CN101854955A - 靶向线粒体的抗肿瘤剂 - Google Patents
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Abstract
描述了靶向线粒体的抗肿瘤剂,以及制造并使用该剂治疗与不希望的细胞增殖相关的疾病的方法。在一方面,本发明提供了具有下式的组合物及其药学上可接受的盐:A-B,其中A为分子伴侣抑制剂而B为线粒体穿透部分,且A与B相连接,任选地由连接部分相连接。
Description
优先权要求
本发明要求2007年9月10日提交的美国临时申请序列号60/993,195的权利和利益,其全部内容以引用的方式包含于本文中。
联邦资助研究或开发
本发明的完成根据国家健康研究所授权号HL54131、CA78810与CA90917受政府支持。政府对本发明拥有相应权利。
技术领域
本发明涉及将靶向线粒体的分子伴侣,例如,热激蛋白90(Hsp90)、Hsp60、热激70kDa蛋白9(HSPA9/致死蛋白(mortalin))或TNF受体相关蛋白1(TRAP-1)的抑制剂,用作抗肿瘤剂,以及生产与使用其以治疗与非期望的细胞增殖相关疾病的方法。
背景
肿瘤细胞在高度不利的环境下表现出增强的存活与增殖能力。已显示它们负调节许多阻止正常(意即非癌性)细胞在不利环境下分裂的细胞通路,且它们亦灭活了在许多正常组织中不利条件下导致细胞死亡的细胞凋亡途径。亦相信肿瘤细胞正调节需用于维持有效增殖的通路。举例而言,许多肿瘤细胞激活细胞胁迫应激通路以允许肿瘤细胞合成并维持需用于继续增殖的蛋白质合成装置。所述在肿瘤中激活的胁迫应激包括热激蛋白(Hsp),其为ATPase指导的分子伴侣。具体而言,Hsp90在许多癌组织中受正调节。Hsp90控制限制数量的目标蛋白的折叠/成熟与在蛋白酶体中被破坏之间的平衡,所述蛋白中有一些涉及信号传导与细胞增殖。
概述
本发明基于,至少部分基于下述发现,即分子伴侣Hsp90、Hsp60与TRAP-1以较之正常细胞增高的水平见于肿瘤细胞的线粒体中,且使用靶向线粒体的分子伴侣抑制剂在肿瘤细胞中抑制分子伴侣导致肿瘤细胞死亡。
在一方面,本方面提供了具有下式的组合物:
A-B,
其中A为分子伴侣抑制剂而B为线粒体穿透部分,且A与B连接,可选地通过连接部分相连;或其药学上可接受的盐。然而,若A为牧羊犬蛋白(Shepherdin)或其片段,则B不能为触角螺旋(触角helix)III同源结构域细胞穿透肽(ANT)(Antennapedia helix III homeodomain cell-penetrating peptide)或其片段。
在一些实施方案中,A为,或包括小分子,例如,安莎霉素类Hsp90抑制剂;格尔德霉素类似物;嘌呤支架类Hsp90抑制剂;间苯二酚(resorcinol);大环内酯(macrolactone)-Hsp90抑制剂;Hsp90的肽抑制剂,例如,包含SEQ ID NO:2(His-Ser-Ser-Gly-Cys)的牧羊犬蛋白肽;或包含与SEQID NO:1具有至少95%同一性序列的肽,其结合于并抑制Hsp90。在有些优选实施方案中,A是或包括根赤壳菌素(radicicol)或其类似物;Hsp90的嘌呤抑制剂;17-烯丙基氨基-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG);17-二甲基氨基格尔德霉素;17-GMB-APA-GA(一种格尔德霉素的马来酰亚胺衍生物,其能使GA与多肽结合);17-(二甲基氨基乙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG);17-[2-(吡咯烷-1-基)乙基]氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AEP-GA);或17-(二甲基氨基丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAP-GA)。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分,B,包括:
其中R1为H、烷基、烯基(alkenyl)、炔基、卤代烃基、芳基、芳香烷基、或RaRbRcSi;Ra、Rb与Rc各自独立选自烷基或芳基;且n可为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分,B,包括:
其中Ra、Rb与Rc各自独立选自烷基或芳基;且n可为1、2或3。
在一些实施方案中,B为线粒体穿透肽,例如,线粒体融合蛋白肽(amitofusin peptide)、靶向线粒体的信号肽、触角螺旋III同源结构域细胞穿透肽(ANT)(例如,包含SEQ ID NO:18)、HIV-1Tat碱性域(例如,包含SEQ IDNO:19或20);VP22肽,或Pep-1肽;RNA线粒体穿透肽(例如,包含SEQID NO:21,22,23或24);或选自下组:富胍(guanidine)类肽、富胍聚氨基甲酸酯(polycarbamate)、寡精氨酸以及富脯氨酸树状聚体(dendrimer)。在一些实施方案中,B为四胍盐、三胍盐、二胍盐或一胍盐化合物或三苯基膦化合物(tetraguanidinium,triiguanidinium,diguanidinium,or monoguanidiniumcompound,or a triphenylphosphonium compound)。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分(moiety),B,包括(芳基)3P-。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分,B,包括罗丹明(Rhodamine)123:
在所述组合物的一些实施方案中,所述分子伴侣抑制剂A,包括格尔德霉素类似物:
其中R2为H、烷基、芳基或芳基烷基;R3为H、烷基;且R4为H、烷基、烯基、芳基、芳基烷基、ORd,其中Rd为H、烷基或芳基烷基。
在一些组合物的实施方案中,R2为H或烷基;R3为H、烷基;且R4为H或ORd,其中Rd为H、烷基。
在一些组合物的实施方案中,R2为H;R3为甲基;且R4为H。
在一些组合物的实施方案中,B为线粒体穿透肽,例如,线粒体融合蛋白肽、靶向线粒体的信号肽,触角螺旋III同源结构域细胞穿透肽(ANT)(例如,包括SEQ ID NO:18)、HIV-1Tat碱性(basic)域(例如,包括SEQID NO:19或20);VP22肽,或Pep-1肽;RNA线粒体穿透肽(例如,包括SEQ ID NO:21、22、23或24);或选自下组:富胍类肽、富胍聚氨基甲酸酯、β寡精氨酸以及富脯氨酸树状聚体。在一些实施方案中,B为四胍盐、三胍盐、二胍盐或一胍盐化合物或三苯基膦化合物。
在一些实施方案中,所述组合物包含A与B之间的连接部分,例如,肽接头或化学接头。
在一些实施方案中,所述连接部分为二价且可选自下组:亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚芳基、亚杂芳基(alkylene,alkenylene,alkynylene,cycloalkylene,arylene,heteroarylene)与肽接头,其中所述亚烷基、亚烯基或亚炔基的任意两个邻近碳-碳键,可以可选地由O、NH、S、PRe、C(O)NRf、亚芳基、亚杂环烷基或亚杂芳基中一个或多个替换;其中Re与Rf独立的选自烷基或芳基。
在一些实施方案中,所述连接部分为:
在一些实施方案中,所述连接部分为亚烷基。
在一些实施方案中,所述连接部分为具有六个碳原子的亚烷基。
在一些实施方案中,所述组合物包括下式的化合物:
其中,R1为H、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基或RaRbRcSi;R2为H、烷基、芳基或芳基烷基;R3为H、烷基;R4为H、烷基、烯基、芳基、芳基烷基、ORd,其中Rd为H、烷基或芳基烷基;Ra、Rb与Rc独立选自烷基或芳基;且n为1到10之间的整数,包括1与10;或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中,所述盐为六氟磷酸盐。
在一些实施方案中,R1为RaRbRcSi,Ra、Rb与Rc独立选自烷基或芳基;R2为H;R3为H、烷基;R4为H;且n为1、2、3或4。
在一些实施方案中,所述化合物可为下式:
其中,q为1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中,q为3。
在一些实施方案中,芳基为苯基。
在一些实施方案中,芳基为苯基且q为3。
在一些实施方案中,X可为六氟磷酸。
在一些实施方案中,所述化合物可为:
在进一步方面,本发明包括诱导癌细胞死亡或肿瘤细胞死亡的方法,例如,在受试者中,例如,哺乳类,例如,人类或非人哺乳类,所述方法包括对受试者施用其量足以诱导癌细胞死亡的本文所述的靶向线粒体的伴侣抑制剂。
在另一方面,本发明提供了诱导癌细胞死亡或肿瘤细胞死亡的方法,例如,在受试者中,例如,哺乳类,例如,人类或非人哺乳类。所述方法包括鉴别罹患癌或肿瘤的受试者,例如,包括癌细胞或肿瘤细胞的癌或肿瘤;并确定所述癌或肿瘤细胞是否增加了伴侣的线粒体浓度,例如,Hsp90或Trap-1,例如,与对照相比,例如,正常的非肿瘤、非癌细胞。若在所述受试者中线粒体所述伴侣的线粒体水平增加了,则所述方法包括对哺乳类施以靶向线粒体的伴侣抑制剂,其包括下式:
A-B,
其中A为伴侣抑制剂而B为线粒体-穿透部分且A与B连接,可选地是由连接部分连接,例如,如本文所述。
在更进一步的实施方案中,本发明提供了鉴别抑制伴侣活性的候选药剂的方法。所述方法包括提供包括至少一种伴侣与亲环素D(Cyclophilin D)的试样;将试样与测试药剂接触;并检测所述伴侣与亲环素D在试样中在测试试剂存在与不存在的结合。抑制结合的测试试样为抑制伴侣活性的候选试剂。在一些实施方案中,所述伴侣为Hsp60、HspA9、Hsp90或TRAP-1。
“癌”如本文所用,指一种以细胞无控制、异常的生长为特征的疾病。“癌细胞”为以无控制的生长而异常分裂与繁殖的细胞。所述细胞可从其原生位点脱离(例如,肿瘤)并迁移到身体其它部分而形成另一个位点(例如,另一个肿瘤),该过程称为转移(metastasis)。“肿瘤”为由未控制与进行的过量细胞分裂导致的异常组织块且亦称为新生物。肿瘤可为良性(非癌性)或恶性。本文所述方法对治疗癌与肿瘤细胞为有用的,意即,恶性与良性肿瘤两者,以及无实体肿瘤的癌(例如造血组织肿瘤),只要需治疗的细胞如本文所述其伴侣位于线粒体。
分子伴侣是涉及多肽正确的胞内折叠与装配但不成为其最终结构组成部分的一组蛋白中的任意蛋白分子伴侣见于细菌、线粒体与真核生物细胞溶胶。在此,“分子伴侣”与“伴侣”可互换使用。
在此,术语“趋线粒体性”(mitochondriotropic)与“靶向线粒体”或“线粒体穿透的”(mitochondrial-penetrating)可互换使用。
在此,术语“趋线粒体试剂”指本文所述具有式A-B的组合物,其中所述试剂抑制伴侣活性并定位于线粒体。
如本文所用,“伽米替尼(Gamitrinib)”指格尔德霉素类似物,例如,17-AAG,通过氨基基团于C17位置通过接头连接于线粒体穿透部分的,举例而言,四胍(G4),三胍(G3),二胍(G2),单胍(G1),或三苯基膦(TPP)部分。贯穿本应用,有时表示为特定伽米替尼部分的线粒体穿透部分。举例而言,伽米替尼-G4指存在四胍部分的伽米替尼。举例而言,伽米替尼-TPP指存在三苯基膦部分的伽米替尼。贯穿本应用,复数形式“伽米替尼”亦表示一种或更多下述药剂:伽米替尼-G4、伽米替尼-G3、伽米替尼-G2、伽米替尼-G1与伽米替尼-TPP。
尽管下列描述有时针对分子伴侣Hsp90,需理解此描述可通用于在癌细胞线粒体中过表达的结构上相关的分子伴侣,例如,TRAP-1(Song et al.,J.Biol.Chem.,270:3574-3581(1995);Cechetto and Gupta,Experimental cellResearch,260:30-39(2000));Heat Shock 60kDa protein 1(Hsp60/HspD1)(Singh et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.169(2),391-396(1990));Brosset al.,J.Hum.Genet.52(1),56-65(2007));and Heat shock 70kDa protein 9(HSPA9/mortalin)(Domanico et al.,Mol.cell.Biol.13(6),3598-3610(1993);Bhattacharyya et al.,J.Biol.Chem.270(4),1705-1710(1995);Kaul et al.,FEBS Lett.361(2-3),269-272(1995))。
一方面,现行发明提供了靶向线粒体的分子伴侣抑制剂,意即,其穿透线粒体膜并积聚于其中。伴侣抑制剂可通过与线粒体穿透部分相联系靶向线粒体。分子伴侣抑制剂可为,举例而言,蛋白,或其伴侣结合片段,其与伴侣蛋白结合。举例而言,可使用某些细胞凋亡抑制剂蛋白(IAPs)。IAPs为抗细胞凋亡蛋白家族(Schimmer,Can.Res.64:7183-7190(2004));有用的IAPs包括那些与分子伴侣Hsp90结合的。与分子伴侣天然结合的这些与其它蛋白的片段为本发明的一部分。亦可使用与分子伴侣天然结合并抑制其的这些与其它肽或蛋白的拟肽。
所述伴侣抑制剂亦可为小分子,本文所述的靶向线粒体的伴侣抑制剂,例如,通过本文所述筛选方法鉴别的小分子。
所述分子伴侣抑制剂连接于线粒体穿透部分。所述线粒体穿透部分可为,举例而言,碱性或带正电荷的肽序列,例如,来自触角同源结构域(ANT)的第三螺旋。在一些实施方案中,所述线粒体穿透部分可为如在Fernandez-Carneado et al.(J.Am.Chem.Soc.,127:869-874(2005))中描述的四胍化合物。
所述分子伴侣抑制剂与所述线粒体穿透部分间的连接可为共价键,例如,肽键或硫醚键。在一些实施方案中,例如,所述伴侣抑制剂或所述线粒体穿透部分中的一个或两者为非肽的,例如,小分子,所述分子伴侣抑制剂与线粒体穿透部分通过化学接头相连。在一些实施方案中,所述分子伴侣抑制剂与所述线粒体穿透部分间的连接可为非共价相互作用,例如,离子相互作用。在另一方面,现行发明亦以鉴别伴侣抑制剂的方法为特征。具体而言,本发明以鉴别破坏Hsp90与亲环素D(CypD)间、Hsp60与CypD或TRAP-1与CypD间相互作用的候选化合物的方法为特征。
本发明提供了数种优点。举例而言,较之如本文所述的正常细胞,在线粒体伴侣的增加表达,提供了可用于灭杀肿瘤细胞而不伤害正常细胞的定位方法,因而使副作用成为最小并增加效率。此外,许多肿瘤与癌细胞类型显示伴侣在线粒体中积聚,因此,多种类型的肿瘤与癌可为本文所述方法所治疗。
本发明提供了在本领域内具有优点的趋线粒体性试剂(例如,靶向线粒体的伴侣抑制剂)。这些试剂有较高效率位于线粒体且在伴侣的线粒体积聚的细胞中(例如,癌细胞)选择性的诱导线粒体崩溃以及细胞死亡。这些试剂对于存在于转化细胞(例如,癌细胞)中的位于线粒体的伴侣具有最大作用而对正常伴侣功能(例如,正常或非转化细胞中Hsp90的功能)具有最小作用。因此,这些试剂对于癌治疗是理想的候选,这是因为期待它们较之现行已知伴侣抑制剂,其并不特异性的抑制位于线粒体的伴侣,具有更低的毒性。
举例而言,如本文所述的伽米替尼为新型、小分子抗癌剂适于人类测试。尽管申请人不愿拘于理论,伽米替尼的组合设计有效的将其定位于线粒体,从而使其对肿瘤细胞的细胞毒作用最大化,同时使其对非肿瘤或正常细胞的作用最小化。这是因为肿瘤细胞中线粒体伴侣池(例如,Hsp90andTRAP1)的存在,其对于肿瘤细胞存活为至关重要的,但确并不存在于正常细胞中或对正常细胞存活具有可忽略的作用。此外,伽米替尼的组合设计使其对主要在细胞溶胶中表达伴侣的非肿瘤或正常细胞的作用最小化。较之现行的Hsp90抑制剂(参见,例如,Drysdale et al.,“Targeting Hsp90for thetreatment of cancer,”Curr Opin Drug Discov Devel,9:483-495(2006)),伽米替尼具有对肿瘤细胞改善了的细胞毒活性,这受体内与体外结果所支持。另一个重要的优点为,这些试剂不影响Hsp90在细胞溶胶中通常的自身稳定功能,并因此并不引发使用通常Hsp90拮抗剂所见的潜在补偿生存信号,例如Hsp70诱导((残基,例如,Drysdale et al.,(2006),见上)。引物线粒体Hsp90伴侣不见于多数正常组织(如本文所示),伽米替尼对肿瘤具有选择性且对正常细胞具有较低毒性,使伽米替尼称为抗癌疗法的有利候选。此外,肿瘤-相关Hsp90与ATPase口袋拮抗剂以较之正常细胞为高的亲和度结合(参见,例如,Kamal et al.,Nature,425:407-410(2003)),且这可进一步从基于伽米替尼疗法保护具有低水平线粒体Hsp90的正常器官,意即,脑。遵循伽米替尼的范例,其它伴侣抑制剂,例如,嘌呤抑制剂或间苯二酚抑制剂(例如,基于吡唑的间苯二酚Hsp90抑制剂CCT018159的哌嗪、吗啉代与哌啶衍生物),可用于以癌细胞为靶(see,例如,Sharp et al.,Cancer Res.67(5):2206-16(2007);Sharp et al.,Mol Cancer Ther.6(4):1198-1211(2007);Eccles et al.,Cancer Res.68(8):2850-60(2008);Strausberg et al.,Nature,429:469-474(2004);Butcher,Nat Rev Drug Discov 4,461-467(2005);Philips,Biochem Soc Trans,33:657-661(2005)).
除非另行定义,所有本文所用的技术与科学术语具有本发明所属领域一般技术人员通常理解的相同含义。本文所描述的方法与材料用于本方面;亦可使用其它合适的本领域已知的方法与材料。所述材料、方法与实施方案仅为说明所用但并非意为限定的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库登录以及其它参考文献以全文引用的方式包含于本文之中。若出现冲突,应以本说明书,包括其定义为准。
下述详细描述与附图,以及权利要求将清楚表明本发明的其它特性与优点。
附图说明
图1A为一对免疫印迹显示类Hsp90伴侣TRAP-1相对正常细胞以增高水平位于肿瘤细胞的线粒体中。显示了TRAP-1与在提纯自所指定肿瘤细胞类型的细胞溶胶或线粒体提取物中线粒体标记Cox-IV(顶部小图),或来自正常小鼠器官线粒体的免疫印迹(底部小图)。β-肌动蛋白表达作为对照在小图中显示。
图1B-I为免疫组织化学染色原生组织试样,显示正常胰脏(B)、乳房(D)\结肠(F)或肺脏(H)样本中TRAP-1的体内表达,或胰脏(C)、乳房(E)、结肠(G)或肺脏(I)腺癌的对应情况。
图1J为一系列三个相关的线粒体或细胞溶胶提取物的免疫印迹,显示Hsp90在肿瘤细胞中定位于线粒体。显示Cox-IV表达水平与β-肌动蛋白β表达水平作为对照。
图1K-L为电子显微镜照片,显示针对Hsp90的抗体定位于分离的HeLa细胞线粒体中(图1K),但非特异性抗体并不定位于分离的HeLa细胞线粒体中(图1L)。
图1M为一系列六个相关来自HeLa细胞的总细胞溶胶提取物(TCE)或分离的线粒体(PK-treated)或细胞溶胶提取物的免疫印迹,显示钙联接蛋白(Calnexin)、Lamp-1、GAPDH、Cox-IV、TRAP-1与Hsp90的表达水平。
图2A为一组来自经35S标记温育的纯化小鼠脑线粒体提取物的两张放射自显影照片,在缬氨霉素存在或不存在情况下体外转录与翻译的Hsp90或对照PiC并用蛋白酶K(PK)处理,显示在处理后放射性标记的Hsp90或对照PiC的水平。
图2B为一对来自PK处理的经与不同浓度的毛地黄皂苷温育的HeLa细胞线粒体沉淀(P)或上清(S)免疫印迹,显示作为对照的Hsp90与mt-Hsp70蛋白水平。
图2C为一组四个在存在或不存在PK条件下悬浮于存在(SHE)或不存在(HE)蔗糖的缓冲液中且其线粒体外膜通过反复移液遭机械破坏的HeLa细胞线粒体蛋白内含物的免疫印迹,显示Hsp90、Smac与CypD的蛋白水平。
图2D为一组五个来自HeLa细胞总线粒体提取物(MTE)、进一步经分级分离的外膜提取物(OM)、内膜框架提取物(IMS)、内膜提取物(IM)与线粒体基质提取物(Matrix)的免疫印迹,显示Hsp90、VDAC、Cyt c、Cox-IV与CypD的蛋白水平。
图2E为一组七个经分级分离为线粒体(left)或细胞溶胶(right)的小鼠器官的免疫印迹,显示Hsp90、Cox-IV与Cyt c的蛋白水平。β-肌动蛋白为细胞溶胶对照。
图2F为一对来自肿瘤(HeLa,MCF-7,Raji)或正常(HFF,HGF,WS-1)细胞总细胞提取物的免疫印迹,显示Hsp90与TRAP-1的水平。β-肌动蛋白为对照。
图2G为一组七个所指正常细胞类型或对照HeLa细胞经分级分离的为线粒体(左边三个印迹)或细胞溶胶提取物(右边四个印迹)的免疫印迹,显示Hsp90、TRAP-1与Cox-IV水平。β-肌动蛋白为对照。
图3A-D是在Hela细胞线粒体存在(A,B,D)或不存在(C)情况下温育的具有(A,C)或不具有(B)触角细胞-穿透序列(ANT)的FITC-结合牧羊犬蛋白或乱序的ANT拟肽(D)的线粒体积聚的荧光显微镜图像,显示具有ANT(Sheph-ANT)的牧羊犬蛋白与细胞穿透性乱序(scrambled)拟肽两者皆积聚于线粒体。
图3E为于分离线粒体组分中在用FITC-结合Sheph-ANT或FITC-结合Scram-ANT处理细胞后量化的荧光强度的条形图,显示Sheph-ANT与Scram-ANT在线粒体中积聚到相似水平。
图3F为在分离自用FITC-结合牧羊犬蛋白(Sheph)或具有ANT的FITC-结合牧羊犬蛋白(Sheph-ANT)温育的Hela细胞线粒体的线粒体与线粒体组分提取物中量化的荧光强度的条形图,显示Sheph-ANT在线粒体、外膜/内膜空间(OM+IMS)以及内膜/基质(IM+Matrix)中积聚,未处理试样(None)为对照。
图3G为来自Raji线粒体提取物(MTE)在牧羊犬蛋白-琼脂糖上分级分离的(顶部)的洗脱组分,或乱序拟肽-琼脂糖(底部)珠的一对免疫印迹,显示Hsp90与TRAP-1受牧羊犬蛋白-琼脂糖而非乱序的拟肽(peptidomimetic)-琼脂糖结合。
图3H为给予增加浓度的提纯自与Sheph-ANT温育的Hela细胞的TMRM-装载线粒体并分析其荧光发射变化的线粒体膜电势经时线型图,显示Sheph-ANT诱导线粒体膜电势变化且所述作用随线粒体浓度增加而减少。乱序拟肽(Scram-ANT)用60μg TMRM装载线粒体温育作为对照。
图3I为一对来自提纯的用Sheph-ANT或Scram-ANT处理的Raji细胞线粒体提取物的免疫印迹,显示Sheph-ANT处理以剂量依赖性形式减少线粒体Cyt c。
图3J为一组三个来自原发人类肉瘤试样通过用Sheph-ANT或Scram-ANT处理试样并将线粒体(Mito)从上清(Sup)分级分离获取的提取物的免疫印迹,显示Sheph-ANT处理以剂量依赖性形式增加释放到上清中的Cyt c。
图3K为Hela用DMSO或17-AAG温育的细胞线粒体的免疫印迹,显示线粒体内膜蛋白Smac与Cyt c的蛋白水平。
图3L为来自17-AAG处理Hela细胞线粒体上清的免疫印迹,显示上清中Smac与Cyt c的水平。线粒体提取物(MTE)用作对照。
图4A为两个显示在原生WS-1成纤维细胞(左边)或Raji类淋巴母细胞(右边)中添加Sheph-ANT或Scram-ANT后线粒体膜电势的经时线型图。
图4B显示了在存在(+)或不存在(-)葡萄糖的情况下温育正常WS-1成纤维细胞后获取的总细胞提取物(TCE,左边两个印迹)或来自分离线粒体(中间组的三个印迹)以及细胞溶胶(右边组四个印迹)组分的提取物的三组免疫印迹,显示hsp90、TRAP-1或Grp94的蛋白质水平。CoxIV与β-肌动蛋白为对照。
图4C为在添加Sheph-ANT或Scram-ANT于分离自葡萄糖饥饿的WS-1成纤维细胞的TMRM装载线粒体后线粒体膜电势的经时图。
图4D为来自用Sheph-ANT或Scram-ANT温育的正常小鼠肝脏的分离线粒体提取物的一堆免疫印迹。
图4E为在添加Sheph-ANT或Scram-ANT于分离自正常小鼠肝脏(左边)或正常小鼠脑(右边)的TMRM装载线粒体后线粒体膜电势的两个经时线型图。
图4F为一组四个来自野生型NIH3T3(正常)或Ras转化NIH3T3成纤维细胞的线粒体(MTE)或细胞溶胶抽提物的免疫印迹,显示Hsp90、TRAP-1的蛋白水平。CoxIV与β-肌动蛋白为对照。
图4G包括在添加Sheph-ANT或Scram-ANT于分离自NIH3T3(左边)或Ras转化NIH3T3(右边)成纤维细胞的TMRM装载线粒体后线粒体膜电势的两个经时线型图,显示Sheph在转化细胞中诱导线粒体膜电势丧失。
图5A与5B为经线粒体染色(MitoTracker)与FITC结合Sheph-ANT(图5A)或FITC结合Scram-ANT(图5B)双重标记并通过图像合并分析的HeLa细胞共聚焦显微镜图像。
图5C为在经FITC-结合Sheph-ANT或FITC结合Scram-ANT处理的HeLa细胞总细胞提取物(TCE)、细胞溶胶提取物或线粒体提取物中显示荧光强度的条形图。
图5D为显示在添加Sheph-ANT(实线)、17-AAG(点线)或Scram-ANT(虚线)于装载JC-1的Raji细胞后的线粒体膜电势的经时线型图。
图5E小图为用不同浓度17-AAG温育的HeLa细胞细胞溶胶提取物的免疫印迹,显示细胞色素c与β-肌动蛋白为对照。
图5F小图为经Sheph-ANT或Scram-ANT处理的HeLa细胞经时间推移摄像显微镜拍摄的静止照片,显示细胞凋亡的细胞形态学(右上小图)或线粒体融合/分裂(右下小图)。
图5G包括显示用增加浓度的Sheph-ANT(实线)或增加浓度的Scram-ANT(虚线)温育的肿瘤细胞(左边)与正常细胞(右边)由MTT(3-4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)存活率分析确定的存活率百分比的两个线型图。
图5H包括显示用增加浓度的17-AAG温育4小时(左边)或24小时(右边)的肿瘤细胞(左边)与正常细胞(右边)由MTT确定的存活率百分比的两个线型图。
图6A为一组两个使用针对TRAP-1抗体或IgG(作为对照)自经环孢素A(CsA)或格尔德霉素(GA)处理的纯化Raji线粒体提取物免疫沉淀的线粒体TRAP-1与CypD的免疫印迹。未经任何药物处理的线粒体提取物(None)为对照。
图6B为一组两个自经有(+)或无(-)CsA处理的Raji线粒体提取物使用针对Hsp90抗体或IgG(作为对照)免疫沉淀Hsp90与CypD的免疫印迹。
图6C为一组三个免疫印迹;上边与中间小图为使用GST(作为对照)或GST-CypD自经CsA或GA或无药物(None)处理的Raji线粒体提取物捕获的Hsp90和TRAP-1的免疫印迹。下边小图为对应于上边与中间免疫印迹的经考马斯染色的凝胶。
图6D为在存在(虚线)或不存在(实线)CsA情况下添加(箭头处)Sheph-ANT或Scram-ANT于分离自HeLa细胞的TMRM装载线粒体之后线粒体膜电势的经时线型图。
图6E为显示在存在(圆形)或不存在(正方形)CsA情况下经增加浓度的Sheph-ANT(实心记号)或Scram-ANT(空心记号)处理的HeLa细胞由MTT确定的存活率百分比的线型图。
图6F为显示经对照siRNA(空心记号)或CypD-引导siRNA(实心记号)转染,经经增加浓度的Sheph-ANT(正方形)或Scram-ANT(圆形)处理的HeLa细胞由MTT确定的存活率百分比的线型图。
图6G为显示经对照siRNA或TRAP-1-引导siRNA在存在或不存在CsA情况下转染的HeLa细胞由MTT确定的存活率百分比的条形图。
图6H为一组两对经对照siRNA或CypD引导siRNA(两小图的上组)或TRAP-1引导siRNA(两小图的下组)转染的HeLa细胞提取物的免疫印迹。非转染培养细胞(None)为对照。β-肌动蛋白免疫印迹为对照。
