CN107699589B - 一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用 - Google Patents

一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备及其应用。一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒制备方法，包括（1）制备Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用，该平台成功制备Cre和Flp独立可控的重组伪狂犬病毒。本发明成功获得Cre和Flp独立依赖的表达荧光蛋白的重组伪狂犬病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用。
背景技术
人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一,有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。
伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双链DNA分子，约150kb，成熟病毒粒子含有约50种蛋白质，PRV除了具有疱疹病毒科成员的优点外，其不感染人，因而成为研究神经环路的重要工具。然而，野生型PRV毒力强，感染大鼠后3天左右即引起死亡，同时具有双向运动的特点，因此，限制了其在神经环路研究中的应用。而由野生型PRV衍生而来的疫苗株(PRV-Bartha)的毒性大大减弱，感染大鼠后10天才引起动物死亡，而且具有严格逆向传播的特点，大大提高了其在神经环路研究中的应用价值。目前为止，研究人员以PRV为对象，构建了一系列的带有荧光蛋白标签的重组PRV，并成功应用于神经网络结构和功能的研究。尽管如此，缺乏依赖于Cre和Flp表达不同颜色荧光蛋白和跨级运输的重组伪狂犬病毒。因此，本发明对于解析神经环路研究具有十分重要的意义。
随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明建立了一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒。将在解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的应用，该重组病毒可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。
为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：
1)Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的质粒构建：采用PCR扩增、酶切重组的方式将SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO.16所示序列顺次插入载体pAAV-nEF Con/Fon hChR2(H134R)-EYFP(addgene,55644#)，获得克隆命名为pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-CMV-BFP-right arm。
2)Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组病毒的制备：将步骤1)中的克隆转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养上清，纯化，即得重组伪狂犬病毒PRV527。
利用上述制备方法制得的重组伪狂犬病毒的应用，所述的应用包括但不限于利用本发明提供的重组伪狂犬病毒建立伪狂犬病毒的药物筛选平台，研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制、伪狂犬病毒病毒疫苗和诊断试剂的研发、伪狂犬病毒感染的动物模型的建立、伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析、或是对哺乳动物的脑神经环路进行示踪。
对哺乳动物的脑神经环路进行示踪，具体的，示踪包括下述步骤：
取0.1μl LV551定位注射到鼠脑，感染后3周后取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同脑区；另外，取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同脑区(作为对照，没有注射过LV551的鼠)。感染后5天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；对脑片使用荧光显微镜观察。
或是下述应用步骤：
取0.1μl LV553定位注射到鼠脑，感染后3周后取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同脑区；另一方面，取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同区域(作为对照，没有注射过LV551的鼠)。感染后5天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。
所述的LV551和LV553病毒，其制备方法包括：
1)具备表达Cre/TK和Flp/TK能力的辅助病毒：用PCR扩增、酶切重组的方式将SEQID NO.26和SEQ ID NO.25插入质粒3rd gen lentiviral plasmid with hUbC-drivenEGFP(14883#，addgene)，获得克隆命名为pCre-F2A-nlsDsred-T2A-TK的质粒；将SEQ IDNO.31和SEQ ID NO.32插入14883#(addgene)，获得克隆命名为pFlp-T2A-TK的质粒。
2)表达Cre/TK和Flp/TK能力的辅助病毒的制备：将pCre-F2A-nlsDsred-T2A-TK与商业化的包装质粒(pGAG/POL、pREV和pVSVG，System Biosciences)共转染293T细胞制备辅助病毒LV551；将pFlp-T2A-TK与商业化的包装质粒(pGAG/POL、pREV和pVSVG，SystemBiosciences)共转染293T细胞制备辅助病毒LV553。
所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猪等动物的神经环路标记；本发明所用的绿色荧光蛋白基因和红色荧光蛋白基因只是作为一个范式，因此，还可用其他外源基因替代本发明的荧光蛋白基因。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.本发明制备了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒，其能够分别在Cre和Flp的控制下实现荧光蛋白的表达和病毒的跨级，便于开展相关的研究。该重组病毒为神经科学问题的研究提供了全新的Cre和Flp偶联控制可视化和跨级的逆向示踪工具，填补了该领域的空白。
2.本发明对于开展伪狂犬病毒的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；
3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。高灵敏的表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒能够感染鼠等动物的神经细胞，能作为神经环路标记工具。
附图说明
图1本发明构建的一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的质粒示意图；
其中，A：含有同源臂和筛选标记的Cre和Flp依赖表达绿色和红色荧光蛋白的质粒构建示意图；
B：伪狂犬病毒的基因组示意图；
C：Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒构建示意图；
D：表达Cre/TK的辅助病毒示意图；
E：表达Flp/TK的辅助病毒示意图。
图2为一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒分别依赖Cre和Flp表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白示意图。
其中，A：细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：A左图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，A中图表示细胞表达Cre后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，A右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
B：含有Flp的细胞表达Flp后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：B左图表示细胞表达Flp后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，B中图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，B右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
C：不含Cre和Flp的对照细胞感染重组伪狂犬病毒PRV527，没有表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：C左图表示不含Cre的细胞后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，C中图表示不含Flp的细胞无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，C右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白。
图3为一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒分别稳定携带Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白元件的示意图。
重组伪狂犬病毒PRV527在体外BHK21细胞中传代10代后，通过Cre和Flp来检测绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达情况，从实验结果来看，本发明制备的重组伪狂犬病毒PRV527能够稳定的携带Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白元件。
