KR20100074177A - 미토콘드리아-표적화된 항-종양 물질 - Google Patents

미토콘드리아-표적화된 항-종양 물질 Download PDF

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KR20100074177A
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mitochondria
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다리오 씨. 알티에리
병 훈 강
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유니버시티 오브 매사추세츠
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Abstract

본 발명은 미토콘드리아-표적화된 항종양제, 상기 미토콘드리아-표적화된 항종양제를 제조하는 방법 및 원치않는 세포 증식과 연관된 질병의 치료를 위하여 상기 미토콘드리아-표적화된 항종양제를 사용하는 방법을 개시한다. 일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식을 갖는 조성물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다: A-B, 여기서 A는 분자 샤페론 억제자이고 B는 미토콘드리아-관통성 모이어티이고, A와 B는 연결 모이어티에 의해 연결되거나, 연결되지 않는다.

Description

미토콘드리아-표적화된 항-종양 물질{MITOCHONDRIA-TARGETED ANTI-TUMOUR AGENTS}
우선권 주장
본원은 2007년 9월 10일에 출원된, 미국 가특허 출원 제60/993,195호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 참고문헌으로써 본 명세서에 통합된다.
연방 정부 지원하의 연구 또는 개발
본 발명은 미국국립보건원에 의해 수여된, 보조금 번호 HL54131, CA78810, 및 CA90917하의 정부 보조로 진행되었다. 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 발명은 항종양 물질로 사용되는, 분자 샤페론, 예를 들어, 열 충격 단백질(Heat Shock Protein) 90(Hsp90), Hsp60, 열 충격 70kDa 단백질 9(Heat Shock 7OkD Protein 9)(HSPA9/모르탈린(mortalin)), 또는 TNF 수용체-연관 단백질 1(TRAP-1)의 미토콘드리아-표적화된 억제자, 상기 억제자의 제조 방법 및 원치 않는 세포 증식과 연관된 질환의 치료를 위한 상기 억제자의 사용 방법과 관련이 있다.
배경
종양 세포는 매우 비우호적인 환경에서 생존 및 증식하기 위하여 향상된 능력을 나타낸다. 이들은 정상(즉, 비-암성) 세포가 유해한 환경에서 분열하는 것을 막는 다수의 세포 경로를 하향 조절시키는 것으로 드러났고, 이들은 또한 악조건하의 많은 정상 조직에서 세포 사멸을 야기시키는 아폽토시스 경로를 불활성화시킨다. 종양 세포는 또한 활발한 증식을 유지하기 위해 필요한 경로들을 상향 조절시키는 것으로 믿어진다. 예를 들어, 다수의 종양 세포는 이들이 증식을 지속하는데 필요한 단백질 기구를 합성하고 유지하도록 하는 세포 스트레스-반응 경로를 활성화시킨다. 종양에서 활성화된 스트레스 반응은 열-충격 단백질(Hsps)의 상향-조절을 포함하는데, 상기 단백질은 ATPase-유도성 분자 샤페론이다. 특히, Hsp90은 다수의 암성 조직내에서 상향조절된다. Hsp90은 제한된 수의 클라이언트 단백질의 폴딩/성숙과 프로테아좀 파괴 사이에서의 균형을 조절하는데, 상기 단백질중 일부는 신호 전달과 세포 증식에 관여한다.
요약
본 발명은, 적어도 부분적으로, 분자 샤페론 Hsp90, Hsp60, 및 TRAP-1이 정상 세포와 비교할 때 종양 세포의 미토콘드리아에서 증가된 수준으로 발견되며, 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 사용한 종양 세포 미토콘드리아내 분자 샤페론의 억제는 종양 세포 사멸을 야기시킨다는 발견에 기초한다.
일 양상에서, 본 발명은 하기 화학식을 갖는 조성물(compositions) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
A-B,
상기 식에서 A는 분자 샤페론 억제자(molecular chaperone inhibitor)이고 B는 미토콘드리아-관통성 모이어티(mitochondria-penetrating moiety)이고 A와 B는 연결 모이어티에 의해 연결되거나 연결 모이어티 없이 연결된다. 그러나, A가 쉬페르딘(Shepherdin) 또는 이의 단편인 경우, B는 안테나페디아 헬릭스 III 호메오도메인 세포-관통성 펩티드(Antennapedia helix III homeodomain cell-penetrating peptide, ANT) 또는 이의 단편이 아니다.
일부 구체예에서, A는, Hsp90에 결합하고 이를 억제하는, 소분자(small molecule), 예를 들어, 안사마이신(Ansamycin) 클래스 Hsp90 억제자; 젤다나마이신 유사체; 퓨린-스캐폴드 클래스 Hsp90 억제자, 레조르시놀; 또는 매크로락톤-Hsp90 억제자; Hsp90의 펩티드 억제자, 예를 들어, 서열번호 2(His-Ser-Ser-Gly-Cys)를 포함하는 쉬페르딘 펩티드; 또는 서열번호 1과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 펩티드이거나 상기한 것들을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, A는 라디시콜 또는 이의 유사체; Hsp90의 퓨린 억제자; 17-알릴아미노-데메톡시젤다마이신(17-AAG); 17-디메틸아미노젤다나마이신; 17-GMB-APA-GA(폴리펩티드에 대한 GA의 컨주게이션을 가능하게 하는 젤다나마이신의 말레이미도 유도체); 17-(디메틸아미노에틸아미노)-17-데메톡시젤다나마이신(17-DMAG); 17-[2-(피롤리딘-1-일)에틸]아미노-17-데메톡시젤다나마이신(17-AEP-GA); 또는 17-(디메틸아미노프로필아미노)-17-데메톡시젤다나마이신(17-DMAP-GA)이거나 상기한 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티, B는
Figure pct00001
을 포함하는데, 여기서 R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 RaRbRcSi이고; Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다.
일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티, B는,
Figure pct00002
를 포함하는데, 여기서 Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n은 1, 2, 또는 3일 수 있다.
일부 구체예에서, B는 미토콘드리아 관통성 펩티드, 예를 들어, 마이토푸신 펩티드, 미토콘드리아 표적성 신호 펩티드, 안테나페디아 헬릭스 III 호메오도메인 세포-관통성 펩티드(ANT)(예를 들어, 서열번호 18을 포함함), HIV-1 Tat 염기성 도메인(예를 들어, 서열번호 19 또는 20을 포함함); VP22 펩티드, 또는 Pep-1 펩티드; RNA 미토콘드리아 관통성 신호(예를 들어, 서열번호 21, 22, 23, 또는 24를 포함함)이거나; 구아니딘-풍부 펩토이드, 구아니딘-풍부 폴리카바메이트, β-올리고아르기닌, 및 프롤린-풍부 덴드리머로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, B는 테트라구아니디늄(tetraguanidinium), 트리이구아니디늄(triiguanidinium), 디구아니디늄, 또는 모노구아니디늄 화합물, 또는 트리페닐포스포늄 화합물이다.
일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티, B는, (아릴)3P-를 포함한다.
일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티, B는, 로다민(Rhodamine) 123을 포함한다:
Figure pct00003
.
상기 구성물의 일부 구체예에서, 분자 샤페론 억제자, A는 젤다나마이신 유사체를 포함한다:
Figure pct00004
, 여기서, R2는 H, 알킬, 아릴, 또는 아릴알킬이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H, 알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 또는 ORd이다(여기서 Rd는 H, 알킬, 또는 아릴알킬임).
조성물의 일부 구체예에서, R2는 H 또는 알킬이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H, 또는 ORd이다(여기서 Rd는 H, 알킬임).
조성물의 일부 구체예에서, R2는 H이고; R3는 메틸이고; R4는 H이다.
조성물의 일부 구체예에서, B는 미토콘드리아 관통성 펩티드, 예를 들어, 마이토푸신 펩티드, 미토콘드리아 표적 신호 펩티드, 안테나페디아 헬릭스 III 호메오도메인 세포-관통성 펩티드(ANT)(예를 들어, 서열번호 18을 포함함), HIV-1 Tat 염기성 도메인(예를 들어, 서열번호 19 또는 20을 포함함); VP22 펩티드, 또는 Pep-1 펩티드; RNA 미토콘드리아 관통성 신호(예를 들어, 서열번호 21, 22, 23, 또는 24를 포함함)이거나; 구아니딘-풍부 펩토이드, 구아니딘-풍부 폴리카바메이트, β-올리고아르기닌, 및 프롤린-풍부 덴드리머, 포스포늄 염, 예를 들어, 메틸트리페닐포스포늄 및 테트라페닐포스포늄으로 구성된 군에서 선택된다. 조성물의 일부 구체예에서, B는 ANT 또는 이의 미토콘드리아-관통 단편이거나 상기한 것들을 포함한다. 조성물의 일부 구체예에서, B는 테트라구아니디늄, 트리이구아니디늄, 디구아니디늄, 또는 모노구아니디늄 화합물, 또는 트리페닐포스포늄 화합물이거나 상기한 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 A와 B 사이에 연결 모이어티, 예를 들어, 펩티드 링커 또는 화학적 링커를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 링커 모이어티는 2가(divalent)이고 알킬렌, 알케닐렌, 아키닐렌, 시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 및 펩티드 링커로 구성된 군에서 선택될 수 있는데, 여기서 상기 알킬렌, 알케닐렌, 또는 아키닐렌의 임의의 2개의 인접한 탄소-탄소 결합은 O, NH, S, PRe, C(O)NRf, 아릴렌, 헤테로시클로알킬렌, 또는 헤테로아릴렌 중 하나 이상으로 대체되거나 비대체될 수 있으며, 여기서 Re 및 R은 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 모이어티는
Figure pct00005
이다.
일부 구체예에서, 상기 링커 모이어티는 알킬렌이다.
일부 구체예에서, 상기 링커 모이어티는 6개의 탄소 원자를 지니는 알킬렌이다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00006
, 여기서, R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 RaRbRcSi이고; R2는 H, 알킬, 아릴, 또는 아릴알킬이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H, 알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 또는 ORd이고(여기서, Rd는 H, 알킬, 또는 아릴알킬임); Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n은 1과 10 사이의 정수이다.
일부 구체예에서, 상기 염은 헥사플루오로포스페이트 염이다.
일부 구체예에서, R1은 RaRbRcSi이고, Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; R2는 H이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H이고; n은 1, 2, 3, 또는 4이다.
일부 구체예에서, 화합물은 하기 화학식의 화합물일 수 있다:
Figure pct00007
, 여기서, q는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
일부 구체예에서, q는 3이다.
일부 구체예에서, 아릴은 페닐이다.
일부 구체예에서, 아릴은 페닐이고 q는 3이다.
일부 구체예에서, X는 헥사플루오로포스페이트일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기 화합물일 수 있다:
Figure pct00008
.
추가 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 피검체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 포유동물에서, 암 세포 사멸 또는 종양 세포 사멸을 유도하는 방법을 포함하는데, 당해 방법은 암 세포 사멸을 유도하는데 충분한 양의 본원에 기재된 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 피검체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 피검체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 포유동물에서, 암 세포 사멸 또는 종양 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 암 또는 종양, 예를 들어, 암 세포 또는 종양 세포를 포함하는 암 또는 종양을 지니는 피검체를 확인하는 단계; 상기 암 또는 종양의 세포가 대조군, 예를 들어, 정상, 비종양, 비암 세포와 비교하여, 예를 들어, 샤페론, 샤페론, 예를 들어, Hsp90 또는 Trap-1의 증가된 미토콘드리아 농도를 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 피검체가 상기 샤페론의 증가된 미토콘드리아 수준을 지니는 경우, 당해 방법은 하기 화학식을 포함하는 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다:
A-B,
여기서, A는 샤페론 억제자이고 B는 미토콘드리아-관통성 모이어티이고, A와 B는, 예를 들어, 본원에 기재된, 연결 모이어티에 의해 연결되거나 비연결된다.
아직 추가 양상에서, 본 발명은 샤페론 활성을 억제시키기 위한 후보 물질을 확인하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 하나 이상의 샤페론 및 시클로필린(Cyclophilin) D를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 상기 샘플과 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 시험 물질의 존재 및 부재시에 상기 샘플내의 상기 샤페론 및 시클로필린 D의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 결합을 억제하는 시험 물질은 샤페론 활성을 억제시키는 후보 물질이다. 일부 구체예에서, 상기 샤페론은 Hsp60, HspA9, Hsp90, 또는 TRAP-1이다.
본원에 사용된 용어 "암"은 세포의 비조절된, 비정상적 성장으로 특징지워지는 질병을 의미한다. "암 세포"는 비조절된 성장을 동반하며 비정상적으로 분열하고 증식하는 세포이다. 이 세포는 이의 기원(예를 들어, 종양)의 부위로부터 떨어져 나와 신체의 다른 부위로 옮겨가 또 다른 부위(예를 들어, 또 다른 종양)를 생성시킬 수 있는데, 이 과정은 전이로 지칭된다. "종양"은 비조절되고 점진적인 과도한 세포 분열을 야시시키는 비정상적 세포 덩어리이고, 신생물로도 지칭된다. 종양은 양성(비암성) 또는 악성일 수 있다. 본원에 기재된 방법은, 치료되어야 할 세포가 본원에 기재된 샤페론의 미코콘드리아 국소화(localization)를 지니기만 하면, 암 및 종양 세포, 즉, 악성 및 양성 종양을 비롯한 비고형 종양을 지니는 암(예컨대, 조혈암)의 치료에 유용하다.
분자 샤페론은 최종 구조의 성분이 되지 않으며너 폴리펩티드의 정확한 세포내 폴딩 및 조립에 관여하는 임의의 단백질 집단이다. 분자 샤페론은 세균, 미토콘드리아, 및 진핵 세포질에서 발견된다. 본원에서, "분자 샤페론" 및 "샤페론"은 교체가능하게 사용된다.
본원에서, 용어 "향미토콘드리아성(mitochondriotropic)"는 "미토콘드리아 표적성(mitochondrial targeting)" 및 "미토콘드리아-관통성(mitochondrial penetrating)"과 교체가능하게 사용된다.
본원에서, 용어 "향미토콘드리아성 작용제(mitochondriotropic agents)"는 본원에 기재된 화학식 A-B를 갖는 조성물을 의미하는데, 여기서, 상기 작용제는 샤페론 활성을 억제시키고 미토콘드리아로 국소화된다.
본원에 사용된, "가미트리닙(Gamitrinib)"은 링커를 통해 C17 위치에서 미토콘드리아 관통 모이어티, 예를 들어, 테트라구아니디늄(G4), 트리구아니디늄(G3), 디구아니디늄(G2), 모노구아니디늄(G1), 또는 트리페닐포스포늄(TPP) 모이어티에 컨주게이션된, 젤다나마이신 유사체, 예를 들어, 17-AAG를 지칭한다. 이러한 적용을 통해, 특정 가미트리닙의 일부가 되는 미토콘드리아 관통 모이어티가 때때로 지시된다. 예를 들어, 가미트리닙-G4는 테트라구아니디늄 모이어티에 존재하는 가미트리닙을 지칭한다. 예를 들어, 가미트리닙-TPP는 트리페닐포스포늄 모이어티가 존재하는 가미트리닙을 지칭한다. 또한 이 적용을 통해, 복수형 "가미트리닙들"의 사용은 하기한 것들 중 하나 이상을 지칭한다: 가미트리닙-G4, 가미트리닙-G3, 가미트리닙-G2, 가미트리닙-G1, 및 가미트리닙-TPP.
하기 설명이, 때때로, 분자 샤페론 Hsp90에 관한 것이나, 설명은 암 세포의 미토콘드리아에서 과발현되는 구조적으로 관련된 분자 샤페론, 예를 들어, TRAP-1(Song et al, J. Biol. Chem., 270:3574-3581 (1995); Cechetto and Gupta, Experimental Cell Research, 260:30-39 (2000)); 열 충격 6OkDa 단백질 1(Hsp60/HspDl)(Singh et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 169 (2), 391-396 (1990)); Bross et al., J. Hum. Genet. 52 (1), 56-65 (2007)); 및 열 충격 7OkDa 단백질 9(HSPA9/mortalin)(Domanico et al., Mol. Cell. Biol. 13 (6), 3598-3610 (1993); Bhattacharyya et al., J. Biol. Chem. 270 (4), 1705-1710 (1995); Kaul et al., FEBS Lett. 361 (2-3), 269-272 (1995))에 일반화될 수 있음이 이해되어야 한다.
일 양상에서, 본 발명은 미토콘드리아를 표적으로 삼는 즉, 미토콘드리아 막을 관통하고 상기 막에 축적되는 분자 샤페론 억제자를 제공한다. 샤페론 억제자는 미토콘드리아 관통 모이어티와의 결합을 통해 미토콘드리아를 표적으로 삼을 수 있다. 예를 들어, 분자 샤페론 억제자는, 샤페론 단백질에 결합하는, 단백질, 또는 이의 샤페론 결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 특정 아폽토시스 단백질 억제자(IAPs)가 사용될 수 있다. IAP는 항아폽토시스 단백질 패밀리이고(Schimmer, Can. Res. 64:7183-7190 (2004)); 유용한 IAP는 분자 샤페론 Hsp90에 결합하는 샤페론을 포함한다. 분자 샤페론에 자연적으로 결합하는 이들 및 기타 단백질의 단편은 본 발명의 일부분이다. 분자 샤페론에 자연적으로 결합하고 이를 억제하는 이들 및 기타 펩티드 또는 단백질의 펩티도미메틱(peptidomimetics)이 또한 사용될 수 있다.
샤페론 억제자는 또한 소분자, 본원에 기재된 미토콘드리아에 표적화되는 샤페론 억제자, 예를 들어, 본원에 기재된 스크리닝 방법을 통해 확인된 소분자일 수 있다.
분자 샤페론 억제자는 미토콘드리아 관통 모이어티에 연결된다. 예를 들어, 미토콘드리아 관통 모이어티는, 염기성 또는 양으로 하전된 펩티드 서열, 예를 들어, 안테나페디아 호메오도메인(ANT)의 3차 헬릭스로부터의 염기성 또는 양으로 하전된 펩티드 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 미토콘드리아 관통 모이어티는 퍼난데스-카네아도 등의 문헌[Fernandez-Carneado et al., J. Am. Chem. Soc, 127:869-874 (2005)]에 기재된 테트라구아니디늄 화합물일 수 있다.
분자 샤페론 억제자와 미토콘드리아 관통 모이어티 사이의 연결은 공유 결합, 예를 들어, 펩티드 결합 또는 티오에테르 결합일 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 샤페론 억제자와 미토콘드리아 관통 모이어티 중 하나 또는 둘 모두가 비-펩티드성인데, 예를 들어, 소분자, 분자 샤페론 억제자 및 미토콘드리아 관통 모이어티는 화학적 링커를 통해 연결된다. 일부 구체예에서, 분자 샤페론 억제자와 미토콘드리아 관통 모이어티 사이의 연결은 비공유성 상호작용, 예를 들어, 이온성 상호작용일 수 있다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 샤페론 억제자를 확인하기 위한 방법을 특색으로 한다. 특히, 본 발명은 Hsp90와 시클로필린 D(CypD) 간, Hsp60와 CypD 간, 또는 TRAP-1과 CypD간 상호작용을 붕괴시키는 후보 화합물을 확인하기 위한 방법을 특색으로 한다.
본 발명은 몇몇 이점을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 정상 세포와 비교할 때, 미토콘드리아내의 샤페론의 발현 증가는 정상 세포를 해치지 않으면서, 그리하여 부작용을 최소화하고 효능을 증가시키면서 종양 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있는 표적화된 접근법을 제공한다. 또한, 매우 다양한 유형의 종양 및 암 세포는 샤페론의 미토콘드리아 축적을 나타내며, 그에 따라, 많은 유형의 종양과 암은 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있다.
본 발명은 종래의 것을 능가하는 향미토콘드리아성 작용제(예를 들어, 미토콘드리아로 표적화된 샤페론 억제자)를 제공한다. 이러한 물질은 증가된 효능으로 미토콘드리아에 국소화되고 샤페론의 미토콘드리아 축적을 나타내는 세포(예를 들어, 암 세포)에서 미토콘드리아 붕괴 및 세포 사멸을 선택적으로 유도한다. 이러한 물질은 형질전환된 세포(예를 들어, 암 세포)에 존재하는 미토콘드리아에 국소화된 샤페론의 기능에 최대의 영향을 미치며 정상적인 샤페론 기능(예를 들어, 정상 또는 비형질전환된 세포에서 Hsp90 기능)에 최소의 영향을 미친다. 따라서, 이러한 물질은, 미토콘드리아에 국소화된 샤페론을 특이적으로 억제하지 않는 종래 알려진 샤페론 억제자보다 더 적은 독성을 지닐 것으로 예상되므로 암 치료를 위한 이상적인 후보이다.
예를 들어, 본원에 기재된 가미트리닙은 인간에서 시험하기에 적합한 신규한, 소분자 항암 물질이다. 본 출원인들은 이론으로 제한되는 것을 원치 아니하나, 가미트리닙의 조합 설계는 이들을 미토콘드리아에 효율적으로 표적화시키고, 그로 인해 종양 세포에 대한 이들의 세포독성 효과를 최대화시킴과 동시에 비-종양 또는 정상 세포에 대한 이들의 효과를 최소화시킨다. 이것은 종양 세포 생존에는 중요하나 정상 세포내에 존재하지 않거나 정상 세포 생존에 미미한 영향을 미치는 종양 세포내 샤페론의 미토콘드리아 풀(예를 들어, Hsp90 및 TRAP1)의 존재 때문이다. 또한, 가미트리닙의 조합 설계는 세포질에서 현저하게 샤페론을 발현하는 비-종양 또는 정상 세포에 대한 이들의 영향을 최소화시킨다. 현재의 Hsp90 억제자( 예를 들어, 하기 문헌 참조: Drysdale et al., "Targeting Hsp90 for the treatment of cancer," Curr Opin Drug Discov Devel, 9:483-495 (2006))와 비교할 때, 가미트리닙은 종양 세포에 대한 개선된 세포독성 활성을 지니는데, 이는 시험관내 및 생체내 결과로 뒷받침된다. 또 다른 중요한 이점은 이러한 물질들이 세포질내 Hsp90의 일반적인 항상성 기능에 영향을 미치지 않고, 그러므로 일반적인 Hsp90 길항제로 드러난 보상 생존 신호(compensatory survival signals)(예를 들어, Hsp70 유도)를 잠재적으로 유도하지 않는다는 것이다((예를 들어, 하기 문헌 참조: Drysdale et al., (2006) supra). 미토콘드리아 Hsp90 샤페론은 (본원에서 입증한 것과 같이) 대부분의 정상 조직에 없기 때문에, 가미트리닙은 종양 세포에 대해 선택적이고 성장 세포에 대해 감소된 독성을 나타내는데, 이는 가미트리닙을 항-암 치료를 위한 선호되는 후보자가 되게 한다. 또한, 종양-연관 Hsp90은 정상 세포와 비교하여 더 높은 친화력으로 ATPase 포켓 길항제에 결합하고(예를 들어, 하기 문헌 참조: Kamal et al., Nature, 425:407-410 (2003)), 이것은 가미트리닙-기반 요법으로부터, 낮은 수준의 미토콘드리아 Hsp90을 지니는 정상 기관, 즉 뇌를 더 보호할 수 있다. 가미트리닙의 패러다임에 따라, 기타 샤페론 억제자, 예를 들어, 퓨린 억제자 또는 레조르시놀 억제자(예를 들어, 피라졸-기반 레조르시놀 Hsp90 억제자 CCTO 18159의 피페라지닐, 몰포리노 및 피페리딜 유도체)가 암 세포를 표적으로 삼는데 사용될 수 있다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Sharp et al., Cancer Res. 67 (5):2206-16 (2007); Sharp et al., MoI Cancer Ther. 6 (4): 1198-1211 (2007); Eccles et al., Cancer Res. 68 (8):2850-60 (2008); Strausberg et al., Nature, 429:469-474 (2004); Butcher, Nat Rev Drug Discov 4, 461-467 (2005); Philips, Biochem Soc Trans, 33 :657-661 (2005)).
달리 정의하지 않는한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에서 사용을 위해 본원에 기재되어 있다; 당업계에 공지된 기타, 적합한 방법과 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이고 제한하기 위하여 의도된 것이 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이타베이스 엔트리, 및 기타 참고문헌은 이들의 전체로 참고문헌으로 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한, 본 명세서가 기준이 될 것이다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기 상세한 설명과 도면, 및 특허청구범위로부터 자명할 것이다.
도면의 설명
도 1A는 정상 세포에 비해 종양 세포내에서 증가된 수준으로 Hsp90-유사 샤페론 TRAP-1이 미토콘드리아에 국소화됨을 보여주는 한 쌍의 면역블랏이다. 지시된 종양 세포 유형으로부터 정제된 세포질 또는 미토콘드리아 추출물내 TRAP-1과 미토콘드리아 마커 Cox-IV에 대한 면역블랏(상단 패널), 또는 정상 마우스 장기로부터의 미토콘드리아(하단 패널)에 대한 면역블랏이 도시되어 있다. β-액틴 발현이 상단 패널내 대조군으로 도시되어 있다.
도. 1B-I는 정상 췌장(B), 유방 (D), 결장 (F) 또는 폐(H)의 표본내, 또는 췌장 (C), 유방 (E), 결장 (G), 또는 폐 (I)의 선암의 사례에서 TRAP-1의 생체내 발현을 보여주는 면역조직화학적으로 염색된 초대(primary) 조직 샘플의 이미지이다.
도 1J는 Hsp90이 종양 세포내 미토콘드리아에 국소화됨을 보여주는 미토콘드리아 또는 세포질 추출물에 대한 일련의 3개의 관련된 면역블랏이다. Cox-IV 발현 수준과 β-액틴 발현 수준이 대조군으로 도시되어 있다.
도 1K-L은 Hsp90에 대한 항체가 분리된 HeLa 세포 미토콘드리아에 국소화되나(도 1K) 비특이적 항체는 분리된 HeLa 세포 미토콘드리아에 국소화되지 않는다(도 1L)는 것을 보여주는 전자 현미경사진이다.
도 1M은 전체 세포질 추출물(TCE) 또는 분리된 미토콘드리아(PK-처리됨) 또는 HeLa 세포로부터의 세포질 추출물에 대한 일련의 6개의 관련된 면역블랏인데, 칼넥신(Calnexin), Lamp-1, GAPDH, Cox-IV, TRAP-1, 및 Hsp90의 발현 수준을 보여준다.