图6I为经增加浓度的星形孢菌素处理经pcDNA3(作为对照)或TRAP-1cDNA转染的正常WS-1成纤维细胞由MTT确定的存活率百分比的条形图。
图7A为在添加(于箭头处)ANT-GA或未偶联的GA/ANT混合物于分离自HeLa细胞的不同浓度(μg)的TMRM装载线粒体后线粒体膜电势的经时线型图。与60μg分离线粒体温育的GA/ANT未偶联混合物为对照。
图7B包括显示在存在或不存在CsA的情况下添加(于箭头处)ANT-GA或未偶联的GA/ANT混合物于分离自HeLa细胞(左边)或小鼠脑(右边)的TMRM装载线粒体之后线粒体膜电势的经时线型图。
图7C为一对从经ANT-GA或未偶联的GA/ANT混合物处理的HeLa细胞线粒体(两小图的上组)或分离小鼠肝线粒体(两小图的下组)释放的细胞色素c的两个免疫印迹组成的组。
图7D为显示用不同浓度的GA、ANT-GA或GA/ANT温育的HeLa细胞由MTT确定的存活率百分比的线型图。
图7E为显示经ANT-GA(实心正方形)或GA/ANT(空心圆形)处理的原生人类成纤维细胞WS-1(黑)、HGF(紫)或HFF(绿)由MTT确定的存活率百分比的线型图。前列腺癌PC3细胞(蓝)为对照。
图7F为经ANT-GA(左边两图)或GA/ANT(右边两图)处理的p53+/+(上边两图)与p53-/-(下边两图)HCT116细胞流式细胞计数分析的四个散点图,y轴为碘丙锭染色强度,而x轴为DEVDase活性。
图8为一组四个免疫印迹。上边小图为分离自睾丸、肺、脾、肾、脑与肝的线粒体经蛋白酶K(PK)处理后的Hsp90免疫印迹,仅于睾丸与脑中显示最低限表达。分别使用Bcl-2(中间小图)与Cox-IV(下边小图)免疫印迹作为阴性与阳性对照。未经PK处理的脑线粒体的Bcl-2免疫印迹亦用作阳性对照(左边小图)。
图9为一对免疫印迹。上边小图为分离自原生p53-/-小鼠淋巴瘤样本线粒体,与Sheph-ANT或Scram-ANT温育所制备的提取物的Cyt c免疫印迹。Cox-IV免疫印迹用作阳性对照(下边小图)。
图10A为一组两个免疫印迹。上边小图为CypD免疫印迹,其中GST或GST-TRAP-1与重组CypD温育,添加CsA、GA或无药物,显示GST-TRAP-1 CypD被GST-TRAP-1而非GST下拉。图10A的下边小图为所述免疫印迹胶的考马斯标记。
图10B为一组两个免疫印迹。上边小图为来自GST或GST-CypD下拉体外转录和翻译的35S标记Hsp90电泳的蛋白质凝胶的放射自显影。图10B下边小图,为所述实验中所用胶的考马斯染色。
图11为显示经pcDNA3(作为对照)或TRAP-1转染并经不同浓度的星形孢菌素处理的正常HFF人类成纤维细胞由MTT确定的存活率百分比的条形图。
图12A为一组六小图的图像;上与中行为与纯化Raji细胞线粒体温育的FITC-GA(左上小图)、FITC-ANT(右上小图)或FITC-ANT-GA(中左小图)或者无纯化Raji细胞线粒体温育的FITC-ANT-GA(中右小图)的荧光显微镜图像。下行小图为与纯化Raji细胞线粒体温育在PK处理前(左下小图)与后(右下小图)的FITC-ANT-GA。
图12B为一种将17-AGG或17-GMB-APA-GA通过硫醚连接偶联于ANT以产生ANT-GA的方案示意图。
图12C为一对质谱。上边小图为进行偶联反应以产生ANT-GA的质谱,于箭头处显示17-GMP-APA-GA的峰。下边小图为进行偶联反应以产生ANT-GA的质谱,与箭头处显示ANT与ANT-GA的峰。
图12D为显示经ANT-GA(中间泳道)或GA/ANT未偶联化合物(右边泳道)处理的HeLa细胞中Akt表达的免疫印迹。未处理HeLa细胞用作对照(左边泳道)。β-肌动蛋白用作对照(下边小图,泳道与上边小图对应)。
图13A为一对在来自MCF-7或HCT116细胞(上边小图),或原生WS-1或HFF人类成纤维细胞(下边小图)的分离细胞溶胶(C)或线粒体(M)组分中显示Hsp60与COX-IV表达的Western blot。
图13B为一组六个显微照片显示乳房、结肠或肺腺癌(肿瘤)或对应的正常组织(正常)的原生人类组织样本经针对Hsp60抗体染色,且通过免疫组织化学分析。放大率,x200。
图13C为一组六个图表显示下述实验的结果:其中74INT正常上皮细胞或WS-1正常成纤维细胞经非定向的或Hsp60引导siRNA转染,并分析DEVDase活性以及通过多参数流式细胞计数分析进行碘丙锭染色。指明了每个象限中的细胞百分比。None,未转染细胞。
图14为在此提出的序列的非正式序列列表。
图15A为显示伽米替尼组合模块结构的示意图,其中TBDPS指叔丁基二苯基甲硅烷基。
图15B左上小图为在经17-AAG或伽米替尼-G4(示为“G4”)(1-10μM)处理的细胞中,以Chk1依赖性Cdc25的磷酸化的形式显示伴侣活性的放射自显影照片,其中上样对照示于中间(Cdc25)与下边(GST-Chk1)。右边小图为显示左边小图所示条带光密度定量的条形图,代表两个实验。
图15C为量化17-AAG或伽米替尼-G4(示为“G4”)线粒体积聚的条形图,其中“None”指载体对照。平均值±平均值的标准误差(n=3)。
图16A为显示在经伽米替尼-G1(“G1”)、伽米替尼-G2(“G2”)、伽米替尼-G3(“G3”)、伽米替尼-G4(“G4”)、伽米替尼-TPP(“TPP”)、GA或17-AAG(浓度为1μM)处理并分析荧光发射的TMRM装载线粒体中线粒体内膜电势的经时线型图。
图16B,左边小图为显示与混以四胍盐(17-AAG+TG-OH)、17-AAG与1μM环孢素A(“17-AAG+CsA”)、1.5μM伽米替尼-G4(“G4”)、1.5μM伽米替尼-G4与1μM环孢素A(“G4+CsA”)的17-AAG温育的TMRM装载线粒体中线粒体内膜电势的经时线型图。右边小图为显示与混以三苯基膦的GA(“GA+TPP-OH”)、混以三苯基膦与1μM环孢素A的GA(“GA+TPP-OH+CsA”)、三苯基膦自身(“TPP”)及三苯基膦与1μM环孢素A(“TPP+CsA”)温育的TMRM装载线粒体中线粒体内膜电势的经时线型图。
图16C为免疫印迹小图显示在经伽米替尼-G1(“G1”)、伽米替尼-G2(“G2”)、伽米替尼-G4(“G4”)或17-AAG处理的肿瘤线粒体中在上清(S)或沉淀(P)中细胞色素c的释放,显示Cox-IV作为线粒体标记(20分钟)。
图16D为显示自与IPI-504、BIIB021、NVP-AUY922、17-AAG或伽米替尼-G4(“G4”)温育3小时的线粒体释放细胞色素百分比的经时线型图。数据代表两个独立实验。
图17A包括显示经不同浓度的伽米替尼-G1(“G1”)、伽米替尼-G2(“G2”)、伽米替尼-G3(“G3”)、伽米替尼-G4(“G4”)、伽米替尼-TPP(“TPP”)或17-AAG处理的H460细胞由MTT分析的细胞存活率百分比两个线型图,左边的线型图为处理3小时后,而右边的线型图为处理24小时以后,平均值±标准偏差(n=2)。
图17B为显示经伽米替尼-G4(“G4”)、伽米替尼-TPP(“TPP”)或17-AAG(浓度为10μM)处理的SKBr3细胞由MTT分析的存活率百分比的经时线型图。
图17C为显示经10μM伽米替尼-G4(“G4”)、伽米替尼-TPP(“TPP”)或17-AAG在所示时间间隔处理的SKBr3细胞通过Trypam blue染色所得的死细胞百分比的条形图。平均值±平均值的标准误差(n=3)。
图17D包括四个散点图。H460细胞经伽米替尼-G4(“G4”)或溶剂载体处理4小时并用JC-1标记,并通过示于散点图上边FL2/FL1荧光比例,或示于散点图下边DEVDase(胱天蛋白酶)活性的变化对其线粒体膜电势的丧失进行分析(通过多参数流式细胞计数)。指明了每个象限中细胞的百分比,且PI用于表示碘丙锭。
图17E为两个在软琼脂上菌落形成的图像,在上边图像中显示使用经溶剂载体(None)处理四小时的H460细胞两周后的菌落形成,在下边图像中显示使用经伽米替尼-G4(“G4”)处理四小时的H460细胞两周后的菌落形成。放大率,x200。
图17F为显示在肿瘤细胞系(K562,黑;MDA-MB-231,浅橙;U87MG,红;MCF-7,粉红;H1975,浅棕;DU145,橙;H460,蓝;HCT116,紫红;HL-60,紫;Raji,深粉红;THP-1绿)中由MTT分析的存活率百分比作为伽米替尼-G4(实线)或17-AAG混以TG-OH(虚线)浓度函数的线型图。数据代表两个实验。
图17G为显示用对照(实心记号)或CypD(空心记号)siRNA转染的H460细胞中由MTT分析的存活率百分比作为17-AGG(圆形)或伽米替尼-G4(正方形)浓度函数的线型图。平均值±平均值的标准误差(n=3)。
图17H为一系列显示经伽米替尼-G1(“G1”)、伽米替尼-G2(“G2”)、伽米替尼-G3(“G3”)、伽米替尼-G4(“G4”)、伽米替尼-TPP(“TPP”)或17-AAG处理(以5μM的浓度,处理24小时)的HeLa细胞中Akt、Hsp70、Chk1与GAPDH蛋白质水平的免疫印迹。
图18A在上边和下边包括两个线型图。上边的线型图显示在携带H460肺腺癌异种移植肿瘤(100-150mm3)并经伽米替尼-G4(“G4”)或17-AAG处理的SCID/beige小鼠中肿瘤体积作为时间的函数。下边的线型图显示在以实施例11所述剂量逐级上升用药方案经溶剂载体、伽米替尼-G1(“G1”)或伽米替尼-TPP(“TPP”)处理中肿瘤体积作为时间的函数。肿瘤体积用测径器测量。
图18B显示通过TUNEL在原位可视化的经溶剂载体(“Vehicle”)或伽米替尼-G4(“G4”)处理的肿瘤所得的肿瘤样本中核小体内DNA断裂的两个标记为“溶剂载体”与“G4”的图像。下边的条形图显示阳性细胞的量化。放大率,x400。***,p<0.0001。
图18C显示一系列自经溶剂载体或伽米替尼-G4(“G4”)处理的动物收获的H460异种移植肿瘤的细胞溶胶组分中细胞色素c(Cyto c)、Cox-IV与GAPDH的免疫印迹。分析了两个小鼠/组(动物#)。
图18D为显示经溶剂载体、17-AAG、伽米替尼-G1(“G1”)、伽米替尼-G4(“G4”)或伽米替尼-TPP(“TPP”)处理的小鼠在实验结束时测量的体重下降百分比的条形图。平均值±平均值的标准误差。
图18E为显示自正常WS-1成纤维细胞分离并与未偶联17-AAG/TG-OH伽米替尼-G4(“G4”)温育的TMRM装载线粒体,在CsA存在或不存在情况下的膜电势百分比的经时线型图。箭头,添加时点。
图18F显示两个自正常HFF成纤维细胞或HeLa细胞分离并经伽米替尼-G1(“G1”)、伽米替尼-G2(“G2”)、伽米替尼-G3(“G3”)、伽米替尼-G4(“G4”)、伽米替尼-TPP(“TPP”)或17-AAG处理的线粒体中Cyto c与Cox-IV的免疫印迹。Cox-IV用作线粒体标记。
图18G为显示人类成纤维细胞(HFF,黑线)、牛动脉内皮细胞(中等灰色)、肠上皮细胞(深灰色)或人类脐静脉内皮细胞(浅灰)在温育24小时后由MTT分析的存活率百分比作为伽米替尼-G4(实线)或17-AAG(虚线)浓度的函数。数据代表两个实验。
图19为在这些研究中使用的GA(17-AAG)、IPI-504以及非基于GA(BIIB021与NVP-AUY922)Hsp90抑制剂的化学结构的概略示意图。
图20A为显示在处理期间以2mg/kg每日两次i.p.经溶剂载体或伽米替尼-G4(“G4”)处理(HL-60)的人类急性白血病HL-60肿瘤体积的经时线型图(2/小鼠,6个肿瘤/组)。箭头:处理起始时点。
图20B为在显示处理期间使用以下剂量逐级上升用药方案,即每日两次2mg/kg(0-2日),每日两次2.5mg/kg(3-5日)以及每日两次3mg/kg,经溶剂载体或伽米替尼-G4(“G4”)处理(MDA-MB-231)的人类乳房腺癌MDA-MB-231肿瘤体积的经时线型图(2/小鼠,6个肿瘤/组)。箭头:处理起始时点。
详细描述
线粒体在细胞存活与细胞死亡中起至关重要的作用(Pandey et al.,EMBO J.,19:4310-4322(2000);Green and Kroemer,Science,305:626-629,(2004))。该细胞器功能失常或完整性破坏为许多细胞死亡通路的分子先决条件,其特征为线粒体内膜渗透性增加、膜电势丧失、基质肿胀以及外膜的最终破裂向细胞溶胶释放致细胞凋亡蛋白,意即,细胞色素c(Green andKroemer,Science,305:626-629,(2004))。尚未完全理解以“线粒体渗透性转变”为人所知的该过程是如何受调控的(Green and Kroemer,Science,305:626-629,(2004));发现所述渗透性转变孔,包括电压依赖性阴离子通道(VDAC-1)、腺嘌呤核苷酸转运体(ANT)或亲免疫因子亲环素D(CypD),或者并非不可或缺(Kokoszka et al.,Nature,427:461-1465,(2004);Krauskopf etal.,Biochim.Biophys.Acta,1757:590-595,(2006)),或者只涉及部分但非全部形式的线粒体细胞死亡(Baines et al.,Nature,434:658-662,(2005);Nakagawaet al.,Nature,434:652-658,(2005))。
本发明基于,至少部分基于下述发现,即在肿瘤细胞线粒体中发现了分子伴侣Hsp60、Hsp90与TRAP-1,且在肿瘤细胞线粒体中使用靶向线粒体的伴侣抑制剂导致癌细胞死亡。不愿拘于理论,抑制所述线粒体伴侣可导致激活线粒体渗透性转变,引起线粒体功能崩溃,包括线粒体膜电势丧失与细胞色素c的释放,其导致细胞死亡。
因此,本文所述的是包含伴侣抑制剂,例如,HSPA9、Hsp60、Hsp90或TRAP-1抑制剂,以及线粒体穿透部分,可选地包含插入接头的趋线粒体试剂,以及制造与使用这些组合物以治疗与异常细胞增殖,例如,癌与肿瘤,相关的疾病,例如,以杀灭癌或肿瘤细胞,例如,在体内与体外。本文亦描述了包含这些趋线粒体试剂的组合物。
I.分子伴侣
分子伴侣,特别是热激蛋白(Hsp)基因家族的成员(Lindquist and Craig,Annu.Rev.Genet.1988;22:631-77),协助蛋白质折叠的质量控制、蛋白质降解以及亚细胞区室间的蛋白质运输(Hartl and Hayer-Hartl,Science 2002;295:1852-8)。这涉及下述周期性的循环:ATPase活性、附加伴侣的募集以及在亚细胞微域中的区室化,包括线粒体(Young et al.,Cell 2003;112:41-50)。分子伴侣经常通过下述方式与增强的细胞存活相联系(Beere,JCell Sci 2004;117:2641-51):细胞凋亡体起始线粒体细胞死亡的阻抑(Paul etal.,Mol Cell Biol 2002;22:816-34)、幸存效应物的稳定性增加(Sato et al.,ProcNatl Acad Sci U S A 2000;97:10832-7)以及p53失活(Wadhwa et al.,J BiolChem 1998;273:29586-91)。如本文所述,所述伴侣抗细胞凋亡功能在肿瘤细胞维持中起中枢功能,且可选择性的以其为靶杀灭癌细胞。亦参见:Whitesell et al.,Nat Rev Cancer 2005;5:761-72;and Isaacs et al.,Cancer Cell2003;3:213-7。
下面是可使用现行方法作为靶的部分分子伴侣的简要描述。在一些实施方案中,对现行方法(例如,对筛选方法)为有用的分子伴侣多肽与本文描述的氨基酸序列(例如,与人类序列)具有至少大约90%、95%、99%或100%同一性。在一些实施方案中,编码对现行方法(例如,对筛选方法)为有用的分子伴侣的核酸与本文描述的核酸序列(例如,与人类序列)具有至少大约90%、95%、99%或100%同一性。
序列间的比较与两个序列间相同性百分比的确定可使用数学算法完成。举例而言,两个氨基酸序列间的相同性百分比可使用Needleman与Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法确定,该算法已包含于GCG软件包(可从万维网gcg.com获取)中的GAP程序中,使用缺省参数,例如,使用gap penalty为12、gap extend penalty为4以及frameshift gap penalty为5的Blossum 62scoring matrix。
Hsp90(热激90-kD蛋白1)
Hsp90是在许多蛋白,包括癌基因信号蛋白中构象成熟中起重要作用的的分子伴侣,如本文所述,Hsp90于癌细胞,而非正常细胞的线粒体中积聚,且可成为本文所述的包含线粒体穿透序列的组合物的靶。
人类Hsp90的GenBank Acc.No.包括对于热激蛋白90kDa alpha(细胞溶胶的),A类成员同工型1,NM_001017963.2(核酸)与NP_001017963.2(蛋白),对热激蛋白90kDa alpha(细胞溶胶的),A类成员同工型2,NM_005348.3(核酸)与NP_005339.3(蛋白)。变体2较之变体1在5’UTR与编码序列上有差异。其结果是同工型2较之同工型1在N-端较短。
Hsp90亦以HSPCA;HSPC1;HSP90A;HSP89-ALPHA(HSP89A);脂多糖相关蛋白2(LAP2)以及LPS相关蛋白2等名为人所知。
TRAP-1(TNF受体相关蛋白1)
TRAP-1与hsp90有高同源性,且与类型1肿瘤坏死因子受体结合(参见Song et al.,J.Biol.Chem.,270:3574-3581(1995))。所得的661-氨基酸蛋白质与HSP90蛋白家族成员有60%的特异性,但其缺乏见于HSP90蛋白中的高度带电荷的域。参见,例如,Felts et al.,J Biol Chem.2000;275(5):3305-12。如本文所述,TRAP-1在癌细胞但非正常细胞的线粒体中积聚,且可成为本文所述的包含线粒体穿透序列的组合物的靶。
人类TRAP的GenBank Acc.No.包括NM_016292.2(核酸)与NP_057376.2(氨基酸)。TRAP亦称为热激蛋白,75-KD(HSP75);肿瘤坏死因子受体相关蛋白1;TRAP1与TNFR相关蛋白1。
Hsp60(热激60-kD蛋白1)
Hsp60,与其相联系的伴侣素(chaperonin),Hsp10,已被识别为进化上保守的胁迫应激伴侣(Zhao et al.,Embo J 2002;21:4411-9),很大程度上,但非专属性的区室化于线粒体(Soltys and Gupta,Int Rev Cytol 2000;194:133-96),且在细胞器生物发生与摄入的前蛋白的折叠/再折叠中起至关重要的作用(Deocaris et al.,Cell Stress Chaperones 2006;11:116-28)。然而,关于Hsp60是否促成细胞存活仍存争论,有数据暗示其通过增强的胱天蛋白酶激活具有促进细胞凋亡作用(Samali et al.,Embo J 1999;18:2040-8;Xanthoudakis et al.,Embo J 1999;18:2049-56),或,相反,涉及隔离含Bax复合物而具有抗细胞凋亡机理(Shan et al.,J Mol Cell Cardiol 2003;35:1135-43)。Hsp60在癌症中的作用同样不确定,因已报道该伴侣的正调节(Thomas et al.,Leuk Res 2005;29:1049-58;Cappello et al.,BMC Cancer 2005;5:139),或负调节(Tang et al.,Cell Stress Chaperones 2005;10:46-58;Cappelloet al.,Cancer 2006;107:2417-24)在不同肿瘤系列中与疾病结果相关。如本文所述,Hsp60较之正常细胞,在肿瘤细胞中高表达,且以Hsp60为靶导致线粒体功能失常与细胞凋亡,而在正常细胞中丧失Hsp60很好的被耐受,并不导致细胞死亡。
Hsp60亦以CPN60;GROEL;HSP60;HSP65;SPG13与HuCHA60等名为人所知。人类Hsp60示例性的GenBank Acc.No.包括:对转录变体1(最长的变体),NM_002156.4(核酸)与NP_002147.2(蛋白),对转录变体2,NM_199440.1(核酸)与NP_955472.1(蛋白)。变体2较之变体1在5’UTR上有差异。变体1与变体2两者编码相同同工型。
HspA9(热激70kDa蛋白9)
HspA9属于热激蛋白70家族,其包含热诱导性以及组成性表达的成员。后者称为热激同族蛋白,HspA9即属于此类。HspA9在细胞增殖控制中其这样,且可作为伴侣作用。参见,例如,Wadhwa et al.,Int J Cancer.2006;118(12):2973-80;Wadhwa et al.,J Gene Med.2004;6(4):439-44。
HspA9亦以致死蛋白、mthsp70与GRP75等名为人所知。人类HspA9示例性的GenBank Acc.No.包括:热激70kDa蛋白9前体,NM_004134.5(核酸)与NP_004125.3(蛋白)。
II.分子伴侣抑制剂
本文所述的组合物与方法包括使用分子伴侣抑制剂,例如,Hsp60、HspA9、Hsp90和/或TRAP-1的抑制剂。在本文所述方法与组合物为有用的抑制剂直接作用于伴侣蛋白自身,意即,并非作用于其上游或下游。许多上述抑制剂在本领域是已知的,例如,肽抑制剂与小分子抑制剂。在一些实施方案中,本发明为有用的分子伴侣抑制剂抑制该伴侣,例如,Hsp60、HspA9、Hsp90和/或TRAP-1的ATPase活性。在一些实施方案中,本发明中为有用的分子伴侣抑制剂抑制Hsp60、HspA9、Hsp90或TRAP-1与亲环素D的结合。在一些实施方案中,本发明中为有用的分子伴侣抑制剂抑制Hsp60、HspA9、Hsp90或TRAP-1与存活素(survivin)的结合。在一些实施方案中,分子伴侣抑制剂与伴侣结合,并诱导该伴侣的对象蛋白在蛋白酶体中降解。
此外,存在多种对鉴别、设计以及分析候选伴侣抑制剂的方法。举例而言,合理的筛选方法已用于通过计算方法使用牧羊犬蛋白肽(LFACGSSHK,均为D-氨基酸)作为筛选非肽结构数据库的框架以鉴别其它以Hsp90为靶的分子,参见,例如,Meli et al.,J.Med.Chem.,49:7721-7730(2006)。
分子伴侣的靶抑制剂
许多肽分子伴侣,例如Hsp90和/或TRAP-1的抑制剂在本领域是已知的。对本文所述的组合物与方法为有用的抑制剂可包含全肽或多肽(例如,细胞凋亡诱导蛋白(AIP,例如存活素)整个分子,或其活性(意即,抑制性)片段,所述片段保留了其母体Hsp90的抑制活性,意即,至少母体活性的40%;活性片段优选具有所述母体多肽Hsp90抑制性活性的50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多))。
存活素肽及衍生物
存活素肽与肽衍生物披露于U.S.Patent Application No.11/187,230(以全文引用的方式包含于本文)。活性存活素肽均具有SEQ ID NO:2的核心Hsp90结合序列基序(His Ser Ser Gly Cys),其位于所述存活素蛋白的唯一杆状病毒细胞凋亡抑制剂重复(Baculovirus Inhibitor of Apoptosis(IAP)Repeat(BIR))域中。该基序对应于全长存活素(SEQ ID NO:1)80-84位置的氨基酸残基。肽包含此基序,以及其肽衍生物,可(a)与Hsp90的N端ATPase域(所谓“ATP袋”)结合,以及(b)在体外与体内抑制Hsp90-存活素蛋白-蛋白相互作用。
如本文所用的术语存活素肽与存活素肽衍生物,指下述肽,即其序列包含少于阻止细胞死亡的有效存活素蛋白全氨基酸序列。对本发明为有用的存活素肽以及肽衍生物抑制分子伴侣,具体而言,抑制分子伴侣,例如Hsp90或TRAP-1与亲环素D之间的相互作用。
人类野生型存活素全长多肽具有下列氨基酸序列:
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD(SEQID NO:1)
下述表(表1)列出了一些可与Hsp90结合的存活素肽的示例:
表1.示例性存活素肽
SEQ ID NO:2 His Ser Ser Gly Cys
SEQ ID NO:3 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys
SEQ ID NO:4 Ile Asp Asp His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu
SEQ ID NO:5 Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu
SEQ ID NO:6 Lys His Ser Ser Gly Cys
SEQ ID NO:7 His Ser Ser Gly Cys Ala
SEQ ID NO:8 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala
SEQ ID NO:9 Lys Lys His Ser Ser Gly Cys
SEQ ID NO:10 His Ser Ser Gly Cys Ala Phe
SEQ ID NO:11 His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys
SEQ ID NO:12 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu
存活素的变体亦可用于本文所述的方法与组合物。可进行保守与非保守的氨基酸替换。具体而言,可对一个或多个,例如直至五个、十个、二十个或三十个在对应于SEQ ID NO:1中His80到Cys84的核心五聚体序列(意即,上面提出的SEQ ID NO:2)以外的氨基酸进行保守性氨基酸替换。存活素肽的类肽由(Rational design of Shepherdin,a novel anticancer agent.Cancer Cell.7(5):457-68(2005))描述,以全文引用的形式包含于本文中。
其它IAP肽与衍生物
其它细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP)与Hsp90相互作用,包含从IAP(EntrezAccession No.:NP_001156)、cIAP2(Entrez Accession No.:NP_001157)与XIAP(Entrez Accession No.:NP_001158)。如本文所披露,这些IAP蛋白包含至少一个介导Hsp90相互作用的杆状病毒IAP重复域。举例而言,XIAP(BIR1)的第一个BIR域介导Hsp90-XIAP结合相互作用。
IAP蛋白,或其Hsp90结合与抑制片段可因此用于现行组合物与方法。举例而言,在这些IAP蛋白中对应于一个或多个BIR域的肽,或其Hsp90结合片段,可用于本文披露的组合物与方法以诱导癌或肿瘤细胞死亡。IAP蛋白,或其Hsp90结合片段,亦可作为测试化合物受筛选,例如,以鉴别抑制分子伴侣与亲环素D之间结合的候选化合物。在一些实施方案中,IAP蛋白,或其Hsp90结合片段,可作为测试化合物受筛选以鉴别诱导癌细胞死亡的候选化合物。
XIAP的第一个BIR域的示例包括下述序列:
RLKTFANFPSGSPVSASTLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSPNCRFIN(SEQ ID NO:14)
cIAP1的第一个BIR域的示例包括下述序列:
RMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKRGDSPTEKHKKLYPSCRFVQ(SEQ ID NO:15)
cIAP2的第一个BIR域的示例包括下述序列:
RMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGLMLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQ(SEQ ID NO:16)