其中，A：细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：A左图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，A中图表示细胞表达Cre后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，A右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
B：含有Flp的细胞表达Flp后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：B左图表示细胞表达Flp后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，B中图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，B右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白。
图4为一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒解析鼠脑神经环路的应用示意图。其中，A：Cre驱动的重组伪狂犬病毒PRV527感染鼠神经细胞后表达绿色荧光蛋白，从上至下三个图的解释分别为：A上图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白(箭头指向为绿色荧光蛋白)，A中图表示细胞表达Cre后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，A下图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
B：Flp驱动的重组伪狂犬病毒PRV527感染鼠神经细胞后表达红色荧光蛋白，从上至下三个图的解释分别为：B上图表示细胞表达Flp后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，B中图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白(箭头指向为红色荧光蛋白)，B下图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
C：没有Cre和Flp存在时，重组伪狂犬病毒PRV527感染鼠神经细胞后不能表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，从上至下三个图的解释分别为：C上图表示不含Cre的细胞后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，C中图表示不含Flp的细胞无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，C下图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
实施例1：一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：
1.1 Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白且含有同源臂的克隆：
1.1.1具备Cre依赖表达绿色荧光蛋白能力的克隆
分别采用PCR的方法扩增EGFP(序列见SEQ ID NO.1)和Ubc启动子(序列见SEQ IDNO.2)。扩增相应序列的引物分别如下：DNA片段EGFP的引物：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，模板为pEGFP；DNA片段Ubc启动子的引物：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，模板为FUGW(14883#，addgene)。本发明所有PCR使用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。首先使用AscI和NcoI双切pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA(20298#，addgene)，然后采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1插入到载体，获得克隆命名为pDIO-EGFP；然后使用MluI和BamHI双切pDIO-EGFP，采用同源重组的方式将片段SEQ IDNO.2插入pDIO-EGFP，从而获得新的质粒，命名为pUbc-DIO-EGFP。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.1.2具备Flp依赖表达红色荧光蛋白能力的克隆：
采用PCR扩增、酶切重组的方式将相关元件拼接。采用PCR的方法扩增mCherry(序列见SEQ ID NO.7)。扩增相应序列的引物如下：DNA片段mCherry的引物：SEQ ID NO:8和SEQID NO:9，模板为pCAGGS-mCherry(41583#，addgene)。本发明所有PCR使用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用AscI和XbaI双切pAAV-nEF Con/Fon hChR2(H134R)-EYFP(55644#，addgene)，然后采用同源重组的方式将SEQ ID NO.7插入到载体，获得克隆命名为pFDIO-mCherry。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.1.3具备Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白能力的克隆：
采用PCR扩增、酶切重组的方式将Cre依赖表达绿色荧光蛋白的元件与Flp表达红色荧光蛋白的元件进行整合。具体为：采用PCR的方法扩增Ubc-Dio-EGFP-WPRE-hGHpA(序列见SEQ ID NO.10),引物：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，模板为pUbc-DIO-EGFP。使用MluI单切pFDIO-mCherry，然后采用同源重组的方式将SEQ ID NO.10插入到载体，获得克隆命名为pFDIO-mCherry-DIO-EGFP。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.1.4具备Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白能力且含有同源臂的克隆：为了获得具备重组能力的克隆，需要将相应的同源臂分别插入到pFDIO-mCherry-DIO-EGFP中，具体如下：首先采用PCR的方法扩增左同源臂(序列见SEQ ID NO.13)，所用引物分别为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，模板为PRV病毒的基因组。将SEQ ID NO.13插入到经过MluI单切pFDIO-mCherry-DIO-EGFP，从而获得质粒pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP；然后采用PCR的方法扩增右同源臂(序列见SEQ ID NO.16)，所用引物分别为SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18，模板为PRV病毒的基因组。将SEQ ID NO.16插入到经过RsrII单切的pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP，从而获得质粒pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-right arm。本发明所有PCR使用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，且构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.1.5具备Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白能力且含同源臂和筛选标记的克隆：为了便于后续的重组病毒的筛选，需要将筛选标记插入到pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-right arm，具体如下：首先采用PCR的方法扩增BFP(序列见SEQ IDNO.19)，所用引物分别为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21，模板为pME-TagBFP-NS(75342#，addgene)。将SEQ ID NO.19插入到经过HindIII和XhoI双切的pcDNA3.1+，从而获得质粒pcDNA3.1+-BFP；然后采用PCR的方法扩增CMV-BFP-bGHpA(SEQ ID NO:22)，所用引物分别为SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24，模板为pcDNA3.1+-BFP。将SEQ ID NO:22插入到经过RsrII单切的pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-right arm，从而获得质粒pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-CMV-BFP-right arm。本发明所有PCR使用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，且构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.2构建Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：
1.2.1病毒的重组：将质粒pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-CMV-BFP-rightarm采用脂质体转染的方法转染到BHK21细胞，4小时后更换含有2％FBS的DMEM，并加入伪狂犬病毒Bartha株。在不同时间观察荧光的表达和细胞的病变情况，感染2天后收集培养基上清(含有病毒液体)，病毒命名为PRV527(图1)；
