CN101663066A - 近红外电磁改变稳态细胞膜电位 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于应用近红外光能和放射量以通过光去极化效应改变所有受辐射细胞的生物能稳态跨膜电位和线粒体电位(ΔΨ－稳态)的系统和方法。这种去极化作用随之而来导致受辐射的线粒体和细胞质膜的跨膜电位ΔΨ的绝对值降低。可通过降低膜电位ΔΨ、附带弱化质子动力势Δp并关联降低磷酸化势ΔGp，使得很多细胞合成代谢反应和耐药机制作用功能降低和/或削弱。在暴露于辐射的区域内，细菌、真菌和哺乳动物细胞中将一致出现膜电位ΔΨ的降低。这种膜去极化作用提供增强抗菌剂、抗真菌剂和/或抗肿瘤药物仅抵抗被靶向的不希望有的细胞的能力。

Description

近红外电磁改变稳态细胞膜电位

发明领域

本发明总体上涉及用于以所选择的能量和放射量产生红外光辐射的方法和系统，该能量和放射量将通过去极化效应来改变受辐射的细胞的生物能稳态跨膜电位和线粒体电位，更具体地，涉及用于膜去极化以增强抗微生物和抗真菌化合物靶向细菌和/或真菌和/或癌症细胞的方法和系统。

发明背景

细菌、真菌和其它生物污染物对抗微生物药物抗性的普遍提高给人类的生存构成了令人忧虑的威胁。自从磺胺药物(磺胺(sulfanilamide)，在1936年首次使用)和青霉素(penicillin)(1942，PfizerPharmaceuticals)问世以来，全球各地开发了各种各样数量庞大抗菌药物，这为抗性污染物和病原体的实现和传播创造了有效环境。某些抗性污染物具有特别的流行病学意义，因为其在医院和一般环境中占优势。抗生素的普遍使用不仅促使抗性细菌的产生，例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus)(MRSA)和万古霉素抗性肠球茵(vancomycin-resistant enterococci)(VRE)，而且造成真菌生物感染(霉菌病)，例如念珠菌属(Candida)的有利条件。

尽管存在作为杀微生物剂的有效抗真菌药物(例如两性霉素(amphotericin)B(AmB))，但可归因于念珠菌血症的死亡率仍为约38％。在某些情况下，为了治疗耐药性真菌，必须给予大剂量AmB，其频繁使用导致肾毒性和其它有害作用。此外，过度使用抗微生物剂或抗生素可导致在活生物体内的生物积聚，这也可能对哺乳动物细胞有细胞毒性。考虑到世界人口的不断增加和耐药性细菌和真菌的流行，预期在可预知的未来细菌或真菌感染发生率将继续上升不止。

目前，用于细菌和真菌感染的可用的疗法包括给予抗细菌和抗真菌治疗剂，或者，在某些情况下，施用外科手术切除受感染的区域。因为单独的抗细菌和抗真菌疗法很少能治愈，尤其是考虑到新近出现的耐药性病原体，而高度破坏外貌的手术疗法极度不健全，因此开发新的治疗或预防微生物感染的策略势在必行。

因此，需要用于可在给定的靶位点降低细菌或真菌感染风险而对除靶向的细菌和真菌(生物污染物)外的生物部分(例如哺乳动物组织、细胞或某些生化制品例如蛋白制品)没有无法耐受的风险和/或无法耐受的有害作用的方法和系统。

发明简述

本发明涉及用于降低对减轻或消除微生物和/或肿瘤相关病理必需的抗微生物分子(抗微生物药物)和/或抗肿瘤分子(抗肿瘤药物)的最小抑制浓度(MIC)的方法和系统，由此本来在人安全剂量下不起作用的药物将可再次用作辅助治疗。根据本发明方法和系统，使用以所选择的能量和放射量(dosimetry)的近红外光辐射(本文称为NIMELS，代表“近红外除菌系统”)在受辐射的区域内引起所有膜的去极化作用，这将改变受辐射的细胞的膜电位ΔΨ的绝对值。

本发明其它特点和优势将在以下对实施方案的详细说明中提出，部分从说明中就显而易见，或可通过本发明实践学会。本发明这样的特点和优势将通过特别是在书面说明书和所附权利要求中指出的系统、方法和设备来实现和达到。

附图简述

当和附图一起阅读时，可更充分地根据以下说明书理解本发明各方面，本质上应将这些附图看作例证性而非限制性。附图不一定成比例，而重点放在本发明原理上。在附图中：

图1显示典型的磷脂双层。

图2显示磷脂的化学结构。

图3显示磷脂双层膜偶极效应(Ψd)。

图4A显示在NIMELS辐射之前具有稳态跨膜电位的细菌细胞质膜、哺乳动物线粒体膜或真菌线粒体膜的磷脂双层。图4B显示在NIMELS辐射后的细菌细胞质膜、哺乳动物线粒体膜或真菌线粒体膜的瞬态细胞质膜电位。

图5显示跨膜蛋白嵌入其中的磷脂双层。

图6显示对电子传递和质子泵的一般阐述。

图7显示在真菌和哺乳动物细胞中对应于ΔΨ-线-真菌(ΔΨ-mito-fungi)或ΔΨ-线-哺(ΔΨ-mito-mam)的线粒体膜的一般视图。

图8显示NIMELS辐射(以单一放射量)对MRSA跨膜电位的效应，其通过在激光辐射后将对照和激光处理样品中绿荧光发射强度作为以分钟计的时间的函数来测量。

图9显示NIMELS辐射(以各种放射量)对白色念珠菌(C.albicans)跨膜电位的效应，其通过激光处理样品相对于对照样品的绿荧光发射强度百分比降低来测量。

图10显示通过在对照和激光处理样品中的红荧光发射强度测量的NIMELS辐射(以单一放射量)对白色念珠菌线粒体膜电位的效应；和通过在对照和激光处理样品中的红荧光对绿荧光的比率测量的NIMELS辐射(以单一放射量)对白色念珠菌线粒体膜电位的效应。

图11显示通过在对照和激光处理样品中的红荧光发射强度测量的NIMELS辐射(以单一放射量)对人胚肾细胞线粒体膜电位的效应；和通过在对照和激光处理样品中的红荧光对绿荧光的比率测量的NIMELS辐射(以单一放射量)对人胚肾细胞线粒体膜电位的效应。

图12显示在MRSA中总谷胱甘肽浓度的降低，因为其与这些细胞中NIMELS辐射(以几种放射量)所导致的活性氧类别(reactiveoxygen species)(ROS)的产生相关联，激光处理样品中谷胱甘肽浓度的降低以相对于对照的百分比来表示。

图13显示在白色念珠菌中总谷胱甘肽浓度的降低，因为其与这些细胞中NIMELS辐射(以几种放射量)所导致的活性氧类别(ROS)的产生相关联，激光处理样品中谷胱甘肽浓度的降低以相对于对照的百分比来表示。

图14显示在人胚肾细胞中总谷胱甘肽浓度的降低，因为其与这些细胞中NIMELS辐射(以两种不同放射量)所导致的活性氧类别(ROS)的产生相关联，激光处理样品中谷胱甘肽浓度的降低以相对于对照的百分比来表示。

图15显示NIMELS和甲氧西林在MRSA菌落生长抑制中的协同作用，数据显示甲氧西林的作用被亚致死的NIMELS放射量增强。

图16显示NIMELS和杆菌肽(bacitracin)在MRSA菌落生长抑制中的协同作用，箭头指出在所示两个样品中MRSA菌落生长或不长，图像显示杆菌肽的作用被亚致死的NIMELS放射量增强。

图17显示描绘根据实验数据显示的NIMELS与甲氧西林、青霉素和红霉素(erythromycin)对MRSA菌落生长抑制的协同作用的条形图。

图18是按本发明方法治疗的典型甲癣患者的指甲外观随时间改善的组图。图A显示基线，即治疗前受感染的脚趾甲；图B显示治疗后60天的脚趾甲；图C显示治疗后80天的脚趾甲；而图D显示治疗后100天的脚趾甲。

图19阐明在用亚致死NIMELS辐射的大肠杆菌(E.coli)中膜电位降低的检测。

图20阐明用亚致死NIMELS辐射的大肠杆菌中谷胱甘肽降低的检测。

尽管在附图中描绘了并在附图有关说明中阐述了某些实施方案，但本领域技术人员应该了解，所描述的实施方案为例示性的，在本发明范围内可以设想并实践其所示变化以及本文所述的其它实施方案。

发明详述

除非内容明确另外规定，否则本说明书中所用的单数形式“一个”、“一种”、“所述”也包括它们所指术语的复数形式。例如，提及“NIMELS波长”可包括在所述NIMELS波长范围内的任何波长以及这样的波长的组合。

除非明确另外指出，否则本文所用措辞“或”以“同兼”的“和/或”的理解来使用，而不能理解为“互异”的“不是/就是”。

本文所用术语“约”意即大约、在附近、粗略或左右。当术语“约”与数字范围联合使用时，其通过扩充所提出的数值的上下界线来修饰范围。一般而言，本文所用术语“约”以高于和低于所述值的20％的变化来修饰数值。

本发明涉及用于降低对减轻或消除微生物和/或肿瘤相关病理必需的抗微生物分子(药物)和/或抗肿瘤分子(药物)的最小抑制浓度(MIC)的方法和系统，由此本来在人安全剂量下不起作用的药物可再次用作辅助治疗。根据本发明方法和系统，使用以所选择的能量和放射量的近红外光辐射(本文称为NIMELS，代表“近红外除菌系统”)在受辐射的区域内引起膜的去极化作用，这将改变受辐射的细胞的膜电位ΔΨ的绝对值。

这一改变的ΔΨ将引起质子动力势Δp和所有受影响的膜的生物能学的连带弱化。因此，NIMELS辐射的作用(NIMELS效应)可增强抵抗微生物感染及其引起的对人宿主的伤害的现有抗微生物分子。这些作用将使得很多细胞合成代谢反应(例如细胞壁形成)和需要化学渗透电化学能(chemiosmotic electrochemical energy)来发挥作用的药物抗性机制(例如流出泵)作用减弱。因此，任何膜相关的细胞抗性机制或利用膜电位ΔΨ、质子动力势Δp或磷酸化势ΔGp作为其功能能源需要的合成代谢反应，将受到本发明方法和系统的影响。

本发明方法和系统利用光辐射来增强抗微生物药物和/或抗真菌药物仅抵抗被靶向的不合需要的细胞(例如MRSA或皮肤念珠菌感染)，这种选择性因为哺乳动物细胞通常不受意欲损伤细菌或真菌细胞的治疗(使用分子或药物)的影响这一事实而成为可能。

在例示性实施方案中，依照本发明方法和系统使用的应用光辐射包括如本文所述以NIMELS放射量的约850nm-约900nm范围内的一种或多种波长。在一个方面，使用约865nm-约875nm的波长。在另一方面，这样的应用辐射具有以NIMELS放射量的约905nm-约945nm的波长。在一个方面，这样应用光辐射具有约925nm-约935nm的波长。在特别方面，可采用930nm的波长(或包括930nm在内的狭窄波长范围)。在本发明的某些方面，多波长范围分别包括870和930nm。

其生物能系统可受到本发明NIMELS影响的微生物病原体包括微生物(microorganism)，例如细菌、真菌、霉菌、支原体、原生动物和寄生虫。

在一个实施方案中，本发明方法和系统用于治疗、减少和/或消除已知引起皮肤或伤口感染的感染实体，例如葡萄球菌(Staphylococci)和肠球菌。葡萄球菌和肠球菌感染可涉及身体上的几乎任何皮肤表面，已知可引起诸如疖子、痈、大疱性脓疱病和烫伤样皮肤综合征等皮肤病症。金黄色葡萄球菌(S.aureus)也是葡萄球菌食物中毒、肠炎、骨髓炎、中毒性休克综合征、心内膜炎、脑膜炎、肺炎、膀胱炎、败血病和手术后伤口感染的原因。当患者在医院或长期护理机构时可获得葡萄球菌感染。卧病人群和抗生素的普遍使用已导致出现金黄色葡萄球菌的抗生素抗性菌株。这些菌株称作甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)。由MRSA引起的感染常常抵抗多种抗生素(尤其是β-内酰胺(β-lactam))，并且与非MRSA微生物引起的感染相比，随之而来的是明显更高的发病率和死亡率、更高的花费和更长的住院时间。在医院，MRSA感染的风险因素包括鼻孔移生、手术、先前抗生素治疗、送入重病监护室、与移生了MRSA的患者或健康护理人员接触、在医院超过48小时和使用通过皮肤的留置导管或其它医疗器械。

在另一实施方案中，本发明方法和系统用于治疗、减少和/或消除已知为皮肤念珠菌病的感染实体。这些念珠菌感染涉及皮肤，可占据身体的几乎任何皮肤表面。然而，最经常出现在温暖、潮湿或有折痕的区域(例如腋窝和腹股沟)。皮肤念珠菌病极为常见。念珠菌是尿疹最常见的原因，其利用尿布内温暖潮湿的环境。引起这些感染的最常见的菌类为白色念珠菌(Candida albicans)。在患有糖尿病的个体和肥胖者中念珠菌感染也极为平常。念珠菌还可引起指甲感染(称作甲癣)、指甲周围的皮肤感染(甲沟炎)和嘴角周围的感染(称为口角唇炎)。

术语“NIMELS放射量”表示本发明主题波长(subject wavelength)能够产生活性氧类别(“ROS”)，藉此降低靶位点生物污染物的水平的功率密度(W/cm²)和能量密度(J/cm²)(此处1瓦特＝1焦耳/秒)值。该术语还包括辐射细胞以通过降低ΔΨ且同时产生的ROS来提高生物污染物对抗微生物或抗肿瘤药物的敏感度，其中所述污染物对所述药物耐受。可实现该方法而对除所述生物污染物外的宿主对象组织没有无法耐受的风险和/或无法耐受的副作用。

“增强”抗真菌药物或抗细菌药物或抗肿瘤药物，意即本发明方法和系统抵消真菌、细菌或癌症的抗性机制，足以让所述药物以比不存在本方法和系统时更低的浓度抑制所述真菌、细菌或癌症的生长和/或增殖。在基本上完全抗性的情况下，即所述药物对所述细胞没有作用时，增强意即所述药物将抑制病原体细胞的生长和/或增殖，藉此以治疗可接受剂量治疗所述疾病状态。

本文所用术语“微小生物”指在显微镜下可见的生物，定义为太小而不能由人的眼睛看见的生物。为本发明目的，微小生物可为细菌、真菌、古细菌、原生动物等。措辞微生物(microbial)定义为属于或涉及微小生物(microorganisms)。

本文所用术语“细胞膜(或细胞质膜或线粒体膜)”指在所有活细胞中具有共同结构的半渗透脂质双层。其主要含有涉及无数重要细胞过程的蛋白质和脂类。作为本发明靶标的细胞膜具有＞1的蛋白质/脂类比率。换句话说，在污染物(或部分，即宿主组织)中没有一种靶膜含有超过49.99％干重的脂类。

本文所用术语“线粒体”指膜包裹的细胞器，其在大部分真核细胞(哺乳动物细胞和真菌)中存在。线粒体是‘细胞动力工厂’，因为其为真核细胞产生大部分作为细胞化学能源使用的ATP供应。线粒体含有由磷脂双层和蛋白质组成的内膜和外膜。然而，这两种膜具有不同性质。线粒体外膜包裹整个细胞器，具有与真核细胞质膜相似的蛋白质/磷脂比率，而线粒体内膜形成称为嵴的内部隔室，具有与原核生物细胞质膜相似的蛋白质/磷脂比率。这使得诸如细胞色素等蛋白有较大空间恰当有效地起作用。电子传递系统(“ETS”)位于线粒体内膜上。在线粒体内膜里还有将代谢物跨过该膜转运的高度受控的转运蛋白。

本文所用术语“液态镶嵌模型”指一种广泛接受的含多种帮助跨膜转运的嵌入蛋白的结构上和功能上不对称的脂质双层生物膜概念。之所以命名为液态镶嵌模型，是因为磷脂在膜中位置移动几乎毫不费劲(流动性)，并因为膜内存在的所有磷脂、蛋白质和糖蛋白组合使得从外面看起来细胞为镶嵌式图象。该模型基于热力学和功能上的精细平衡。改变膜的热力学影响膜的功能。

本文所用术语“膜偶极电位Ψd”(与跨膜电位ΔΨ形成不同)指在膜表面高度水化的脂类头部(亲水)和双层低极性内部(疏水)之间形成的电位。脂质双层本质上具有由偶极基团和偶极分子的结构组织(主要是磷脂的酯键和水)产生的相当大的膜偶极电位Ψd。Ψd不依赖膜表面的离子，本文将用其来描述5种不同的偶极电位：

1)哺乳动物细胞质膜偶极电位Ψd-质膜-哺(Ψd-plas-mam)；

2)哺乳动物线粒体膜偶极电位Ψd-线-哺(Ψd-mito-mam)；

3)真菌细胞质膜偶极电位Ψd-质膜-真菌(Ψd-plas-fungi)；

4)真菌线粒体膜偶极电位真菌Ψd-线-真菌(Ψd-mito-fungi)；和

5)细菌细胞质膜偶极电位Ψd-质膜-细菌(Ψd-plas-bact)。

本文所用术语“跨膜电位”指被膜分开的水相之间的电势差(量纲为mV)，并表示为符号(ΔΨ)。ΔΨ依赖于膜表面的离子，本文将用其来描述三种不同的细胞质跨膜电位：

1)哺乳动物细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-哺(ΔΨ-plas-mam)；

2)真菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-真菌(ΔΨ-plas-fungi)；

3)细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-细菌(ΔΨ-plas-bact)。

本文所用术语“线粒体跨膜电位”指被线粒体内膜分开的区室之间的电势差(量纲为mV)，本文将用其来描述两种不同的线粒体跨膜电位：

1)哺乳动物线粒体跨膜电位ΔΨ-线-哺(ΔΨ-mito-mam)；

2)真菌线粒体跨膜电位ΔΨ-线-真菌(ΔΨ-mito-fungi)。

在线粒体中，来自营养物质(例如葡萄糖)的势能转化为可用于细胞代谢过程的活化能。在连续的氧化还原反应期间释放的能量使得可将质子(H⁺离子)从线粒体基质泵到内膜空间。结果，随着膜的极化，线粒体膜出现化学渗透电势差(ΔΨ-线-哺或ΔΨ-线-真菌)。ΔΨ-线-哺和ΔΨ-线-真菌是线粒体功能的重要参数，其为细胞能量状态(氧化还原态)提供了直接定量值。

本文所用术语“哺乳动物细胞质跨膜电位(ΔΨ-质膜-哺)”指在哺乳动物细胞细胞质膜的水相之间的电势差。哺乳动物细胞质膜电位不同于主要因H⁺离子(质子)产生的细菌和真菌ΔΨ。在哺乳动物细胞质膜中，ΔΨ的主要促进物是产电的Na⁺/K⁺-ATP酶泵。ΔΨ-质膜-哺由附加的K⁺跨膜扩散(从细胞内到细胞外)量和产电Na⁺/K⁺-ATP酶泵产生。哺乳动物ATP在线粒体中经由质子泵产生。

本文所用术语“真菌细胞质跨膜电位(ΔΨ-质膜-真菌)”指真菌细胞细胞质膜中的电势差。真菌细胞质膜电位由与膜结合的H⁺-ATP酶产生，H⁺-ATP酶是需要ATP以发挥作用的高容量质子泵。这种H⁺-ATP酶泵对于真菌生长和稳定的细胞代谢和维持都需要。真菌ATP在线粒体中产生。

本文所用术语“细菌细胞质跨膜电位(ΔΨ-质膜-细菌)”指细菌细胞细胞质膜中的电势差。在细菌细胞质膜内，由电子和质子(H⁺)跨细菌细胞质膜的稳态流动(迁移)产生细菌细胞质膜电位，迁移因正常电子传递和氧化磷酸化作用而发生。所有电子传递链的共同特征是存在质子泵以造成跨膜质子梯度。尽管细菌没有线粒体，但需氧菌通过本质上与发生在真核线粒体中相同的过程来实施氧化磷酸化作用(产生ATP)。本文所用术语“P-级离子泵”指含有ATP-结合位点(即需要ATP以发挥作用)的跨膜主动转运蛋白集合。在转运过程期间，蛋白亚基之一被磷酸化，认为被转运的离子是经由已磷酸化的亚基来移动。这类离子泵包括哺乳动物细胞质膜中的Na⁺/K⁺-ATP酶泵，其维持典型动物细胞的Na⁺和K⁺电化学电位(ΔNa⁺/K⁺)和pH梯度。P-级离子泵的另一重要成员将质子(H⁺离子)从细胞中运出并将K⁺离子运进细胞。

本文所用术语“Na⁺/K⁺ATP酶”指存在于所有动物细胞细胞质膜的P-级离子泵，其将水解一个ATP分子与运出三个Na⁺离子及运入两个K⁺离子联系在一起，Na⁺离子运出及K⁺离子运入维持典型动物细胞的Na⁺和K⁺电化学电位和pH梯度。真菌细胞(真核细胞同样)中的内部负膜电位通过ATP提供动力的不同的质子泵将H⁺离子运出细胞外来产生。

本文所用术语“离子交换剂和离子通道”指哺乳动物细胞中不依赖ATP系统并有助于建立细胞质膜电位的跨膜蛋白。

本文所用术语“氧化还原(氧化/还原反应的缩写)”阐述了例如在细胞中通过一系列的极为复杂的涉及电子传递的过程来使糖氧化的复杂过程。氧化还原反应是化学反应，其中电子从供体分子转移到受体分子。术语氧化还原来自于还原作用和氧化作用两个概念，可以以简单的术语来解释：

氧化作用描述分子、原子或离子的电子丢失；

还原作用描述分子、原子或离子的电子获得。

本文所用术语“氧化还原态”阐述所述细胞的氧化还原环境(或氧化应激水平)。

本文所用术语“稳态细胞质跨膜电位(ΔΨ-稳态)”指在按照本发明方法和系统辐射前，哺乳动物、真菌或细菌细胞的定量的细胞质膜电位，其将在不存在这样的辐射下继续存在。

例如，在正常电子传递和氧化磷酸化作用期间发生的电子和质子跨细菌细胞膜的稳态流动将处于稳态，因为穿过膜的常规氧化还原反应发生恒定流动。与此相反，对这种氧化还原态的任何改变将产生瞬态膜电位。本文将使用ΔΨ-稳态来阐述三种(3)不同的稳态细胞质跨膜电位，其基于物种为：

1)稳态哺乳动物细胞质跨膜电位ΔΨ-稳态-哺(ΔΨ-steady-mam)；

2)稳态真菌细胞质跨膜电位ΔΨ-稳态-真菌(ΔΨ-steady-fungi)；

3)稳态细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-稳态-细菌(ΔΨ-steady-bact)。

本文所用术语“瞬态细胞质膜电位(ΔΨ-瞬态)”指在按照本发明方法和系统辐射后哺乳动物、真菌或细菌细胞的细胞质膜电位，藉此辐射改变了细胞质膜的生物能学。在细菌中，ΔΨ-瞬态也将改变该细胞的氧化还原态，因为所述细胞质膜是ETS和细胞色素所在之处。ΔΨ-瞬态是在没有用本发明方法的辐射时将不出现的状态。本文将使用ΔΨ-瞬态来阐述三种(3)不同的瞬态细胞质跨膜电位，其基于物种为：

1)瞬态哺乳动物细胞质跨膜电位ΔΨ-瞬态-哺(ΔΨ-tran-mam)；

2)瞬态真菌细胞质跨膜电位ΔΨ-瞬态-真菌(ΔΨ-tran-fungi)；

3)瞬态细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-瞬态-细菌(ΔΨ-tran-bact)。

本文所用术语“稳态线粒体膜电位(ΔΨ-稳态-线)”指在按照本发明方法和系统辐射前哺乳动物或真菌线粒体的定量的线粒体膜电位，其在将来缺乏这样的辐射后将继续存在。

例如，在正常电子传递和氧化磷酸化作用期间发生的电子和质子穿过线粒体内膜的稳态流动将处于稳态，因为穿过该膜的常规氧化还原反应发生恒速流动。对这种氧化还原态的任何改变将产生瞬态膜电位。本文将使用ΔΨ-稳态-线来阐述两种(2)不同的稳态线粒体膜电位，其基于物种为：

1)稳态线粒体哺乳动物电位ΔΨ-稳态-线-哺(ΔΨ-steady-mito-mam)；

2)稳态线粒体真菌电位ΔΨ-稳态-线-真菌(ΔΨ-steady-mito-fungi)。

本文所用术语“瞬态线粒体膜电位(ΔΨ-瞬态-线-哺(ΔΨ-tran-mito-mam)或ΔΨ-瞬态-线-真菌(ΔΨ-tran-mito-fungi))”指在按照本发明方法和系统辐射后哺乳动物或真菌细胞的膜电位，藉此辐射改变了线粒体内膜的生物能学。在哺乳动物和真菌细胞中，ΔΨ-瞬态-线也将改变该细胞的氧化还原态，因为所述线粒体内膜是电子传递系统(ETS)和细胞色素所在。随着这些线粒体(H⁺)梯度的产生，ΔΨ-瞬态-线还可强烈影响(质子-动力势)Δp-线-哺(Δp-mito-mam)和Δp-线-真菌(Δp-mito-fungi)，以便为众多的细胞功能产生足够的ATP。ΔΨ-瞬态-线是不用本发明方法的辐射时将不出现的状态。本文将使用ΔΨ-瞬态-线来阐述两种(2)不同的瞬态线粒体膜电位，其基于物种为：

1)瞬态线粒体哺乳动物电位ΔΨ-瞬态-线-哺；

2)瞬态线粒体真菌电位ΔΨ-瞬态-线-真菌。

本文所用术语“细胞色素”指含有血红素基并实施电子传递的膜结合的血红素蛋白。本文所用术语“电子传递系统(ETS)”阐述介导生物化学反应的一系列膜相关电子载体(细胞色素)，其产生细胞的能量流(ATP)。在原核细胞(细菌)中，这发生于细胞质膜中。在真核细胞(真菌和哺乳动物细胞)中，这发生在线粒体中。