肽抑制剂的变体
分子伴侣的肽抑制剂变体亦为本发明一部分。其包括序列变体。当进行了保守性氨基酸替换时,所述替换可为在下列任何组中一个氨基酸替换另一个:精氨酸、组氨酸与赖氨酸;天冬氨酸与谷氨酸;丙氨酸、亮氨酸异亮氨酸与缬氨酸;以及苯丙氨酸、色氨酸与酪氨酸。此处所列的氨基酸残基可为天然出现的。亦可替换为类似种类的非天然出现氨基酸残基。举例而言,可用带负电荷的非天然出现氨基酸替换带负电荷的天然出现氨基酸;可用疏水性芳香族的非天然出现氨基酸替换疏水性芳香族的天然出现氨基酸;依此类推。
同一性可变动,且可通过本领域众所周知的方法确定。“同源性”与“同一性”均指两个多肽序列间的序列相似性,其中同一性为更严格的比较。同源性与同一性均可通过比较每个序列中可为比较而进行比对的位置来确定。当在比较序列中一个位置由相同氨基酸残基所占据时,所述多肽可称为在该位置为相同的;当等价位置由同一个氨基酸(例如,相同的)或相似氨基酸(例如,在立体化学上或带电性质上相似),则所述分子可称为在该位置为同源的。序列间同源性或同一性的百分比是各序列均具有的匹配或同源位置数量的函数。本文所述的多肽生物学活性变体可与对应天然出现的多肽(例如,存活素片段或IAP片段,例如,如本文所述)具有至少或大约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或同源性。编码所述生物学活性变体多肽的核酸可类似的描述为具有与对应天然出现的核酸序列至少或大约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性或同源性。本领域一般技术人员可方便的识别核酸序列的简并变体,且该变体可用于本文所述的目的。
当在人类受试者中使用肽抑制剂和/或线粒体穿透部分,通常期望使用人类或人源化序列。因此,本文所述方法可包括使用标准分子生物学技术以人源化非人类序列。此外,可使用人类序列以做成构建体。
肽抑制剂的修饰
本文所述肽的修饰版本亦可用于本文所述的组合物与方法。所述肽与其生物学活性变体可经多种方法修饰。举例而言,试剂,包括附加的氨基酸残基、其它取代基以及保护基团可添加到或者氨基末端,或者羧基末端,或者两者皆是。所述修饰可以改变所述肽的形式或改变所述肽相互结合或相互作用,与非相同肽或其它肽结合或相互作用为目的进行。举例而言,所述肽可经描述以包含半胱氨酸残基或其它含硫残基或试剂,其可参与形成二硫键。举例而言,可添加至少两个半胱氨酸残基,其中一个或两者为,可选地,在所述肽的C端或N端。
所述肽可通过在半胱氨酸残基间形成二硫键(或,更一般的,在至少两个存在于所述肽的半胱氨酸残基(例如,在末端区域内的)中的两个之间)环化。尽管当前发明的肽可为直链或环形的,环形肽通常较之直链肽具有优势,因为其环状结构更加坚固,且因此其生物学活性可能较之对应的直链肽为高(参见,一般的,Camarero and Muir,J.Am.Chem.Soc.,121:5597-5598,(1999))。
已描述自直链前体制备环形多肽的策略,且可用于现行肽。举例而言,可使用化学交联方法制备所述肽的支架环化版本(Goldenburg and Creighton,J.Mol.Biol.,165:407-413,(1983))。其它方法包括分子内化学连接方法(参见,例如Camarero et al.,Angew Chem.Int.Ed.,37:347-349,(1998);Tam and Lu,Prot.Sci.,7:1583-1592,(1998);Camarero and Muir,Chem.Commun.,1369-1370,(1997);and Zhang and Tam,J.Am.Chem.Soc.,119:2363-2370,(1997))与分子内酶连接方法(Jackson et al.,J.Am.Chem.Soc.,117:819-820,(1995)),其在水性条件下允许直链合成肽有效的环化。亦参见U.S.PatentNo.7,105,341。
或者,或另外,所述肽可进一步在氨基末端或羧基末端包含取代基。所述取代基可为酰基基团或者取代或未取代的胺基团(例如,N端的取代基可为酰基而C端可由取代或未取代的胺基团(例如,由一个、两个或三个取代基的氨基基团,所述取代基可相同或相异)酰胺化)。所述胺基团可包含低级烷基(例如,具有1-4个碳原子的烷基)、烯基、炔基或卤代烷基。所述酰基基团可为低级酰基基团(例如,具有直至四个碳原子的酰基基团),尤其是乙酰基基团。
如本文所用的术语“烷基”意指饱和烃基团,其可为直链或有支链的。作为例子的烷基基团包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如,正丙基与异丙基)、丁基(例如,正丁基、异丁基、叔丁基)、戊基(例如,正戊基、异戊基,新戊基)以及类似物。烷基基团可含有从1到大约20、从2到大约20、从1到大约10、从1到大约8、从1到大约6、从1到大约4或从1到大约3个碳原子。
如本文所用的“烯基”指具有一个或多个双键的烃基基团。作为例子的烯基基团包括乙烯基、丙烯基以及类似物。
如本文所用的“炔基”指具有一个或多个碳碳叁键的烃基基团。作为例子的炔基基团包括乙炔基、丙炔基以及类似物。
如本文所用的“卤代烷基”指具有一个或多个卤素取代基的烃基基团。作为例子的卤代烷基基团包括CF3、C2F5、CHF2、CCl3、CHCl2、C2Cl5或类似物。
如本文所用的“芳基”指包含6到19个碳原子的单环或多环芳香性基团。作为例子的芳基基团包括,但不限定于未取代或取代的苯基、未取代或取代的芴基以及未取代或取代的萘基。
如本文所用的“杂环芳基”指单环或多环的饱和或不饱和环系统,在一个实施方案中为3到10元,在另一个实施方案中为4到7元,在进一步的实施方案中为5到6元,其中在有些实施方案中一个或多个环系统中的1个到3个原子是杂原子,意即,除碳以外的元素,包括但不限定于:氮、氧或硫。在有些实施方案中,环中一个原子可由羰基或磺酰基基团取代。
如本文所用的“亚烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚环烷基”、“亚芳基”、“亚杂芳基”以及“亚杂环烷基”指“烷基”、“烯基”、“炔基”、“环烷基”、“芳基”、“杂环芳基”以及“杂环烷基”的二价连接。所述二价接头,在一些实施方案中,可在两个方向上存在,例如C(O)NH可为-C(O)NH-或-NHC(O)-。
应指出,所述肽可为变动长度,且可为或可包括天然见于伴侣结合蛋白(CBP),例如存活素或IAP的连续的氨基酸残基,或与天然出现的CBP序列由一定程度差异(但保留对其有用性为足够的活性)。当所述肽在其N端或C端(或两者皆是)包括非天然见于CBP的氨基酸残基时,所述附加的序列长度可为大约200氨基酸残基,且这些残基可平均或不平均的分布于N端与C端之间。举例而言,N端与C端两者均可包括大约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基。另外,一个末端可包含大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个残基,而一个末端可不包括任何残基(例如,可终结于与天然出现的存活素序列相同的氨基酸序列)。
更加具体而言,所述N端或C端可包含1到大约100(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100)个带正电荷的氨基酸残基(例如,碱性氨基酸例如精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸残基);1到大约100个带负电荷的氨基酸残基(例如,酸性氨基酸残基,例如天冬氨酸或谷氨酸残基);1到大约100个甘氨酸残基;1到大约100个疏水氨基酸残基(例如,疏水脂肪族残基,例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸,或疏水芳香族残基,例如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸);或1到大约100(例如,1-4)个半胱氨酸残基。
所述肽,包括上述修饰肽,可具有蛋白酶抗性并可包括一个或多个类型的保护基团,例如酰基基团、酰胺基团、苄基或苯甲酰基基团或聚乙二醇。更具体而言,肽,包括上述修饰肽,可与N端乙酰化和/或C端酰胺化。
当包含非天然出现或修饰氨基酸残基时,其可选自下组或其它许多本领域可用的:4-羟基脯氨酸、gamma-羧基谷氨酸、o-磷酸丝氨酸、o-磷酸酪氨酸或delta-羟基赖氨酸。其它的例子包括萘丙氨酸,其可替换色氨酸以协助合成,L-羟基丙基,L-3,4-二羟基苯丙氨酸、alpha-氨基酸例如L-alpha-羟基赖氨酸以及D-alpha-甲基丙氨酸、L-alpha-甲基丙氨酸、beta-氨基酸以及异喹啉基。具有非天然出现氨基酸残基的肽可称为合成肽,并构成本文所述的一种类型的变体。其它变体包括其氨基酸残基(可为L-或D-形式)天然出现的侧链由非天然出现侧链所取代的肽。
在一个实施方案中,所述肽可在任一末端(或两者皆是)(例如,在N端)具有三个附加的氨基酸(Met-Gly-Ser),以及在任一末端(或两者皆是)(例如,在C端)具有七到八个附加的氨基酸(Thr-Ser-His-His-His-His-His-His-Cys(SEQ ID NO:13))。
在另一个实施方案中,所述肽可通过本领域所知方法PEG酰化。
关于通过还原/烷基化和/或酰化对肽进行修饰的指导,可参阅Tarr,Methods of Protein Microcharacterization,J.E.Silver ed.,Humana Press,Clifton N.J.(1986)155-194;关于化学偶联于合适载体的指导,可参阅Mishelland Shiigi,eds,Selected Methods in Cellular Immunology,WH Freeman,SanFrancisco,Calif.(1980)与U.S.Pat.No.4,939,239;以及关于温和福尔马林处理的指导,可参阅Marsh,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.,(1971)41:199-215。
亦可使用所述抑制性肽的拟肽。本文披露,与本领域已知的肽抑制剂可根据本领域已知方法修饰以产生拟肽。参见,例如,Kazmierski,W.M.,ed.,Peptidomimetics Protocols,Human Press(Totowa NJ 1998);Goodman et al.,cds.,Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry:Synthesis of Peptides and Peptidomimetics,Thiele Verlag(New York 2003);以及Mayo et al.,J.Biol.Chem.,278:45746,(2003)。在一些情况下,这些肽的修饰拟肽版本以及本文披露的片段在体内相对于非拟肽的肽显示增强的稳定性。
构建拟肽的方法包括在肽序列中用D-氨基酸对映异构体替换一个或多个,例如,所有的氨基酸。上述序列在本文中称为“翻转(retro)”序列。在另一种方法中,可翻转所述氨基酸残基的N端到C端的顺序,使原来肽中从N端到C端氨基酸序列变为修饰拟肽中氨基酸残基从C端到N端的顺序。上述序列可称为“反转(inverso)”序列。
拟肽可同时为翻转与反转版本,意即,本文披露肽的“翻反”版本。所述新拟肽可包含D-氨基酸且经排列使在拟肽中氨基酸残基从N端到C端的顺序对应于原来肽中氨基酸残基从C端到N端的顺序。
其它制造拟肽的方法包括在肽中将一个或多个氨基酸残基用所述氨基酸化学上迥异但可识别的功能类似物,意即,人工氨基酸类似物取代。人工氨基酸类似物包括氨基酸、β取代氮基酸(氨基酸)、氨基酸的含磷似物,例如α-氨基磷酸与α-氨基次磷酸,及具有非肽连接的氨基酸。人工氨基酸可用于构建拟肽,例如类肽寡聚物(例如,类肽酰胺或酯类似物)、肽、环肽、寡脲或寡氨基甲酸酯肽;或杂环分子。作为例子的存活素翻反拟肽包括LFACGSSHK(SEQ ID NO:25)、CGSSH(SEQ ID NO:26)、GSSHK(SEQID NO:27)、KKWKMRRNQFWVKVQRLFACGSSHK(SEQ ID NO:28)、KKWKMRRNQFWVKVQRCGSSH(SEQ ID NO:29)与KKWKMRRNQFWVKVQRGSSHK(SEQ ID NO:30),其中所述序列全部为D-氨基酸。这些序列可通过,例如,氨基末端生物素化以及羧基末端酰胺化修饰。
所有本文所述的肽,包括本文所述的变体形式,可进一步包括异种多肽(例如,具有不见于CBP中序列的多肽)。所述异种多肽可为增加其附加于(例如,融合的,如在融合蛋白中)的肽循环半衰期的肽。所述异种多肽可为白蛋白(例如,人类血清白蛋白或其部分)或免疫球蛋白(例如,IgG的Fc区域)的一部分。所述异种多肽可为线粒体穿透部分。
模仿本文所述肽必要构象的化合物应考虑为在本方面所覆盖的范围内。上述类似物具有多种可能设计。U.S.Patent No.5,192,746;U.S.PatentNo.5,169,862;U.S.Patent No.5,539,085;U.S.Patent No.5,576,423;U.S.Patent No.5,051,448;以及U.S.Patent No.5,559,103,其均以引用方式包含于本文,描述了多种构建上述化合物的方法。
模仿肽序列的非肽化合物在本领域为已知的(Meli et al.J.Med.Chem.,49:7721-7730(2006),描述了识别牧羊犬蛋白的非肽小分子模仿物的方法)。模仿肽序列的非肽化合物的合成在本领域亦为已知的(参见,例如,Eldredct al.J.Med.Chem.,37:3882,(1994);Ku et al.J.Med.Chem.,38:9,(1995);Meli et al.J.Med.Chem.,49:7721-7730(2006))。本发明尤其考虑了与伴侣结合的模仿CBP肽的非肽化合物。
本发明亦考虑了合成模仿化合物。如本领域所知,肽可通过将氨基基团与已经与偶联剂,例如二环己基碳二亚胺(DCC)的反应激活的羧基相连的方法合成。游离氨基基团对激活羰基的攻击导致肽键的形成以及二环己基脲的释放。保护除所述意欲反应的氨基与羧基基团外的潜在反应性基团可能为必需的。举例而言,含有激活羰基的组分的氨基基团可用叔丁氧羟基基团封闭。该保护基可随后通过将肽暴露于稀酸中而移除,该处置对肽键无损。
使用该方法,可方便的通过固相方法逐步将氨基酸添加到连接于不可溶基质,例如聚苯乙烯珠的成长肽链上以方便的合成肽。将所期望的肽序列羧基末端的氨基酸(带有氨基保护基团)首先固定于所述聚苯乙烯珠。随即移除所述氨基酸的保护基团。用偶联剂添加下一个氨基酸(带有保护基团)。随后继以漂洗周期。所述漂洗周期可视需要(optionally)重复。
在一个实施方案中,现行发明的类似物为与本文所述伴侣抑制剂肽具有序列同源性的肽。这些类似物包括,但不限定于,其L-氨基酸由其D-异构体取代的肽。一种常见的衡量序列同源性,以及更重要的,统计学显著相似性的方法,是利用由Lipman与Pearson所著的算法用Monte Carlo分析以获取Z值。根据此分析,大于6的Z值显示可能的显著性,而大于10的Z值被认为是统计学上显著的(Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),85:2444-2448,(1988);Lipman and Pearson,Science,227:1435-1441,(1985)。更具体而言,本文所述的CBP肽以及上述类似物可使用任何已知方法合成,包括茶袋法或由Merrifield et al.,Biochemistry,21:5020-5031,(1982);Houghten Wellings,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),82:5131-5135,(1985);Atherton,Methods in Enzymology,289:44-66,(1997)或Guy and Fields,Methods in Enzymology,289:67-83,(1997)所描述固相肽合成过程,或者使用可市购的自动合成仪。
分子伴侣的小分子抑制剂
许多对本文所述的方法与组合物为有用的小分子伴侣抑制剂在本领域为已知的。举例而言,对本文所述的方法与组合物为有用的小分子伴侣抑制剂包括,但不限定于,与Hsp90ATP结合袋结合的分子。本领域已知的小分子Hsp90抑制剂描述于,例如,Rodina et al.,(Nature Chemical Biology,published online July 1,2007)。
在有些实施方案中,所述伴侣抑制剂为从数种化学型中选出的Hsp90抑制剂。这些化学型中的两个为安莎霉素(Ansamycin)与大环内酯类抑制剂。其代表为根赤壳菌素与环丙根赤壳菌素,大环内酯类Hsp90抑制剂类,以及17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17DMAG)与17AAG,安莎霉素类Hsp90抑制剂成员。根赤壳菌素与格尔德霉素抑制Hsp90的结构基础为已知的,因此本领域的技术人员可方便的生成并测试其将保留Hsp90抑制活性的类似物,参见,例如,Roe et al.,J.Med.Chem.42(2):260-6(1999)。嘌呤抑制剂为第三类对本文所述的组合物与方法为有用的化合物。
Hsp90的安莎霉素类抑制剂
对本发明为有用的分子伴侣抑制剂的进一步示例包括,但不仅限于,奎宁安莎霉素抗生素,例如马克霉素(macbecin)、格尔德霉素(geldanamycin)、格尔德霉素类似物与除莠霉素A(herbimycin A)。
格尔德霉素为热激蛋白-90(Hsp90)的抑制剂,其涉及广谱范围蛋白(“对象蛋白”),包括涉及信号传导、细胞周期控制与转录调控的重要蛋白的折叠、激活与装配。格尔德霉素与Hsp90的结合破坏了Hsp90-对象蛋白相互作用,阻止对象蛋白正确折叠。格尔德霉素与格尔德霉素类似物为其一部分。
如本文所用,“格尔德霉素类似物”指与格尔德霉素具有共同核心结构但具有次要化学修饰的化合物。
为格尔德描述位置17变体的格尔德霉素类似物在本领域是已知的,其中许多为可市购的。可市购的格尔德霉素类似物的示例包括,但不仅限于,17-烯丙基氨基-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、17-二甲基氨基格尔德霉素、17-GMB-APA-GA(一种格尔德霉素的马来酰亚胺衍生物,其能使GA与多肽结合)、17-(二甲基氨基乙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)、17-[2-(吡咯烷-1-基)乙基]氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AEP-GA)以及17-(二甲基氨基丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-DMAP-GA)。亦参见Sasaki et al.,U.S.Pat.No.4,261,989(1981);Schnur et al.,U.S.Pat.No.5,932,566(1999);Schnur et al.,J.Med.Chem.,38:3806-3812,(1995);Schnur etal.,J.Med.Chem.,38:3813-3820,(1995);以及Santi et al.,US 2003/0114450A1(2003)。
在位置11变体的格尔德霉素类似物在本领域是已知的。其示例包括,但不仅限于,Muroi et al.,U.S.Pat.No.4,421,688(1983);Schnur,U.S.Pat.No.5,387,584(1995);Schnur et al.,U.S.Pat.No.5,932,566(1999);Welch et al.,U.S.Pat.No.6,015,659(2000);Whitesell et al.,WO 94/08578A2(1994);Ho etal.,WO 00/03737A2(2000);Snader et al.,WO 02/36574A1(2002);Snader etal.,WO 02/079167A1(2002);Santi et al.,WO 03/013430A2(2003);Zhang etal.,WO 03/066005A2(2003);Omura et al.,JP 63-218620(1988);Schnur et al.,J.Med.Chem.,38:3806-3812,(1995);以及Schnur et al.,J.Med.Chem.,38:3813-3820,(1995);其以引用方式包含于本文。在本领域中为已知的11-O-甲基格尔德霉素化合物描述于U.S.Patent No.6,855,705,U.S.Patent No.6,887,993,与U.S.Patent No.6,870,049。
在一些组合物的实施方案中,所述分子伴侣抑制剂包括格尔德霉素类似物:
其中,R2为H、烷基、芳基或芳基烷基;R3为H、烷基;而R4为H、烷基、亚烷基、芳基、芳基烷基,ORd,其中Rd为H、烷基或芳基烷基。
在一些组合物的实施方案中,R2为H或烷基;R3为H、烷基;而R4为H或ORd,其中Rd为H、烷基。
在一些组合物的实施方案中,R2为H;R3为甲基;且R4为H。
源自间苯二酚(resorcinol)的Hsp90抑制剂
源自间苯二酚的化合物是Hsp90的潜在抑制剂。其包括基于4,5-二芳基异噁唑(4,5-diarylisoxazole)支架的化合物(参见,例如,Brough et al.,J.Med.Chem,2007)、基于3,4-二芳基吡唑(3,4-diarylpyrazole)支架的化合物(参见,例如,U.S.Patent No.7,247,734与Sharp et al.,Cancer Res.67(5):2206-16(2007))、以及基于3,4-二芳基吡唑间苯二酚HSP90抑制剂(CCTV018159)、酰胺间苯二酚化合物(例如,描述于International Publication No.WO/2006/117669)以及异噁唑间苯二酚化合物。亦参见Sharp et al.,MolCancer Ther.6(4):1198-1211(2007)(合成的有效间苯二酚吡唑/异噁唑酰胺类似物,例如,VER-49009及其对应的异噁唑VER-50589);Eccles et al.,CancerRes.68(8):2850-60(2008)(NVP-AUY922,新型间苯二酚噁唑酰胺热激蛋白90(HSP90)抑制剂);Barril et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.16(9):2543-2548(2006)(所述基于吡唑的Hsp90抑制剂CCT018159的哌嗪、吗啉代与哌啶衍生物)。
大环内酯类-Hsp90抑制剂
大环化合物根赤壳菌素与莫诺西林(monocillin),及其类似物例如环丙根赤壳菌素,是与Hsp90ATP结合位点结合的抑制剂。参见,例如,Turbyvilleet al.,J.Nat.Prod.,69(2):178-184(2006),Soga et al.,Curr.Cancer Drug Targets.3(5):359-69(2003),Shiotsu et al.,Blood.96(6):2284-91(2000)与U.S.Pat.No.7,115,651。KF25706,根赤壳菌素的新型肟衍生物,通过选择性消耗结合Hsp90的信号分子而在体内具有抗肿瘤的活性(Soga et al.,Cancer Res.59(12):2931-8(1999))。
亦已知包含根赤壳菌素与格尔德霉素结构组分的嵌合抑制剂,参见,例如,Hadden et al.,Curr.Top.Med.Chem.6(11):1173-82;Shen et al.,J.Org.Chem.71(20):7618-31(2006)。
Hsp90的嘌呤抑制剂
已报道所述嘌呤支架(scaffold)类的Hsp90抑制剂在癌症体外与体内模型中均为有效且具选择性,且该活性的结构基础亦已确定。参见Wright etal.,Chem.Biol.11(6):775-85(2004)。已合成数种8-芳基-磺酰腺嘌呤化合物,且显示其具有Hsp90抑制活性,例如,PU-H71与PU-H64,其与Hsp90的结构已经解析。参见Immormino et al.,J.Med.Chem.49(16):4953-60(2006)。其它嘌呤类Hsp90抑制剂在本领域为已知的,包括,例如,3,4-二芳基吡唑与相关类似物(McDonald et al.,Curr.Top.Med.Chem.6(11):1193-203(2006));吡唑嘧啶与相关类似物(U.S.Patent No.7,148,228);吡咯并嘧啶及其相关类似物(U.S.Patent No.7,138,402)以及2-氨基嘌呤类似物(U.S.PatentNo.7,138,401)。
Hsp60抑制剂
数种Hsp60抑制剂在本领域为已知的,包括epolactaene(Nagumo et al.,Biochem.J.387:835-840(2005);Tan and Negishi,Org.Lett.8(13):2783-2785(2006)与Nagumo et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters14:4425-4429(2004))与咪唑立宾(mizoribine)(优青糖苷(bredinin))(Itoh et al.,J.Biol.Chem.274:35147-35151(1999))。
HspA9(致死蛋白)抑制剂
MKT-077,具有针对癌细胞选择性毒性的阳离子若丹菁(rhodacyanine)染料,与HspA9/致死蛋白结合,并消除其与肿瘤阻抑蛋白p53的相互作用。参见,例如,Wadhwa et al.,Cancer Res.2000;60(24):6818-21。
其它抑制剂
对本发明为有用的分子伴侣抑制剂亦包括抑制Hsp60与亲环素D、Hsp90与亲合素D或TRAP-1与亲合素D之间相互作用的分子。这些抑制剂可鉴别自本领域的已知分子,或通过本文所述的方法存在于化学文库中;参见,例如,Meli et al.,J.Med.Chem.49:7721-7730(2006)与Howes et al.,Anal.Biochem.,350(2):202-213(2006)。举例而言,非肽小分子5-氨基咪唑-4-氨甲酰-1-beta-D-呋喃核糖苷(AICAR)鉴别为结构上新颖的Hsp90抑制剂(参见Meli et al.,2006,见上),且可用于本文所述方法。亦参见Blagg et al.,Med.Res.Rev.26(3):310-338(2005)。
III.线粒体穿透部分
本文描述了线粒体穿透性分子伴侣抑制剂。任何本文所述的分子伴侣抑制剂可通过使用本领域已知方法将其与线粒体穿透部分相联系进行修饰,其限定条件为:若所述伴侣抑制剂为牧羊犬蛋白或其活性片段,所述线粒体穿透部分不能为触角蛋白或其片段。下面给出示例。
如本文所用,线粒体穿透部分为与其相联系的,例如,通过化学方法结合的,分子伴侣抑制剂较之所述分子伴侣抑制剂本身,其线粒体定位增加的化学基团,例如,肽、拟肽或其它化合物。
肽线粒体穿透部分
