CN109970861B - 一种靶向线粒体的nd4融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向线粒体的ND4融合蛋白，从N端至C端分别包含CAG启动子、线粒体靶向序列、ND4和UTR，其中所述线粒体靶向序列为OPA1基因的线粒体靶向序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明公开了编码所述ND4融合蛋白的核苷酸序列、包含所述核酸的表达载体、表达所述的ND4融合蛋白的细胞株、包含所述的ND4融合蛋白的制剂以及所述融合蛋白的制备方法。还公开了ND4融合蛋白和含ND4融合蛋白的制剂在治疗Leber遗传性视神经病变中的应用。OPA1线粒体靶向序列定向引导ND4蛋白进入线粒体，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

Description

一种靶向线粒体的ND4融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种靶向线粒体的ND4融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy,LHON)是一种退行性视力障碍，通常表现为中央视力的双侧丧失。平均发病年龄在20岁中期，通常在数周至数月内没有疼痛，直到双眼视力恶化到0.1以下，严重影响患者的生活质量。LHON是由于线粒体基因突变引起的，与NADH泛醌氧化还原酶、即线粒体呼吸链的复合体I亚基的三个线粒体基因之一的突变有关。研究表明，影响ND1基因的G3460A突变、影响ND6基因的T14484C突变和影响ND4基因的G11778A突变被认为是LHON的主要原因，并且每种突变都具有永久性视力丧失的显著风险。所有这些都与视网膜神经节细胞的局灶性退化有关。

两个主要的LHON突变G3460A和T14484C导致患者血小板中分离的线粒体NADH脱氢酶活性降低80％。然而，从G11778A细胞中分离出的线粒体显示复合物I和呼吸链中大多数其他成分的活性接近正常。对中国LHON患者而言，G11778A位点突变患者占90％。在11778位点的突变，使ND4蛋白的精氨酸转变成组氨酸，导致功能障碍、视神经损伤和Leber遗传性视神经病变，其发病率高、预后差。

LHON治疗的主要问题产生于将DNA输送到细胞器的障碍。现有技术CN 102634527B公开了一种重组人NADH脱氢酶亚单位4基因及其表达载体构建方法，其大小为2889bp，由COX10的编码28个氨基酸的肽链，引导ND4蛋白进入到线粒体中。CN 104450747 A公开了一种用于治疗Leber遗传性视神经病变的重组腺相关病毒-NADH脱氢酶亚单位4(ND4)基因全长以及药剂。该基因全长为3824bp，其由CAG启动子序列、带Cox10的线粒体定位序列的ND4的编码序列和长度为625bp的UTR组成。将CN 102634527 B的药剂，或CN 104450747 A的含有CAG-Cox10-ND4的药剂注入眼玻璃体腔中，用于治疗Leber遗传性视神经病变，该等药剂能够在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞，该蛋白N前端的信号肽定向引导该蛋白进入线粒体，成熟的ND4蛋白发挥作用。但是，该技术还存在靶向性不高，治疗效果不佳的缺点，还有待改进。目前还没有利用OPA1携带融合蛋白来定位线粒体治疗疾病的报道，而且OPA1比CoX10序列更长靶向性效果更好，OPA1参与细胞内膜的融合，可以准确的将ND4蛋白定位到线粒体内膜上，本研究是首创的采用OPA1-ND4融合蛋白治疗Leber遗传性视神经病变。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中ND4融合蛋白靶向性不高、治疗效果不佳的技术问题，提供一种靶向性ND4蛋白及其制备方法和应用。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种靶向线粒体的ND4融合蛋白，从N端至C端分别包含CAG启动子、线粒体靶向序列、ND4和UTR，其特征在于，所述线粒体靶向序列为OPA1基因的线粒体靶向序列，所述OPA1基因的线粒体靶向序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述OPA1基因的线粒体靶向序列由序列如SEQ ID No:2所示的核苷酸编码。