本文所用术语“pH梯度(ΔpH)”指膜任一边的两个体相之间的pH差。

本文所用术语“质子电化学梯度(ΔμH⁺)(量纲为kJ mol^-1)”指跨膜的电性质和化学性质，尤其是质子梯度，代表可用于细胞中工作的细胞势能类型。这种膜两边之间的质子电化学电位差参与涉及质子泵的主动转运，有时也称为化学渗透电位或质子动力势。当无论通过何手段降低ΔμH⁺时，就说明在受影响的细胞中抑制了细胞合成代谢途径和抗性机制。这可通过联合λn和Tn以辐射单一靶位点来完成，或可同时或序贯给予经配置和排布用于递送的药物到靶位点(即用(λn和Tn)+(一种或多种药物分子)共同靶向合成代谢途径)来进一步增强。

本文所用术语“离子电化学梯度(Δμx+)”指由离子(不同于H⁺)浓度梯度引起的跨膜的电性质和化学性质，代表可用于细胞中工作的细胞势能类型。在哺乳动物细胞中，通过将Na⁺穿过细胞质膜主动转运出细胞来维持Na⁺离子电化学梯度。这是与质子电化学电位不同的梯度，但由ATP偶联泵产生，所述ATP在氧化磷酸化作用期间由哺乳动物线粒体质子-动力势(Δp-线-哺)产生。当无论通过何手段降低Δμx+时，就说明在受影响的细胞中抑制了细胞合成代谢途径和抗性机制。这可通过联合λn和Tn以辐射单一靶位点来完成，或可同时或序贯给予经配置和排布用于递送的药物到靶位点(即用(λn和Tn)+(一种或多种药物分子)共同靶向合成代谢途径)来进一步增强。

本文所用术语“共同靶向细菌合成代谢途径”指(λn和Tn在靶位点降低细胞的(ΔμH⁺)和/或(Δμx⁺)以影响合成代谢途径)+(一种或多种药物分子以影响同一细菌合成代谢途径)，并可指能够被药物分子抑制的任何以下细菌合成代谢途径：

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的肽聚糖生物合成，该药物结合与细菌细胞壁中的肽聚糖交联的细菌转肽酶(青霉素结合蛋白)活性位点。抑制这些酶最终导致细胞溶解和死亡；

其中被靶向的细菌合成代谢途径为由药物共同靶向的肽聚糖生物合成，该药物结合细胞壁中间物中的乙酰基-D-丙氨酰-D-丙氨酸基团，并因此防止将N-乙酰胞壁酸(NAM)-肽和N-乙酰葡糖胺(NAG)-肽亚基结合到肽聚糖基质(通过对转糖基和/或转肽发挥作用来有效抑制肽聚糖生物合成)，藉此防止革兰氏阳性细菌中正确形成肽聚糖；

其中被靶向的细菌合成代谢途径为由药物共同靶向的肽聚糖生物合成，该药物结合C₅₅-异戊二烯焦磷酸，并防止焦磷酸酶与C₅₅-异戊二烯焦磷酸相互作用，因此降低了可用于携带内膜外的结构单元肽聚糖的C₅₅-异戊二烯焦磷酸的量；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细菌蛋白质生物合成，该药物结合细菌核糖体的亚基50S亚基中的23S rRNA分子，导致肽酰-tRNA在细胞中的积聚，因此消耗了激活α-氨基酸所必须的游离tRNA，并通过引起肽酰-tRNA过早从核糖体解离来抑制转肽作用；

其中所述共同靶向的药物同时结合50S细菌核糖体亚基的23SRNA的两个结构域，并可藉此抑制细菌核糖体亚基50S和30S(核糖体亚基组件)的形成，其中使所述共同靶向的药物氯化以提高其透入细菌细胞的亲脂性，并结合细菌核糖体50S亚基的23S部分，防止肽酰-tRNA从氨酰基位点(A-位点)转移到肽酰位点(P-位点)，藉此抑制转肽酶反应，这导致从核糖体释放不完整的肽；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细菌蛋白质生物合成，该药物结合30S细菌核糖体亚基，阻断氨基-酰基tRNA结合核糖体的受体位点(A-位点)，藉此抑制密码子-反密码子的相互作用和蛋白质合成的延伸阶段；

其中所述共同靶向的药物能以更高亲和力结合于细菌核糖体，并且结合方向不同于具有八氢并四苯(octahydrotetracene)-2-甲酰胺骨架的多聚乙酰抗微生物剂的典型亚类，因此，它们对含tet(M)核糖体和tet(K)流出遗传决定子的金黄色葡萄球菌的菌株有活性；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细菌蛋白质生物合成，该药物结合特异性氨酰-tRNA合成酶以防止特定氨基酸或其前体酯化为其相容tRNA的氨基酸或其前体之一，从而防止形成氨酰-tRNA，并因此终止将必需氨基酸掺入到细菌蛋白质中；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细菌蛋白质生物合成，该药物在起始阶段之前抑制细菌蛋白质合成，其抑制方式为通过23S rRNA结构域V结合50S rRNA以及与30S核糖体亚基的16SrRNA相互作用，因此，防止蛋白质合成的起始子甲酰-甲硫氨酸(f-Met-tRNA)和30S核糖体亚基结合；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细菌蛋白质生物合成，该药物以在靠近肽基转移酶中心的23S rRNA P位点区域中的蛋白L3与细菌核糖体50S亚基相互作用，并因此抑制肽基转移酶活性和肽基转移，阻断P-位点的相互作用，并防止活性50S核糖体亚基的正常形成；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的DNA复制和转录，该药物抑制拓扑异构酶II(DNA促旋酶)和/或拓扑异构酶IV；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的DNA复制和翻译，该药物抑制DNA聚合酶IIIC，该酶为革兰氏阳性细菌染色体DNA复制所需，但在革兰氏阴性细菌中不存在；

其中被靶向的合成代谢途径为DNA复制和转录，该合成途径由抑制拓扑异构酶II(DNA促旋酶)和/或拓扑异构酶IV和/或DNA聚合酶IIIC的混合药物化合物(pharmacological hybrid compound)共同靶向；

其中被靶向的合成代谢途径为由局部药物共同靶向的细菌磷脂生物合成，该药物对富含磷脂酰乙醇胺的细胞质膜起作用，并很好地与其它局部增效剂联合起作用；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细菌脂肪酸生物合成，该药物通过选择性靶向β-酮酰基-(酰基载体蛋白(ACP))合酶I/II(FabF/B)(其为II型脂肪酸合成中必不可少的酶)来抑制细菌脂肪酸生物合成；

其中被靶向的合成代谢途径为维持细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-细菌，所述共同靶向的药物主要通过与革兰氏阳性细胞质膜结合而不是渗入细胞内并引起去极化作用和膜电位损失(导致抑制蛋白质、DNA和RNA合成)来破坏细菌细胞膜本身特有的多方面功能；

其中所述共同靶向药物增加细菌细胞壁的渗透性，因此使得无机阳离子自由通过细胞壁，藉此破坏细胞质和细胞外环境之间的离子梯度；

其中被靶向的合成代谢途径为维持细菌膜的选择性渗透性和细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-细菌，所述共同靶向药物为阳离子抗菌肽，该肽对细菌膜的带负电表面比对真核细胞的中性膜表面更有选择性，并导致原核生物膜渗透化和细菌细胞膜的最终穿孔和/或崩解，藉此促进细菌细胞内容物漏出和跨膜电位崩溃；

其中所述共同靶向药物抑制细菌蛋白酶肽去甲酰酶，该酶催化甲酰基离开新合成的细菌多肽的N-末端；和

其中所述共同靶向药物抑制细菌中的双组分调控系统，例如抑制通过跨细菌细胞质膜的信号转导对其环境响应的能力，这些信号转导过程不在哺乳动物膜中存在。

本文所用术语“共同靶向真菌合成代谢途径”指(λn和Tn在靶位点降低细胞的(ΔμH⁺)和/或(Δμx⁺)以影响合成代谢途径)+(药物以影响同一真菌合成代谢途径)，并可指能够被药物抑制的任何以下真菌合成代谢途径：

其中被靶向的合成代谢途径为由局部药物共同靶向的磷脂生物合成，该药物破坏真菌细胞膜中存在的磷脂结构，并很好地与其它局部增效剂联合作用；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的麦角固醇生物合成，该药物在C-14脱甲基作用阶段抑制麦角固醇生物合成，C-14脱甲基作用是通过细胞色素P-450酶14-a-固醇脱甲基酶催化的三步氧化反应的部分，导致消耗麦角固醇，并积聚经由破坏细胞质膜结构干扰作为膜组分的麦角固醇的大多数功能的羊毛甾醇和其它14-甲基化固醇；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的麦角固醇生物合成，该药物抑制角鲨烯环氧酶，进而在真菌细胞中抑制麦角固醇生物合成，导致真菌细胞膜渗透性增加；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的麦角固醇生物合成，该药物在麦角固醇生物合成途径中的两个单独并明显不同的点抑制d14-还原酶和d7，d8-异构酶这两种酶；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的真菌细胞壁生物合成，该药物抑制(1，3)β-D-葡聚糖合酶，进而抑制真菌细胞壁中的β-D-葡聚糖合成；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的真菌固醇生物合成，该药物结合真菌细胞膜中的固醇，共同靶向的药物结合的主要固醇是麦角固醇，这有效改变细胞膜的瞬时温度，在膜中引起孔形成，导致在真菌细胞膜中形成有害离子通道；

其中将所述共同靶向的药物配制用于在脂类、脂质体、脂类复合物和/或胶态分散体中递送以防止来自该药物的毒性；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的蛋白质合成，该药物5-FC由胞嘧啶通透酶吸收到真菌细胞中，使脱去氨基成为5-氟尿嘧啶(5-FU)，转化为三磷酸核苷并掺入到RNA中，在此处其导致密码错编；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的真菌蛋白质合成，该药物抑制真菌延伸因子EF-2(在功能上与其哺乳动物相应物截然不同)和/或哺乳动物细胞中不存在的真菌延伸因子3(EF-3)；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的真菌几丁质生物合成(N-乙酰-D-葡糖胺的β-(1，4)-连接的均聚物)，该药物通过抑制一种或多种几丁质合酶2的作用来抑制真菌几丁质生物合成，几丁质合酶2是真菌中原始隔膜形成和细胞分裂所必需的酶；

其中所述共同靶向的药物抑制几丁质合酶3的作用，该酶是在萌芽和生长、交配和孢子形成期间合成几丁质所必需的酶；

其中所述共同靶向的药物螯合多价阳离子(Fe⁺³或Al⁺³)，导致负责线粒体电子传递和细胞能量产生的金属依赖性酶的抑制，还导致真菌细胞内过氧化物的正常降解的抑制；和

其中所述共同靶向的药物抑制真菌中的双组分调控系统，例如抑制通过跨真菌细胞质膜的信号转导对其环境响应的能力。

本文所用术语“共同靶向癌症合成代谢途径”指(λn和Tn在靶位点处降低细胞的(ΔμH⁺)和/或(Δμx⁺)以影响合成代谢途径)+(药物以影响同一癌症合成代谢途径(影响程度比非癌症细胞大))，并可指能够被药物抑制的任何以下癌症合成代谢途径：

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的DNA复制，该药物通过交联DNA双螺旋链中的鸟嘌呤核苷碱基使得该链不能解开和分离来抑制DNA复制，解开和分离为DNA复制所必需；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的DNA复制，该药物可与同一条DNA链或不同DNA链中的两种不同的7-N-鸟嘌呤残基反应；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的DNA复制，该药物通过用作抗代谢物来抑制DNA复制和细胞分裂；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细胞分裂，该药物通过防止微管的功能来抑制细胞分裂；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的DNA复制，该药物通过防止细胞进入G1期(DNA复制开始)和DNA复制(S期)来抑制DNA复制和细胞分裂；

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的细胞分裂，该药物提高微管的稳定性，防止在细胞分裂后期染色体分离；和

其中被靶向的合成代谢途径为由药物共同靶向的DNA复制，该药物通过抑制I型或II型拓扑异构酶来抑制DNA复制和细胞分裂，抑制这些酶将通过扰乱恰当的DNA超螺旋来干扰DNA的转录和复制。

本文所用术语“质子-动力势(Δp)”指作为质子和跨膜的电压梯度组合的储能(象电池一样起作用)。Δp的两个组分为ΔΨ(跨膜电位)和ΔpH(H⁺化学梯度)。换句话说，Δp由H⁺跨膜电位ΔΨ(外面为负(酸性))和跨膜pH梯度ΔpH(里面为碱性)组成。这种势能以电化学梯度的形式储存，并通过在化学渗透期间将氢离子跨生物膜(线粒体内膜或细菌和真菌细胞质膜)泵送而产生。细胞中的Δp可用于化学功、渗透功或机械功。质子梯度通常用于氧化磷酸化作用以驱动ATP合成，其在细菌、真菌或哺乳动物细胞(包括癌症细胞)中可用于驱动流出泵。本文将使用Δp来阐述基于物种的膜中四种(4)不同的质子动力势，其算术定义为(ΔP＝ΔΨ+ΔpH)：

1)哺乳动物线粒体质子-动力势(Δp-线-哺)；

2)真菌线粒体质子-动力势(Δp-线-真菌)；

3)真菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-真菌)；

4)细菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-细菌)。

本文所用术语“哺乳动物线粒体质子-动力势(Δp-线-哺)”指以跨哺乳动物线粒体内膜的(H⁺)电化学梯度形式储存的势能。在哺乳动物线粒体中，Δp-线-哺用于氧化磷酸化作用以驱动ATP合成。

本文所用术语“真菌线粒体质子-动力势(Δp-线-真菌)”指以跨真菌线粒体内膜的(H⁺)电化学梯度形式储存的势能。在真菌线粒体中，Δp-线-真菌用于氧化磷酸化作用以驱动ATP合成。

本文所用术语“真菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-真菌)”指以跨真菌细胞质膜的(H⁺)电化学梯度形式储存的势能，其通过由膜结合的H⁺-ATP酶将氢离子跨细胞质膜泵送而产生。该细胞质膜结合的H⁺-ATP酶为高容量质子泵，需要ATP以发挥作用。用于该H⁺-ATP酶的ATP由Δp-线-真菌产生。真菌细胞中的Δp-质膜-真菌可用于驱动流出泵。

本文所用术语“细菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-细菌)”指以跨细菌细胞质膜的电化学梯度(H⁺)形式储存的势能，其通过在化学渗透期间将氢离子跨细胞质膜泵送而产生。Δp-质膜-细菌在细菌细胞质膜中用于氧化磷酸化作用以驱动ATP合成，并可用于驱动细菌细胞中的流出泵。

本文所用术语“合成代谢途径”指由较小单位构建分子的细胞代谢途径。这些反应需要能量。很多合成代谢途径和过程由三磷酸腺苷(ATP)提供动力。这些过程可包括简单分子(例如单氨基酸)和复合分子的合成，复合分子例如肽聚糖、蛋白质、酶、核糖体、细胞的细胞器、核酸、DNA、RNA、葡聚糖、几丁质、简单脂肪酸、复合脂肪酸、胆固醇、固醇和麦角固醇。

本文所用术语“能量转移”指质子通过嵌在膜中的呼吸复合体传递，其利用电子传递反应跨膜泵送质子，造成也称作质子电化学梯度的电化学电位。

本文所用术语细胞中的“能量转化”指化学键不断地断裂和形成，以造成可能的能量交换和转换。通常所述的能量从较集中形式转换为较不集中的形式是造成细胞呼吸作用的所有生物或化学过程的驱动力。

本文所用术语“解偶联剂”指导致储存在膜中的质子电化学梯度(ΔμH⁺)中的能量与ATP的合成分离的分子或装置。

本文所用术语“解偶联”指使用解偶联剂(分子或装置)以引起储存在膜中的质子电化学梯度(ΔμH⁺)中的能量与ATP的合成分离。

本文所用术语“5′-三磷酸腺苷(ATP)”指用作细胞内能量传递的“分子流(mocular currency)”的多功能核苷酸。ATP在细胞内传送化学能用于新陈代谢，并在细胞呼吸作用期间作为能源产生。很多酶和大量细胞过程(包括生物合成反应、流出泵运行和合成代谢细胞生长和分裂)消耗ATP。

本文所用术语“二磷酸腺苷(ADP)”是通过ATP酶将ATP去磷酸化的产物。通过ATP合成将ADP转化回ATP。应该理解，在生理条件下，需氧呼吸细胞中的ATP合酶制造ATP，同时用由ETS造成的质子-动力势Δp作为能源。以这种方式产生能量的总过程命名为氧化磷酸化作用。氧化磷酸化的总反应顺序为：ADP+Pi→ATP。驱动生物学反应的潜在动力是反应物和产物的吉布斯自由能。吉布斯自由能是能用于(“自由”)做功的能量，术语吉布斯自由能变化(ΔG)指能在膜中用于做功的自由能的变化。这种自由能是焓(ΔH)、熵(ΔS)和温度的函数。(焓和熵如下所述。)

本文所用术语“磷酸化势(ΔGp)”指在任何给定组的ATP、ADP和Pi浓度下用于ATP合成的ΔG(量纲为kJ mol^-1)。

本文所用术语“CCCP”指羰基氰化间氯苯腙，是剧毒的离子载体和呼吸链的解偶联剂。CCCP提高质子透过膜的电导率，作为典型的解偶联剂通过解除ATP合成与ΔμH⁺的偶联并消除ΔΨ和ΔpH二者起作用。

本文所用术语“去极化作用”(去能量化)指降低细胞质膜或线粒体膜电位ΔΨ的绝对值。应该明白任何细菌细胞质膜的去极化作用将导致ATP损失并增加自由基形成。还应该明白任何真核细胞的线粒体去极化作用将导致ATP损失并增加自由基形成。

本文所用术语“焓变(ΔH)”指膜系统的焓或热含量的变化，是膜系统热力学势的商或说明。

本文所用术语“熵变(ΔS)”指膜系统的熵变为在分子水平上更加无序状态的熵。术语“氧化还原应激(redox stress)”指不同于标准的细胞还原/氧化电位(“氧化还原作用”)状态的细胞条件。氧化还原应激包括ROS水平提高、谷胱甘肽水平降低以及改变细胞的氧化还原电位的任何其它情况。

本文所用术语“活性氧类别”指以下种类之一：

a)超氧化物离子自由基(O₂ ^-)；

b)过氧化氢(非自由基)(H₂O₂)；

c)羟基自由基(^*OH)；

d)氢氧根离子(OH^-)。

这些ROS通常通过以下反应链发生：

O₂→O_2-+2H⁺→H₂O₂→OH^-+^*OH→OH^-

(e-)   (e-)   (e-)      (e-)

本文所用术语“单线态氧”指(“1O₂”)，其经由与三线态-激发分子相互作用形成。单线态氧为带有其处于反平行自旋电子的非自由基中间体。因为单线态氧1O₂的电子没有自旋限制，所以其具有非常高的氧化本领，能够轻易地攻击膜(例如经由多不饱和脂肪酸或PUFA)氨基酸残基、蛋白质和DNA。

本文所用术语“能量应激(energy stress)”指改变细胞中的ATP水平的条件。这可能是线粒体和/或细胞质膜中电子传递变化和与解偶联剂或改变ΔΨ的辐射接触。

本文所用术语“NIMELS效应”指用本发明在细胞的质膜和线粒体膜水平从ΔΨ-稳态到ΔΨ-瞬态的受辐射的细胞的生物能“状态”改变。具体而言，NIMELS效应可弱化利用质子动力势或化学渗透电位作为其能量需求的细胞合成代谢途径或抗微生物剂和/或癌症的抗性机制。

本文所用术语“周质空间或周质”指在革兰氏阴性细菌中细胞质膜与外膜之间的空间，在革兰氏阳性细菌和真菌例如念珠菌和毛癣菌属(Trichophyton species)中细胞质膜和细胞壁之间的空间。这种周质空间涉及各种各样的生物化学途径，包括营养物质获得、肽聚糖合成、电子传递和改变对细胞有毒性的物质。在革兰氏阳性细菌例如MRSA中，周质空间具有显著的临床意义，因为其是β-内酰胺酶灭活基于青霉素的抗生素的地方。

本文所用术语“流出泵”指将分子(例如抗生素、抗真菌剂或毒素)从细胞质或细胞周质输出的主动转运蛋白组件，其用于以能量依赖方式将分子从细胞移到外部环境。

本文所用术语“流出泵抑制剂”指干扰流出泵从细胞输出分子的能力的化合物或电磁辐射递送系统和方法。特别地，本发明流出泵抑制剂为电磁辐射形式，其经由改变ΔΨ-稳态-哺、ΔΨ-稳态-真菌或ΔΨ-稳态-细菌干扰泵从细胞排出治疗性抗生素、抗真菌药物、抗肿瘤药物和毒素的能力。

细胞“利用流出泵抗性机制”意即细菌或真菌或癌症细胞将抗细菌和/或抗真菌和/或抗肿瘤的药物从其细胞质或外周胞质流出到该细胞的外部环境中，藉此将这些药物在细胞中的浓度降低到低于其抑制所述细胞生长和/或增殖所必需的浓度。

在细胞生长上下文中，术语抑制意即降低(若可能的话终止)细胞群生长和/或增殖的速率。

在蛋白质化学中，一级结构指氨基酸的线性排列；二级结构指线性氨基酸结构是否形成螺旋或β折叠结构；蛋白质或任何其它大分子的三级结构为其立体结构，或换句话说，为整个单链分子的空间组织(包括构象)；四级结构为多个具三级结构的蛋白质分子的呈多亚基复合体的排布。

本文所用术语“蛋白质应激(protein stress)”指蛋白质(包括酶和参与膜转运的其它蛋白质)三级和四级结构的热力学改变。该术语包括但不限于：蛋白质变性、蛋白质错误折叠、蛋白质交联、链间键和链内键(例如二硫键)的依赖氧的和不依赖氧的氧化作用、单个氨基酸的氧化作用等。

术语“pH应激(pH stress)”指细胞内pH的改变，即细胞内pH降低到低于约6.0或细胞内pH提高到高于约7.5pH。这可例如通过让细胞与本文所述的本发明接触并改变细胞膜组分或引起稳态膜电位ΔΨ-稳态变化来促成。

本文所用术语“抗真菌分子”指杀真菌或抑制真菌的化学药品或化合物。本发明首要功效是其增强抗真菌分子的能力，其通过在真菌抗性菌株中抑制合成代谢反应和/或流出泵活性或抑制需要质子动力势或化学渗透电位作为能量的其它抗性机制来增强。

本文所用术语“抗细菌分子(或药物)”指杀细菌或抑制细菌的化学药品或化合物。本发明另一首要功效在于其增强抗细菌分子的能力，其通过在细菌抗性菌株中抑制流出泵活性或抑制合成代谢反应和/或需要质子动力势或化学渗透电位作为能量的其它抗性机制来增强。

本文所用抗细菌或抗真菌分子的“亚抑制浓度”指小于抑制群体中的大部分靶细胞所需的浓度。(在一个方面，靶细胞为被靶向治疗的细胞，包括但不限于细菌、真菌和癌症细胞)。通常亚抑制浓度指小于最小抑制浓度(MIC)的浓度，除非明确规定，否则其定义为让靶细胞的生长或增殖降低至少10％所需要的浓度。

本文所用术语“最小抑制浓度”或MIC定义为导致抑制微小生物生长的最低有效或治疗浓度。

本文所用术语药物或分子(例如抗细菌或抗真菌药物)的“治疗有效量”指与NIMELS一起将部分或完全减轻由靶(病原体)细胞引起的一种或多种症状的浓度。特别地，治疗有效量指与NIMELS一起产生如下效果的药物量：(1)如果不能消除也要降低患者体内靶细胞的数量；(2)抑制(即如果不能终止也要减慢)患者体内靶细胞的增殖；(3)抑制(即如果不能终止也要减慢)感染传播；(4)减轻(如果不能消除的话)与感染有关的症状。

本文所用术语“相互作用系数”定义为在NIMELS激光和/或所述抗微生物分子与所述靶细胞之间的抑菌/杀菌和/或抑制真菌/杀真菌相互作用的大小的数值表示。

生物膜中能量转移的热力学

本发明涉及扰乱细胞膜生物热力学(生物能学)并随之降低受辐射的细胞足够经受正常的能量转移和能量转化的能力。

本发明方法和系统在光学上改动和改变Ψd-质膜-哺、Ψd-线-哺、Ψd-质膜-真菌、Ψd-线-真菌和Ψd-质膜-细菌以进一步发起相同膜的ΔΨ和Δp的改变。这由脂质双层长链脂肪酸的C-H共价键的近红外靶向辐射引起，其导致偶极电位Ψd的变化。

为了帮助理解这种生物能改变的过程，提出以下关于对膜生物能学和生物膜中的能量转移的热力学应用的说明。首先，膜(脂质双层，参见图1)拥有由与偶极基团和分子有关的结构(主要是磷脂(图2)的酯键和水)产生的显著的偶极电位Ψd。这些偶极基团被定向，使烃相对于外膜区带正电荷(图3)。通常偶极电位程度(degree)大，一般为几百毫伏。第二个主要势能(电荷跨膜分隔)产生了跨膜电位ΔΨ。跨膜电位定义为膜两边水体相之间的电位差，其由选择性跨膜转运带电分子而产生。通常细胞膜的细胞质一侧的电位相对于胞外的生理溶液为负(图4A)。

偶极电位Ψd构成所有细胞质膜和线粒体膜的大部分的并且是功能上重要的部分的静电电位。Ψd改变膜内电场，在非极性的双层中心产生真正的正电荷。作为这种“正电荷”的结果，脂质膜在带正电荷和负电荷的疏水离子之间的渗透率方面表现出显著(例如最高到6个数量级)的差异。Ψd在膜对亲脂离子的渗透性方面也起重要作用。

众多细胞过程，例如蛋白质(酶)的结合和插入、蛋白质侧向扩散、配体-受体识别和与内源及外源分子的膜融合中的某些步骤，都严重依赖膜双层的物理性质Ψd。在模型膜系统中的研究业已阐明了单价和多价离子引起纯脂质中的等温相变、不同相的分离和混合物中各个组分分类簇集(distinct clustering)的能力。在膜中，诸如以上的这些变化(changes such as these)可对嵌入膜中的蛋白质和细胞色素的构象动力学(图4B)产生物理影响，更明确地，在其进行周期(operating cycle)期间对其跨膜域经历巨大的构象重排的蛋白质(图5)产生物理影响。最重要的是，Ψd的变化被认为调控膜酶活性。

能量转移

生物膜中的能量转移通常涉及三种相互关联的机制：

1)氧化还原能转换为储存在跨膜离子电化学电位中的“自由能”，该自由能也称作膜质子电化学梯度ΔμH⁺。位于膜两边的这种质子(这些质子参与涉及质子泵的主动转运)之间的电化学电位差有时也称作化学渗透电位或质子动力势。