在本文所述的组合物中,伴侣抑制剂(如本文所述)可附加于肽线粒体穿透部分。举例而言,可使用对应于见于触角蛋白第三个α螺旋的触角蛋白载体序列(Gratton et al.,Cancer Cell,4:31,(2003))。上述肽的示例序列为RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:18),在此称为ANT。其它本文所披露的伴侣抑制剂可附加于的目标肽的示例包括,但不仅限于,例如,来自HIV-1的TAT蛋白序列(Chen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:4325,(1999);Kelemen et al.,J.Biol.Chem.,277:8741-8748,(2002)),例如,RKKRRQRRR(SEQ ID NO:19)(Brooks et al.,Adv.Drug Del.Rev.,57(4):559-577(2005)),或者具有序列RKKRRORRRGC(SEQ ID NO:20)的修饰TAT(Barnett et al.,Inv.Ophth.Vis.Sci.,47:2589-2595(2006))。另一个示例包括来自单纯疱疹病毒的VP22蛋白(Lundberg and Johansson,Biochem.Biophys.Res.Comm.,291:367-371,(2002))与Pep-1蛋白载体(Morris et al.,Nature Biotech.,19:1173-1176,(2001))。在一些实施方案中,所述肽包括氨基酸D-异构体或其它修饰,例如,以改善其摄入或降低胞内降解。
包括肽线粒体穿透部分的多肽可通过标准技术,例如化学合成产生,或自编码所述多肽的核酸表达产生。
其它可能作为线粒体穿透部分为有用的片段包括,但不仅限于,见于位于线粒体蛋白的靶向线粒体的序列。靶向线粒体的序列的非限定性示例包括人类细胞色素c氧化酶亚基VIII的N端区域、人类ATP合酶c亚基P1同工型的N端区域或如U.S.Pat.App.20040072774所述的醛脱氢酶定位序列的N端区域,其以引用方式包含于本文中。举例而言,线粒体融合蛋白片段(人类线粒体融合蛋白1序列位于GenBank Acc.No.NP_284941.2,人类线粒体融合蛋白2序列位于GenBankAcc.No.NP_055689.1),例如,人类线粒体融合蛋白2的氨基酸97-757(参见U.S.Pat.No.6,953,680,以引用方式包含于本文中),作为靶向线粒体的序列在本发明中为有用的。
拟肽线粒体穿透部分
拟肽线粒体穿透部分亦可用于本文所述的组合物与方法。对拟肽的一般描述与其制造方法可见于上文。
举例而言,如包含于本文的Fernández-Carneado et al.J.Am.Chem.Soc.127(3):869-74,(2005)所描述的不可水解的四胍化合物,可用于现行组合物与方法。
靶向线粒体的信号肽
亦可使用将蛋白导向线粒体的片段。其示例包括RRIVVLHGYGAVKEVLLNHK(SEQ ID NO:41)、大鼠细胞色素P4502E1(CYP2E1)的氨基酸74-95(Neve and Ingelman-Sundberg,J.Biol.Chem.,276(14):11317-11322(2001));来自酵母细胞色素c氧化酶IV前体的可剪切预片段(MLSLRQDIRFFKPATRTLCSSR(SEQ ID NO:42),参见Maarse et al.,EMBO J.3(12):2831-2837(1984)与Hurt et al.,FEBS 178(2)306-310(1984));来自流感病毒PB2蛋白的靶向线粒体的肽(Carr et al.,Virology,344(2):492-508,(2006);含于血红素裂解酶的输入信号(Diekert et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(21):11752-11757,(1999));线粒体基质酶鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)(Horwich et al.,EMBO J.4(5):1129-1135,(1985).Hay et al.,Biochim.Biophys.Acta.779(1):65-87,(1984);Fujiwara et al.,Genome Inform.Ser.Workshop,Genome Inform.8:53-60,(1997)。
核酸线粒体穿透部分
可作为线粒体穿透部分作用的核酸(例如那些在以引用方式包含于本文中的U.S.Patent No.5,569,754中所描述的,例如,CCGCCAAGAAGCG(SEQ ID NO:21);GCGTGCACACGCGCGTAGACTTCCCCCGCAAGTCACTCGTTAGCCCGCCAAGAAGCGACCCCTCCGGGGCGAGCTGAGCGGCGTGGCGCGGGGGCGTCAT(SEQ ID NO:22);ACGTGCATACGCACGTAGACATTCCCCGCTTCCCACTCCAAAGTCCGCCAAGAAGCGTATCCCGCTGAGCGGCGTGGCGCGGGGGCGTCATCCGTCAGCTC(SEQ ID NO:23);或ACTTCCCCCGCAAGTCACTCGTTAGCCCGCCAAGAAGCGACCCCTCCGGGGCGAGCTG(SEQ ID NO:24))亦可用于本文所述的组合物与方法。将核酸与肽相连的方法在本领域为已知的。
亲脂阳离子线粒体穿透部分
作为线粒体穿透部分作用的亲脂阳离子描述于Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100(9):5407-12(2003),其以全文引用的方式包含于本文中。对本发明为有用的亲脂阳离子包括,例如,罗丹明123与膦盐,例如,甲基三苯基膦盐与四苯基膦盐。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分包括:
其中R1为H、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基或RaRbRcSi;Ra、Rb与Rc独立选自下组:烷基或芳基;且n可为0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分包括:
其中Ra、Rb与Rc独立选自下组:烷基或芳基;且n可为1、2或3。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分包括(芳基)3P-。
在一些实施方案中,所述阳离子线粒体穿透部分包括罗丹明123:
IV.连接部分
在一些实施方案中,所述线粒体穿透部分与分子伴侣抑制剂如本文所述通过接头相连。如本文所用,“连接”指将线粒体穿透部分与伴侣抑制剂通过共价或非共价键或关联连接。
不少接头可用于将伴侣抑制剂与线粒体穿透部分相连。举例而言,可使用肽接头,例如,包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多氨基酸的肽接头。在一些实施方案中,所述肽接头具有伸缩性,意即,包括可采取具有伸缩性构象的氨基酸,例如,包括甘氨酸、丙氨酸和/或谷氨酸残基。
在线粒体穿透部分与伴侣抑制剂均为肽的实施方案中,一般期望以包括或不包括插入接头的融合蛋白形式产生靶向线粒体的伴侣抑制剂,例如,使用编码全融合蛋白的核酸。
在一些实施方案中,所述接头部分为二价的,且可选自下组:亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚芳基、亚杂芳基与肽接头,其中所述亚烷基、亚烯基或亚炔基中任何两个相邻碳碳键可视需要(任选地)用一个或多个O、NH、S、PRe、C(O)NRf、亚芳基、亚杂环烷基或亚杂芳基所取代;其中Re与Rf独立选自烷基或芳基。
在一些实施方案中,所述连接部分为:
在一些实施方案中,所述连接部分为亚烷基。
在一些实施方案中,所述连接部分为具有六个碳原子的亚烷基。
一种类型的靶向线粒体的伴侣抑制剂通过将伴侣抑制剂交联于线粒体穿透部分产生。合适的交联剂包括那些具有两个由合适间隔物分开的迥异反应基团的异型双功能试剂(例如,m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟琥珀酰亚胺酯),或者同型双功能试剂(例如,辛二酸二琥珀酰亚胺(disuccinimidylsuberate))。上述接头可从Pierce Chemical Company,Rockford,Ill处获取。
对制造本文所述的组合物为有用的一般方法在本领域为已知的。在一些实施方案中,所述方法包括将线粒体穿透部分,例如本文所述的ANT,与接头,例如二硫键接头,如SSP,相接触以形成反应混合物,将反应混合物与伴侣抑制剂,例如格尔德霉素类似物,相接触,以获取包括与伴侣抑制剂相结合的线粒体穿透部分的组合物。在一些实施方案中,所述方法包括将所述线粒体穿透部分与一定量的接头相接触,使得反应混合物中接头与线粒体穿透部分的比例为大约1∶1。相应的,本发明以制备以下物质的方法为特征:线粒体穿透部分,例如本文所述的ANT,与伴侣抑制剂,例如格尔德霉素类似物如17-AAG相结合。
所述线粒体穿透部分与伴侣抑制剂可使用在本领域为已知的的重组方法通过合成接头相连,使其能够作为单一蛋白链制成;参见,例如,Bird etal.,Science,242:423-426(1988)与Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988))。
举例而言,本发明的伴侣抑制剂可与一个或多个线粒体穿透部分功能性的相连(通过化学成键、基因融合、非共价关联或其它)。
本文所述组合物包括具有下式的化合物:
其中R1为H、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基或RaRbRcSi;R2为H、烷基、芳基或芳基烷基;R3为H、烷基;R4为H、烷基、烯基、芳基、芳基烷基、ORd,其中Rd为H、烷基或芳基烷基;Ra、Rb与Rc独立选自下组:烷基或芳基;且n为1与10之间的整数,包含1与10,或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中,所述盐为六氟磷酸盐。
在一些实施方案中,R1为RaRbRcSi,Ra、Rb与Rc独立选自下组:烷基或芳基;R2为H;R3为H、烷基;R4为H;且n为1、2、3或4。
在一些实施方案中,所述化合物选自:
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中,所述化合物可为下式:
其中q为1、2、3、4、5或6;且X为药学上可接受的反荷离子。
在一些实施方案中,q为3。
在一些实施方案中,芳基为苯基。
在一些实施方案中,芳基为苯基且q为3。
在一些实施方案中,X可为六氟磷酸。
在一些实施方案中,所述化合物为:
合成方法
本文所述化合物可通过格尔德霉素或17-GMB-APA-GA类似物的结合反应制备。使用这些化合物中任一允许与亲核部分,例如硫醇、胺或醇结合。可进行阳离子线粒体穿透部分的加工以包括1个到10个之间的包括下列单体结构的胍部分:
其可缩略为下面显示了合成上述含寡聚胍结构化合物的一种通常迭代方法。可用乙酸钾(KSAc)处理甲磺酸(mesylate G1)以提供硫酯(thio ester),碱处理后暴露于分子伴侣抑制剂马来酰亚胺(maleimidederivative)衍生物(L-GA),例如格尔德霉素,之后的碱处理可提供所期望的第一代组合物G1-GA。所述G1-硫酯化合物可依以下顺序处理:例如,甲磺酸(methanesulfonic acid)处理;三丁基膦存在下碳酸铯(cesium carbonate)处理;继以G1处理并最终使用甲磺酸酐(methanesulfonic anhydride)处理以提供G1的高级同系物G2。容易看出,所述迭代过程可提供寡聚胍单元。在下面的实施例中阐述了一些化合物以说明该过程。尽管示于此处的概略是描述使用马来酰亚胺基团以促进结合的接头,该方法可延伸至具有其它结合功能性的接头,例如N-羟琥珀酰亚胺酯(如17-NHS-ALA-GA)。本领域技术人员亦可发现该迭代方案可延伸至其它非基于GA的Hsp90抑制剂,例如基于嘌呤的拮抗剂或间苯二酚拮抗剂。
V.治疗方法
本文所述的化合物,意即,靶向线粒体的伴侣抑制剂对治疗与不受控制的细胞增殖,如发生于肿瘤形成与癌症中的细胞增殖相联系的疾病为有用。在一些实施方案中,用本文所述方法治疗的肿瘤可与本文所述的癌症相联系。
一般而言,所述方法包括对需要,或经确定需要上述治疗的受试者施以治疗上有效量的本文所述的治疗化合物。
如在此背景下所用,“治疗”意为改善与不受控制的细胞增殖相联系的疾病至少一种症状。理想而言,治疗可导致所述增殖细胞的生物,或所述细胞(意即,所述癌或肿瘤细胞)增值率的下降。
“有效量”为足以造成有益或期望结果的量。举例而言,治疗量为取得期望治疗效果的量。该量可与预防上有效量,即需用以阻止疾病或疾病症状发作的量相同或相异。有效量可于一次或更多给药、施用或剂量中施与。组合物的治疗上有效量取决于所选组合物。
所述组合物可使用本领域已知方法,例如,肠外、口服、粘膜或其它给药方法系统性或局域性的施与,或两者皆是。如本领域技术人员应理解,给药途径应基于对特定病况治疗的适合性,以及组合物的组成加以选择。
所述组合物可自每天一次或多次到每周一次或多次施用,包括两天一次(once every other day)。技术人员应理解某些因素可影响需用于有效治疗受试者的剂量与时机,包括但不仅限于,疾病或病症的严重程度、之前的治疗、受试者总体的健康和/或年龄以及其它既有疾病。另外,使用治疗上为有效量的本文所述组合物治疗受试者可包括一次单独治疗或一系列的治疗。
本文所述的化合物对治疗肿瘤与癌症为有用。本文所述化合物可施用于诊断罹患癌症的患者,例如,任何本文提及类型的癌症。举例而言,所述靶向线粒体的伴侣抑制剂可用于治疗罹患选自下组一种或更多癌症或肿瘤的受试者:肺、乳房、上皮、大肠、直肠、睾丸、膀胱、胆囊、胆管、前列腺、结肠、胃、食道、胰、肝、子宫、卵巢或脑,但不仅限于此。在某些实施方案中,本文所述化合物对治疗急性骨髓性白血病、B类淋巴母细胞白血病、乳房腺癌、肺腺癌、前列腺腺癌、胶质母细胞瘤、结肠腺癌与子宫颈癌为有用。在其他实施方案中,本文所披露的靶向线粒体的伴侣抑制剂可用于治疗罹患血管瘤、何杰金氏病(Hodgkin’s disease)、大细胞非何杰金氏淋巴瘤、恶性淋巴瘤、白血病、真性红细胞增多症、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、嗜铬细胞瘤、软组织肉瘤、上颌癌、舌癌、唇癌、口腔癌、黑色素瘤或非黑色素皮肤癌(myelodysplastic syndrome with refractory anemia,neuroblastoma,glioma,pheochromocytoma,soft tissue sarcoma,maxillarycancer,lingual cancer,lip cancer,mouth cancer,melanoma,or non-melanomaskin cancer)的受试者,但不仅限于此。一般而言,可用本文所述化合物与候选化合物治疗的癌症包括但不仅限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病或种系细胞肿瘤。在优选实施方案中,本文所述化合物可施用于诊断罹患子宫颈癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、上皮细胞癌、结肠直肠癌、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、髓细胞性白血病与白血病性单核细胞淋巴瘤的患者。
给药与服药
上述化合物的毒性与治疗有效性可通过标准医药学过程在细胞培养或实验动物中确定,例如,确定LD50(50%种群的致死量)以及ED50(50%种群有治疗效果的剂量)。毒性与治疗效果间剂量的比例为治疗指数,且可表达为比例LD50/ED50。优选显示高治疗指数的化合物。尽管可使用显示毒性副作用的化合物,需留意设计将该化合物定位于作用组织,例如骨或软骨的给药系统,从而使对未感染的细胞的潜在伤害减至最小,从而减少副作用。
自细胞培养分析与动物研究所得的数据可用于查明在人类中使用的剂量范围。上述化合物的剂量优选位于包含其LD50为微毒或无毒的循环浓度范围。所述剂量可在此范围内根据使用的给药形式与给药途径而变动。对任何用于本发明方法的化合物,其治疗上有效量可预先通过细胞培养分析加以预计。可在动物模型中计算出达到循环血浆浓度范围为包括在细胞培养中确定的IC50(意即,达到最大化症状抑制效果一半的测试化合物浓度)的剂量。上述信息可用于更准确的确定在人类中为有用的剂量。血浆水平可通过,例如,高效液相色谱来测量。
技术人员应理解某些因素会影响需用于有效治疗患者的剂量与时机,包括但不仅限于所治疗患者的类型、疾病或病症的严重程度、之前的治疗,患者总体的健康和/或年龄以及其它既有疾病。另外,使用治疗上为有效量的蛋白、多肽、抗体或其它化合物治疗患者可包括一次单独治疗,或优选一系列的治疗。
若所述化合物为小分子,示例性的剂量包括每千克受试者或试样重量毫克或微克量的小分子(例如,大约每千克1微克到大约每千克500毫克,大约每千克100微克到大约每千克5毫克,大约每千克1微克到大约每千克50微克)。应进一步理解小分子的适当剂量取决于所述小分子调节表达或活性的有效性。当这些小分子中的一个或多个施用于动物(例如,人类)以调节本发明多肽或核酸的表达或活性时,医生、兽医或研究者可,例如,首先给予较低剂量的处方,随后增加剂量直至获得适当的反应。另外,应理解对任何特定动物受试者的特定剂量水平应取决于多种因素,包括所用特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、总体健康、性别及其食谱、给药时间、给药途径、排泄率、任何组合用药以及所调节的表达或活性程度。
鉴别治疗用的受试者
在一些实施方案中,所述方法包括(i)鉴别并选择罹患癌症的个体,并视需要(ii)确定该个体的癌细胞是否在线粒体中表达高水平的Hsp90伴侣。若这些细胞在线粒体中表达高水平的Hsp90伴侣,则所述个体为使用靶向线粒体的伴侣抑制剂治疗的候选者,意即,可选用于此目的,且所述方法进一步包括(iii)对所述个体施以包含靶向线粒体的伴侣抑制剂的组合物。
罹患癌症的个体可使用本领域已知方法鉴定,例如,因为其表现症状或作为筛选的结果。可实施附加的临床测试以确证所述诊断,所述测试包括但不仅限于,验血,X-射线,CT扫描,内镜检查术以及活组织取样的组织学检查。
个体中癌症症状包括但不仅限于,非正常的肿块与隆起,出血,疼痛和/或溃疡,淋巴结肿大,咳嗽与咯血,肝肿大(肿大的肝脏),骨疼痛,受侵袭的骨骨折以及神经学症状,体重减少,食欲减退与恶病质(肌肉消瘦),过度流汗,以及贫血。
罹患癌症的个体可使用本领域已知方法鉴别出,例如,因为其显示症状或作为筛选的结果。可进行其它临床测试,包括但不仅限于,自检、乳房X线照片、胎儿潜血测试、子宫颈细胞检测(例如,阴道宫颈涂片Papsmear)、直肠指检、前列腺特异性抗原(PSA)血液测试、乙状结肠镜检(digitalrectal exam,prostate specific antigen(PSA)blood testing,sigmoidoscopy),其在直肠与结肠下部寻找肉眼可见的异常,以及结肠镜检,其允许视觉检查直肠与整个结肠,以及双重对比钡剂灌肠法(DCBE),其允许对直肠与结肠的放射照相检查。
不少在线粒体中检测高水平伴侣的方法在本领域为已知的,包括免疫测定法,例如,使用针对Hsp90的抗体。举例而言,在线粒体中检测伴侣可通过获取线粒体与亚线粒体组分,继以使用已知检测方法,例如比对粒体组分的Western blotting、使用针对Hsp90抗体的免疫电子显微镜以及基质协助激光解吸电离(MALDI)蛋白组学(例如,质谱与飞行时间分析)等方法来达成。
本文披露了鉴别为用伴侣抑制剂治疗的候选者的个体的其它方法。在这些方法中,来自个体的癌细胞(i)暴露于靶向线粒体的伴侣抑制剂,并(ii)分析是否存在一个或多个下列活性:细胞死亡增加、细胞存活率丧失、线粒体膜完整性丧失(例如,Smad或细胞色素c释放)与Hsp90伴侣活性丧失(例如,Akt激酶降解)。进行这些分析的方法在本领域为已知的,且包括流式细胞计数、MTT分析、凝胶电泳以及Western blotting。本文实施方案亦描述了示例性的方法。
若所述癌细胞显示一种或更多这些活性,则将所述个体归类于用靶向线粒体的伴侣抑制剂治疗的候选者。在其他新方法中,来自相同个体的癌细胞置于培养基中。将部分所述癌细胞与靶向线粒体的伴侣抑制剂相接触,并在允许所述细胞增殖的条件下培养。若所述靶向线粒体的伴侣抑制剂抑制所接触的癌细胞增殖和/或诱导其细胞凋亡,例如,相对于未与抑制剂接触的细胞,则所述个体为用靶向线粒体的伴侣抑制剂治疗的候选者。
VI.药物组合物
本文所述靶向线粒体的伴侣抑制剂(其皆可在本文中称之为“活性化合物”)可包含于药物组合物中。上述组合物通常包括所述活性化合物与药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可包括溶剂、分散介质、涂覆物、抗菌及抗真菌剂、等渗剂与延迟吸收剂,以及类似物,只要与医药施与相容。补充性的活性化合物亦可包含于所述组合物中。亦包含药物组合物自身,以及本文所述化合物药学上可接受的盐。在药学领域众所周知添加药学上活性氨基化合物无毒的加成盐与其游离碱在活性上并无差异。
药学上可接受的盐包括酸与碱加成盐两者。“药学上可接受的盐”指那些保留游离碱生物学有效性与特性的,以及并非生物学或其它方面不受欢迎的盐。合适的药学上可接受的酸加成盐可用无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似物,以及有机酸例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、安息香酸、苯乙烯酸、苦杏仁酸、甲磺酸以及p-甲苯磺酸(acetic acid,propionic acid,glycolic acid,pyruvic acid,fumaric acid,tartaric acid,citric acid,benzoic acid,cinnamic acid,mandelic acid,methanesulfonic acid,and p-toluenesulfonic acid)及类似物来形成。
药学上可接受的碱加成盐包括那些源自无机碱的,例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐以及类似物。特别优选铵、钾、钠、钙与镁盐。源自药学上可接受的有机无毒碱包括伯胺、叔胺、仲胺、取代胺,包括天然出现的取代胺、环胺的盐,以及碱性例子交换树脂,例如异丙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、奴弗卡因(procain)、海巴明(hydrabamine)、胆碱(choline)、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基还原葡萄糖胺(betaine,ethylenediamine,glucosamine,methylglucamine)、可可碱(theobromine)、嘌呤、哌嗪、哌啶、多胺树脂及类似物。特别优选的有机无毒碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺与二环己胺。
药物组合物通常配制为与其预期的给药途径相容。给药途径的示例包括非消化道,例如静脉内、皮内、皮下,口腔(例如,吸入)、经皮(局部)、头粘膜以及直肠给药。用于非消化道、皮内或皮下施用的溶液或悬浊液可包括下列成分:用于注射的无菌稀释液,例如水,盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成溶剂;抗菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯(methyl parabens);抗氧化剂,例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠(sodiumbisulrite);螯合剂,例如乙二胺四乙酸;缓冲液,例如乙酸、柠檬酸或磷酸以及调节渗透压的试剂,例如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱调节,例如盐酸或氢氧化钠。非消化道制备物可封装于安瓿瓶、一次性注射器或多个玻璃或塑料制的剂量瓶。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性时)或分散液,以及无菌粉末以临时制备无菌注射溶液或分散液。为静脉内给药,合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,所述组合物必需为无菌的,且应为足以方便的进行注射的流体。其在生产与储藏条件下应为稳定的,且必须在阻止微生物,例如细菌与真菌沾染的情况下保藏。所述载体可为溶液或分散介质包括,例如,水、乙醇、多醇(例如,乙二醇、丙二醇以及液体聚乙二醇,以及类似物),以及其合适的混合物。其合适的流动性可通过,例如使用如卵磷脂的包衣,通过保持分散时所需的颗粒大小,以及通过使用表面活性剂来保持。可通过多种抗菌与抗真菌剂,例如,氨基甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)与类似物来阻止微生物的作用。在许多情况下,优选在组合物中包含等渗剂,例如,蔗糖、多醇例如甘露醇与山梨醇、氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂,例如单硬脂酸铝或明胶,以延长注射组合物的吸收。
可通过在合适溶剂中包含所需量的活性化合物与,视需要上面列举的成分中一种或组合,继以过滤除菌,以制备无菌的注射溶液。一般而言,通过将所述候选化合物包含于含有碱性分散媒介的无菌溶剂载体以及所需的其它上面列举的那些成分以制备分散液。对于为制备无菌注射溶液的无菌粉末,优选制备方法为真空干燥以及冻干,其产生所述活性成分加上来自之前其过滤除菌溶液中任何其它所期望的成分。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为达口服治疗给药的目的,可包含候选化合物与赋形剂,并使用片剂、含片或胶囊,例如明胶胶囊的形式。口服组合物亦可使用流质载体制备以用作漱口液。可作为组合物一部分包含药学上相容的结合剂,和/或佐剂材料。所述片基、丸剂、胶囊、含片与类似物可包含任何下列成分,或类似性质的化合物:粘合剂,例如微晶纤维素、树胶或凝胶;赋形剂,例如淀粉或乳糖;崩解剂,例如海藻酸、PRIMOGEL或玉米淀粉;润滑剂例如硬脂酸镁或STEROTES;助流剂例如胶质二氧化硅;甜味剂例如蔗糖或糖精;或调味剂,例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味剂。
为吸入给药,所述化合物以来自含有合适推进剂,例如如二氧化碳的气体,的加压容器或分配器,或喷雾器的气溶胶的形式给药。
系统给药亦可通过经粘膜或经皮方法。对经粘膜或经皮给药,在配制物中使用适于需渗透的穿透剂。上述穿透剂在本领域为周知的,且包括,例如,对经粘膜给药,去污剂、胆盐以及褐霉酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜给药可通过使用鼻腔喷雾或栓剂达成。对经皮给药,如本领域周知的,将化学化合物配制为软膏、油膏、胶与乳膏。尽管申请者不愿拘于理论,系统性施与的靶向线粒体的伴侣抑制剂的任何非特异性细胞毒作用期待为最小限的,其原因至少如下:在多数正常组织中Hsp90与TRAP1的线粒体水平较低;如本文所说明,Hsp90与TRAP-1的线粒体定位通常为肿瘤细胞特异性的,因此所述抑制剂将优先积聚于肿瘤细胞的线粒体中;在那些具有线粒体定位的Hsp90与TRAP-1的正常组织中,Hsp90与TRAP-1的活性相对于肿瘤细胞中的活性为低;而且,应期望血脑屏障会保护脑。
所述化合物亦可以栓剂的形式制备(例如,使用传统栓剂基底,例如可可油与其它甘油酯)或直肠给药用的保留灌肠法。
在一个实施方案中,所述候选化合物与保护该化合物不受从体内迅速消除的载体,例如控制释放组分,包括植入物与微囊给药系统一起制备。可使用生物可降解的、生物相容的多聚物,例如乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、聚酐、聚羟乙酸、胶原蛋白、聚原酸酯以及聚乳酸(ethylene vinyl acetate,polyanhydrides,polyglycolic acid,collagen,polyorthoesters,and polylacticacid)。制备上述配制物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。所述材料亦可市购自Alza Corporation与Nova Pharmaceuticals,Inc.。脂质体悬浮液(包括使用针对病毒抗原的单克隆抗体定位于感染细胞的脂质体)亦可作为药学上可接受的载体使用。其可根据本领域技术人员所知的方法制备,例如,描述于U.S.Patent No.4,522,811中的。