1.2.2病毒的纯化：采用双层plaque assay的方法，结合荧光显微镜产生的蚀斑(绿色)和产生的浅色斑点的对应特点，挑取含有绿色荧光斑点的浅色空斑到新鲜培养的BHK21细胞(含有2％FBS的DMEM)，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，分别在感染后观察荧光的表达和细胞产生的病变情况，待细胞病变明显且有可见绿色荧光时，将含有细胞的培养板放在-80℃，30min后置于37℃解冻，重复此过程3次；重复上述过程，直到所有的荧光斑和浅色的空斑完全一致，即表示病毒已经纯化；
1.2.3病毒的扩大培养和浓缩：将病毒感染BH2K1细胞后2天收集培养基上清，400g离心10min，然后使用0.45μm虑膜过滤，采用双层空斑的方法检测每种重组病毒的滴度；采用高速离心的方法对病毒进行浓缩(50000g，离心2.5小时)，离心前的病毒滴度是1.5×107PFU/ml，离心后的病毒滴度是6.5×109PFU/ml，以便达到动物实验的要求。
1.3分别构建表达Cre/TK和Flp/TK的辅助病毒：
1.3.1构建表达Cre/TK的辅助病毒
1.3.1.1具备表达Cre/TK能力的克隆：首选采用基因合成的方式合成nlsDsred-T2A-TK(SEQ ID NO.25)，合成的片段插入pUC57，命名为pUC57-Dsred-T2A-TK。采用PCR扩增、酶切重组的方式将相关元件拼接。分别采用PCR的方法扩增Cre(序列见SEQ ID NO.26)和nlsDsred-T2A-TK(序列见SEQ ID NO.25)。扩增相应序列的引物分别如下：DNA片段Cre的引物：SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，模板为pNrl-Cre(13780#，addgene)；DNA片段nlsDsred-T2A-TK的引物：SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，模板为pUC57-nlsDsred-T2A-TK。本发明所有PCR使用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。首先使用BamHI和EcoRI双切FUGW(14883#，addgene)，然后采用同源重组的方式将SEQ ID NO.26和SEQ IDNO.25插入到载体，获得克隆命名为pCre-F2A-nlsDsred-T2A-TK。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.3.1.2构建表达Cre/TK能力的辅助病毒：将pCre-F2A-nlsDsred-T2A-TK与商业化的包装质粒(pGAG/POL、pREV和pVSVG，System Biosciences)共转染293T细胞，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，分别在感染后观察荧光的表达情况，收集病毒液，命名为LV551，400g离心10min，然后使用0.45μm虑膜过滤，检测重组病毒的滴度；采用高速离心的方法对病毒进行浓缩(50000g，离心2.5小时)，离心前的病毒滴度是2×104PFU/ml，离心后的病毒滴度是1×106PFU/ml，以便达到动物实验的要求。
1.3.2构建表达Flp/TK的辅助病毒
1.3.2.1具备表达Flp/TK能力的克隆：采用PCR扩增、酶切重组的方式将相关元件拼接。分别采用PCR的方法扩增Flp基因(序列见SEQ ID NO.31)和TK基因(序列见SEQ IDNO.32)。扩增相应序列的引物分别如下：DNA片段Flp基因的引物：SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:34，模板为pCAG-Flpe(13787#，addgene)；DNA片段TK基因的引物：SEQ ID NO:35和SEQID NO:36，模板为pUC57-Dsred-T2A-TK。本发明所有PCR使用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。首先使用BamHI和EcoRI双切FUGW(14883#，addgene)，然后采用同源重组的方式将SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32插入到载体，获得克隆命名为pFlp-T2A-TK。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
1.3.2.2构建表达Flp/TK能力的辅助病毒：将pFlp-T2A-TK与商业化的包装质粒(pGAG/POL、pREV和pVSVG，System Biosciences)共转染293T细胞，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，分别在感染后观察荧光的表达情况，收集病毒液，命名为LV553，400g离心10min，然后使用0.45μm虑膜过滤，检测重组病毒的滴度；采用高速离心的方法对病毒进行浓缩(50000g，离心2.5小时)，离心前的病毒滴度是1.3×104PFU/ml，离心后的病毒滴度是2.1×106PFU/ml，以便达到动物实验的要求。
实施例2：一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒分别依赖Cre和Flp表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白：
目前，尚没有同时在一个重组伪狂犬病毒中同时具备Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白能力的逆向可视化系统，为了表明本发明的优势，本实施例将在Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白能力方面进行分析：
一方面，通过转染pNrl-Cre(可以表达Cre，13780#，addgene)到BHK21细胞，24小时后取5μl实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是1.5×107PFU/ml)感染能表达Cre的BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，分别在感染后采用同样的曝光参数观察荧光的表达情况。
实验结果：
图2中A：细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：A左图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，A中图表示细胞Cre无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，A右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
另一方面，取10μl实施例1制备的辅助病毒LV553(病毒滴度是1.3×104PFU/ml)到BHK21细胞(表达Flp)，24小时后取5μl实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是1.5×107PFU/ml)感染能表达Flp的BHK21细胞，另外，取5μl实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是1.5×107PFU/ml)感染没有Flp的BHK21细胞(作为对照)，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，分别在感染后采用同样的曝光参数观察荧光的表达情况。
实验结果：
图2中B：含有Flp的细胞表达Flp后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：B左图表示细胞表达Flp后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，B中图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，B右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
图2中C：不含Cre和Flp的对照细胞感染重组伪狂犬病毒PRV527，没有表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：C左图表示不含Cre的细胞后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，C中图表示不含Flp的细胞无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，C右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白。
总体而言：本发明制备的PRV527具有Cre依赖表达绿色荧光蛋白和Flp依赖表达红色荧光蛋白的能力，当没有Cre和Flp存在时，未见绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达。
实施例3：一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒稳定性分析：
为了分析PRV527携带Cre和Flp依赖元件的稳定性，取5μl实施例1制备的PRV527(病毒滴度是1.5×107PFU/ml)(作为P0)感染BHK21细胞，感染2天后收集上清(作为P1)，按照上述方法在BHK21细胞上进行传10代，收集每代的病毒液，一方面进行plaqueassay检测plaque的形态和均一性，另一方面分析EGFP在病毒传代过程中的稳定性以及该病毒体外感染BHK21细胞后表达荧光的能力。结果如图3所示，重组伪狂犬病毒PRV527在BHK21细胞上进行传10代。取P10代的重组伪狂犬病毒PRV527按照实施例1的方式进行检测，即：
一方面，通过转染pNrl-Cre(可以表达Cre，13780#，addgene)到BHK21细胞，24小时后取5μl实施例3制备的P10代重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是1.6×107PFU/ml)感染能表达Cre的BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，分别在感染后采用同样的曝光参数观察荧光的表达情况。
实验结果：