2)在哺乳动物细胞中，通过从细胞主动运出(Na⁺)来维持跨细胞质膜的(Na⁺)离子电化学梯度Δμx⁺。这是不同于质子电化学电位的梯度，其经由在氧化磷酸化作用期间从哺乳动物线粒体质子-动力势Δp-线-哺产生的ATP由(泵)产生。

3)使用这种“自由能”以制造ATP(能量转化)来推进跨膜的主动转运，且同时在细胞中积聚所需溶质和代谢物，这被称为磷酸化势ΔGp。换言之，ΔGp是在任何给定组的ATP、ADP和Pi浓度下用于ATP合成的ΔG。

稳态跨膜电位(ΔΨ-稳态)

当其化学电位梯度ΔμH⁺和E(能量)的值暂时独立并且没有能量流穿过系统边缘时，膜“系统”状态处于平衡。若ΔμH⁺和E的膜系统变量恒定，但有净能量流过该系统，那么该膜系统处于稳态，并暂时独立。

正是细胞(呼吸、生长和分裂的细胞)的这种暂时独立的稳态跨膜和/或线粒体电位(ΔΨ-稳态)是焦点。如果未受到内部或外部事件的妨碍，在正常电子传递和氧化磷酸化作用期间的电子和质子或Na⁺/K⁺离子的这种跨线粒体膜或细胞质膜的“稳态”流动，很可能将一直继续下去。膜热力学的任何外部改变，将导致产生瞬态跨膜和/或线粒体电位ΔΨ-瞬态，这种从ΔΨ-稳态到ΔΨ-瞬态的变化是本发明目标。

状态变量ΔΨ-稳态和ΔΨ-瞬态之间的数学关系称为状态方程。在热力学中，状态函数(state function或state quantity)是一种性质或系统，其仅依赖于系统的当前状态。其不依赖于系统获得其特定状态的方式。本发明以暂时依赖方式促使跨膜和/或线粒体电位ΔΨ的状态转换，以使膜的生物能学从热力学稳态条件ΔΨ-稳态变为处于瞬态ΔΨ-瞬态的能量应激和/或氧化还原应激之一。

这在ΔΨ-稳态-哺、ΔΨ-稳态-真菌、ΔΨ-稳态-细菌、ΔΨ-稳态-线-哺和ΔΨ-稳态-线-真菌中都可发生。不希望受任何理论的束缚，认为这种转换由脂质双层长链脂肪酸的C-H共价键的近红外靶向辐射(用930nm波长)(其导致偶极电位Ψd改变)和细胞色素链的近红外靶向辐射(用870nm的λ)(其同时改变膜的ΔΨ-稳态和氧化还原作用电位)引起。

热力学第一定律和膜

热力学第一定律(其适用于膜系统)的基本方面是隔热系统(insulated system)的能量保持不变，热和功二者都被认为是能量的等同形式。因此，膜系统的能量水平(Ψd和ΔΨ)可通过以下方式改变：分别由力或压强作用经过特定距离或在单元体积内所做的机械功的增加或减少；和/或跨膜温度梯度传递的非破坏性热。

本定律(能量守恒定律)假定与其环境隔热的系统的总能量不变。因此，给系统增加任何量(能量)的热和功必定在系统能量变化上得到反映。

红外辐射的吸收

红外辐射的个体光子不含有足以诱导如在紫外辐射的光子中可见的电子跃迁(在分子中)的能量(例如以电子伏特测量的)。为此，红外辐射吸收限于在分子键的可能的振动和旋转态中有小能量差异的化合物。

按照定义，对于吸收红外辐射的膜双层，在吸收红外光子的脂质双层分子键内的振动或旋转必定引起膜偶极电位的净变化。若红外辐射频率(波长)与吸收分子(即长链脂肪酸的C-H共价键)的振动频率相匹配，则辐射将被吸收，导致ψd变化。这可发生在Ψd-质膜-哺、Ψd-线-哺、Ψd-质膜-真菌、Ψd-线-真菌和Ψd-质膜-细菌中。换言之，用本文所述方法和系统可使所有细胞脂质双层的焓和熵(ΔH和ΔS)发生直接和被靶向的变化

本发明基于上面已经介绍的见解组合，部分源自包括下列的经验数据：

人们已了解，作为ROS和毒性单线态氧反应产生和相互作用的结果，独特的单一波长(870nm和930nm)能够杀死诸如大肠杆菌等细菌细胞(原核生物)和(真核生物)例如中国Hela仓鼠卵巢细胞(CHO)。参见例如于2003年8月26日提交的美国专利申请系列10/649910号和2004年2月11日提交的美国专利申请系列10/776106号，它们的整体教导通过引用合并到本文中。用这样的NIMEL系统，已经确立本发明激光系统和方法(NIMEL系统)以低于通常在共焦激光显微术中发现的功率密度的5log(例如在光阱(optical trap)中使用(大约到500,000w/cm²的低功率))将波长870nm和930nm组合而不是避免单独的波长，以有利地开发这样的波长用于治疗激光系统的用途。

这样做的明确目的是为了使辐射野内的所有细胞的ΔΨ-稳态-哺、ΔΨ-稳态-真菌、ΔΨ-稳态-细菌、ΔΨ-稳态-线-哺和ΔΨ-稳态-线-真菌发生改变，对其进行处理并去极化。在本发明中这通过脂质双层长链脂肪酸中的C-H共价键的近红外靶向辐射(用930nm的能量)来实现，其导致辐射野内所有生物膜的偶极电位Ψd-质膜-哺、Ψd-线-哺、Ψd-质膜-真菌、Ψd-线-哺和Ψd-质膜-细菌发生改变。其次，细胞色素链的近红外辐射(用870nm)将另外改变ΔΨ-稳态和具有细胞色素的膜(即细菌细胞质膜和真菌和哺乳动物线粒体)的氧化还原电位。

作为直接发色团(细胞色素和长链脂肪酸中的C-H键)，在本发明辐射路径中所有细胞脂质双层的膜脂类和细胞色素的分子动力学中将有直接的焓变和熵变。这将改变各种膜偶极电位Ψd并同时改变受辐射的细胞的所有膜的膜电位ΔΨ的绝对值。

通过脂类和细胞色素的金属蛋白反应中心的分子运动(即ΔS)的显著增加发生这些变化，因为它们在线性单光子过程中从NIMEL系统吸收能量。因为在脂质双层和/或细胞色素中即使小的热力学变化也将足以改变偶极电位Ψd，所以附着的电子传递蛋白质或跨膜蛋白的分子形状(并由此酶的反应性)将使功能减弱。这将直接影响并改变受辐射的细胞所有膜的ΔΨ。

依照本文所述方法和系统，出现了NIMELS效应，重要的是对细胞膜没有造成热损伤或磨蚀机械损伤。这种联合并定靶的低剂量方法是对现有方法的明显改变和改进，而现有方法会导致能量束路径内的所有膜的实际上的机械损伤。

膜熵和热力学第二定律

热能转换为其它能量形式从来都是不完全的，(按照热力学第二定律)总是必须伴随熵的增加。熵(在膜中)是一种态函数，由于热能输入或输出的(能量)变化和相关的分子重排，它在反应中的变化阐述了反应的方向。

即使热能和机械能在其基本特性(作为能量形式)方面是等价的，但在将热能转化为功的能力方面仍有局限性，即热能太多可永久损伤膜构造并在任一方向防止功或有益能量变化。

NIMELS效应将以临时依赖方式在脂质双层水平改变受辐射的细胞的熵“态”。熵的这种增加将改变所有受辐射的膜(线粒体和细胞质)的Ψd，并因此在热力学上改变跨细胞膜的电子和质子的“稳态”流(图6和7)。这进而又将稳态跨膜电位ΔΨ-稳态变为瞬态膜电位(ΔΨ-瞬态)。

这种现象将发生于：

1)哺乳动物细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-哺；

2)真菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-真菌；

3)细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-细菌；

4)哺乳动物线粒体跨膜电位ΔΨ-线-哺；和

5)真菌线粒体跨膜电位ΔΨ-线-真菌。

这是在流动镶嵌膜中被靶向的长链脂肪酸的C-H键水平的焓变的直接结果，其引起对可改变膜的有形性质的动态无序(在膜中)的测量。这种流动镶嵌增加熵，并可破坏电子传递蛋白的三级和四级性质，引起氧化还原应激、能量应激和随后的ROS产生，那将进一步损伤膜并另外改变生物能学。

既然呼吸细胞电子传递系统的主要功能是在稳态条件下转换能量，那么本发明技术将用于在换能过程中暂时性机械-光学上解偶联许多有关的热力学相互作用。这可用改变质子电化学梯度ΔμH⁺和质子动力势和膜Δp的绝对量值的明确意图来完成。这种现象尤其可发生于：

1)哺乳动物线粒体质子-动力势(Δp-线-哺)；

2)真菌线粒体质子-动力势(Δp-线-真菌)；

3)真菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-真菌)；和

4)细菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-细菌)。

这样的现象可进而降低可用于磷酸化和合成ATP(ΔGp)的吉布斯自由能值ΔG。本发明实现这些现象以抑制必需依赖能量的合成代谢反应，增强药物疗法和/或降低细胞(对抗微生物剂、抗真菌剂和抗肿瘤分子)的抗性机制，因为很多这些抗性机制利用质子动力势或化学渗透电位作为其能量需要以抵抗和/或流出这些分子。

由ΔΨ-稳态的改变导致的自由基产生

认为用于氧化磷酸化作用和其它生物能功的化学解偶联剂的作用依赖膜(细胞质或线粒体)的充能状态。另外，认为细菌膜或真核线粒体内膜的充能状态是电化学质子梯度ΔμH⁺，该梯度通过在细胞呼吸作用和电子传递期间发生的初级质子转移事件而建立。

直接驱散(去极化)ΔμH⁺(例如通过渗透偶联膜使质子或补偿性离子移动)的作用剂通过诱导膜电位ΔΨ-稳态的降低来短路能量耦联和抑制生物能功。这将在呼吸作用(初级质子转移)快速继续时发生。

例如，氧化磷酸化作用的典型的解偶联剂羰基氰化间氯苯腙(CCCP)诱导膜电位ΔΨ-稳态降低，并随着呼吸作用继续诱导伴随产生ROS。这些作用剂(解偶联剂)通常不能用作抗微生物剂、抗真菌剂或抗肿瘤剂，因为其对所有细菌、真菌和哺乳动物细胞都有相应的毒性作用。

然而，业已证明在抗抗微生物剂、抗真菌剂或抗肿瘤剂的很多靶标细胞中，Δp解偶联剂(如CCCP)将破坏流出泵所需的能量梯度，因此诱导这些药物在细胞内积聚急剧增加。这些结果清楚表明某些抗性机制(例如药物流出泵)是由质子动力势驱动的。如果有办法使这种作用仅达到损伤“靶标细胞”，这种选择性将是对解偶联剂的普遍损害特性的明显改进。

本发明的科学发现和实验数据表明，随着膜光学上去极化，ROS的产生会进一步增强受影响的细胞的去极化作用，并进一步增强本发明的抗细菌效果(参见实施例VIII)。

通过用NIMELS激光辐射产生自由基和ROS

本发明可通过机械-光学上改变膜能量转移过程的很多有关的热力学相互作用以及改变ΔΨ-稳态，通过降低以下受辐射的膜的ΔμH⁺和Δp起光解偶联剂的作用：

1)哺乳动物线粒体质子-动力势(Δp-线-哺)；

2)真菌线粒体质子-动力势(Δp-线-真菌)；

3)真菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-真菌)；

4)细菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-细菌)。

这种降低的Δp将因为改变的氧化还原态而引起一系列的自由基和自由基氧中间体产生。业已用实验方法证明了自由基和活性氧类别的产生，本文在以下阐述了ΔΨ-稳态改变为ΔΨ-瞬态(参见实施例VIII)：

1)ΔΨ-稳态-哺+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态-哺；

2)ΔΨ-稳态-真菌+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态-真菌；

3)ΔΨ-稳态-细菌+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态-细菌；

4)ΔΨ-线-真菌+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态-线-真菌；

5)ΔΨ-线-哺+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态-线-哺。

因ΔΨ-稳态+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态现象而改变的氧化还原态和自由基及ROS的产生，可导致生物膜的严重进一步损伤，例如引起脂质过氧化作用。

脂质过氧化作用

脂质过氧化作用在微生物和哺乳动物界都是生物细胞损伤和死亡的主要原因。在该过程中，强氧化剂引起含有多不饱和脂肪酸(PUFA)的膜磷脂裂解。膜严重损伤可导致膜流体性的局部降低，完全破坏双层膜的完整性。

线粒体膜(哺乳动物细胞和真菌)的过氧化作用对呼吸链具有有害结果，导致ATP的产量不足和细胞能量循环崩溃。细胞质膜(细菌)的过氧化作用可影响膜的渗透性，使膜蛋白(例如孔蛋白(porins)和流出泵)功能紊乱，抑制信号转导，不恰当的细胞呼吸作用和ATP形成(即原核生物呼吸链位于细胞质膜，因为原核生物没有线粒体)。

自由基

自由基定义为含有不成对电子的原子或分子。自由基可在生物环境中引起的损伤的实例为从多不饱和脂肪酸(PUFA)的双-烯丙基C-H键除去一个电子(经由已有的或已产生的自由基)，这将产生以碳为中心的自由基。

R^*+(PUFA)-CH(双-烯丙基C-H键)→(PUFA)-C^*+RH

该反应可起始生物膜的脂质过氧化损伤。还可将自由基加到非自由基分子中，产生自由基产物。

(A^*+B→A-B^*)或非自由基产物(A^*+B→A-B)

这方面的实例为通过^*OH羟化芳香化合物。

活性氧类别(ROS)

氧气实际上是自由基种类。然而，因为其在不同的具有基态平行自旋的π-反键轨道中含有两个不成对电子，(自旋限制)规则通常防止O₂在没有催化剂时接受具平行自旋的电子对。因此，O₂必须一次接受一个电子。

细胞(原核和真核)中有很多重要供体，它们能够刺激氧的一个电子还原，这将产生另外的自由基种类。

这些通常分类为：

超氧化物离子自由基(O₂ ^-)

过氧化氢(非自由基)(H₂O₂)

羟基自由基(^*OH)

羟基离子(OH^-)

反应链为：

O₂→O₂ ^-+2H⁺→H₂O₂→OH^-+^*OH→OH^-

(e-)     (e-)     (e-)     (e-)

超氧化物

文献中对这些分子对细胞的威胁进行了适当分类。例如，超氧化物可作为氧化剂或还原剂起作用。

NADH→NAD⁺

超氧化物对于生物体的新陈代谢有更高的重要性，可还原细胞色素C。通常认为超氧化物(O₂ ^-)与脂类(即膜)蛋白质和DNA的反应速率太慢，不具有生物学意义。超氧化物过氧羟自由基(HOO^*)的质子化形式具有比(O₂ ^-)低的还原电位，但能够从PUFA移走氢原子。同样要注意的是，(HOO^*)的pKa值为4.8，靠近生物膜的(酸性)微环境将有利于形成过氧羟自由基。此外，超氧化物(O₂ ^-)与任何游离Fe⁺³的反应将产生“过铁酸基团(perferryl)”中间体，该中间体也可与PUFA反应并诱导脂类(膜)过氧化作用。

过氧化氢

过氧化氢(H₂O₂)(本身)不是好氧化剂，不能从PUFA移走氢。然而，它可跨过生物膜(相当容易)以在细胞的其它地方发挥危险有害的作用。例如，(H₂O₂)对微细胞环境内的过渡金属元素(例如Fe⁺²和Cu⁺)具有高度反应性，然后可形成羟基自由基(^*OH)(称作Fenton反应)。羟基自由基是生物学中已知的最具活性的种类之一。

羟基自由基

羟基自由基(^*OH)将与几乎所有种类的生物分子反应。它具有极快的反应速率，该速率基本上由羟基自由基(^*OH)的扩散速率和(^*OH)形成位点附近与之反应的分子的存在(或不存在)来控制。实际上，羟基自由基(^*OH)的标准还原电位(E0′)为(+2.31V)，高于(H₂O₂)的电位7倍的值，它在生物学有关自由基中分类为最具反应性。除破坏蛋白质和DNA之外，羟基自由基还将引发生物膜的脂质过氧化作用。

由PUFA的过氧化作用形成的活性氧类

此外，脂质过氧化作用(来自任何来源)的发展将导致从PUFA产生三种其它的活性氧类别中间体分子。

(a)烷基氢过氧化物(ROOH)；

象H₂O₂一样，烷基氢过氧化物在技术上不是自由基种类，但在过渡金属元素例如Fe⁺²和Cu⁺存在时不稳定。

(b)烷基过氧自由基(ROO^*)；和

(c)烷氧基自由基(RO^*)。

烷基过氧自由基和烷氧基自由基是极端活性氧类别，也有助于脂质过氧化作用的进一步传送过程。因ΔΨ-稳态+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态现象而改变辐射细胞的氧化还原态并产生自由基和ROS是本发明的另一方面。这是一种相加效应，以进一步改变细胞生物能学并抑制必需依赖能量的合成代谢反应，增强药物疗法和/或降低细胞抗抗微生物分子、抗真菌分子和抗肿瘤分子的抗性机制。

过量产生ROS可损伤细胞大分子、上面所有的脂类。业已证明脂类氧化作用既改变生物膜的小规模结构动力学以及其更宏观的侧面组织，又改变发生变化的偶极矩Ψd组分的填充密度依赖的重新定向。(脂类中)酰基链的氧化损伤导致丢失双键、缩短链和导入氢过氧化基团。因此，认为这些变化影响脂质双层和偶极电位Ψd的结构特点和动力学。

抗微生物剂抗性

抗微生物剂抗性定义为微小生物幸存于抗微生物药物或分子的能力。抗微生物剂抗性可经由自然选择、通过随机突变或通过基因工程改造自然发展而来。同样地，微生物可经由诸如质粒交换机制在彼此之间转移抗性基因。如果微小生物携带几种抗性基因，就将其称为多药耐药，或非正式地称为“超级病菌”。

病原体细菌和真菌的多药耐药性在治疗受这样的生物体感染的患者中是个严重问题。目前，发明或发现安全用于人类的抗微生物药物花费巨大而且很难。同样地，已经出现发展为攻击所有已知抗微生物剂种类和机制的突变生物体。因此，几乎没有抗微生物剂能够保持其长期功效。抗微生物药物抗性的大部分机制已知。

微生物表现抗微生物剂抗性的四种主要机制为：

a)使药物失活或修饰药物；

b)改变靶位点；

c)改变代谢途径；和

d)通过降低药物渗透性和/或增加主动流出到细胞表面来减少药物积聚。

抗性微生物实例

金黄色葡萄球菌是目前困扰人类的最重要的抗性细菌病原体之一。这种革兰氏阳性菌主要发现于接近全世界成年人群的一半的粘膜和皮肤上。金黄色葡萄球菌非常适应所有已知抗生素种类的压力。金黄色葡萄球菌是在1947年发现的第一种对青霉素有抗性的细菌。从此，发现对甲氧西林和苯唑青霉素(oxacillin)的几乎完全抗性。1961年首次检测到“超级病菌”MRSA(甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌)，现在在全世界的医院和社区中到处存在。今天，在美国所有金黄色葡萄球菌感染中超过半数对青霉素、甲氧西林、四环素(tetracycline)和红霉素有抗性。最近，已经报告对新的抗生素种类(最近重新选择的抗微生物剂)糖肽类和噁唑烷酮类中，有显著抗性(万古霉素从1996年，Zyvox从2003年)。

最近还出现成为流行病的新变种CA-MRSA(社区获得的MRSA)，它是一组快速发展的致死性的疾病的原因，这些疾病包括坏死性肺炎、严重脓血症和坏死性筋膜炎。每日报告在矫正机构(correctional facilities)、运动队、新兵连、新生儿室和男性同性恋活跃场所中有社区相关(CA)-MRSA感染发作。现在在很多城区区域CA-MRSA感染看来几乎成为地方病，引起大部分CA-金黄色葡萄球菌感染。

科学和医学团体一直在努力发现现有抗微生物药物的增效剂和细菌及真菌的抗性系统的抑制剂。这样的增效剂和/或抑制剂如果对人无毒，那么对于治疗受病原体和抗性微生物感染的患者将非常有价值。美国多达80％的人在某处移生有金黄色葡萄球菌。大部分为间歇性移生，20-30％为持久性移生。卫生保健人员、糖尿病患者和依靠透析的患者都具有较高的移生率。鼻前孔是成年人的主要移生位点，其它潜在移生位点包括腋窝、直肠和会阴。

细菌ΔΨ-稳态的选择性药理学改变

有一类相当新颖的称为脂肽类的杀菌性抗生素，其中的达托霉素(daptomycin)是FDA批准的第一个成员。经证明(在体外和体内)该抗生素可经由与目前市场上的其它抗生素明显不同的作用机制迅速杀死几乎所有临床有关的革兰氏阳性细菌(例如MRSA)。

达托霉素的作用机制涉及依赖钙将脂肽化合物掺入到细菌细胞质膜中。在分子水平上，结合在两个天冬氨酸残基(在达托霉素分子中)之间的钙减少了其净负电荷，使得其可更好地与通常在革兰氏阳性细菌细胞质膜中存在的带负电的磷脂作用。由于通常与真菌或哺乳动物细胞在治疗水平没有相互作用，因而其为非常具选择性的分子。

业已提出达托霉素的效果由对细菌细胞质膜的钙依赖性作用而产生，这消除了跨膜膜电位梯度ΔμH⁺。这实际上是仅针对细菌膜的选择性化学去极化作用。众所周知，维持恰当的充能细胞质膜对于细菌细胞的存活和生长必不可少，但去极化作用(以这种方式)不能自行达到致死细菌的作用。例如，在钾离子存在下可引起去极化作用的抗生素缬氨霉素(valinomycin)是抑菌剂而不是杀菌剂，CCCP的情况也同样。

相反，在缺乏质子动力势Δp这种跨膜电位梯度ΔμH⁺的主要组分时，细胞不能制造ATP或吸收生长和繁殖所需要的必需营养物质。ΔμH⁺的崩解解释了由达托霉素产生的不同(有害)作用(例如抑制蛋白质、RNA、DNA、肽聚糖、脂磷壁酸和脂类生物合成)。

进一步调查关于药物达托霉素的先前技术，提出加入庆大霉素(gentamicin)或米诺环素(minocycline)(到达托霉素中)导致提高了其对MRSA的杀菌活性。因为通过能量依赖的泵可将庆大霉素和米诺环素二者排出MRSA细胞，这两种药物是30S细菌核糖体水平的蛋白质合成(合成代谢功能)抑制剂。这指出通过达托霉素消除跨膜电位梯度ΔμH⁺可增强某些抗微生物药物。这应该作为通过降低膜电位ΔΨ而作用减小的抗性机制和ATP不能用于(即伴随着降低的ΔGp)蛋白质合成的合成代谢功能这一事实的结果而出现。

基于以上所述，很明显需要能够在特定靶标区域通过安全地降低靶细胞的膜电位ΔΨ(ΔΨ-稳态+(NIMELS治疗)→→ΔΨ-瞬态)来光学上抑制靶细胞中药物流出泵和/或合成代谢反应的活性。本发明方法用所选择的红外波长(例如870nm和930nm)不依赖任何外源化学作用剂(例如达托霉素)实现这一任务和其它任务。这是对需要系统药物来完成同样的任务的已有的先前技术方法明显的改进。

多药耐药性流出泵

现在已知在革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌和癌症细胞中存在多药耐药性流出泵。流出泵通常具有赋予广谱抗性机制的多特异性转运体。这些可增强抗微生物剂抗性的其它机制(例如抗微生物剂靶标突变或抗微生物分子的酶修饰)的作用。用于抗微生物剂的主动流出临床上可与以下抗微生物剂有关：β-内酰胺抗微生物剂、大环内酯(marcolide)类、氟喹诺酮(fluoroquinolone)类、四环素类和其它重要的抗生素以及大部分抗真菌化合物，包括依曲康唑(itraconazole)和特比萘芬(terbinafine)。

由于流出泵抗性，微生物具有俘获抗微生物剂或毒性化合物的能力并将其排出到细胞外面(环境)，藉此减低这些药物的细胞内积聚。通常认为一种或多种这些流出泵的过表达防止药物在细胞内积聚到其抑制活性必需的阀值。在微生物中，药物流出普遍性地与形成电化学电位的质子动力势和/或这些蛋白质泵所需的必需能量(ATP)偶联。这包括：

1)哺乳动物线粒体质子-动力势(Δp-线-哺)；

2)真菌线粒体质子-动力势(Δp-线-真菌)；

3)真菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-真菌)；和

4)细菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-细菌)。

细菌抗生素流出泵在系统发生上属于5个超家族：

(i)ABC(ATP结合盒)，它是由ATP水解提供能量的初级主动转运体；

(ii)SMR[DMT(药物/代谢物转运体)超家族的小的多药耐药性亚家族]；

(iii)MATE[MOP(多药物/低聚糖基-脂类/多聚糖翻转酶)超家族的多-抗微生物剂挤出亚家族(multi-antimicrobial extrusion subfamily)]；

(iv)MFS(主要易化超家族)；和

(v)RND(耐药/结节/分化超家族)，它们是由离子梯度驱动的所有次级主动转运体。

抑制流出泵的本发明方法是在受辐射的区域内膜ΔΨ的总的改变(光去极化作用)，其导致降低电化学梯度，从而降低磷酸化势ΔGp和用于泵功能能量需求的能量。具有抑制靶标细胞的很多不同合成代谢和能量驱动机制(包括吸收用于正常生长的营养物质)的相同的光生物学机制也是本发明的目的。

流出泵能量减少：靶向作用于机制的驱动力

今天，没有属于已经开发用于临床的“能量阻止剂(energy-blocker)”分子家族的药物用作流出泵抑制剂。已经发现有几种分子为“通用”流出泵抑制剂。两个这样的分子为利血平(reserpine)和维拉帕米(verapamil)。这些分子最初分别作为囊泡单胺类转运体的抑制剂和跨膜钙进入阻滞剂(或钙离子拮抗剂)被认识。维拉帕米在癌症细胞和某些寄生虫中被称为MDR泵抑制剂，还改进妥布霉素(tobramycin)的活性。

利血平通过改变为MDR流出泵功能所需的膜质子-动力势Δp的产生来抑制Bmr和NorA的活性，Bmr和NorA是两种革兰氏阳性菌的流出泵。尽管这些分子能够抑制与抗生素(即四环素)排出有关的ABC转运体，但阻止细菌流出所需浓度对人有神经毒性。迄今为止，在用达托霉素的相似的实验文献中还没有提及。真菌药物流出主要由两组膜结合转运蛋白介导：ATP结合盒(ABC)转运体和主要易化超家族(MFS)泵。