更优选地，所述ND4融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

OPA1(Optic Atrophy 1)基因属于核基因，编码的蛋白是线粒体内源发动蛋白，是线粒体塑形蛋白家族的成员。OPA1蛋白通过不同位点的剪接，形成多种亚型，参与线粒体内膜融合，可以作为线粒体定位信号、ND4蛋白位于线粒体内膜上，可以通过OPA1基因的线粒体靶向序列引导ND4进入线粒体，使成熟的ND4蛋白发挥作用。目前还没有利用OPA1基因的线粒体靶向序列携带融合蛋白来定位线粒体治疗疾病的报道，本发明首创采用了OPA1-ND4(为简略起见，OPA1基因的线粒体靶向序列在融合蛋白中仍简称为OPA1)融合蛋白来治疗Leber遗传性视神经病变。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种编码所述的ND4融合蛋白的核酸。

优选地，编码所述的ND4融合蛋白的核酸其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其全长为4006bp，自1bp至1735bp为CAG启动子(共1735bp)；1736bp至2001bp为OPA1基因的线粒体靶向序列(共266bp)；2002bp至3381bp为ND4基因(共1380bp)；3382bp至4006bp为UTR(共625bp)。OPA1基因的线粒体靶向序列和625bp的UTR非编码区的功能是引导ND4蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能。其中OPA1基因的线粒体靶向序列设计在ND4序列的前面，其作用是使翻译的ND4蛋白进入线粒体；UTR是非编码序列，设计在ND4蛋白的后面，其作用是稳定线粒体靶向序列和ND4的表达。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种用于表达所述的核酸的表达载体。优选地，所述载体为pAAV2。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种表达ND4融合蛋白、或含所述表达载体的细胞株。所述细胞株优选哺乳动物细胞，更优选293T细胞。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种含ND4融合蛋白的制剂。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种所述ND4融合蛋白的制备方法，其包含以下步骤：

(1)制备本发明上述表达ND4融合蛋白、或含所述表达载体的细胞株；

(2)筛选重组子，获得阳性克隆，表达并纯化ND4融合蛋白。

优选地，步骤(1)还包括将本发明所述表达载体转染细胞株；所述细胞株优选哺乳动物细胞，更优选293T细胞。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种所述的ND4融合蛋白、或者所述的制剂在制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：OPA1基因的线粒体靶向序列和ND4融合后，OPA1基因的线粒体靶向序列参与细胞内膜的融合，可以准确地将ND4蛋白定位到线粒体内膜上，从而很好地将ND4带入到线粒体中。将含有OPA1-ND4融合蛋白的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞。该蛋白N前端的信号肽定向引导该蛋白进入线粒体效果好，成熟的ND4蛋白发挥作用，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

附图说明

图1为ND4融合蛋白的序列构成及融合蛋白进入到线粒体里发挥作用的示意图；

图2为PCR检测ND4基因；

图3为细胞质总ND4蛋白表达量分析，其中A图为western blot免疫印迹，B图为半定量分析印迹中总ND4蛋白的表达水平；

图4为线粒体ND4蛋白表达量分析，其中A图为western blot免疫印迹，B图为半定量分析印迹中线粒体ND4蛋白的表达水平；

图5为免疫荧光图谱；

图6为兔眼玻璃体腔注射实验，其中左侧为注射PBS，右侧为注射pAAV2-OPA1-ND4病毒。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。以下是主要试剂和设备的信息：