图3中A：细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：A左图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，A中图表示细胞表达Cre后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，A右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
另一方面，取10μl实施例1制备的辅助病毒LV553(病毒滴度是1.3×104PFU/ml)到BHK21细胞(表达Flp)，24小时后取5μl实施例3制备的P10重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是1.6×107PFU/ml)感染能表达Flp的BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养，分别在感染后采用同样的曝光参数观察荧光的表达情况。
实验结果：
图3中B：含有Flp的细胞表达Flp后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，从左至右三个图的解释分别为：B左图表示细胞表达Flp后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，B中图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，B右图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白。
总体而言，其在传代过程中能稳定携带Cre和Flp依赖元件。
实施例4：一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒在解析脑神经环路中的应用，其步骤是：
4.1 Cre依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒：一方面，取0.1μl实施例1制备的LV551(病毒滴度是1×106PFU/ml)定位注射到鼠脑，感染后3周后取0.1μl实施例1制备的注射重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是6.5×109PFU/ml)定位注射到鼠脑相同脑区；另一方面，取0.1μl实施例1制备的注射重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是6.5×109PFU/ml)定位注射到鼠脑相同脑区(作为对照，没有注射过LV551的鼠)。感染后5天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；对脑片使用荧光显微镜观察。
结果显示：
图4中A：Cre驱动的重组伪狂犬病毒PRV527感染鼠神经细胞后表达绿色荧光蛋白，从上至下三个图的解释分别为：A上图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白(箭头指向为绿色荧光蛋白)，A中图表示细胞表达Cre后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，A下图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
总体而言，重组病毒注射到鼠脑后，可见绿色荧光蛋白信号(图4中A)，表明重组病毒具有标记脑神经环路的能力，且该病毒具有Cre依赖表达绿色荧光蛋白的能力。
图4C：没有Cre和Flp存在时，重组伪狂犬病毒PRV527感染鼠神经细胞后不能表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，从上至下三个图的解释分别为：C上图表示不含Cre的细胞后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，C中图表示不含Flp的细胞无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白，C下图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白。
4.2 Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒：一方面，取0.1μl实施例1制备的LV553(病毒滴度是2.1×106PFU/ml)定位注射到鼠脑，感染后3周后取0.1μl实施例1制备的注射重组伪狂犬病毒PRV527(病毒滴度是6.5×109PFU/ml)定位注射到鼠脑相同脑区；另一方面，对照和实施例4的4.1的对照一致。感染后5天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；对脑片使用荧光显微镜观察。
结果显示：
图4中B：Flp驱动的重组伪狂犬病毒PRV527感染鼠神经细胞后表达红色荧光蛋白，从上至下三个图的解释分别为：B上图表示细胞表达Flp后无法驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达绿色荧光蛋白，B中图表示细胞表达Cre后驱动重组伪狂犬病毒PRV527表达红色荧光蛋白(箭头指向为红色荧光蛋白)，B下图表示重组伪狂犬病毒PRV527感染细胞后广谱表达蓝色荧光蛋白；
对照见图4中C。
总体而言，重组病毒注射到鼠脑后，可见红色荧光蛋白信号(图4中B)，表明重组病毒具有标记脑神经环路的能力，且该病毒具有Cre依赖表达绿色荧光蛋白的能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所
<120> 一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用
<130> 一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用
<160> 36
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60
agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120
ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180
cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240
gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300
taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360
cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420
gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480
tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540
tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600
aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660
cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720
gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780
gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840
acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900
ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960
gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020
tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080
tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140
ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc taaattctgg ccgtttttgg cttttttgtt 1200
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggttcctgcg gccgcacgcg tgcgccgggt tttggcgcct cc 42
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<212> DNA
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cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 480
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gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 600
atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 660
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<210> 10
<211> 3346
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60
agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120
ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180
cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240
gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300
taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360
cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420
gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480
tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540
tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600
aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660
cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720
gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780
gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840
acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900
ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960
gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020
tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080
tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140
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agacggtacc gagctcggag cgatcgcggt accggatcct ctagagtcga ctccggaata 1260
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ttagcaatat gaaacctctt aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatggcgc 1380
gccgatttac ttgtacagct cgtccatgcc gagagtgatc ccggcggcgg tcacgaactc 1440
cagcaggacc atgtgatcgc gcttctcgtt ggggtctttg ctcagggcgg actgggtgct 1500
caggtagtgg ttgtcgggca gcagcacggg gccgtcgccg atgggggtgt tctgctggta 1560
gtggtcggcg agctgcacgc tgccgtcctc gatgttgtgg cggatcttga agttcacctt 1620
gatgccgttc ttctgcttgt cggccatgat atagacgttg tggctgttgt agttgtactc 1680
cagcttgtgc cccaggatgt tgccgtcctc cttgaagtcg atgcccttca gctcgatgcg 1740
gttcaccagg gtgtcgccct cgaacttcac ctcggcgcgg gtcttgtagt tgccgtcgtc 1800
cttgaagaag atggtgcgct cctggacgta gccttcgggc atggcggact tgaagaagtc 1860
gtgctgcttc atgtggtcgg ggtagcggct gaagcactgc acgccgtagg tcagggtggt 1920
cacgagggtg ggccagggca cgggcagctt gccggtggtg cagatgaact tcagggtcag 1980
cttgccgtag gtggcatcgc cctcgccctc gccggacacg ctgaacttgt ggccgtttac 2040
gtcgccgtcc agctcgacca ggatgggcac caccccggtg aacagctcct cgcccttgct 2100
caccatggtg gctagcataa cttcgtataa agtatcctat acgaagttat ttgccttaac 2160
ccagaaatta tcactgttat tctttagaat ggtgcaaaga ataacttcgt ataatgtatg 2220
ctatacgaag ttatgaattc gatatcaagc ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa 2280
tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg 2340
ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct 2400
tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg 2460
gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct 2520
gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg 2580
ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg 2640
tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc 2700
tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc 2760
gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc 2820
ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgagc gctgctcgag agatctacgg 2880
gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt 2940
gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt 3000
ctataatatt atggggtgga ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac 3060
ctgtagggcc tgcggggtct attgggaacc aagctggagt gcagtggcac aatcttggct 3120
cactgcaatc tccgcctcct gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt 3180
gggattccag gcatgcatga ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt agagacgggg 3240
tttcaccata ttggccaggc tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct acccaccttg 3300
gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg aaccactgct cccttc 3346
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ggttcctgcg gccgcacgcg tgcgccgggt tttggcgcct cc 42
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
cgatcgcaga tccttacgcg gaagggagca gtggttcacg c 41
<210> 13
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
tgcagctcca gcgccaccag gcgcaccagg ttgagctggt ggcgctgcac gcgcgcgcgg 60
atcgagtgcg cgtccagcgc cagcgcggcc agcccgggga agagctgcgt gagctccgtg 120
cgctcgtccg cgcggtaggc cacgacgacg tagtgggcca gcaggaagcg caggttgccg 180
tcgccgctgc gcgaggcggg cgcgtccccg ctggcgccgc gcggcggcgg cgcgttgggc 240
acgagcgcgc cgagctggaa gttgttgcgc aggcggtccc cgtacacgtt gccgttgtgc 300
agcaggcgcc gcagcagcag caggcccgtg atggtgttca ccgtggcgcg cagcagcggc 360
gcgtcctcgc cgaggaagag gttctggccg cggcccagga aggcggccgc ggcgcggttg 420
acctcgtcca cgaagcccgc gccgtcgacc tcgttggcgc cgacgttcgc gccggggacc 480
acgcgcaggc gcgccagcgc ggcgagcacg ctgtggccct ccagcgcgta gcgcccgtgg 540
agctgctcgc gcggcacgcg cgcgtagttg tagcggtacg agatgcgccc gccctcggcc 600
agcgcctggc tcagcgcgtc caggtactcg gggacccgct ccagcaggtc cgcgatgccc 660
agcggggcgg cggcgcccgc ggcgccgggc ccctgccgcg cgcggtgcac caggtgcagg 720
cacagcgcgg cgctctcgag cgccgagtag tgccggttgc ccacgtacag acgcccgcag 780
gcctgcagcg ccgtggtcgt cacgcccatg aaggtgcgcg acatgcggcc gtcgcgcgag 840
tcgatggcgc gcgagacctg cgggcgctcc gcgacgagcg tggcctggag cgtggcgtac 900
cacgtgccga agagcacgcc ggaggcggcg ccgcgcgcgg cgtacaccat ggccaggaag 960
tccagcgaga ggttggcgtc gtaggcgagc gccacgtcgt tcttggcgat ctgcacctcg 1020