细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-细菌和细胞壁合成

在正常细胞新陈代谢期间，通过细胞质膜挤出质子形成ΔΨ-质膜-细菌。这种功能也酸化(降低pH)细菌细胞质膜近旁的狭窄区域。业已证明在革兰氏阳性的枯草杆菌(Bacillus subtilis)中，当电子传递系统通过增加质子导体被阻滞时，提高了肽聚糖自溶素的活性(即不再受抑制)。这提示ΔΨ-质膜-细菌和ΔμH⁺(独立于用于细胞酶功能的储能)对细胞壁合成代谢功能和生理学潜在地具有深刻和开拓性的影响。

另外，业已证明ΔΨ-质膜-细菌解偶联剂抑制肽聚糖形成与参与肽聚糖合成的核苷酸前体的积聚并抑制N-乙酰葡糖胺(GIcNAc)这种肽聚糖中最主要的生物高聚物的转运。

对称为速朴肽(tachyplesin)的抗微生物化合物也有提及，速朴肽降低革兰氏阳性及革兰氏阴性病原体中的ΔΨ-质膜-细菌(抗微生物剂组合物及其药用制剂，美国专利第5,610,139号，其全部教导通过引用合并到本文中)。经证明该化合物在亚致死浓度时具有在MRSA中增强细胞壁合成抑制剂β-内酰胺抗生素氨苄青霉素(ampicillin)的能力。希望将光学上降低的ΔΨ-质膜-细菌的多种影响(即增加细胞壁自我分解、抑制细胞壁合成和增强细胞壁抗微生物剂)与靶向细菌细胞壁的任何其它相关抗微生物治疗结合。这在革兰氏阳性细菌例如MRSA中尤其有意义，所述MRSA不具有流出泵作为细胞壁抑制抗微生物化合物的抗性机制。

细胞壁抑制化合物在革兰氏阳性细菌中不必如其在革兰氏阴性细菌中所必需一样通过膜获得入口，来表现抗细胞壁作用。实验证据已经证明(参见实施例XII)，NIMELS激光及其伴随的光ΔΨ-质膜-细菌降低的现象在MRSA中与细胞壁抑制抗微生物剂起协同作用。这必须经由抑制合成代谢(外周胞质)ATP偶联功能来起作用，因为MRSA不具有对肽聚糖抑制抗微生物剂起作用的流出泵，因为它们不必进入细胞来生效。

ΔΨ-质膜-真菌和ΔΨ-线-真菌：对纠正细胞功能和抗性抗真菌剂必不可少

在正常细胞新陈代谢期间，ΔΨ-线-真菌在线粒体中经由电子传递系统产生，然后经由线粒体ATP合酶酶系统产生ATP。然后正是ATP为细胞质膜结合H⁺-ATP酶提供动力以产生ΔΨ-质膜-真菌。先前业已发现化学药品水蓼二醛(polygodial)以剂量依赖方式抑制真菌线粒体ATP合酶(Lunde和Kubo，Antimicrob Agents Chemother.2000年7月，44(7)1943-1953，其全部教导通过引用合并到本文中)。进一步发现这种经诱导的细胞质ATP浓度降低导致产生ΔΨ-质膜-真菌的细胞质膜结合的H⁺-ATP酶的抑制，这种损害进一步弱化其它细胞活性。另外，ΔΨ-质膜-真菌的降低将引起导致质子流入的细胞质膜生物能和热力学破坏，这将瓦解质子动力势并因此抑制营养物质吸收。

更重要的是，ATP是生物合成真菌细胞质膜脂类麦角固醇所必须的。麦角固醇是被在今天的医药中所用的有关商业抗真菌化合物(即唑类、特比萘芬和依曲康唑)的大部分所靶向的结构脂类。

研究业已证明两种抗微生物肽(Pep2和Hst5)具有引起ATP流出真菌细胞(即消耗细胞内的ATP浓度)的能力，这种降低的胞质ATP导致ABC转运体CDR1和CDR2失活，它们是依赖ATP的抗真菌药物流出泵。

使用光方法使膜去极化并消耗真菌的细胞ATP作为流出泵抑制剂和合成代谢反应的增效剂是有利的。因此，需要光学上改变ΔΨ-质膜-真菌和/或ΔΨ-线-真菌来抑制必需细胞功能、ATP产生和增强抗真菌化合物。

因此，用于防止药物抗性(经由流出泵)的策略之一是降低细胞内ATP水平，该水平诱导依赖ATP的流出泵失活。在真菌病原体中，一直没有可接受的化学药物来完成该任务。然而，NIMELS效应有能力在光学上完成该目标，实验证据业已证明NIMELS激光和在真菌中的现象与抗真菌化合物有协同作用(参见实施例XIII)。

这种NIMELS效应将依照本文所公开的方法和系统发生，而对细胞膜不会产生热量或磨蚀机械损伤。这种联合并靶向的低剂量方法是对所有现有方法的明显改变和改进，而现有方法会导致能量射束路径内的所有膜的实际上的机械损伤。

在第一方面，本发明提供改变NIMELS射束路径内所有膜的偶极电位Ψd(Ψd-质膜-哺、Ψd-线-哺、Ψd-质膜-真菌、真菌Ψd-线-哺和Ψd-质膜-细菌)以在同样的膜中发动一连串ΔΨ和Δp的进一步改变的方法。

将所有受辐射的细胞生物能稳态膜电位ΔΨ-稳态(ΔΨ-稳态-哺、ΔΨ-稳态-真菌、ΔΨ-稳态-细菌、ΔΨ-稳态-线-哺和ΔΨ-稳态-线-真菌)改变为ΔΨ-瞬态值(ΔΨ-瞬态-哺、ΔΨ-瞬态-真菌、ΔΨ-瞬态-细菌、ΔΨ-瞬态-线-哺和ΔΨ-瞬态-线-真菌)。这导致伴随的去极化作用和所有受辐射的细胞的Δp(Δp-线-哺、Δp-线-真菌、Δp-质膜-真菌和Δp-质膜-细菌)绝对值的可计量的改变。

通过用所需波长、功率密度水平和/或能量密度水平的光辐射辐射靶位点，这些现象发生了，而对除被靶向的生物污染物(细菌和真菌)外的特定靶位点其中/其上的生物学对象(例如哺乳动物组织、细胞或某些生化制剂例如蛋白质制剂)没有无法耐受的风险和/或无法耐受的有害作用。

在某些实施方案中，这样施用的光辐射可如本文所述在NIMELS放射量具有约850nm-约900nm的波长。在例示性实施方案中，使用约865nm-约875nm的波长。在另外实施方案中，这样施用的光辐射可在NIMELS放射量具有约905nm-约945nm的波长。在某些实施方案中，这样施用的光辐射可具有约925nm-约935nm的波长。在下文所例示的代表性的非限制性实施方案中，采用的波长为930nm。

在如下所示的例示性实施方案中，可改变生物能稳态膜电位，并可采用包括分别将870和930nm扩入括号的范围的多波长范围。

NIMELS增强标尺(NPMS)

如前面所详述，NIMELS参数包括激光二极管的平均单一或相加的输出功率和二极管的波长(870nm和930nm)。这一信息与靶位点的一束或多束激光射束面积(cm²)、激光系统功率输出和辐射时间联合在一起，提供可用于计算本发明的有效而又安全的辐射方案的整套信息。

基于用NIMELS激光获得的这些新的抗性逆转和抗微生物剂增强的相互作用，需要有对每一种独特的抗微生物剂和激光放射量适用的“增强效果”的定量值。

定义一组新参数以考虑执行NIMELS激光的任何不同的放射量值和所检查的特定抗微生物剂的任何MIC值。可仅通过在用NIMELS系统的任何特定实验或治疗参数内创造一组定量测定病原体生物体的CFU的变量，来简单适应NIMELS激光系统和方法。

这些参数创造了称为NIMELS增强标尺(NPMS)的尺度，开发了NIMELS激光固有的逆转抗性和/或增强抗微生物药物的MIC的现象，也用功率和/或治疗时间产生了对灼伤或损伤邻近组织的安全性的量度标准。NPMS尺度测量1-10之间的NIMELS效应数(Ne)，其中目标是以抗微生物剂浓度和NIMELS放射量的任何安全组合在降低病原体CFU计数中达到Ne≥4。尽管CFU计数在此处用于定量测定病原体生物体，但其它定量手段，例如染色检测方法或聚合酶链反应(PCR)方法，也可用于获得A、B和Np参数的值。

NIMELS效应数Ne是相互作用系数，它表示抗微生物药物与NIMELS激光协同对抗病原体靶标而对健康组织无害的联合抑制性/抑菌性效果的程度。

NIMELS增强数(Np)是表示特定浓度的抗微生物剂对病原体靶标是否有协同作用或拮抗作用而对健康组织无害的值。因此，在任何特定组的标准实验或治疗参数内：

·A＝单用NIMELS时病原体的CFU计数；

·B＝单用抗微生物剂时病原体的CFU计数；

·Np＝用(NIMELS+抗微生物剂)时病原体的CFU计数；和

·Ne＝(A+B)/2Np；

NIMELS效应数Ne的解释：

其中：

若2Np＜A+B，则在所采用的浓度和放射量用NIMELS激光成功地增强了(特定)抗微生物剂；

然后：

若Ne＝1，则没有增强效果。若Ne＞1，则有增强效果。若Ne≥2，则对抗微生物剂至少有50％增强效果。若Ne≥4，则对抗微生物剂至少有75％增强效果。若Ne≥10，则对抗微生物剂至少有90％增强效果。

样品计算1

·A＝110CFU

·B＝120CFU

·Np＝75CFU

·Ne＝(110CFU+120CFU)/2(75)＝1.5

样品计算2

·A＝150CFU

·B＝90CFU

·Np＝30CFU

·Ne＝(150CFU+90CFU)/2(30)＝4

一般而言，当治疗微生物感染时，用较低剂量的抗微生物剂可能有利，因为抗微生物剂很贵，并基本上与不合需要的副作用有关联，这些副作用可包括系统性肾损伤和/或肝损伤。因此，需要设计降低和/或增强抗微生物剂MIC的方法。本发明提供当治疗的区域同时用NIMELS激光系统治疗时降低抗微生物分子的MIC的系统和方法。

如果降低了用于局部和有抗性的病灶感染(例如皮肤、糖尿病足、褥疮)的抗微生物剂的MIC，那么将可恢复很多较老的、较便宜的和更安全的抗微生物剂治疗这些感染的疗效。因此，通过加入NIMELS激光(例如产生在一方面＞1，在另一方面≥4，在再一方面≥10的Ne值)来降低抗微生物剂的MIC，代表朝着恢复曾经失去的抗生素疗效的正确步骤。

因此，在一个方面，本发明提供降低根除或至少弱化微生物病原体所必需的抗微生物分子的MIC的方法和系统，其经由受辐射区内膜的去极化作用来实现，膜的去极化作用将降低受辐射的细胞的膜电位ΔΨ。这种变弱的ΔΨ将引起关联性的弱化质子动力势Δp和所影响的所有膜的相关生物能学。这种“NIMELS效应”增强抵抗微生物感染并对人宿主引起伤害的现有抗微生物分子，这是本发明另一目标。

在某些实施方案中，这样施用的光辐射如本文所述在NIMELS放射量具有约850nm-约900nm的波长。在例示性实施方案中，使用约865nm-约875nm的波长。在另外的实施方案中，这样施用的光辐射可在NIMELS放射量具有约905nm-约945nm的波长。在某些实施方案中，这样施用的光辐射可具有约925nm-约935nm的波长。在一方面，采用的波长为930nm。

其生物能系统受到本发明NIMELS激光系统影响的微生物病原体包括诸如细菌、真菌、霉菌、支原体、原生动物和寄生虫等微生物。如下所述，例示性实施方案可采用包括分别将870和930nm扩入括号的范围的多波长范围。

在本发明一个方面的方法中，设想波长范围的辐射独立地按顺序、以混合比或基本上并行地(所有都可使用脉冲波和/或连续波，CW，运行)实施。

可在给予抗微生物剂之前，之后或并行施予NIMELS能量以NIMELS放射量对生物污染物辐射。然而，所述以NIMELS放射量的NIMELS能量可在受感染的个体或其它哺乳动物中抗微生物剂达到“峰血浆水平”之后给予。应该注意的是，联合给予的抗微生物剂应该具有抵抗抗性的靶标污染物的任何天然敏感变体的抗微生物活性。

在约0.01M或更小或约0.001M或更小或约0.0005M或更小的抗微生物剂浓度，本发明方法和系统辐射的波长将污染物的敏感性增加到相似的非抗性污染物株的水平。

本发明方法减慢或消除靶位点的微生物污染物的进展，改进至少与污染物有关的某些症状或无症状病理状态，和/或增加污染物对抗微生物剂的敏感性。例如，本发明方法通过增加生物污染物对抗微生物剂(生物污染物已经发展出或获得对该抗微生物剂的抗性)的敏感性来导致靶位点的微生物污染物水平降低，和/或增强抗菌化合物活性，而对生物对象没有不利作用。与治疗前水平比较，微生物污染物水平可降低例如至少10％、20％、30％、50％、70％或更多。关于生物污染物对抗微生物剂的敏感性，所述敏感性增强至少10％。

在另一方面，本发明提供实现本发明其它方面的方法的系统。这样的系统包括用于产生辐射的激光振荡器、用于计算和控制辐射剂量的控制器和用于将辐射通过应用区域传输到治疗位点的递送组件(系统)。合适的递送组件/系统包括空芯光波导管(hollow waveguides)、光纤和/或自由空间(free space)/射束光传输组分。合适的自由空间/射束光传输组分包括准直透镜和/或孔径光阑。

在一种形式中，系统使用两个或多个固态二极管激光起双波长近红外光源作用。所述两个或多个固态二极管激光可用统一的控制器定位于单独架子上。所述两种波长可包括在约850nm-约900nm和约905nm-约945nm的两个范围的发射。使用本发明激光振荡器发射本文公开范围之一的单波长(或峰值，例如中心波长)。在某些实施方案中，这样的激光器用于发射基本上在约865-875nm和约925-935nm范围内的辐射。

本发明系统可包括期望产生的每一单个波长范围的合适的光源。例如，使用合适的固态激光二极管、可变超短脉冲激光振荡器或掺杂离子(例如用合适的稀土元素)的光纤或光纤激光器。在一种形式中，合适的近红外激光器包括掺钛蓝宝石。包括含其它固态、液态或气体增益(主动)媒介激光源在内的其它合适的激光源可在本发明范围内使用。

按照本发明一个实施方案，治疗系统包括适合产生基本上在约850nm-约900nm的第一波长范围内的光辐射的光辐射产生系统，促成通过应用区域传输光辐射的递送组件，和与光辐射产生装置操作性地连在一起用于控制通过应用区域传输辐射剂量以使每单位面积传输辐射的功率密度和能量密度时间积分低于预定阀值的控制器。同样在该实施方案内，治疗系统尤其适于产生基本上在约865nm-约875nm的第一波长范围的光辐射。

按照另外的实施方案，治疗系统包括经配置产生基本上在约905nm-约945nm的第二波长范围的光辐射的光辐射产生装置；在某些实施方案中，光辐射产生装置同时或并行/序贯产生所述第一波长范围。同样是在该实施方案范围内，治疗系统尤其适于产生基本上在约925nm-约935nm的第一波长范围的光辐射。

治疗系统可进一步包括用于通过应用区域传输第二波长范围(在可适用的地方为第一波长范围)的光辐射的递送组件(系统)，和操作性地用于控制选择性产生基本上在第一波长范围或基本上在第二波长范围或其任何组合的辐射的光辐射产生装置的控制器。

按照一个实施方案，递送组件包括一种或多种光纤，其末端经配置和排布用于在医疗器械的光传输范围内的某位置插入患者组织，其中以NIMELS放射量将辐射递送到医疗器械周围的组织。递送组件可进一步包括自由射束光系统。

按照另外的实施方案，治疗系统控制器包括控制辐射剂量的功率限幅器。控制器可进一步包括储存患者概况的存储器和用于根据操作者输入的信息计算特定靶位点所需剂量的放射量计算器。在一个方面，存储器也可用于储存关于不同类型疾病和治疗概况的信息，例如，与特定应用有关的辐射型式和辐射剂量。可按不同型式将光辐射从治疗系统递送到应用位点。可作为连续波(CW)或脉冲或每种的组合来产生和传输辐射，例如，以单波长型式或以多波长(例如双波长)型式。例如，可将两种辐射波长多路传输(光联合)或同时传输到相同治疗位点。可使用的合适的光组合技术包括但不限于：偏振射束分光器(组合器)的使用，和/或从合适的镜子和/或透镜聚焦输出的重叠，或其它合适的多路传输/联合技术。或者，可以以交替型式来传输辐射，其中将两个波长的辐射交替传输到同一治疗位点。可按照本发明NIMELS技术按需来选择两个或多个脉冲之间的时间间隔。每次治疗可联合任何这些传输模式。可按需选择传输的光辐射的强度分布。

例示性实施方案包括高顶礼帽(top-hat)式或基本上高顶礼帽式(例如梯形等)强度分布。可使用其它强度分布，例如高斯分布。

本文所用术语“生物污染物”用来指经与靶位点直接或间接接触，能够对靶位点(例如患者受感染的组织或器官)或对接近靶位点的哺乳动物(例如，诸如，举例而言，在细胞、组织或移植在受者中的器官的情况下，或在用于患者的装置的情况下)产生不需要的和/或有害作用的污染物。根据本发明的生物污染物为通常在靶位点发现的诸如细菌、真菌、霉菌、支原体、原生动物、寄生虫等微生物，它们为本领域技术人员已知。

本领域技术人员将理解，本发明方法和系统可应用于相关的通常为本领域技术人员已知的多种生物污染物。提供以下名单仅为了阐明可根据本发明方法和装置靶向的宽广范围的微生物的目的，并非意欲限制本发明范围。

因此，生物污染物(病原体)的例证性非限制性实例包括但不限于：任何细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌属(Enterobater)、芽胞杆菌属(Bacillus)、弧形杆菌属(Campylobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、克雷伯菌属(Klebsiella)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、链球菌属(Streptococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)。

为进一步阐明，所考虑的生物污染物包括但不限于：任何真菌，例如毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、念珠菌属、短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)、镰刀菌属(Fusarium spp)、曲霉属(Aspergillus spp)、链格孢属(Alternaria)、枝顶孢属(Acremonium)、双间柱顶孢(Scytalidinumdimidiatum)和透明小柱透明柱霉(Scytalidium hyalinum)。寄生虫也可为被靶向的生物污染物，例如锥虫(Trypanosoma)和疟原虫(malarialparasites)，包括疟原虫种，以及霉菌、支原体和朊病毒。还可靶向病毒，包括例如：人免疫缺陷病毒和其它逆转录病毒、疱疹病毒、细小病毒、丝状病毒、圆环病毒、副粘病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒(包括乙型肝炎和丙型肝炎)、痘病毒、披膜病毒、EB病毒和细小病毒。

应该理解，待辐射的靶位点不必已经受到生物污染物感染。本发明方法甚至可用于在感染前“预防”。另外的实施方案包括在医疗器械上使用，例如导管(例如IV导管、中心静脉导管、动脉导管、外周导管、透析导管、腹膜透析管、硬膜外麻醉导管)、人造关节、支架、外固定器(external fixator pins)、胸导管、饲喂管等。

在某些情况下，辐射可治标以及预防。因此，为治疗或减轻感染症状，本发明方法以治疗有效量的时间来辐射一个或多个组织。措辞“治疗或减轻”意即与没有受到这样的治疗的个体的症状比较，减轻、防止和/或逆转按本发明治疗的个体的症状。

本领域技术人员应该明白，本发明应用于相关的由微生物、真菌和病毒感染引起的或否则与之有关的疾病(参见Harrison的Principles of Internal Medicine(内科医学原理)，第13版，McGraw Hill，New York(1994)，其全部教导通过引用合并到本文中)。在某些实施方案中，本发明方法和系统与本领域可用的传统治疗方法一起使用(参见例如Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础)，第8版，1990，Pergmon Press，其全部教导通过引用合并到本文中)，以通过给予已知抗菌组合物来治疗感染。术语“抗微生物组合物”、“抗微生物剂”指将其给予动物(包括人)并抑制微生物感染增殖的化合物和其组合(例如抗细菌剂、抗真菌剂和抗病毒剂)。

所考虑的广泛应用范围(wide breath)包括例如：所提及的不在少数的多种皮肤病、手足病、小儿病和一般药。待治疗的靶位点与给予的能量之间的相互作用由多种参数来定义，这些参数包括波长、靶位点的化学和物理性质、功率密度或射束辐照度、使用的是连续波(CW)还是脉冲辐射、激光射束光点直径、照射时间、能量密度和作为具有任何这些参数的激光辐射的结果的靶位点物理性质的任何变化。另外，靶位点的物理性质(例如吸收和散射系数、散射各向异性、热传导性、热容量和机械强度)也可影响总体效果和结果。

NIMELS放射量(dosimetry)表示功率密度(W/cm²)和能量密度(J/cm²，此处1瓦＝1焦耳/秒)值，在该值时主题波长能够产生ROS，并藉此降低靶位点生物污染物的水平，和/或辐射污染物以通过降低ΔΨ且同时产生ROS来增加生物污染物(所述污染物有对该抗微生物剂的抗性)对抗微生物剂的敏感性，而对除生物污染物外的生物部分(例如哺乳动物细胞、组织或器官)没有无法耐受的风险和/或无法耐受的副作用。

如Boulnois 1986(Lasers Med Sci 147-66(1986)，其全部教导通过引用合并到本文中)所述，以低功率密度(也称作辐照度)和/或能量，激光-组织之间的相互作用可阐述为纯粹的光学(光化学)，而以较高功率密度，光-热相互作用随之发生。在下文例示的某些实施方案中，NIMELS放射量参数位于在传统上光动力疗法与外源药物、染料和/或发色团一起使用的区域里已知的光化学和光-热参数之间，但可在不需要外源药物、染料和/或发色团的光动力疗法领域起作用。

能量密度-也可表达为流量(fluence)或粒子或放射流和时间的乘积(或积分)-用于本领域医学激光应用通常在约1 J/cm²-约10,000J/cm²(5个数量级)之间变化，然而功率密度(辐照度)在约1x10^-3W/cm²-超过约10¹²W/cm²(15个数量级)之间变化。当功率密度和辐射照射时间之间采用反向相关关系时，可观察到对于任何预期的激光-组织相互作用需要大约同样的能量密度。结果，激光照射持续时间(辐射时间)是确定激光-组织作用的特性和安全性的主要参数。例如，如果人们在算术上在体内寻找组织热蒸发(非磨蚀)(基于Boulnois 1986)，那么可观察到为了产生1000J/cm²的能量密度(参见表1)，人们可使用任何以下放射量参数：

表1：在Boulnois表基础上派生的数值实例

功率密度        时间       能量密度

1x10⁵W/cm²      0.01秒     1000J/cm²

1x10⁴W/cm²      0.10秒     1000J/cm²

1x10³W/cm²      1.00秒     1000J/cm²

该级数阐述了可用于对抗组织中的生物污染物的NIMELS相互作用的合适的方法或基本运算法则。换言之，为了达到激光-组织相互作用现象，该数学关系为反向相关。通过在能量密度和时间和功率参数中插入NIMELS实验数据，该基本原理可用作放射量计算的基础用于观察到的由NIMELS能量赋予的抗菌现象。

在受辐射的靶位点特定相互作用(例如靶位点的化学和物理性质；使用的是连续波(CW)还是脉冲辐射；激光射束光点直径；和作为具任何这些参数的激光辐射的结果的靶位点物理性质的任何变化，例如吸收和散射系数、散射各向异性、热传导性、热容量和机械强度)的基础上，执行者能够调整功率密度和时间以获得所需要的能量密度。

本文所提供的实例显示了在体外和体内治疗两种情况下这样的关系。因此，在治疗情况下，例如甲癣或受感染的伤口，对于具有1-4cm直径的光点直径，功率密度值在约0.5W/cm²-约5W/cm²之间变化，以维持在远低于“变性”和“组织过热”水平的安全和不损伤/最小程度损伤热激光-组织相互作用范围内。可使用其它合适的光点直径。对于这种反向相关关系，只要传输了所需能量，用于具有这些波长的NIMELS相互作用所需的阀值能量密度可保持不依赖于光点直径。在例示性实施方案中，通过均一的几何分布将光能输送到组织(例如平顶或高顶礼帽级数)。用这样的技术，可计算足以产生ROS(NIMELS效应)的合适的NIMELS放射量，以达到降低生物污染物水平和/或提高生物污染物(所述污染物对抗微生物剂有抗性)对抗微生物剂的敏感性所需但低于“变性”和“组织过热”水平的的阀值能量密度。

本文例示的在体内靶向微生物(例如甲癣)的NIMELS放射量为约200J/cm²-约700J/cm²，实施大约100-700秒。这些功率值没有接近与光切除或光热(激光/组织)相互作用有关的功率值。

校准的激光射束的强度分布由射束的功率密度给出，并被定义为激光输出功率与以(cm²)表示的圆面积的比率和能量的空间分布型式。因此，入射面积为1.77cm²的高斯射束模式的1.5cm辐射光点的照射模式可在1.77cm²辐射区内产生至少6个不同的功率密度值。这些变化的功率密度将光点表面区域上的强度(或能量浓度)从1(在外围)增加到中心点的6。在本发明某些实施方案中，提供射束模式，其克服了这种与传统激光射束发射有关的固有误差。NIMELS参数可作为治疗时间(Tn)的函数按照下式计算：

Tn＝能量密度/功率密度

在某些实施方案中(参见例下文体外实验)，Tn为约50-约300秒，在其它实施方案中，Tn为约75-约200秒，在又一实施方案中，Tn为约100-约150秒。在体内实施方案中，Tn为约100-约1200秒。

使用上述关系和所需的光强度分布，例如本文所述平顶照明几何分布，业已实验性证明了一系列体内能量参数用于体外NIMELS微生物去污染治疗有效。因此，业已证明对于给定靶位点关键参数为以多种不同光点直径和功率密度用于NIMELS治疗所需的能量密度。