PCR反应扩增仪：加拿大BBI公司

移液器：加拿大BBI公司

SW-CJ-1D洁净工作台：江苏苏洁净化设备厂

DK-8D型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司

YXJ-2离心机：湘仪离心机仪器有限公司

凝胶成像系统：Gene Genius公司

TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)有限公司

Marker：生工生物工程(上海)有限公司

6×DNALoading Dye：生工生物工程(上海)有限公司

PCR产物纯化回收试剂盒：生工生物工程(上海)有限公司

KpnI/SalI酶：生工生物工程(上海)有限公司

Lipofectamine 2000试剂盒：美国Invitrogen公司

实施例1 pAAV2-ND4的构建

获取人的ND4核苷酸序列后(美国国家生物技术信息中心参考序列：yp_003024035.1)，本发明改变了线粒体编码序列为核编码序列，由北京奥科生物技术进行序列的合成，获得pGEM-T-ND4。通过经KpnI/SalI酶切pGEM-T-ND4，并将克隆亚基嵌入有KpnI/SalI酶切位点的基因治疗载体pSNAV-2(生工生物工程(上海)有限公司)中，命名为pAAV2-ND4。AAV2-ND4中ND4含1380个核苷酸。在6孔板上，使用Lipofectamine 2000试剂盒将pAAV2-ND4载体转染到293T细胞中。然后这些细胞被转移到一个110×480mm²瓶中培养，而且，细胞数达到8×10⁸时，用HSV1-rc/DUL2感染，然后将细胞分装到250mL费恩巴赫培养瓶中，培养48h后用于进一步纯化。

重组子的筛选和鉴定步骤同CN104450747A，简单描述如下。取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用KpnI/SalI酶切鉴定。

实施例2 pAAV2-OPA1-ND4的构建

整个ND4融合蛋白CAG-OPA1-ND4-UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示(为简略起见，OPA1基因的线粒体靶向序列在融合蛋白中仍简称为OPA1)，将序列合成后，将融合蛋白的DNA序列的5’端引入质粒载体pAAV2的KpnI酶切位点，3’端为SalI酶切位点。其中OPA1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或由序列如SEQ ID No:2所示的核苷酸编码。重组质粒经限制性内切酶酶切验证，且命名为pAAV2-OPA1-ND4。CAG-OPA1-ND4-UTR的结构及其在线粒体发挥作用的图示如图1。

实施例3 细胞培养与病毒转染

人胚肾细胞(293T)，生长在单层培养的高糖Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)中，培养在二氧化碳培养箱中，在37的温度下5％的二氧化碳平衡空气孵育。把293T细胞分成4组培养，在1组细胞中加入PBS，2组细胞转染pAAV2-ND4(1×10⁹μg)，在3组细胞转染pAAV2-OPA1-ND4(1×10⁹μg，转染方法同CN104450747A)。转染48小时后，各组分别进行RT-PCR检测、免疫印迹和免疫荧光。

实施例4 免疫印迹

293T细胞用PBS洗涤三次，并分离全细胞蛋白。超声细胞匀浆，分别在添加PMSF的冰冷的RIPA缓冲液中，然后(4℃,10,000×g,5min)离心至澄清。从分别感染PBS缓冲液(空白对照)、pAAV2-ND4和pAAV2-OPA1-ND4的细胞中分离出全细胞蛋白和线粒体蛋白质。分离线粒体：细胞用预冷PBS清洗两次并且用600μl预冷线粒体提取缓冲液[0.25mM Sucrose，20mM Hepes，10mM KCl，1.5mM MgCl₂，1mM EDTA(pH 7.4)]悬浮起来。裂解细胞搅匀后离心4℃，750×g，3min，其次是3500×g，3min和5000×g，3min。收集上清液，离心4℃，20,000×g，30min，收集线粒体。分别破碎细胞和线粒体提取细胞质总ND4蛋白和线粒体ND4蛋白。

然后进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，点转移到聚偏氟膜上(Bio-Rad,Her-cules,CA,USA)，用于免疫检测，用兔anti-ND4抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.Texas,USA)染色，然后用山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶结合二级抗体。一些聚偏氟乙烯膜通过鼠抗人GAPDH和VDAC1抗体(Gene,Hong Kong,China)孵育重复检测GAPDH和VDAC1。用自动图像分析仪器(Li-Cor；Lincoln,NE,USA)对薄膜上条带进行观察分析，各蛋白带的积分光密度用归一化法积分，得到相同的样本对应的GAPDH和VDAC1条带的光学密度值。统计分析采用SPSS19.0统计软件。所有值均以平均±标准差(SD)表示，至少三次重复试验。进行统计分析，单、双尾配对t检验。P值小于0.05表示差异显著。