도 2A는 발리노마이신과 함께 또는 이것 없이 35S-표지된, 시험관내 전사되고 번역된 Hsp90 또는 대조 PiC와 함께 인큐베이션하고 단백질분해효소 K(PK)로 처리한 정제된 마우스 뇌 미토콘드리아로부터의 추출물에 대한 2개의 방사능사진 세트인데, 처리후 방사능표지된 Hsp90 또는 대조 PiC의 수준을 보여준다.
도 2B는 대조군으로서 Hsp90과 mt-Hsp70의 단백질 수준을 보여주는 다양한 농도의 디지토닌과 함께 인큐베이션시킨 PK 처리된 HeLa 세포 미토콘드리아로부터의 펠렛(P) 또는 상청액(S)에 대한 한 쌍의 면역블랏이다.
도 2C는 PK의 존재 또는 부재하에 수크로스를 포함하는 버퍼(SHE) 또는 수크로스가 없는 버퍼(HE) 중에 현탁시킨, 반복된 피펫팅에 의해 기계적으로 파쇄된 외부 미토톤드리아 막을 지니는, HeLa 세포 미토콘드리아의 단백질 함량에 관한 4개의 면역블랏 세트인데, Hsp90, Smac, 및 CypD의 단백질 발현 수준을 보여준다.
도 2D는 HeLa 세포로부터의 전체 미토콘드리아 추출물(MTE), 더 분획화된(fractionated) 외막 추출물(outer membrane extracts, OM), 내막 공간 추출물(intermembrane space extracts, IMS), 내막 추출물(inner membrane extracts, IM) 및 미토콘드리아 매트릭스 추출물(Matrix)에 대한 5개의 면역블랏의 세트인데, Hsp90, VDAC, Cyt c, Cox-IV, 및 CypD의 단백질 수준을 보여준다.
도 2E는 미토콘드리아(좌) 또는 세포질(우)내로 분획화된 마우스 장기의 7개 면역블롯 세트인데, Hsp90, Cox-IV, 및 Cyt c의 단백질 수준을 보여준다. β-액틴은 세포질 대조군이다.
도 2F는 종양(HeLa, MCF-7, Raji) 또는 정상(HFF, HGF, WS-I) 세포로부터의 전체 세포 추출물에 대한 한쌍의 면역블랏인데, Hsp90 및 TRAP-1 수준을 보여주며, β-액틴은 대조군이다.
도 2G는 미토콘드리아(좌측 3개 블랏) 또는 세포질 추출물(우측 4개 블랏)에 분획화된 지시된 정상 세포 유형 또는 대조 HeLa 세포에 대한 7개 면역블랏 세트인데, Hsp90, TRAP-1, 및 Cox-IV의 수준을 보여준다. β-액틴은 대조군이다.
도 3A-D는 HeLa 세포 미토콘드리아의 존재(A, B, D) 또는 부재(C)하에 인큐베이션시킨, 안테나페디아 세포-관통성 서열(ANT)을 지니거나(A, C) 지니지 않는(B) FITC-컨주게이션된 쉬페르딘의 미토콘드리아 축척 또는 ANT(D)를 지니는 스크램블된 펩티도미메틱의 미토콘드리아 축척에 관한 형광 현미경 이미지인데, ANT를 지니는 쉬페르딘(Sheph-ANT) 및 ANT를 지니는 세포 투과성 스크램블된 펩티도미메틱(Scram-ANT) 둘 모두가 미토콘드리아내에 축적됨을 보여준다.
도 3E는 FITC-컨주게이션된 Sheph-ANT 또는 FITC-컨주게이션된 Scram-ANT로 세포의 처리후 분리된 미토콘드리아 분획에서 정량된 형광 강도에 대한 막대 그래프인데, Sheph-ANT와 Scram-ANT가 미토콘드리아내에서 유사한 수준으로 축적됨을 보여준다.
도 3F는 FITC-컨주게이션된 쉬페르딘(Sheph), 또는 ANT를 지니는 FITC-컨주게이션된 쉬페르딘(Sheph-ANT)과 함께 인큐베이션한 HeLa 세포 미토콘드리아로부터 분리된 미토콘드리아의 추출물 및 미토콘드리아 분획에서 정량한 형광 강도에 대한 막대 그래프인데, Sheph-ANT가 미토콘드리아, 외막/내막 공간(OM+IMS), 및 내막/매트릭스(IM+Matrix)내에 축적됨을 보여준다. 비처리된 샘플(None)은 대조군이다.
도 3G는 쉬페르딘-세파로즈(상단) 또는 스크램블된 펩티도미메틱-세파로즈(하단) 비드 상에 분획화된 Raji 미토콘드리아 추출물(MTE)로부터의 용리된 분획에 대한 한쌍의 면역블랏인데, Hsp90과 TRAP-1이 쉬페르딘-세파로즈에 의해 결합되어 있으나 스트램블된 펩티도미메틱-세파로즈에 의해 비결합되어 있음을 보여준다.
도 3H는 Sheph-ANT와 함께 인큐베이션시킨 HeLa 세포로부터 정제된 TMRM-로딩된 미토콘드리아의 농도(μg)를 증가시킴에 따른 주어진 시간의 미토콘드리아 막 전위에 대한 선 그래프인데, Sheph-ANT가 미토콘드리아 막 전위에서 변화를 유도시키며 효과가 미토콘드리아의 농도를 증가시킴에 따라 감소됨을 보여준다. 스크램블된 펩티도미메틱(Scram-ANT)을 대조군으로 60 μg의 TMRM-로딩된 미토콘드리아와 함께 인큐베이션하였다.
도 3I는 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT를 처리한 Raji 세포의 정제된 미토콘드리아로부터의 추출물에 대한 한쌍의 면역블랏인데, Sheph-ANT 처리가 용량-의존적 방식으로 미토콘드리아 Cyt c를 감소시킴을 보여준다.
도 3J는 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT으로 샘플을 처리하고 상청액(Sup)으로부터 미토콘드리아(Mito)를 분획화시켜 획득한 초대(primary) 인간 육종 샘플로부터의 추출물에 대한 3개의 면역블랏 세트인데, Sheph-ANT 처리가 용량-의존적 방식으로 상청액내로 Cyt c 방출을 증가시킴을 보여준다.
도 3K는 DMSO 또는 17-AAG와 함께 인큐베이션한 HeLa 세포 미토콘드리아에 대한 면역블랏인데, 미토콘드리아 내막 단백질 Smac와 Cyt c의 단백질 수준을 보여준다.
도 3L은 17-AAG-처리된 HeLa 세포 미토콘드리아로부터의 상청액에 대한 면역블랏인데, 상기 상청액내의 Smac와 Cyt c 수준을 보여준다. 미토콘드리아 추출물(MTE)은 대조군으로 사용된다.
도 4A는 일차 WS-1 섬유아세포(좌) 또는 Raji 림프모구양(lymphoblastoid) 세포(우)에 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT의 첨가후 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위를 보여주는 2선 그래프이다.
도 4B는 글루코스의 존재(+) 또는 부재(-) 하에 정상 WS-1 섬유아세포 또는 HeLa 세포를 인큐베이션한 후 획득한 분리된 미토콘드리아(3개의 블랏 중 가운데 세트) 및 세포질(4개의 블랏중 오른쪽 방향 세트) 분획으로부터의 전체 세포 추출물(TCE, 좌측의 2개 블랏) 또는 추출물에 대한 3개의 면역블랏 세트를 도시한 것인데, Hsp90, TRAP-1, 또는 Grp94의 단백질 수준을 보여준다. CoxIV 및 β-액틴은 대조물질이다.
도 4C는 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT를 글루코스-무공급(glucose-starved) WS-I 섬유아세포에 첨가한 후 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위의 그래프이다.
도 4D는 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT와 함께 인큐베이션한 정상 마우스 간으로부터의 분리된 미토콘드리아로부터의 추출물에 대한 한 쌍의 면역블랏이다.
도 4E는 정상 마우스 간(좌) 또는 정상 마우스 뇌(우)로부터 분리된 TMRM-로딩된 미토콘드리아에 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT의 첨가후 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위의 2선 그래프이다.
도 4F는 야생형 NIH3T3(정상) 또는 Ras-변형된 NIH3T3 섬유아세포로부터의 미토콘드리아(MTE) 또는 세포질 추출물의 4개의 면역블랏 세트인데, Hsp90, TRAP-1 단백질 수준을 보여준다. Cox-IV 및 β-액틴은 대조군이다.
도 4G는 NIH3T3 (좌) 또는 Ras-형질전환된 NIH3T3(우) 섬유아세포로부터 분리된 TMRM-로딩된 미토콘드리아에 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT의 첨가(화살표)후 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위에 대한 2선 그래프로 이루어져 있는데, Sheph가 형질전환된 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 손실을 유도함을 보여준다.
도 5A 및 도 5B는 미토콘드리아 염색(MitoTracker) 및 FITC-컨주게이션된 Sheph-ANT(도 5A) 또는 FITC-컨주게이션된 Scram-ANT(도 5B)으로 이중-표지된 HeLa 세포에 대한 공초점 현미경 사진이고 이미지 머징으로 분석된다.
도 5C는 FITC-컨주게이션된 Sheph-ANT 또는 FITC-컨주게이션된 Scram-ANT로 표적화된 HeLa 세포의 전체 세포 추출물(TCE), 세포질 추출물, 또는 미토콘드리아 추출물에서 형광 강도를 보여주는 막대 그래프이다.
도 5D는 JC-1-로딩된 Raji 세포에 Sheph-ANT(실선), 17-AAG(점선), 또는 Scram-ANT(파선)의 첨가후 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위를 보여주는 선 그래프이다.
도 5E 패널은 상이한 농도의 17-AAG와 함께 인큐베이션시킨 HeLa 세포로부터의 세포졸 추출물에 대한 면역블랏인데, 시토크롬 c와 β-액틴은 대조군으로 도시되어 있다.
도 5F 패널은 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT로 처리한 HeLa 세포의 시건-경과 비데오 현미경 스틸 이미지인데, 아폽토시스(상단, 우측 패널) 또는 미토콘드리아 융합/분열(하단, 우측 패널)의 세포 형태를 보여준다.
도 5G는 Sheph-ANT(실선)의 농도를 증가시키면서 또는 Scram-ANT(파선)의 농도를 증가시키면서 인큐베이션시킨 종양 세포(좌) 및 정상 세포(우)의, MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 생존도 분석에 의해 측정된, 생존도 비율을 보여주는 2선 그래프로 이루어져 있다.
도 5H는 4시간(좌) 또는 24시간(우) 동안 17-AAG의 농도를 증가시키면서 인큐베이션한 종양 세포(좌) 및 정상 세포(우)의, MTT로 측정된, 생존도 백분윤을 보여주는 2선 그래프로 이루어져 있다.
도 6A는 시클로스포린 A(CsA) 또는 젤다나마이신(GA)으로 처리된 정제된 Raji 미토콘드리아 추출물로부터의, TRAP-1에 대한 항체 또는 IgG(대조군)를 사용하여 면역침전된 미토콘드리아 TRAP-1 및 CypD에 대한 2개의 면역블랏 세트이다. 임의의 약물로 처리되지 않은 미토콘드리아 추출물(None)이 대조군이다.
도 6B는 Hsp90에 대한 항체 또는 IgG(대조군)을 사용하여 CsA로 처리(+)하거나 이것을 처리하지 않은(-) Raji 미토콘드리아 추출물로부터 면역침전된 Hsp90 및 CypD에 대한 2개의 면역블랏의 세트이다.
도 6C는 3개의 면역블랏 세트이다; 상단 및 중간 패널은 GST(대조군) 또는 GST-CypD를 사용하여 CsA 또는 GA를 처리하거나 약물을 처리하지 않은(None) Raji 미토콘드리아 추출물로부터 포획된 Hsp90 및 TRAP-1의 면역블랏이다. 하단 패널은 상단 및 중간 패널의 면역블랏에 상응하는 쿠마시(Coomassie) 염색 겔이다.
도 6D는 CsA의 존재(파선) 또는 부재(실선)시에 HeLa 세포로부터 분리된 TMRM-로딩된 미토콘드리아에 대한 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT의 첨가 후(화살표) 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위를 보여주는 선 그래프이다.
도 6E는 CsA의 존재(원) 또는 부재(사각형)시 Sheph-ANT(속찬 기호) 또는 Scram-ANT(속빈 기호)의 농도를 증가시키면서 처리된 HeLa 세포의, MTT에 의해 결정된, 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이다.
도 6F는 농도가 증가된 Sheph-ANT(사각형) 또는 Scram-ANT(원)으로 처리된, 대조 siRNA(속빈 기호) 또는 CypD-유도 siRNA(속찬 기호)로 형질감염시킨 HeLa 세포의, MTT에 의해 측정된, 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이다.
도 6G는 CsA의 존재 또는 부재시 대조 siRNA 또는 TRAP-1-유도 siRNA로 형질감염시킨 HeLa 세포의, MTT로 측정한, 생존도 비율을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6H는 대조 siRNA, 또는 CypD-유도 siRNA(2개의 패널 중 상단 세트) 또는 TRAP-1-유도 siRNA(2개의 패널 중 하단 세트)로 형질 감염시킨 HeLa 세포의 추출물에 대한 2쌍의 면역블랏 세트이다. 비-형질감염된 배양물(None)은 대조군이고, β-액틴 면역블랏은 대조군이다.
도 6I는 증가된 농도의 스타우스포린으로 처리된, pcDNA3(대조군) 또는 TRAP-1 cDNA로 형질감염된 정상 WS-1 섬유아세포의, MTT로 측정된, 생존도 비율에 대한 막대 그래프이다.
도 7A는 HeLa 세포로부터 분리된 다양한 농도(μg)의 TMRM-로딩된 미토콘드리아에 대한, ANT-GA 또는 비커플링된 혼합물 GA/ANT의 첨가후(화살표) 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위를 나타낸 선 그래프이다. 60 μg의 분리된 미토콘드리아와 함께 인큐베이션된, 비커플링된 혼합물 GA/ANT는 대조군이다.
도 7B는 HeLa 세포(좌) 또는 마우스 뇌(우)에서 분리된 TMRM-로딩된 미토콘드리아에 CsA와 함께 또는 이것 없이 ANT-GA 또는 비커플링된 혼합물 GA/ANT의 첨가후(화살표) 시간에 따른 미토콘드리아 막 전위를 보여주는 2선 그래프로 구성되어 있다.
도 7C는 ANT-GA 또는 GA/ANT의 비커플링된 혼합물로 처리된 분리된 HeLa 세포 미토콘드리아(2개 패널중 상단 세트) 또는 분리된 마우스-간 미토콘드리아(2개의 패널 중 하단 세트)로부터 방출된 시토크롬 c에 대한 2개의 면역블랏의 한 쌍의 세트이다.
도 7D는 다양한 농도로 GA, ANT-GA, 또는 GA/ANT와 함께 인큐베이션된 HeLa 세포의, MTT에 의해 측정된, 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이다.
도 7E는 ANT-GA(속찬 사각형) 또는 GA/ANT(속빈 원)으로 처리된, 일차 인간 섬유아세포 WS-1(검정), HGF(자주), 또는 HFF(녹색)의, MTT에 의해 측정된, 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이다. 전립선 암 PC3 세포(파랑)는 대조군이다.
도 7F는 ANT-GA(좌측 2개 도면) 또는 GA/ANT(우측 2개 도면)으로 처리된 p53+/+(상단 2개의 도면) 및 p53"A(하단 2개의 도면) HCT116 세포에 대한 유세포 분석의, y-축에 프로피디움 아이오다이드 염색 강도를 x-축에 DEVDase 활성을 도시한, 4개의 산점도(scatter plot)이다. 각 4분면에서 세포의 비율이 표기되어 있다.
도 8은 4개의 면역블랏 세트이다. 상단 패널은 고환, 폐, 지라, 신장, 뇌, 및 간에서 분리된 프로테안나제 K(PK)로 처리된 미토콘드리아에 대한 Hsp90 면역블랏인데, 고환과 뇌에서만 최소 발현을 보여준다. Bcl-2(중간 패널) 및 Cox-IV(하단 패널) 면역블랏을, 각각, 음성 및 양성 대조군으로 사용하였다. 또한 PK 처리 없이 뇌 미토콘드리아에서 Bcl-2 면역블랏을 양성 대조군으로 사용하였다(좌측 패널).
도 9는 한쌍의 면역블랏이다. 상단 패널은 주요 p53-/- 마우스 림프종 견본으로부터 분리되고 Sheph-ANT 또는 Scram-ANT와 함께 인큐베이션한 미토콘드리아에서 제조한 추출물의 Cyt c 면역블랏이다. Cox-IV 면역블랏을 양성 대조군으로 사용하였다(하단 패널).
도 1OA는 3개의 면역블랏의 세트이다. 상단 패널은 CsA, GA의 첨가를 동반하거나, 약물의 첨가를 동반하지 않는 재조합 CypD와 인큐베이션시킨 CypD 면역블랏인데, GST-TRAP1 CypD는 GST-TRAP-1에 의해 붕괴되나(pulled down) GST에 의해서는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 도 10A의 하단 패널은 쿠마시 염색된 면역블랏팅된 겔이다.
도 1OB는 2개의 면역블랏의 세트이다. 상단 패널은 시험관내에서 전사되고 번역된 35S-표지된 Hsp90의 GST 또는 풀 다운된 GST-CypD의 전기영도로부터의 단백질 겔에 대한 방사능사진이다. 도 1OB, 하단 패널은 당해 실험에서 사용된 겔에 대한 쿠마시 염색이다.
도 1OC는 2개의 면역블랏의 세트이다. 상단 패널은 시험관내에서 전사되고 번역된 35S-표지된 CypD의 GST 또는 풀 다운된 GST-CypD의 전기영도로부터의 단백질 겔에 대한 방사능사진이다. 도 1OC, 하단 패널은 당해 실험에서 사용된 겔에 대한 쿠마시 염색이다.
도 11은 pcDNA3(대조군) 또는 TRAP-1 cDNA로 형질감염되고 다양한 농도의 스타우스포린으로 처리된 정상 HFF 인간 섬유아세포의, MTT로 결정된, 생존도 비율을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12A는 6개의 이미지 패널 세트이다; 상단 및 중간 열은 정제된 Raji 세포 미토콘드리아와 함께 인큐베이션된 FITC-GA (상단, 좌측 패널), FITC-ANT(상단, 우측 패널), 또는 FITC-ANT-GA(중간 좌측 패널) 또는 정제된 Raji 세포 미토콘드리아 없이 인큐베이션된 FITC-ANT-GA(중간, 우측 패널)의 형광 현미경 이미지이다. 하단 열의 패녈들은 PK 처리 전(하단, 좌측 패널) 및 후(하단, 우측 패널)의 정제된 Raji 세포 미토콘드리아와 함께 인큐베이션된 FITC-ANT-GA이다.
도 12B는 ANT-GA를 생산하기 위해 티오에테르 연결에 의한 ANT에 대한 17-AAG 또는 17-GMB-APA-GA의 커플링을 위한 한가지 도식을 보여주는 다이어그램이다.
도 12C는 한쌍의 질량 분광사진이다. 상단 패널은 ANT-GA를 생산하기 위해 수행된 커플링 반응의 질량 스펙트럼인데, 화살표로 17-GMP-APA-GA에 관한 피크를 보여준다. 하단 패널은 ANT-GA를 생산하기 위해 수행된 커플링 반응의 질량 스펙트럼인데, 화살표로 ANT 및 ANT-GA에 관한 피크를 보여준다.
도 12D는 ANT-GA(중간 레인) 또는 비커플링된 혼합물 GA/ANT(우측 레인)로 처리된 HeLa 세포에서 Akt 발현(상단 패널)을 보여주는 면역블랏이다. 비처리된 HeLa 세포를 대조군으로 사용하였다(좌측 레인). β-액틴을 대조군으로 사용하였다(하단 패널, 상단 패널에서와 동일한 레인).
도 13A는 MCF-7 또는 HCT116 세포(상단 패널), 또는 일차 WS-1 또는 HFF 인간 섬유아세포(하단 패널)로부터의 분리된 세포질(C) 또는 미토콘드리아(M) 분획에서 Hsp60 및 COX-IV 발현을 보여주는 한쌍의 웨스턴 블랏이다.
도 13B는 Hsp60에 대한 항체로 염색하고, 면역조직화학으로 분석한, 유방, 결장, 또는 폐의 선암의 일차 인간 조직 견본(종양), 또는 매칭되는 정상 조직(정상)을 보여주는 6개의 현미경사진 세트이다. 배율, x200.
도 13C는 74INT 정상 상피 세포 또는 일차 WS-1 정상 섬유아세포를 비-표적화되거나 Hsp60-유도된 siRNA로 형질감염시키고, DEVDase 활성 및 다중파라미터성 유세포분석(multiparametric flow cytometry)에 의한 프로피디움 아이오다이드 염색으로 분석한 실험의 결과를 보여주는 6개의 도면 세트이다. 각 4분면에서 세포의 비율이 표시되어 있다. None, 형질감염되지 않은 세포.
도 14는 본원에 설명된 서열의 비격식적 서열 목록이다.
도 15A는 가미트리닙의 조합 모듈 구조를 보여주는 다이어그램인데, TBDPS는 터트-부틸디페닐실일을 나타낸다.
도 15B 상단 좌측 패널은 중간(Cdc25) 및 하단(GST-Chkl)에 도시된 로딩 대조군과 함께 17-AAG 또는 가미트리닙-G4("G4"로 표기됨)(1-10 μM)으로 처리한 세포에서 Cdc25의 Chk1-의존성 인산화로서 샤페론 활성을 보여주는 방사능 사진이다. 우측 패널은 좌측 패널에 도시된 밴드의 농도계측식 정량을 보여주는 막대 그래프이고 2회 실험을 대표한다.
도 15C는 17-AAG 또는 가미트리닙-G4("G4"로 표기됨)의 미토콘드리아 축적을 정량한 막대 그래프인데, 여기서 "None"은 비히클 대조군을 나타낸다. 평균±SEM (n=3).
도 16A는 가미트리닙-G1("G1"), 가미트리닙-G2("G2"), 가미트리닙-G3("G3"), 가미트리닙-G4("G4"), 가미트리닙-TPP("TPP"), GA, 또는 17-AAG(1 μM의 농도)로 처리하고 TMRM-로딩된 미토콘드리아에서 시간에 따른 미토콘드리아 내막 전위를 보여주는 선 그래프이며 형광 방출에 관해 분석하였다.
도 16B, 좌측 패널은 테트라구아니디늄과 혼합한 17-AAG(17-AAG + TG-OH), 17-AAG 및 1 μM 시클로스포린 A("17-AAG + CsA"), 1.5 μM 가미트리닙-G4("G4"), 1.5 μM 가미트리닙-G4 및 1 μM 시클로스포린 A("G4 + CsA")와 함께 인큐베이션한 TMRM-로딩된 미토콘드리아에서 시간에 따른 미토콘드리아 내막 전위를 보여주는 선 그래프이다. 우측 패널은 트리페닐포스포늄과 혼합된 GA("GA + TPP-OH"), 트리페닐포스포늄 및 1 μM 시클로스포린 A와 혼합된 GA("GA + TPP-OH + CsA"), 트리페닐포스포늄 그 자체("TPP") 및 트리페닐포스포늄과 1 μM 시클로스포린 A("TPP + CsA")와 함께 인큐베이션한 TMRM-로딩된 미토콘드리아에서 시간에 따른 미토콘드리아 내막 전위를 보여주는 선 그래프이다. 화살표는 첨가 시점을 나타낸다.
도 16C는 상청액(S) 또는 펠렛(P)에서 시토크롬 c 방출을 보여주는 면역블랏 패널인데 가미트리닙-G1("G1"), 가미트리닙-G2("G2"), 가미트리닙-G4("G4"), 또는 17-AAG(20분)으로 처리된 종양 미토콘드리아에서 미토콘드리아 마커로서 Cox-IV을 보여준다.
도 16D는 3시간 동안 IPI-504, BIIB021, NVP-AUY922, 17-AAG, 또는 가미트리닙-G4("G4")와 함께 인큐베이션한 미토콘드리아로부터 시간에 따른 시토크롬 c 방출 비율을 보여주는 선 그래프이다. 데이터는 2회 독립 실험의 결과를 대표한다.
도 17A는 상이한 농도로 가미트리닙-G1("G1"), 가미트리닙-G2("G2"), 가미트리닙-G3("G3"), 가미트리닙-G4("G4"), 가미트리닙-TPP("TPP"), 또는 17-AAG로 처리된, MTT로 분석된, H460 세포의 생존도 비율을 보여주는 2선 그래프로 구성되어 있는데, 당해 그래프에서 처리 3시간 경과후는 좌측에 처리 24시간 경과후는 우측에 도시되어 있다. 평균±SD(n=2).
도 17B는 가미트리닙-G4("G4"), 가미트리닙-TPP("TPP"), 또는 17-AAG(10 μM의 농도)로 처리된 SKBr3 세포의 시간에 따른 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이고 MTT로 분석하였다.
도 17C는 표기된 시간 간격으로 10 μM의 가미트리닙-G4("G4"), 가미트리닙-TPP("TPP"), 또는 17-AAG로 처리된 SKBr3 세포에서 트리팜(Trypam) 블루 염석으로 분석한 죽은 세포의 비율을 보여주는 막대 그래프이다. 평균±SEM(n=3).
도 17D는 4개의 산점도로 구성되어 있다. H460 세포를 4시간 동안 가미트리닙-G4("G4") 또는 비히클로 처리하고 JC-1으로 표지하고, 산점도의 산단에 도시된 것과 같이 FL2/FL1 형광 비에서의 변화로 미토콘드리아 막 전위의 손실에 대해 분석(다중파라미터 유세포분석)하거나, 산점도의 하단에 도시된 것과 같이 DEVDase(카스파제) 활성에 대해 분석하였다. 각 4분면에 세포 비율이 표기되어 있고 PI를 사용하여 프로피디움 아이오다이드를 나타내고 있다.
도 17E는 연질 아가에서 콜로니 형성에 관한 2장의 사진인데, 위쪽 사진은 4시간 동안 비히클(None)으로 처리된 H460 세포를 사용하여 2주후의 콜로니 형성을 보여주고 아래쪽 사진은 4시간 동안 50 μM로 가미트리닙-G4("G4")으로 처리된 H460 세포를 사용하여 2주후의 콜로니 형성을 보여준다. 배율, x200.