将口服或非消化道组合物配置为单位剂量的形式以方便给药并均一化剂量是有利的。本文所使用的单位剂量形式指组装对所治疗受试者为单一剂量的物理上分离的单元;每个单元包含经计算与必需的医药载体一同产生所期望治疗效果的预决量的活性化合物。
编码本文所述多肽的核酸分子可插入载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可通过,例如,静脉内注射、局部给药(参见,例如,U.S.Patent5,328,470)或立体定向注射(参见,例如Chen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3054-3057,(1994))给药。所述基因治疗载体的医药制备物可包括在可接受稀释剂中的基因治疗载体,或可包括其中包埋了基因给药载体的缓释基质。另外,当整个基因给药载体可从重组细胞完整的产生时,例如,逆转录病毒载体,所述医药制备物可包含一个或多个产生所述基因给药系统的细胞。
修饰,例如脂化,可用于稳定化蛋白并增强摄入与组织穿透。脂化的方法描述于Cruikshank et al.,J.Acquired Immune Deficiency Syndromes andHuman Retrovirology,14:193,(1997)。
药物组合物可以和服药说明一起包括在容器内,包装,或分配器中。
VII.核酸
编码本文所述基于肽靶向线粒体的伴侣抑制剂的核酸亦包括在现行披露的范围之内。
为本发明一部分的核酸可编码任何由本文披露方法鉴别的肽,只要其结合于并抑制线粒体Hsp90分子伴侣,例如Hsp90和TRAP-1。本发明公开的核酸还包括编码修饰模式的肽的核酸,所述肽结合并抑制线粒体Hsp90分子伴侣,例如翻转肽、与线粒体穿透序列连接的肽、与异源多肽序列连接的肽、与细胞内摄序列连接的肽以及与线粒体穿透序列连接的翻转肽。
在一些实施方案中,所述核酸编码用于基因疗法的靶向线粒体的分子伴侣抑制剂。
本文所披露的核酸包括RNA与DNA两者,包括自细胞分离的重组DNA与合成(例如,化学合成)DNA。核酸可为双链或单链的。核酸可使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如,次黄苷或磷硫酰核苷酸(phosphorothioatenucleotides))合成。上述寡核苷酸可用于,例如,制备具有对核酸酶增加抗性的核酸。
现行发明亦包括遗传构建体(例如,载体与质粒),所述构建体包括编码本文所述的靶向线粒体的伴侣抑制剂可操纵的连接于使该靶向线粒体的伴侣抑制剂表达成为可能的转录和/或翻译序列,例如,表达载体。选定的核酸,例如,编码本文所述肽的选定DNA分子,在满足下述条件时,称为与另一个核酸分子“可操纵的连接”,即当其或者邻近该其它分子或在同样或其它位置使得该其它分子可指导所述选定核酸的转录和/或表达。
本发明亦包括各种工程改造的细胞,例如,转化的宿主细胞,其包括,并视需要表达,本文所披露的核酸。原核与真核细胞,例如,哺乳类细胞(例如,肿瘤细胞)、酵母、真菌以及细菌(例如大肠杆菌),以及原生与转化细胞,可为宿主细胞。许多合适的细胞在本领域为已知的。
VIII.筛选方法
本文描述了鉴别候选化合物的方法,所述化合物可以举出小分子有机或无机分子(例如,具有小于1000Da的分子量)、寡肽、寡核苷酸、碳水化合物以及对本文所述治疗方法为有用的抗体为例。在一些方法中,候选化合物根据其结合伴侣,例如,Hsp90或TRAP-1的能力进行筛选。在一些方法中,候选化合物根据其结合亲环素D的能力进行筛选。在一些方法中,候选化合物通过计算方法使用计算机进行筛选(例如,如实施方案12所述,为鉴别期待其与Hsp90结合的候选化合物,例如,Hsp90的脱辅基(apo-open)形式)。化学结构文库在本领域为已知的。
这些候选化合物可视需要与本文所述的线粒体穿透部分连接(通过共价或非共价相互作用)。在一些方法中,候选化合物根据其抑制亲环素D与伴侣,例如,Hsp90或TRAP-1的能力进行筛选。在一些方法中,候选化合物根据其定位于线粒体的能力进行筛选。在一些方法中,候选化合物根据其诱导细胞死亡的能力进行筛选。
测试化合物文库
在有些实施方案中,使用测试化合物文库筛选可用于治疗癌症的候选化合物。如本文所使用的“测试化合物”可为任何化学化合物,例如,大分子(例如,多肽、蛋白复合物、糖蛋白或核酸)或小分子(例如,氨基酸、核苷酸、有机或无机化合物)。测试化合物可具有小于10000克每摩尔、小于000克每摩尔、小于1000克每摩尔或小于500克每摩尔的化学式量。所述测试化合物可为天然出现的(例如,草药或天然产物)、合成的,或可包含天然与合成化合物两者。测试化合物的示例包括肽、拟肽(例如,类肽)、氨基酸、氨基酸类似物、多聚核苷酸、多聚核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物以及有机或无机化合物,例如,杂有机化合物或有机金属化合物。
测试化合物可单独或平行进行筛选。平行筛选的示例包括对大型化学文库的高通量药物筛选。可生成上述候选化合物文库,亦可从,例如,Chembridge Corp.,San Diego,CA购入。文库可设计为涵盖歧异范围的化合物。举例而言,文库可包含500、1000、10000、50000或100000或更多化合物。在有些情况下,文库包含增加具有抗癌活性可能的化合物类。增加具有抗癌活性可能的化合物类包括已知的伴侣抑制剂以及结构上类似的化合物。举例而言文库可包含安莎霉素抗生素、格尔德霉素类似物以及吡唑嘧啶以及相关类似物。文库可设计与合成为涵盖上述化合物类。
已综述了组合文库的合成(参见,例如Gordon et al.,J.Med.Chem.,37:1385,(1994);DeWitt and Czarnik,Acc.Chem.Res.,29:114,(1996);Armstrong et al,,Acc.Chem.Res.,29:123-131,(1996);Ellman,J.A.,Acc.Chem.Res.,29:132,(1996);Gordon et al.,Acc.Chem.Res.,29:144,(1996);Lowe,G.Chem.Soc.Rev.,309,(1995),Blondelle et al.,Trends Anal.Chem.,14:83,(1995);Chen et al.,J.Am.Chem.Soc.,116:2661,(1994);U.S.PatentsNos.5,359,115,5,362,899与5,288,514;以及PCT Publication Nos.WO92/10092,WO93/09668,WO91/07087,WO93/20242,与WO94/08051)。
化合物文库可根据多种方法制备,其中部分在本领域为已知的。举例而言,混合均分(split-pool)策略可通过下列方法实施:功能化多聚体支持的珠置于多数反应容器中;多种适于固相肽合成的多聚体支持为已知的,且其中一些为可市购的(例如,参见,如Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,2nd edition,Springer-Verlag,Berlin(1993))。对每个珠等分试样添加不同激活氨基酸溶液,并允许反应继续以产生多数固化氨基酸,每个容器一种。衍生化珠的等分试样随即经漂洗,储藏(pool),而所述珠的储备再次分割,每个等分试样置于不同的反应容器中。随即添加另一种激活氨基酸于每个珠等分试样。反复该合成循环直至获取所期望的肽长度。每个合成循环所添加的氨基酸残基可随机选取;或者,可选择氨基酸以提供存偏见的文库,例如,该文库中部分抑制剂的选择为非随机性,例如,提供这样的抑制剂,即其与已知与抗体相互作用的肽具有已知结构类似性或同源性,例如,抗个体基因型抗体抗原结合位点。应了解广泛范围的肽、拟肽或非肽化合物可方便的用此方法生成。
所述混合均分策略可导致获得肽,例如调节子的文库,其可用于制备用于本文所述筛选的测试化合物文库。在另一个用作说明的合成中,通过DeWitt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6909,(1993)所述的方法构建了diversomer文库。其它合成方法,包括描述于Houghten et al.,Nature,354:84,(1991)的所谓“茶包(tea-bag)”技术,亦可用于合成根据本主题发明的化合物文库。
可筛选化合物文库以确定该文库任何成员是否具有针对伴侣,例如,Hsp90或TRAP-1的抑制活性,以及,若确为此,则鉴别所述抑制剂。已描述了筛选组合文库的方法。参见,例如,Gordon et al.,J.Med.Chem,见上。可筛选可溶化合物文库以分离针对伴侣,例如,Hsp90或TRAP-1的抑制剂,继以通过常规技术(例如,质谱、NMR或类似方法)鉴别所述分离配体。筛选如本文所述。
筛选
本文提供了鉴别治疗肿瘤或癌症候选化合物的方法。关于涉及的生物学机理,尽管申请者不愿拘于任何特定理论,但认为上述化合物在线粒体中抑制伴侣,从而抑制伴侣介导的对亲环素D(CypD)功能的拮抗。亲环素D为诱导线粒体性细胞死亡的亲免疫因子,且认为伴侣通过蛋白折叠/重折叠机理拮抗CypD的功能。使用导向线粒体的新型Hsp90 ATPase拮抗剂使该通路无用化导致线粒体功能的突然崩溃与选择性的肿瘤细胞死亡。因此,伴侣是线粒体完整性的新型调节剂,且其细胞器特异性的拮抗剂可提供新类型的有效抗癌剂。
在有些实施方案中,筛选在线粒体中具有抑制伴侣能力的化合物可包含从一组测试化合物中鉴别那些(i)抑制和/或结合分子伴侣的,(ii)抑制分子伴侣与亲环素D之间相互作用的,和/或(iii)减少肿瘤细胞线粒体中伴侣水平的。显示(i)、(ii)或(iii)中一种或更多活性的测试化合物在本文中称为“候选化合物”。筛选分析可视需要包括进一步根据其在体外或体内调节癌细胞增殖的能力测试候选化合物。现行发明的筛选分析可在全细胞制备物和/或在体外无细胞系统中实施。在一些实施方案中,测试化合物或候选化合物连接于线粒体穿透部分。
测试化合物与包括伴侣蛋白的无细胞试样的结合可在体外通过下述方法检测,即,例如,将所述伴侣蛋白可逆或不可逆的固化于底物上,例如板(例如,96孔聚苯乙烯微滴定板)中的孔壁上。举例而言,微滴定板可被以伴侣蛋白或其片段,经漂洗与封闭(例如,用BSA)以阻止测试化合物对板的非特异性结合。随即所述伴侣蛋白与板交联。在多种条件下(例如,在37℃下0.5-12小时)将测试化合物添加于经涂覆的板。所述板可随即经润洗,且所述测试化合物与所述伴侣蛋白的结合可通过多种本领域已知方法中任一检测。举例而言,特异性的与所述伴侣蛋白结合的抗体可用于免疫分析。若期望,所述抗体可经标记(例如,用荧光或放射性同位素)并直接检测(参见,例如,West and McMahon,J.Cell Biol.,74:264,(1977))。此外,可使用二次抗体进行检测(例如,与抗伴侣蛋白抗体结合的标记抗体)。与所述伴侣蛋白结合的测试化合物可通过其抑制抗体与固化伴侣蛋白结合的能力进行检测。在另一种检测方法中,该测试化合物经标记(例如,通过放射性同位素、荧光团、生色团或类似物),且测试化合物与所述伴侣蛋白的结合通过检测固化于底物的标记来进行检测。
还在另一个实施方案中,测试化合物固化于底物,例如,于如上所述的微滴定板,与包含伴侣蛋白(或其片段)的无细胞试样温育,漂洗,且检测所述伴侣蛋白结合固化测试化合物的能力。举例而言,Hsp90(或其片段)可作为与可光学上检测的蛋白,例如,绿色荧光蛋白或其变体(其可在紫外线下检测出来)的融合蛋白产生,且检测所述融合蛋白结合测试化合物的能力。或者,伴侣蛋白可作为与具有可检测酶活性的酶,例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶的融合蛋白产生。编码所有这些酶的基因已经克隆,且对于技术人员而言是可得以使用的。如期望,所述融合蛋白可包含抗原,其可由多克隆或单克隆抗体使用常规方法检测并测定。合适的抗原包括酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶与-半乳糖苷酶)与非酶多肽(例如,血清蛋白,例如BSA与球蛋白,以及乳蛋白,例如酪蛋白)。在这些方法中,检测了伴侣融合蛋白结合于测试化合物的能力。
为鉴别与伴侣蛋白结合的多肽,可使用蛋白/蛋白相互作用的双杂交分析(参见,例如,Chien et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578,(1991);Fieldset al.,U.S.Pat.No.5,283,173;Fields and Song,Nature,340:245,(1989);LeDouarin et al.,Nucleic Acids Research,23:876,(1995);Vidal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:10315-10320,(1996);以及White,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:10001-10003,(1996))。实施多种双杂交方法的试剂盒是可市购的(例如,自Clontech;Palo Alto,CA)。
在有些其它实施方案中,伴侣蛋白或其片段与测试化合物的相互作用通过或者与所述伴侣蛋白或者与所述测试化合物共价相连的供体荧光团同与所述伴侣蛋白或者与所述测试化合物共价相连的受体荧光团之间的荧光共振能量转移(FRET)进行测试,其中所述受体与供体荧光团并非均与所述伴侣蛋白或者与所述测试化合物连接,且供体发射光谱与受体激发光谱有合适的重叠以在荧光团通过伴侣蛋白-测试化合物相互作用而彼此靠近时提供有效的非放射性能量转移。
在一些方法中,作为治疗肿瘤或癌症候选化合物的测试化合物可通过将测试化合物与包含一个或多个伴侣蛋白与CypD的试样结合,并随即根据伴侣与CypD之间相互作用减少进行筛选。在一个实施方案中,使用无细胞系统以确定重组TRAP-1或重组Hsp90是否与重组CypD在测试化合物存在情况下共免疫沉淀。
在一些方法中,将作为治疗肿瘤或癌症候选化合物的测试化合物可与一种或更多肿瘤细胞进行接触,并衡量所述伴侣表达的减少。在与之相关的方法中,将一种或更多测试化合物与表达重组伴侣的肿瘤细胞接触,且衡量该细胞中所述重组伴侣表达的减少。伴侣的表达可通过,例如Northernblot、RT-PCR分析、RNAse保护分析、Western blot、酶联免疫吸收分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)与荧光激活细胞分选(FACS)进行测定。在所述测试化合物存在情况下的表达水平,较之其不存在时情况下的表达水平,将指明所述测试化合物是否抑制所述伴侣的表达。在一个实施方案中,测试化合物为小分子干扰RNA(siRNA)。
既已鉴别出测试化合物作为候选化合物,所述候选化合物可进一步的进行测试,例如,在使用体外或体内模式系统的肿瘤细胞增殖分析中。体外增殖分析包括将候选化合物与肿瘤细胞培养,例如,Raji细胞相接触,并衡量所述候选化合物在培养细胞中诱导细胞凋亡和/或阻止其增殖的能力。体内肿瘤分析包括将候选化合物施与动物模型,例如,罹患癌症或具有产生癌症素因的啮齿类,并随后衡量所述候选化合物在所述动物中抑制肿瘤发育或肿瘤增殖的能力。癌症动物模型的示例包括具有异种移植癌细胞的动物。其它动物模型包括具有产生癌症基因素因的啮齿类,例如,具有下述突变形式的小鼠:(1)结肠腺瘤性息肉病基因(APC)(例如,多处肠道瘤形成(APCMin)小鼠(参见,例如,Haigis et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,101:9769-9773,(2004)),(2)mut-s homologue-2(Msh2)基因(参见,例如,Kohonen-Corish et al.,Cancer Research,62:2092-2097,(2002)),以及/或者(iii)MutL homologue1(Mlh1)基因(参见,例如,Cohen et al.,Cell,85:1125-1134,(1996))。C57BL/6J-ApcMin小鼠可自Jackson Harbor Labs(Bar Harbor,ME)获取。另外,可将动物模型暴露于致癌化学物,例如二甲肼衍生物或杂环胺,例如2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]并吡啶(PhIP),有报道其在动物模型中诱导肿瘤。
在一些方法中,治疗肿瘤或癌症的候选化合物可进一步根据其细胞凋亡诱导活性进行测试,即通过将所述候选化合物与包含一种或更多肿瘤细胞的试样相接触,并随即测试细胞存活率的减少的方法。在一个实施方案中,使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)还原分析测定细胞存活率的减少。所述由Mossman(J.Immunol.Methods 65:55-63(1983))开发的色度法MTT分析,是基于水溶性MTT向不溶性紫色甲月替(formazan)的转换。随即将甲月替溶解,并用其570nm处的吸光度确定其浓度。所述方法可根据Plescia et al.(Cancer Cell.2005May;7(5):457-68)中所述进行。亦可使用其它存活率分析。
在一些方法中,治疗肿瘤或癌症的候选化合物可进一步进行测试,即通过将测试化合物与包含一种或更多肿瘤细胞的试样相接触,并随即筛选细胞凋亡增加的方法。在一个实施方案中,通过DEVDase水解确定胱天蛋白酶活性增加,从而细胞凋亡的增加是明显的。测量细胞凋亡的方法在本领域为众所周知的。
在一些方法中,治疗肿瘤或癌症的候选化合物可进一步根据其破坏线粒体膜完整性的能力进行测试。举例而言,候选化合物可进一步根据其诱导线粒体膜电势变化、增加细胞色素c释放或增加Smad释放的能力进行测试。在一个实施方案中,用候选化合物处理细胞,并进一步用线粒体膜电势敏感性荧光染料JC-1处理细胞,并通过流式细胞计数分析绿/红荧光的变化。
在一些方法中,治疗肿瘤或癌症的候选化合物可进一步根据其抑制伴侣活性的能力进行测试。举例而言,候选化合物可进一步根据其诱导Hsp90对象蛋白,Akt降解的能力进行测试。
医药化学
一旦鉴别出有兴趣的化合物(或试剂),可使用医药化学的标准原理以产生该化合物的衍生物。可根据药学特性,例如,效力、药动力学、稳定性、溶解度与清除率的改善来筛选衍生物。在上述分析中导致化合物活性的部分可通过如本领域通行的检查结构-活性关系(SAR)来把握。医药化学领域的一般技术人员可修饰候选化合物或试剂(意即,先导化合物)的部分并测量所述修饰对所述化合物或试剂效力的作用从而产生增加有效性的衍生物。举例而言,残基Nagarajan et al.,J.Antibiot.,41:1430-1438,(1988)。进一步,若所述化合物(或试剂)的生物化学靶为已知或已确定的,所述靶与化合物的结构可为衍生物的设计与优化提供信息。为此目的的分子建模软件为可市购的(例如,自Molecular Simulations,Inc.)。
实施例
本发明在下述实施例中进一步得到描述,其并非限定描述于权利要求中的本发明的范围。
实施例1:线粒体中的Hsp90伴侣
该实施例中描述的实验是为确定伴侣TRAP-1与Hsp90的亚细胞位置而设计的。
针对TRAP-1的抗体在分离自多种肿瘤细胞类型的纯化线粒体中检测到强烈的~75kDa免疫反应性条带(图1A)。该位置是选择性的,这是因为TRAP-1仅以极低水平见于分离自正常小鼠组织的线粒体(图1A),并不存在于肿瘤或正常细胞的细胞溶胶中(图1A,与未显示数据)(Chen et al.,Mol.Cell.Biol.,16:4691-4699,(1996))。检查了原生肿瘤样本与其对应的体内正常组织间的TRAP-1差异表达。根据免疫组织化学,TRAP-1在下列位置腺癌肿瘤细胞中强烈表达:胰(图1C)、乳房(图1E)、结肠(图1G)与肺(图1I)。相反,正常胰(图1B)、乳房(图1D)、结肠(图1F)与肺(图1H)的上皮所含TRAP-1的水平极低,另外IgG并不使正常或肿瘤组织染色(未显示)。
除其已知的细胞溶胶(cytosol)内位置外,在多种肿瘤细胞类型线粒体中通过Western blotting检测到了Hsp90的充足储备(图1J)。相应的,根据电子显微镜观察,针对Hsp90抗体标记分离自HeLa细胞的纯化线粒体(26.6±4.1金颗粒/线粒体,n=13)(图1K),而IgG并不显著使线粒体染色((1.1±0.33金颗粒/线粒体,n=13;p<0.0001)(图1L)。线粒体如下所述鉴定。纯化自HeLa细胞的线粒体组分(级分(fraction))含有TRAP-1与Hsp90,但无来自内质网(钙联接蛋白),或细胞溶胶(GAPDH)的蛋白,仅具有极低量的溶酶体标记Lamp-1(图1M)。分离线粒体活跃的摄入Hsp90。35S标记体外转录与翻译的Hsp90蛋白在经蛋白酶K处理后迅速的聚集于分离脑线粒体内,且该反应被解偶联剂缬氨霉素完全抑制(图2A)。使用35S标记线粒体磷酸载体,PiC作为线粒体摄入(import)对照,获得了相似的结果(图2A)。
为确定Hsp90是否在体内定位于线粒体,对自原生睾丸、肺、脾、肾、脑与肝细胞获取的线粒体提取物进行了免疫印迹。这些免疫印迹显示Hsp90在原生细胞的线粒体中以低水平表达(图8)。用蛋白酶K降解外膜蛋白,包括Bcl-2,并不减少分离线粒体中Hsp90的反应性(图8),表明其受保护不受蛋白水解影响。
相反,使用毛地黄皂苷渗透外膜导致Hsp90自线粒体沉淀至上清的浓度依赖性释放,而与基质相联系的mt-Hsp70则不受影响(图2B)。在蔗糖不存在情况下,机械破坏外膜使Smac从线粒体间膜空间中彻底排空,但并不影响与基质相联系的亲环素D(CypD)(图2C)。尽管此处理降低Hsp90反应性,大量Hsp90反应性仍保持与线粒体相联系(图2C),表明Hsp90定位于基质与线粒体间膜空间两者。允许分析个体细胞器区室,包括外膜(OM)、间膜空间(IMS)、内膜(IM)与基质的的亚线粒体分级分离实验方法用于检查Hsp90的位置。Hsp90定位于间膜空间与线粒体基质两者(图2D)。
与TRAP-1类似,Hsp90定位于线粒体是选择性的,而且,除脑与睾丸外,未见线粒体Hsp90表达于其它调查的正常小鼠组织中(图2E)。进一步脑与睾丸中线粒体Hsp90的水平显著低于在肿瘤细胞类型中观察到的Hsp90水平(图1J)。相反,在正常与肿瘤细胞类型中,Hsp90的细胞溶胶储备广泛的存在(图2E)。在人类细胞中,Hsp90与TRAP-1两者在多种肿瘤细胞系中高水平表达,但在三种正常原生成纤维细胞类型中以低水平表达(图2F)。该定位的差异并非因为较之肿瘤细胞在正常细胞中全局性Hsp90伴侣表达的减少。正常细胞中Hsp90在细胞溶胶中的量接近代表性的肿瘤细胞类型中的量,但其线粒体储备则显著减少,且线粒体中TRAP-1水平亦降低(图2G)。
实施例2:以线粒体Hsp90伴侣为靶导致线粒体透过性改变以及细胞
死亡
在该实施例中描述的实验中,使用了Hsp90伴侣的两个ATPase袋拮抗剂:小分子GA衍生物,17-AAG(Isaacs et al.,Cancer Cell,3:213-217,(2003)),以及拟肽免疫球蛋白(Sheph),其通过添加触角蛋白螺旋III同源结构域细胞穿透序列(“ANT”,Plescia et al.,Cancer Cell,7:457-468,(2005))而具有细胞透过性。两个分子均通过竞争ATP结合并抑制Hsp90的ATPase活性以抑制Hsp90伴侣活性(Neckers and Ivy,Curr.Opin.Oncol.,15:419-424,(2003);Plescia et al.,Cancer Cell,7:457-468,(2005))。
如下所述从HeLa细胞中分离纯化线粒体。荧光素结合Sheph-ANT在纯化线粒体内积聚(图3A),而未在缺乏触角蛋白细胞穿透序列的牧羊犬蛋白,Sheph时(图3B),或缺乏线粒体时(图3C)检测到荧光信号。荧光素结合细胞透过乱序拟肽,Scram-ANT,亦积聚于分离线粒体内(图3D),且荧光强度的量化显示在分离线粒体中Sheph-ANT与Scram-ANT两者在线粒体内穿透的效率上无法区分。
定量了有(Sheph-ANT)或无(Sheph)触角蛋白细胞穿透肽的牧羊犬蛋白的亚线粒体分布。细胞透过性的Sheph-ANT存在于未分级分离的线粒体中,同样也存在于所有亚线粒体区室,包括间膜空间、内膜与基质(图3F)。该定位完全依赖于触角蛋白肽(ANT),因为Sheph(无ANT)并不见于线粒体或任何亚线粒体区室中(图3F)。为确定牧羊犬蛋白是否在体内在线粒体中直接与Hsp90分子结合,我们下一步将牧羊犬蛋白或乱序拟肽与琼脂糖珠偶联。根据Western blotting,在牧羊犬蛋白-琼脂糖上对Raji线粒体提取物进行分级分离导致TRAP-1与Hsp90两者的特异性洗脱(图3G,上边部分)。相反,未发现Hsp90分子与固化乱序拟肽的联系(图3G,下边部分)。
在这些实验条件下,添加Sheph-ANT于纯化HeLa细胞线粒体导致线粒体膜电势的突然丧失(图3H)。该反应随线粒体浓度增加进行性的减弱(图3H),表明需要化合物积聚于线粒体内。相反,Sheph-ANT并不影响正常细胞的线粒体膜电势超过背景水平(见下,图4A、C、E、G),且乱序拟肽(Scram-ANT)对肿瘤或正常细胞的线粒体膜电势并无显著作用(图3H,以及见下,图4A、C、E、G)。另外,Sheph-ANT诱导自分离自Raji类淋巴母细胞(图3I),与原生人类肉瘤试样,在体内(图3J)线粒体中细胞色素c的浓度依赖性释放,而Scram-ANT无显著作用(图3I、J)。与这些数据抵触,Hsp90拮抗剂17-AAG并不诱导细胞色素c与Smac自分离肿瘤线粒体中的释放(图3K),且仅仅在高浓度(20μM)时,导致少量排出线粒体细胞色素c,但非Smac,于上清中(图3L)。
实施例3:在肿瘤与正常细胞类型中线粒体自身稳定的差异调节
Sheph-ANT并不导致分离自WS-1正常人类成纤维细胞的线粒体中线粒体膜电势的丧失(图4A,左边部分),而其使纯化自B-类淋巴母细胞Raji细胞的线粒体快速去极化(图4A,右边部分)。Scram-ANT对正常或肿瘤线粒体并不具有显著的作用(图4A)。Hsp90水平可通过细胞胁迫条件。WS-1成纤维细胞的葡萄糖饥饿增加作为对照的内质网Hsp90同源物Grp94的水平(图4B,左边部分)。然而,在葡萄糖饥饿后在WS-1线粒体中内源TRAP-1与Hsp90表达仅有最低限的变化(图4B,右边部分)。与此一致,较之Scram-ANT,Sheph-ANT并不显著影响葡萄糖饥饿WS-1线粒体的膜电势(图4C)。
Sheph-ANT诱导自分离自p53-/-小鼠淋巴瘤样本线粒体的细胞色素c释放(图9);该处理对正常小鼠肝线粒体的细胞色素c或Smac水平无作用(图4D),且并不影响正常小鼠肝(图4E,左边部分)或脑(图4E,右边部分)线粒体的膜电势。对照乱序拟肽,Scram-ANT,对正常或肿瘤线粒体无显著作用(图9,图4D、E)。
为查明Hsp90向肿瘤与正常线粒体差异补充的原因,检查了癌基因对Hsp90定位与表达水平的作用。正常NIH3T3成纤维细胞显示低水平线粒体Hsp90(图4F),然而,用突变Ras癌基因对这些细胞进行逆转录病毒转导导致Hsp90向线粒体的补充增加。而TRAP-1表达的增加相对不显著(图4F)。相反,细胞溶胶Hsp90水平在正常或Ras-转化NIH3T3细胞中并无变化(图4F)。Sheph-ANT对分离自正常NIH3T3细胞的线粒体并无作用(图4G,左边部分),而其迅速的去极化Ras-转化NIH3T3线粒体(图4G,右边部分),这一点类似于既有肿瘤细胞。
实施例4:抑制线粒体Hsp90分子对杀灭肿瘤细胞的差异调节