细胞质总ND4蛋白的表达水平：细胞质总的ND4蛋白，第1组(PBS)ND4平均表达值是0.85±0.04，第2组(AAV2-OPA1-ND4)的平均表达值是1.16±0.05，第3组(AAV2-ND4)的平均表达值是1.10±0.084。第1组与第2组、第3组比较有显著性差异，p值分别为0.0002和0.0013。相比之下，第2组和第3组之间无显著性差异，p值为0.2771(图3)。这表明293T细胞被AAV2-OPA1-ND4和AAV2-ND4转染，ND4蛋白成功表达。

线粒体ND4蛋白：组1(PBS)的平均表达水平是0.87±0.05，组2(AAV2-OPA1-ND4)的平均表达值1.07±0.06，而组3(AAV2-ND4)的平均表达值是0.86±0.06。组1与组2比较有显著性差异，p值为0.0001；组1与组3比较无显著性差异，p值为0.9020；组2和组3之间有显著性差异，P值为0.0052(图4)。这表明，在转染AAV2-OPA1-ND4后表达的ND4蛋白可以进入线粒体，在转染AAV2-ND4后表达的ND4蛋白不能进入线粒体。

实施例5 免疫荧光

细胞与兔anti-ND4(Santa Cruz Biotechnology,Inc.Texas,USA)和羊抗HSP(Santa Cruz Biotechnology,Inc.Texas,USA)混合物孵育，在湿盒4℃过夜。玻片用PBS洗涤三次，在室温下，起点用DAPI染色10min，在PBS洗涤三次后，然后用20％甘油固定，用激光扫描共聚焦显微镜(Nikon Eclipse Ti-SR,Japan)检测荧光。

线粒体蛋白，热休克蛋白60(HSP60)，位于细胞线粒体，显示红色荧光，ND4显示绿色荧光，DAPI染色细胞核显示蓝色荧光。组1细胞的ND4显示线粒体荧光；组2(pAAV2-ND4)细胞的ND4显示强荧光在细胞核；组3(pAAV2-OPA1-ND4)细胞的ND4显示强荧光在线粒体(图5)。结果表明，受到pAAV2-OPA1-ND4转染细胞的外源ND4可以进入细胞线粒体，而受到pAAV2-ND4转染细胞的外源ND4只能进入细胞核但不能进入线粒体。

实施例6 PCR检测ND4的表达

提取转染pAAV2-OPA1-ND4的293T细胞的RNA、反转录利用TRIZOL试剂盒提取兔子的总RNA并反转录合成cDNA模板。设计引物：PCR引物F：5’-ATCTCCGCACACTCTCTCCTCA-3’(序列如SEQ ID NO:4所示)；PCR引物R：5’-GAGGAAAACCCGGTAATGATGTC-3’(序列如SEQ ID NO:5所示)，PCR反应条件为：

PCR反应条件

对PCR产物电泳检测，得到一个大小约2800bp左右的目的条带，如图2所示，说明ND4成功地在兔子中表达了。

实施例7 RT-PCR检测ND4的表达

分别提取转染pAAV2-ND4(对照组)和pAAV2-OPA1-ND4的293T细胞的RNA(实验组)、反转录，利用TRIZOL试剂盒提取总RNA并反转录合成cDNA模板。用NCBI的保守结构域分析软件分析ND4的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物：

兔-actin-S：CGAGATCGTGCGGGACAT(序列如SEQ ID NO:6所示)；

兔-actin-A：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(序列如SEQ ID NO:7所示)；