도 17F는 MTT로 분석한 종양 세포주(K562, 검정; MDA-MB-231, 연한 오렌지; U87MG, 빨강; MCF-7, 핑크; H1975, 연한 갈색; DU145, 오렌지; H460, 파랑; HCTl 16, 자주; HL-60, 바이올렛; Raji, 진한 핑크; THP-I, 그린)에서 가미트리닙-G4(실선) 또는 TG-OH와 혼합된 17-AAG(점선) 농도의 함수로 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이다. 데이터는 2회 실험의 대표값이다.
도 17G는 MTT로 분석한 대조군(속찬 기호) 또는 CypD(속빈 기호) siRNA로 형질감염시킨 H460 세포에서 17-AAG(원) 또는 가미트리닙-G4(사각형) 농도의 함수로 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이다. 평균±SEM (n=3).
도 17H는 가미트리닙-G1("G1"), 가미트리닙-G2("G2"), 가미트리닙-G3("G3"), 가미트리닙-G4("G4"), 가미트리닙-TPP("TPP"), 또는 17-AAG(24시간 동안 5 μM의 농도)으로 처리된 HeLa 세포세포에서 Akt, Hsp70, Chk1, 및 GAPDH 단백질 수준을 보여주는 일련의 면역블랏이다.
도 18A는 위쪽 및 아래쪽에 2개의 선 그래프로 구성되어 있다. 위쪽 선 그래프는 H460 폐 선암 이종이식 종양(100-150 mm)을 나르는 가미트리닙-G4("G4") 또는 17-AAG로 처리된 SCID/beige 마우스에서 시간의 함수로서 종양 부피를 보여준다. 아래쪽 선 그래프는 비히클, 가미트리닙-G1("G1") 또는 가미트리닙-TPP("TPP")과 함께 실시예 11에 기재된 대로 용량 에스컬레이션 섭생으로 처리된 마우스에서 시간의 함수로서 종양 부피를 보여준다. 종양 부피를 캘리퍼로 측정하였다.
도 18B는 TUNEL에 의해 제자리에서(in situ) 가시화된 비히클("Vehicle") 또는 가미트리닙-G4("G4") 처리 종양으로부터의 종양 견본에서 뉴클레오좀간(internucleosomal) DNA 절편화(fragmentation)에 관한 "Vehicle" 및 "G4" 표지된 2개의 이미지를 보여준다. 아래쪽 막대 그래프는 정량된 양성 세포를 보여준다. 배율, x400. ***, p＜O.0001.
도 18C는 비히클- 또는 가미트리닙-G4("G4") 처리 동물에서 수확된 H460 이종이식 종양의 세포질 분획내 시토크롬 c(Cyto c), Cox-IV, 및 GAPDH에 관한 일련의 면역블랏을 보여준다. 2마리 마우스/그룹(동물 #)을 분석하였다.
도 18D는 실험 말기에 측정된, 비히클, 17-AAG, 가마트리닙-G1("G1"), 가마트리닙-G4("G4"), 또는 가마트리닙-TPP("TPP")로 처리된 마우스에서 체중 손실 비율을 보여주는 막대 그래프이다. 평균±SEM.
도 18E는 정상 WS-1 섬유아세포에서 분리되고 CsA 존재 또는 부재하에 비커플링된 17-AAG/TG-OH 또는 가미트리닙-G4("G4")과 함께 인큐베이션한 TMRM-로딩된 미토콘드리아에서 시간에 따른 막 전위 비율을 보여주는 선 그래프이다. 화살표, 첨가 시점.
도 18F는 가미트리닙-G1("G1"), 가미트리닙-G2("G2"), 가미트리닙-G3("G3"), 가미트리닙-G4("G4"), 가미트리닙-TPP("TPP"), 또는 17-AAG으로 처리되고 정상 HFF 섬유아세포 또는 HeLa 세포에서 분리된 미토콘드리아에서 Cyto c 및 Cox-IV에 대한 2개의 면역블랏을 보여준다. Cox-IV를 미토콘드리아 마커로 사용하였다.
도 18G는 인큐베이션 24시간 후 MTT로 분석한, 인간 섬유아세포(HFF, 검은선), 우 대동맥 내피 세포(bovine aortic endothelial cell)(무광, medium grey), 장 상피 세포(어두운 회색) 또는 인간 제대 정맥 내피 세포(연한 회색)내 가미트리닙-G4(실선) 또는 17-AAG(점선)의 농도의 함수로서 생존도 비율을 보여주는 선 그래프이다. 데이터는 2회 실험의 대표값이다.
도 19는 이러한 연구에 사용된 GA(17-AAG), IPI-504, 및 비-GA 기반(BIIB021 및 NVP-AUY922) Hsp90 억제자의 화학 구조의 도식적 다이어그램이다.
도 2OA는 처리가 지속되는 동안 일일 2회 2 mg/kg 복강내로(i.p.)(HL-60) 비히클 또는 가미트리닙-G4("G4")로 처리된 시간에 따른 인간 급성 백혈병 HL-60 종양 부피(2/마우스, 6 종양/그룹)를 보여주는 선 그래프이다. 화살표는 처리 개시점.
도 2OB는 처리가 지속되는 동안 일일 2회 2 mg/kg(0-2일), 일일 2회 2.5 mg/kg(3-5일), 및 일일 2회 3 mg/kg으로 시작하여 용량 에스컬레이션 섭생(MDA-MB-231)으로 비히클 또는 가미트리닙-G4 ("G4")으로 처리된 시간에 따른 인간 유방 선암 MDA-MB- 231 종양 부피(2/마우스, 6 종양/그룹)를 보여주는 선 그래프이다. 화살표는 처리 개시점.
상세한 설명
미토콘드리아는 세포 생존과 세포 사멸에 중요한 역할을 한다(Pandey et al, EMBO J., 19:4310-4322 (2000); Green and Kroemer, Science, 305:626-629, (2004)). 이러한 세포소기관의 기능부전 및 온전함(integrity)의 상실은 내부 미코콘드리아 막의 증가된 투과성, 막 전위의 상실, 매트릭스의 팽윤, 및 궁극적으로 세포질내, 아폽토시스성(apoptogenic) 단배질, 즉, 시토크롬 c의 방출을 동반하는 외막의 파열에 의해 특징지워지는, 다수의 세포 사멸 경로의 분자적 전제조건이다(Green and Kroemer, Science, 305:626-629, (2004)). "미토콘드리아 투과성 전이"로 공지된, 이러한 과정이 어떻게 일어나는지는 완전히 이해되지 않고 있다(Green and Kroemer, Science, 305:626-629, (2004)); 전압-의존성 음이온 채널(VDAC-1), 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터(ANT), 또는 이뮤노필린 시클로필린 D(CypD)를 포함하는, 투과성 전이 세공의 구성성분들이 불필요해지거나(Kokoszka et al., Nature, 427:461-1465, (2004); Krauskopf et al., Biochim. Biophys. Acta, 1757:590-595, (2006)), 모든 형태의 미토콘드리아 세포 사멸에 해당되는 것은 아니나, 일부 경우에 연루되어 있는 것이 확인되었다(Baines et al., Nature, 434:658-662, (2005); Nakagawa et al., Nature, 434:652-658, (2005)).
본 발명은, 적어도 부분적으로, 분자 샤페론 Hsp60, Hsp90 및 TRAP-1이 종양 세포의 미토콘드리아에서 증가된 수준으로 발견되고, 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 사용한 종양 세포 미토콘드리아내 분자 샤페론의 억제가 암 세포 사멸을 야기시킨다는 발견에 기초한다. 이론에 의개 국한되는 것을 원치 않으며, 이러한 미토콘드리아 샤페론의 억제는 세포 사멸을 유도하는, 미토콘드리아 막 전위의 소실 및 시토크롬 c의 방출을 포함하는, 미토콘드리아 기능의 붕괴를 동반하는 미토콘드리아 투과성 전이의 활성화를 초래할 수 있다.
따라서, 본원은 샤페론 억제자, 예를 들어, HSPA9, Hsp60, Hsp90 또는 TRAP-1 억제자, 및 개재(intervening) 링커를 지니거나 지니지 않는, 미토콘드리아 관통 모이어티를 포함하는 향미토콘드리아성 작용제, 이러한 조성물을 제조하는 방법, 및, 예를 들어, 생체내 및 시험관내에서, 비정상 세포 증식과 관련된 장애, 예를 들어, 암 및 종양 세포를 치료하기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법을 개시한다. 또한 본원은 이러한 향미토콘드리아성 작용제를 함유하는 조성물을 개시한다.
I. 분자 샤페론
분자 샤페론, 특히 열 충격 단백질(Hsp) 유전자 패밀리의 일원들(Lindquist and Craig, Annu. Rev. Genet. 1988; 22:631-77)은 단백질 폴딩 품질 조절, 단백질 분해, 세포하(subcellular) 구획들 간의 단백질 트래피킹(trafficking)을 보조한다(Hartl and Hayer-Hartl, Science 2002; 295: 1852-8). 분자 샤페론은 ATPase 활동의 주기적 순환, 추가 샤페론의 모집, 및 미토콘드리아를 포함하는, 세포하 마이크로도메인내 구획화에 관여한다(Young et al, Cell 2003; 112:41-50). 분자 샤페론은 종종 아폽토좀-개시 미토콘드리아 세포 사멸의 억제를 통한(Paul et al., MoI Cell Biol 2002; 22:816-34), 향상된 세포 생존(Beere, J Cell Sci 2004; 117:2641-51), 생존 이펙터의 안정성 증가(Sato et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 10832-7), 및 p53의 불활성화(Wadhwa et al., J Biol Chem 1998; 273:29586-91)에 관여한다. 본원에 기재된 대로, 샤페론 항-아폽토시스 기능은 종양 세포 유지에 중요한 역할을 하며 암 세포를 사멸시키기 위해 선택적으로 표적화될 수 있다. 또한 하기 문헌을 참조하라: Whitesell et al., Nat Rev Cancer 2005; 5:761-72; 및 Isaacs et al., Cancer Cell 2003; 3:213-7.
하기는 본 발명을 사용하여 표적화될 수 있는 분자 샤페론의 일부에 대한 간략한 설명이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법(예를 들어, 스크리닝 방법)에서 유용한 분자 샤페론 폴리펩티드는 본원에 기재된 아미노산 서열(예를 들어, 인간 서열)에 대해 적어도 약 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법(예를 들어, 스크리닝 방법)에서 유용한 분자 샤페론을 엔코딩하는 핵산은 본원에 기재된 핵산 서열(예를 들어, 인간 서열)에 대해 적어도 약 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일하다.
서열 비교 및 두 서열 간의 동일성 비율의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 두 아미노산 사열 간의 동일성 비율은 니들만과 분쉬(Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444-453) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 상기 알고리즘은, 디폴트 파라미터, 예를 들어, 12의 갭 페널티, 4이 갭 신장 페널티, 및 5의 프레임시프트 갭 페널티를 지니는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지(월드 와이드 웹 gcg.com에서 가용함)내 GAP 프로그램에 통합되어 있다.
Hsp90(열-충격 90-kD 단백질 1)
HSP90은 종양유전자 신호전달 단백질을 포함하는, 다수의 단백질의 형태적 성숙에 중요한 역할을 하는 분자 샤페론이다. 본원에 기재된 대로, Hsp90은 암세포의 미토콘드리아내에 축적되나, 정상 세포에서는 그렇지 않으며, 미토콘드리아-관통 서열을 포함하는 본원에 기재된 조성물을 사용하여 표적화될 수 있다.
인간 Hsp90의 유전자은행 수탁 번호는 NM_O1Ol7963.2(핵산) 및 열 충격 단백질 9OkDa 알파(세포질), 클래스 A 멤버 1 이소형 1의 경우, NP_001017963.2(단백질), 열 충격 단백질 9OkDa 알파(세포질), 클래스 A 멤버 1 이소형 2의 경우, NM_005348.3(핵산) NP_005339.3(단백질)을 포함한다. 변이체 2는 변이체 1과 비교하여 5' UTR 및 코디 서열에서 상이하다. 그 결과 얻은 이소형 2는 이소형 1과 비교하여 N-말단에서 더 짧다.
Hsp90은 또한 HSPCA; HSPC1; HSP90A; HSP89-ALPHA(HSP89A); 리포폴리사카라이드-연관 단백질 2(LAP2); 및 LPS-연관 단백질 2로 공지되어 있다.
TRAP-1(TNF 수용체-연관 단백질 1)
TRAP-1은 hsp90와 높은 상동성을 지니며, 타입 1 종양 괴사 인자 수용체에 결합한다(하기 문헌 참조: Song et al., J. Biol. Chem., 270:3574-3581 (1995)). 감소된(deduced) 661-아미노산 단백질은 HSP90 패밀리 일원과 60% 유사하나, HSP90 단백질에서 발견되는 고도로 하전된 도메인이 결여되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Felts et al., J Biol Chem. 2000; 275(5):3305-12. 본원에 기재된 대로, TRAP-1은 암 세포의 미토콘드리아내에 축적되나, 정상 세포에서는 그렇지 않으며, 미토콘드리아-관통 서열을 포함한ㄴ 본원에 기재된 조성물을 사용하여 표적화될 수 있다.
인간 TRAP-1의 경우 유전자은행 수탁 번호는 NM_016292.2(핵산) 및 NP_057376.2(아미노산)을 포함한다. 또한 TRAP-1은 열-충격 단백질, 75-KD(HSP75); 종양 괴사 인자 수용체-연관 단백질 1; TRAP1; 및 TNFR-연관 단백질 1으로도 공지되어 있다.
Hsp60(열-충격 60-kD 단백질 1)
연관된 샤페로닌, Hsp1O과 함께, Hsp60은 대개 진화적으로 보존되어 있고, 미토콘드리아내에 전적으로 구획화되지 않으며(Soltys and Gupta, Int Rev Cytol 2000; 194: 133-96), 세포소기관 생체생성 및 운송된 프리단백질의 폴딩/재폴딩에 중요한 역할을 갖는(Deocaris et al., Cell Stress Chaperones 2006; 11:116-28) 스트레스 반응 샤페론으로 인지되어 왔다(Zhao et al., Embo J 2002;21 :4411-9). 그러나, 데이터는 향상된 카스파제 활성화를 통한 향-아폽토시스 기능(Samali et al., Embo J 1999; 18:2040-8; Xanthoudakis et al., Embo J 1999; 18:2049-56), 또는, 반대로, Bax-함유 복합체의 격리(sequestration)에 관여하는 항-아폽토시스 메커니즘(Shan et al., J Mol Cell Cardiol 2003; 35: 1135-43)을 제시하여, Hsp60가 세포 생존에도 기여하는지 여부는 논쟁의 여지가 있었다. 암에서의 Hsp60의 역할도 동일하게 불명확하였는데, 그 이유는 이 샤페론의 상향-조절(Thomas et al., Leuk Res 2005; 29: 1049-58; Cappello et al, BMC Cancer 2005; 5: 139), 또는 하향-조절(Tang et al., Cell Stress Chaperoenes 2005; 10:46-58; Cappello et al., Cancer 2006; 107:2417-24)이 질환 결과와 상호연관된 다양한 종양 시리즈에서 보고되었기 때문이다. 본원에 기재된 대로, Hsp60은 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 고도로 발현되며, Hsp60의 표적화는 미토콘드리아 기능부전 및 아폽토시스를 초래하며, 반편 정상 세포에서 Hsp60의 손실은 잘 인내되며, 세포 사멸을 초래하지 아니한다.
Hsp60은 또한 CPN60; GROEL; HSP60; HSP65; SPG13; 및 HuCHA60으로도 공지되어 있다. 인간 Hsp60의 경우 예시적인 유전자은행 수탁 번호는 NM_002156.4(핵산) 및 전사 변형체 1(더 긴 변형체)의 경우 NP_002147.2(단백질), 및 전사 변형체 2의 경우 NM_199440.1(핵산) 및 NP_955472.1(단백질)를 포함한다. 변형체 2는 변형체 1과 비교하여 5' UTR에 차이가 존재한다. 두 변형체 1과 2는 동일한 이소형을 엔코딩한다.
HspA9(열 충격 7OkD 단백질 9)
HspA9은 열 충격 단백질 70 패밀리에 속하며, 열-유도적으로 발현되는 일원 및 구성적으로 발현되는 일원 둘 모두를 포함한다. 후자는 열-충격 동족체 단백질로 지칭되며, 그중 하나가 HspA9이다. HspA9은 세포 증식 조절에 소정 역할을 담당하며, 또한 샤페론으로 역할할 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Wadhwa et al., Int J Cancer. 2006; 118(12):2973-80; Wadhwa et al., J Gene Med. 2004; 6(4):439-44.
또한 HspA9은 모르탈린(mortalin), mthsp70, 및 GRP75로 공지되어 있다. 인간 HspA9의 경우, 예시적인 유전자은행 수탁 번호는 NM_004134.5(핵산) 및 NP_004125.3(단백질), 열 충격 7OkD 단백질 9 전구체를 포함한다.
II. 분자 샤페론의 억제자
본원에 기재된 조성물과 방법은 분자 샤페론의 억제자, 예를 들어, Hsp60, HspA9, Hsp90 및/또는 TRAP-1의 억제자의 용도를 포함한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 억제자는 샤페론 단백질 그 자체에 직접적으로 작용하는데, 즉, 이들은 상류 또는 하류에 작용하지 아니한다. 다수의 그러한 억제자, 예를 들어, 펩티드 억제자 및 소분자 억제자가 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 유용한 분자 샤페론 억제자는 샤페론, 예를 들어, Hsp60, HspA9, Hsp90, 및/또는 TRAP-1의 ATPase 활성을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 유용한 분자 샤페론 억제자는 시클로필린 D에 대한 Hsp60, HspA9, Hsp90, 또는 TRAP-1의 결합을 억제한다. 일부 구체예에서, 본 발명에 유용한 분자 샤페론 억제자는 수비빈(수비빈)에 대한 Hsp60, HspA9, Hsp90, 또는 TRAP-1의 결합을 억제한다. 일부 구체예에서, 분자 샤페론 억제자는 샤페론에 결합하고 샤페론의 클라이언트 단백질의 프로테아좀 분해를 유도한다.
또한, 후보 샤페론 억제자를 확인, 디자인, 및 분석하는데 유용한 다수의 방법이 존재한다. 예를 들어, 합리적인 스크리닝 방법을 사용하여 Hsp90을 표적으로 삼는 추가 분자를 확인하였는데, 이 방법은 비펩티드성 구조의 데이터베이스를 스크리닝하기 위해 스캐폴드로서, 쉬페르딘 펩티드(LFACGSSHK, 모두 D-아미노산)을 사용하는 전산 접근법을 사용한다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Meli et al, J. Med. Chem., 49:7721-7730 (2006).
분자 샤페론의 펩티드 억제자
분자 샤페론, 예를 들어, Hsp90 및/또는 TRAP-1의 다수의 펩티드 억제자가 당업계에 공지되어 있다. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 유용한 억제자는 전체 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 아폽토시스-유도 단백질(AIP, 예컨대, 수비빈)의 전부, 또는 모 폴리펩티드의 Hsp90 억제 활성을 보유한, 즉 모 폴리펩티드의 활성의 적어도 40%를 보유한 이의 활성 단편(즉, 억제성 단편)를 포함할 수 있고; 활성 단편은 바람직하게는 모 폴리펩티드의 Hsp90-억제 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상을 지닌다.
수비빈 펩티드 및 유도체
수비빈 펩티드과 펩티드 유도체는 미국 특허 출원 제11/187,230호(이의 전체로 참고문헌으로 본원에 통합됨)에 개시되어 있다. 활성 수비빈 펩티드는 서열번호 2의 코어 Hsp90 결합 서열 모티프(His Ser Ser Gly Cys)를 공유하는데, 이것은 수비빈 단백질의 아폽토시스(IAP) 반복(BIR) 도메인의 단일 배큘로바이러스 억제자내에 위치하고 있다. 이 모티프는 전장 수비빈(서열번호 1)의 위치 80-84의 아미노산 잔기들에 대응한다. 이 모티프, 이의 펩티드 유도체를 포함하는 펩티드는 (a) Hsp90의 N-말단 ATPase 도메인("ATP 포켓")에 결합할 수 있고 (b) 시험관내 및 생체내에서 Hsp90-수비빈 단백질-단백질 상호작용을 억제시킬 수 있다.
본원에 사용된, 용어 수비빈 펩티드 및 수비빈 펩티드 유도체는 세포 사멸을 억제하는 기능적 수비빈 단백질의 완전한 아미노산 서열보다 더 적은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 의미한다. 본 발명에 유용한 수비빈 펩티드와 펩티드 유도체는 분자 샤페론을 억제시키며, 특히, 분자 샤페론, 예를 들어, Hsp90 또는 TRAP-1, 및 시클로필린 D 간의 상호작용을 억제시킨다.
전장 인간, 야생형 수비빈 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 지닌다:
Figure pct00009
하기 표(표 1)은 Hsp90에 결합할 수 있는 일부 예시적인 수비빈 펩티드를 나열한 것이다:
표 1. 예시적인 수비빈 펩티드
Figure pct00010
수비빈 펩티드의 변이체는 또한 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 보존적 및 비보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 특히, 보존적 아미노산 치환이 서열번호 1의 His 80 내지 Cys 84에 상응하는 코어 펜타머 서열(즉, 위에 기재된 서열번호 2)을 벗어나 하나 이상, 예를 들어, 최대 5개, 10개, 20개, 또는 30개 아미노산까지 이루어질 수 있다. 수비빈 펩티드의 펩티도미메틱은 이의 전체로서 참고문헌으로 본원에 통합된 문헌[Plescia et al., Rational design of Shepherdin, a novel anticancer agent. Cancer Cell. 7(5):457-68 (2005)]에 기재되어 있다.
다른 IAP 펩티드 및 유도체
다른 아폽토시스 단백질의 억제자(IAPs)는 Hsp90와 상호작용하며, cIAP1(엔트레즈(Entrez) 수탁 번호 NP_001156), cIAP2(엔트레즈 수탁 번호 NP_001157), 및 XIAP(엔트레즈 수탁 번호 NP_1O1158)를 포함한다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Deveraux and Reed, Genes and Dev., 13:239-252 (1999). 이러한 IAP 단백질은 본원에 개시된 것과 같이, Hsp90 상호작용을 매개하는 적어도 하나의 배큘로바이러스 IAP 반복 도메인을 함유한다. 예를 들어, XIAP의 제 1 BIR 도메인(BIR1)은 Hsp90-XIAP 결합 상호작용을 매개한다.
따라서, IAP 단백질, 또는 이의 Hsp90-결합 및 -억제 단편이 본 발명의 조성물과 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 IAP 단백질내의 하나 이상의 BIR 도메인에 상응하는 펩티드, 또는 이의 Hsp90-결합 단편이 암 또는 종양 세포 사멸을 유도하기 위해 본원에 개시된 조성물과 방법에서 사용될 수 있다. IAP 단백질, 또는 이의 Hsp90-결합 단편은, 또한 시험 화합물로서 스크리닝될 수 있는데, 예를 들어, 분자 샤페론과 시클로필린 D 사이의 결합을 억제시키는 후보 화합물을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 일부 구체예에서, IAP 단백질, 또는 이의 Hsp90-결합 단편은 암 세포 사멸을 유도하는 후보 화합물을 확인하기 위해 시험 화합물로서 스크리닝될 수 있다.
예시적인 XIAP의 제 1 BIR 도메인은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00011
예시적인 cIAP1의 제 1 BIR 도메인은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00012
예시적인 cIAP2의 제 1 BIR 도메인은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00013
펩티드 억제자의 변이체
분자 샤페론의 펩티드 억제자의 변이체는 또한 본 발명의 일부이다. 이들은 서열 변이체를 포함한다. 보존적 아미노산 치환이 이루어지는 경우, 치환은 하기 그룹 중 임의 그룹 중의 또 다른 아미노산 잔기에 대해 하나의 아미노산 잔기로 이루어 질 수 있다: 아르기닌, 히스티딘, 및 리신; 아스파르트산 및 글루탐산; 알라닌, 루신, 이소루신 및 발린; 및 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 여기에 나열된 아미노산 잔기들은 자연적으로 생성된다. 유사한 종류의 비-자연적으로 생성되는 아미노산 잔기들이 또한 치환될 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 비자연적으로 생성되는 아미노산 잔기가 음으로 하전된 자연적으로 생성되는 아미노산 잔기로 대체될 수 있고; 소수성 방향족성 비자연적으로 생성되는 아미노산 잔기가 소수성 방향족성 자연적으로 생성되는 아미노산 잔기로 치환될 수 있으며; 그 밖의 경우도 가능하다.
동일성 정도는 상이할 수 있고 당업계에 잘 확립된 방법으로 결정될 수 있다. "상동성" 및 "동일성"은 각각 2개의 폴리펩티드 서열 간의 서열 유사도를 의미하는데, 동일성이 더 엄격한 비교기준이 된다. 상동성 및 동일성은 각각 비교 목적을 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열내 위치가 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우, 해당 폴리펩티드는 그러한 위치에서 동일한 것으로 간주될 수 있다; 등가 위치가 동일한 아미노산(예를 들어, 입체 및/또는 전자적 특성에 동일) 또는 유사한 아미노산(예를 들어, 입체 및/또는 전자적 특성에서 유사)에 의해 점유된 경우, 해당 분자는 그러한 위치에서 상동성인 것으로 간주될 수 있다. 서열들 간의 상동성 또는 동일성 비율은 해당 서열들에 의해 고유된 매칭되거나 상동성 있는 위치들의 개수에 대한 함수이다. 본원에 기재된 폴리펩티드의 생물학적으로 활성있는 변이체는 상응하는 자연적으로 생성되는 폴리펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 , 수비빈 단편 또는 IAP 단편)에 적어도 또는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성 또는 상동성을 지닐 수 있다. 유사하게 생물학적으로 활성있는 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 상응하는 자연적으로 생성되는 핵산 서열에 적어도 또는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 지니는 것으로 기재될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 핵산 서열의 축퇴성 변이체, 및 그러한 변이체가 본원에 기재된 목적을 위해 사용될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다.
인간 피검체에서 펩티드 억제자 및/또는 미토콘드리아 관통 모이어티를 사용할 때, 인간 또는 인간화된 서열을 사용하는 것이 일반적으로 요망될 수 있을 것이다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 비인간 서열을 인간화시키기 위한 표준 분자생물학 기법들을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 서열은 작제물을 제조하는데 사용될 수 있다.