cggccctcgt ccgcggccgc ggtcgcctcg ggcgcctcct cggcggcgcg cgccgcgtcc 1080
gcctcctcgg cggcgcgcgc cgtctcctcg agcaccacga gcgcttcggc cacgcgctcc 1140
acctgccgct ccagcggccg cagctgctcg tccacctcgg cctcgaggcg cgcgcccgcg 1200
gccatggcgt tgtccagcgc cgcggcggcc gcgcggcggc gcgcgttcgc gtgcgccagc 1260
gcgaggcgcg cgtcgaggcc ctcgccgaag cccgggcggg cccagaagcc cacggggaac 1320
gggggcgcga tgaagtggcg cgcgctgccc gggatcgcag cggcctcgaa ggcgaaccac 1380
gcgcggtcca tggcgcgggg ggacatgggc cgcgcgccgc cgcgcgccgc cttatcatcc 1440
ccgctccccg ccgccgcccg gccccacgcg cgccacgatc gcgatcaccg ccgcggcccg 1500
gcgacgtact cggcgaggcc gcgcacggtc gcggccatcg cgctcgcgtt gccgcgcgtc 1560
tgggtgcagg gcaggcgcgt cacgtcgagc acgcgcatgc tccgctgggc cacaaacacc 1620
agcaggggca cgagcgtgat ctcctcgccg cccgggggca cggcggcggc gaggaggcgc 1680
gccgagtcgc gcagctggca cagcccctcg tgccgctgcc cgcgcttgct gggcgtgttg 1740
aggttccggg ggaagcggca cgtcttgagc tcgatgacga agcacaggtg cggccccacc 1800
cccagccgca ccacgcacac gcagtcgggg cggcgcaccc cgaggttgac ttcaaaggcc 1860
agggtcaagg acgccttctt aagcgtctcg cggggaagcc cgaagagact ctcgccgtac 1920
gcggacgggt cgcggcgcag gcgttcgtag aagcggttgt ggcagcggat ccccgcccgg 1980
aagcgcgccg ggatgcgcat 2000
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
ggttcctgcg gccgcatgca gctccagcgc caccaggc 38
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gccaaaaccc ggcgcacgcg atgcgcatcc cggcgcgctt c 41
<210> 16
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
ccctcgcccc tcccacccgc gccgcggccg gatggagacc gcgacggagg caacgacgac 60
ggcgtgggag ggggctcggg gcgcgtataa agccatgtgt atgtcatccc aataaagttt 120
gccgtgcccg tcaccatgcc cgcgtcgtcc gtgcgcctcc cgctgcgcct cctgaccctc 180
gcgggcctcc tggccctcgc gggggccgcc gccctcgccc gcggcgcgcc gcagggtggg 240
ccgccctcgc cgcagggggg tcccgcgccc accgcggcgc ccgcgcgcgg gcccaccctg 300
ttcgtcctgg acggcgacgg ctccgcgtgg ttcgtcttcc agctcggcgg gctgggggcg 360
ctcaacgaca cgcgcatccg cgggcacctg ctcggccggt acctcgtctc gtaccaggtg 420
gtgcccccgc ccgtctccgc gtggtacttt gtgcagcgcc cgcgcgagcg cccgcgcctc 480
tcggggccgc cctcgggcgc ggagctcgtg gccttcgacg cgcccggcgt ccggcgcacg 540
tacaccacgg cggcggtgtg gcccgcggag gtggccgtcc tcgcggacgc ggaggcgcgc 600
tgccccgcgg ccgtcttcaa cgtgacgctg ggcgaggcct tcctcggcct gcgcgtcgcg 660
ctgcgctcct tcctgccgct ggaggtcatc atctccgccg agcggatgcg catgatcgcg 720
cccccggcgc tcggctcgga cctggagccg ccgggcccgc ccgcgggccg cttccacgtg 780
tacacgctcg gcttcctctc cgacggggcc atgcaccaga cgatgcgcga cgtggccgcc 840
tacgtgcacg agagcgacga ctacctcgcc cagctgtcgg cggcgcacgc ggccgccctg 900
gccgccgtgg tgcagcccgg gccgtactac ttttaccgcg cggcggtgcg cctcggcgtg 960
gccgccttcg tcttctccga ggcggcgcgc cgcgaccggc gcgcctcggc gccggcgctc 1020
ctgcgcgtcg agagcgacgc gcgcctgctc tcgcgcctgc tcatgcgcgc ggccggctgc 1080
cccgcgggct tcgccgggct cttcgacggg cgcgccgagc gcgtcccggt ggcgcccgcg 1140
gaccagctcc gcgccgcctg gaccttcggc gaggacccgg cgccccggct ggacctcgcg 1200
cgggcgaccg tcgccgaggc gtaccgccgc tccgtgcggg ggaagccctt cgaccagcag 1260
gcgctcttct tcgccgtcgc cctgctgctg cgcgccggcg gccccggcga cgcgcgcgag 1320
accctgctcc gcaccacggc catgtgcacc gcggagcgcg ccgccgcggc cgccgagctc 1380
acgcgggccg cgctctcgcc gacggccgcg tggaacgagc ccttcagcct gctcgacgtc 1440
ctctcgtcgt gcgccgtctc gctgcgccgc gacctcggcg gggacgccac cctggccaac 1500
ctgggcgccg cggcgcggct cgcgctggcg cccgccgggg ccccgggcgc ggcggcggcg 1560
acggacgagg gggcggggga ggaggaggac cccgtcgcgc gcgccgcgcc cgagatcccc 1620
gccgaggcgc tgctcgccct gcccctgcgc gggggcgcca gcttcgtgtt cacgcgccgg 1680
cgcccggact gcggcccggc gtacacgctc ggcggcgtgg acatcgccaa cccgctcgtg 1740
ctcgccctcg tcagcaacga cagcgccgcg tgcgactaca cggaccgcat gcccgagtcc 1800
cagcacctgc cggcgacgga caacccgtcc gtgtgcgtgt actgcgactg cgtgttcgtg 1860
cgctactcct ccgcgggcac gatcctggag accgtcctca tcgagtccaa ggacatggag 1920
gagcagctca tggccggcgc caactccacc atccccagct tcaacccgac gctgcacggc 1980
ggcgacgtca aggccctgat 2000
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
gtaggtaacc acgtgcgacc ggtccctcgc ccctcccacc cgcg 44
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
gttcctgcgg ccgctcggtc atcagggcct tgacgtcgcc g 41
<210> 19
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
agcgagctga ttaaggagaa catgcacatg aagctgtaca tggagggcac cgtggacaac 60
catcacttca agtgcacatc cgagggcgaa ggcaagccct acgagggcac ccagaccatg 120
agaatcaagg tggtcgaggg cggccctctc cccttcgcct tcgacatcct ggctactagc 180
ttcctctacg gcagcaagac cttcatcaac cacacccagg gcatccccga cttcttcaag 240
cagtccttcc ctgagggctt cacatgggag agagtcacca catacgaaga cgggggcgtg 300
ctgaccgcta cccaggacac cagcctccag gacggctgcc tcatctacaa cgtcaagatc 360
agaggggtga acttcacatc caacggccct gtgatgcaga agaaaacact cggctgggag 420
gccttcaccg agacgctgta ccccgctgac ggcggcctgg aaggcagaaa cgacatggcc 480
ctgaagctcg tgggcgggag ccatctgatc gcaaacatca agaccacata tagatccaag 540