“NIMELS放射量”包括从第一阀值点(本发明主题波长在此点能够光学上降低靶位点的ΔΨ)到第二终点和/或增加生物污染物(所述污染物抗该抗微生物剂)对抗微生物剂的敏感性(该数值临近检测到对生物部分的无法耐受的不利风险或作用(例如热损伤，例如穿孔)的数值)的功率密度和/或能量密度范围。本领域技术人员应该了解，在某种情况下，考虑到从本发明方法获得的内在益处，可容忍对靶位点(例如哺乳动物细胞、组织或器官)的有害作用和/或风险。因此，预期终止点为在该点时有害作用相当大并由此而不必要(例如细胞死亡、蛋白质变性、DNA损伤、发病率或死亡率)的点。

在某些实施方案中，例如对于体内应用，本文涵盖的功率密度范为约0.25-约40W/cm²。在其它实施方案中，功率密度范围为约0.5W/cm²-约25W/cm²。

在另外实施方案中，功率密度范围可包括约0.5W/cm²-约10W/cm²的值。本文例示的功率密度为约0.5W/cm²-约5W/cm²。业已在体内证明约1.5-约2.5W/cm²的功率密度对于各种微生物有效。

经验数据似乎显示当在体外装置(例如培养板)而不是体内(指甲)靶向生物污染物时，通常使用较高的功率密度。

在某些实施方案中(参见以下体外实施例)，本文预期的能量密度范围大于50J/cm²但小于约25,000J/cm²。在其它实施方案中，能量密度范围为约750J/cm²-约7,000J/cm²。在又一实施方案中，能量密度范围为约1,500J/cm²-约6,000J/cm²，取决于生物污染物是在体外装置(例如培养板)中还是在体内(例如脚指甲或医疗器械周围)被靶向。在某些实施方案中(参见以下体内实施例)，能量密度为约100J/cm²-约500J/cm²。在其它体内实施方案，能量密度为约175J/cm²-约300J/cm²。在又一实施方案中，能量密度为约200J/cm²-约250J/cm²。在某些实施方案中，能量密度为约300J/cm²-约700J/cm²。在某些其它实施方案中，能量密度为约300J/cm²-约500J/cm²。在又一实施方案中，能量密度为约300J/cm²-约450J/cm²。

用于各种体外治疗微生物种类的经验试验的功率密度为约1W/cm²-约10W/cm²。

本领域技术人员应该了解，在本文涵盖的功率密度和能量密度范围内，用于特定情况的具体合适的NIMELS放射量值的确定可经由常规试验以经验为主来进行。近红外能量与牙周治疗联合使用的从业者(例如牙医)根据各个给定患者有关的紧急事件例行调整功率密度和能量密度(例如调整作为组织颜色、组织构造和病原体入侵深度函数的参数)。举例而言，激光治疗浅色组织的牙周感染(例如黑色素缺乏患者)将比深色组织具有更大的热安全参数，因为深色组织将更有效地吸收近红外能量，并因此将这些近红外能量在该组织中更快地转化为热。因此，明显需要从业者确定用于不同治疗方案的多种不同NIMELS放射量值的能力。

如下所述，业已发现按照本发明方法可有效治疗抗生素抗性细菌。另外，业已发现本发明方法可用于增强传统方法，用于与传统方法联合使用，代替传统治疗或甚至连续地作为有效治疗方法。因此，本发明可与抗生素治疗联合。术语“抗生素”包括但不限于：β-内酰胺类、青霉素类和头孢菌素类、万古霉素类、杆菌肽类、大环内酯类(红霉素类)、酮内酯(ketolide)类(泰利霉素(telithromycin))、林可酰胺(lincosamide)类(林大霉素(clindomycin))、氯霉素(chloramphenicol)类、四环素类、氨基糖苷(aminoglycoside)类(庆大霉素类)、两性霉素类、anilinouracils、头孢唑啉(cefazolin)类、克林霉素(clindamycin)类、莫匹罗星(mupirocin)类、磺胺(sulfonamide)类和甲氧苄啶(Trimethoprim)、利福平(rifampicin)类、甲硝唑(metronidazole)类、喹诺酮(quinolone)类、新生霉素(novobiocin)类、多粘菌素(polymixin)类、噁唑烷酮类(例如雷奈佐利(linezolid))、甘氨环素(glycylcycline)类(例如替加环素(tigecycline))、环脂肽类(例如达托霉素)、截短侧耳素(pleuromutilin)类(例如瑞他莫林(retapamulin))和短杆菌肽(gramicidin)类等和其任何盐或变体。还应该理解，在本发明范围内四环素类包括但不限于：(immunocycline)、氯四环素(chlortetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、地美环素(demeclocycline)、甲烯土霉素(methacycline)、多西环素(doxycycline)和米诺环素等。还应该进一步理解，在本发明范围内，氨基糖苷类抗生素包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)和新霉素(neomycin)等。

如下所述，业已发现按照本发明方法可有效治疗抗真菌剂抗性的真菌。另外，业已发现本发明方法可用于增强传统方法，用于与传统方法联合使用，代替传统治疗或甚至连续地作为有效治疗方法。因此，本发明可与抗真菌治疗联合使用。术语“抗真菌剂”包括但不限于：多烯类、唑类、咪唑类、三唑类、丙烯胺类、棘白菌素(echinocandin)类、环吡酮(cicopirox)、氟胞嘧啶、灰黄霉素(griseofulvin)、阿莫罗芬(amorolofine)、sodarins和其组合(包括其盐)。

如下所述，业已指定按照本发明方法可有效治疗抗肿瘤剂抗性的癌症。另外，业已发现本发明方法可用于增强传统方法，用于与传统方法联合使用，代替传统治疗或甚至连续地作为有效治疗方法。因此，本发明可与抗肿瘤治疗联合使用。术语“抗肿瘤剂”包括但不限于：放线菌素(actinomycin)、蒽环霉素(anthracycline)类、博莱霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)、紫杉烷(taxane)类、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)和其组合(包括其盐)。

在先前技术中试图在细菌和真菌中发现药物抗性系统抑制剂或抗微生物剂增效剂的共同原则一直是，这样的作用剂必须对受感染的哺乳动物组织无毒，以便具有任何内在价值。此外，永远的事实是，抗微生物剂影响细菌或真菌的并非与哺乳动物宿主共有的细胞过程，因此，通常在实际上和设计上是安全的并具治疗作用。在先前技术中，如果抗微生物剂、增效剂和/或抗性逆转实体也以与其损伤病原体相同的方式影响哺乳动物细胞，那么它们就不能安全用于治疗。

在本发明中，实验数据(参见例如实例I-X)支持所有细胞型式的ΔΨ和Δp的普遍改变，因此导致了这样的概念，即不仅所有细胞膜的电-机械方面而且电-动力方面都不具有可足以被分开的不同的性质。这指出在射束路径上的所有细胞都受到去极化作用影响，而不仅仅是病原体细胞(不希望有的细胞)。

再次肯定NIMELS系统的光生物学和细胞热力学数据已经被阐明(即跨过原核和真核物种的所有膜的热力学都受到相同方式的影响)，利用这种普遍的光去极化作用，通过将抗微生物剂分子加入到治疗方案中并在(仅在)不希望有的细胞中增强这样的分子，独立地开发了本发明技术。这样被靶向的治疗结果可开发NIMELS激光的普遍去极化效应，该结果可对在治疗射束路径上的哺乳动物细胞比细菌和真菌级数更高并更短暂。因此，如实验数据显示，哺乳动物细胞面对光去极化作用和ROS产生，在暂时性能量爆发方面的测量度比在细菌或真菌细胞中所观察到的应该更大一些。

以下实例提供实验证据，该实验证据结合目前对光生物学和细胞热力学和当施用于细胞过程时热力学守恒的理解提供普遍的光膜去极化作用的概念。

实施例

包括以下实施例以证明本发明例示性实施方案，并非意欲限制本发明范围。本领域技术人员应该了解，无需偏离本发明精神和范围即可对特定实施方案进行很多改变，仍可获得相似或类似结果。

实施例I

表2：易感型的、中间型的和抗性型的金黄色葡萄球菌的MIC值

实施例II

细菌方法：用于体外MRSA实验的NIMELS治疗参数

以下参数阐明用于体外实验V和VIII-XII的施用于MRSA的本发明通用细菌方法。

A.用于MRSA的实验材料和方法

表3.CFU计数方法

时间(小时)	任务	FTE(小时)
			T-18	接种物过夜培养50ml直接来自甘油储液	1
T-4	确立初始培养物三个稀释度1∶50、1∶125、1∶250LB培养基	1
				监测初始培养物的OD600	4
T0	制备接种板培养物在上午10点，将OD600＝1.0的培养物在PBS中以1∶300稀释(50ml最终体积)，在室温储存1小时。(室温应该为大约25℃)	1
			T+1	接种24孔板将2ml等份样分配到24孔板的预定孔中，转移到NOMIR。	1
T+2到+8	稀释处理的样品在激光处理后，将来自各孔的100μL在PBS中系列稀释到最终稀释度1∶1000。	4
				将处理的样品涂板将100μL最终稀释液一式五份(5x)涂布到含及不含抗生素的TSB琼脂板上。(每孔10个TSB板)	2

	让板在37℃温育18-24小时。
			T+24	对每个板的菌落进行计数。	6

在体外试验中用大肠杆菌和白色念珠菌对所有NIMELS辐射实施相似的细胞培养和动力学方案。因此，例如，白色念珠菌ATCC14053液态培养物于37℃在YM培养基(21g/L，Difco)中生长。将标准混悬液等份分到24孔组织培养板的所选孔中。在激光处理后，从每孔移走100μL，连续稀释到1∶1000，得到最终稀释度为初始培养物的1∶5x10⁶。将各个最终稀释度的等份样涂布到单独板中。然后在37℃温育这些板大约16-20小时。进行手动菌落计数并记录。

表4.用于ΔΨ和ROS测定的方法

时间(小时)	任务	PTE(小时)
			T-18	接种物过夜培养50ml直接来自甘油储液	1
T-4	确立初始培养物三个稀释度1∶50、1∶125、1∶250LB培养基	1
				监测初始培养物的OD600	4
T0	制备接种板的培养物在上午10点，将OD600＝1.0的培养物在PBS中以1∶300稀释(50ml最终体积)，在室温储存1小时。(室温应该为大约25℃)	1
			T+1	接种24孔板用于测定将2ml等份样分配到24孔板的预定孔中，转移到NOMIR。	1
T+2到+8	稀释处理的样品在激光处理后，按照单独测定的指导处理各个对照和激光处理的样品。	4

在体外试验中用大肠杆菌和白色念珠菌对所有NIMELS辐射再次实施相似的细胞培养和动力学方案。因此，例如，白色念珠菌ATCC14053液态培养物于37℃在YM培养基(21g/L，Difco)中生长。将标准混悬液等份分到24孔组织培养板的所选孔中。在激光处理后，按照单独测定的指导处理各个激光处理样品和对照样品。

实施例III

哺乳动物细胞方法：用于体外HEK293(人胚肾细胞)实验的NIMELS 治疗参数

以下参数阐明用于体外实验的施用于HEK293细胞的本发明通用细菌方法。

A.用于HEK29S细胞的实验材料和方法

将存于自由式培养基(Invitrogen)中的HEK293细胞以1x10⁵个细胞/ml的密度(0.7ml总体积)接种到24孔板的适宜的孔中。在实验之前细胞在加湿培养箱中于37℃以8％CO₂温育大约48小时。在实验时细胞大约为90％融合，大约等于3x10⁵个总细胞。在临处理前用预温的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，在处理期间覆盖2ml的PBS。

在激光处理后，从孔中用机械方法取出细胞，转移到1.5ml的离心管。按照试剂盒厂商说明书测定线粒体膜电位和总谷胱甘肽。

实施例IV

体外测定CRT+(黄色)和CRT-(白色)金黄色葡萄球菌的NIMELS实验

我们用金黄色葡萄球菌的crt-(白色)突变体进行实验，用基因工程改造除掉crt基因(黄色类胡罗卜色素)得到该突变体，这些突变体经受了先前确定的NIMELS激光对野生型(黄色)金黄色葡萄球菌的非致死剂量。本实验目的是测定用NIMELS激光产生活性氧类别(ROS)和/或产生单线态氧的现象。在科技文献中，Liu等先前使用了类似的模型来测定黄色(类胡罗卜色素)金黄色葡萄球菌抗嗜中性粒细胞的抗氧化剂保护活性(Liu等，Staphylococcus aureus golden pigment impairsneutrophil killing and promotes virulence through its antioxidant activity(金黄色葡萄球菌的金黄色色素弱化了嗜中性粒细胞的杀伤力并通过其抗氧化性活性提高毒力)Vol 202，No 2，2005年7月18日，209-215，其全部教导通过引用合并到本文中)。

先前已经确定通过能够保护生物体免遭单线态氧的类胡罗卜(抗氧化剂)色素弱化了金黄色葡萄球菌的金黄色，当分离的突变体(crt^-)不能产生这样的类胡罗卜色素时，突变菌落在外观上为“白色”，其对氧化剂杀伤更敏感，具有受损的嗜中性粒细胞存活。

发现了NIMELS激光的非致死放射量(对野生型金黄色葡萄球菌)一直可杀死达到90％的突变“白色”细胞，而不能杀死正常的金黄色葡萄球菌。在这两种金黄色葡萄球菌菌株中的唯一遗传学差异是突变体缺乏抗氧化剂色素。该实验数据强烈提示正是内源性产生的活性氧类别和/或单线态氧杀死了“白色”金黄色葡萄球菌。

表5.数据：

D1-D4黄色野生型金黄色葡萄球菌

D5-D6白色“crt^-”突变型金黄色葡萄球菌

板编号	输出功率(W)	射束光点(cm)	时间(秒)	总能量焦耳	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
							D1	11	1.5	720	7920	4481.793	6.224712
D2	11.5	1.5	720	8280	4685.511	6.507654
							D3	12	1.5	720	8640	4889.228	6.790595
D4	12.5	1.5	720	9000	5092.946	7.073536
							板编号	输出功率(W)	射束光点(cm)	时间(秒)	总能量焦耳	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
D5	11	1.5	720	7920	4481.793	6.224712
							D6	11.5	1.5	720	8280	4685.511	6.507654
D7	12	1.5	720	8640	4889.228	6.790595
							D8	12.5	1.5	720	9000	5092.946	7.073536

样品D1-D4黄色野生型金黄色葡萄球菌。

样品D5-D6白色“crt^-”突变型金黄色葡萄球菌

表6.

实施例V

用于在MRSA、白色念珠菌和大肠杆菌中ΔΨ改变的NIMELS体外 试验

存在经挑选的可在15-30分钟内为完整细胞吸收并积聚在完整细胞中而不会可感知地染色其它原生质组份的荧光染料。这些膜电位染料指示剂多年来一直有用，业已用于研究细胞生理学。可易于监测这些染料的荧光强度，因为其荧光光谱性质对跨膜电位ΔΨ-稳态值的变化作出响应。

这些染料通常通过在细胞外介质和膜或膜细胞质之间的电位依赖分配来起作用。经由电势与染料上的离子电荷相互作用发生染料再分配。这种荧光可通过质子载体(protonophore)羰基氰化间氯苯腙(CCCP)在约5分钟内消除，说明染料浓度的维持依赖于通过功能性ETS和Δp维持的内部负性的跨膜电位。

假设检验：

虚假设是μ1-μ2＝0：

μ1是接受羰花青染料的对照细胞培养物(未受激光处理)中的荧光强度；

μ2是用来自NIMELS激光的亚致死放射量预先辐射的相同的细胞培养物中的荧光强度。

数据显示通过用NIMELS激光系统预处理(细胞)，消除了(小于未受辐射的对照或“未受激光处理”细胞)细胞荧光，这表明NIMELS激光经由细胞质膜与细胞的呼吸过程和氧化磷酸化相互作用。

μ1-μ2＝0

将确认对细胞培养物加入亚致死NIMEL辐射对ΔΨ-稳态没有影响。

μ1-μ2＞0

将确认对细胞培养物加入亚致死NIMEL辐射对ΔΨ-稳态有消除或去极化效应。

材料和方法

BacLight^TM细菌膜电位试剂盒(B34950，Invitrogen U.S.)。BacLight^TM细菌膜电位试剂盒提供羰花青染料DiOC2(3)(碘化3，3’-二乙基氧杂羰花青，组分A)和CCCP(羰基氰化3-氯苯腙，组分B)(二者都存在于DMSO中)和1xPBS溶液(组分C)。

DiOC2(3)在所有细菌细胞中发出绿荧光，但随着染料分子在由较大的膜电位引起的较高细胞质浓度时本身缔合，荧光朝红光发射位移。质子离子载体例如CCCP通过消除质子梯度破坏膜电位，因此导致较高的绿荧光。

MRSA中膜电位ΔΨ的检测

用对照和激光处理样品在亚致死放射量的群体平均荧光强度计算绿荧光发射：

表6

数据显示当激光处理的细胞如图8所示具有较少的“绿荧光”时，μ1-μ2＞0。这些MRSA样品显示用亚致死NIMELS放射量明显改变并降低ΔΨ-稳态-细菌到ΔΨ-瞬态-细菌之一。

白色念珠菌中膜电位ΔΨ的检测

用对照和激光处理样品在亚致死放射量的群体平均荧光强度计算绿荧光发射，其示于以下表中：

表7

数据显示当激光处理的白色念珠菌细胞如图9所示具有较少的“绿荧光”时，μ1-μ2＞0。这些白色念珠菌样品显示用逐渐升高的(亚致死)NIMELS激光放射量明显改变并降低ΔΨ-稳态-细菌到ΔΨ-瞬态-真菌之一。

大肠杆菌中膜电位ΔΨ的检测

用对照和激光处理样品在亚致死放射量的群体平均荧光强度计算红/绿比率。

数据显示当激光处理的细胞如图9所示具有较少的“绿荧光”时，μ1-μ2＞0。这些大肠杆菌样品显示用亚致死NIMELS放射量明显改变并降低ΔΨ-稳态-细菌到ΔΨ-瞬态-细菌之一。

实施例VI

用于在白色念珠菌中用亚致死激光放射量的NIMELS体外试验

假设检验：

虚假设是μ1-μ2＝0：

a)μ1是用线粒体膜电位检测试剂盒检测的对照细胞培养物线粒体中的荧光强度；

b)μ2是用来自NIMELS激光的亚致死放射量预先辐射并用线粒体膜电位检测试剂盒检测的相同的细胞培养物中的荧光强度。

数据显示通过用NIMELS激光系统预处理(细胞)，消除了(小于未对照未受激光处理细胞)线粒体荧光，结果表明NIMELS激光与真菌及哺乳动物细胞的线粒体中的细胞呼吸过程和氧化磷酸化作用相互作用。

μ1-μ2＝0

将确认对细胞培养物加入亚致死NIMEL辐射对ΔΨ-稳态-线没有影响。

μ1-μ2＞0

将确认对细胞培养物加入亚致死NIMEL辐射对ΔΨ-稳态-线有消除或去极化效应。

材料和方法

线粒体膜电位检测试剂盒(APO LOGIX JC-1)(Cell TechnologyInc，950 Rengstorff Ave，Suite D，Mountain View CA 94043)。

线粒体膜电位(ΔΨ)损失是细胞凋亡的标志。APO LOGIX JC-1检测试剂盒测量细胞中的线粒体膜电位。

在非凋亡性细胞中，JC-1(碘化5，5′，6，6′-四氯-1，1’，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花青(tetraethylbenz imidazolylcarbocyanine))在细胞溶质中作为单体(绿色)存在，也能在染为红色的线粒体中积聚成凝聚物。然而，在凋亡和坏死性细胞中，JC-1以单体形式存在，将细胞溶质染为绿色。

表8.白念色珠菌放射量表

(APO LOGIX JC-1)试剂盒通过将绿荧光转换为红荧光来测量膜电位。在图10A中，测量了红色外观并绘图，红色应该只出现在具有完整膜的细胞中，对照和激光处理样品中的绿与红的比率示于图10B中。

在本试验中，很明显激光处理样品中的红荧光减少了，同时绿与红的比率提高了，这标志去极化作用。这些结果与跨膜ΔΨ试验的结果一样(即二者数据都显示去极化作用)。

这些结果还显示μ1-μ2＞0，以及对细胞线粒体进行亚致死NIMEL辐射消除ΔΨ-稳态-线或使其去极化，表明明显将白念色珠菌ΔΨ-稳态-线-真菌减少为ΔΨ-瞬态-线-真菌。

实施例VII

用于在人胚肾细胞ΔΨ-线中用亚致死激光放射量的NIMELS体外试 验

假设检验：

虚假设是μ1-μ2＝0：

a)μ1是经受线粒体膜电位检测试剂盒检测的哺乳动物对照细胞培养物线粒体(未受激光处理)中的荧光强度；

b)μ2是用来自NIMELS激光的亚致死放射量预先辐射并经受线粒体膜电位检测试剂盒检测的相同的细胞培养物中的荧光强度。

数据显示通过用NIMELS激光系统预处理(细胞)，消除了(小于对照未受激光处理细胞)线粒体荧光，结果指出NIMELS激光与哺乳动物细胞的线粒体中的细胞呼吸过程和氧化磷酸化作用相互作用。

μ1-μ2＝0

将确认对哺乳动物细胞培养物线粒体加入亚致死NIMEL辐射对ΔΨ-稳态-线-哺没有影响。

μ1-μ2＞0

将确认对哺乳动物细胞培养物加入亚致死NIMEL辐射对ΔΨ-稳态-线-哺有消除或去极化效应。

材料和方法

线粒体膜电位检测试剂盒(APO LOGIX JC-1)(Cell TechnologyInc，950 Rengstorff Ave，Suite D，Mountain View CA 94043)。

线粒体膜电位(ΔΨ)损失是细胞凋亡的特点。APO LOGIX JC-1检测试剂盒测量细胞中的线粒体膜电位。在非凋亡性细胞中，JC-1(碘化5，5′，6，6′-四氯-1，1’，3，3′-四乙基苯并咪唑羰花青)在细胞溶质中作为单体(绿色)存在，也能在染为红色的线粒体中积聚成凝聚物。然而，在凋亡和坏死性细胞中，JC-1以单体形式存在，将细胞溶质染为绿色。

表9.哺乳动物细胞放射量

HEK-293(人胚肾细胞)ΔΨ-线测定

(APO LOGIX JC-1)试剂盒通过将绿荧光转换为红荧光来测量膜电位。在图11A中，测量了红色外观并绘图，红色应该只出现在具有完整膜的细胞中，对照和激光处理样品中的绿与红的比率示于图11B中。

在本试验中，很明显激光处理样品中的红荧光减少了，同时绿与红的比率提高了，这标志去极化作用。这些结果显示μ1-μ2＞0，以及对哺乳动物细胞线粒体进行亚致死NIMEL辐射消除了ΔΨ-稳态-线-哺或使其去极化，表明明显将哺乳动物ΔΨ-稳态-线-哺减少为ΔΨ-瞬态-线-哺。

实施例VIII

活性氧类别(ROS)的NIMELS体外试验

在用可与先前实施例中上述用于ΔΨ试验相比的亚致死激光放射量的激光将细菌跨膜ΔΨ-稳态-细菌改变为ΔΨ-瞬态-细菌、将ΔΨ-稳态-线-真菌改变为ΔΨ-瞬态-线-真菌和将ΔΨ-稳态-线-哺改变为ΔΨ-瞬态-线-哺后，实施这些用于产生活性氧类别(ROS)的体外试验。

材料和方法

总谷胱甘肽定量检测试剂盒(Dojindo Laboratories，KumamotoTechno Research Park，2025-5Tabaru，Mashiki-machi，Kamimashiki-gun，Kumamoto 861-2202，JAPAN)。

谷胱甘肽(GSH)是动物组织、植物组织、细菌和酵母中最丰富的硫醇(SH)化合物。GSH起多种不同作用，例如对抗活性氧类别的保护作用和保留蛋白质SH基。在这些反应期间，GSH转化为谷胱甘肽二硫化物(GSSG，GSH的氧化形式)。因为GSSG被谷胱甘肽还原酶酶促还原，所以GSH在生物体中是占优势的形式。DTNB(5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸))称为Ellman试剂，被开发用于检测硫醇化合物。在1985年，提出了谷胱甘肽再循环系统，通过DTNB和谷胱甘肽还原酶创造了极为敏感的谷胱甘肽检测方法。DTNB和谷胱甘肽(GSH)反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。因为2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物，所以可通过在412nm处测量吸光率来测定样品溶液中的GSH浓度。GSH通过谷胱甘肽还原酶从GSSG产生，再次与DTNB反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸。因此，这一再循环反应改进总谷胱甘肽检测的敏感性。

ROS在显著浓度时，将以超过其由谷胱甘肽抗氧化剂系统组分(过氧化氢酶、过氧化物酶、GSH)还原的速率的速率快速特异性地与靶标反应。

以将ΔΨ-稳态-细菌改变为ΔΨ-瞬态-细菌之一的亚致死NIMELS放射 量在MRSA中检测谷胱甘肽

如图12所示的结果清楚表明，以将ΔΨ-稳态-细菌改变为ΔΨ瞬态-细菌之一的亚致死NIMELS放射量在MRSA中降低总谷胱甘肽，这是用亚致死将跨膜ΔΨ-稳态-细菌改变为ΔΨ-瞬态-细菌之一产生ROS的证据。

以将ΔΨ-稳态-细菌改变为ΔΨ-瞬态-细菌之一的亚致死NIMELS放射 量在大肠杆菌中检测谷胱甘肽

如图20所示的结果清楚表明，以将ΔΨ-稳态-细菌改变为ΔΨ瞬态-细菌之一的亚致死NIMELS放射量在大肠杆菌中降低总谷胱甘肽，这是用亚致死将跨膜ΔΨ-稳态-细菌改变为ΔΨ-瞬态-细菌之一产生ROS的证据。

以将ΔΨ-稳态-线-真菌改变为ΔΨ-瞬态-线-真菌并随后将ΔΨ-稳态-真菌改变为ΔΨ-瞬态-真菌之一的亚致死NIMELS在白色念珠菌中检测谷胱甘肽。

以将ΔΨ-稳态-线-真菌改变为ΔΨ-瞬态-线-真菌并随后将ΔΨ-稳态-真 菌改变为ΔΨ-瞬态-真菌之一的亚致死NIMELS放射量在白色念珠菌 中检测谷胱甘肽

如图13所示的结果清楚表明，以将ΔΨ-稳态-线-真菌改变为ΔΨ瞬态-线-真菌并随后将ΔΨ-稳态-真菌改变为ΔΨ-瞬态-真菌之一的亚致死NIMELS放射量在白色念珠菌中降低总谷胱甘肽，这是用亚致死将ΔΨ-稳态-线-真菌改变为ΔΨ瞬态-线-真菌并随后将ΔΨ-稳态-真菌改变为ΔΨ-瞬态-真菌之一产生ROS的证据。