펩티드 억제자의 변형
본원에 기재된 펩티드들의 변형된 버전이 또한 본원에 기재된 조성물과 방법에 사용될 수 있다. 펩티드 및 이의 생물학적으로 활성있는 변이체는 다수의 방법으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산 잔기들, 다른 치환, 및 보호기들을 포함하는 제제가 아미노산 말단, 카르복시 말단 중 어느 하나, 또는 상기 말단 둘 모두에 부가될 수 있다. 변형은 펩티드의 형태를 변형시키거나 해당 펩티드가 또 다른 펩티드, 비동일한 펩티드, 또는 다른 폴리펩티드와 결합하거나 상호작용하는 방식을 변형시키기 위한 목적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 디술피드 결합 형성에 참여할 수 있는 시스테인 잔기 또는 기타 황-함유 잔기 또는 제제를 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 임의로, 펩티드의 C-말단 또는 N-말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에 적어도 2개의 시스테인 잔기를 부가할 수 있다.
펩티드는 시스테인 잔기들 사이의 (또는, 더 일반적으로, 폴리펩티드(예를 들어, 말단 영역에서)내에 존재하는 적어도 2개의 시스테인 잔기들중 2개 사이의) 이황화 결합의 형성으로 고리화될 수 있다. 본 발명의 펩티드가 선형 또는 고리형일 수 있으나, 고리형 펩티드는 일반적으로 이들이 고리 구조가 더 단단하고 그에 따라 이들의 생물학적 활성이 상응하는 선형 펩티드의 활성 보다 더 높을 수 있다는 점에서 선형 펩티드를 능가하는 이점을 갖는다(일반적으로, 하기 문헌 참조: Camarero and Muir, J. Am. Chem. Soc, 121 :5597-5598, (1999).
선형 전구체로부터의 고리 폴리펩티드의 제조를 위한 전략은 개시되어 있고 본 밤령의 펩티드에 채용될 수 있다. 예를 들어, 화학적 가교 방법이 해당 펩티드의 골격 고리화된 버전을 제조하는데 사용될 수 있다(Goldenburg and Creighton, J. Mol. Biol, 165:407-413, (1983)). 기타 방법은 화학적 분자내 라이게이션 방법(예를 들어, 하기 문헌 참조: Camarero et al, Angew Chem. Int. Ed., 37:347-349, (1998); Tarn and Lu, Prot. ScL, 7: 1583-1592, (1998); Camarero and Muir, Chem. Commun., 1369-1370, (1997); 및 Zhang and Tarn, J. Am. Chem. Soc, 119:2363-2370, (1997) 및 효소적 분자내 라이케이션 방법(Jackson et al., J. Am. Chem. Soc, 117:819-820, (1995)을 포함하는데, 상기 방법은 선형 합성 펩티드가 수성 조건하에서 효율적으로 고리화되도록 한다. 또한 미국 특허 제7,105,341호를 참조하라.
대안적으로, 또는 추가로, 펩티드는 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서 치환기(substituent)를 포함할 수 있다. 치환기는 아실기 또는 치환되거나 비치환된 아민기일 수 있다(예를 들어, N-말단에서 치환기는 아실기일 수 있고 C-말단에서 치환되거나 비치환된 아민기(예를 들어, 동일하거나 상이할 수 있는, 1개, 2개, 또는 3개의 치환기를 갖는 아미노 기)로 아미드화될 수 있다)). 아민 기는 저급 알킬(예를 들어, 1-4개의 탄소를 지니는 알킬), 알케닐, 알키닐, 또는 할로알킬 기를 포함할 수 있다. 아실 기는 저급 아실 기(예를 들어, 최대 4개의 탄소 원자를 지니는 아실 기), 특히 아세틸 기일 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지된 포화된 탄화수소 기를 지칭한다. 알킬 기의 예는 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(예를 들어, n-프로필 및 이소프로필), 부틸(예를 들어, n-부틸, 이소부틸, t-부틸), 펜틸(예를 들어, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸) 등을 포함한다. 알킬 기는 1 내지 약 20개, 2 내지 약 20개, 1 내지 약 10개, 1 내지 약 8개, 1 내지 약 6개, 1 내지 약 4개, 또는 1 내지 약 3개의 탄소 원자를 함유할 수 있다.
본원에 사용된, "알케닐"은 하나 이상의 이중 탄소-탄소 결합을 지니는 알킬 기를 의미한다. 알케닐 기의 예는 에테닐, 프로페닐 등을 포함한다.
본원에 사용된, "알키닐"은 하나 이상의 삼중 탄소-탄소 결합을 지니는 알킬 기를 의미한다. 알키닐 기의 예는 에티닐, 프로피닐 등을 포함한다.
본원에 사용된, "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐 치환기를 지니는 알킬 기를 의미한다. 할로알킬 기의 예는 CF3, C2F5, CHF2, CCI3, CHCl2, C2Cl5 등을 포함한다.
본원에 사용된, "아릴"은 6 내지 19개 탄소 원자를 함유한 방향족 단일고리 또는 다중고리 기를 의미한다. 아릴 기의 예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 비치환되거나 치환된 페닐, 비치환되거나 치환된 플루오레닐, 및 비치환되거나 치환된 나프틸을 포함한다.
본원에 사용된, "헤테로시클로알킬"은 한 구체예에서 3 내지 10개 일원, 또 다른 구체예에서, 4 내지 7개 일원, 추가 구체예에서 5 내지 6개 일원의, 단일고리 또는 다중고리, 포화 또는 불포화 고리 시스템을 의미하며, 상기 고리 시스템내의 원자들중 하나 이상, 특정 구체예에서, 1 내지 3개의 원자들은 헤테로원자, 즉, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 질소, 산소 또는 황을 포함하는, 탄소 이외의 원소이다. 특정 구체예에서, 고리의 원자들중 하나는 카르보닐 또는 설포닐 기로 대체될 수 있다.
본원에 사용된, "알킬렌," "알케닐렌," "아키닐렌," "시클로알킬렌," "아릴렌," "헤테로아릴렌," 및 "헤테로시클로알킬렌"은 "알킬," "알케닐," "알키닐," "시클로알킬," "아릴," "헤테로아릴," 및 "헤테로시클로알킬" 기를 연결하는 2가의 기를 의미한다. 2가 링커는, 일부 구체예에서, 양 방향에 존재할 수 있는데, 예를 들어, C(O)NH는 -C(O)NH- 또는 -NHC(O)-일 수 있다.
강조한 대로, 펩티드는 길이에 있어서 상이할 수 있고 샤페론 결합 단백질(CBP), 예를 들어, 수비빈 또는 IAP에서 자연적으로 생서외거나, 자연적으로 생성되는 (그러나 충분한 활성을 보유하여 유용한) CBP 서열로부터 소정 규모로 차이가 나는 연속된 아미노산 잔기이거나 이를 포함할 수 있다. 펩티드가 이들의 N-말단 또는 C-말단(또는 양 말단)에서 CBP에서 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 잔기들을 포함하는 경우, 추가의 서열(들)이 약 200개 아미노산 잔기 길이일 수 있고, 이러한 잔기들은 N-말단과 C-말단 사이에 균등하게 또는 비균등하게 분할될 수 있다. 예를 들어, N- 및 C-말단 둘 모두는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 한 말단은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200개 잔기들을 포함할 수 있고, 한 말단은 전혀 포함하지 않을 수 있다(예를 들어, 말단은 자연적으로 생성되는 수비빈 서열과 동일한 아미노산 서열로 종결될 수 있다).
더 구체적으로, N- 또는 C-말단은 양으로 하전된 1 내지 약 100개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개) 아미노산 잔기(예를 들어, 염기성 아미노산 잔기, 예컨대, 아르기닌, 히스티딘, 및/또는 리신 잔기); 음으로 하전된 1 내지 약 100개의 아미노산(예를 들어, 산성 아미노산 잔기들, 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산 잔기들); 1 내지 약 100개의 글리신 잔기; 1 내지 약 100개의 소수성 아미노산 잔기(예를 들어, 소수성 알리파틱 잔기, 예컨대, 알라닌, 루신, 이소루신 또는 발린 또는 소수성 방향족 잔기, 예컨대, 페닐알라닌, 트립토판 또는 티로신); 또는 1 내지 약 100개(예를 들어, 1-4개) 시스테인 잔기를 포함할 수 있다.
상기한 변형된 펩티드를 포함하는, 펩티드는 프로테아제 내성일 수 있고 한 유형 이상의 보호기, 예컨대, 아실기, 아미드기, 벤질 또는 벤조일기, 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 더 구체적으로, 상기 변형된 펩티드를 포함하는, 펩티드는 N-말단 아세틸화되고/거나 C-말단 아미드화될 수 있다.
자연적으로 생성되거나 변형된 아미노산 잔기들이 포함된 경우, 이들은 하기한 것들 또는 당업계에 가용한 다수의 기타의 것들에서 선택될 수 있다: 4-히드록시프롤린, 감마-카르복시글루탐산, o-포스포세린, o-포스포티로신, 또는 델타-히드록시리신. 다른 일예는 나프틸알라닌을 포함하는데, 트립토판의 경우 합성을 용이하게 하기위해, L-히드록시프로필, L-3,4-디히드록시페닐알라닐, 알파-아미노산, 예컨대, L-알파-히드록시리실 및 D-알파-메틸알라닐, L-알파-메틸알라닐, 베타-아미노산, 및 이소퀴놀일로 치환될 수 있다. 비자연적으로 생성되는 아미노산을 지니는 펩티드는 합성 펩티드로서 지칭될 수 있고 본원에 기재된 변이체의 한 유형을 구성할 수 있다. 기타 변이체는 아미노산 잔기(L- 또는 D-형태 중 어느 하나)의 자연적으로 생성되는 측쇄가 비자연적으로 생성되는 측쇄로 대체된 펩티드를 포함한다.
일 구체예에서, 펩티드는 어느 한 말단(또는 양 말단)(예를 들어, N-말단)에서 3개의 잉여 아미노산(Met-Gly-Ser) 및 어느 한쪽 말단(또는 양쪽 말단)(예를 들어, C-말단)에서 7 내지 8개의 잉여 아미노산(Thr-Ser-His-His-His-His-His-His-Cys(서열번호 13))을 지닐 수 있다.
또 다른 구체예에서, 펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 페길화(PEGylation)될 수 있다.
환원/알킬화 및/또는 아실화에 의한 펩티드 변형에 관한 지침의 경우, 당업자가 문헌[Tarr, Methods of Protein Microcharacterization, J. E. Silver ed., Humana Press, Clifton N.J. (1986) 155-194]을 참조할 수 있고; 적절한 담체 대한 화학적 커플링에 관한 지침의 경우, 당업자는 문헌[Mishell and Shiigi, eds, Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, Calif. (1980) and 미국 특허 제 4,939,239]을 참조할 수 있으며; 유수한 포르말린 처리에 관한 지침의 경우, 당업자는 문헌[Marsh, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol, (1971) 41: 199-215]을 참조할 수 있다.
억제 페티드의 펩티도미메틱이 또한 사용될 수 있다. 본원에 개시되고 당업계에 공지된 펩티드 억제자는 펩티도미메틱을 생산하기 위한 당업계에 공지된 방법에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Kazmierski, W.M., ed., Peptidomimetics Protocols. Human Press (Totowa NJ 1998); Goodman et al., eds., Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thiele Verlag (New York 2003); 및 Mayo et al., J. Biol. Chem., 278:45746, (2003). 일부 경우에 있어서, 본원에 개시된 펩티드 및 단편의 이러한 변형된 펩티도미메틱 버전은 비-펩티도미메틱 펩티드에 비해, 생체내에서 향상된 안정성을 나타낸다.
펩티도미메틱을 만들기 위한 방법은 D-아미노산 거울상이성질체와 더불어 펩티드 서열내 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, 아미노산의 전부를 대체하는 것을 포함한다. 그러한 서열은 "레트로" 서열로 본원에서 지칭딘다. 또 다른 방법에서, 아미노산 간기의 N-말단 내지 C-말단 순서가 역전되어, 본래 펩티드의 N-말단으로부터 C-말단까지의 아미노산 잔기의 순서가 변형된 펩티도미메틱내의 C-말단으로부터 N-말단까지의 아미노산 잔기의 순서가 된다. 그러한 서열은 "인버소(inverso)" 서열로 지칭될 수 있다.
펩티도미메틱은 레트로 및 인버소 버전 둘 모두일 수 있는데, 즉, 본원에 개시된 펩티드의 "레트로-인버소" 버전일 수 있다. 신규한 펩티도미메틱은 정렬된 D-아미노산으로 구성되어 펩티도미메틱내의 N-말단으로부터 C-말단까지의 아미노산 잔기들의 순서는 본래 펩티드의 C-말단으로부터 N-말단까지의 아미노산 잔기들의 순서와 대응될 수 있다.
펩티도미메틱을 제조하기 위한 다른 방법은 펩티드내의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 해당 아미노산의 화학적으로 독특하나 인지된 기능적 유사체, 즉, 인공 아미노산 유사체로 대체하는 것을 포함한다. 인공 아미노산 유도체는 아미노산의 β-아미노산, β-치환된 β-아미노산("β3-아미노산"), 인 유사체, 예컨대, α-아미노산 포스폰산 및 α-아미노 포스핀산, 및 비-펩티드 연결을 지니는 아미노산을 포함한다. 인공 아미노산은 펩티도미메틱, 예컨대, 펩토이드 올리고머(예를 들어, 펩토이드 아미드 또는 에스테르 유사체), β-펩티드, 고리 펩티드, 올리고우레아 또는 올리고카바메이트 펩티드; 또는 헤테로시클릭 고리 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 예시적인 수비빈 레트로-인버소 펩티도미메틱은 LFACGSSHK(서열번호 25), CGSSH(서열번호 26), GSSHK(서열번호 27), KKWKMRRNQFWVKVQRLFACGSSHK(서열번호 28), KKWKMRRNQFWVKVQRCGSSH(서열번호 29), 및 KKWKMRRNQFWVKVQRGSSHK(서열번호 30)을 포함하며, 상기 서열들은 모두 D-아미노산을 포함한다. 이러한 서열은, 예를 들어, 아미노 말단의 비오티닐화 및 카르복시 말단의 아미드화에 의해 변형될 수 있다.
본원에 기재된 변이체 형태를 포함하는, 본원에 기재된 임의의 펩티드는 이종성 폴리펩티드(예를 들어, CBP에서 나타나지 않는 서열을 지니는 폴리펩티드)를 추가로 포함할 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 부착된(예를 들어, 융합 단백질에서와 같이, 융합된) 펩티드의 순환 반감기를 증가시키는 폴리펩티드일 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 이의 일부분) 또는 면역글로불린의 일부분(예를 들어, IgG의 Fc 영역)일 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 미토콘드리아-관통성 모이어티일 수 있다.
본원에 기재된 펩티드의 요구되는 형태를 흉내내는 화합물이 본 발명의 영역내에 포함되는 것으로 고려된다. 그러한 모방체를 위한 다양한 디자인이 가능하다. 미국 특허 제5,192,746호; 미국 특허 제5,169,862호; 미국 특허 제5,539,085호; 미국 특허 제5,576,423호; 미국 특허 제5,051,448호; 및 미국 특허 제5,559,103호는 모두 참고문헌으로서 본원에 통합되며, 그러한 화합물을 만들기 위한 다수의 방법을 기재하고 있다.
펩티드 서열을 흉내내는 비펩티드성 화합물이 당업계에 공지되어 있다(쉬페르딘의 비펩티드성 소분자 모방체를 확인하는 방법을 소개하는 문헌[Meli et al. J. Med. Chem., 49:7721-7730 (2006)]). 펩티드 서열을 흉내낸 비-펩티드 화합물을 합성이 또한 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Eldred et al. J. Med. Chem., 37:3882, (1994); Ku et al. J. Med. Chem., 38:9, (1995); MeIi et al. J. Med. Chem., 49:7721-7730 (2006)). 샤페론에 결합하는 CBP 펩티드를 흉내내는 그러한 비펩티드 화합물은 본 발명에 의해 특별히 고려된다.
본 발명은 또한 합성 모방 화합물을 고려한다. 당업계에 공지된 것과 같이, 펩티드는 커플링제, 예컨대, 디시클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC)와의 반응으로 활성화되는 카르복실 기에 아미노 기를 연결시킴으로써 합성될 수 있다. 활성화된 카르복실 기에 대한 유리 아미노 기의 공격은 펩티드 결합의 형성과 디시클로헥실우레아의 방출을 야기시킨다. 반응하도록 의도된 아미노기와 카르복실기 이외의 잠재적 반응기를 보호할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, (활성화된 카르복실기를 함유한 구성요소의 α-아미노기는 터트부틸옥시카르보닐 기로 차단딜 수 있다. 이 보호기는 후속하여 해당 펩티드를 묽은 산에 노출시킴으로써 제거될 수 있는데, 펩티드 결합은 온전한 상태로 유지된다.
이 방법으로, 펩티드는 불용성 매트릭스, 예컨대, 폴리스티렌 비드에 연결된 성장하는 펩티드 쇄에 아미노산을 단계적으로 첨가함으로써 고체상 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 요망되는 펩티드 서열의 (아미노 보호기를 동반한) 카르복실-말단 아미노산은 제일 먼저 폴리스티렌 비드에 고정된다. 이후 아미노산의 보호기는 제거된다. (보호기를 지니는) 다음 아미노산은 커플링제와 함께 부가된다. 상기 부가 이후에 세척 사이클이 진행된다. 상기 사이클은 필요시 반복된다.
일 구체예에서, 본 발명의 모방체는 본원에 기재된 샤페론 억제자 펩티드에 대한 서열 상동성을 지니는 펩티드이다. 이러한 모방체는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, L-아미노산이 이들의 D-이성질체로 대체된 펩티드를 포함한다. 서열 상동성, 및 더 중요하게는 통계학적으로 유의미한 유사도를 평가하기 위한 일반적인 방법은 Z 값을 획득하기 위해 리프만과 피어슨에 의해 기술된 알고리즘을 사용하는 몬데 카를로 분석을 사용하는 것이다. 이 분석에 따라서, 6을 초과하는 Z 값은 추정되는 중요성(probable significance)을 나타내며, 10을 초과하는 Z 값은 통계학적으로 유의미한 것으로 고려된다(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85:2444-2448, (1988); Lipman and Pearson, Science, 227: 1435-1441, (1985). 더 일반적으로, 본원에 기재된 CBP 펩티드 및 상기한 모방체는 문헌[Merrifield et al, Biochemistry, 21:5020-5031, (1982); Houghten Wellings, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:5131-5135, (1985); Atherton, Methods in Enzymology, 289:44-66, (1997), 또는 Guy and Fields, Methods in Enzymology, ]289:67-83, (1997)]에 기재된 티-백 방법 또는 고체상 펩티드 합성 절차를 포함하는, 임의의 공지된 방법을 사용하거나, 상업적으로 입수가능한 자동화된 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
분자 샤페론의 소분자 억제자
본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 다수의 소분자 샤페론 억제자는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 기재딘 조성물과 방법에 유용한 소분자 샤페론 억제자는 이로만 국한되는 것은 아니지만, Hsp90 ATP 결합 포켓에 결합하는 분자를 포함한다. 당업계에 공지된 소분자 Hsp90 억제자는, 예를 들어, 문헌[Rodina et al., (Nature Chemical Biology, published online July 1, 2007)]에 기재되어 있다.
일부 구체예에서, 샤페론 억제자는 몇몇 케모타입들 중 어느 하나에서 선택된 Hsp90 억제자이다. 이러한 케모타입중 2개는 안사마이신과 매크로락톤 억제자이다. 이들은 매크로락톤 Hsp90 억제자 클래스의 일원인, 라디시콜과 시클로프로파라디시콜, 및 Hsp90 억제자의 안사마이신 클래스의 일원인 17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시-젤다나마이신(17DMAG) 및 17AAG에 의해 대표된다. 라디시콜과 젤다나마이신에 의한 Hsp90의 억제를 위한 구조적 기초는 공지되어 있고, 그에 따라 당업계의 통상의 기술자는 Hsp90 억제 활성을 보유할 상기 라디시콜 및 젤다나마이산의 유사체를 용이하게 생성시키고 시험할 수 있다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Roe et al, J. Med. Chem. 42(2):260-6 (1999). 퓨린 억제자는 본원에 기재된 조성물과 방법에서 유용한 화합물의 제 3 부류를 형성한다.
Hsp90의 안사마이신 억제자
본 발명에 유용한 분자 샤페론 억제자의 추가 일예는 이로만 국한되는 것은 아니지만 퀴닌 안사마이신 항생제, 예컨대, 맥베신(macbecins), 젤다나마이신, 젤다나마이신 유사체, 및 허비마이신 A를 포함한다.
젤다나마이신은 신호 전달, 세포 주기 조절 및 전사 조절에 관여하는 주요 단백질을 포함하는, 넓은 범위의 단백질("클라이언트 단백질")의 폴딩, 활성화 및 조립에 관여하는, 열 충격 단백질-90(Hsp90)의 억제자이다. Hsp90에 대한 젤다나마이신의 결합은 Hsp90-클라이언트 단백질 상호작용을 붕괴시키고, 이것은 상기 클라이언트 단백질이 올바르게 폴딩되는 것을 막는다. 젤다나마이신과 젤다나마이신 유사체는 본 발명의 일부이다.
본원에 사용된, "젤다나마이신 유사체"는 젤다나마이신과 공통되는 코어 구조를 공유하나 작은 화학적 변형을 지니는 화합물을 지칭한다.
젤다나마이신의 위치 17에서 변이가 존재하는 젤다나마이신 유사체가 당업계에 공지되어 있고 다수의 유사체는 상업적으로 입수가능하다. 상업적으로 입수가능한 젤다나마이신 유사체의 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 17-알릴아미노-데메톡시젤다마이신(17-AAG), 17-디메틸아미노젤다나마이신, 17-GMB-APA-GA(폴리펩티드에 대한 GA의 컨주게이션을 가능케하는 젤다나마이신의 말레이미도 유도체), 17-(디메틸아미노에틸아미노)-17-데메톡시젤다나마이신(17-DMAG), 17-[2-(피롤리딘-1-일)에틸]아미노-17-데메톡시젤다나마이신(17-AEP-GA), 및 17-(디메틸아미노프로필아미노)-17-데메톡시젤다나마이신(17-DMAP-GA)를 포함한다. 또한 하기 문헌을 참조하라: Sasaki et al., 미국 특허 제4,261,989호(1981); Schnur et al., 미국 특허 제5,932,566호(1999); Schnur et al., J. Med. Chem., 38:3806-3812, (1995); Schnur et al., J. Med. Chem., 38:3813-3820, (1995); 및 Santi et al., US 2003/0114450 Al (2003).
위치 11에 변이가 존재하는 젤다나마이신 유사체가 당업계에 공지되어 있다. 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 참고문헌으로 본원에 통합되는 하기 문헌에 개시된 것을 포함한다: Muroi et al., 미국 특허 제4,421,688호(1983); Schnur, 미국 특허 제5,387,584호(1995); Schnur et al., 미국 특허 제5,932,566호(1999); Welch et al., 미국 특허 제6,015,659호(2000); Whitesell et al., WO 94/08578 A2 (1994); Ho et al., WO 00/03737 A2 (2000); Snader et al., WO 02/36574 Al (2002); Snader et al., WO 02/079167 Al (2002); Santi et al., WO 03/013430 A2 (2003); Zhang et al., WO 03/066005 A2 (2003); Omura et al., JP 63-218620 (1988); Schnur et al., J. Med. Chem., 38:3806-3812, (1995); 및 Schnur et al., J. Med. Chem., 38:3813-3820, (1995). 당업계에 공지된 11-O-메틸젤다나마이신 화합물은 미국 특허 제6,855,705호, 미국 특허 제6,887,993호, 및 미국 특허 제6,870,049호에 기재되어 있다.
조성물의 일부 구체예에서, 분자 샤페론 억제자는 젤다나마이신 유사체를 포함한다:
Figure pct00014
여기서 R2는 H, 알킬, 아릴, 또는 아릴알킬이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H, 알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 또는 ORd(여기서 R은 H, 알킬, 또는 아릴알킬임)이다.
조성물의 일부 구체예에서, R2는 H 또는 알킬이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H, 또는 ORd(여기서 Rd는 H, 알킬임)이다.
조성물의 일부 구체예에서, R2는 H이고; R3는 메틸이고; R4는 H이다.
Hsp90의 레조르시놀-유래 억제자
레조르시놀에서 유래된 화합물은 Hsp90의 유력한 억제자이다. 이들은 4,5-디아릴이속사졸 스캐폴드에 기초한 화합물(예를 들어, 하기 문헌 참조: Brough et al., J. Med. Chem, 2007), 3,4-디아릴피라졸 스캐폴드에 기초한 화합물(예를 들어, 하기 문헌 참조: 미국 특허 제7,247,734호 및 Sharp et al., Cancer Res. 67 (5):2206-16 (2007)), 및 3,4-디아릴 피라졸 레조르시놀 HSP90 억제자(CCTO18159), 아미드 레조르시놀 화합물(예를 들어, 국제 공개 공보 WO/2006/117669에 기재된 화합물), 및 이속사졸 레조르시놀 화합물을 포함한다. 또한 하기 문헌을 참조하라: Sharp et al., Mol Cancer Ther. 6 (4): 1198-1211 (2007)(합성된, 강력한 레조르시닐릭 피라졸/이속사졸 아미드 유사체, 예를 들어, VER-49009 및 상응하는 이속사졸 VER-50589); Eccles et al., Cancer Res. 68 (8):2850-60 (2008)(NVP-AUY922, 신규한 레조르시닐릭 이속사졸 아미드 열 충격 단백질 90(HSP90) 억제자); Barril et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 16(9):2543-2548 (2006)(피라졸-기반 Hsp90 억제자 CCTO18159의 피라지닐, 몰포리노 및 피페리딜 유도체).
매크로락톤-Hsp90 억제자
매크로시클릭 라디시콜 및 모노시클린, 및 이의 유사체, 예컨대, 시클로프로파라디시콜은 Hsp90의 ATP-결합 부위에 결합하는 억제자이다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Turbyville et al., J. Nat. Prod., 69(2): 178-184 (2006), Soga et al., Curr. Cancer Drug Targets. 3(5):359-69 (2003), Shiotsu et al., Blood. 96(6):2284-91 (2000), 및 미국 특허 제7,115,651호. KF25706, 라디시콜의 신규한 옥심 유도체는 Hsp90 결합 신호전달 분자의 선택적 고갈(selective depletion)을 통해 생체내 항종양 활성을 지닌다(Soga et al., Cancer Res. 59(12):2931-8 (1999)).