Sheph-ANT显示选择性杀灭肿瘤细胞。荧光素-结合Sheph-ANT积聚于肿瘤细胞的核周区域,并通过共聚焦显微镜显示与线粒体标记MitoTracker的反应性共域化(图5A)。尽管Scram-ANT在分离、纯化线粒体中积聚(图3D、E),ScramANT并不与MitoTracker在完整,生活细胞中共域化(图5B)。这些结果表明尽管Scram-ANT有能力穿透线粒体(如积聚于分离线粒体所指明),Scram-ANT并不积聚到足以通过共聚焦显微镜在线粒体原位(在细胞中)检测出的水平。尽管申请者不愿拘于理论,但无法在线粒体原位检测出Scram-ANT的积聚可能反映了Scram-ANT对其它细胞溶胶膜状区室的非特异性穿透,例如,Scram-ANT在该细胞所有区室中平衡性分布,因此降低了线粒体定位Scram-ANT的稳态水平,从而超出了共聚焦显微镜的检测之限。同样,不愿拘于理论,Sheph-ANT的积聚似因为Sheph部分与定位于线粒体内Hsp90或TRAP-1的紧密结合。与此预测一致,对荧光强度的量化揭示Scram-ANT在受处理细胞线粒体提取物中的积聚较之Sheph-ANT减少(图5C)。相反,两个序列均在受处理细胞的总细胞提取物与细胞溶胶组分中以相似水平积聚(图5C)。
在添加5分钟内,Sheph-ANT在肿瘤细胞中诱导线粒体膜电势丧失(图5D),并将线粒体细胞色素c释放到细胞溶胶中(未显示)。比较而言,细胞透过性乱序拟肽(Scram-ANT)无作用(图5D)。在平行实验中,17-AAG不影响HeLa细胞的线粒体膜电势(图5D),且在宽浓度范围内对细胞色素c释放无作用(图5E)。当使用时间推移显微录像术分析时,暴露于Sheph-ANT,但非Scram-ANT的肿瘤细胞在几分钟内显示细胞凋亡的形态学特征,包括细胞皱缩、膜起泡以及核周区域线粒体的融合/分裂(图5F)。相应的,暴露于Sheph-ANT 1小时足以以浓度依赖性方式杀灭不同肿瘤细胞类型,而细胞透过性拟肽,Scram-ANT则无效(图5G)。与作用的选择性一致,相似水平的Sheph-ANT并不影响多种正常人类成纤维细胞类型的存活率(图5G)。比较而言,17-AAG以同样的动力学参数对肿瘤存活率则无作用,仅在长时间暴露于该药剂的情况下导致部分杀灭细胞,在处理后24小时方能检测出来(图5H)。
实施例5:线粒体中的Hsp90调控伴侣网
自分离的Raji线粒体中免疫沉淀的TRAP-1见于与内源CypD的复合物(图6A)。CypD抑制剂环孢素A在体内(CsA)阻止CypD-TRAP-1复合物的形成(图6A)。用GA处理则无作用(图6A)。与TRAP-1类似,自分离线粒体提取物免疫沉淀的Hsp90在体内与内源CypD相联系,且该相互作用亦被CsA阻止(图6B)。Hsp90不见于TRAP-1免疫复合物(未显示),表明在线粒体中存在含CypD的独立TRAP-1与Hsp90复合物。Hsp90伴侣与CypD间的相互作用使用无细胞系统得以确证。在下拉实验中,重组TRAP-1或Hsp90直接与重组CypD结合,并且,与之相对,CypD直接与重组Hsp90分子相联系,该反应亦可被CsA,但非GA所破坏(图10)。比较而言,GST在体外并不与Hsp90或TRAP-1相联系(图10)。用GST-CypD与Raji线粒体提取物一起温育导致TRAP-1与Hsp90两者的分离,且这些相互作用可被CsA但非GA所抑制(图6C)。
实施例6:Hsp90-引导线粒体自身稳定的分子条件
用CsA抑制CypD活性完全阻止Sheph-ANT对肿瘤线粒体的膜去极化(图6D)。Sheph-ANT对正常肝线粒体无作用,无论存不存在CsA。CsA显著抑制Sheph-ANT诱导细胞死亡,在未经CsA处理的细胞培养中导致完全细胞杀灭的Sheph-ANT浓度(50μM)下,保留了70%的细胞存活率(图6E)。为确证CsA的保护作用具特异性,我们下一步通过小干扰RNA(siRNA)迅速去除了其靶,CypD,并量化了牧羊犬蛋白介导的细胞杀灭。用siRNA去除CypD亦阻止Sheph-ANT诱导的肿瘤细胞杀灭,在Sheph-ANT的广泛范围有效浓度(50-100μM)下恢复60-70%的细胞存活率(图6F)。比较而言,乱序拟肽Scram-ANT无论存不存在CsA(图6E),或在非目标性或CypD引导的siRNA转染后(图6F),都无作用。
为确定线粒体Hsp90、TRAP-1或两个分子是否均在透过性转变中拮抗CypD的功能,进行了下列实验。TRAP-1表达,其仅存在于线粒体中,由siRNA所去除,且确定了其对细胞存活率的作用。TRAP-1沉默减少了HeLa细胞存活率大约50%,较之非目标siRNA(图6G)。用CsA预温育完全抑制了由TRAP-1沉默诱导的细胞死亡(图6G),表明在线粒体中Hsp90伴侣对CypD的拮抗对癌细胞存活是必需的。在对照实验中,导向TRAP-1或CypD的siRNA减少了这两种蛋白在HeLa细胞中的表达,而非目标siRNA无作用(图6H)。为进一步检查线粒体Hsp90分子是否带来针对细胞凋亡的积极保护,将TRAP-1转染入正常人类成纤维细胞,其仅表达极低水平的该蛋白(图2F、G)。随后根据其对星形孢菌素(staurosporine)-诱导细胞凋亡的抗性测试所述转染人类成纤维细胞。在WS-1(图6I)或HFF(图11)正常人类成纤维细胞中表达重组TRAP-1在广泛的星形孢菌素浓度范围内较之对照强烈阻碍了其细胞凋亡。
实施例7:导向线粒体的GA的设计与化学合成
尽管Sheph-ANT在分离线粒体与生活细胞中诱导透过性转变,并触发选择性肿瘤细胞死亡,其性质已为人熟知的Hsp拮抗剂,17-AAG(Neckersand Ivy,Curr.Opin.Oncol.,15:419-424,(2003))比对粒体完整性无作用(图3K、L),且显示部分抗癌活性(图5H)。为确定17-AAG功能的缺乏是否因为其无法在线粒体内积聚,进行了定位研究。荧光素结合GA无法积聚于分离的肿瘤细胞线粒体中(图12A)。17-AAG的变体,17-(3-(4-马来酰亚胺丁酰氨甲酰)丙氨基-去甲氧基格尔德霉素(17-GMB-APA-GA)(图12B、C)通过硫醚键与触角蛋白细胞穿透肽(ANT)共价偶联。当与FITC结合时,该称为ANT-GA的新型化合物(图12C),迅速在分离肿瘤线粒体内积聚,而未在不存在线粒体时检测到荧光信号(图12A)。用蛋白酶K预处理ANT-GA消除其线粒体内的积聚,而在用ANT-GA与线粒体温育后添加蛋白酶K则无效(图12A),表明所述化合物受保护不受蛋白水解影响。用低于最佳浓度的ANT-GA温育HeLa细胞过夜导致Hsp90对象蛋白Akt的降解(图12D),确证了其抑制Hsp90ATPase活性的能力,与未偶联的ANT与GA混合物并无不同。
实施例8:通过导向线粒体的GA(Mitochondria-Directed
GA)(ANT-GA)诱导线粒体透过性转变以及选择性细胞死亡
将纯化HeLa细胞线粒体与ANT-GA温育导致线粒体膜电势的突然丧失(图7A)。该反应随线粒体浓度增加进行性的减弱,表明化合物在线粒体内的积聚对活性是必需的(图7A)。CsA完全反转了肿瘤细胞中ANT-GA诱导的膜去极化(图7B),进一步证实了CypD在该通路中的作用。此外,ANT-GA对肿瘤细胞是选择性的,且在分离肿瘤线粒体中触发浓度依赖性的细胞色素c释放(图7C,上边部分),但并不影响正常脑线粒体的膜电势,无论有或没有CsA(图7B),或正常肝线粒体的细胞色素c成分(图7C,下边部分)。在对照实验中,GA/ANT未偶联的混合物,或GA自身,并不显著影响正常或肿瘤线粒体膜电势(图7B),且对细胞色素c释放无作用(图7C)。当添加到肿瘤细胞时,ANT-GA,而非GA自身或GA/ANT未偶联的混合物,产生快速(~2小时)且浓度依赖性的细胞杀灭(图7D),而这些化合物均不影响各种正常人类成纤维细胞类型的存活率(图7E)。最后,由ANT-GA诱导的肿瘤细胞杀灭具有细胞凋亡的典型特征,即胱天蛋白酶(caspase)活性增加,如DEVDase水解所确定,且不受p53是否存在影响(图7F)。比较而言,GA/ANT未偶联的混合物在p53+/+或p53-/-细胞中并不诱导细胞凋亡(图7F)。
实施例9:肿瘤中Hsp60选择性的细胞保护
为确定Hsp60细胞保护是否在癌症优选使用,检查了其在正常与肿瘤细胞类型中的表达与功能。从肿瘤细胞(6-7x107)中基本如(Dohi et al.,J ClinInvest 2004;114:1117-27)所述提取了线粒体与细胞溶胶组分。Hsp60大量见于乳房腺癌MCF-7与结肠腺癌HCT116细胞的线粒体与线粒体外(Soltys andGupta,Int Rev Cytol 2000;194:133-96),意即,细胞溶胶组分中(图13,上边小图)。比较而言,原生WS-1与HFF人类成纤维细胞在两个亚细胞区室中均展示Hsp60水平明显减少(图13A,下边部分)。根据免疫组织化学,在体内正常乳房、结肠与肺上皮中,Hsp60无法检出,或其表达水平极低(图13B);乳房、肺与结肠腺癌的原生组织样本,以及相匹配的正常组织匿名获自UMass Memorial Cancer Center Tissue Bank。组织切片经处理用于使用IgG或针对Hsp60的抗体(1∶1000)的免疫组织化学,如(Dohi et al.,J Clin Invest2004;114:1117-27)所述。在对照实验中,IgG并不使正常或肿瘤上皮染色。
为确定Hsp60细胞保护是否在肿瘤细胞中选择性的有作用,在正常与肿瘤细胞类型中针对Hsp60表达采取了措施,并分析其细胞存活率。使用小干扰RNA(siRNA)的基因沉默通过将无目标(VIII)或导向Hsp60的双链(ds)RNA寡核苷酸使用oligofectamine(3μl/孔)如(Beltrami et al.,J Biol Chem2004;279:2077-84)所述加以实施。此外(alternatively),将细胞用对照或针对Hsp60的SMART储备siRNA寡核苷酸(Dharmacon)通过oligofectamine转染。对双转染实验,用对照或导向Hsp60的siRNA以每次转染之间48小时的间隔装载细胞。
用导向Hsp60的siRNA转染74INT正常人类上皮细胞或WS-1原生人类成纤维细胞导致Hsp60表达的阻抑,而无目标的siRNA则无作用。与从肿瘤细胞系所得的结果不合(variance),用siRNA在正常细胞中急性去除Hsp60,较之用无目标的siRNA转染的对照培养细胞,并不导致细胞存活率的丧失,或胱天蛋白酶活性增加(图13C)。
因此,Hsp60(其与存活素结合,数据未显示)对在肿瘤中不同的得到利用的体内广泛抗细胞凋亡程序作出贡献,并可因此作为靶以优选杀灭肿瘤细胞,同时使正常细胞幸免
实施例10:伽米替尼有效的破坏线粒体完整性
伽米替尼(GA线粒体基质抑制剂)为第一类区室化于线粒体的Hsp90伴侣的小分子拮抗剂。伽米替尼具有组合结构,并含有源自Hsp90抑制剂,17-烯丙氨基格尔德霉素(17AAG)的苯醌安莎霉素支架(Isaacs et al.,CancerCell,3:213-217(2003))、在C17位置的接头区域与靶向线粒体的部分,或者由一到四个纵列的环状胍重复(Fernandez-Carneado et al.,J Am Chem Soc,127:869-874(2005)).(伽米替尼G1-G4),或者由三苯基膦(Armstrong,Br JPharmacol,151:1154-1165(2007))(伽米替尼-TPP)提供(Fig.15A)。伽米替尼的17-AAG部分预计与Hsp90的ATPase袋相接触,而所述胍组件在该结合界面被排除,从所述ATPase袋中伸出指向溶剂。在预测的船坞结构(dockingstructure)中,伽米替尼对Hsp90的结合排列接近格尔德霉素(GA)的(Stebbinset al.,Cell,89:239-250(1997)),其中117-AGG区域重原子的均方根偏差为0.5
伽米替尼-G4在肿瘤细胞裂解液中有效的与GA亲和珠竞争Hsp90的结合,并在纯化对象蛋白重组成分析(Arlander et al.,J.Biol.Chem.,281:2989-2998(2006))中抑制Hsp90的伴侣活性(图15B)。伽米替尼-G4选择性积聚于分离肿瘤线粒体中,而无目标的17-AAG并不透过或积聚于线粒体中(图15C)(Kang et al.,Cell,131:257-270(2007))。
伽米替尼破坏线粒体完整性。当添加到分离肿瘤线粒体中时,所有伽米替尼均以类似效率导致内膜电势的突然丧失(图16A)。比较而言,无目标的Hsp90拮抗剂,GA、17-AAG或17-(二甲基氨基乙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素(DMAG)并不影响线粒体膜电势(图16A)。伽米替尼(G4或TPP)迅速使肿瘤线粒体去极化,且该反应为CypD的抑制剂环孢素A(CsA)所抑制(图16B)。比较而言,与分离的线粒体穿透部分,例如,TG-OH或TPP-OH相混的17-AAG或AG比对粒体膜电势无作用,无论CsA是否存在(图16B)。所有伽米替尼亦诱导线粒体细胞色素c的快速(20分钟)释放,而11-AGG则无效(图16C)。
几种最近开发的基于嘌呤与异噁唑间苯二酚的Hsp90拮抗剂(图19)用来测试线粒体完整性的变化。伽米替尼诱导自线粒体突然与完全的细胞色素c释放(图16D)。比较而言,17-AAG,17-AGG的氢醌衍生物(IPI-504),嘌呤类似物(BIIB021)或异噁唑(NVP-AUY922)Hsp90抑制剂对细胞色素c释放无作用(图16D)。
线粒体去极化与细胞色素c的释放是线粒体透过性转换的典型特征(Green et al.,Science 305:626-629(2004)),通常导致细胞死亡。与此预测一致,将肺腺癌H460细胞暴露于伽米替尼-G3或G43小时足以产生浓度依赖性(IC50~0.5μM)与完全的细胞存活率丧失(图17A,左边部分)。在此时限内,伽米替尼-G1或17-AAG无作用,而伽米替尼-G2或伽米替尼-TPP具有中等活性,反应了胞内积聚的不同效率(图17A,左边部分)。在24小时时,所有伽米替尼大致相似的杀灭了全部肿瘤细胞种群,而17-AAG仅导致细胞存活率或细胞增殖的部分减少(图17A,右边部分)。
现行Hsp90抑制剂基本上均在多数肿瘤细胞类型中导致细胞周期停滞,继以在48-72小时不同程度的细胞凋亡。为寻找伽米替尼较之非靶向线粒体的Hsp90抑制剂在抗癌活性发明潜在的机理差异,使用了乳房腺癌SKBr3细胞(对Hsp90抑制高度敏感的模式细胞类型)。用伽米替尼(G4或TPP)或17-AAG处理SKBr3细胞类似的于48小时时,并在整个96小时期间减少了代谢活性(图17B)。然而,多数经17-AAG处理的SKBr3细胞在72小时后仍生存,而伽米替尼具有细胞毒性,而在24小时时造成近乎完全的肿瘤细胞杀灭(图17C)。该细胞死亡反应以线粒体内膜电势丧失与胱天蛋白酶活性为特征,表明为线粒体性细胞凋亡(图17D)。与其细胞毒特性一致,伽米替尼(G4)阻抑在软琼脂中的锚着非依赖性肿瘤生长(图17E)并对一系列异种肿瘤细胞类型(包括,例如,人类肿瘤细胞类型、慢性髓细胞性白血病细胞、B类淋巴母细胞白血病细胞、乳房腺癌细胞、肺腺癌细胞、前列腺腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、结肠腺癌细胞与子宫颈腺癌细胞)具有细胞毒作用。伽米替尼的细胞毒作用独立于p53的状态与存活因子,例如Bcl-2的表达(图17F)。用siRNA急性沉默CypD(Green et al.,Science 305:626-629(2004))部分减轻伽米替尼介导的肿瘤细胞杀灭(图17G),确证了透过性转换孔在此通路中的作用。
为确定伽米替尼是否对Hsp90伴侣的线粒体储备有特异性,子宫颈癌HeLa细胞用17-AAG处理,导致其对象蛋白Chk1与Akt的失稳(Isaacs et al.,Cancer Cell,3:213-217(2003)),与伴侣Hsp70的表达增加(Beere et al.,NatCell Biol,2:469-475(2000))。Chk1与Akt水平降低与Hsp70水平增高与细胞溶胶Hsp90的抑制相一致(图17H)。比较而言,伽米替尼对Chk1、Akt与Hsp70的水平的作用无法检出,说明其对细胞溶胶Hsp90具有最低限的作用(图17H)。
实施例11:伽米替尼在异种移植肿瘤模型中为有效的
在异种移植肿瘤模型中衡量伽米替尼的有效性与毒性。
为构建此实施例中所用模型,将悬浮于灭菌PBS(200μl)的HL60(10x106)或H460(4x106)细胞皮下注射到10周龄CB17SCID/beige(TaconicFarms)免疫妥协的雌性小鼠腹部两侧。此外,将悬浮于200μl 50%基质胶(matrigel)的MDA-MB-231细胞(5x106)用于皮下注射到CB17 SCID/beige小鼠。当浅表肿瘤体积达到100-150mm3,将动物随机分为两组(2肿瘤/小鼠,3动物/组),并用溶剂载体(DMSO)或溶解于20%含Cremophor EL(Sigma)的PBS通过腹膜内(i.p.)注射处理。采用下列时间表将伽米替尼-G4用于无菌腹膜内i.p.注射:对HL60异种移植物,2mg/kg每日两次;对H460异种移植物,第0日2mg/kg每日两次,第1日2.5mg/kg每日两次,余下处理期间3.0mg/kg每日两次;对MDA-MB-231异种移植物,第0-2日2mg/kg每日两次,第3-5日2.5mg/kg每日两次,以及余下处理期间3mg/kg每日两次。将17-AAG溶解于20%Cremophor EL中,并根据与伽米替尼-G4同样的剂量升级用药方案在H460异种移植物研究中用于系统性i.p.注射。采用下述时间表使用伽米替尼-G1:每日30mg/kg(第0-2日),以及余下处理期间每日50mg/kg。伽米替尼-TPP以整个实验期间每日10mg/kg用于i.p.注射。用测径器每日测量肿瘤,且用下述公式计算肿瘤体积:([以毫米计的长度]x[以毫米计的宽度]2)/2。在不同处理组中,在每个反应开始和结束时称量小鼠的重量。
体内亚细胞分级分离根据下述方法进行。在来自经溶剂载体或伽米替尼处理的小鼠的HL60异种移植肿瘤达到300-400mm3的体积时对其进行收获,并使用Mitochondria Isolation Kit(SIGMA)制备细胞溶胶组分。释放于所述细胞溶胶的细胞色素c通过Western blotting分析。
原位核小体内DNA断裂(TUNEL)根据下述方法进行。在处理结束时,从经溶剂载体或伽米替尼处理的动物收获肿瘤,将其固定于福尔马林,包埋于石蜡中,并切片。使用ApopTag Plus Peroxidase In Situ ApoptosisDetection kit(Chemicon)根据说明书,如之前所述的(Dohi et al.,Mol Cell,27:17-28(2007))进行TUNEL染色。用Olympus显微镜使用连线电荷耦合装置照相机(on-line charge-coupled device camera)以400x的放大率捕获图像(坏死区域排除在本分析之外)。为量化,在400x放大视野中10个独立区域(10区域/组)对TUNEL阳性细胞进行计数。
用下列方法进行组织学分析。在实验结束时处死来自溶剂载体或伽米替尼组的动物,收集器官,包括脑、结肠、心、肾、肝、肺、胰、小肠、脾与胃,将其固定于福尔马林并包埋于石蜡。将切片(5μm)置于高粘附性载玻片,用苏木精伊红染色并用光学显微镜进行分析。
使用unpaired t-test在GraphPad software program(Prism 4.0)上分析数据。所有的统计学测试均为双向的。0.05的p-值视为统计上显著的。
对小鼠系统性的施与伽米替尼-G4抑制体内既存人类白血病(图20A)、乳房肿瘤(图20B)与肺部肿瘤(图18A)的生长。相似剂量的17-AAG在小鼠中对人类肺癌生长无作用(图18A,上边部分)。携带不同趋线粒体部分的伽米替尼(单胍(G1)或三苯基膦(TPP))一在体内抑制肺癌生长(图18A,下边部分)。收获自经伽米替尼处理动物的肺部肿瘤在原位展示广泛细胞凋亡(图18B)。此外,收获自经伽米替尼处理动物的肺部肿瘤展示细胞溶胶有细胞色素c存在(图18C),表明伽米替尼在体内诱导线粒体功能失常。进一步,结果暗示伽米替尼可具有最小限的副作用:在所用浓度下,伽米替尼在处理期间并不导致动物受试者显著的体重下降(图18D),且收集自经伽米替尼处理动物的器官相对于未经伽米替尼处理动物的组织而言在组织学上为正常的。为确定伽米替尼诱导的线粒体功能失常是否仅限于肿瘤而非正常细胞,使用伽米替尼处理肿瘤与正常细胞。有效浓度的伽米替尼并不影响正常人类成纤维细胞的线粒体膜电势(无论CsA是否存在(图18E))。伽米替尼亦不影响正常人类成纤维细胞中的细胞色素c成分(图18F)。诱导肿瘤细胞杀灭的伽米替尼浓度并不降低正常人类细胞类型的存活率(图18G)。
这些结果表明伽米替尼具有选择性、有效性与安全性。
实施例12:为鉴别趋线粒体性伴侣抑制剂的计算模型
用于所有锚着计算的Hsp90晶体结构使用对应于pdb code 1YET.pdb的坐标取自蛋白数据库(Stebbins et al.,Cell,89:239-250(1997))。起初的X-ray结构包含其配体格尔德霉素(GA),将其从活性位点移除以产生Hsp90的脱辅基(apo-open)形式。使用不同锚着过程、不同计算方法程序以及能量函数(energy function)将伽米替尼锚着于Hsp90的活性位点以定义代表伽米替尼-Hsp90复合物最低自由能的共通结构。首先,使用Macromodel program(Mohamadi et al.,J.Comp.Chem.,11:440-467(1990))、AMBER force field(Duan et al.,J.Comp.Chem.,24:1999-2012(2003))与GB/SA approach(RamiReddy et al.,J.Comp.Chem.,19:769-780(1998))将伽米替尼结构最小化以考虑水溶剂的影响。
在第一组锚着计算中,使用AutoDock程序(Morris et al.,J.Comp.Chem.19:1639-1662(1998))对伽米替尼的最低能量结构进行针对Hsp90的推定N-端受体的盲锚着实验。通过Autogrid程序在Hsp90的ATPase袋周围以0.35间距产生质量定心的网格图(mass-centered grid map)。对氢键与范德华相互作用建模,分别使用12-10与12-6作为Lennard-Jones参数(所述程序包的缺省参数)。使用Mehler and Solmajer(Mehler and Solmajer,Protein Eng,4:903-910(1991))的距离依赖性介电常数计算静电网格图。对最小化,应用Lamarckian genetic algorithm(LGA)与pseudo-Solis与West方法使用缺省参数。在所有运行中将世代数(number of generation)设为2500万,且因此用能量衡量的总数定义中止标准。对配体使用随机网格开始位置、随机朝向与随机扭转(仅限于能屈的配体)。总共运行了310次。在所述锚着运行结束时,将配体构象以能量增加的顺序排列。随后,使用具有最低能量的配体构象作为参照,取所有与参照质心到质心(a center of mass)距离小于1.5的构象认为其属于第一个簇。一旦构象被分配于某簇,即不将其用于其它(能量上不利的)簇。随即对所有尚未分类的构象重复该过程,直至所有构象都置于簇中。多数锚着结构具有共同构象特征,其原型以所述复合物的全局最低结构为代表。得自Autodock运行的能量最低结构的17-AAG区域与GA的苯醌安莎霉素支架重叠良好,其所有重原子的均方根偏差为0.56
在第二组锚着计算中,使用Glide software(Friesner et al.,J.Med.Chem.,47:1739-1749(2004);and Halgren et al.,J.Med.Chem.,47:1750-1759(2004))将伽米替尼的最低结构锚着于Hsp90受体。为所述ATPase结合袋周围的配体构建了每边长度为14的立方体结合盒。允许所述配体完全的屈曲性,并使用Glide standard-precision(SP)mode对锚着姿势进行评分。从该过程所得伽米替尼17-AAG区域的最佳姿势再次与GA的苯醌安莎霉素支架在X-ray结构中(Stebbins et al.,Cell,89:239-250(1997))与之前的锚着计算中(rmsd为0.51)为可重叠的。
最后,为衡量下述可能性,即所述能屈的配体可导致相异的组合物几何结构,在溶液中对伽米替尼单独进行初步的构象分析,其中水分子通过GB/SA方法隐含表现。为发掘伽米替尼的构象空间,使用10000步MonteCarlo Multiple Minimum method(Chang et al.,J.Am.Chem.Soc.,111:4379-4386(1989))与在Macromodel中执行的AMBER force field,运行了基于扭转的构象搜索。对所述配体鉴别出了并存储了4223独特的构象。通过该计算所得的所有构象随即用作配体进行针对Hsp90受体的锚着计算,采用与simple Glide docking approach描述相同的过程。每个锚着于受体的构象具有不同的评分。重要的是,上位的226个姿势仍然在其17-AAG区域与GA的苯醌安莎霉素支架完全重叠,其平均rmsd为0.6
实施例13:合成
(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((
2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢
-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]
嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基
硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5-二氧吡咯
烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-
三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲酸酯,四
六氟磷酸盐(伽米替尼-G4,
1)(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[l,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,tetrakishexafluorophosphate salt(Gamitrinib-G4,1))
步骤1.((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基甲磺酸,四六氟磷酸盐4(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylmethanesulfonate,tetrakis hexafluorophosphate salt 4):
用N-甲基吗啉(0.30mL,2.76mmol)与甲磺酸酐(240mg,1.38mmol)在室温下氮气下处理醇3在乙腈(5mL)中的溶液(如描述于Fernandez-Carneado etal.,J.Am.Chem.Soc.,127:869-874(2005),445mg,0.276mmol)。在室温下搅拌5小时后,真空移除大部分挥发物。将残留物质用二氯甲烷(30mL)稀释,并用0.1M aq.NH4PF6(20mL)洗涤。水相用额外的二氯甲烷(30mL)重新抽提。合并的有机相在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。通过柱层析(2-5%MeOH的二氯甲烷溶液)纯化得到作为四六氟磷酸盐的4(452mg,97%,淡棕色泡沫)。1H-NMR(600MHz,丙酮-d6)δ7.72-7.67(m,4H),7.52-7.48(m,2H),7.48-7.43(m,4H),7.35-7.00(br,盐质子),4.46(dd,1H,J=4.2Hz,10.8Hz),4.28(dd,1H,J=7.2Hz,10.2Hz),4.00-3.95(m,1H),3.85-3.68(m,9H),3.60-3.47(m,16H),3.18(s,3H),3.04-2.95(m,6H),2.76-2.68(m,6H),2.28-2.14(m,8H),2.05-1.89(m,8H),1.06(s,9H).
