中将具有600nm至700nm的波长的光递送至神经元的单突触前额叶向海马的投射，其中所述投射包含权利要求1-9中任一项所述的变体光响应性多肽，并且其中将光递送至所述投射使所述投射去极化并诱导情境记忆提取。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述前额叶向海马的投射是前额叶向海马的投射。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述前额叶向海马的投射是前扣带向海马的投射。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述投射是朝向海马的锥体CA3/CA1细胞。
51.如权利要求47所述的方法，其中所述前扣带的神经元包含所述变体光响应性多肽。
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