라디시콜과 젤다나마이신의 구조 구성성분을 포함하는 키메라 억제자가 또한 공지되어 있다(예를 들어, 다음 문헌 참조: Hadden et al., Curr. Top. Med. Chem. 6(11):1173-82; Shen et al., J. Org. Chem. 71(20):7618-31 (2006).
Hsp90의 퓨린 억제자
퓨린-스캐폴드 부류의 Hsp90 억제자가 암의 시험관내 및 생체내 모델 둘 모두에서 Hsp90에 대하여 강력하고 선택적인 것으로 보고되었고, 이 활성의 구조적 근간이 확인되었다. 하기 문헌 참조: Wright et al., Chem. Biol. 11(6):775-85 (2004). 몇몇 8-아릴-설파닐 아데닌 화합물이 합성되었고 Hsp90 억제 활성을 갖는 것으로 드러났는데, 예를 들어, PU-H71과 PU-H64는, 이의 구조가 Hsp90으로 밝혀졌다. 하기 문헌 참조: Immormino et al., J. Med. Chem. 49(16):4953-60 (2006). 기타 퓨린 클래스 Hsp90 억제자가 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 3,4-디아릴 피라졸과 관련된 유사체(McDonald et al., Curr. Top. Med. Chem. 6(11): 1193-203 (2006)); 피라졸로피리미딘과 관련된 유사체(미국 특허 제7,148,228호), 피롤로피리미딘과 관련된 유사체(미국 특허 제7,138,402호), 및 2-아미노퓨린 유사체(미국 특허 제7,138,401호)를 포함한다.
Hsp60 억제자
몇몇 Hsp60 억제자가 당업계에 공지되어 있고, 에포락타엔(epolactaene)(Nagumo et al., Biochem. J. 387:835-840 (2005); Tan and Negishi, Org. Lett. 8(13):2783-2785 (2006); 및 Nagumo et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14:4425-4429 (2004)), 및 미조리빈(브레디닌) (Itoh et al., J. Biol. Chem. 274:35147-35151 (1999))이 포함된다.
HspA9(모르탈린) 억제자
MKT-077, 암세포에 대한 선택적 독성을 지니는 양이온성 로다시아닌(rhodacyanine) 염료 유사체는 HspA9/모르탈린에 결합하고, 종양 억제 단백질, p53과 이의 상호작용을 폐기시킨다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Wadhwa et al., Cancer Res. 2000; 60(24):6818-21.
기타 억제자
본 발명에 유용한 분자 샤페론 억제자는 또한 Hsp60과 시클로필린 D, Hsp90과 시클로필린 D, 또는 TRAP-1과 시클로필린 D 사이의 상호작용을 억제시키는 분자를 포함한다. 이러한 억제자는 당업계에 공지된 분자들로부터 확인되거나, 본원에 기재된 방법에 의해 화학적 라이브러리내에 존재하는 분자들로부터 확인될 수 있다; 예를 들어, 하기 문헌 참조: Meli et al., J. Med. Chem. 49:7721-7730 (2006), 및 Howes et al., Anal. Biochem., 350(2):202-213 (2006). 예를 들어, 비펩티드성 소분자 5-아미노이미다졸-4-카르복사미드-1-베타-D-리보푸라노시드(AICAR)는 Hsp90의 구조적으로 신규한 억제자로서 확인되었고(다음 문헌 참조: Meli et al., 2006, supra), 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 또한, 하기 문헌 참조: Blagg et al., Med. Res. Rev. 26(3):310-338 (2005).
III. 미토콘드리아-관통성 모이어티
미토콘드리아 관통 분자 샤페론 억제자가 본원에 개시된다. 본원에 기재된 임의의 분자 샤페론 억제자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 미토콘드리아-관통성 모이어티와의 결합에 의해 변형될 수 있는데, 단, 샤페론 억제자가 쉬페르딘 또는 이의 활성 단편인 경우, 당해 미토콘드리아-관통성 모이어티가 안테나페디아 또는 이의 단편이 아닌 것을 조건으로 한다. 예는 아래에 제시되어 있다.
본원에 사용된, 미토콘드리아-관통성 모이어티는 단독의 분자 샤페론 억제자와 비교할 때, 결합된, 예를 들어, 화학적으로 컨주게이션된, 분자 샤페론 엊게자의 미토콘드리아 국소화를 증가시키는, 화학기, 예를 들어, 펩티드, 펩티도미메틱, 또는 기타 화합물이다.
펩티드 미토콘드리아-관통성 모이어티
본원에 기재된 조성물에서, (본원에 기재된) 샤페론 억제자는 펩티드 미토콘드리아-관통성 모이어티에 부착될 수 있다. 예를 들어, 안테나페디아의 제 3 α-나선에서 발견된 서열에 상응하는, 안테나페디아 담체 서열(Gratton et al., Cancer Cell, 4:31, (2003))이 사용될 수 있다. 그러한 펩티드의 예시적인 서열은 RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 18)인데, 본원에서 ANT이다. 본원에 개시된 샤페론 억제자가 부착될 수 있는 표적화된 펩티드의 다른 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 예를 들어, HIV-1으로부터의 TAT 단백질(Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:4325, (1999); Kelemen et al., J. Biol. Chem., 277:8741-8748, (2002)), 예를 들어, RKKRRQRRR(서열번호 19)(Brooks et al., Adv. Drug Del. Rev., 57(4):559-577 (2005)), 또는 RKKRRORRRGC(서열번호 20) 서열을 지니는 변형된 TAT(Barnett et al., Inv. Ophth. Vis. Sci., 47:2589-2595 (2006))를 포함한다. 또 다른 일예는 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 VP22 단백질(Lundberg and Johansson, Biochem. Biophys. Res. Comm., 291:367-371, (2002)), 및 Pep-1 펩티드 담체(Morris et al., Nature Biotech., 19:1173-1176, (2001))를 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 펩티드는 D-이성질체 아미노산 또는 기타 변형, 예를 들어, 흡수를 증가시키거나 세포내 파괴를 감소시키기 위한 변형을 포함한다.
펩티드 미토콘드리아-관통성 모이어티를 포함하는 폴리펩티드는 표준 기술, 예컨대, 화학적 합성에 의해, 또는 해당 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산으로부터의 발현을 통해 생산될 수 있다.
미토콘드리아-관통성 모이어티로서 유용할 수 있는 다른 단편은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 미토콘드리아에 국소화되는 단백질에서 발견되는 미토콘드리아-표적화 서열을 포함한다. 미토콘드리아-표적화 서열의 비제한적 일예는 인간 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 VIII의 N-말단 영역, 인간 ATP 합성효소의 서브유닛 c의 P1 이소형의 N-말단 영역, 또는 참고문헌으로 본원에 통합된 미국 특허 출원 제20040072774호에 기재된 알데히드 데하이드로게나제 표적화 서열의 N-말단 영역을 포함한다. 예를 들어, 마이토퓨신의 단편(인간 마이토퓨신 1 서열은 유전자은행 수탁번호 NP_284941.2이고; 인간 마이토퓨신 2 서열은 유전자은행 수탁 번호 NP_055689.1임), 예를 들어, 인간 마이토퓨신 2의 아미노산 97-757(참고문헌으로 본원에 통합된 미국 특허 제6,953,680호 참조)가 본 발명에서 미토콘드리아-표적화 모이어티로서 유용하다.
펩티도미메틱 미토콘드리아-관통성 모이어티
펩티도미메틱 미토콘드리아 관통 모이어티는 또한 본원에 개시된 조성물과 방법에 사용될 수 있다. 펩티도미메틱, 및 이들을 제조하기 위한 방법에 관한 전반적인 설명은 위에서 확인가능하다.
예를 들어, 본원에 통합된, 문헌[Fernandez-Carneado et al. J. Am. Chem. Soc. 127(3):869-74, (2005)]에 기재된 것과 같은 가수분해불가능한(non-hydrolyzeable) 테트라구아니디늄 화합물이 본 발명의 조성물과 방법에 사용될 수 있다.
미토콘드리아 표적화 신호 펩티드
단백질을 미토콘드리아에 유도하는 신호 펩티드의 단편이 사용될 수 있다. 일예는 RRIVVLHGYGAVKEVLLNHK(서열번호 41), Rat 시토크롬 P450 2E1의 아미노산 74-95(CYP2E1)(Neve and Ingelman-Sundberg, J. Biol. Chem., 276(14): 11317-11322 (2001); 효모 시토크롬 c 옥시다제 IV 전구체로부터의 절단가능한 전구조각(prepiece)(MLSLRQDIRFFKP ATRTLCSSR(서열번호 42), Maarse et al., EMBO J. 3(12):2831-2837 (1984) 및 Hurt et al., FEBS 178(2) 306-310 (1984) 참조); 인플루엔자 바이러스의 PB2 단백질로부터의 미토콘드리아-표적화 신호(Carr et al., Virology, 344(2):492-508, (2006); 헴 리아제(heme lyases) 내부에 함유된 유입(import) 신호(Diekert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96(21): 11752-11757, (1999); 미토콘드리아 매트릭스 효소 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)의 선도 펩티드(Horwich et al., EMBO J. 4(5): 1129-1135, (1985). Hay et al., Biochim. Biophys. Acta. 779(1):65-87, (1984); Fujiwara et al., Genome Inform. Ser. Workshop, Genome Inform. 8:53-60, (1997)를 포함한다.
핵산 미토콘드리아-관통성 모이어티
미토콘드리아 관통 모이어티로 역할하는 핵산(예컨대, 참고문헌으로 본원에 통합된, 미국 특허 제 5,569,754호에 기재된 핵산, 예를 들어, CCGCCAAGAAGCG(서열번호 21); GCGTGCACACGCGCGTAGACTTCC CCCGCAAGTCACTCGTTAGCCCGCCAAGAAGCGACCCCTCCGGGGCGAGCTGAGCGGCGTGGCGCGGGGGCGTCAT(서열번호 22); ACGTGCATACGCACGTAGACATTCCCCGCTTCCCACTCCAAAGTCCGCCA AGAAGCGTATCCCGCTGAGCGGCGTGGCGCGGGGGCGTCATCCGTCAGCTC(서열번호 23); 또는 ACTTCCCCCGCAAGTCACTCGTTAGCCCGCCAAGAAGCGACCCCTCCGGGGCGAGCTG(서열번호 24)가 본원에 기재된 조성물과 방법에 사용될 수도 있다. 핵산을 펩티드에 연결하기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
친유성 양이온 미토콘드리아-관통성 모이어티
미토콘드리아 관통 모이어티로서 역할하는 친유성 양이온은 전체로 참고문헌으로 본원에 통합된 하기 문헌에 기재되어 있다: Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100(9):5407-12 (2003). 본 발명에 유용한 친유성 양이온은, 예를 들어, 로다민 123과 포스포늄 염, 예를 들어, 메틸트리페닐포스포늄과 테트라페닐포스포늄을 포함한다.
일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티는 하기한 것을 포함한다:
Figure pct00015
, 여기서 R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 RaRbRcSi이고; Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 수 있다.
일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티는 하기의 것을 포함하는데,
Figure pct00016
, 여기서 Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n은 1, 2, 또는 3일 수 있다. 일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티는 (아릴)3P-를 포함한다.
일부 구체예에서, 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티는 로다민 123을 포함한다:
Figure pct00017
IV. 연결 모이어티
일부 구체예에서, 미토콘드리아 관통 모이어티는 링커를 통해 본원에 기재된 분자 샤페론 억제자에 연결된다. 본원에 사용된, "연결"은 공유 또는 비공유 결합 또는 연결을 통해 미토콘드리아-관통성 모이어티와 샤페론 억제자를 연결시키는 것을 의미한다.
다수의 링커는 샤페론 억제자를 미토콘드리아-관통성 모이어티에 연결시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드 링커는 가요성(flexible)인데, 즉, 예를 들어, 글리신, 알라닌, 및/또는 글루타민 잔기를 포함하는, 가요성 형태를 수용하는 아미노산을 함유한다.
미토콘드리아-관통성 모이어티와 샤페론 억제자가 둘다 펩티드인 구체예에서, 일반적으로 전체 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산을 사용하여, 개재 링커을 지니거나 지니지 않는, 융합 단백질로서 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 생산하는 것이 요망될 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 링커 모이어티는 2가이고, 알킬렌, 알케닐렌, 아키닐렌, 시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 및 펩티드 링커로 구성된 그룹에서 선택될 수 있고, 여기서 상기 알킬렌, 알케닐렌, 또는 아키닐렌의 임의의 2개의 인접한 탄소-탄소 결합은 O, NH, S, PRe, C(O)NRf, 아릴렌, 헤테로시클로알킬렌, 또는 헤테로아릴렌 중의 하나 이상으로 대체되거나 비대체될 수 있다(여기서 Re 및 Rf는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택된다).
일부 구체예에서, 링커 모이어티는
Figure pct00018
이다.
일부 구체예에서, 링커 모이어티는 알킬렌이다.
일부 구체예에서, 링커 모이어티는 6개의 탄소 원자를 지니는 알킬렌이다. 한 유형의 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자는 샤페론 억제자를 미토콘드리아-관통성 모이어티에 가교시킴으로써 생산된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르)에 의해 분리된 2개의 독특하게 반응하는 기를 지니는, 이종이기능성(heterobifunctional)이거나 동종이기능성(예를 들어, 디숙신이미딜 수버레이트)인 가교제를 포함한다. 그러한 링커는 피어스 케미컬 컴퍼니[Pierce Chemical Company, Rockford, 111.]로부터 입수가능하다.
본원에 기재된 조성물을 제조하기 위한 유용한 일반적인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구체예에서, 해당 방법은 미토콘드리아-관통성 모이어티, 예를 들어, 본원에 기재된 ANT와 링커, 예를 들어, 디설피드 링커, 예컨대, SSP를 접촉시켜 반응 혼합물을 형성시키고, 상기 반응 혼합물과 샤페론 억제자, 예를 들어, 젤다나마이신 유사체와 접촉시키고, 상기 샤페론 억제자에 컨주게이션된 미토콘드리아-관통성 모이어티를 포함하는 조성물을 획득하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 해당 방법은 반응 혼합물내의 링커 대 미토콘드리아-관통성 모이어티의 비가 약 1:1이 되도록 미토콘드리아-관통성 모이어티를 소정량의 링커와 접촉시키는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 샤페론 억제자, 예를 들어, 젤다나마이신 유사체, 예컨대, 17-AAG에 컨주게이션된, 미토콘드리아-관통성 모이어티, 예를 들어, 본원에 기재된 ANT를 제조하는 방법을 특징으로 한다.
미토콘드리아-관통성 모이어티와 샤페론 억제자는 당업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 이들이 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 합성 링커에 의해 결합될 수 있다; 예를 들어, 하기 문헌 참조: Bird et al, Science, 242:423-426 (1988); 및 Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)).
예를 들어, 본 발명의 샤페론 억제자는 (화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유적 연결 또는 기타 방법에 의해) 하나 이상의 미토콘드리아-관통성 모이어티에 기능적으로 연결될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00019
,
상기 식에서, R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 RaRbRcSi이고; R2는 H, 알킬, 아릴, 또는 아릴알킬이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H, 알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 또는 ORd(여기서, Rd는 H, 알킬, 또는 아릴알킬임)이고; Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n은 1 내지 10 사이의 정수이다.
일부 구체예에서, 염은 헥사플루오로포스페이트 염이다.
일부 구체예에서, R1은 RaRbRcSi이고, Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; R2는 H이고; R3는 H, 알킬이고; R4는 H이고; n은 1, 2, 3, 또는 4이다.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기한 것들 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염들 중에서 선택될 수 있다:
Figure pct00020
.
일부 구체예에서, 상기 화합물는 하기 화학식의 화합물일 수 있다:
Figure pct00021
, 여기서 q는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; X는 약제학으로 허용되는 카운터 이온이다.
일부 구체예에서, q는 3이다.
일부 구체예에서, 아릴은 페닐이다.
일부 구체예에서, 아릴은 페닐이고 q는 3이다.
일부 구체예에서, X는 헥사플루오로포스페이트일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 화합물은 하기 화합물일 수 있다:
Figure pct00022
합성 방법
본원에 기재된 화합물은 젤다나마이신 또는 17-GMB-APA-GA 유사체의 컨주게이션에 의해 제조될 수 있다. 이러한 화합물들 중 임의 화합물의 사용은 친핵성 모이어티, 예컨대, 티올, 아민, 또는 알코올과의 컨주게이션을 가능케한다. 양이온성 미토콘드리아-관통성 모이어티의 합성(elaboration)은 하기 단량체 구조를 포함하는 1 내지 10개의 구아니디니오 모이어티를 포함하도록 수행될 수 있다:
Figure pct00023
, 상기 구조는
Figure pct00024
로 축약될 수 있다. 올리고머 구아니디니오 구조를 포함하는 그러한 조성물의 합성에 관한 반복적인 일반적 방법은 하기에 제시되어 있다. 메실레이트 G1은 포타슘 아세테이트(KSAc)로 처리되어, 염기 처리에 후속하여 분자 샤페론 억제자, 예컨대, 젤다나마이신(GA)의 말레이미드 유도체(L-GA)에 대한 노출시, 원하는 첫번째 생성 조성물 G1-GA를 제공할 수 있는 티오 에스테르를 제공할 수 있다. Gl-티오에스테르 화합물은 차례로 순서대로 처리될 수 있는데, 예컨대, 메탄설폰산이 처리되고; 트리부틸포스핀 존재하 세슘 카르보네이트가 처리되고; 후속하여 G1과 반응시키고 마지막으로 G1의 고차 상동체인 G2를 제공하는 메탄설포닉 안하이드라이드가 처리된다. 명확하게 확인가능한 이러한 반복적인 과정은 올리고머성 구아니디니오 단위체에 대한 접근을 제공한다. 몇몇 화합물은 하기 과정을 설명하기 위한 아래의 실시예에 적합하다. 여기에 제시한 도식이 컨주게이션을 용이하게 하기 위한 말레이미드 기를 지니는 링커에 관해 기재하고 있으나, 이 방법은 컨주게이션을 위한 다른 작용기, 예컨대, N-히드록시 석신이미드 에스테르(예컨대, 17-NHS-ALA-GA)를 지니는 링커로 확장될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 또한 이 반복적 도식이 다른 비-GA 기반 Hsp90 억제자, 예컨대, 퓨린 기반 길항제 또는 레조르시놀 길항제로 확장될 수 있음을 인지할 것이다.
Figure pct00025
V. 처리 방법
본원에 기재된 화합물, 즉, 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자는, 비조절된 세포 증식 발생시, 예를 들어, 종양 형성시 및 암에서, 비조절된 세포 증식과 연관된 질병의 치료에 유용하다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 종양은 본원에 기재된 암과 연관될 수 있다.
일반적으로, 이 방법은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 치료 화합물을, 그러한 치료가 필요한 피검체, 또는 그러한 치료가 필요한 것으로 결정된 피검체에게 투여하는 것을 포함한다.
이 문맥에 사용된, "치료하다"는 비조절된 세포 증식과 연관된 질환의 하나 이상의 증상을 개선시키는 것을 의미한다. 이상적으로, 치료는 증식하는 세포의 사멸, 또는 상기 세포(즉, 암 또는 종양 세포)의 증식율의 감소를 야기시킬 수 있따.
"유효량"은 유익하거나 요망되는 결과를 달성하는데 충분한 양이다. 예를 들어, 치료량은 요망되는 치료 효과를 달성시키는 양이다. 이 양은 예방학적 유효량과 동일하거나 상이할 수 있는데, 상기 예방학적 유효량은 질병 또는 질병 증상의 개시를 막는데 필요한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여(administrations), 적용 또는 투여량(dosages)으로 투여될 수 있다. 치료학적 유효량의 조성물은 선택된 조성물에 좌우된다.
조성물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 비경구, 경구, 점막, 또는 기타 투여 경로를 사용하여, 전신적으로, 국소적으로, 또는 상기 둘 모두로 투여될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자가 이해할 것이지만, 투여 경로는 특정 병태의 치료에 관한 적합성, 및 조성물의 조성에 기초하여 선택되어야 한다.
조성물은 일(日) 당 1회 이상 내지 주당 1회 이상 투여될 수 있는데; 매 1일마다 1회 투여가 포함된다. 당업계의 통상의 기술자는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 질병 또는 장애이 극심도, 이전의 치료, 전반적인 건강 및/또는 피검체의 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하는, 특정 인자가 피검체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 적시(timing)에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 치료학적 유효량의 본원에 기재된 조성물로의 피검체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 종양과 암의 치료에 유용하다. 본원에 기재된 화합물은 암, 예를 들어, 본원에 기재된 암의 유형중 임의 유형의 암을 진단받은 환자에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자는, 폐, 유방, 상피, 대장, 직장, 고환, 담당, 담관(bile duct), 담도(biliary tract), 전립선, 결장, 위, 식도, 췌장, 간, 자궁, 난소, 또는 뇌의 하나 이상의 암 또는 종양으로 고통받고 있는 피검체를 치료하기 위해 사용될 수 있으나, 이로만 국한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 화합물은 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), B 림프모구양 백혈병(lymphoblastoid leukemia), 유방 선암, 폐 선암, 전립선 선암, 교아종, 결장 선암, 및 자궁경부암(cervical carcinoma)의 치료에 유용하다. 다른 일예로, 본원에 개시된 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자는 혈관종, 호치킨병, 기세포 비호치킨 림르종, 악성 림프종, 백혈병, 적혈구증가증(polycythemia vera), 신경모세포종(Neuroblastoma), 망막아종(retinoblastoma), 불응성 빈혈(refractory anemia)을 동반한 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 신경모세포종(neuroblastoma), 신경아교종(glioma), 갈색세포종(pheochromocytoma), 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 상악암(maxillary cancer), 설암, 구순암, 구강암, 흑색종, 또는 비흑색종 피부암으로 고통받고 있는 피검체를 치료하는데 사용될 수 있으나, 이로만 국한되는 것은 아니다. 일반적으로, 본원에 기재된 화합물 및 후보 화합물로 치료될 수 있는 암은 암(carcinomas), 육종(sarcomas), 림프종, 백혈병, 또는 생식세포종양(germ cell tumors)를 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 본원에 기재된 화합물은 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 폐암, 상피암, 결장직장암, 버킷림프종, 골수성 백혈병, 및 백혈병성 단핵구 림프종으로 진단받은 환자에게 투여될 수 있다.
투여 및 용량
이러한 화합물의 독성 및 이료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량)과 ED50(집단의 50%에 치료학적으로 유효한 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이고 이것은 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있으나, 비감염된 세포에 대한 잠재적인 피해를 최소화하고, 그로 인해 부작용을 감소시키기 위해, 영향받은 조직의 부위, 예를 들어, 뼈와 연골 부위에 그러한 화합물을 표적화시키는 전달 시스템을 설계하기 위해 치료(care)가 필요하다.
세포 배양 분석 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간에서 사용을 위한 소정 범위의 투여량을 제형화시키는데 사용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 발마직하게는 독성을 거의 지니지 않거나 전혀 독성이 없는 ED50을 포함하는 소정 범위의 순환 농도내에 존재한다. 투여량은 채택된 투여량 형태 및 활용되는 투여 경로에 의존하여 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 임의 화합물의 경우, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 평가될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 측정된 것과 같이 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 절반을 달성시키는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위가 달성되도록 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장내 수준은, 예를 들어, 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해, 측정될 수 있다.
당업계의 통상의 기술자는, 치료될 환자의 유형, 질병 또는 장애의 극심도, 이전의 치료, 환자의 전반적인 건강 및/또는 연량, 및 존재하는 다른 질병을 포함하나, 이로만 국한되지 아니하는, 특정 인자가 환자를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량과 타이밍에 영향을 미친다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 치료학적 유효량의 단백질, 폴리펩티드, 항체, 또는 기타 화합물로의 환자의 치료는 단일 치료를 포함거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
화합물이 소분자인 경우, 예시적인 용량은 환자의 킬로그램 또는 샘플 중량당 밀리그램 또는 마이크로그램 분량의 소분자(예를 들어, 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 500 밀리그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 5 밀리그램, 또는 킬로그램당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50 마이크로그램)을 포함한다. 더욱이 소분자의 적절한 용량은 조절되는 발현 또는 활성과 관련하여 소분자의 효능에 좌우된다는 것이 이해된다. 하나 이상의 이러한 소분자가 동물(예를 들어, 인간)에 투여되어 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 또는 활성을 조절시키는 경우, 임상의, 수의사, 또는 연구자는, 예를 들어, 제일 먼저 비교적 저 용량을 처방하고, 적절한 반응이 획득될 때까지 용량을 순차적으로 증가시킬 수 있다. 또한, 임의 특정 동물 피검체에 관한 특정 용량 수준은 채택된 특정 화합물의 활성, 피검체의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별, 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출속도, 임의 약물 조합, 및 조절도는 발현 똔느 활성의 정도를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것임이 이해된다.
치료를 위한 피검체 확인
일부 구체예에서, 당해 방법은 암을 앓고 있는 개체를 확인 및 선별하는 단계, 및 임의로 (ii) 상기 개체의 암 세포가 미토콘드리아내에서 높은 수준의 Hsp90 샤페론을 발현하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 세포가 미토콘드리아내에서 높은 수준의 Hsp90 샤페론을 발현하면, 개체는 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자로의 치료를 위한 후보자가 되는데, 즉, 선별될 수 있고, 당해 방법은 (iii) 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 포함하는 약제 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
암을 지니는 개체는, 예를 들어, 이들이 증상 또는 스크리닝 결과로서 증상을 나타내기 때문에, 당업계의 공지된 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 추가의 임상 시험이 수행될 수 있고, 진단을 확증하기 위해, 혈액 검사, X-선, CT 스캔, 내시경, 및 생검 조직의 조직학 검사를 포함하나, 이로만 국한되는 것은 아니다.
개체내 암의 증상은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 특이한 혹 또는 부종, 출혈, 동통 및/또는 궤양, 비대해진 림프절, 기침 및 객혈, 간종대(비대해진 간), 골 통증, 영향받은 골의 골절 및 신경학적 증상, 체중 감소, 식욕 부진 및 악액질(근육 감소(muscle wasting)), 다한증(excessive sweating), 및 빈혈을 포함한다.