以将ΔΨ-稳态-线-哺改变为Ψ-瞬态-线-哺的亚致死NIMELS放射量在 HEK 293(人胚肾细胞)中检测谷胱甘肽

如图14所示的结果清楚表明，以将ΔΨ-稳态-线-哺改变为ΔΨ瞬态-线-哺的亚致死NIMELS放射量在HEK-293(人胚肾细胞)中降低总谷胱甘肽，这是用亚致死将跨膜ΔΨ-稳态-线-哺改变为ΔΨ-瞬态-线-哺产生ROS的证据。

实施例IX

用红霉素和甲氧苄啶评估亚致死剂量NIMELS激光对MRSA的影响

在本实施例中，在MRSA中测定了亚致死剂量的NIMELS激光对抗生素红霉素的增强作用是否比对抗生素甲氧苄啶的增强作用更强。在红霉素抗性中流出泵起主要作用。在革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌中没有报道甲氧苄啶流出泵抗性机制。

背景：红霉素为大环内酯抗生素，具有与β-内酰胺青霉素极为相似的抗菌谱。它过去在治疗大范围的影响皮肤和呼吸道的革兰氏阳性细菌感染中有效，被认为是使用最安全的抗生素之一。过去红霉素用于对青霉素类过敏的人群。红霉素的作用机制是通过阻断细菌蛋白质合成来防止细菌生长和复制。这是因为红霉素结合细菌核糖体的50S中的23S rRNA分子，藉此阻断生长的肽链的排出由此抑制肽的移动而得以实现。红霉素抗性(与其它大环内酯类一致)流传猖獗，广泛传播，经由两个重要抗性系统来完成。

A)将50S核糖体亚基中的23S rRNA改变为不敏感；

B)将药物流出细胞。

甲氧苄啶是历史上用于治疗尿道感染的抗生素。其为称作二氢叶酸还原酶抑制剂的抗微生物剂类的成员。甲氧苄啶的作用机制是干扰细菌二氢叶酸还原酶(DHFR)系统，因为其为二氢叶酸类似物。由于其对酶的亲和力比天然底物高1000倍，这引起DHFR的竞争性抑制。

因此，甲氧苄啶抑制分子四氢叶酸的合成。四氢叶酸是从头合成DNA核苷酸胸苷酸必不可少的前体。细菌不能从环境(即感染宿主)中吸收叶酸，因此，依赖自己从头合成四氢叶酸。对该酶的抑制最终防止DNA复制。

甲氧苄啶抗性通常是因正常染色体DHFR或药物抗性DHFR酶生产过剩而产生。甲氧苄啶抗性金黄色葡萄球菌的报道已经指出，抗性为染色体介导型式，或在大质粒上编码。业已报道某些菌株既表现染色体介导又表现质粒介导的甲氧苄啶抗性。在革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌中，对甲氧苄啶的抗性是由于遗传突变，尚无报道说甲氧苄啶被主动流出出细胞。

细菌的流出泵

细菌和真菌中药物抗性的主要途径为将抗生素主动排出(流出)细胞，由此在细胞的细胞质内达不到治疗浓度。

主动流出抗生素(和其它有害分子)是由革兰氏阳性细菌的细胞质膜和革兰氏阴性细菌的外膜中的一系列跨膜蛋白介导的。

临床上，经由流出泵介导的抗生素抗性在革兰氏阳性细菌中对于大环内酯类、四环素和氟喹诺酮类最有意义。在革兰氏阴性细菌中，流出介导的β-内酰胺抗性也具有高度临床意义。

假设检验

虚假设为μ1-μ2＝0和μ1-μ3＝0，其中

a)μ1为作为对照的来自NIMEL激光系统的对MRSA的亚致死放射量；和

b)μ2为来自NIMEL激光系统的对MRSA的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入甲氧苄啶；和

c)μ3为来自NIMEL激光系统的对MRSA的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入红霉素。

数据表明在亚致死辐射后加入抗生素甲氧苄啶或红霉素，导致这些MRSA菌落生长降低，如下：

μ1-μ2＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入甲氧苄啶，对MRSA菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ2＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入甲氧苄啶，对MRSA菌落的正常生长产生有害作用。

μ1-μ3＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入红霉素，对MRSA菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ3＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入红霉素，对MRSA菌落的正常生长产生有害作用。

表10

结果

本实验清楚表明，在用NIMELS系统的亚致死激光参数下，μ1-μ2＝0并μ1-μ3＝0。这指出流出泵受到抑制，对红霉素的抗性通过NIMELS对MRSA的ΔΨ-稳态-细菌的效应逆转了。

实施例X

用四环素和利福平评估亚致死剂量的NIMELS激光对MRSA的影响

本实验目的是在MRSA中观察亚致死剂量的NIMELS激光对抗生素四环素的增强作用是否比对抗生素利福平的增强作用更强。充分地研究了流出泵，其在四环素抗性中起主要作用。然而，在革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌中没有报道利福平流出泵抗性机制。

本实验先前也用红霉素和甲氧苄啶进行过，且数据显示NIMELS效应能够损伤红霉素的流出泵抗性机制。

四环素

认为四环素是抑菌性抗生素，意即其通过抑制蛋白质合成妨碍细菌生长。四环素由通过酶氨酰-tRNA的结合来抑制细菌30S核糖体的作用来实现这一结果。四环素抗性通常是由于获得新基因，该基因编码用于能量依赖的四环素流出泵，或编码用于保护细菌核糖体不受四环素作用的蛋白质。

利福平

利福平是细菌RNA聚合酶抑制剂，通过直接阻止RNA延长起作用。利福平通常用于治疗分枝杆菌感染，但也与夫西地酸(fusidic acid)联合在治疗抗性甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)中起作用，夫西地酸是抑菌性蛋白质合成抑制剂。没有报道利福平在MRSA中经由流出泵的抗性。

假设

虚假设为μ1-μ2＝0和μ1-μ3＝0，其中

a)μ1为作为对照的来自NIMEL激光系统的对MRSA的亚致死放射量；和

b)μ2为来自NIMEL激光系统的对MRSA的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入四环素；和

c)μ3为来自NIMEL激光系统的对MRSA的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入利福平。

数据表明在亚致死辐射后加入抗生素四环素或利福平，导致这些MRSA菌落生长降低，如下：

μ1-μ2＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入四环素，对MRSA菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ2＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入四环素，对MRSA菌落的正常生长产生有害作用。

μ1-μ3＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入利福平，对MRSA菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ3＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入利福平，对MRSA菌落的正常生长产生有害作用。

表11.

结果

本实验清楚表明，在用NIMELS系统的亚致死激光参数下，μ1-μ2＝0并μ1-μ3≥0。这指出流出泵受到抑制，对四环素的抗性通过NIMELS对MRSA的ΔΨ-稳态-细菌的效应逆转了。

实施例XI

用甲氧西林评估亚致死剂量NIMELS激光对MRSA和ΔΨ-质膜-细菌 抑制细胞壁合成的影响

甲氧西林

甲氧西林是β-内酰胺，先前用于治疗由革兰氏阳性细菌(尤其是原本抗性大部分青霉素的产β-内酰胺酶的生物体，例如金黄色葡萄球菌)引起的感染，但临床上已不再使用。术语甲氧西林-抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)继续用于阐述抗性所有青霉素的金黄色葡萄球菌菌株。

作用机制

象其它β-内酰胺抗生素一样，甲氧西林通过抑制肽聚糖(细菌细胞壁)合成起作用。

业已证明在革兰氏阳性细菌枯草杆菌中，当通过增加质子导体阻止ETS时，提高了肽聚糖自溶素的活性(即不再受抑制)。这提示ΔΨ-质膜-细菌和ΔμH⁺(独立于用于细胞酶功能的储能)对细胞壁合成代谢功能和生理学潜在地具有深刻和开拓性的影响。

另外，业已报道ΔΨ-质膜-细菌解偶联剂抑制肽聚糖形成且积聚与肽聚糖合成有关的核苷酸前体并抑制N-乙酰葡糖胺(GIcNAc)这种肽聚糖中最主要的生物高聚物的转运。

假设检验

杆菌肽增强光降低的ΔΨ-质膜-细菌对正成长的细胞壁的多种影响(即增加细胞壁自我分解，抑制细胞壁合成)。这在不具有作为细胞壁抗性机制抑制抗微生物化合物的流出泵的革兰氏阳性细菌例如MRSA中尤其有意义。

虚假设为μ1-μ2＝0和μ1-μ3＝0，其中

a)μ1为作为对照的来自NIMEL激光系统的对MRSA的亚致死放射量；和

b)μ2为来自NIMEL激光系统的对MRSA的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入甲氧西林；和

μ1-μ2＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入甲氧西林，对MRSA菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ2＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入甲氧西林，对MRSA菌落的正常生长产生有害作用。

结果

如图15所示，本实验清楚表明，在用NIMELS系统的亚致死激光参数下，μ1-μ2≥0，意即对正常生长的MRSA菌落进行亚致死NIMEL辐射后，加入甲氧西林产生有害作用，其如CFU计数所示。这提示通过NIMELS对MRSA的ΔΨ-稳态-细菌效应，增强了甲氧西林(独立于流出泵)。

因此，NIMELS激光和其伴随的光ΔΨ-质膜-细菌降低现象与细胞壁抑制性抗微生物剂在MRSA中有协同作用。不希望受到理论的束缚，这必定是经由抑制合成代谢(外周胞质)ATP偶联的功能来起作用，因为MRSA没有用于甲氧西林的流出泵。

实施例XII

用杆菌肽评估亚致死剂量NIMELS激光对MRSA和ΔΨ-质膜-细菌抑 制细胞壁合成的影响

杆菌肽是由枯草杆菌产生的环状多肽的混合物。作为有毒并难于使用的抗生素，杆菌肽通常不能口服施用，而是局部使用。

作用机制

杆菌肽干扰C₅₅-异戊二烯焦磷酸的去磷酸化作用，这种分子运送革兰氏阴性生物体中内膜外面的细菌细胞壁的和革兰氏阳性生物体中的细胞质膜的肽聚糖的结构单元。

业已显示在革兰氏阳性细菌枯草杆菌中，当通过增加质子导体阻止ETS时，提高了肽聚糖自溶素的活性(即不再受抑制)。这指出ΔΨ-质膜-细菌和ΔμH⁺(独立于用于细胞酶功能的储能)对细胞壁合成代谢功能和生理学潜在地具有深刻和开拓性的影响。

另外，业已报道ΔΨ-质膜-细菌解偶联剂抑制肽聚糖形成且积聚与肽聚糖合成有关的核苷酸前体并抑制N-乙酰葡糖胺(GIcNAc)这种肽聚糖中最主要的生物高聚物的转运。

假设检验

杆菌肽增强光降低的ΔΨ-质膜-细菌对正成长的细胞壁的多种影响(即增加细胞壁自我分解，抑制细胞壁合成)。这在不具有作为细胞壁抗性机制抑制抗微生物化合物的流出泵的革兰氏阳性细菌例如MRSA中尤其有意义。

虚假设为μ1-μ2＝0和μ1-μ3＝0，其中

a)μ1为作为对照的来自NIMEL激光系统的对MRSA的亚致死放射量；和

b)μ2为来自NIMEL激光系统的对MRSA的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入杆菌肽。

μ1-μ2＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入杆菌肽，对MRSA菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ2＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入杆菌肽，对MRSA菌落的正常生长产生有害作用。

结果

如图16所示，本实验清楚表明，在用NIMELS系统的亚致死激光参数下，μ1-μ2≥0，意即对正常生长的MRSA菌落进行亚致死NIMEL辐射后，加入杆菌肽产生有害作用。在图16中，在所示的两个样品中箭头指向MRSA生长或缺乏生长。这指出通过NIMELS对MRSA的ΔΨ-稳态-细菌效应，增强了杆菌肽(独立于流出泵)。因此，NIMELS激光及其伴随的光ΔΨ-质膜-细菌降低现象与细胞壁抑制性抗微生物剂在MRSA中有协同作用。不希望受到理论的束缚，这最可能经由抑制偶联ATP的合成代谢(外周胞质)功能来起作用，因为MRSA没有用于杆菌肽的流出泵。

实施例XIII

用兰美抒(Lamisil)和斯皮仁诺(Sporanox)评估亚致死剂量NIMELS激 光对白色念珠菌的影响

本实验目的是在白色念珠菌中观察亚致死剂量的NIMELS激光是否对抗真菌化合物兰美抒和/或斯皮仁诺有增强作用。

介绍

业已发现真菌细胞中细胞溶质ATP浓度的降低导致抑制偶联细胞质膜的H⁺-ATP酶，该酶产生ΔΨp-真菌，这种损伤弱化了其它细胞活行。另外，降低ΔΨp-真菌引起细胞质膜生物能和热力学破坏，导致质子流入，这使质子动力势崩溃，因此抑制营养物质吸收。更重要的是，ATP是生物合成真菌细胞质膜脂类麦角固醇所必须的。麦角固醇是被在今天的医药中所用的包括包括兰美抒和斯皮仁诺(及其同类相似物)在内的有关商业抗真菌化合物(即唑类、特比萘芬和依曲康唑)的大部分靶向的结构脂类。

最近还证明两种新型抗微生物肽(Pep2和Hst5)具有引起ATP流出出真菌细胞(即消耗细胞内的ATP浓度)的能力，这种胞质ATP的降低导致ABC转运体CDR1和CDR2失活，它们是依赖ATP的抗真菌药物流出泵。

兰美抒

兰美抒(象其它烯丙胺类一样)通过抑制角鲨烯环氧化酶来抑制麦角固醇合成，角鲨烯环氧化酶是真菌细胞壁合成路径的部分。

斯皮仁诺

依曲康唑(斯皮仁诺)的作用机制与其它唑类抗真菌剂相同：其抑制由真菌细胞色素P450氧化酶介导的麦角固醇的合成。

假设

由于通过使膜去极化和消耗细胞ATP而在真菌中光降低ΔΨ-质膜-真菌和/或ΔΨ-线-真菌，亚致死放射量的NIMELS激光增强兰美抒和斯皮仁诺对白色念珠菌的作用。

虚假设为μ1-μ2＝0和μ1-μ3＝0，其中

a)μ1为作为对照的来自NIMEL激光系统的对白色念珠菌的亚致死放射量；和

b)μ2为来自NIMEL激光系统的对白色念珠菌的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入斯皮仁诺；和

c)μ3为来自NIMEL激光系统的对白色念珠菌的相同的亚致死放射量，且以刚好低于有效水平的抗性MIC加入兰美抒。

数据显示在亚致死辐射后加入兰美抒和/或斯皮仁诺，导致这些白色念珠菌菌落生长降低，如下：

μ1-μ2＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入斯皮仁诺，对白色念珠菌菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ2＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入斯皮仁诺，对白色念珠菌菌落的正常生长产生有害作用。

μ1-μ3＝0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入兰美抒，对白色念珠菌菌落的正常生长不产生有害作用。

μ1-μ3＞0

将确认在亚致死NIMEL辐射后加入兰美抒，对白色念珠菌菌落的正常生长产生有害作用。

表12.白色念珠菌NIMELS放射量图表

表13.菌落计数

结果

本实验清楚表明，在用NIMELS系统的亚致死激光参数下，μ1-μ2＞0并μ1-μ3＞0，意即对正常生长的白色念珠菌菌落进行亚致死NIMEL辐射后，加入兰美抒产生有害作用。这提示通过NIMELS激光系统的亚致死放射量辐射，增强了麦角甾醇生物合成抑制剂(兰美抒和斯皮仁诺)。

实施例XIV

NIMELS放射量计算

以下实施例阐述了所选择的描述NIMELS方法于本文所述波长影响各种常见的微生物生存力的能力的实验。例示性微生物包括大肠杆菌K-12、多药耐药性的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、抗性甲氧西林的金黄色葡萄球菌、白念色珠菌和红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)。

如上所详述，NIMELS参数包括激光二极管的平均单一或相加的输出功率和二极管的波长(870nm和930nm)。这一资料与靶位点的一束或多束激光射束面积(cm²)合在一起，提供可用于计算本发明的有效而又安全的辐射方案的最初的整套资料。给定激光的功率密度测量NIMELS在靶位点的潜在的效应。功率密度是任何给定激光输出功率和射束面积的函数，可用以下方程计算。

对于单波长：

1)功率密度(W/cm²)＝激光输出功率/射束直径(cm²)对于双波长处理：

2)功率密度(W/cm²)＝激光(1)输出功率/射束直径(cm²)+激光(2)输出功率/射束直径(cm²)

射束面积可通过以下计算：

3)射束面积(cm²)＝直径(cm)²×0.7854或射束面积(cm²)＝Pi×半径(cm)²

通过一个以特定输出功率运行的NIMELS激光二极管系统经某一时间传输入组织的总光子能量以焦耳测量，如下计算：

4)总能量(焦耳)＝激光输出功率(瓦特)×时间(秒)

同时通过两个以特定输出功率的NIMELS激光二极管系统(两种波长)经某一时间传输给组织的总光子能量以焦耳测量，如下计算：

5)总能量(焦耳)＝[激光(1)输出功率(瓦特)×时间(秒)]+[激光(2)输出功率(瓦特)×时间(秒)]

在实践中，为了正确测量用于最大NIMELS有利响应的剂量，了解总能量在辐射区域上的分布和分配是有用的(但并非必需的)。可按能量密度(焦耳/cm²)来测量总能量分布。如下所述，对于光的特定波长，在测定组织反应中能量密度是最重要的因素。一个NIMELS波长的能量密度可如下导出：

6)能量密度(焦耳/cm²)＝激光输出功率(瓦特)×时间(秒)/射束面积(cm²)

7)能量密度(焦耳/cm²)＝功率密度(W/cm²)×时间(秒)

当使用两种NIMELS波长时，能量密度可如下导出：

8)能量密度(焦耳/cm²)＝激光(1)输出功率(瓦特)×时间(秒)/射束面积(cm²)+激光(2)输出功率(瓦特)×时间(秒)/射束面积(cm²)；或

9)能量密度(焦耳/cm²)＝功率密度(1)(W/cm²)×时间(秒)+功率密度(2)(W/cm²)×时间(秒)

为了计算用于特定剂量的处理时间，执行者可用下列方程之一使用能量密度(J/cm²)或能量(J)以及输出功率(W)和射束面积(cm²)：

10)治疗时间(秒)＝能量密度(焦耳/cm²)/输出功率密度(W/cm²)

11)治疗时间(秒)＝能量(焦耳)/激光输出功率(瓦特)

因为放射量计算(例如在本实施例中举例的)可能繁重，所述治疗系统还可包括储存所有研究治疗可能性和放射量的计算机数据库。用基于上述公式的计算法则为控制器中的计算机(放射量和参数计算器)预编程序，以便任何操作者可容易地在屏幕上检索数据和参数并输入另外的必需数据(例如：光点直径、所需总能量、时间和各个波长的脉冲宽度、拟受辐射的组织、拟受辐射的细菌)连同任何其它必需信息，以便可通过放射量和参数计算器产生任何和所有有利的治疗结果所需的计算法则和计算并因此运行激光。

在以下实施方案中，总而言之，当细菌培养物暴露于NIMELS激光时，细菌杀灭率(通过在处理后的培养皿上计数菌落形成单位或CFU来测量)介于93.7％(抗性多种药物的大肠杆菌)到100％(所有其它细菌和真菌)。

实施例XV

细菌方法：用于体外靶向大肠杆菌的NIMELS治疗参数

以下参数阐明以远低于文献中与热损伤有关的温度的最终温度应用于大肠杆菌的本发明方法。

A.用于大肠杆菌K-12的实验材料和方法

大肠杆菌K12液态培养物在Luria Bertani(LB)培养基(25g/L)中生长。平板含有35mL的LB平板培养基(25g/L LB，15g/L细菌学用琼脂)。用PBS进行培养物稀释。用无菌技术实施所有方案和操作。

B.生长动力学

取出种子培养物，接种多个50mL LB培养物，在37℃过夜生长。第二天早上，挑选最健康的培养物，用于接种5％到50mL 37℃的LB中，随时间监测O.D.₆₀₀，每30-45分钟测量一次，直到培养物处于稳定期。

C.主种子生产

以对数期的培养物(OD₆₀₀大约0.75)开始，将10mL置于4℃，加入10mL的50％甘油，等份分到20个冷冻管中，在液氮中速冻。然后将冷冻管储存在-80℃。

D.液体培养物

如前所述制备大肠杆菌K12的液态培养物。从继代培养物中取出100μL等份样，用PBS连续稀释到1∶1200。为了确保细胞PBS混悬液中的细胞达到静态(生长)且没有明显增殖，使该稀释物在室温温育大约2小时，或直到不再观察到O.D.₆₀₀增加，可进一步等份分配相对一致数目的细胞用于测定。

一旦确定K12稀释物处于静态，将2mL该混悬液等份加入到24孔组织培养板的所选孔中，用于以特定放射量参数的所选NIMELS实验。在室温温育板直到准备使用(大约2小时)。

在激光处理后，从每孔取出100μl，连续稀释到1∶1000，导致最终稀释度为初始K12培养物的1∶1.2x10⁵。将每一最终稀释液等份样3x200L涂布到三个平行的单独培养皿中。然后在37℃温育培养皿大约16小时。进行手动菌落计数并记录。还对各个培养皿进行数码照相。在体外试验中对于所有用金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的NIMELS辐射测定，使用相似的细胞培养物和动力学方案。例如，白色念珠菌ATCC 14053液态培养物于37℃在YM培养基(21g/L，Difco)中生长。将标准混悬液等份分到24孔组织培养板的所选孔中。在激光处理后，从每孔取出100μl，连续稀释到1∶1000，导致最终稀释度为初始培养物的1∶5x10⁵。将每一最终稀释液3x200L涂布到单独培养皿中。然后在37℃温育培养皿大约16-20小时。进行手动菌落计数并记录。还对各个培养皿进行数码照相。

红色毛癣菌ATCC 52022液态培养物在蛋白胨-葡萄糖(PD)培养基中于37℃生长。将标准混悬液等份分到24孔组织培养板的所选孔中。在激光处理后，从每孔取出等份样并涂布到单独培养皿中。然后在37℃温育培养皿大约91小时。在温育66小时和91小时后进行手动菌落计数并记录。尽管对照孔中的生物体都生长，但本文所述的激光处理的孔100％不生长。还对各个培养皿进行数码照相。

从室温开始对PBS溶液进行热量检测。在系统温度升到接近临界阀值44℃之前，在12分钟的激光照射周期可使用十(10)瓦特的NIMELS激光能量。

表14.体外NIMELS放射量的时间和温度测量

NIMEL输出功率(W)	射束光点1.5CM直径重叠面积(CM2)	处理时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(辐射暴露)(J/cm2)	功率密度(辐射)(W/cm2)	开始温度	结束温度
								板1-N--3.0+3.0＝6.0W	1.76	720	4320	2448	3.40	20.5℃	34.0℃
板2-N--3.5+3.5＝7.0W	1.76	720	5040	2858	3.97	20.7℃	36.5℃
								板3-N--4.0+4.0＝8.0W	1.76	720	5760	3268	4.54	21.0℃	38.5℃
板4-N--	1.76	720	6480	3679	5.11	2.0℃	41.0℃

4.5+4.5＝9.0W
								板5-N--5.0+5.0＝10.0W	1.76	720	7200	4089	5.68	21.0℃	40.5℃
板6-N--5.5+5.5＝11W	1.76	720	7920	4500	6.25	21.0℃	46.0℃
								板7-N--7.0+7.0＝14.0W	1.76	360	5040	2863	7.95	21.0℃	47.0℃
板8-N--7.5+7.5＝15W	1.76	360	5400	3068	8.52	21.7℃	47.2℃

实施例XVI

用于体外靶向大肠杆菌的NIMELS激光波长930NM的放射量值

本实验证明，NIMELS单波长λ＝930nm在用于哺乳动物组织的安全热量参数内与体外抵抗大肠杆菌的可定量的抗菌功效有关。

体外实验数据证明，如果在不到25％的时间内仅930nm的辐射满足进入系统5400J的总能量和3056J/cm²的能量密度的阀值，那么仍可达到100％抗菌功效。

表15.用于体外靶向大肠杆菌的亚致死的NIMELS(λ＝930)放射量

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死大肠杆菌的百分率
							7.0	1.5	720	5040	2852	3.96	40.2％
8.0	1.5	720	5760	3259	4.53	100.0％
							10.0	1.5	540	5400	3056	5.66	100.0％

体外实验数据还证明，在用于哺乳动物组织的安全热量参数内，用λ＝930nm的单一能量治疗，具有体外抵抗细菌物种金黄色葡萄球菌的抗菌功效。

也认为如果在不到25％的时间内满足进入系统的5400J的总能量和3056J/cm²的能量密度的阀值，对于金黄色葡萄球菌和其它细菌种类，那么仍可达到100％抗菌功效。

表16.用于体外靶向金黄色葡萄球菌的亚致死的NIMELS(λ＝930)放射量

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死金黄色葡萄球菌的百分率
							7.0	1.5	720	5040	2852	3.96	24.1％
8.0	1.5	720	5760	3259	4.53	100.0％

体外实验数据也表明，在用于哺乳动物组织的安全热量参数范围内，用λ＝930nm的NIMELS单波长治疗，具有体外抵抗白色念珠菌的抗真菌功效。

还认为如果在不到25％的时间内满足进入系统5400J的总能量和3056J/cm²的能量密度的阈值，那么仍可达到100％抗真菌功效。

表17.用于体外靶向白色念珠菌的亚致死的NIMELS(λ＝930)放射量

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死白念色珠菌的百分率
							8.0	1.5	720	5760	3259	4.53	100.0％
9.0	1.5	720	6840	3681	5.11	100.0％

实施例XVII

体外NIMELS激光波长870NM的放射量值

体外实验数据还证明，单独用870nm波长抵抗大肠杆菌，高达7200J总能量和4074J/cm²能量密度和5.660W/cm²功率密度，仍不能达到显著杀灭。

表18.大肠杆菌研究-单波长λ＝870nm

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	对照CFU	NIMELSCFU	对照-NIMEL差异	杀死大肠杆菌的百分率
										6.0	1.5	720	4320	2445	3.40	90	95	(5)	-5.6％
7.0	1.5	720	5040	2852	3.96	94	94	0	0.0％
										8.0	1.5	720	5760	3259	4.53	93	118	(25)	-26.9％
9.0	1.5	720	6480	3667	5.09	113	112	1	0.9％
										10.0	1.5	720	7200	4074	5.66	103	111	(8)	-7.8％
10.0	1.5	540	5400	3056	5.66	120	101	19	15.8％