aaacccgcta agaacctcaa gatgcctggc gtctactatg tggactacag actggaaaga 600
atcaaggagg ccaacaacga gacctacgtc gagcagcacg aggtggcagt ggccagatac 660
tgcgacctcc ctagcaaact ggggcacaag cttaat 696
<210> 20
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
ctagcgttta aacttaagct taccatgcct ccaaagaaga agagaaaggt gagcgagctg 60
attaaggaga ac 72
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
aacgggccct ctagactcga gttaattaag cttgtgcccc agttt 45
<210> 22
<211> 1682
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660
ctggctagcg tttaaactta agcttaccat gcctccaaag aagaagagaa aggtgagcga 720
gctgattaag gagaacatgc acatgaagct gtacatggag ggcaccgtgg acaaccatca 780
cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag ggcacccaga ccatgagaat 840
caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac atcctggcta ctagcttcct 900
ctacggcagc aagaccttca tcaaccacac ccagggcatc cccgacttct tcaagcagtc 960
cttccctgag ggcttcacat gggagagagt caccacatac gaagacgggg gcgtgctgac 1020
cgctacccag gacaccagcc tccaggacgg ctgcctcatc tacaacgtca agatcagagg 1080
ggtgaacttc acatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa acactcggct gggaggcctt 1140
caccgagacg ctgtaccccg ctgacggcgg cctggaaggc agaaacgaca tggccctgaa 1200
gctcgtgggc gggagccatc tgatcgcaaa catcaagacc acatatagat ccaagaaacc 1260
cgctaagaac ctcaagatgc ctggcgtcta ctatgtggac tacagactgg aaagaatcaa 1320
ggaggccaac aacgagacct acgtcgagca gcacgaggtg gcagtggcca gatactgcga 1380
cctccctagc aaactggggc acaagcttaa ttaactcgag tctagagggc ccgtttaaac 1440
ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 1500
cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 1560
aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 1620
cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 1680
gg 1682
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
aggtaaccac gtgcgaccgg tgttgacatt gattattgac ta 42
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
tgggaggggc gagggaccgg ccatagagcc caccgcatcc c 41
<210> 25
<211> 1716
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
atgcctccaa agaagaagag aaaggtgatg gcctcctccg agaacgtcat caaggagttc 60
atgcgcttca aggtgcgcat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc 120
gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt gaccaagggc 180
ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tccccccagt tccagtacgg ctccaaggtg 240
tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacaagaagc tgtccttccc cgagggcttc 300
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tccctgcagg acggctcctt catctacaag gtgaagttca tcggcgtgaa cttcccctcc 420
gacggccccg taatgcagaa gaagactatg ggctgggagg cctccaccga gcgcctgtac 480
ccccgcgacg gcgtgctgaa gggcgagatc cacaaggccc tgaagctgaa ggacggcggc 540
cactacctgg tggagttcaa gtccatctac atggccaaga agcccgtgca gctgcccggc 600
tactactacg tggactccaa gctggacatc acctcccaca acgaggacta caccatcgtg 660
gagcagtacg agcgcgccga gggccgccac cacctgttcc tggagggcag aggaagtctg 720
ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggcccaatgc gcatcctccg gatctacctc 780
gacggcgcct acggcaccgg caagagcacc acggcccggg tgatggcgct cggcggggcg 840
ctgtacgtgc ccgagccgat ggcgtactgg cgcactctgt tcgacacgga cacggtggcc 900
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cgccacccgg tggccgcgac ggtgtgcttc ccgctggcgc gcttcatcgt cggggacatc 1140
agcgcggcgg ccttcgtggg cctggcggcc acgctgcccg gggagccccc cggcggcaac 1200
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gtcaacacgt cgcgctacct gagctcgggg cgccgctggc gcgacgactg ggggcgcgcg 1380
ccgcgcttcg accagaccac gcgcgactgc ctcgcgctca acgagctctg ccgcccgcgc 1440
gacgaccccg agctccagga caccctcttc ggcgcgtaca aggcgcccga gctctgcgac 1500
cggcgcgggc gcccgctcga ggtgcacgcg tgggcgatgg acgcgctcgt ggccaagctg 1560
ctgccgctgc gcgtctccac cgtcgacctg gggccctcgc cgcgcgcctg cgccgcggcc 1620
gtggcggcgc aggcgcgcgg catggaggtg acggagtccg cgtacggcga ccacatccgg 1680
cagtgcgtgt gcgccttcac gtcggagatg ggggtg 1716
<210> 26
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
gccaatttac tgaccgtaca ccaaaatttg cctgcattac cggtcgatgc aacgagtgat 60
gaggttcgca agaacctgat ggacatgttc agggatcgcc aggcgttttc tgagcatacc 120
tggaaaatgc ttctgtccgt ttgccggtcg tgggcggcat ggtgcaagtt gaataaccgg 180
aaatggtttc ccgcagaacc tgaagatgtt cgcgattatc ttctatatct tcaggcgcgc 240
ggtctggcag taaaaactat ccagcaacat ttgggccagc taaacatgct tcatcgtcgg 300
tccgggctgc cacgaccaag tgacagcaat gctgtttcac tggttatgcg gcggatccga 360
aaagaaaacg ttgatgccgg tgaacgtgca aaacaggctc tagcgttcga acgcactgat 420
ttcgaccagg ttcgttcact catggaaaat agcgatcgct gccaggatat acgtaatctg 480
gcatttctgg ggattgctta taacaccctg ttacgtatag ccgaaattgc caggatcagg 540
gttaaagata tctcacgtac tgacggtggg agaatgttaa tccatattgg cagaacgaaa 600
acgctggtta gcaccgcagg tgtagagaag gcacttagcc tgggggtaac taaactggtc 660
gagcgatgga tttccgtctc tggtgtagct gatgatccga ataactacct gttttgccgg 720