암을 지니는 개체를 확인하기 위한 스크리닝은 당업계에 공지되어 있다. 스크리닝 방법은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 자가-검사, 유방조영상(mammograms), 태아 잠혈 검사(fetal occult blood testing,), 자궁경부 조직검사(cervical cytology)(예를 들어, 팝 검사(Pap smear)), 디지털 직장 검사, 전립선 특이 항원(prostate specific antigen, PSA) 혈액 검사, 결장경(sigmoidoscopy)(직장 및 결장의 하부에서 가시적 비정상 관찰), 및 결장경(colonoscopy)(직장 및 전체 결장의 시각화 가능케함), 및 이중 콘트라스트 바륨 관장(double contrast barium enema, DCBE)(직장 및 결장의 방사선 검사를 가능케함)을 포함한다.
예를 들어, Hsp90에 대한 항체를 사용하는, 면역검정을 포함하는, 미토콘드리아내의 높은 수중의 샤페론을 검출하기 위한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미토콘드리아내의 샤페론의 검출은 미토콘드리아와 하부미토콘드리아(submitochondria) 분획을 획득하고, 후속하여 공지딘 검출 방법, 예컨대, 웨스턴 블랏팅, Hsp90에 대한 항체를 수반하는 면역전자 현미경, 및 미토콘드리아 분획의 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) 프로테오믹스(예를 들어, 질량 분광광도 및 비행시간 분석)에 의해 달성될 수 있다.
샤페론 억제자로의 치료를 위한 후보자인 개체를 확인하기 위한 추가 방법은 본원에 개시되어 있다. 이러한 방법에서, 개체로부터의 암 세포는 (i) 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자에 노출되고 (ii) 하나 이상의 하기 활성의 존재에 대해 분석된다: 세포 사멸 증가, 세포 생존도 소실, 미토콘드리아 막 전위 소실, 미토콘드리아 막 통합성(integrity) 소실(예를 들어, Smad 또는 시토크롬 c 방출), 및 Hsp90 샤페론 활성의 소실(예를 ㄷ르어, Akt 키나아제의 분해). 이와 같은 분석을 수행하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고 유세포분석, MTT 분석, 겔 전기영동, 및 웨스턴 블랏팅을 포함한다. 예시적인 방법은 또한 본원의 실시예에 기재되어 있다.
암 세포가 하나 이상의 이러한 활성을 나타내는 경우, 개체는 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자로 치료를 위한 후보자로서 분류된다. 다른 신규한 방법에서, 동일 개체로부터의 암 세포는 배양 배지내에 놓여 진다. 암 세포 중 일부는 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자와 접촉되고, 상기 세포가 증식되도록 하는 조건하에서 배양된다. 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자는, 예를 들어, 억제자와 비접촉된 세포에 비해, 접촉된 세포의 증식을 억제시키고/거나 아폽토시스를 유도하면, 개체는 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자로의 치료를 위한 후보자가 된다.
VI. 약제 조성물
본원에 기재된 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자(본원에서 "활성 화합물"로 지칭될 수 있는 모든 억제자)는 약제 조성물에 포함될 수 있다. 그러한 조성물은 전형적으로 활성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 양립가능한, 용매, 현탁 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함할 수 있다. 또한 보충 활성 화합물이 조성물내에 포함될 수 있다. 또한 약제 조성물 그 자체, 및 본원에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이 포함된다. 약리학적으로 활성있는 아민 화합물의 비독성 부가 염이 이들의 유리 염기와 활성에 있어서 상이하지 않다는 것은 잘 알려져 있다.
약제학적으로 허용되는 염은 산부가염과 염기 부가염 둘 모두를 포함한다. "약제학적으로 허용되는 염"은 유리 염기의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하며 생물학적으로 또는 달리 바람직한 그러한 염을 의미한다. 적합한 약제학적으로 허용되는 산 부가염은 무기 산, 예컨대, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기 산, 예컨대, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 푸라므산, 타르타르산, 시크르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산 등으로 형성될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염기 부가염은 무기 염기, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등에서 유래되는 그러한 염을 포함한다. 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염이 특히 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 유기 무독성 염기에서 유래된 염은 일차, 이차, 및 삼차 아민, 치환된 아민(자연적으로 생성되는 치환된 아미을 포함), 고리 아민 및 염기성 이온 교화 레진, 예컨대, 이소프로필아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 디시클로섹실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 쎄오브로민(theobromine), 퓨린, 피레라진, 피페리딘, 폴리아민 레진 등의 염을 포함한다. 특히 바람직한 유기 무독성 염기능 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올-아민 및 디시클로헥실아민이다.
약제 조성물은 일반적으로 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 일예는, 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대, 주사용수, 염수 용액, 고정유(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코브산 또는 소디움 비설피트; 킬레이트제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장력(tonicity) 조정을 위한 제제, 예컨대, 소디움 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대, 염화수소산 또는 소디움 히드록사이드로 조정될 수 있다. 비경구 제조물은 앰플, 1회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이얼에 장입될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제 조성물은 멸균된 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균된 수성 용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균된 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충액 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 쉬운 주사도(syringability)가 존재하는 정도로 유동화되어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정하여야 하며 세균과 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콩 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어, 코딩, 예컨대, 레시틴의 사용으로, 분산의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 활동의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 조성물 중에, 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 소디움 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물 중에, 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴 를 포함함으로써 달성될 수 있다.
멸균된 주사가능 용액은 활성 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 위에 그 수가 나열된 성분들의 하나 이상의 조합을 지니는 적절한 용매에 포함시키고, 후속하여 여과 정제로 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질과 위에 그 수가 나열된 성분들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하느는 멸균된 비히클에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균된 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조인데, 상기 건조는 사전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분의 분말과 함께 요망되는 임의의 추가 성분을 양산시킨다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료 투여 목적의 경우, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고 정제, 트로키, 또는 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척액으로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 적합한 결합제, 및/또는 애주번트 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분들 중 임의 성분, 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 미세결정성 셀룰로오스, 검 트라가캔쓰 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토오스, 붕해제(disintegrating agent), 예컨대, 알긴산, PRIMOGEL, 또는 옥수수 전분; 윤할제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트 또는 STEROTES; 활택제(glidant), 예컨대, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드; 감미제(sweetening agent), 예컨대, 수크로스 또는 사카린; 또는 착향제flavoring agent), 예컨대, 페파민트, 메틸 사리실레이트, 또는 오렌지 향.
흡입 투여의 경우, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어, 기체, 예컨대, 이산화탄소를 함유한 가압 용기 또는 분배기, 또는 네뷸라이져로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 스며들어야 할 장벽에 적합한 침투제(penetrants)가 제형에 사용된다. 그러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여의 경우, 세제(detergents), 담즙 염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 연고, 살브(salves), 젤, 또는 크림으로 제형화된다. 출원인은 이론에 의해 한정되는 것을 원치 아니하며, 본원에 기재된 전신적으로 투여되는 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자의 임의의 비특이적 세포독성 효과는 적어도 다음과 같은 이유로 최소화될 것으로 기대된다: 미토콘드리아 Hsp90과 TRAP1의 수준은 대부분의 정상 조직에서 낮음; 본원에서 설명한 것과 같이, Hsp90과 TRAP-1의 미토콘드리아 국소화는 일반적으로 종양 세포-특이적이고, 그래서 억제나는 종양 세포의 미토콘드리아내에 우선적으로 축적될 것임; 미토콘드리아-국소화된 Hsp90 및 TRAP-1을 지니는 그러한 정상 조직에서, Hsp90과 TRAP-1의 활성은 종양 세포에서 활성과 비교하여 감소됨; 혈액-뇌 장벽은 뇌를 보호할 것으로 기대됨.
화합물은 또한 좌제(예를 들어, 코코아 버터와 기타 글리세리드와 같은 관용적인 좌제 기재를 지님) 또는 직장 전달을 위한 체류 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 활성 화합물은, 임플란트와 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 조절 방출 제형과 같이, 신체로부터 급속 제거로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 그러한 제형의 제조 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation)과 노바 파마슈티칼스, 인크(Nova Pharmaceuticals, Inc)로부터 구매하여 입수가능하다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체와 함께 감염된 세포에 표적화되는 리포좀을 포함함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어, 미국 특허 제 4,522,811호에 기재된 바업에 따라 제조될 수 있다.
투여의 간편함과 투여량의 균성성을 위한 투여량 유닛으로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화시키는 것이 유리하다. 본원에 사용된 것과 같은 투여량 유닛 형태는 치료될 피검체를 위한 단일(unitary) 투여량으로서 적합화된 물리적으로 분리된 유닛을 의미한다; 각각의 유닛은 필요한 약제학적 담체와 연계하여 요망되는 치료 효과를 생산하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
본원에 기재된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자는 벡터내로 삽입될 수 있꼬 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 벡터는, 예를 들어, 정맥내 주사, 국소 투여(예를 들어, 미국 특허 제5,328,470호 참조) 또는 주촉성(stereotactic) 주사(예를 들어, 문헌[Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3054-3057, (1994)] 참조)에 의해 피검체에 전달될 수 있다. 유전자 치료 벡터의 약제학적 제조물은 적합한 희석제 중에 해당 유전자 치료 벡터를 포함하거나, 해당 유전자 전달 비히클이 매립된(imbedded) 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터로부터 온전하게 생산될 수 있는 경우, 약제학적 제조물은 해당 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
지질화와 같은 변형이 단백질을 안정화시키고 흡수 및 조직 투과를 향상시키는데 사용될 수 있다. 지질화 방법은 문헌[Cruikshank et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, 14: 193, (1997)]에 기재되어 있다.
약제 조성물은 투여를 위한 사용지침서와 함께 용기, 팩, 또는 분배기내에 포함될 수 있다.
VII. 핵산
본원에 기재된 펩티드-기반 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 엔코딩하는 핵산이 또한 본원의 개시사항내에서 포함된다.
본 발명의 일부인 핵산은 미토콘드리아 Hsp90 샤페론, 예를 들어, Hsp90과 TRAP-1에 결합하고 이를 억제시키는 본원에 개시된 방법에 의해 확인된 펩티드들 중 임의의 펩티드를 엔코딩할 수 있다. 본원에 개시된 핵산은 또한 미토콘드리아 Hsp90 샤페론에 결합하고 이를 억제시키는 변형된 버전의 펩티드, 예를 들어, 레트로 펩티드, 이종성 폴리펩티드 서열에 연결된 펩티드, 미토콘드리아-관통 서열에 연결된 펩티드, 세포 내재화 서열에 연결된 펩티드, 및 미토콘드리아-관통 서열에 연결된 레트로 펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산은 유전자 치료에 사용하기 위한 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 엔코딩한다.
본원에 개시된 핵산은 세포로부터 분리된 재조합 DNA 및 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA를 포함하는, RNA와 DNA 둘 모두를 포함한다. 핵산은 이중가닥이거나 단일가닥일 수 있다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 유도체(예를 들어, 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 사용하여 합성될 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 증가된 내성을 지니는 핵산을 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 발현시킬 수 있는 전사 및/또는 번역 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 포함하는 유전자 컨스트럭트(예를 들어, 벡터 및 플라스미드), 예를 들어, 발현 벡터를 포함한다. 선택된 핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 펩티드를 엔코딩하는 DNA 분자는 또 다른 핵산 분자, 예를 들어, 프로모터에 "작동가능하게 연결"되는데, 이때 상기 DNA 분자는 다른 분자에 인접하여 위치하거나 상기 다른 분자가 선택된 핵산의 전사 및/또는 번역을 유도할 수 있도록 동일 또는 다른 위치에 위치한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 핵산을 함유하고 이를 선택적으로 발현시키는, 다양한 조작된 세포, 예를 들어, 형질변형된 숙주 세포를 포함한다. 원핵생물 및 진핵생물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포(예를 들어, 종양 세포), 효모, 진균, 및 세균(예컨대, 대장균(Escherichia coli)), 및 일차 세포 및 형질변형된 세포가 숙주 세포가 될 수 있다. 다수의 적합한 세포가 당업계에 공지되어 있다.
VIII. 스크리닝 방법
본원은 본원에 기재된 치료 방법에 유용한 후보 화합물, 예를 들어, 작은 유기 또는 무기 분자(예를 들어, 1,000 Da 미만의 분자량을 지니는 분자), 올리고펩티드, 올리고뉴클레오티드, 탄수화물, 및 항체를 확인하는 방법을 기술한다. 몇몇 방법에서, 후보 화합물은 샤페론, 예를 들어, Hsp90 또는 TRAP-1에 결합하는 이의 활성에 대해 스크리닝된다. 몇몇 방법에서, 후보 화합물은 시클로필린 D에 결합하는 이의 활성에 대해 스크리닝된다. 몇몇 방법에서, 후보 화합물은 Hsp90, 예를 들어, Hsp90의 아포-개방형(apo-open form)에 결합할 것으로 기대되는 후보 화합물을 확인하기 위해, 예를 들어, 실시예 12에 기재된 것과 같은) 컴퓨터분석(computational) 방법에 의해 컴퓨터가상실험으로(in silico) 스크리닝된다. 화학 구조의 라이브러리는 당업계에 공지되어 있다.
이러한 후보 화합물은 본원에 기재된 미토콘드리아-관통성 모이어티에 (공유 또는 비공유 상호작용을 통해) 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 몇몇 방법에서, 후보 화합물은 시클로필린 D와 샤페론, 예를 들어, Hsp90 또는 TRAP-1 사이의 상호작용을 억제시키는 이의 활성에 대해 스크리닝된다. 몇몇 방법에서, 후보 화합물은 미토콘드리아에 국소화되는 이의 활성에 대해 스크리닝된다. 몇몇 방법에서, 후보 화합물은 세포 사멸을 유도하는 이의 활성에 대해 스크리닝된다.
시험 화합물의 라이브러리
특정 구체예에서, 암 세포 치료에 사용될 수 있는 후보 화합물에 대한 스크리닝은 시험 화합물의 라이브러리를 사용한다. 본원에 사용된, "시험 화합물"은 임의의 화합물, 예를 들어, 거대분자(예를 들어, 폴리펩티드, 단백질 복합체, 당단백질, 또는 핵산) 또는 소분자(예를 들어, 아미노산, 뉴클레오티드, 유기 또는 무기 화합물)일 수 있다. 시험 화합물은 몰당 약 10,000 그램 미만, 몰당 5,000 그램 미만, 몰당 1,000 그램 미만, 몰당 약 500 그램 미만의 화학식량을 지닐 수 있따. 시험 화합물은 자연적으로 생성되거나(에를 들어, 허브 또는 천연 생성물), 합성되거나, 천연 및 합성 성분 둘 모두를 포함할 수 있다. 시험 화합물의 일예는펩티드, 펩티도미메틱(예를 들어, 펩토이드(peptoids)), 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 및 유기 또는 무기 화합물, 예를 들어, 이종성유기(heteroorganic) 또는 유기금속성(organometallic) 화합물을 포함한다.
시험 화합물은 개별적으로 또는 병렬적으로 스크리닝될 수 있다. 병렬 스크리닝의 일예는 화합물의 거대 라이브러리의 고 처리 약물 스크리닝이다. 그러한 후보 화합물의 라이브러리는, 예를 들어, 캠브리지 코포레이션(Chembridge Corp., San Diego, CA)으로부터 생성 또는 구입될 수 있다. 라이브러리는 다양한 범위의 화합물을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 500, 1000, 10,000, 50,000, 또는 100,000개 이상의 특유 화합물을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 라이브러리는 항-암 활성을 갖기 위한 향상된 효능(potential)을 지니는 화합물의 부류를 포함한다. 향상된 효능을 지니는 화합물 부류는 공지의 샤페론 억제자 및 구조적으로 유사한 화합물을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 안사마이신 항생제, 젤다나마이신 유사체, 및 피라졸로피리미딘 및 관련 유사체를 포함할 수 있다. 라이브러리는 그러한 화합물 부류를 포함하도록 설계 및 합성될 수 있다.
조합 라이브러리의 합성이 검토되었다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Gordon et al, J. Med. Chem., 37: 1385, (1994); DeWitt and Czarnik, Ace. Chem. Res., 29: 114, (1996); Armstrong et al., Ace. Chem. Res., 29: 123-131, (1996); Ellman, J. A., Ace. Chem. Res., 29: 132, (1996); Gordon et al., Ace. Chem. Res., 29: 144, (1996); Lowe, G. Chem. Soc. Rev., 309, (1995), Blondelle et al., Trends Anal. Chem., 14:83, (1995); Chen et al., J. Am. Chem. Soc, 116:2661, (1994); 미국 특허 제5,359,115호, 제5,362,899호, 및 제5,288,514호; 및 PCT 공개공보 제WO92/10092호, 제WO93/09668호, 제WO91/07087호, 제WO93/20242호, 및 WO94/08051호).
화합물의 라이브러리는 다양한 방법에 따라 제조될 수 있는데, 이들 중 일부는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 분할-풀(split-pool) 전략이 하기 방법으로 실행될 수 있다: 기능화된 폴리머 지지체의 비드가 다수의 반응 용기내에 놓여 진다; 고체-상 펩티드 합성에 적합한 다양한 폴리머 지지체가 공지되어 있고, 일부는 시중에서 구매가능하다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, 2nd edition, Springer-Verlag, Berlin (1993)). 비드의 각 앨리쿼트에 활성화된 상이한 아미노산 용액이 첨가되고, 반응은, 각 반응 용기에서 하나씩, 다수의 고정된 아미노산을 양산하도록 진행된다. 유도체화된 비드의 앨리쿼트는 이후 세척되고, 풀링되고(즉, 재취합되고), 비드의 풀은 다시 나뉘어 지는데, 각각의 앨리쿼트는 별개의 반응 용기내에 담겨진다. 또 다른 활성화된 아미노산이 이후 비드의 각 앨리쿼트에 첨가된다. 합성 주기는 원하는 펩티드 길이가 얻어질 때까지 반복된다. 각 합성 주기에서 첨가된 아미노산 잔기는 무작위로 선택될 수 있고; 달리, 아미노산은, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 항-이디오타입 항체 항원 결합 부위와 상호작용할 수 있는 공지의 펩티드와 알려진 구조적 유사성 또는 상동성을 지니는 억제자를 제공하기 위해, 편향(biased) 라이브러리, 예를 들어, 억제자의 특정 부위가 작위적으로(non-randomly) 선택된 라이브러리를 제공하기 위해 선택될 수 있다. 매우 다양한 펩티드성, 펩티도미메틱, 또는 비펩티드성 화합물이 이러한 방식으로 용이하게 생성될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
분할-풀 전략은 결과적으로 펩티드 라이브러리, 예를 들어, 모듈레이터를 야기시킬 것이고, 이것은 본원에 기재된 스크리닝에 사용하기 위한 시험 화합물의 라이브러리를 제조하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예시적 합성에서, 디버소머(diversomer) 라이브러리가 문헌[DeWitt et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6909, (1993)]의 방법으로 생성된다. "티-백(tea-bag)" 기술을 포함하는, 문헌[Houghten et al., Nature, 354:84, (1991)]에 기재된 다른 합성 방법이 또한 본 발명에 따른 화합물의 라이브러리를 합성하는데 사용될 수 있다.
화합물의 라이브러리는 라이브러리의 임의 일원이 샤페론, 예를 들어, Hsp90 또는 TRAP-1, 억제 활성을 지니는지 여부를 결정하기 위해, 또한 만일 그러한 억제 활성을 지닌다면, 해당 억제자를 확인하는데 사용될 수 있다. 조합 라이브러이를 스크리닝하는 방법은 개시된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Gordon et al., J. Med. Chem., supra]을 참조하라. 가용성 화합물 라이브러리는 샤페론, 예를 들어, Hsp90 또는 TRAP-1의 억제자를 분리시키기 위해 스크리닝될 수 있으며, 후속하여 관용 기술(예를 들어, 질량 분광광도분석, NMR 등)에 의한 분리된 리간드의 확인이 실행된다.
스크리닝(Screens)
본원은 종양 또는 암의 치료를 위한 후보 화합물을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 본 출원인은 관여된 생물학적 메카니즘에 관한 임의의 특정 이론에 의해 제한되는 것을 원하지 아니하며, 그러한 화합물은 미토콘드리아내에서 샤페론을 억제시키고 그로 인해 시클로필린 D(CypD) 기능의 샤페론-매개 길항작용을 억제시키는 것으로 생각된다. 시클로필린 D는 미토콘드리아 세포 사멸을 유도하는 이뮤노필닌(immunophilin)이고, 샤페론은 단백질 폴딩/리폴딩 메카니즘을 통해 CypD 기능을 길항시키는 것으로 생각된다. 미토콘드리아에 유도되는 신규한 Hsp90 ATPase 길항제를 사용하여 이 경로를 불능화(disabling)시키는 것은 미토콘드리아 기능의 급작스런 붕괴와 선택적인 종양 세포 사멸을 초래한다. 따라서, 샤페론은 미토콘드리아 통합성의 신규한 조절자이고, 이들의 세포소기관-특이적 길항제는 신규한 부류의 유력한 항암제일 수 있다.
특정 구체예에서, 미토콘드리아에서 샤페론을 억제시킬 수 있는 화합물의 스크리닝은 시험 화합물의 그룹에서 (i) 분자 샤페론을 억제시키고/거나 이에 결합하고, (ii) 분자 샤페론과 시클로필린 D 사이의 상호작용을 억제시키고/거나 (iii) 종양 세포 미토콘드리아에서 샤페론의 수준을 감소시키는 그러한 화합물을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 (i), (ii), 또는 (iii)의 활성중 하나 이상의 활성을 나타내는 시험 화합물은 본원에서 "후보 화합물"로 지칭된다. 스크리닝 분석은 임의로 시험관내 또는 생체내에서 암 세포의 증식을 조절하는 이들의 활성에 관하여 후보 화합물을 추가로 시험할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 분석은 전체 세포 제조물 및/또는 생체외(ex vivo) 무세포 시스템에서 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 시험 화합물 또는 후보 화합물은 미토콘드리아-관통성 모이어티에 연결된다.
샤페론 단백질을 포함하는 무세포 샘플에 대한 시험 화합물의 결합이, 예를 들어, 기재(substrate), 예를 들어, 플레이트(예를 들어, 96-웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트)의 웰 표면 상에 샤페론 단백질을 가역적으로 또는 비가역적으로 고정시킴으로써 시험관내에서, 검출될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트는 샤페론 단백질, 또는 이의 단편으로 코팅되고, 세척되고 블록킹되어(예를 들어, BSA로 블로킹됨) 플레이트에 대한 시험 화합물의 비특이적 결합을 차단할 수 있다. 이후 샤페론 단백질은 플레이트에 가교된다. 시험 화합물은 수많은 조건(예를 들어, 37℃에서, 0.5 내지 12 시간)하에서 코팅된 플레이트에 첨가된다. 이후 플레이트는 헹구어질 수 있고 샤페론 단백질에 대한 시험 화합물의 결합은 다양한 종래 공지된 방법들 중 임의 방법으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 샤페론 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 면역검정에 사용될 수 있다. 원하는 경우, 항체는 표지되고(예를 들어, 형광적으로 또는 방사능동위원소로) 직접적으로 검출될 수 있다(예를 들어, 문헌[West and McMahon, J. Cell Biol, 74:264, (1977)] 참조). 대안적으로, 제 2이 항체가 검출을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 항-샤페론 단백질 항체에 결합하는 표지된 항체). 샤페론 단백질에 결합하는 시험 화합물은 고정된 샤페론 단백질에 대한 항체의 결합을 억제시키는 이들의 활성에 의해 검출될 수 있다. 대안적인 검출 방법에서, 시험 화합물은 표지되고(예를 들어, 방사능동위원소, 형광단, 발색단 등), 샤페론 단백질에 대한 시험 화합물의 결합은 기재상에 고정된 표지를 검출함으로써 검출도니다.
여전히 또 다른 구체예에서, 시험 화합물은 기재, 예를 들어, 상기한 바와 같이 마이크로타이터 플레이트에 고정되고, 샤페론 단백질(또는 이의 단편)을 포함하는 무세포 샘플과 함께 인큐베이션되고, 세척되고, 고정된 시험 화합물에 결합하는 샤페론 단백질의 활성이 검출된다. 예를 들어, Hsp90 (또는 이의 단편)은 광학적으로 검출될 수 있는 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 이의 변이체(UV 광하에서 검출될 수 있음)와의 융합 단백질로서 생산될 수 있고, 시험 화합물에 결합하는 융합 단백질의 활성이 검출된다. 대안적으로, 샤페론은 검출가느한 효소 활성을 지니는 효소, 예컨대, 양고추냉이과산화효소, 알카라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 글루코스 옥시다제와의 융합 단백질로 생산될 수 있다. 이러한 효소 모두를 엔코딩하는 유전자는 클로닝되고 당업계의 통상의 기술자에 의한 사용을 위해 가용하다. 원하는 경우, 융합 단백질은 항원을 포함할 수 있고, 이것은 관용적 방법을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로 검출되고 측정될 수 있다. 적합한 항원은 효소(예를 들어, 양고추냉이 과산화효소, 알카라인 포스파타제, 및 β-갈락토시다제) 및 비효소성 폴리펩티드(예를 들어, 혈청 단백질, 예컨대, BSA와 글로불린, 우유 단백질, 예컨대, 카세인)을 포함한다. 이러한 방법에서, 시험 화합물에 결합하는 샤페론 융합 단백질의 활성이 검출된다.
샤페론 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 확인하기 위해, 단백질/단백질 상호작용의 2-하이브리드 분석이 사용될 수 있다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578, (1991); Fields et al., 미국 특허 제 5,283,173호; Fields and Song, Nature, 340:245, (1989); Le Douarin et al., Nucleic acids Research, 23:876, (1995); Vidal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 10315-10320, (1996); 및 White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 10001-10003, (1996)). 다양한 2-하이브리드 방법을 실행하기 위한 키트가 시중에서 구입가능하다(예를 들어, 클론텍(Clontech, Palo Alto, CA)으로부터 구입가능).
다른 특정 구체예에서, 샤페론 단백질, 또는 이의 단편, 및 시험 화합물의 상호작용은 샤페론 단백질 또는 시험 화합물 중 어느 하나에 공유적으로 연결된 도너 형광단과 샤페론 단백질 또는 시험 화합물 중 어느 하나에 공유적으로 연결된 억셉터 형광단 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의해 검출되며, 여기서 상기 억셉터와 도너 형광단은 상기 샤페론 단백질 또는 시험 화합물에 둘 다 연결되지 아니하며, 상기 도너 방출 스펙트럼과 상기 억셉터 여기 스펙트럼의 적절한 중첩이 존재하여 상기 형광단이 샤페론 단백질-시험 화합물 상호작용을 통해 근접되는 경우 효율적인 비방사(nonradiative) 에너지 전이가 야기된다.