H-ND4-S：CTGCCTACGACAAACAGAC(序列如SEQ ID NO:8所示)；

H-ND4-A：AGTGCGTTCGTAGTTTGAG(序列如SEQ ID NO:9所示)；

荧光定量PCR的反应体系和反应程序：

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH₂O 8μL、引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。

按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。

采用相对定量方法研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，实验组和对照组分别为0.76±0.15和0.35±0.05，表明实验组视网膜上ND4的表达明显比对照组提高(P＜0.05)。

实施例8 兔眼玻璃体腔注射实验

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化pAAV2-OPA1-ND4病毒。

取12只兔子平分为二组，分别用0.1％的病毒(实验组)和PBS(对照组)在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。

裂隙灯、眼压、眼底照相检查：

二组兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示(图6)，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症，是安全的。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 一种靶向线粒体的ND4融合蛋白及其制备方法和应用

<130> P1711583C

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 86

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OPA1

<400> 1

Met Trp Arg Leu Arg Arg Ala Ala Val Ala Cys Glu Val Cys Gln Ser

1 5 10 15

Leu Val Lys His Ser Ser Gly Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Gln Lys

20 25 30

Leu His Leu Val Ser Arg Ser Ile Tyr His Ser His His Pro Thr Leu

35 40 45

Lys Leu Gln Arg Pro Gln Leu Arg Thr Ser Phe Gln Gln Phe Ser Ser

50 55 60

Leu Thr Asn Leu Pro Leu Arg Lys Leu Lys Phe Ser Pro Ile Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Gln Pro Arg Arg