对金黄色葡萄球菌单用具有λ＝870nm的辐射也可观察到相当的结果

实施例XVIII

NIMELS独特交替870NM和930NM光能之间的协同作用

体外实验数据还证明，当交替使用两者(870nm在930nm之前)时在两种NIMELS波长(λ＝870nm和930nm)之间有相加作用。业已发现作为第一辐射存在的870nm NIMELS波长，加强第二个930nmNIMELS波长辐射的抗菌功效的作用。

体外实验数据证明，这种协同作用(联合870nm波长和930nm波长)使得930nm的光能可以减量。如本文所示，当(870nm在930nm之前)波长以交替方式联合时，光能被减少到用于NIMELS 100％抗大肠杆菌功效所需的总能量和能量密度的大约1/3。

体外实验数据还证明，如果将等量的870nm光能以高20％的功率密度在930nm光能之前加到系统中，那么这种协同机制可使930nm的光能(总能量和能量密度)降低到NIMELS 100％抗大肠杆菌功效所需总能量密度的大约1/2。

表19.来自交替NIMELS波长的大肠杆菌数据

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死大肠杆菌的百分率
							8W/8W	1.5	540/18012分钟	4320/1440＝5760	2445/815＝3529	4.53/4.53	100.0％
10W/10W	1.5	240/2408分钟	2400/2400＝4800	1358/1358＝2716	5.66/5.66	100.0％

这种协同能力对人组织安全性有意义，因为930nm光能以比870nm光能更快的速率加热系统，其对于哺乳动物系统在治疗期间产生可能最少量的热是有益的。

还认为如果NIMELS光能(870nm和930nm)以上述方式对其它细菌物种交替使用，那么100％抗细菌效果基本上是相同的。

体外实验数据还证明，当辐射真菌时交替使用两种波长(870nm在930nm之前)，在这两种NIMELS波长(870nm和930nm)之间也有相加作用。作为第一辐射存在的870nm NIMELS波长，算术加强第二个930nm NIMELS波长辐射的抗真菌功效的作用。

体外实验数据(参见表以下)证明，如果将等量的870nm光能以比细菌种类抗菌功效所需高20％的功率密度在930nm光能之前加到系统中，那么这种协同机制可使930nm的光能(总能量和能量密度)降低到NIMELS 100％抗真菌功效所需总能量密度的大1/2。

表20.来自交替NIMELS波长的白色念珠菌数据

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死白色念珠菌的百分率
							10W/10W	1.5	240/2408分钟	2400/2400＝4800	1358/1358＝2716	5.66/5.66	100.0％

这种协同作用对人组织安全性有意义，因为930nm光能以比870nm光能更快的速率加热系统，其对于哺乳动物系统在治疗期间产生可能最少量的热是有益的。

还认为如果NIMELS光能(870nm和930nm)以上述方式对其它真菌物种交替使用，那么100％抗真菌效果基本上是相同的。

实施例XIX

NIMELS独特的同时协同λ＝870NM和λ＝930NM光能之间的作用

体外实验数据还证明，当将其同时使用(870nm与930nm联合)时，在两个NIMELS波长(870nm和930nm)之间有相加作用。870nmNIMELS波长和930nm NIMELS波长作为同时辐射存在绝对提高NIMELS系统的抗菌功效作用。

体外实验数据(参见例如以下表IX和X)证明，通过联合λ＝870nm和λ＝930nm(在本实施例中同时使用)，有效降低930nm光能和密度到当用本发明单一治疗时所需总能量和能量密度的约一半。

表21.联合NIMEL波长的大肠杆菌数据

输出功率(W)870nm/930nm	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死大肠杆菌的百分率
							5W+5W＝10	1.5	720	3600(x2)＝7200	2037(x2)＝4074	5.66	100％

表22.联合NIMEL波长的金黄色葡萄球菌数据

输出功率(W)870nm/930nm	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死金黄色葡萄球菌的百分率
							5W+5W＝10W	1.5	720	3600(x2)＝7200	2037(x2)＝4074	5.66	98.5％
5.5W+5.5＝11W	1.5	720	3960(x2)＝7920	2241(x2)＝4482	6.22	100％

这种同时协同能力对人组织安全性有意义，因为930nm光能以比870nm光能更快的速率加热系统，其对于哺乳动物系统在治疗期间产生可能最少量的热是有益的。

还认为如果NIMELS光能(870nm和930nm)以上述方式对其它细菌物种同时使用，那么100％抗细菌效果基本上是相同的(参见图17、18和19)。体外实验数据还证明，当将其同时对真菌使用时，在两个NIMELS波长(870nm和930nm)之间有相加作用。业已发现870nmNIMELS波长和930nm NIMELS波长作为同时辐射存在，提高NIMELS系统的抗真菌功效作用。

体外实验数据证明，当(870nm和930nm)波长以同时的方式联合时，这种协同效果(联合870nm波长和930nm波长用于同时辐射)使得930nm光能降低到用于NIMELS 100％抗白色念珠菌真菌功效所需总能量和能量密度的大约1/2。

表23.联合NIMELS长的白色念珠菌数据

输出功率(W)

射束光

时间(秒)

总能量

能量密度

功率密度

杀死白

870nm/930nm	点(CM)		(焦耳)	(J/cm2)	(W/cm2)	色念珠菌的百分率
							5W+5W＝10W	1.5	720	3600(x2)＝7200	2037(x2)＝4074	5.66	100％

因此，NIMELS波长(λ＝870nm和930nm)可以以交替方式或同时地或以这样的方式的任何组合使用，藉此减少与温度增加(将其最小化)有关的λ＝930的接触时间，以达到抗细菌和抗真菌功效。

体外实验数据还证明，当大肠杆菌以以下参数单用(对照)λ＝830nm波长辐射时，对照830nm激光在12分钟辐射周期产生零抗细菌功效，以同样的参数在用λ＝930nm辐射时可使与100％抗细菌和抗真菌功效有关的NIMELS放射量最小化。

表24.单一波长λ＝830nm时的大肠杆菌数据

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
						8.0	1.5	720	5760	3259	4.53
9.0	1.5	720	6480	3667	5.09

体外实验数据还证明，当以安全的热放射量使用时，用与λ＝930nm组合的λ＝830nm辐射时几乎没有相加作用。作为第一辐射的830nm对照波长的存在，在与第二930nm NIMELS波长产生协同抗细菌功效方面远次于870nm NIMELS波长。

表25.取代的交替830nm对照波长的大肠杆菌数据

输出功率(W)830nm/930nm	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死大肠杆菌的百分率
							8W/8W	1.5	540/18012分钟	4320/1440＝5760	2445/815＝3529	4.53/4.53	0％
10W/10W	1.5	240/240	2400/2400	1358/1358	5.66/5.66	65％

8分钟

＝4800

＝2716

体外实验数据还证明，当以安全的热放射量使用时，当830nm波长和NIMELS 930nm波长同时使用时有较小的相加作用。实际上，体外实验数据证明，当870nm与930nm同时联合时与市售830nm相比，需要少17％总能量、少17％的能量密度和少17％的功率密度以达到100％抗大肠杆菌功效。这样作再次充分减少热量和对拟用NIMELS波长治疗的体内系统的伤害。

表26.取代的同时用830nm对照波长的大肠杆菌数据

输出功率(W)830nm/930nm	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	杀死大肠杆菌的百分率
							5W+5W＝10	1.5	720	3600(x2)＝7200	2037(x2)＝4074	5.66	91％
5.5W+5.5＝11W	1.5	720	3960(x2)＝7920	2250(x2)＝4500	6.25	90％
							6W+6W＝12W	1.5	720	3960(x2)f＝8640*	2454(x2)＝4909*	6.81	100％

杀死细菌的数量

体外数据还表明，NIMELS激光系统在体外有效(在热量耐受内)抵抗含有2,000,000(2x10⁶)个菌落形成单位(CFU)的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌溶液。这是通常在受感染的人溃疡组织的1克样品中所见的2x增加量。Brown等报告在检测的75％的糖尿病患者中的微生物细胞都至少为100,000CFU/克，在37.5％患者中，微生物细胞的量大于1,000,000(1x10⁶)CFU(参见Brown等，Ostomy WoundManagement(造瘘术伤口管理)，401：47，issue 10，(2001)，其全部教导通过引用合并到本文中)。

热量参数

体外实验数据还证明，NIMELS激光系统可在对人组织安全的热量耐受范围内实现100％抗细菌和抗真菌功效。

实施例XX

低温对NIMELS的影响

冷却细菌物种

体外实验数据还证明，通过在激光照射周期前在PBS中充分降低细菌样品的初始温度到4℃2个小时，用NIMELS激光系统以任何目前可再产生的抗细菌能量不能达到光抗细菌功效。

实施例XXI

NIMELS对红色毛癣菌的效应

本实施例证明当以交替或同时方式使用NIMELS波长(870nm和930nm)时的效应。

表27.NIMELS对红色毛癣菌交替波长试验

实验编号	输出功率(W)870nm/930nm	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
							1	8W/8W	1.5	540/18012min.	4320/1440＝5760	2445/815＝3529	4.53/4.53
2	10W/10W	1.5	240/2408min.	2400/2400＝4800	1358/1358＝2716	5.66/5.66

1号实验＝最小效果

2号实验＝在所有板中都100％杀死

表28.NIMELS对红色毛癣菌同时波长试验

实验编号	输出功率(W)870nm/930nm	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
							3	5+5＝10	1.5	72012min.	3600(x2)＝7200	2037(x2)＝4074	5.66
4	5.5W+5.5W＝11W	1.5	720	3960(x2)＝7920	2250(x2)＝4500	6.25
							5	6W+6W＝12W	1.5	720	3960(x2)＝8640	2454(x2)＝4909	6.81

3、4、5号实验＝在所有板中都100％杀死

表29.NIMELS红色毛癣菌-单波长

实验编号λ＝930	输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
							6	8.0	1.5	720	5760	3259	4.53
7	9.0	1.5	720	6840	3681	5.11

6、7号实验＝在所有板中都100％杀死

表30.对照红色毛癣菌-830nm/930nm交替

实验编号λ＝830和λ＝930	输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(分钟)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
							8	8W/8W	1.5	540/18012min	4320/1440＝5760	2445/815＝3529	4.53/4.53
9	10W/10W	1.5	240/2408min	2400/2400＝4800	1358/1358＝2716	5.66/5.66

8号实验＝无作用

9号实验＝100％杀死

如上表XVIII中所述治疗导致100％杀死。

表31.用λ＝830nm和930nm体外靶向红色毛癣菌

输出功率(W)	射束光点(CM)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
						5+5＝10	1.5	720	3600(x2)＝7200	2037(x2)＝4074	5.66

实施例XXII

MRSA/抗微生物剂增强

本实施例表明，在体外靶向MRSA使用NIMEIS波长(λ＝830nm和930nm)增加对抗微生物剂甲氧西林的敏感性。进行了四个单独的实验。关于这四个实验的数据组列于以下表中。也参见图17，该图显示：(a)NIMELS与甲氧西林、青霉素和红霉素在MRSA菌落的生长抑制中的协同作用，数据表明青霉素和甲氧西林被亚致死NIMELS放射量增强，其通过抑制细菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-细菌)，藉此抑制与药物共同靶向的肽聚糖合成的合成代谢过程来实现；和(b)红霉素增强的程度更大，因为NIMELS效应抑制供应用于蛋白质合成的合成代谢过程和红霉素抗性流出泵的能量的细菌细胞质膜质子-动力势(Δp-质膜-细菌)。

材料

表32.

CFU计数的通用方法：

表33

时间(小时)	任务	TE(小时)
			-18	接种物过夜培养50ml直接来自甘油储液
-4	确立初始培养物

	三个稀释度1∶50、1∶125、1∶250
				监测初始培养物的OD600
0	制备接种板的培养物在上午10点，将OD600＝1.0的培养物在PBS中以1∶300稀释(50ml最终体积)，在室温储存1小时。(室温应该为大约25℃)
			+1	接种24孔板将2ml等份样分配到24孔板的预定孔中，转移到NOMIR(总共8个24孔板)。
+2到+8	稀释处理的样品在激光处理后，将来自各孔的100μL在PBS中系列稀释到最终稀释度1∶1000。
				将处理的样品涂板将100μL最终稀释度以3个平行涂布到含及不含30μg/ml甲氧西林的TSB琼脂板上。(每孔6个TSB板)
	让板在37℃温育18-24小时。
			+24	对每个板的菌落进行计数(总共96个板)。

表34.MRSA放射量级数11-06-06实验#1

第一次激光照射程序：870和930都用

第二次激光照射程序：单用930

参数	输出功率(W)	射束光点(CM)	光点面积(cm2)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	开始温度℃	最后温度℃
										实验(1)870于5W和930于5W辐射12分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	720	7200	4074	5.66	24.4	44

实验(1)930于8W辐射6分钟	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	44	46.8
实验(2)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	26.5	48.1
										实验(2)930于8W辐射6分钟	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	48.1	47.4
										实验(3)870于5.5W和930于5.5W辐射10分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	600	6000	3395	5.66	25.7	43.1
实验(3)930于8W辐射4分钟	8.0	1.5	1.77	240	1920	1086	4.53	43.1	44.8
实验(4)870于5.5W和930于5.5W辐射10分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	600	6600	3735	6.22	22.9	45.2
										实验(4)930于8W辐射4分钟	8.0	1.5	1.77	240	1920	1086	4.53	45.2	45.3
										实验(5)870于5W和930于5W辐射8分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	480	4800	2716	5.66	24.2	43.2
实验(5)930于7W辐射4分钟	7.0	1.5	1.77	240	1680	951	3.96	43.2	43.8
实验(6)870于5.5W和930于5.5W辐射8分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	480	5280	2988	6.22	25.3	42.7
										实验(6)930于7W辐射4分钟	7.0	1.5	1.77	240	1680	951	3.96	42.7	44.9
										实验(7)870于5W和930于5W辐射6分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	360	3600	2037	5.66	26.2	40.6
实验(7)930于7W辐射4分钟	7.0	1.5	1.77	240	1680	951	3.96	40.6	44
实验(8)870于5.5W和930于5.5W辐射6分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	360	3960	2241	6.22	26	42
										实验(8)930于7W辐射4分钟	7.0	1.5	1.77	240	1680	951	3.96	42	44.2

对MRSA研究的独立报告，2006年11月7日

(MRSA数据级数11-07-06实验#1)

实验1-设计

用8种不同的激光剂量处理对数生长期的MRSA的盐水混悬液，标记为A1到H1。

稀释处理过的和未处理对照的混悬液，在含或不含30μg/ml甲氧西林的胰蛋白胨大豆琼脂上作三个平行铺板。在37℃生长24小时后计数菌落。

在含与不含甲氧西林用于对照(未处理)和处理二种MRSA的板中比较CFU(菌落形成单位)。

实验1-结果

条件D1到H1显示处理和未处理的样品的甲氧西林板上的CFU同样减少。

条件A1、B1和C1显示，与未处理的对照比较，激光处理的样品的CFU分别少30％、33％或67％。

这表明对样品A1、B1和C1进行的处理使得MRSA对甲氧西林的作用敏感。

表35.MRSA数据级数11-07-06实验#1

MRSA放射量级数         11-07-06

第一次激光照射程序：870和930都用

第二次激光照射程序：单用930

参数	输出功率(W)	射束光点(CM)	光点面积(cm2)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	开始温度℃	最后温度℃
										实验(1)870于5W和930于5W辐射12分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	720	7200	4074	5.66	23.4	45.3
实验(1)930于8W辐射6分	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	45.3	46.8
										钟
实验(2)870于5W和930于5W辐射12分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	720	7200	4074	5.66	21.2	45.5
										实验(2)930于8W辐射6分	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	45.5	47.7
钟
										实验(3)870于5W和930于5W辐射12分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	720	7200	4074	5.66	21.6	47.0
实验(3)930于8W辐射6分	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	47.0	49.0
										钟
实验(4)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	20.4	50.3
										实验(4)930于8W辐射6分	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	50.3	50.1
钟
										实验(5)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	24.0	50.9
实验(5)930于8W辐射6分	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	50.9	50.2
										钟
实验(6)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	23.0	48.2
										实验(6)930于8W辐射6分	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	48.2	48.3
钟
										实验(7)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	5.66	22.0	48.3
实验(7)930于7W 辐射8分	7.0	1.5	1.77	480	3360	1901	3.96	48.3	44.2
										钟
实验(8)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	840	9240	5229	6.22	22.0	47.6
										实验(8)930于7W辐射8分钟	70	1.5	1.77	480	3360	1901	3.96	47.6	46.2

对MRSA研究的独立报告，2006年11月8日

(MRSA数据级数11-08-06实验#2)

实验2-设计

基于实验1和先前所确立的有效剂量，用8种不同的激光剂量处理对数生长期的MRSA盐水混悬液，标记为A2到H2。

稀释处理过的和未处理对照的混悬液，在含或不含30μg/ml甲氧西林的胰蛋白胨大豆琼脂上作三个平行铺板。在37℃生长24小时后计数菌落。

实验2-结果

在含与不含甲氧西林的板中比较CFU，显示除A2和B2外的所有激光处理的样品中甲氧西林的功效显著增强。该数据以表格形式在下面概述。

表37

表38.MRSA数据级数11-08-06实验#2

表39.用于NOMIR MRSA研究的概要方案-2006年11月9日(11-09-06实验#3)

方法：

时间(小时)	任务	FTE(小时)
			T-18	接种物过夜培养50ml直接来自甘油储液	1
T-4	确立初始培养物三个稀释度1∶50、1∶125、1∶250	1
				监测初始培养物的OD600	4
T0	制备接种板的培养物在上午10点，将OD600＝1.0的培养物在PBS中以1∶300稀释(50ml最终体积)，在室温储存1小时。(室温应该为大约25℃)	1
			T+1	接种24孔板(总共8个板)将2ml等份样分配到24孔板的预定孔中，转移到NOMIR(总共8个24孔板)。	1
T+2到+8	稀释处理的样品激光处理后，将来自各孔的100μL在PBS中系列稀释到最终稀释度1∶1000。	4
				将处理的样品涂板将100μL最终稀释度一式五份(5x)涂布到含及不含30μg/ml甲氧西林的TSB琼脂板上。(每孔10个TSB板)	2
	让板在37℃温育18-24小时。
			T+24	对每个板的菌落进行计数(总共160个板)。	6

表40.MRSA放射量级数11-09-06实验#3

MRSA放射量级数  11-0906

第一次激光照射程序：870和930都用

第二次激光照射程序：单用930

参数	输出功率(W)	射束光点(CM)	光点面积(cm2)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	开始温度℃	最后温度℃
										实验(1)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	22.0	48.1
实验(1)930于8W辐射6分钟	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	48.1	47.7
实验(2)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	22.9	48.8
										实验(2)930于8W辐射6分钟	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	48.8	48.7
										实验(3)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	22.8	48.9
实验(3)930于8W辐射6分钟	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	48.9	48.9
实验(4)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	24.0	50.3
										实验(4)930于8W辐射6分钟	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	50.3	50.5
										实验(5)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是实验(5)930于	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	5.66	23.7	48.4
6W辐射9分钟	6.0	1.5	1.77	540	3240	1833	3.40	48.4	45.0
实验(6)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	5.66	23.5	49.2
										实验(6)930于6W辐射9分钟	6.0	1.5	1.77	540	3240	1833	3.40	42.9	46.3
										实验(7)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	5.66	25.6	49.9
实验(7)930于6W辐射9分钟	6.0	1.5	1.77	540	3240	1833	3.40	49.9	46.3
实验(8)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	5.66	22.1	48.0
										实验(8)930于6W辐射9分钟	6.0	1.5	1.77	540	3240	1833	3.40	48.0	46.0

MRSA研究的独立报告，2006年11月9-10日

MRSA数据级数11-10-06实验#3

实验3-设计

基于实验1及2和先前所确立的有效剂量，用8种不同的激光剂量处理对数生长期的MRSA盐水混悬液，标记为A3到H3。

稀释处理过的和未处理对照的混悬液，在含或不含30μg/ml甲氧西林的胰蛋白胨大豆琼脂上作5个平行铺板。在37℃生长24小时后计数菌落。

实验3-结果

在含与不含甲氧西林的板中比较CFU，显示在所有激光处理的样品中甲氧西林的有效性显著增强。该数据以表格形式在下面概述。

表41.

表42.MRSA数据级数11-10-06实验#3

表43.用于NOMIR MRSA研究的概要方案-2006年11月10日方法：

时间(小时)	任务	FTE(小时)
			T-18	接种物过夜培养50ml直接来自甘油储液	1
T-4	确立初始培养物三个稀释度1∶50、1∶125、1∶250	1
				监测初始培养物的OD600	4
T0	制备接种板的培养物在上午10点，将OD600＝1.0的培养物在PBS中以1∶300稀释(50ml最终体积)，在室温储存1小时。(室温应该为大约25℃)	1
			T+1	接种24孔板(总共6个板)将2ml等份样分配到24孔板的预定孔中，转移到NOMIR(总共6个24孔板)。	1
T+2到+8	稀释处理的样品在激光处理后，将来自各孔的100μL在PBS中系列稀释到最终稀释度1∶1000。	4
				将处理的样品涂板将100μL最终稀释度以下列方式作5个平行(5x)涂布到TSB琼	2

	脂板上：24孔板编号1和2含及不含30μg/ml甲氧西林；24孔板编号3和4含及不含μg/ml青霉素；24孔板编号5和6含及不含μg/ml红霉素。(每孔10个TSB板)
				让板在37℃温育18-24小时。
T+24	对每个板的菌落进行计数(总共120个板)。	6

表44.MRSA放射量级数11-10-06实验#4

MRSA放射量级数      11-0906

第一次激光照射程序：870和930都用

第二次激光照射程序：单用930

参数	输出功率(W)	射束光点(CM)	光点面积(cm2)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)	开始温度℃	最后温度℃
										实验(1)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	22.3	46.3
实验(1)930于8W辐射6分钟(甲氧西林板)	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	46.3	47.6
实验(2)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	5.66	23.1	47.1
										实验(2)930于6W辐射9分钟(甲氧西林板)	6.0	1.5	1.77	540	3240	1833	3.40	47.1	44.3
										实验(3)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	24.4	48.4
实验(3)930于8W辐射6分钟(青霉素板)	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	48.4	47.1
实验(4)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	566	23.3	47.9
										实验(4)930于6W辐射9分钟(青霉素板)	6.0	1.5	1.77	540	3240	1833	3.40	47.9	45.0
										实验(5)870于5.5W和930于5.5W辐射12分钟，之后是	11.0	1.5	1.77	720	7920	4482	6.22	22.9	50.2
实验(5)930于8W辐射6分钟(红霉素板)	8.0	1.5	1.77	360	2880	1630	4.53	50.2	51.6
实验(6)870于5W和930于5W辐射14分钟，之后是	10.0	1.5	1.77	840	8400	4753	5.66	24.2	50.3
										实验(6)930于6W辐射9分钟(红霉素板)	6.0	1.5	1.77	540	3240	1833	3.40	50.3	43.6

MRSA研究的独立报告，2006年11月10-11日

(MRSA数据级数11-10-06实验#4)

实验4-设计

基于在先前实验中所确定的有效剂量，用2种不同的激光剂量处理对数生长期的MRSA盐水混悬液，标记为A4到F4。

稀释处理过的和未处理对照的混悬液，在含或不含30μg/ml甲氧西林(A4和B4组)、0.5μg/ml青霉素G(C4和D4组)或4μg/ml红霉素(E4和F4组)的胰蛋白胨大豆琼脂上作5个平行铺板。

在37℃生长24小时后计数菌落。

实验4-结果

激光处理增加MRSA对所测试的各种抗生素的敏感性若干倍。该数据以表格形式在下面概述。

表45.

表46.MRSA数据级数11-10-06实验#4

实施例XXIII

体内安全性测试-人患者

在体外纤维原细胞研究之后，发明人对其自身进行放射量滴定，以确定可传输给人皮肤组织而对受辐射的组织无灼伤或其他损伤的安全的最大能量水平和接触时间。

他使用的方法是用NIMELS激光以变化的时间长度和功率设置辐射其大脚趾。这一自我照射的实验结果如下所示。

表47.联合的波长放射量

参数	输出功率(W)	射束光点(CM)	光点面积(cm2)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
								870nm	1.5	1.5	1.77	250	375	212	0.85
930nm	1.5	1.5	1.77	250	375	212	0.85
								联合	3.0	1.5	1.77	250	750	424	1.70

表48：λ＝930nm时的放射量

参数(nm)	输出功率(W)	射束光点(CM)	光点面积(cm2)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
								930nm	3.0	1.5	1.77	120	360	204	1.70

将时间/温度评估制成图表，以确保这些激光能量对人皮肤组织的热量安全性(数据未列出)。在一个激光程序中，他以870nm和930nm二者照射自己的大脚趾长达233秒，同时用激光红外温度计测量脚趾甲表面温度。他发现用870nm和930nm连同1.70W/cm²的联合功率密度使用上述放射量，在表面温度为37.5℃时产生疼痛，关掉激光器。

在第二个激光程序中，他以930nm照射大脚趾达142秒，同时再次用激光红外温度计测量脚趾甲表面温度。他发现单用930nm在1.70W/cm²的功率密度时，表面温度为36℃时产生疼痛，关掉激光器。

实施例XXIV

体内安全性测试-有限的临床初步研究

在上述实验之后，治疗了另外的罹患脚甲癣的患者。这些患者都是免费的志愿者，提供了签字的知情同意书。本有限数目的小规模研究的原则目标是如在体外用NIMELS激光装置所获得的一样，在体内达到消除真菌的同样水平。我们还决定应用发明者在其自我照射实验期间耐受的最大照射时间和温度限制。在受到高度控制和监测的环境中，对每一对象实施3到5个激光照射程序。4名对象是征募来经受治疗的。不付给提供签字知情同意书的对象报酬，告知他们可在任何时间退出，即使是在治疗过程中。

用于治疗第一个对象的放射量与发明者自我照射期间所用(如上所示)的一样。趾甲表面温度参数也与发明者在自我照射中发现的温度一样。

经治疗的脚趾显示显著减轻足癣和趾甲床周围的鳞片，这表示消除了起真菌库作用的趾甲板的污染。通过横切组织粘附物来刮擦对照趾甲，保留刮削物涂板到真菌培养基上。以完全相同的方式刮擦经治疗的趾甲并涂布。

为了培养趾甲刮削物，加入以下物质制备沙氏葡糖琼脂(2％葡萄糖)培养基：氯霉素(0.04mg/ml)，用于一般的真菌测试；氯霉素(0.04mg/ml)和放线菌酮(cycloheximide)(0.4g/ml)，选择性用于皮肤真菌；氯霉素(0.04mg/ml)和灰黄霉素(20μg/ml)，作为真菌生长的阴性对照。

#1号治疗和#2号治疗(在#1号治疗后3天进行)进行9天的真菌学结果是一样的，在对照脚趾甲板上皮肤真菌生长，经治疗的脚趾甲板没有生长。经治疗的趾甲板不显示任何生长，然而未治疗的对照趾甲板显示显著生长。跟踪第一个对象120天，接受了4次同样方案的治疗。图18显示治疗前(A)、治疗后60天(B)、治疗后80天(C)和治疗后120天(D)的脚趾甲的比较。特别要注意的是，健康和未受感染的趾甲板遮盖50％趾甲区并在120天后由健康表皮生长。

尽管本文业已阐述了某些实施方案，但本领域技术人员应该明白，不偏离其精神，本发明方法、系统和设备可体现为其它特定形式。因此，本发明实施方案在各方面都应该考虑为阐明性的，而非限制本发明。应该理解，人趾甲起耐高温的透镜的作用，分散和/或反射部分NIMELS红外能量。因此，进行猪皮肤剂量/耐受研究以滴定不灼伤/损伤组织的最大NIMELS放射量。猪皮肤用作人皮肤的模型。遵照动物保护法并按照NIH的实验动物饲养管理和使用手册(Guide for theCare and Use of Laboratory Animals)进行这些研究。这些试验如下所示。

猪皮肤剂量/耐受研究

表49.