步骤2.S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫羟乙酸,四六氟磷酸盐5(S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylethanethioate,tetrakis hexafluorophosphate salt5):
将甲磺酸4溶液(452mg,0.267mmol)与硫羟乙酸钾(153mg,1.34mmol)在四氢呋喃(THF,8mL)/水(3mL)中回流16小时。在冷却至室温后,用二氯甲烷(30mL)稀释反应混合物,并用0.1M aq.NH4PF6(20mL)洗涤。水相用额外的二氯甲烷(30mL)重新抽提。合并的有机相用0.1M aq.NH4PF6(20mL)洗涤,在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。用二乙醚-己烷(1∶1)进行研磨得到5作为四六氟磷酸盐(420mg,94%,浅棕色固体)。1H-NMR(400MHz,丙酮-d6)δ7.73-7.66(m,4H),7.53-7.42(m,6H),7.22-6.92(br,盐质子),3.85-3.65(m,10H),3.62-3.46(m,16H),3.16(d,2H,J=6.4Hz),3.04-2.86(m,6H),2.77-2.67(m,6H),2.37(s,3H),2.29-2.14(m,8H),2.04-1.88(m,8H),1.06(s,9H);MS(EI)m/z 1087(M+1),1233(M+HPF6+1)。
步骤3.
(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5-二氧吡咯烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲酸酯,四六氟磷酸盐1((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,tetrakis hexafluorophosphate salt 1):
将在脱气的MeOH(4mL)中的5(118mg,0.071mmol)溶液在室温下在N2中用叔丁醇钾(0.21mL,0.21mmol,1M在THF中)处理。30分钟后,用1N aq.HCl(ca.0.1mL)中和反应混合物,并用0.1N磷酸缓冲液(pH6,3mL)处理。对所述缓冲溶液在室温下在N2中添加在脱气MeOH(2mL)中的格尔德霉素-马来酰亚胺2溶液(如Mandler,et al.Bioconjug.Chem.13:786-791(2002)所述合成,65mg,0.085mmol)2小时后,反应液浓缩为约3mL。用二氯甲烷(20mL)稀释所得反应混合物并用0.1M aq.NH4PF6(30mL)洗涤。用二氯甲烷重新抽提水相。合并的有机相在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。预HPLC(5-50%在水中的乙腈,0.1%TFA)分离继以浓缩得到作为三氟乙酸(TFA)盐的1。所述TFA盐溶解于二氯甲烷(3mL)并用0.1M aq.NH4PF6(2mLx5)反复洗涤。从二乙醚-己烷(1∶1)浓缩继以研磨得到1作为四六氟磷酸盐(88mg,52%,紫色固体)。根据在254nm的HPLC,1的纯度超过99%。通过HRMS所测得的1的分子量([M+3H]3+,m/z 604.9698)与理论量(m/z 604.9736)一致。1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.25(s,1H),7.70-7.60(m,4H),7.53-7.40(m,6H),7.30(br s,1H),7.11(d,1H,J=8.4Hz),7.06(s,2H),6.80-6.40(br,盐质子),6.74(dt,1H,J=18.8Hz,J=6Hz),6.63(t,1H,J=11.2Hz),5.83(t,1H,J=10Hz),5.68(d,1H,J=9.6Hz),5.24(br s,2H),5.08(s,1H),4.43(d,1H,J=9.2Hz),3.98-3.86(m,1H),3.86-3.78(m,1H),3.75-3.68(m,1H),3.67-3.60(m,1H),3.60-3.42(m,14H),3.42-3.23(m,21H),3.22-3.10(m,3H),3.20(s,3H),3.03(dd,1H,J=14Hz,5Hz),2.92-2.52(m,7H),2.52-2.40(m,9H),2.40-2.30(m,1H),2.25-2.00(m,10H),1.97(s,3H),1.86-1.70(m,14H),1.71(s,3H),1.05(s,9H),0.95(d,3H,J=6.4Hz),0.92(d,3H,J=6.8Hz);MS(EI)m/z 1812.5(M+1)。
实施例14:合成
(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基 甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5- 二氧吡咯烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲 基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基 甲酸酯,六氟磷酸盐(伽米替尼-G1,I)((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,hexafluorophosphate salt(Gamitrinib-G1,I))
步骤1.S-((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫羟乙酸,六氟磷酸盐I-2(S-((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methyl ethanethioate,hexafluorophosphate saltI-2):
将I-1(如Fernandez-Carneado et al.,J.Am.Chem.Soc.,127:869-874(2005)所述合成,2.30g,3.48mmol)的搅拌溶液与硫羟乙酸钾(potassium thioacetate)(794mg,6.95mmol)在THF(40mL)/H2O(16mL)中回流16小时。在冷却至室温后,用二氯甲烷(100mL)稀释反应混合物,并用0.1M aq.NH4PF6(50mL)洗涤,水相用额外的二氯甲烷(50mL)重新抽提。合并的有机相用0.1M aq.NH4PF6(30mL)洗涤,在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。通过柱层析(25%己烷/乙酸乙酯到100%乙酸乙酯)纯化得到作为六氟磷酸盐(hexafluorophosphate salt)的I-2(2.12g,95%,淡黄色固体)。1H-NMR(400MHz,丙酮-d6)δ7.72-7.65(m,4H),7.52-7.41(m,6H),6.98(br,2H),3.85-3.73(m,3H),3.73-3.64(m,1H),3.61-3.46(m,4H),3.15(d,2H,J=6.4Hz),2.36(s,3H),2.23-2.10(m,2H),2.08-1.91(m,2H)1.06(s,9H)。
步骤2.(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5-二氧吡咯烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲酸酯,六氟磷酸盐I((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,hexafluorophosphate saltI):
向脱气MeOH(3mL)中的I-2(100mg,0.156mmol)溶液在室温下在N2中添加叔丁醇钾(tert-butoxide)(0.47mL,0.47mmol,1M在THF中)。30分钟后,用1N aq.HCl(约0.5mL)中和反应混合物,并用0.1N磷酸缓冲液(pH6,2mL)处理。对所述缓冲溶液在室温下在N2中添加在脱气MeOH(1mL)中的格尔德霉素-马来酰亚胺2溶液(144mg,0.188mmol)2小时后,反应液浓缩为约2mL。用二氯甲烷(30mL)稀释所得反应混合物并用0.1M aq.NH4PF6(30mL)洗涤。用二氯甲烷(30mL)重新抽提水相。合并的有机相在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。预HPLC(5-50%在水中的乙腈,0.1%TFA)提纯并浓缩得到作为三氟乙酸(TFA)盐的I。所述TFA盐溶解于二氯甲烷(3mL)并用0.1M aq.NH4PF6(2mLx5)洗涤。从二乙醚浓缩继以研磨得到I作为六氟磷酸盐(hexafluorophosphate)(107mg,50%,紫色固体)。根据在254nm的HPLC,I的纯度超过98%。通过HRMS所测得的I的分子量([M+H]+,1221.6073)与理论量(m/z 1221.6090)一致。1H-NMR(600MHz,丙酮-d6)δ9.40(d,1H,J=5.4Hz),7.75-7.60(m,4H),7.53-7.40(m,6H),7.40-7.23(m,2H),7.11(s,1H),6.93-6.85(m,1H),6.66(t,1H,J=11Hz),5.85(t,1H,J=10Hz),5.78(d,1H,J=9.6Hz),5.12(s,1H),4.55(d,1H,J=9.6Hz),4.12-4.05(br d,1H),4.06-3.98(m,1H),3.98-3.93(m,1H),3.85-3.45(m,13H),3.39-3.15(m,5H),3.32(s,3H),3.20(s,3H),3.05-2.95(m,1H),2.87(s,3H),2.77-2.68(m,1H),2.64-2.58(m,1H),2.53-2.39(m,2H),2.30-2.13(m,4H),2.05-1.91(m,2H),2.01(s,3H),1.88-1.76(m,4H),1.75(s,3H),1.75-1.67(m,2H),1.06(s,9H),1.00(d,3H),0.91(d,3H)MS(EI)m/z 1221.58(M+1)。
实施例15:合成
(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((
叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-
基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5-
二氧吡咯烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲
基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基
甲酸酯,二六氟磷酸盐(伽米替尼-G2,
II)((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8- ((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]p yrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyri midin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-h ydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3 .1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,bis hexafluorophosphate salt (Gamitrinib-G2,II)
步骤1.S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫羟乙酸,二六氟磷酸盐II-2(S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methyl ethanethioate,bishexafluorophosphate saltII-2):
将II-1(如Fernandez-Carneado et al.,J.Am.Chem.Soc.,127:869-874(2005)所述合成,1.71g,1.70mmol)的搅拌溶液与硫羟乙酸钾(583mg,5.10mmol)在THF(20mL)/H2O(8mL)中回流16小时。在冷却至室温后,用二氯甲烷(100mL)稀释反应混合物,并用0.1M aq.NH4PF6(50mL)洗涤,水相用额外的二氯甲烷(50mL)重新抽提。合并的有机相用0.1M aq.NH4PF6(50mL)洗涤,在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。通过柱层析(100乙酸乙酯到5%二氯甲烷中的MeOH)纯化并浓缩得到作为二六氟磷酸盐的II-2(1.45g,87%,淡棕色固体)。1H-NMR(400MHz,丙酮-d6)δ7.73-7.67(m,4H),7.53-7.42(m,6H),7.27(br d,2H),7.11(br d,2H),3.85-3.63(m,6H),3.62-3.48(m,8H),3.61-3.46(m,4H),3.14(d,2H,J=6Hz),2.99(dd,2H,J=14,4.6Hz),2.73(ddd,2H,J=14,9,4.6Hz),2.36(s,3H),2.28-2.12(m,4H),2.05-1.89(m,4H)1.06(s,9H)。
步骤2.
(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5-二氧吡咯烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲酸酯,二六氟磷酸盐
II((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,bis hexafluorophosphate saltII):
向脱气MeOH(4mL)中的II-2(110mg,0.112mmol)溶液在室温下在N2中添加叔丁醇钾(0.34mL,0.34mmol,1M在THF中)。30分钟后,用1N aq.HCl(约0.3mL)中和反应混合物,并用0.1N磷酸缓冲液(pH 6,0.5mL)处理。对所述缓冲溶液在室温下在N2中添加在脱气MeOH(2mL)中的格尔德霉素-马来酰亚胺2溶液(94mg,0.122mmol)2小时后,反应液浓缩为约2mL。用二氯甲烷(30mL)稀释所得反应混合物并用0.1M aq.NH4PF6(30mL)洗涤。用二氯甲烷(30mL)重新抽提水相。合并的有机相在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。预HPLC(5-50%在水中的乙腈,0.1%TFA)提纯并浓缩得到作为三氟乙酸(TFA)盐的II。所得TFA盐溶解于二氯甲烷(3mL)并用0.1M aq.NH4PF6(2mLx5)洗涤。从二乙醚浓缩继以研磨得到II作为二六氟磷酸盐(55mg,29%,紫色固体)。根据在254nm的HPLC,II的纯度超过99%。通过HRMS所测得的I的分子量([M+2H]+2,m/z 709.8534)与理论量(m/z 709.8577)一致。1H-NMR(600MHz,CD3CN)δ9.26(s,1H),7.70-7.65(m,4H),7.52-7.43(m,6H),7.13-7.08(m,1H),7.06(s,1H),6.87(br,1H),6.78-6.68(m,1H),6.64-6.55(m,2H),6.46(br,1H),5.83(t,1H,J=10Hz),5.72-5.65(m,1H),5.21(br,2H),5.07(s,1H),4.46-4.42(m,1H),3.82-3.78(m,1H),3.73-3.69(m,1H),3.66-3.62(m,1H),3.62-3.41(m,9H),3.41-3.25(m,11H),3.29(s,3H),3.22-3.03(m,3H),3.20(s,3H),2.93-2.71(m,3H),2.70-2.58(m,2H),2.56-2.39(m,3H),2.38-2.32(m,1H),2.25-2.03(m,5H),1.98-1.95(m,6H),1.85-1.70(m,8H),1.71(s,3H),1.05(s,9H),0.97-0.93(m,3H),0.92(d,3H)MS(EI)m/z 1418.51(M+1)。
实施例16:合成
(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-(((( 2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并 [1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基) 甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5-二氧 吡咯烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基 -3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲 酸酯,三六氟磷酸盐(伽米替尼-G3,III)((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,tris hexafluorophosphate salt(Gamitrinib-G3,III))
步骤1.((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲醇,三六氟磷酸盐III-1(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methanol,trishexafluorophosphate salt III-1):
将甲磺酸I-1(545mg,0.82mmol)的搅拌溶液与硫羟乙酸钾(188mg,1.65mmol)在THF(10mL)/H2O(4mL)中回流16小时。添加甲磺酸(0.27mL,4.12mmol)并将反应混合物回流24小时。在冷却至室温后,用二乙醚(50mL)与水(50mL)分离有机相与水相,水相用额外的水(20mL)重新抽提。合并的水相用二乙醚洗涤。随即用碳酸氢钾(495mg,4.94mmol)中和水相,并将溶剂蒸发至干。向所得的固体添加MeOH(100mL),并过滤去除沉淀。使用MeOH/CH2Cl2系统(MeOH/CH2Cl2=50/50→5/95)反复该过程两次。浓缩得到粗的黄色泡沫。对此产物在MeOH(10mL)中的溶液在室温下添加碳酸铯(322mg,0.99mmol)与三丁基膦(0.12mL,0.49mmol)。搅拌40分钟后,添加THF(10mL)中的甲磺酸II-1(697mg,0.69mmol)并在室温下搅拌反应混合物16小时。随即在真空中移除大部分挥发物。残留物用二氯甲烷(50mL)稀释并用0.1M aq.NH4PF6(30mL)洗涤。用额外的二氯甲烷(30mL)重新抽提水相。合并的有机相在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。通过柱层析(MeOH/CH2Cl2:2%到5%)纯化得到作为三六氟磷酸盐的III-1(560mg,64%,白色固体)。1H-NMR(400MHz,丙酮-d6)δ7.74-7.70(m,4H),7.54-7.44(m,6H),4.28(t,1H,J=5.2Hz),3.84-3.60(m,8H),3.60-3.44(m,14H),3.07-2.97(m,4H),2.75-2.58(m,4H),2.27-2.14(m,5H),2.14-1.74(m,7H),1.06(s,9H)。步骤2.((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)硫羟甲酸,三六氟磷酸盐III-2:
用N-甲基吗啉(0.19mL,1.70mmol)与甲磺酸酐(178mg,1.02mmol)在室温下N2下处理醇III-1(433mg,0.34mmol)在THF(5mL)中的溶液。在室温下搅拌2小时后,用二氯甲烷(30mL)稀释反应混合物,并用0.1M aq.NH4PF6(20mL)洗涤。水相用额外的二氯甲烷(30mL)重新抽提。合并的有机相在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。通过柱层析(MeOH/CH2Cl2:2%到5%)纯化得到作为三六氟磷酸盐的III-2(359mg,78%,淡棕色泡沫)。1H-NMR(400MHz,丙酮-d6)δ7.80-7.65(m,4H),7.55-7.40(m,6H),4.41(dd,1H,J=10.4Hz,4.4Hz),4.25(dd,1H,J=10.4Hz,7.6Hz),3.95-3.87(m,1H),3.84-3.58(m,7H),3.58-3.40(m,12H),3.20(s,3H),3.07-2.94(m,4H),2.76-2.57(m,4H),2.28-2.10(m,6H),2.05-1.86(m,6H),1.06(s,9H)。
步骤3.S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫羟乙酸,三六氟磷酸盐III-3(S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methyl ethanethioate,trishexafluorophosphate saltIII-3):
将III-2(359mg,0.27mmol)的搅拌溶液与硫羟乙酸钾(97mg,0.85mmol)在THF(8mL)/H2O(3ml)中回流16小时。在冷却至室温后,用二氯甲烷(50mL)稀释反应混合物,并用0.1M aq.NH4PF6(30mL)洗涤,水相用额外的二氯甲烷(30mL)重新抽提。合并的有机相用0.1M aq.NH4PF6(20mL)洗涤,在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。从二乙醚-己烷(1∶1)研磨得到作为三六氟磷酸盐的III-3(294mg,83%,淡黄色固体)。1H-NMR(600MHz,丙酮-d6)δ8.20-7.74(br,盐质子),7.74-7.68(m,4H),7.53-7.44(m,6H),3.86-3.75(m,3H),3.73-3.56(m,5H),3.56-3.44(m,12H),3.21(dd,1H,J=13.8,6Hz),3.08-2.95(m,5H),2.80-2.61(m,4H),2.37(s,3H),2.24-2.10(m,6H),2.00-1.82(m,6H)1.06(s,9H)。
步骤4.(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基氧)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)甲基)-2,3,4,6,7,8-六氢-1H-嘧啶并[1,2-a]嘧啶-2-基)甲基硫)-2,5-二氧吡咯烷-1-基)丁酰氨基)丙氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲酸酯,三六氟磷酸盐III((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((tert-butyldiphenylsilyloxy)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)methyl)-2,3,4,6,7,8-hexahydro-1H-pyrimido[1,2-a]pyrimidin-2-yl)methylthio)-2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)butanamido)propylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate,trishexafluorophosphate saltIII):
向脱气MeOH(4mL)中的III-1(209mg,0.157mmol)溶液在室温下在N2中添加叔丁醇钾(0.47mL,0.47mmol,1M在THF中)。30分钟后,用1N aq.HCl(约0.1mL)中和反应混合物,并用0.1N磷酸缓冲液(pH6,3mL)处理。对所述缓冲溶液在室温下在N2中添加在脱气MeOH(2mL)中的格尔德霉素-马来酰亚胺2溶液(133mg,0.173mmol)。2小时后,反应液浓缩为约3mL。用二氯甲烷(20mL)稀释所得反应混合物并用0.1M aq.NH4PF6(30mL)洗涤。用二氯甲烷(20mL)重新抽提水相。合并的有机相在Na2SO4上干燥,过滤并浓缩。预HPLC(5-50%在水中的乙腈,0.1%TFA)提纯并浓缩得到作为TFA盐的III。所得TFA盐溶解于二氯甲烷(3mL)并用0.1M aq.NH4PF6(2mLx5)洗涤。从二乙醚浓缩继以研磨得到III作为三六氟磷酸盐(110mg,34%,紫色固体)。根据在254nm的HPLC,III的纯度超过96%。通过HRMS所测得的III的分子量([M+H]+,m/z 539.2695)与理论量(m/z 539.2740)一致。1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.26(s,1H),7.70-7.63(m,4H),7.52-7.40(m,6H),7.15-7.08(br,1H),7.06(s,1H),6.81-6.68(m,2H),6.65-6.57(m,2H),6.45-6.15(br,6H),5.83(t,1H,J=10.2Hz),5.69(d,1H,J=7.2Hz),5.21(br s,2H),5.08(s,1H),4.44(dd,1H,J=9.6,4.8Hz),3.83-3.78(m,1H),3.73-3.70(m,1H),3.66-3.61(m,1H),3.61-3.42(m,10H),3.42-3.25(m,18H),3.22-3.14(m,3H),3.20(s,3H),2.85-2.71(m,7H),2.71-2.41(m,7H),2.38-2.32(m,1H),2.25-2.18(m,1H),2.18-2.04(m,8H),1.97(s,3H),1.85-1.70(m,10H),1.72(s,3H),1.06(s,9H),1.01(d,3H),0.95(dd,3H)MS(EI)m/z 1615.51(M+1)。
实施例17:合成(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(6-(三苯基膦) 己基氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环 [16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲酸酯六氟磷酸盐(伽米替 尼-TPP,9)((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(6-(triphenylphosphonio)hexylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-ylcarbamate hexafluorophosphate(Gamitrinib-TPP,9))
步骤1.叔丁基6-(三苯基膦)己基氨基甲酸酯,氢溴酸盐7(tert-butyl6-(triphenylphosphonium)hexylcarbamate,bromide salt7):
向在乙腈(10mL)中的6溶液(如Egbertson,et al.J.Med.Chem.,37:2537-2551(1994)所述,1.60g,5.71mmol)中添加三苯基膦(1.57g,5.99mmol),并将反应液回流16小时。在反应液冷却至室温后,使用正己烷(100mlx3)抽提去除过量的三苯基膦。浓缩并在真空下干燥获得膦盐7(3.09g,99%,白色固体)1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.89-7.84(m,3H),7.80-7.71(m,12H),6.72(br t,1H),3.57-3.50(m,2H),2.85-2.79(m,2H),1.50-1.38(m,4H),1.30-1.16(m,4H)。
步骤2.6-(三苯基膦)己烷-1-胺氯化物盐酸盐8(6-(triphenylphosphonium)hexan-1-amine chloride hydrochloride 8):
用HCl(4N在1,4-二噁烷中,171mL)溶液在室温下处理膦盐7(1.5g,0.765mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液。在搅拌3小时后,浓缩反应液。在真空下干燥得到胺8(1.31g,99%,白色固体)。使用胺8无需进一步提纯。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.12(br s,3H),7.94-7.88(m,3H),7.86-7.75(m,12H),3.70-3.60(m,2H),2.75-2.68(m,2H),1.58-1.44(m,6H),1.38-1.30(m,2H).