몇몇 방법에서, 종양 또는 암의 치료를 위한 후보 화합물인 시험 화합물은 하나 이상의 샤페론 단백질과 CypD를 포함하는 샘플에 시험 화합물을 접촉시키고, 이후 샤페론과 CypD 사이의 감소된 상호작용에 대한 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 일 구체예에서, 무세포 시스템은 재조합 TRAP-1 또는 재조합 Hsp90가 시험 화합물의 존재시 재조합 CypD와 동시-면역침전(co-immunoprecipitation)되는지 여부를 결정하는데 사용된다.
몇몇 방법에서, 종양 또는 암의 치료를 위한 후보 화합물인 시험 화합물은 하나 이상의 종양 세포와 접촉되고 샤페론의 감소된 발현에 관해 평가된다. 관련 방법에서, 하나 이상의 시험 화합물은 재조합 샤페론을 발현하는 종양 세포와 접촉되며, 세포는 재조합 샤페론의 감소된 발현에 대한 평가된다. 샤페론의 발현이 노던 블랏, RT-PCR 분석, RNAse 보호 분석, 웨스턴 블랏, 효소-연관 면역흡착 분석(ELISA), 방사능면역분석(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 측정될 수 있다. 시험 분자의 분재시의 발현 수준과 비교하여, 시험 화합물의 존재시의 발현의 수준은 해당 시험 화합물이 샤페론의 발현을 억제시키는지 여부를 나타낼 것이다. 일 구체예에서, 시험 화합물은 작은 간섭 RNA(siRNA)이다.
후보 화합물로서 시험 화합물을 확인한 경우, 해당 후보 화합물은, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 모델 시스템을 사용하여 종양 세포의 증식 분석에서, 추가로 시험될 수 있다. 시험관내 증식 분석은 후보 화합물을 종양 세포, 예를 들어, Raji 세포의 배양물에 후보 화합물을 접촉시키는 단계, 및 배양된 세포에서 아폽토시스를 유도하고/거나 상기 배양된 세포의 증식을 막는 후보 화합물의 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 생체내 종양 분석은 후보 화합물을 동물 모델, 예를 들어, 종양 또는 종양을 발달시키는 소양(predisposition)을 지니는 설치류에 투여하는 단계, 및 후속하여 동물에서 종양 발달 또는 종양 증식을 억제시키는 후보 화합물의 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 암의 예시적인 동물 모델은 이종이식된 암 세포를 지니는 동물을 포함한다. 다른 동물 모델은 종양을 발달시키는 유전자적 소양을 지니는 설치류, 예를 들어, (i) 선종성 대장 폴립(adenomatous polyposis coli, APC) 유전자(예를 들어, 다발성 장 종양 발생(multiple intestinal neoplasia, APCMin) 마우스(예를 들어, 하기 문헌 참조: Haigis et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 101:9769-9773, (2004)), (ii) mut-s 상동체-2(Msh2) 유전자(예를 들어, 하기 문헌 참조: Kohonen-Corish et al., Cancer Research, 62:2092-2097, (2002)), 및/또는 (iii) MutL 상동체-1(Mlh1) 유전자(예를 들어, 하기 문헌 참조: Cohen et al., Cell, 85: 1125-1134, (1996))의 돌연변이 형태를 지니는 마우스를 포함한다. C57BL/6J-Apc Min 마우스는 잭슨 하버 랩(Jackson Harbor Labs, Bar Harbor, ME)으로부터 입수가능하다. 대안적으로, 동물 모델은, 동물 모델에서 종양을 유도하는 것으로 보고된, 발암성 화합물, 예컨대, 디메틸히드라진 유도체 또는 헤테로고리 아민, 예컨대, 2-아미노-1-메틸-6-페닐이미다조[4,5-b]피리딘(PhIP)에 노출될 수 있다.
몇몇 방법에서, 종양 또는 암의 치료를 위한 후보 화합물은 하나 이상의 조양 세포를 포함하는 샘플에 해당 후보 화합물을 접촉시키고 이후 감소된 세포 생존도에 관해 스크리닝함으로써 킴으로써 아폽토시스-유도 활성에 관해 추가로 시험될 수 있다. 일 구체예에서, 감소된 세포 생존도는 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 환원 분석으로 측정된다. 모스만(Mossman)(J. Immunol. Methods 65:55-63 (1983))에 의해 개발된 발색성 MTT 분석은 수용성 MTT의 불용성 자주색 포마잔(formazan)으로의 전환에 기초한다. 포마잔은 이후 가용화되고, 이의 농도는 570 nm에서의 광학 밀도에 의해 측정된다. 방법은, 예를 들어, 문헌[Plescia et al., Cancer Cell. 2005 May;7(5):457-68)]에 기재된 대로, 수행될 수 있다. 다른 생존도 분석이 또한 사용될 수 있다.
몇몇 방법에서, 종양 또는 암의 치료를 위한 후보 화합물은 하나 이상의 종양 세포를 포함하는 샘플에 시험 화합물을 접촉시키고, 이후 증가된 아폽토시스에 대해 스크리닝함으로써 추가로 시험될 수 있다. 일 구체예에서, 증가된 아폽토시스는 DEVDase 가수분해에 의해 측정시 카스파제 활성의 증가로서 입증된다. 아폽토시스를 측정하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
몇몇 방법에서, 종양 또는 암의 치료를 위한 후보 화합물은 미토콘드리아 막 온전성을 붕괴시키는 이들의 활성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물은 미토콘드리아 막 전위에서의 변화를 유도하거나, 시토크롬 c 방출을 증가시키거나, Smad 방출을 증가시키는 이들의 활성에 관해 추가로 시험될 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 후보 화합물로 처리되고 미토콘드리아 막 전위-민감성 형광 염료 JC-1으로 추가로 처리되고, 유세포분석에 의해 녹색/적색 형광 비에서의 변화에 대해 분석된다.
몇몇 방법에서, 종양 또는 암의 치료를 위한 후보 화합물은 샤페론 활성을 억제시키는 이들의 활성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물은 Akt, Hsp90 클라이언트 단백질의 분해를 유도하는 이들의 활성에 대해 추가로 시험될 수 있다.
의약 화학
관심있는 화합물(또는 제제)가 확인되면, 의약 화학의 표준 원리가 화합물의 유도체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 유도체는 개선된 약리학적 특성, 예를 들어, 효능, 약동학, 안정성, 용해도, 및 소거(clearance)에 대해 스크리닝될 수 있다. 상기 분석에서 화합물의 활성에 관여하는 모이어티는 당업계에서 일반적으로 실행되는 구조-활성 관계(structure-activity relationships, SAR) 검사로 기술될 수 있다. 약제 화학 분야의 통상의 기술자는 후보 화합물 또는 제제(즉, 리드(lead) 화합물) 상의 모이어티를 변형시키고 그에 따라 필요한 효능을 지니는 유도체를 생산하기 위해 해당 화합물 또는 제제의 효능에 대한 상기 변형의 효과를 측정할 수 있다. 일예로, 문헌[Nagarajan et al, J. Antibiot, 41:1430-1438, (1988)]을 참조하라. 더욱이, 화합물(또는 제제)의 생화학적 표적이 공지되거나 결정된 경우, 표적 및 화합물의 구조는 유도체의 설계 및 최적화를 위한 정보를 제공할 수 있다. 분자 모델링 소프트웨어가 이러한 목적을 위해 시중에서 구입가능하다(예를 들어, 모레큘라 시뮬레이션 인크(Molecular Simulations, Inc.)로부터 구입가능함).
실시예
본 발명은 특허청구범위에 기재된 본 발명의 영역을 벗어남이 없이, 하기 실시예들에 더 상세히 기재된다.
실시예 1: 미코콘드리아내의 Hsp90 샤페론
이 실시예에 기재된 실험을 샤페론 TRAP-1 및 Hsp90의 세포하 국소화를 결정하기 위해 설계하였다.
TRAP-1에 대한 항체는 다양한 종양 세포 유형에서 분리된 정제된 미토콘드리아에서 풍부한 ~ 75kDa의 면역반응성 밴드를 검출하였다(도 1A). TRAP-1가 정상 마우스 조직에서 분리한 미토콘드리아에서 매우 낮은 수준으로 발견되었고(도 1A), 종양 또는 종양 세포의 세포질에서 부재하였기 때문에(도 1A 및 미도시) 이러한 국소화는 선택적이었다(Chen et al., Mol. Cell. Biol, 16:4691-4699, (1996)). 일차 종양 견본 및 이들 각각의 정상 조직내, 생체내에서, 차별적(differential) TRAP-1 발현을 검사하였다. 면역조직화학에 의해, TRAP-1은 췌장(도 1C), 유방(도 1E), 결장(도 1G), 및 폐(도 1I)의 선암의 종양 세포내에서 강하게 발현되었다. 반대로, 정상 췌장(도 1B), 유방(도 1D), 결장(도 1F), 및 폐(도 1H)의 상피는 매우 낮은 수준의 TRAP-1을 포함하였고, IgG는 정상 또는 종양 조직을 염색시키지 못하였다(미도시).
세포질내의 이의 알려진 국소화 이외에, Hsp90의 풍부한 풀은 웨스턴 블랏팅에 의해(도 1J), 다양한 종양 세포 유형의 미토콘드리아에서 검출되었다. 따라서, Hsp90에 대한 항체는, 전자 현미경에 의해(도 1K), HeLa 세포로부터 분리된 정제된 미토콘드리아(26.6±4.1 금 입자/미토콘드리아, n=13)를 표지시켰으나, IgG는 미토콘드리아를 유의미하게 염색시키지 못하였다(1.1±0.33 금 입자/미토콘드리아, n=13; p<0.0001)(도 1L). 미토콘드리아를 하기와 같이 특성결정하였다. HeLa 세포에서 정제된 미토콘드리아 분획은 TRAP-1과 Hsp90를 포함하였으나, 소포체(endoplasmic reticulum)의 단백질(칼넥신), 또는 세포질의 단백질(GAPDH)을포함하지 않았고, 매우 적은 양의 Lamp-1, 리소좀 마커를 포함하였다(도 1M). Hsp90는 분리한 미토콘드리아에서 활발하게 유입되었다. 35S-표지된 시험관내에서 전사되고 번역된 Hsp90 단백질은 단백질분해효소 K의 처리후 분리된 뇌 미토콘드리아 내부에 용이하게 축적되었고, 이 반응은 언커플러(uncoupler), 발리노마이신에 의해 완전히 억제되었다(도 2A).
유사한 결과가 미토콘드리아 유입에 관한 대조군인, 35S-표지된 미토콘드리아 포스페이트 담체, PiC로 얻어졌다(도 2A). Hsp90이 생체내에서 미토콘드리아에 국소화되는지 여부를 결정하기 위해, 면역블랏을 초대(primary) 고환, 폐, 지라, 신장, 뇌 및 간 세포에서 획득한 미토콘드리아 추출물에 대해 수행하였다. 이러한 면역블랏은 Hsp90이 초대 세포의 미토콘드리아에서 낮은 수준으로 발현된다는 것을 드러냈다(도 8). Bcl-2를 포함하는, 외막 단백질의 단백질분해효소 K 분해는 분리된 미토콘드리아에서 Hsp90 반응성을 감소시키지 않았는데(도 8), 이는 단백질가수분해로부터 외막 단백질이 보호되었음을 제시한다.
반대로, 디지토닌으로의 외막의 투과(permeabilization)는 상청액내로의 미토콘드리아 펠렛으로부터의 Hsp90의 농도 의존적 방출을 야기시켰으며, 반면 매트릭스 결합 mt-Hsp70는 영향받지 아니하였다(도 2B). 수크로즈의 부재시, 외막의 기계적 파괴는 미토콘드리아 내막 공간으로부터의 Smac를 완전히 고갈시켰으며, 이는 매트릭스-결합 시클로필린 D(CypD)에 영향을 미치지 않았다(도 2C). 이러한 처리에 의해 감소되기 하였지만, 실질적인 Hsp90 반응성은 미토콘드리아와 관련하여 유지되었으며(도 2C), 이는 Hsp90가 매트릭스와 미토콘드리아 내막 공간 둘 모두에 국소화됨을 제시하였다. 외막(outer membrane, OM), 내막공간(intermembrane space, IMS), 내막(inner membrane, IM) 및 매트릭스를 포함하는, 개별 세포소기관 구획에 대한 분석을 가능케하는 서브미토콘드리아 분획화 프로토콜을 사용하여 Hsp90의 국소화를 시험하였다. Hsp90는 내막 공간과 미토콘드리아 매트릭스 둘 모두에 국소화되었다(도 2D).
TRAP-1과 유사하게, Hsp90의 미토콘드리아 국소화는 선택적이었고, 뇌와 고환을 제외하고는, 미토콘드리아 Hsp90의 발현은 조사한 다른 정상 마우스 조직에서 발견되지 않았다(도 2E). 더욱이, 뇌와 고환에서의 미토콘드리아 Hsp90 수준은 종양 세포 유형에 관해 관찰된 미토콘드리아 Hsp90 수준에 비해 상당히 낮았다(도 1J). 반대로, Hsp90의 세포질 풀은 정상 및 종양 세포 유형에서 편재적으로(ubiquitously) 존재하였다(도 2E). 인간 세포에서, Hsp90와 TRAP-1 둘 모두 다양한 종양 세포주에서 높은 수준으로 발현되었으나, 3가지 정상 초대 섬유아세포 유형에서 낮은 수준으로 발현되었다(도 2F). 차별적 국소화는 정상 대 종양 세포에서 Hsp90 샤페론의 전체적으로(globally) 감소된 발현에 기인하지 아니하였다. 정상 세포에서 Hsp90의 세포질 양은 대표적인 종양 세포 유형의 양과 거의 비슷하였고, 반면 이의 미토코드리아 풀은 상당히 감소되었고, 미토콘드리아내 TRAP-1 수준도 감소되었다(도 2G).
실시예 2: 미토콘드리아 Hsp90 샤페론 표적화는 미토콘드리아 투과성 변화 및 세포 사멸을 초래한다
이 실시예에 기재된 실험에서, Hsp90 샤페론의 2가지 ATPase 포켓 길항제, 소분자 GA 유도체, 17-AAG(Isaacs et al, Cancer Cell, 3:213-217, (2003)), 및 펩티도미메틱 쉬페르딘(Sheph)[안테나페디아 헬릭스 III 호메오도메인 세포-관통 서열("ANT", Plescia et al., Cancer Cell, 7:457- 468, (2005))의 부가에 의해 세포를 관통할 수 있게 만들어짐]을 사용하였다. 두 분자는 ATP 결합과 경쟁하고 Hsp90 ATPase 활성을 억제시킴으로써 Hsp90 샤페론 활성을 억제한다(Neckers and Ivy, Curr. Opin. Oncol., 15:419-424, (2003); Plescia et al., Cancer Cell, 7:457-468, (2005)).
정제된 미토콘드리아를 하기한 대로 HeLa 세포에서 분리하였다. 플루오레세인-컨주게이션된 Sheph-ANT는 정제된 미토콘드리아 내부에 축적되었고(도 3A), 반면 형광 신호는 안테나페디아 세포-관통 서열이 결여된 쉬페르딘, Sheph의 경우(도 3B), 또는 미토콘드리아의 부재시(도 3C) 검출되지 않았다. 플루오레세인-컨주게이션된 세포-투과성 스크램블된 펩티도미메틱, Scram-ANT이 또한 분리된 미토콘드리아 내부에 축적되었고(도 3D), 형광 강도의 정량은 Sheph-ANT와 Scram-ANT 서열 둘 모두가 분리된 미토콘드리아에서 미토콘드리아내 관통 효율에 있어 명확하지 아니하였음을(도 3E) 보여주었다.
안테나페디아 세포-관통성 펩티드를 지니거나(Sheph-ANT) 지니지 않는 쉬페르딘(Sheph)의 서브미토콘드리아 분포를 정량하였다. 세포 투과성 Sheph-ANT는 비분획화된 미토콘드리아를 비롯한 내막 공간, 내막 및 매트릭스를 포함하는 모든 서브미토콘드리아 구획내에 존재하였다(도 3F). 이러한 국소화는 안테나페디아 펩티드(ANT)에 전체적으로 의존하였는데, Sheph(ANT 없음)가 미토콘드리아 또는 임의의 서브-미토콘드리아 구획내에서 발견되지 않았기 때문이다(도 3F). 쉬페르딘이 생체내에서 미토콘드리아내의 Hsp90 분자에 직접적으로 결합했는지를 결정하기 이해, 본 발명자들은 다음으로 쉬페르딘 또는 스크램블된 펩티도미메틱을 세파로즈 비드에 커플링시켰다. 쉬페르딘-세파로즈 상의 Raji 미토콘드리아 추출물의 분획화는 결과적으로 웨스턴 블랏팅에 의해 TRAP-1과 Hsp90 둘 모두의 특이적 용리를 야기시켰다(도 3G, 위). 대조적으로, 고정화된 스크램블된 펩티도미메틱과 Hsp90 분자의 결합은 입증되지 않았다(도 3G, 아래).
이러한 실험 조건하에서, Sheph-ANT의 정제된 HeLa 세포 미토콘드리아에 대한 부가는 미토콘드리아 막 전위의 급작스런 손실을 초래하였다(도 3H). 이 반은은 증가된 미토콘드리아 농도에서 점진적으로 약화되었는데(도 3H), 이는 미토콘드리아 내부에 화합물 축적을 위한 필요조건을 제시한다. 반대로, Sheph-ANT는 백그라운드 수준에 걸쳐 정상 세포의 미토콘드리아 막 전위에 영향을 미치지 않았고(아래 참조, 도 4A, C, E, G), 스크램블된 펩티도미메틱(Scram-ANT)는 종양 또는 정상 세포의 미토콘드리아 막 전위에 유의미한 영향을 미치지 못했다(도 3H 및 아래 참조, 도 4A, C, E, G). 또한 Sheph-ANT는 생체내에서 Raji 림프모구양 세포(도 3I), 및 초대 인간 육종 샘플(도 3J)로부터 분리된 미토콘드리아로부터 시토크롬 c의 농도-의존성 방출을 유도하였고, 반면 Scram-ANT는 유의미한 영향을 미치지 못하였다(도 3I, J). 이러한 데이터에 대한 분산에서, Hsp90 길항제 17-AAG는 분리된 종양 미토콘드리아로부터 시토크롬 c 또는 Smac 방출을 유도하지 못하였고, Hsp90 길항제 17-AAG는, 단지 높은 농도에서(20 μM), 상청액내로, 미토콘드리아 시토크롬 c의 적은 방류(discharge)를 초래하였으나, Smac의 방류를 초래하지 못하였다(도 3L).
실시예 3: 종양 대 정상 세포 유형에서 미토콘드리아 항상성의 차별적 조절
Sheph-ANT는 WS-1 정상 인간 섬유아세포로부터의 미토콘드리아의 막 전위의 손실을 초래하지 못하였고(도 4A, 좌), 반면 Sheph-ANT는 B-림프모구양 Raji 세포로부터 정제된 미토콘드리아를 용이하게 탈분극시켰다(도 4A, 우). Scram-ANT는 정상 또는 종양 미토콘드리아에 대하여 유의미한 영향을 미치지 못하였다(도 4A). Hsp90 수준은 세포 스트레스에 의해 조절될 수 있다. WS-1 섬유아세포의 글루코스 결핍(deprivation)은, 대조군으로 사용된, 소포체 Hsp90 상동체, Grp94의 수준을 증가시켰다(도 4B, 좌). 그러나, 글루코스 결핍후 WS-1 미토콘드리아내 내생성 TRAP-1과 Hsp90에서의 최소 변화가 존재하였다(도 4B, 우). 이와 일치하여, Sheph-ANT는, Scram-ANT와 비교할 때, 글루코스-결핍된 WS-1 미토콘드리아의 막 전위에 유의미하게 영향을 미치지 못하였다(도 4C).
p53-/- 마우스 림프종 표본으로부터 분리된 미토콘드리아로부터의 Sheph-ANT-유도된 시토크롬 c 방출(도 9); 이러한 처리는 정상 마우스 간 미토콘드리아의 시토크롬 c 또는 Smac 수준에 영향을 미치지 못하였고(도 4D), 정상 마우스 간(도 4E, 좌), 또는 뇌(도 4E, 우) 미토콘드리아의 막 전위에 영향을 미치지 못하였다. 대조군인 스크램블된 펩티도미메틱, Scram-ANT는 정상 또는 종양 미토콘드리아에 유의미한 영향을 미치지 못하였다(도 9, 도 4D, E).
종양 대비 정상 미토콘드리아에 대한 Hsp90 분자의 차별적 모집에 관한 근간을 시험하기 위해, Hsp90 국소화에 대한 종양유전자 발현의 효과 및 발현 수준을 시험하였다. 정상 NIH3T3 섬유아세포는 낮은 수준의 미토콘드리아 Hsp90를 나타내었다(도 4F). 그러나, 돌연변이 Ras 종양유전자를 지니는 이러한 세포의 레트로바이러스 형질도입(transduction)은 결과적으로 미토콘드리아에 대한 Hsp90의 증가된 모집을 야기시켰고, 반면 TRAP-1 발현은 현저하게 덜 증가하였다(도 4F). 반대로, 세포질 Hsp90 수준은 정상 또는 Ras-형질변형된 NIH3T3 세포에서 변화되지 않았다(도 4F). Sheph-ANT는 정상 NIH3T3 세포로부터 분리된 미토콘드리아에 영향을 미치지 않았고(도 4G, 좌), 반면 Sheph-ANT는, 확립된 종양 세포와 유사하게, Ras-형질변형된 NIH3T3 미토콘드리아를 용이하게 탈분극시켰다(도 4G, 우).
실시예 4: 미토콘드리아 Hsp90 분자의 억제에 의한 종양 세포 사멸의 차별적 조절
Sheph-ANT는 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 것으로 밝혀졌다. 형광물질 컨쥬게이션된 Sheph-ANT는 종양 세포의 핵주위 영역에 축적되고, 공초점 현미경에 의해 미토콘드리아 마커 미토트래커(MitoTracker)의 반응성과 함께 공동 국소화(co-localization)된다(도 5A). Scram-ANT는 분리된 정제 미토콘드리아 내부에 축적되나(도 3D, E), Scram-ANT는 온전한 살아있는 세포에서 미토트래커와 공동 국소화되지 않았다(도 5B). 이러한 결과는 Scram-ANT가 미토콘드리아 침투에 대해 적격(분리된 미토콘드리아에서의 축적에 의해 나타남)이나, Scram-ANT가 인시츄(세포내)의 미토콘드리아에서 공초점 현미경에 의해 검출가능한 수준으로 축적되지 않음을 암시한다. 본 발명자들은 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, 인시츄의 미토콘드리아에서의 Scram-ANT의 축적을 검출하지 못하는 것은 다른 세포질 막 구획에서의 Scram-ANT의 비특이적 투과, 예를 들어, 세포의 구획을 통한 Scram-ANT의 평형 분포, 및 이에 따른 미토콘드리아에 국소화되는 Scram-ANT의 정류 상태 수준의 공초점 현미경의 검출 한도 아래로의 감소를 반영할 수 있다. 또한, 이론으로 제한하고자 하는 바는 아니지만, Sheph-ANT의 축적은 미토콘드리아 내에 국소화된 Hsp90 또는 TRAP-1에 대한 Sheph 부분의 강한 결합으로 인한 것으로 보인다. 예측과 일치하게, 형광 강도의 정량은 처리된 세포의 미토콘드리아 추출물 내의 Scram-ANT 축적이 Sheph-ANT에 비해 감소된 것을 나타내었다(도 5C). 반대로, 둘 모두의 서열은 처리된 세포 추출물 및 처리된 세포의 세포질 분획에 동등하게 축적되었다(도 5C).
첨가 5분 이내에, Sheph-ANT는 종양 세포에서의 미토콘드리아 막 전위의 상실(도 5D), 및 세포질 내의 미토콘드리아 시토크롬 c의 방전(나타내지 않음)을 유도하였다. 대조적으로, 세포 투과성의 스크램블된(scramble) 펩티드 모방체(peptidomimetic)(Scram-ANT)는 효과가 없었다(도 5D). 병행 실험에서, 17-AAG는 HeLa 세포에서 미토콘드리아 막 전위에 영향을 미치지 않았고(도 5D), 광범위한 농도에 걸쳐 시토크롬 c 방출에 효과가 없었다(도 5E). 저속 촬영 비디오현미경으로 분석하는 경우, Sheph-ANT에 노출된 종양 세포는 수분 이내에 세포 수축, 막 수포형성, 핵주위 영역 부근의 미토콘드리아의 융합/분열을 포함하는 아폽토시스의 형태적 특징을 나타내었으나, Scram-ANT에 노출된 종양 세포는 그렇지 아니했다(도 5F). 따라서, Sheph-ANT에 대한 1시간의 노출은 농도 의존 방식으로 비대응 종양 세포 유형을 사멸시키기에 충분한 반면, 세포 투과성인 스크램블된 펩티드 모방체 Scram-ANT는 효과적이지 않았다(도 5G). 작용의 선택성과 일치하게, 동등한 농도의 Sheph-ANT는 다양한 정상 인간 섬유모세포 유형의 생활력에 영향을 미치지 않았다(도 5G). 대조적으로, 17-AAG는 동일 동역학 내에서 종양 세포 생활력에 효과가 없었고, 약물에 대한 연장된 노출만이 처리 24시간 후에 검출가능한 부분적 세포 사멸을 발생시켰다(도 5H).