剂量ID	参数(nm)	输出功率(W)	射束光点(CM)	光点面积(cm2)	时间(秒)	总能量(焦耳)	能量密度(J/cm2)	功率密度(W/cm2)
	870	1.3	1.5	1.77	120	156	88	0.74
									1	930	1.3	1.5	1.77	120	156	88	0.74
	联合	2.6	1.5	1.77	120	312	177	1.47
	930单独	2.6	1.5	1.77	50	130	74	1.47
										870	1.3	1.5	1.77	140	182	103	0.74
2	930	1.3	1.5	1.77	140	182	103	0.74
										联合	2.6	1.5	1.77	140	364	206	1.47
										930单独	2.6	1.5	1.77	60	156	88	1.47
	870	1.3	1.5	1.77	160	208	118	0.74
									3	930	1.3	1.5	1.77	160	208	118	0.74
	联合	2.6	1.5	1.77	160	416	235	1.47
	930单独	2.6	1.5	1.77	70	182	103	1.47
										870	1.3	1.5	1.77	180	234	132	0.74
4	930	1.3	1.5	1.77	180	234	132	0.74
										联合	2.6	1.5	1.77	180	468	265	1.47
										930单独	2.6	1.5	1.77	80	208	118	1.47
										870	1.5	1.5	1.77	100	150	85	0.85
5	930	1.5	1.5	1.77	100	150	85	0.85
										联合	3	1.5	1.77	100	300	170	1.7
										930单独	3	1.5	1.77	40	120	68	1.7
	870	1.5	1.5	1.77	120	180	102	0.85
									6	930	1.5	1.5	1.77	120	180	102	0.85
	联合	3	1.5	1.77	120	360	204	1.7
	930单独	3	1.5	1.77	50	150	85	1.7
										870	1.5	1.5	1.77	140	210	119	0.85

7	930	1.5	1.5	1.77	140	210	119	0.85
										联合	3	1.5	1.77	140	420	238	1.7
										930单独	3	1.5	1.77	60	180	102	1.7
	870	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照
									8	930	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照
	联合	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照
	930单独	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照
	870	1.15	2	3.14	100	115	37	0.37
									9	930	1.15	2	3.14	100	115	37	0.37
	联合	2.3	2	3.14	100	230	73	0.73
	930单独	2.3	2	3.14	40	92	29	0.73
										870	1.15	2	3.14	120	138	44	0.37
10	930	1.15	2	3.14	120	138	44	0.37
										联合	2.3	2	3.14	120	276	88	0.73
										930单独	2.3	2	3.14	50	115	37	0.73
	870	1.15	2	3.14	140	161	51	0.37
									11	930	1.15	2	3.14	140	161	51	0.37
	联合	2.3	2	3.14	140	322	102	0.73
	930单独	2.3	2	3.14	60	138	44	0.73
										870	1.15	2	3.14	160	184	59	0.37
12	930	1.15	2	3.14	160	184	59	0.37
										联合	2.3	2	3.14	160	368	117	0.73
										930单独	2.3	2	3.14	70	161	51	0.73
	870	1.15	2	3.14	180	207	66	0.37
									13	930	1.15	2	3.14	180	207	66	0.37
	联合	2.3	2	3.14	180	414	132	0.73
	930单独	2.3	2	3.14	80	184	59	0.73

	870	1.15	2	3.14	200	230	73	0.37
									14	930	1.15	2	3.14	200	230	73	0.37
	联合	2.3	2	3.14	200	460	146	0.73
	930单独	2.3	2	3.14	90	207	66	0.73
										870	1.15	2	3.14	240	276	88	0.37
15	930	1.15	2	3.14	240	276	88	0.37
										联合	2.3	2	3.14	240	552	176	0.73
										930单独	2.3	2	3.14	120	276	88	0.73
	870	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照
									20	930	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照
	联合	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照
	930单独	对照	对照	对照	对照	对照	对照	对照

实施例XXV

非热能的NIMELS作用

非热能的NIMELS相互作用的证据

通过实验(体外水浴研究)证明了在体外NIMELS实验中达到的温度，没有高到其本身足以中和病原体的程度。

在下面的图表中，可清楚地看到，当简单的大肠杆菌细菌在水浴试管中受到47.5℃连续8分钟的攻击时，其达到91％的菌落生长。因此，基本上证明NIMELS反应在本质上确实是光化学，并在缺乏外源药物和/或染料时出现。

表50

Claims (75)

1.治疗系统，包含：

有效量的合适的药物；和

NIMELS发光激光器，所述激光器经配置和排布以产生于NIMELS放射量Tn的NIMELS辐射λn输出来辐射靶位点，

其中所述输出能够改变受辐射的细胞膜的膜偶极电位Ψd，藉此产生NIMELS效应，其中所述NIMELS效应增强所述药理作用。

2.权利要求1的治疗系统，其中对所述系统进行配置和排布以避免对所述靶位点的生物部分产生不合需要的损伤。

3.权利要求1的治疗系统，其中对所述NIMELS发光激光器进行配置和排布以产生波长为870nm或930nm或二者都有的所述NIMELS辐射输出。

4.权利要求1的治疗系统，其中对所述NIMELS发光激光器进行配置和排布以辐射所述靶位点约50-约1200秒的时间(Tn)。

5.权利要求1的治疗系统，其中所述NIMELS放射量在所述靶位点提供约100J/cm²-约2000J/cm²的能量密度。

6.权利要求1的治疗系统，其进一步包含经配置和排布以散射在所述靶位点处的所述输出的光分散末端。

7.权利要求1的治疗系统，其进一步包含经配置和排布以产生具有几何学平顶强度分布的输出的光传递子系统。

8.权利要求7的治疗系统，其中所述光传递子系统包括平顶透镜。

9.权利要求1的治疗系统，其进一步包括包含光纤的光传递系统。

10.权利要求1的治疗系统，其进一步包含放射量控制器，所述控制器经配置和排布以根据在靶位点处输出的总能量或功率或时间的计算来调整所述能量输出，以产生能够将稳态跨膜电位ΔΨ-稳态改变为瞬态跨膜电位ΔΨ-瞬态的Nimels效应。

11.权利要求1的治疗系统，其中所述药物选自抗细菌药物、抗真菌药物、抗肿瘤药物和其组合。

12.权利要求11的治疗系统，其中所述抗细菌药物选自：β-内酰胺类、糖肽、环状多肽、大环内酯类、酮内酯、苯胺尿嘧啶、林可酰胺类、氯霉素类、四环素类、氨基糖苷类、杆菌肽类、头孢唑啉类、头孢菌素类、莫匹罗星类、硝咪唑类、喹诺酮类和氟喹诺酮类、新生霉素类、多黏菌素类、阳离子去污剂抗生素、噁唑烷酮类或其它杂环有机化合物、甘氨酰环素类、脂肽类、环脂肽类、截短侧耳素类和短杆菌肽类、达托霉素类、利奈唑胺类、安莎霉素类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、平板霉素类、链阳性菌素类、替硝唑类和包括其任何盐在内的它们的组合。

13.权利要求11的治疗系统，其中所述抗真菌药物选自：多烯类、唑类、咪唑类、三唑类、烯丙胺类、棘白菌素类、环吡酮、氟胞嘧啶、灰黄霉素、阿莫罗芬、sodarins和包括其任何盐类在内的它们的组合。

14.权利要求11的治疗系统，其中所述抗肿瘤药物选自：放线菌素、蒽环霉素类、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、紫杉烷类、依托泊苷、替尼泊苷和其组合。

15.治疗系统，包括：

有效治疗量的药物；

NIMELS发光激光器，所述激光器经配置和排布以产生于NIMELS放射量Tn的NIMELS辐射λn来辐射靶位点，用于选择性辐射脂质双层的长链脂肪酸的C-H共价键，其中对所述共价键进行的靶向辐射有效改变受辐射的细胞膜的膜偶极电位Ψd，其中所述λn和Tn的组合适于：(i)辐射细胞色素链，(ii)让所述膜的生物能从热力学稳态条件改变为瞬态能量应激和/或氧化还原应激之一；和

光传递系统，所述光传递系统适于将所述于NIMELS放射量Tn的NIMELS辐射λn递送给靶位点，其中对所述光传递系统进行配置和排布以将于所述NIMELS放射量Tn的所述NIMELS辐射λn递送给所述靶位点而不损伤所需要的宿主细胞。

16.权利要求15的治疗系统，其中对所述NIMELS发光激光器进行配置和排布以对所述靶位点辐射约50-约1200秒的时间(Tn)。

17.权利要求15的治疗系统，其中所述NIMELS放射量在靶位点处提供约100J/cm²-约2000J/cm²的能量密度。

18.权利要求15的治疗系统，其中所述药物选自：抗细菌药物、抗真菌药物、抗肿瘤药物和其组合。

19.权利要求18的治疗系统，其中所述抗肿瘤药物选自：放线菌素、蒽环霉素类、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素和其组合。

20.权利要求18的治疗系统，其中所述抗细菌药物选自：β-内酰胺类、糖肽、环状多肽、大环内酯类、酮内酯、苯胺尿嘧啶、林可酰胺类、氯霉素类、四环素类、氨基糖苷类、杆菌肽类、头孢唑啉类、头孢菌素类、莫匹罗星类、硝咪唑类、喹诺酮类和氟喹诺酮类、新生霉素类、多黏菌素类、阳离子去污剂抗生素、噁唑烷酮类或其它杂环有机化合物、甘氨酰环素类、脂肽类、环脂肽类、截短侧耳素类和短杆菌肽类、达托霉素、利奈唑胺类、安莎霉素类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、平板霉素类、链阳性菌素类、替硝唑类和包括其任何盐类在内的它们的组合。

21.权利要求18的治疗系统，其中所述抗真菌药物选自：多烯类、唑类、咪唑类、三唑类、烯丙胺类、棘白菌素类、环吡酮、氟胞嘧啶、灰黄霉素、阿莫罗芬、sodarins和包括其任何盐类在内的它们的组合。

22.权利要求15的治疗系统，其中对所述系统进行配置和排布以改变质子动力势Δp，其中防止在所述生物部分或生物污染物中的细胞制造足够的ATP或吸收充分生长和繁殖所需的必需的营养物质，所述生长和繁殖包括在所述生物部分或生物污染物中的蛋白质、RNA、DNA、肽聚糖、脂磷壁酸和脂类的合成。

23.权利要求22的治疗系统，其中对所述系统进行配置和排布以增强药物，所述增强经由改变的吉布斯自由能值ΔGp降低可用的ATP，以致危及偶联于所述质子动力势Δp的所述药物的能量依赖的流出来实现。

24.权利要求15的治疗系统，对该系统进行配置和排布以产生具有2-10之间的值的NIMELS效应，Ne，其中Ne代表所述在任何组织、部分或溶液中抵抗微生物病原体的抗微生物增强作用的水平。

25.权利要求15的治疗系统，其中所述光传递系统包括：平顶透镜、光纤或分散末端。

26.降低靶位点细胞中的ΔμH+或Δμx+以抑制细胞合成代谢途径和弱化细胞抵抗抗微生物分子的抗性机制的方法，所述方法包括：

联合λn和Tn以辐射靶位点；

在所述靶位点处并行降低Δp-线-哺和/或Δp-质膜-细菌；和

同时或序贯给予所述靶位点抗菌药物，其中在所述靶位点处实现一种或多种细胞合成代谢途径的抑制。

27.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为肽聚糖生物合成，该途径由能结合在细菌转肽酶的活性位点的所述抗微生物剂共同靶向。

28.权利要求26的方法，其中所述被靶向的细菌合成代谢途径为肽聚糖生物合成，该途径由能结合革兰氏阳性菌细胞壁中间物中的酰基-D-丙氨酰-D-丙氨酸基团的所述抗微生物剂共同靶向，藉此防止N-乙酰胞壁酸(NAM)肽-和N-乙酰葡糖胺(NAG)-肽亚基结合到肽聚糖基质中，藉此防止肽聚糖的正确形成。

29.权利要求26的方法，其中所述被靶向的细菌合成代谢途径为肽聚糖生物合成，该途径由能与C₅₅-异戊二烯焦磷酸结合的所述抗微生物剂共同靶向，藉此防止焦磷酸酶与C₅₅-异戊二烯焦磷酸相互作用，藉此降低了可用于携带内膜外的结构单元肽聚糖的C₅₅-异戊二烯焦磷酸的量。

30.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细菌蛋白质生物合成，该途径由能结合于细菌核糖体50S亚基中的23SrRNA分子的所述抗微生物剂共同靶向，藉此在细胞中积聚肽酰-tRNA，藉此消耗用于活化α-氨基酸所必需的游离tRNA，并通过引起肽酰-tRNA从核糖体过早解离来抑制转肽作用。

31.权利要求30的方法，其中所述抗菌剂能同时结合于所述50S细菌核糖体亚基的23SRNA的两个结构域，藉此抑制所述细菌核糖体亚基50S和30S的形成。

32.权利要求30的方法，其中所述抗微生物剂被氯化以增加其亲脂性并能结合于所述细菌核糖体50S亚基的23S部分，并防止所述肽酰-tRNA从所述活性位点(A-位点)转移到所述肽基位点(P-位点)，藉此抑制转肽酶反应。

33.权利要求30的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细菌蛋白质生物合成，该途径由能结合于30S细菌核糖体亚基的所述抗微生物剂共同靶向，藉此阻断氨基-酰基tRNA与所述核糖体的接受位点(A-位点)结合，藉此抑制密码子-反密码子相互作用和蛋白质合成的延伸阶段。

34.权利要求33的方法，其中所述抗微生物剂能以更强亲合力结合于所述细菌核糖体，并且结合方向不同于具有八氢并四苯-2-甲酰胺骨架的多聚乙酰抗微生物剂的典型亚类。

35.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细菌蛋白质生物合成，该途径由能结合于特定氨酰-tRNA合成酶的所述抗微生物剂共同靶向，藉此防止特定氨基酸或其前体酯化为其相容的tRNA的氨基酸或其前体之一，从而防止氨酰-tRNA的形成。

36.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细菌蛋白质生物合成，该途径由在起始阶段之前抑制细菌蛋白质合成的所述抗微生物剂共同靶向，其抑制方式为通过所述23S rRNA的结构域V与所述50S rRNA结合，连同与所述30S核糖体亚基的16S rRNA相互作用，从而防止蛋白质合成起始子甲酰-甲硫氨酸(f-Met-tRNA)与所述30S核糖体亚基的结合。

37.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细菌蛋白质生物合成，该途径由与在靠近肽基转移酶中心的23S rRNA P位点区域中的蛋白L3与细菌核糖体50S亚基相互作用的所述抗微生物剂共同靶向，并因此抑制肽基转移酶活性和肽基转移，阻断P-位点相互作用，并防止活性50S核糖体亚基的正常形成。

38.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为DNA复制和转录，该途径由抑制拓扑异构酶II(DNA促旋酶)和/或拓扑异构酶IV的所述抗微生物剂共同靶向。

39.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为DNA复制和翻译，该途径由抑制DNA聚合酶IIIC的所述抗微生物剂共同靶向，所述酶为革兰氏阳性细菌染色体DNA复制所需的，但在革兰氏阴性细菌中不存在。

40.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为DNA复制和转录，该途径由抑制拓扑异构酶II(DNA促旋酶)和/或拓扑异构酶IV和/或DNA聚合酶IIIC的所述抗微生物剂共同靶向。

41.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细菌磷脂生物合成，该途径由对富含磷脂酰乙醇胺的细胞质膜起作用的所述抗微生物剂共同靶向。

42.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细菌脂肪酸生物合成，该途径由所述抗微生物剂共同靶向，该抗微生物剂通过选择性靶向II型脂肪酸合成中必不可少的酶β-酮酰基-(酰基载体蛋白(ACP))合酶I/II(FabF/B)来抑制细菌脂肪酸生物合成。

43.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为维持细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-细菌，且所述抗微生物剂通过与革兰氏阳性细胞质膜结合，藉此引起去极化作用和导致蛋白质、DNA和RNA合成抑制的膜电位损失来破坏细菌细胞膜功能。

44.权利要求26的方法，其中所述抗微生物剂增加细菌细胞壁的渗透性，藉此使得无机阳离子自由通过所述细胞壁，藉此破坏细胞质和胞外环境之间的离子梯度。

45.权利要求26的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为维持细菌膜的选择性渗透性和细菌细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-细菌，所述抗微生物剂为阳离子抗菌肽，该肽对所述细菌膜的带负电表面比对真核细胞的中性膜表面更有选择性，并导致膜渗透化和细菌细胞膜的最终穿孔和/或崩解，藉此促进细菌细胞内容物漏出和跨膜电位崩溃。

46.权利要求26的方法，其中所述抗微生物剂抑制细菌蛋白酶肽去甲酰酶，所述去甲酰酶催化甲酰基离开新合成的细菌多肽的N-末端。

47.权利要求26的方法，其中所述抗微生物剂抑制细菌中双组分调控系统，其中所述调控系统包括通过跨细菌细胞质膜的信号转导对其环境响应的能力，其中这些信号转导过程不在哺乳动物膜中存在。

48.权利要求26的方法，其中所述抗微生物剂与第二分子联合或一起被递送，该第二分子对被靶向的细菌作为抗性机制而产生的弱化或使所述抗微生物剂失活的任何蛋白质或酶起竞争性抑制剂的作用，和/或起流出泵抑制剂的作用，因此有助于恢复所述抗微生物剂的功效。

49.降低靶位点细胞中的ΔμH+或Δμx+以抑制细胞合成代谢途径和弱化抵抗抗菌分子的细胞抗性机制的方法，所述方法包括：

联合λn和Tn以辐射靶位点；

在所述靶位点处并行降低Δp-线-哺和/或Δp-质膜-细菌；和

同时或序贯给予所述靶位点多种抗菌药物，其中在所述靶位点处实现一种或多种细胞合成代谢途径的抑制。

50.权利要求49的方法，其中一种或多种所述抗微生物剂与第二分子联合，该第二分子对被靶向的细菌作为抗性机制而产生的弱化或使所述抗微生物剂失活的任何蛋白质或酶起竞争性抑制剂的作用，和/或起流出泵抑制剂的作用，因此有助于恢复所述抗微生物剂的功效。

51.降低靶位点细胞中的ΔμH+或Δμx+以抑制细胞合成代谢途径并弱化细胞抵抗抗真菌分子的抗性机制的方法，所述方法包括：

联合λn和Tn以辐射靶位点；

在所述靶位点处并行降低Δp-线-哺、Δp-线-真菌、Δp-质膜-真菌；和

同时或序贯给予所述靶位点抗真菌药物，其中在所述靶位点实现一种或多种细胞合成代谢途径的抑制。

52.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为磷脂生物合成，该途径由所述抗真菌药物共同靶向，该抗真菌药物破坏真菌细胞膜中存在的磷脂的结构。

53.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为麦角固醇生物合成，该途径由所述抗真菌药物共同靶向，该抗真菌药物在C-14脱甲基作用阶段抑制麦角固醇生物合成，导致消耗麦角固醇并积聚经由破坏细胞质膜结构来干扰作为膜组分的麦角固醇的功能的羊毛甾醇和其它14-甲基化固醇。

54.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为麦角固醇生物合成，该途径由所述抗真菌药物共同靶向，该抗真菌药物抑制角鲨烯环氧酶，进而在真菌细胞中抑制麦角固醇生物合成，导致真菌细胞膜渗透性增加。

55.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为麦角固醇生物合成，该途径由所述抗真菌药物共同靶向，该抗真菌药物抑制d14-还原酶和d7、d8-异构酶。

56.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为真菌细胞壁生物合成，该途径由所述抗真菌药物共同靶向，该抗真菌药物抑制(1，3)β-D-葡聚糖合酶，进而抑制真菌细胞壁中的β-D-葡聚糖合成。

57.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为真菌固醇生物合成，该途径由所述抗真菌药物共同靶向，该抗真菌药物结合真菌细胞膜中的固醇，所述主要固醇为麦角固醇，这有效改变所述细胞膜的瞬时温度，在所述膜中引起孔形成，导致在真菌细胞膜中形成有害的离子通道。

58.权利要求57的方法，其中将所述抗真菌药物配制用于在脂类、脂质体、脂类复合物和/或胶态分散体中递送以防止来自该药物的毒性。

59.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为蛋白质合成，其中所述抗真菌药物为5-FC，其由胞嘧啶通透酶吸收到真菌细胞中，脱去氨基成为5-氟尿嘧啶(5-FU)，转化为三磷酸核苷并掺入到RNA中，在此处其导致密码错编。

60.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为真菌蛋白质合成，该途径由抑制真菌延伸因子EF-2的所述抗真菌药物共同靶向。

61.权利要求51的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为真菌几丁质生物合成，该途径由所述抗真菌药物共同靶向，该抗真菌药物通过抑制一种或多种酶几丁质合酶2的作用来抑制真菌几丁质生物合成。

62.权利要求61的方法，其中所述抗真菌药物抑制几丁质合酶3的作用，该酶是在萌芽和生长、交配和孢子形成期间合成几丁质所必需的酶。

63.权利要求51的方法，其中所述抗真菌药物螯合多价阳离子Fe⁺³或Al⁺³，导致负责线粒体电子传递和细胞能量产生的金属依赖性酶的抑制，还导致真菌细胞内过氧化物的正常降解的抑制。

64.权利要求51的方法，其中所述抗真菌药物抑制真菌中的双组分调控系统，其中所述调控系统通过跨真菌细胞质膜的信号转导对环境响应。

65.权利要求51的方法，其中所述抗真菌药物与第二分子联合，该第二分子对被靶向的真菌作为抗性机制而产生的弱化或使所述抗真菌剂失活的任何蛋白质或酶起竞争性抑制剂的作用，和起流出泵抑制剂的作用，因此有助于恢复所述抗真菌剂的功效。

66.降低靶位点细胞中的ΔμH+或Δμx+以抑制细胞合成代谢途径并弱化细胞抵抗抗真菌分子的抗性机制的方法，所述方法包括：

联合λn和Tn以辐射靶位点；

在所述靶位点的细胞中并行降低Δp-线-哺和/或Δp-线-真菌和/或Δp-质膜-真菌；和

同时或序贯给予所述靶位点多种抗真菌药物，其中在所述靶位点实现一种或多种细胞合成代谢途径的抑制。

67.权利要求66的方法，其中一种或多种所述抗真菌药物与第二分子联合，该第二分子是被靶向的真菌作为抗性机制而产生的弱化或使所述抗真菌剂失活的任何蛋白质或酶的竞争性抑制剂，和起流出泵抑制剂的作用，因此有助于恢复所述抗真菌剂的功效。

68.降低靶位点细胞中的ΔμH+或Δμx+以抑制细胞合成代谢途径并弱化细胞抵抗抗肿瘤药物的抗性机制的方法，所述方法包括：

联合λn和Tn以辐射靶位点；

降低Δp-线-哺和/或哺乳动物细胞质跨膜电位ΔΨ-质膜-哺；和

同时或序贯给予所述靶位点抗肿瘤药物，其中在所述靶位点实现一种或多种细胞合成代谢途径的抑制。

69.权利要求68的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为DNA复制，该途径由所述抗肿瘤药物共同靶向，所述抗肿瘤药物通过交联DNA中的鸟嘌呤核苷碱基导致所述DNA链不能解开和分离来抑制DNA复制，所述解开和分离为DNA复制所必需。

70.权利要求68的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为DNA复制，该途径由所述抗肿瘤药物共同靶向，所述抗肿瘤药物与同一条DNA链或不同DNA链中的两种不同的7-N-鸟嘌呤残基反应。

71.权利要求68的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为DNA复制，该途径由所述抗肿瘤药物共同靶向，所述抗肿瘤药物通过起作抗代谢物的作用来抑制DNA复制和细胞分裂。

72.权利要求68的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细胞分裂，该途径由所述抗肿瘤药物共同靶向，所述抗肿瘤药物通过防止微管起作用来抑制细胞分裂。

73.权利要求68的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为DNA复制，该途径由所述抗肿瘤药物共同靶向，所述抗肿瘤药物通过防止细胞进入G1期和DNA复制来抑制DNA复制和细胞分裂。

74.权利要求68的方法，其中所述被靶向的合成代谢途径为细胞分裂，该途径由所述抗肿瘤药物共同靶向，所述抗肿瘤药物提高微管的稳定性，防止在细胞分裂后期染色体分离。

75.权利要求68的方法，其中被靶向的合成代谢途径为DNA复制，该途径由所述抗肿瘤药物共同靶向，所述抗肿瘤药物通过抑制I型或II型拓扑异构酶来抑制DNA复制和细胞分裂，通过扰乱恰当的DNA超螺旋来干扰DNA的转录和复制。

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