步骤3.(4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(6-(三苯基膦)己基氨基)-13-羟基-8,14-二甲氧-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧-2-氮杂二环[16.3.1]二十二碳-1(21),4,6,10,18-五烯-9-基氨基甲酸酯六氟磷酸盐9((4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(6-(triphenylphosphonio)hexylamino)-13-hydroxy-8,14-dimethoxy-4,10,12,16-tetramethyl-3,20,22-trioxo-2-azabicyclo[16.3.1]docosa-1(21),4,6,10,18-pentaen-9-yl carbamate hexafluorophosphate 9):
向在氯仿(25mL)中的格尔德霉素(GA150mg,0.27mmol)溶液中在室温下在N2中添加胺8(390mg,0.81mmol)与N,N-二异丙基乙醇胺(0.47mL,2.70mmol)。在搅拌3小时后,添加额外的胺8(390mg,0.81mmol)。10小时后,浓缩反应液并用柱层析(2-10%甲醇在二氯甲烷中)纯化。所得盐溶解于二氯甲烷(3mL)并用0.1M aq.NH4PF6(2mLx5)洗涤。从二乙醚浓缩继以研磨获得作为六氟磷酸盐的9(173mg,62%,紫色固体)。根据在254nm处的HPLC,9的纯度高于98%。通过HRMS所测得的9的分子量(M+,m/z890.4559)与理论量(m/z 890.4509)一致。1H-NMR(600MHz,丙酮-d6)δ9.39(s,1H),8.00-7.87(m,9H),7.87-7.75(m,6H),7.30(d,1H,J=11.4Hz),7.10(s,1H),6.66(t,1H,J=11Hz),6.58(br,1H),5.85(t,1H,J=10Hz),5.78(d,1H,J=9.6Hz),5.11(s,1H),4.55(d,1H,J=9.6Hz),4.06(d,1H,J=6Hz),3.66-3.55(m,4H),3.54-3.47(m,1H),3.37-3.33(m,1H),3.31(s,3H),3.21(s,3H),2.78-2.68(m,1H),2.59(dd,1H,J=13.8,4.2Hz),2.40(dd,1H,J=13.8,9.6Hz),2.01(s,3H),1.90-1.77(m,3H),1.74(s,3H),1.74-1.62(m,6H),1.54-1.45(m,3H),0.97(d,3H,J=7.2Hz),0.91(d,3H,J=7.2Hz)MS(EI)m/z 890.08(M+)。
实施例18:线粒体透过GA的设计与化学合成
马来酰亚胺GA衍生物,17-(3-(4-马来酰亚胺丁酰氨甲酰)丙基氨基-去甲氧基格尔德霉素(17-GMB-APA-GA)购自Invivogen。合成带或不带氨基末端FITC基团,在羧基末端带有戴酰胺(CONH2)帽(capped)的Cys残基,具有下述氨基酸序列的细胞透过性螺旋III触角蛋白肽(ANT):RQIKIWFQNRRMKWKKC(SEQ ID NO:40)。ANT中羧基末端Cys的巯基基团与17-GMB-APA-GA的马来酰亚胺基团反应产生硫醚键。为进行此结合反应,将ANT与17-GMB-APA-GA分别溶解于50mM Hepes,pH7.0与DMSO中,其终浓度为10mM,并以1∶1的ANT:17-GMB-APA-GA的比例混合1小时并轻微搅拌。用质谱分析所得ANT-17-GMB-APA-GA结合物,并用于分析线粒体透过性转换与细胞存活率。
一般方法
化学鉴定。1H-NMR在Varian Inova 400NB(400MHz)或Varian Inova600(600MHz)分光仪上获取。质谱记录于HP1100系列LC/MS分光仪。反应的进行程度在TLC板(具有荧光指示UV254的Macherey-Nagel 0.25毫米硅胶60)上进行检查,且所述位点在紫外光(254nm)下和/或通过在将所述TLC板浸染于水合茚三酮或Ce-Mo染色溶液中后炭化(charring)的方法可视化。柱层析在硅胶上进行(Merck 9385硅胶60)。终产物通过使用YMC-PackC18RS column(YMC)装置的HPLC(Waters alliance)在254nm处进行分析。合成化合物的化学成分通过高分辨率质谱(HRMS)使用Waters Q-TOF Premier质谱仪用[M+2H]2+离子或来自[Glu1]-纤维蛋白肽B(CAS 103213-49-6)的单电荷产物离子作为固定质量参照进行确证。理论分子质量使用MassLynxTM软件(Waters Corp.)进行计算,并将其与所测得的质量相比较。所有测得的质量在理论值的测量错误范围(5amu)内,且合乎预计的元素组成。所有的试剂与溶剂(乙腈、甲醇、二乙醚与己烷)均以试剂级购买,并使用时不再进行提纯。四氢呋喃与二氯甲烷分别蒸馏自苯醌钠与CaH2。
细胞系与抗体。子宫颈癌HeLa、结肠直肠腺癌HCT116、乳房腺癌MCF-7与MDA-MB-231、肺腺癌H460与H1975、前列腺腺癌PC3与DU145、表皮样扁平细胞癌A431与B-类淋巴母细胞Raji、HL-60与U937细胞从American Tissue Culture Collection(ATCC,Manassas,VA)获得,且根据供应者的说明培养维持。人类慢性髓细胞性白血病急性发作K562、单核细胞性白血病THP-1、成胶质细胞瘤U87MG、子宫颈癌HeLa、结肠直肠腺癌HCT116、乳房腺癌MCF-7(ER-阳性)与MDA-MB-231(Estrogen受体-阴性)、肺腺癌H460与H1975、前列腺腺癌PC3与DU145、表皮样扁平细胞癌A431与B-类淋巴母细胞Raji、HL-60与U937细胞从American Tissue Culture Collection(ATCC,Manassas,VA)获得,且根据供应者的说明培养维持。正常人类细胞类型,HGF、包皮成纤维细胞HFF、上皮成纤维细胞WS-1与小肠上皮INT亦得自ATCC。牛主动脉内皮细胞与人脐(umbilical)静脉内皮细胞的分离、培养维持遵循公开的实验方法16(Mesri et al.,“Suppression of vascularendothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by Survivintargeting,”Am.J.Pathol.,158:1757-1765(2001))。Bax-/-与p53-/-HCT116细胞有Dr.Bert Vogelstein(Johns Hopkins University)慷慨提供。使用了下列抗体:细胞色素c(Clontech)、Cox-IV(Clontech)、Hsp90(BD Biosciences)、TRAP-1(BD Biosciences)、亲环素D(CypD,肽脯氨酰异构酶F,ppif,Calbiochem)、Bcl-2(BD Biosciences)、Smac(ProSci)、mt-Hsp70(ABR)与β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)。
肽、质粒与重组蛋白表达。经HPLC纯化的细胞透过性翻转-反转牧羊犬蛋白拟肽(存活素序列Lys79-Leu87)及其乱序细胞透过性变体如(Plescia etal.,Cancer Cell,7:457-468,(2005))所述合成,并用于分析细胞存活率、细胞色素c释放与线粒体膜电势。FITC结合天然Sheph,以及细胞透过性Sheph-ANT、Scram、Scram-ANT亦如(Plescia et al.,2005,见上)所述合成。Mammalian Gene Collection(MGC)的全长CypD克隆(GenBank Acc.No.BC030707)购自Invitrogen,并通过PCR使用引物5′AAAAAGAATTCCTGGCGCTGCGCTGCGGCTC 3′(SEQ ID NO:31)与5′AAAAACTCGAGCAGATTAGCTCAACTGGCCACAGTC 3′(SEQ ID NO:32)或,亦可使用5’AAAAAGAATTCGGCGGCATGTGCAGCAAGGGCTCCGGCG 3’(SEQ IDNO:33)与5′AAAAACTCGAGCAGATTAGCTCAACTGGCCACAGTC 3’(SEQ ID NO:34)进行扩增。
MGC全长TRAP-1克隆(GenBank ACC.No.NM_004257(蛋白为NP004248))购自Invitrogen,且所述全长克隆用于转染实验,而对应于所述蛋白成熟形式从Ser60开始的转录物分别使用正向引物5’AAAAAGGATCCGTACGACATGGCGCGCGA 3’(SEQ I.D NO:35)与5′AAAAAGGATCCAGCACGCAGACCGCCGAGG 3’(SEQ ID NO:36),与3’反向引物:5′AAAAACTCGAGCTAGTGTCGCTCCAGGGCCTT 3′(SEQ IDNO:37)进行扩增。将所得PCR产物用EcoRI/XhoI(CypD)或BamHI/XhoI(TRAP-1)消化,并分别连接于pGEX-4T(Pharmacia)或pcDNA3.0(Invitrogen)以进行原核或真核/体外翻译表达。将pGEX-CypD、pGEX-TRAP-1或pGEX-Hsp90cDNA转录入BL21-CodonPlus-RIL大肠杆菌菌株(Stratagene)。
小鼠PiC的全长克隆(溶质(solute)载体家族25(线粒体载体,磷酸载体),成员3(GenBank Acc.No.AL360268(蛋白为CAI13838))购自Invitrogen。PiCcDNA使用引物5′AAAAAGGATCCAGGAGGATGTTCTCGTCCGTAGC 3′(SEQ ID NO:38)与5′AAAAACTCGAGCTACTCAGTTAACCCAAGCTTCTTCTTC 3′(SEQ IDNO:39)进行扩增,且PCR产物用BamHI/XhoI消化,并亚克隆入pcDNA3以产生pcDNA-PiC。用0.2mM IPTG在30℃下诱导重组蛋白5小时,并将所述蛋白自细菌提取物中提纯,如(Fortugno et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(24):13791-6,(2003))所述。
蛋白浓度用Protein Assay试剂(Bio-Rad)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准确定。
亚线粒体分级分离。亚线粒体分级分离通过磷酸涨缩法如之前所述(Bijur and Jope,J.Neurochem.,87:1427-1435,(2003);Hovius et al.,Biochim.Biophys.Acta,1021:217-226,(1990))带微小改动而实施。简言之,将如上所述蔗糖不连续梯度法分离的高度提纯的线粒体沉淀悬浮于膨胀缓冲液中(10mM KH2PO4,pH7.4与蛋白酶抑制剂)并在0℃下温育20分钟,轻微搅拌。将膨胀的线粒体与等体积的收缩缓冲液(10mM KH2PO4,pH7.4,32%蔗糖、30%甘油、10mM MgCl2与蛋白酶抑制剂)混合,并在0℃下继续温育20分钟。在以10000xg离心10分钟后,收集上清,其为包含外膜与间膜空间的线粒体分离组分(OM&IMS)。沉淀用1∶1的膨胀/收缩缓冲液洗涤3次,悬浮于膨胀缓冲液中,并进行超声波处理以破坏内膜,收集得到包含内膜与基质的线粒体分离组分(IM&MA)。OM&IMS与IM&MA通过以150000xg在4℃下离心1小时进一步分级分离。将沉淀分别作为OM与IM分离组分收集。上清进一步使用Centricon 10K与Microcon 10K离心过滤装置(Millipore)并分别作为IMS与MA分离组分收集。
在其它实验中,将分离自HeLa细胞或小鼠脑(2μg/μl,15μl)的线粒体悬浮于SHE缓冲液(HE缓冲液中250mM蔗糖),在135μl SHE缓冲液或HE缓冲液中(10mM Hepes、1mM EDTA,pH7.2)稀释,并在0℃下温育15分钟,同时通过反复抽吸以机械破坏线粒体外膜。试样用50μg/ml蛋白酶K(Roche)在0℃下温育10分钟,并通过Western blotting分析。此外,用增加浓度的毛地黄皂苷(0-0.4%)处理试样以渗透线粒体膜,并用Western blotting分析线粒体蛋白从沉淀到上清的再分配,如(Dohi et al.,J.Clin.Invest.114(8):1117-27,(2004))所述。
线粒体分离与药物的“趋线粒体”特性。线粒体如之前所述(Kang et al.,Cell,131:257-270(2007))从HeLa细胞中分离。简言之,收获HeLa细胞并用TD缓冲液(135mM NaCl,5mM KCl,25mM Tris,pH 7.6)洗涤。将细胞沉淀悬浮液CaRSB缓冲液(10mM NaCl,1.5mM CaCl2,10mM Tris,pH 7.5,蛋白酶抑制剂)中,并于0℃下温育5分钟。用Dounce研磨器将膨胀细胞匀浆化,并立即与1.5体积的MS缓冲液(210mM甘露醇,70mM蔗糖,5mM Tris,pH 7.6,5mM EDTA)混合。细胞核与其它细胞碎片通过在600xg离心15分钟去除。将试样每2600μg线粒体用200μM伽米替尼或17-AAG进一步在0℃下温育5分钟,且所处理的线粒体通过在6000xg下类型10分钟重新分离。所得线粒体沉淀悬浮于MS缓冲液中,并施以在10mM Tris、5mM EDTA,pH7.6、2mM DTT加上蛋白酶抑制剂的1M/1.5M蔗糖不连续梯度中以110000xg离心1.5小时。分离所得线粒体条带,将其在MS缓冲液中洗涤并在含有150mM NaCl、10mM Tris,pH 7.4、0.5%IGEPAL CA-630、1mM EDTA加上蛋白酶抑制剂的缓冲液中裂解。使用Bio-rad蛋白分析试剂用BSA作为标准确定其蛋白浓度。类似蛋白浓度的吸光度在338nm处使用DU380分光光度计(Backman Coulter)确定。因为其最大限的吸光度以及针对17AAG与伽米替尼的信号强度类似,使用338nm处的吸光度进行药物检测。
分离线粒体的荧光分析。在3ml 20mM Tris缓冲液中温育经FITC结合牧羊犬蛋白温育的个别线粒体亚组分(20μg),并以497nm激发波长与525nm发射波长使用CARY ECLIPSE荧光分光光度计(Varian Inc.CA,USA)测量荧光强度(U,任意单位)。在一些实验中,用20μM FITC-牧羊犬蛋白或FITC-乱序肽处理MCF-7细胞30分钟。收获细胞,并使用来自PIERCE的Mitochondria Isolation kit分级分离线粒体。使用Protein assay reagent(Bio-Rad)用BSA作为标准确定蛋白浓度。将五十微克蛋白试样与3ml 20mMTris buffer,pH 7.4,并且在分光光度计(Varian Inc.CA,USA)上以497/525nm激发/发射波长测量荧光强度。
体外线粒体摄入分析。在分离线粒体组分中重组蛋白的摄入如(Younget al.,Cell,112:41-50,(2003))所述带细微改变进行分析。简言之,分离小鼠脑线粒体在含有250mM蔗糖、80mM乙酸钾、20mM HEPES-KOH,pH 7.5、5mM乙酸镁的MC缓冲液中如所述进行洗涤。在体外转录与翻译的35S标记蛋白用等积的MCS缓冲液(500mM蔗糖、80mM乙酸钾、20mMHEPES-KOH(pH7.5)、5mM乙酸镁)稀释,并用在30℃下混于含纯化线粒体(30μg)的50μl总体积中一小时,存在或不存在1μM缬氨霉素。将试样在冰上冷却,并用50μg/ml蛋白酶K在0℃处理10分子。蛋白裂解消化通过添加1mM PMSF中止,并通过在6000xg离心10分钟重新分离线粒体。蛋白摄入线粒体的差异通过放射自显影来确定。
免疫沉淀、下拉分析与亲和层析。分离Raji线粒体在含有150mM NaCl,10mM Tris,pH 7.4,1%Triton X-100,0.5%IGEPAL CA-630加上蛋白酶抑制剂的缓冲液(Roche)中在4℃下持续搅拌裂解1小时。在4℃下以13000xg离心10分钟后,用蛋白G-琼脂糖珠(Calbiochem)在4℃下预清除上清3小时,并在CsA(5μM)或GA(10μM)存在或不存在情况下将200μg经预清除的蛋白与针对Hsp90或TRAP-1抗体在4℃下温育16小时。沉淀的免疫复合物在裂解缓冲液中洗涤,结合蛋白通过SDS凝胶电泳分离,并通过Westernblotting分析。对下拉(pull down)实验,GSH-珠结合GST-CypD、GST-TRAP-1或GST-Hsp90用含有20mM Hepes,pH7.7,75mM KCl,0.1mM EDTA,2.5mMMgCl2,0.05%NP40,1mM DTT加上1mg/ml BSA的H-缓冲液封闭。在CsA或GA存在的情况下,将经封闭的珠与纯化重组蛋白或35S标记蛋白在H-缓冲液中4℃下温育16小时。在温育结束时,在H缓冲液中洗涤沉淀珠,结合蛋白通过SDS凝胶电泳分离,并通过Western blotting或放射自显影分析。对体内捕获分析,在CsA(5μM)或GA(10μM)存在情况下,将GST或GST-CypD与分离Raji线粒体在H-缓冲液中在4℃下混合16小时。洗涤结合蛋白,并通过Western blotting分析。在一些实验中,将牧羊犬蛋白或乱序拟肽(5mg/ml)与琼脂糖珠偶联,并用以分级分离纯化Raji线粒体。经洗涤后,结合的物质用0.1M甘氨酸,pH2.5洗脱,立刻将其中和,并通过Westernblotting分析。
细胞色素c释放。用对照或多种Hsp90拮抗剂处理肿瘤细胞类型,且以5-30分钟间增加的时间间隔收获细胞溶胶提取物并通过Western blotting分析。对无细胞系统的反应,将纯化线粒体(20μg)悬浮于500μl SB缓冲液(0.2M蔗糖、10mM Tris-MOPS,pH7.4,5mM琥珀酸、1mM磷酸钠、10μMEGTA-Tris与2μM鱼藤酮(rotenone))中。在22℃用对照或多种Hsp90拮抗剂处理试样20分钟。在每个温育反应结束时,通过6000xg离心10分钟分离线粒体与上清,并通过Western blotting分析。
线粒体膜电势。Raji细胞用牧羊犬蛋白或对照乱序拟肽(100μM)或17-AAG(5μM)处理,载以线粒体膜电势敏感性荧光染料JC-1,并通过流式细胞术分析绿/红荧光比例的变化。对无细胞系统中的实验,将分离自原生正常细胞、多种肿瘤细胞类型或正常小鼠器官的纯化线粒体悬浮于SB缓冲液中。将试样(100μg)与0.1μM SB缓冲液中的四甲基罗丹明甲酯(TMRM)温育,在CsA(5μM)存在或不存在的情况下用免疫球蛋白或多种乱序拟肽(0.5-1.5μM)、17-AAG(1.5μM)或ANT-GA(1-1.5μM)处理,并在549nm激发与575nm发射下连续分析(Photon Technology International,Inc)。对这些实验,允许SB缓冲液中的TMRM装载线粒体达到稳定荧光强度,其设定为完全极化状态(最大限膜电势)。用2mM CaCl2处理后的荧光强度设为最小限膜电势(完全去极化状态)。将每次处理后荧光强度的变化以最大限与最小限膜电势间的比值作图。在一些实验中,增加浓度(10-100μg)分离自HeLa或MCF-7细胞的TMRM装载线粒体在3mlSB缓冲液中稀释,规正化至总蛋白浓度相对于500μg BSA,并分析膜电势针对对照或所述多种Hsp90拮抗剂反应的变化。
线粒体功能。将正常或肿瘤线粒体(100μg)载以0.1mM四甲基罗丹明甲酯(TMRM),在存在或不存在CsA情况下用伽米替尼或17-AGG温育,并持续在549nm激发与575nm发射处分析其内膜电势的变化(Photon TechnologyInternational,Inc.)。在使用2mM CaCl2处理后的荧光强度对应完全非极化状态。此外,用荧光染料JC-1(Molecular Probes)标记H460细胞,并在用多种试剂处理后通过多参数流式细胞术分析红/绿(F1-2/F1-1)荧光比值的变化。在经药物处理的分离线粒体沉淀或上清中细胞色素c成分通过Western blotting确定。
细胞死亡分析。细胞存活率的调节通过MTT(Kang et al.,“Regulation oftumor cell mitochondrial homeostasis by an organelle-specific Hsp90 chaperonenetwork,”Cell,131:257-270(2007))确定。为确定细胞凋亡,使用CaspaTag(Intergen,Burlington,MA)通过多参数流式细胞术(Kang et al.,“Regulation oftumor cell mitochondrial homeostasis by an organelle-specific Hsp90 chaperonenetwork,”Cell,131:257-270(2007))分析细胞的胱天蛋白酶活性(DEVDase活性)与细胞膜完整性(碘乙锭)。
分析Hsp90功能。对GA珠竞争实验,将SKBr3乳房癌细胞在TNESV裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,1%Nonidet P-40,2mM EDTA,100mMNaCl,1mM正钒酸钠、1mM苯甲磺酰氟、每ml中20μg牛抑肽酶(aprotinin)与亮肽酶素(leupeptin))中裂解。在离心澄清上清后,将裂解液与0、0.5、1或10μM伽米替尼,或0、0.05、0.1或0.5μM GA在冰上温育30分钟。随即对裂解液(等蛋白)使用GA珠沉淀进行Hsp90亲合纯化,并对Hsp90如前所述(Marcu et al.,“Novobiocin and related coumarins and depletion of heatshock protein 90-dependent signaling proteins,”J Natl Cancer Inst,92:242-248(2000))进行印迹分析。用光密度量化通过对由Western blotting可视化的Hsp90条带进行扫描与图像分析以确定残留在裂解液中的Hsp90水平。数据代表两个具有相同结果的独立反应并表明伽米替尼在与GA珠竞争Hsp90结合上与GA同样有效。
在其它实验中,伴侣依赖性GST-Chk1的重构成如之前所述(Arlander etal.,“Chaperoning checkpoint kinase 1(Chk1),an Hsp90 client,with purifiedchaperones,”J Biol Chem,281:2989-2998(2006))确定。简言之,每个试样含有0.7μg树脂结合GST-Chk1(残基1-265)、1μg纯化人类Hsp90α与下列量的其它纯化伴侣蛋白:10μg Hsp70、2μg Hdj1、2μg p50cdc37、0.06units CK2、2.5μg p60Hop。确定由于在伽米替尼或17-AAG存在或不存在情况下Chk1依赖性Cdc25的磷酸化导致的光学密度,并将其以高于缺乏添加伴侣蛋白的试样的激活倍数作图。在一些实验中,用伽米替尼(G1-G4)或17-AAG(5μM)处理HeLa细胞24小时,并通过Western blotting分析分离提取物的Akt或Hsp70表达的调节。
细胞显像。对荧光标记研究,HeLa细胞与FITC结合牧羊犬蛋白或细胞透过性乱序拟肽在线粒体标记MitoTracker的存在下温育。在倒置显微镜(Zeiss Axiovert 200)下使用Perkin-Elmer CSU-10转碟共聚焦扫描器(spinningdisc confocal scanner)摄取图像。使用Hamamatsu ORCA照相机对整个细胞每0.3μm摄取Z-section,并使用Metamorph 6.3r5(Universal Imaging Corp.)作为投影展示。对时间间隔显微录像术,将HeLa细胞保持在35mm玻底组织培养皿(Mat-tek)中。在成像前,在生长条件下用400nM CM-H2XRos(M7513,Molecular Probes)温育细胞15分钟。在洗涤后,添加新鲜培养基,并在人造环境柜(PDMI-2;Harvard Apparatus)内在有CO2交换(0.5升/分钟)情况下在完全培养基中对细胞进行成像。使用带绿色干扰滤镜的100x相差镜头在倒置显微镜(Olympus IX-70)对细胞进行成像。将图像捕获于CoolSnapHQ CCD照相机(Roper Scientific)上,并使用Metamorph software(UniversalImaging Corp.)连锁。在所述时间区间的前10分钟,在不存在任何试剂的情况下对细胞进行成像,在此时点在摄取影像间按滴添加牧羊犬蛋白或细胞透过性乱序拟肽。线粒体的相差图像通过CM-H2XRos标记的存在验证。在一些实验中,分离线粒体用ANT-GA平衡化,用50μg/ml蛋白酶K处理,并通过荧光显微镜分析。
电子显微镜。分离HeLa细胞线粒体在3%甲醛与0.1%戊二醛中在37℃下固定10分钟,在50mM PBS中的NH4Cl,pH7.4中在22℃下温育60分钟以酰胺化自由醛,通过一系列到100%的乙醇脱水,并转移入50∶50(v/v)树脂(Lowicryl K4M):100%乙醇混合物在22℃下过夜。将试样转移至新鲜树脂(x3)的等分试样中,并在60℃下施用于填充包埋胶囊24小时。使用超薄切片机(Reichert-Jung Ultracut E)切得薄切片,置于金支持栅栏上,在22℃下封闭30分钟,并与针对Hsp90N-域的抗体或对照非结合IgG温育。在添加金结合二次抗体(1∶20,Jackson ImmunoResearch Laboratories)后,洗涤试样,将其在22℃下暴露于OsO4蒸汽1小时,用乙酸双氧铀与柠檬酸铅复染,并在Philips EM10电子显微镜上以80kV分析,如(Dohi et al.,J.Clin.Invest.114(8):1117-27,(2004))所述。
分析细胞存活率与细胞凋亡。在37℃下用增加浓度的Hsp90拮抗剂或其相应的对照(牧羊犬蛋白,0-150μM;17-AAG,0-100μM;ANT-GA,0-100μM)处理正常或肿瘤细胞类型1-2.5小时,并通过MTT(Plescia et al.,Cancer Cell,7:457-468,(2005))分析细胞存活率的所示。此外(alternatively),用CypD抑制剂CsA(1μM)处理HeLa细胞,或用对照无目标siRNA或针对CypD的SmartPool siRNA(Dharmacon)对其转染,并在48小时后通过MTT分析其细胞存活率。在多个siRNA寻靶反应中蛋白表达的变化通过Westernblotting衡量。为分析TRAP-1导向细胞保护,原生非转化人类成纤维细胞HFF与WS-1用对照pcDNA3或TRAP-1 cDNA通过lipofectamine转染24小时,暴露以增加浓度(0-1μM)的细胞生物激发剂星形孢菌素(STS),并在另外24小时温育通过MTT后分析细胞凋亡。为分析细胞凋亡,用对照或ANT-GA(100μM)处理p53+/+或p53-/-,并通过同时多参数流式细胞术分析其DEVDase活性(CaspaTag)与碘乙锭染色,如(Dohi et al.,J.Clin.Invest.114(8):1117-27,(2004);Plescia et al.,Cancer Cell,7:457-468,(2005))所述。
组织处理与免疫组织化学。人类乳腺癌、胰腺癌、肺腺癌、结肠腺癌与其对应正常组织的匿名原生手术样本自UMass Memorial Cancer CenterTissue Bank无识别(identifiers)的获取。组织样本固定于缓冲的福尔马林中,并包埋于石蜡。为组织染色,将切片脱石蜡,在水中重新水化,并淬灭内源过氧化物酶。表位热回收通过在10%柠檬酸钠中蒸试样(slides)60分钟进行。经处理的玻片在PBS中润洗,并用针对TRAP-1或对照IgG的抗体使用标准抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶技术(Histostain-plus,ZymedLaboratories)染色。用DBA作为色原体温育玻片,并使用苏木精复染(counterstained with haematoxylin)。分析了每个组织病理学诊断两个独立案例,以及其对应各正常组织,获得相同结果。
统计分析。数据通过双向unpaired t test在GraphPad software package forWindows(Prism 4.0)上进行分析。0.05的p值视为统计上具有显著性。
其它实施方案
应理解为尽管本发明已通过其详细的描述加以说明,前述描述仅意为说明,而非限定本发明的范围,其由附加的权利要求范围所定义。其它方面、优点以及修饰处于下述权利要求的范围中。
Claims (41)
1.包含下式的组合物或其药学上可接受的盐:
A-B,
其中A为分子伴侣抑制剂,B为线粒体穿透部分,且A与B相连接,任选地,通过连接部分连接,其中若A为牧羊犬蛋白或其片段,则B不为触角蛋白螺旋III同源结构域细胞穿透肽(ANT)或其片段。
2.权利要求1所述的组合物,其中A为选自下组的小分子:安莎霉素类Hsp90抑制剂;格尔德霉素类似物Hsp90抑制剂;嘌呤支架类-Hsp90抑制剂;间苯二酚Hsp90抑制剂与大环内酯类-Hsp90抑制剂。
3.权利要求1所述的组合物,其中A为Hsp90的肽抑制剂。
4.权利要求1所述的组合物,其中A为包含SEQ ID NO:2(His-Ser-Ser-Gly-Cys)的牧羊犬蛋白肽。
5.权利要求3所述的组合物,其中A为包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的序列的肽,且其结合并抑制Hsp90。
6.权利要求1所述的组合物,其中B为线粒体穿透肽。
7.权利要求6所述的组合物,其中B选自下组:线粒体融合蛋白肽、靶向线粒体的信号肽、TAT肽、ANT肽、VP22肽或Pep-1肽。
8.权利要求1所述的组合物,其中B为RNA线粒体穿透信号。
9.权利要求1所述的组合物,其中B选自下组:富胍类肽、富胍多聚氨基甲酸酯、β-寡精氨酸和富脯氨酸树状聚体。
10.权利要求1所述的组合物,其中A包括17-烯丙基氨基去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)。
11.权利要求1所述的组合物,其中A包括根赤壳菌素。
12.权利要求1所述的组合物,其中A包括嘌呤支架类Hsp90抑制剂。
13.权利要求1所述的组合物,其中A包括17-二甲基氨基格尔德霉素。
16.权利要求1所述的组合物,其中B为(芳基)3P-。
19.权利要求18所述的组合物,其中R2为H或烷基;R3为H、烷基;和R4为H或ORd,其中Rd为H、烷基。
20.权利要求18所述的组合物,其中R2为H;R3为甲基;和R4为H。
21.权利要求10-13任一项所述的组合物,其中B包括ANT或其线粒体穿透片段。
22.权利要求1所述的组合物,其包括A与B之间的连接部分。
23.权利要求22所述的组合物,其中所述连接部分选自下组:肽接头与化学接头。
24.权利要求1所述的组合物,其中所述连接部分为二价的,且选自下组:亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚芳基、亚杂芳基,与肽接头,其中所述亚烷基、亚烯基或亚炔基的任何两个邻近的碳碳键可任选地由一个或多个O、NH、S、PRe、C(O)NRf、亚芳基、亚杂环烷基或亚杂芳基替代;其中Re与Rf独立选自烷基或芳基。
26.权利要求1所述的组合物,其中所述连接部分为亚烷基。
27.权利要求26所述的组合物,其中所述连接部分为具有六个碳原子的亚烷基。
29.权利要求28所述的组合物,其中所述盐为六氟磷酸盐。
30.权利要求26所述的组合物,其中R1为RaRbRcSi,其中Ra、Rb与Rc独立选自烷基或芳基;R2为H;R3为H、烷基;R4为H;且n为1、2、3或4。
32.权利要求31所述的组合物,其中所述盐为六氟磷酸盐。
34.权利要求33所述的组合物,其中q为3。
35.权利要求33所述的组合物,其中芳基为苯基和q为3。
36.权利要求33所述的组合物,其中X为六氟磷酸。
38.一种诱导癌细胞或肿瘤细胞死亡的方法,所述方法包括将权利要求1-16中任何靶向线粒体的伴侣抑制剂以足以诱导癌细胞死亡的量施与受试者。
39.一种诱导癌或肿瘤细胞死亡的方法,所述方法包括:
鉴别罹患癌或肿瘤的受试者;
确定所述癌细胞或肿瘤细胞是否具有较之对照细胞增加的伴侣的线粒体浓度;
若在所述受试者中具有增加的所述伴侣的线粒体水平,则对哺乳类施以靶向线粒体的伴侣抑制剂,其包括下式:
A-B,
其中A为伴侣抑制剂而B为线粒体-穿透部分且A与B连接,任选地由连接部分连接。
40.一种鉴别抑制伴侣活性的候选试剂的方法,所述方法包括:
提供包含至少一种伴侣与亲环素D的试样;
将所述试样与测试试剂相接触;并
检测所述伴侣与所述试样中的亲环素D在测试试剂存在与不存在情况下的结合,其中,抑制结合的测试试剂为抑制伴侣活性的候选试剂。
41.权利要求40所述的方法,其中所述伴侣为Hsp60、HspA9、Hsp90或TRAP-1。
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