gtcagaaaaa atggtgttgc cgcgccatct gccaccagcc agctatcaac tcgcgccctg 780
gaagggattt ttgaagcaac tcatcgattg atttacggcg ctaaggatga ctctggtcag 840
agatacctgg cctggtctgg acacagtgcc cgtgtcggag ccgcgcgaga tatggcccgc 900
gctggagttt caataccgga gatcatgcaa gctggtggct ggaccaatgt aaatattgtc 960
atgaactata tccgtaacct ggatagtgaa acaggggcaa tggtgcgcct gctggaagat 1020
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<213> 人工合成
<400> 27
cttttttgtt agacaggatc cggcgcgcca ccatgcccaa gaagaagagg aaggtggcca 60
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tggcccaggg ttggactcga cgtctcccgc cagcttgaga aggtcaaaat tcaacagctg 60
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<213> 人工合成
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gataagcttg atatcgaatt cttacacccc catctccgac gtgaa 45
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
agccagttcg acatcctgtg caagaccccc cccaaggtgc tggtgcggca gttcgtggag 60
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aagacccaga aggccaccat cctggaggcc agcctgaaga agctgatccc cgcctgggag 300
ttcaccatca tcccttacaa cggccagaag caccagagcg acatcaccga catcgtgtcc 360
agcctgcagc tgcagttcga gagcagcgag gaggccgaca agggcaacag ccacagcaag 420
aagatgctga aggccctgct gtccgagggc gagagcatct gggagatcac cgagaagatc 480
ctgaacagct tcgagtacac cagcaggttc accaagacca agaccctgta ccagttcctg 540
ttcctggcca cattcatcaa ctgcggcagg ttcagcgaca tcaagaacgt ggaccccaag 600
agcttcaagc tggtgcagaa caagtacctg ggcgtgatca ttcagtgcct ggtgaccgag 660
accaagacaa gcgtgtccag gcacatctac tttttcagcg ccagaggcag gatcgacccc 720
ctggtgtacc tggacgagtt cctgaggaac agcgagcccg tgctgaagag agtgaacagg 780
accggcaaca gcagcagcaa caagcaggag taccagctgc tgaaggacaa cctggtgcgc 840
agctacaaca aggccctgaa gaagaacgcc ccctacccca tcttcgctat caagaacggc 900
cctaagagcc acatcggcag gcacctgatg accagctttc tgagcatgaa gggcctgacc 960
gagctgacaa acgtggtggg caactggagc gacaagaggg cctccgccgt ggccaggacc 1020
acctacaccc accagatcac cgccatcccc gaccactact tcgccctggt gtccaggtac 1080
tacgcctacg accccatcag caaggagatg atcgccctga aggacgagac caaccccatc 1140
gaggagtggc agcacatcga gcagctgaag ggcagcgccg agggcagcat cagatacccc 1200
gcctggaacg gcatcatcag ccaggaggtg ctggactacc tgagcagcta catcaacagg 1260
cggatc 1266
<210> 32
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
atgcgcatcc tccggatcta cctcgacggc gcctacggca ccggcaagag caccacggcc 60
cgggtgatgg cgctcggcgg ggcgctgtac gtgcccgagc cgatggcgta ctggcgcact 120
ctgttcgaca cggacacggt ggccggtatt tacgatgcgc agacccggaa gcagaacggc 180
agcctgagcg aggaggacgc ggccctcgtc acggcgcagc accaggccgc cttcgcgacg 240
ccgtacctgc tgctgcacac gcgcctggtc ccgctcttcg ggcccgcggt cgagggcccg 300
cccgagatga cggtcgtctt tgaccgccac ccggtggccg cgacggtgtg cttcccgctg 360
gcgcgcttca tcgtcgggga catcagcgcg gcggccttcg tgggcctggc ggccacgctg 420
cccggggagc cccccggcgg caacctggtg gtggcctcgc tggacccgga cgagcacctg 480
cggcgcctgc gcgcccgcgc gcgcgccggg gagcacgtgg acgcgcgcct gctcacggcc 540
ctgcgcaacg tctacgccat gctggtcaac acgtcgcgct acctgagctc ggggcgccgc 600
tggcgcgacg actgggggcg cgcgccgcgc ttcgaccaga ccacgcgcga ctgcctcgcg 660
ctcaacgagc tctgccgccc gcgcgacgac cccgagctcc aggacaccct cttcggcgcg 720
tacaaggcgc ccgagctctg cgaccggcgc gggcgcccgc tcgaggtgca cgcgtgggcg 780
atggacgcgc tcgtggccaa gctgctgccg ctgcgcgtct ccaccgtcga cctggggccc 840
tcgccgcgcg cctgcgccgc ggccgtggcg gcgcaggcgc gcggcatgga ggtgacggag 900
tccgcgtacg gcgaccacat ccggcagtgc gtgtgcgcct tcacgtcgga gatgggggtg 960
<210> 33
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
cttttttgtt agacaggatc cggcgcgcca ccatgcccaa gaagaagagg aaggtgagcc 60
agttcgacat cctg 74
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
agcagacttc ctctgccctc gctagcgatc cgcctgttga tgtagct 47
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
gagggcagag gaagtctgct 20
<210> 36
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
gataagcttg atatcgaatt cttaggcata gtctggtaca tcatagggat acacccccat 60
ctccgacgtg aa 72

Claims (7)

1.一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：
1)Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的质粒构建：采用PCR扩增、酶切重组的方式将SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO.16所示序列顺次插入载体pAAV-nEF Con/Fon hChR2(H134R)-EYFP，获得克隆命名为pleft arm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-CMV-BFP-right arm；
2)Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组病毒的制备：将步骤1)中的克隆转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养上清，纯化，即得重组伪狂犬病毒PRV527。
2.权利要求1所述的制备方法制得的重组伪狂犬病毒。
3.权利要求2所述的重组伪狂犬病毒和辅助病毒在研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制中的应用。
4.权利要求2所述的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒疫苗的开发中的应用。
5.权利要求2所述的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。
6.权利要求2所述的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。
7.权利要求2所述的重组伪狂犬病毒在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。
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