85

<210> 2

<211> 266

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OPA1

<400> 2

gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60

tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120

cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180

acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240

cgactacgtc gggccgctgt ggcctg 266

<210> 3

<211> 4006

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND4融合蛋白

<400> 3

gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420

tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480

cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540

ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600

ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660

cggggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg 720

cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc 780

tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg 840

tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc 900

gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga 960

gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc 1020

cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 1080

tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct 1140

gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg 1200

gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg 1260

ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc 1320

cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 1380

ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg 1440

caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg 1500

ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg 1560

tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg 1620

tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca 1680

gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattcgtgct 1740

gcccgcctag aaagggtgaa gtggttgttt ccgtgacgga ctgagtacgg gtgcctgtca 1800

ggctcttgcg gaagtccatg cgccattggg agggcctcgg ccgcggctct gtgcccttgc 1860

tgctgagggc cacttcctgg gtcattcctg gaccgggagc cgggctgggg ctcacacggg 1920

ggctcccgcg tggccgtctc ggcgcctgcg tgacctcccc gccggcggga tgtggcgact 1980

acgtcgggcc gctgtggcct gatgctaaaa ctaatcgtcc caacaattat gttactacca 2040

ctgacatggc tttccaaaaa acacatgatt tggatcaaca caaccaccca cagcctaatt 2100

attagcatca tccctctact attttttaac caaatcaaca acaacctatt tagctgttcc 2160

ccaacctttt cctccgaccc cctaacaacc cccctcctaa tgctaactac ctggctccta 2220

cccctcacaa tcatggcaag ccaacgccac ttatccagtg aaccactatc acgaaaaaaa 2280

ctctacctct ctatgctaat ctccctacaa atctccttaa ttatgacatt cacagccaca 2340

gaactaatca tgttttatat cttcttcgaa accacactta tccccacctt ggctatcatc 2400

acccgatggg gcaaccagcc agaacgcctg aacgcaggca catacttcct attctacacc 2460

ctagtaggct cccttcccct actcatcgca ctaatttaca ctcacaacac cctaggctca 2520

ctaaacattc tactactcac tctcactgcc caagaactat caaactcctg ggccaacaac 2580

ttaatgtggc tagcttacac aatggctttt atggtaaaga tgcctcttta cggactccac 2640

ttatggctcc ctaaagccca tgtcgaagcc cccatcgctg ggtcaatggt acttgccgca 2700

gtactcttaa aactaggcgg ctatggtatg atgcgcctca cactcattct caaccccctg 2760

acaaaacaca tggcctaccc cttccttgta ctatccctat ggggcatgat tatgacaagc 2820

tccatctgcc tacgacaaac agacctaaaa tcgctcattg catactcttc aatcagccac 2880

atggccctcg tagtaacagc cattctcatc caaaccccct ggagcttcac cggcgcagtc 2940

attctcatga tcgcccacgg gcttacatcc tcattactat tctgcctagc aaactcaaac 3000

tacgaacgca ctcacagtcg catcatgatc ctctctcaag gacttcaaac tctactccca 3060

ctaatggctt tttggtggct tctagcaagc ctcgctaacc tcgccttacc ccccactatt 3120

aacctactgg gagaactctc tgtgctagta accacgttct cctggtcaaa tatcactctc 3180

ctacttacag gactcaacat gctagtcaca gccctatact ccctctacat gtttaccaca 3240

acacaatggg gctcactcac ccaccacatt aacaacatga aaccctcatt cacacgagaa 3300

aacaccctca tgttcatgca cctatccccc attctcctcc tatccctcaa ccccgacatc 3360

attaccgggt tttcctctta agagcactgg gacgcccacc gcccctttcc ctccgctgcc 3420

aggcgagcat gttgtggtaa ttctggaaca caagaagaga aattgctggg tttagaacaa 3480

gattataaac gaattcggtg ctcagtgatc acttgacagt tttttttttt tttaaatatt 3540

acccaaaatg ctccccaaat aagaaatgca tcagctcagt cagtgaatac aaaaaaggaa 3600

ttatttttcc ctttgagggt cttttataca tctctcctcc aaccccaccc tctattctgt 3660

ttcttcctcc tcacatgggg gtacacatac acagcttcct cttttggttc catccttacc 3720

accacaccac acgcacactc cacatgccca gcagagtggc acttggtggc cagaaagtgt 3780

gagcctcatg atctgctgtc tgtagttctg tgagctcagg tccctcaaag gcctcggagc 3840

acccccttcc ttgtgactga gccagggcct gcatttttgg ttttccccac cccacacatt 3900

ctcaaccata gtccttctaa caataccaat agctaggacc cggctgctgt gcactgggac 3960

tggggattcc acatgtttgc cttgggagtc tcaagctgga ctgcca 4006

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR引物F

<400> 4

atctccgcac actctctcct ca 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR引物R

<400> 5

gaggaaaacc cggtaatgat gtc 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 兔-actin-S

<400> 6

cgagatcgtg cgggacat 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 兔-actin-A

<400> 7

caggaaggag ggctggaac 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H-ND4-S

<400> 8

ctgcctacga caaacagac 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> H-ND4-A

<400> 9

agtgcgttcg tagtttgag 19

Claims (8)

1.一种编码靶向线粒体的ND4融合蛋白的核酸，其特征在于，所述靶向线粒体的ND4融合蛋白从N端至C端依次包含CAG启动子、线粒体靶向序列、ND4和UTR，所述线粒体靶向序列为OPA1基因的线粒体靶向序列，所述OPA1基因的线粒体靶向序列的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述OPA1基因的线粒体靶向序列由序列如SEQ ID NO:2所示的核苷酸编码；

所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.包含如权利要求1所述的核酸的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pAAV2。

4.表达包含权利要求2或3所述的表达载体的细胞株。

5.如权利要求4所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株为哺乳动物细胞。

6.如权利要求4或5所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株为293T细胞。

7.包含如权利要求1所述的核酸、或如权利要求2或3所述的表达载体的制剂。

8.如权利要求1所述的核酸、如权利要求2或3所述的表达载体、或者如权利要求7所述的制剂在制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。

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