실시예 5: 미토콘드리아에서의 Hsp90-조절된 샤페론 네트워크
분리된 Raji 미토콘드리아로부터 면역침전된 TRAP-1은 내인성 CypD와의 복합체로 발견되었다(도 6A). CypD 억제제인 시클로스포린 A(CsA)는 생체내에서 CypD-TRAP-1 복합체의 형성을 방지하였다(도 6A). GA 처리는 효과가 없었다(도 6A). TRAP-1과 유사하게, 분리된 미토콘드리아 추출물로부터 면역침전된 Hsp90은 생체내에서 내인성 CypD와 관련되었고, 이러한 상호작용은 또한 CsA에 의해 방지되었다(도 6B). TRAP-1 면역 복합체에서 Hsp90은 발견되지 않았고(나타내지 않음), 이는 미토콘드리아 내에 CypD를 함유하는 독립적 TRAP-1- 및 Hsp90-복합체의 존재를 암시한다. Hsp90 샤페론과 CypD 사이의 상호작용을 세포 비함유 시스템을 이용하여 확인하였다. 풀 다운(pull down) 실험에서, 반응에서 재조합 CypD에 직접 결합된 재조합 TRAP-1 또는 Hsp90, 및 반대로 재조합 Hsp90 분자와 직접 회합된 CypD는 또한 CsA에 의해 철폐되었으나, GA에 의해서는 그렇지 아니했다(도 10). 대조적으로, GST는 시험관내에서 Hsp90 또는 TRAP-1과 회합하지 않았다(도 10). GST-CypD와 Raji 미토콘드리아 추출물의 인큐베이션은 TRAP-1 및 Hsp90 둘 모두의 분리를 발생시켰고, 이러한 상호작용은 CsA에 억제되었으나, GA에 의해서는 그렇지 아니했다(도 6C).
실시예 6: Hsp90-특이적 미토콘드리아 항상성의 분자 필요조건
CsA를 이용한 CypD 활성의 억제는 Sheph-ANT에 의한 종양 미토콘드리아의 막 탈분극을 완전히 방지하였다(도 6D). CsA를 이용하거나 이용하지 않고도, Sheph-ANT는 정상적인 간 미토콘드리아에 대해 효과가 없었다. CsA는 Sheph-ANT-유도된 세포 사멸을 현저히 억제하였으며, CsA로 처리되지 않은 배양물에서 완전한 세포 사멸을 생성하는 Sheph-ANT의 농도(50 μM)에서 70%의 세포 생활력을 보존시켰다(도 6E). CsA의 보호 효과가 특이적인지 확인하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 CsA의 표적 CypD를 급성으로 제거하고, 쉬페르딘에 의해 매개되는 종양 세포 사멸을 정량하였다. CypD의 siRNA 제거는 또한 Sheph-ANT 유도 종양 세포 사멸을 방지하며, Sheph-ANT의 광범위한 효과적인 농도(50-100 μM)에 걸쳐 60-70%의 세포 생활력을 회복시켰다(도 6F). 대조적으로, 스크램블된 펩티드 모방체인 Scram-ANT는 CsA의 존재 또는 부재하에서 효과가 없거나(도 6E), 비표적화 또는 CypD-특이적 siRNA의 트랜스펙션 후에 효과가 없었다(도 6F).
미토콘드리아 Hsp90, TRAP-1 또는 둘 모두의 분자가 투과성 전이에서 CypD의 기능을 길항시키는지 결정하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 미토콘드리아에 단독으로 존재하는 TRAP-1 발현을 siRNA에 의해 제거하고, 세포 생활력에 대한 효과를 결정하였다. TRAP-1 사일런싱(silencing)은 비표적화 siRNA에 비해 HeLa 세포 생활력을 약 50% 감소시켰다(도 6G). CsA를 이용한 예비인큐베이션은 TRAP-1 사일런싱에 의해 유도되는 세포 사멸을 완전히 억제하였고(도 6G), 이는 미토콘드리아 내의 CypD의 Hsp90 샤페론 길항작용이 암 세포 생활력에 필요함을 암시한다. 대조군 실험에서, TRAP-1 또는 CypD에 특이적인 siRNA는 HeLa 세포에서 상기 두 단백질의 발현을 감소시킨 반면, 비표적화 siRNA는 효과가 없었다(도 6H). 미토콘드리아 Hsp90 분자가 아폽토시스에 대한 능동 보호를 수여하는지 추가로 시험하기 위해, 매우 낮은 수준의 TRAP-1을 발현하는 정상 인간 섬유모세포에 TRAP-1을 트랜스펙션시켰다(도 2F, G). 트랜스펙션된 인간 섬유모세포를 이후 스타우로스포린 유도된 아폽토시스에 대한 내성에 대해 시험하였다. WS-1(도 6Ⅰ) 또는 HFF(도 11) 정상 인간 섬유모세포에서의 재조합 TRAP-1의 발현은 대조군에 비해 광범위한 스타우로스포린 농도에 걸쳐 아폽토시스를 강하게 방해하였다.
실시예 7: 미토콘드리아 특이적 GA의 디자인 및 화학적 합성
Sheph-ANT는 분리된 미토콘드리아 및 살아있는 세포에서 투과성 전이를 유도하고, 선택적 종양 세포 사멸을 촉발시켰으나, 널리 특성규명된 Hsp90 길항제 17-AAG(Neckers and Ivy, Curr. Opin. Oncol, 15:419-424, (2003))는 미토콘드리아 온전성에 영향을 미치지 않았고(도 3K, L), 온건한 항암 활성을 나타내었다(도 5H). 17-AAG 효과의 결핍이 미토콘드리아 내에서의 17-AAG 축적의 결핍으로 인한 것인지 결정하기 위해, 국소화 연구를 수행하였다. 형광물질 컨쥬게이션된 GA는 분리된 종양 세포 미토콘드리아 내에 축적되지 않았다(도 12A). 17-AAG의 변이체 17-(3-(4-말레이미도부티르카르복사미도)프로필아미노)-데메톡시젤다나마이신(17-GMB-APA-GA)(도 12B, C)은 티오에테르 결합에 의해 안테나페디아 세포 투과 펩티드(ANT)에 공유 결합되었다. FITC와 컨쥬게이션되는 경우, ANT-GA로 명명된 상기 신규한 화합물(도 12C)은 분리된 종양 미토콘드리아 내에 용이하게 축적된 반면, 미토콘드리아의 부재하에서 형광 신호가 검출되지 않았다(도 12A). 단백질 K를 이용한 ANT-GA의 전처리는 미토콘드리아내 축적을 폐지한 반면, 미토콘드리아와의 ANT-GA 인큐베이션 후의 단백질분해효소 K의 첨가는 효과적이지 않았으며(도 12A), 이는 상기 화합물이 단백질분해로부터 보호된 것을 나타낸다. 차선 농도의 ANT-GA와 HeLa 세포의 밤새의 인큐베이션은 Akt, Hsp90 클라이언트 단백질의 분해를 발생시켰으며(도 12D), 이는 ANT 및 GA의 커플링되지 않은 혼합물(GA/ANT)로부터 구별할 수 없을 정도로 Hsp90 ATPase 활성을 억제하는 능력을 입증한다.
실시예 8: 미토콘드리아 특이적 GA(ANT-GA)에 의한 미토콘드리아 투과성 전이 및 선택적 종양 세포 사멸의 유도
ANT-GA와 정제된 HeLa 세포 미토콘드리아의 인큐베이션은 미토콘드리아 막 전위의 갑작스러운 상실을 발생시켰다(도 7A). 이러한 반응은 증가하는 미토콘드리아 농도에서 점진적으로 약화되었고, 이는 미토콘드리아 내의 화합물 축적이 활성에 요구됨을 나타낸다(도 7A). CsA는 종양 미토콘드리아의 ANT-GA-유도된 막 탈분극을 역전시켜(도 7B), 상기 경로에서 CypD의 역할을 강화시켰다. 또한, ANT-GA는 종양 세포에 대해 선택적이었고, 분리된 종양 미토콘드리아에서 시토크롬 c의 농도 의존성 방출을 촉발하였으나(도 7C, 상단), CsA를 이용하거나 이용하지 않고 정상적인 뇌 미토콘드리아의 막 전위(도 7B), 또는 정상적인 간 미토콘드리아의 시토크롬 c 함량(도 1C, 하단)에 영향을 미치지 않았다. 대조군 실험에서, GA/ANT의커플링되지 않은 혼합물, 또는 GA 단독은 정상 또는 종양 미토콘드리아 막 전위에 현저하게 영향을 미치지 않았고(도 7B), 시토크롬 c 방출에 영향을 미치지 않았다(도 7C). 종양 세포에 첨가되는 경우, ANT-GA는 신속(~ 2시간)하고 농도 의존적인 세포 사멸을 생성시켰으나, GA 단독 또는 커플링되지 않은 ANT/GA 혼합물은 그렇지 않은 반면, 상기 화합물 모두는 다양한 정상 인간 섬유모세포 세포 유형의 생활력에 영향을 미치지 않았다(도 7E). 최종적으로, ANT-GA에 의해 유도된 종양 세포 사멸은 DEVDase 가수분해에 의해 결정시 증가된 카스파아제 활성을 가진 아폽토시스의 특징을 갖고, p53의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않았다(도 7F). 대조적으로, 커플링되지 않은 혼합물 GA/ANT는 p53+/+ 또는 p53-/- 세포에서 아폽토시스를 유도하지 않았다(도 7F).
실시예 9: 종양에서의 선택적 Hsp60 세포보호
Hsp60 세포보호가 암에서 우선적으로 이용되었는지 결정하기 위해, 정상 세포 대 종양 세포 유형에서의 Hsp60의 발현 및 기능을 시험하였다. 미토콘드리아 및 세포질 분획을 특히 문헌[Dohi et al., J Clin Invest 2004; 114: 1117-27]에 기술된 바와 같이 종양 세포로부터 추출하였다(6-7x107). Hsp60은 미토콘드리아 및 미토콘드리아외(Soltys and Gupta, Int Rev Cytol 2000; 194: 133-96), 즉, 세포질, 유방 선암종 MCF-7 및 결장 선암종 HCT116 세포에 풍부하게 존재한다(도 13A, 상단 패널). 대조적으로, 일차 WS-1 및 HFF 인간 섬유모세포는 둘 모두의 세포하 구획에서 상당히 감소된 수준의 Hsp60을 나타내었다(도 13A, 하단 패널). 면역조직화학에 의해, Hsp60는 생체내에서 유방, 결장 및 폐의 정상 상피에서 검출되지 않거나, 매우 낮은 수준으로 발현되었다(도 13B). 대조적으로, Hsp60은 유방, 결장 및 폐의 선암종의 종양 세포 집단에서 풍부하게 발현되었고(도 13B); 유방, 폐 및 결장 선암종의 일차 조직 표본, 및 정상적인 매치된 조직을 유매스 메모리얼 암센터 조직 은행으로부터 익명으로 수득하였다. 문헌[Dohi et al., J Clin Invest 2004; 114: 1117-27]에 기재된 바와 같이 Hsp60에 대한 IgG 또는 항체(1:1000)를 이용하는 면역조직화학을 위해 조직 섹션을 처리하였다. 대조군 실험에서, IgG는 정상 또는 종양 상피를 염색시키지 않았다.
Hsp60 세포보호가 종양 세포에서 선택적으로 작용하는지 결정하기 위해, Hsp60 발현을 정상 및 종양 세포 유형에서 표적화하고, 세포 생활력을 분석하였다. 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 유전자 사일런싱을 문헌[Beltrami et al., J Biol Chem 2004; 279:2077-84]에 기재된 바와 같이 올리고펙타민(3 μl/웰)을 이용하는 비표적화된(VIII) 또는 Hsp60-특이적 이중 가닥(ds) RNA 올리고뉴클레오티드의 트랜스펙션에 의해 수행하였다. 대안적으로, 세포를 올리고펙타민에 의해 대조군 또는 Hsp60에 대한 SMART 풀(pool) siRNA 올리고뉴클레오티드(Dharmacon)로 트랜스펙션시켰다. 이중 트랜스펙션 실험을 위해, 세포에 각각의 트랜스펙션 사이에 48시간의 간격으로 대조군 또는 Hsp60 특이적 siRNA를 2회 로딩시켰다.
Hsp60-특이적 siRNA를 이용한 74INT 정상 인간 상피 세포 또는 WS-1 일차 인간 섬유모세포의 트랜스펙션은 Hsp60 발현의 억제를 발생시킨 반면, 비표적화 siRNA는 효과가 없었다. 종양 세포주로 수득된 결과와 일치하지 않게, 정상 세포에서의 Hsp60의 급성 siRNA 제거는 비표적화 siRNA로 트랜스펙션된 대조군 배양물과 비교시 세포 생활력의 상실 또는 증가된 카르파아제 활성을 발생시키지 않았다(도 13C).
따라서, Hsp60(수비빈에 결합함, 데이터는 나타내지 않음)은 생체내에서 종양에서 차별적으로 이용되는 광범위한 항-아폽토시스 프로그램에 기여하고, 따라서 정상 세포는 영향을 미치지 않으면서 종양 세포를 우선적으로 사멸시키도록 표적화될 수 있다.
실시예 10: 가미트리닙은 효과적으로 미토콘드리아 온전성을 분열시킨다.
가미트리닙(GA 미토콘드리아 기질 억제제)은 미토콘드리아 내에 구획화된 첫번째 클래스의 Hsp90 샤페론의 소분자 길항제이다. 가미트리닙의 구조는 결합되어 있고, Hsp90 억제제 17-알릴아미노 젤다나마이신(17-AAG)으로부터 유래된 벤조퀴논 안사마이신 백본(Isaacs et al., Cancer Cell, 3:213-217 (2003)), C17 위치 상의 링커 영역, 및 시클릭 구아니디늄의 1 내지 4개의 탠덤(tandem) 반복부에 의해 제공된 미토콘드리아 표적화 부분을 함유한다(Fernandez-Carneado et al., J Am Chem Soc, 127:869-874 (2005)). (가미트리닙 G1-G4), 또는 트리페닐포스포늄(Armstrong, Br J Pharmacol, 151: 1154-1165 (2007))(가미트리닙-TPP)(도 15A). 가미트리닙의 17-AAG 부분은 Hsp90 ATPase 포켓(pocket)과 접촉하는 것으로 예상되는 반면, 구아니디듐 모듈은 결합 계면으로부터 배제되고, ATPase 포켓 바깥에서 용매를 향해 있다. 예측된 도킹(docking) 구조에서, Hsp90에 대한 가미트리닙의 결합 배열은 젤다나마이신(GA)의 결합 배열에 따르고(Stebbins et al., Cell, 89:239-250 (1997)), 17-AAG 영역의 중원자의 제곱평균제곱근은 0.5Å이다.
가미트리닙-G4는 종양 세포 용해질에서 Hsp90으로의 결합에 대해 GA 친화성 비드와 효과적으로 경쟁하고, 정제된 클라이언트 단백질 재구성 검정에서 Hsp90 샤페론 활성을 억제(도 15B)한다(Arlander et al., J. Biol. Chem., 281:2989- 2998 (2006)). 가미트리닙-G4는 분리된 종양 미토콘드리아에서 선택적으로 축적되는 반면, 비표적화 17-AAG는 미토콘드리아에서 투과되거나 축적되지 않았다(도 15C)(Kang et al., Cell, 131:257-270 (2007)).
가미트리닙은 미토콘드리아 온전성을 분쇄시킨다. 분리된 종양 미토콘드리아에 첨가되는 경우, 가미트리닙은 내막 전위의 갑작스러운 상실을 야기시키고, 모두 동등한 효능을 갖는다(도 16A). 대조적으로, 비표적화 Hsp90 길항제, GA, 17-AAG 또는 17-(디메틸아미노에틸아미노)-17-데메톡시젤다나마이신(DMAG)은 미토콘드리아 막 전위에 영향을 미치지 않았다(도 16A). 가미트리닙(G4 또는 TPP)는 신속히 종양 미토콘드리아를 탈분극시키고, 이러한 반응은 CypD의 억제제인 시클로스포린 A(CsA)에 의해 억제되었다(도 16B). 대조적으로, 분리된 미토콘드리아 투과 부분, 예를 들어, TG-OH 또는 TPP-OH와 혼합된 17-AAG 또는 GA는 CsA의 존재 또는 부재하에서 미토콘드리아 막 전위에 영향을 미치지 않았다(도 16B). 모든 가미트리닙은 또한 미토콘드리아 시토크롬 c의 신속한(20분) 방출을 유도하였으나, 17-AAG는 효과가 없었다(도 16C).
최근에 개발된 여러 퓨린- 및 이속사졸 레조르시놀 기반의 Hsp90 길항제(도 19)를 미토콘드리아 온전성의 변화에 대해 시험하였다. 가미트리닙-G4는 미토콘드리아로부터 시토크롬 c의 갑작스럽고 완전한 방출을 유도하였다(도 16D). 대조적으로, 17-AAG, 17-AAG의 히드로퀴논 유도체(IPI-504), 퓨린 유사체(BIIB021), 또는 이속사졸(NVP-AUY922) Hsp90 억제제는 시토크롬 c 방출에 효과가 없었다(도 16D).
미토콘드리아 탈분극 및 시트크롬 c의 방출은 미토콘드리아 투과성 전이의 특징이고(Green et al, Science 305:626-629 (2004)), 이는 통상적으로 세포 사멸을 발생시킨다. 이러한 예측과 일치하게, 가미트리닙-G3 또는 -G4에 대한 폐 선암종 H460 세포의 3시간의 노출은 세포 생활력의 농도 의존성(IC50 ~0.5 μM) 및 완전한 상실을 발생시키기에 충분하였다(도 17A, 좌측). 이러한 기간 내에서, 가미트리닙-G1 또는 17-AAG는 효과가 없었고, 가미트리닙-G2 또는 가미트리닙-TPP는 중간의 활성을 가졌으며, 이는 세포내 축적의 다양한 효율을 반영한다(도 17A, 좌측). 24시간까지, 모든 가미트리닙은 전체 종양 세포 집단을 동등하게 사멸시킨 반면, 17-AAG는 세포 생활력 또는 세포 증식의 부분적 감소를 발생시켰다(도 17A, 우측).
현재의 Hsp90 억제제는 대부분의 종양 세포 유형에서 세포 주기 정지를 발생시킨 후, 48-72시간까지 다양한 정도의 아폽토시스를 발생시킨다. 비-미토콘드리아 표적화 Hsp90 억제제에 비한 가미트리닙의 항암 활성에서의 잠재적 기계적 차이를 관찰하기 위해, 유방 선암종 SKBr3 세포(Hsp90 억제에 고도로 민감한 모델 세포 유형)를 사용하였다. 가미트리닙(G4 또는 TPP) 또는 17-AAG를 이용한 SKBr3 세포의 처리는 48시간까지 및 96시간의 간격에 걸쳐 대사 활성을 동등하게 감소시켰다(도 17B). 그러나, 17-AAG로 처리된 대부분의 SKBr3 세포는 72시간 후에 여전히 살아있는 반면, 가미트리닙은 세포독성이었고, 24시간까지 종양 세포를 거의 완전히 사멸시켰다(도 17C). 이러한 세포 사멸 반응은 미토콘드리아 아폽토시스를 나타내는 미토콘드리아 내막 전위 및 카스파아제 활성의 상실을 특성으로 하였다(도 17D). 세포독성 특성과 일치하게, 가미트리닙(G4)는 연성 아가에서 고정 의존성 종양 성장을 억제하였고(도 17E), 이종성 종양 세포 유형의 패널(예를 들어, 인간 종양 세포 유형, 만성 골수성 백혈병 세포, B-림프아구양(lymphoblastoid) 백혈병 세포, 유방 선암종 세포, 폐 선암종 세포, 전립선 선암종 세포, 교아종(gliobastoma) 세포, 결장 선암종 세포, 및 자궁경부 암종 세포)에 대해 세포독성 효과를 가졌다. 가미트리닙의 세포독성 효과는 p53 상태 및 생존 인자, 예를 들어, Bcl-2의 발현에 의존적이다(도 17F). siRNA에 의한 CypD의 급성 사일런싱(Green et alScience, 305:626-629 (2004))은 가미트리닙에 의해 매개된 종양 세포 사멸을 부분적으로 약화시켰고(도 17G), 이는 상기 경로에서의 투과성 전이 세공의 역할을 입증한다.
가미트리닙이 Hsp90 샤페론의 미토콘드리아 풀에 특이적인지 결정하기 위해, 자궁경부 암종 HeLa 세포에 17-AAG를 처리하여, 클라이언트 단백질 Chk1 및 Akt의 불안정화(Isaacs et al, Cancer Cell, 3:213-217 (2003)), 및 샤페론 Hsp70의 증가된 발현(Beere et al., Nat Cell Biol, 2:469-475 (2000))을 발생시켰다. Chk1 및 Akt의 감소된 수준 및 Hsp70의 증가된 수준은 세포질 Hsp90의 억제와 일치한다(도 17H). 대조적으로, 가미트리닙은 Chk1, Akt 및 Hsp70의 수준에 대해 검출가능하지 않은 효과를 가지며, 이는 가미트리닙이 세포질 Hsp90에 대해 최소의 효과를 가짐을 암시한다(도 17H).
실시예 11: 가미트리닙은 이종이식 종양 모델에서 효과적이다.
가미트리닙의 효과 및 독성을 이종이식 종양 모델에서 평가하였다.
본 실시예에서 사용되는 모델을 생성시키기 위해, 멸균 PBS(200 μl)에 현탁된 HL60(10 x 106) 또는 H460(4 x 106) 세포를 10주령의 CB17 SCID/베이지(Taconic Farms) 면역약화 암컷 마우스의 양쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 대안적으로, 200 μl의 50% 마트리겔(BD Biosciences)에 현탁된 MDA-MB-231 세포(5 x 106)를 CB17 SCID/베이지 마우스에서의 피하 주사에 사용하였다. 표면 종양이 100-150 mm3의 부피에 도달하는 경우, 동물을 2개의 그룹(2 종양/마우스, 3 동물/그룹)으로 무작위화시키고, PBS 중의 20% 그레모포르(Cremophor) EL(Sigma)에 용해된 비히클(DMSO) 또는 카미트리니브를 복막내(i.p.) 주사로 처리하였다. 가미트리닙-G4를 다음과 같은 스케줄로 멸균 i.p. 주사로 사용하였다: HL60 이종이식물, 매일 2회 2 mg/Kg; H460 이종이식물, d 0에 대해 매일 2회 2 mg/kg, d 1에 대해 매일 2회 2.5 mg/kg, 치료 기간 동안 매일 2회 3.0 mg/kg; MDA-MB-231 이종이식물, d 0-2에 대해 매일 2회 2 mg/Kg, d 3-5에 대해 매일 2회 2.5 mg/Kg, 및 치료의 나머지에 걸쳐 매일 2회 3 mg/Kg. 17-AAG를 20% 크레모포르 EL에 용해시키고, H460 이종이식 연구에서 가미트리닙-G4와 동일한 용량 상승 요법을 이용한 전신 i.p. 주사로 사용하였다. 가미트리닙-G1을 다음과 같은 스케줄로 이용하였다: 매일 30 mg/Kg(d 0-2), 및 치료 나머지 동안 매일 50 mg/Kg. 가미트리닙-TPP를 실험 기간 전체에 걸쳐 매일 10 mg/Kg의 i.p. 주사로 사용하였다. 캘리퍼스를 이용하여 매일 종양 측정을 수행하고, 종양 부피를 식 ([밀리미터 단위의 길이] x [밀리미터 단위의 폭]2)/2. 다양한 치료 그룹의 마우스를 각각의 실험 시작 및 종료시에 칭량하였다.
생체내 세포하 분획화를 다음과 같이 수행하였다. 비히클 또는 가미트리닙 처리된 마우스로부터의 HL60 이종이식 종양을 이들이 300-400 mm3의 부피에 도달하는 경우에 수거하고, 세포질 분획을 미토콘드리아 분리 키트(SIGMA)를 이용하여 제조하였다. 세포질에 방출된 시토크롬 c를 웨스턴 블로팅으로 분석하였다.
인시츄(In situ) 뉴클레오좀내 DNA 분획화(TUNEL)를 다음과 같이 수행하였다. 처리 종료시, 종양을 비히클 또는 가미트리닙 처리된 동물로부터 수거하고, 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 엠베딩시키고, 섹션화하였다. 이전 문헌[Dohi et al, Mol Cell, 27: 17-28 (2007)]에 기재된 바와 같이 지시 설명서에 따라 아포태그 플러스 퍼옥시다아제 인 시츄 아폽토시스 검출 키트(ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection kit)(Chemicon)로 TUNEL 염색을 수행하였다. 400x 배율의 온라인 전하결합소자 카메라를 갖춘 올림푸스(Olympus) 현미경을 이용하여 이미지를 포착하였다(괴사 영역은 분석에서 제외시켰다). 정량화를 위해, TUNEL-양성 세포를 400x 배율 시야의 10개의 독립적 영역(10 시야/각 그룹)에서 계수하였다.
조직학을 다음과 같이 수행하였다. 비히클 또는 가미트리닙 그룹의 동물을 실험 종료시에 안락사시키고, 뇌, 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 소장, 비장 및 위를 포함하는 기관을 수집하고, 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 엠베딩시켰다. 섹션(5 μm)을 고접착성 슬라이드에 두고, 헤마톡실린 에오신으로 염색시키고, 광학현미경으로 분석하였다.
그래프패드(GraphPad) 소프트웨어 패키지(Prism 4.0)에서 언페어드 t 검정(unpaired t-test)을 이용하여 데이터를 분석하였다. 모든 통계 시험은 양측성이었다. 0.05의 p-값이 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
가미트리닙-G4의 마우스로의 전신 투여는 생체내에서 확립된 인간 백혈병(도 20A), 유방 종양(도 20B), 및 폐 종양(도 18A)의 성장을 억제하였다. 17-AAG의 동등한 용량은 마우스에서 인간 폐암 성장에 대해 효과가 없었다(도 18A, 상단). 다양한 미토콘드리오트로픽(mitochondriotropic) 부분(모노-구아니디늄(G1) 또는 트리페닐포스포늄(TPP))을 갖는 가미트리닙은 또한 생체내에서 폐암 성장을 억제하였다(도 18A, 하단). 가미트리닙 처리된 동물로부터 수거된 폐 종양은 인 시츄에서 광범위한 아폽토시스를 나타내었다(도 18B). 또한, 가미트리닙 처리된 동물로부터 수거된 폐 종양은 세포질 시토크롬 c를 나타내었고(도 18C), 이는 가미트리닙이 생체내에서 미토콘드리아 기능이상을 유도한 것을 암시한다. 또한, 상기 결과는 가미트리닙이 사용된 농도에서 최소의 부작용을 가질 수 있고, 가미트리닙이 치료 과정에 걸쳐 동물 피검체에서 현저한 체중 손실을 야기시키지 않고(도 18D), 가미트리닙 처리된 동물로부터 수거된 기관이 가미트리닙로 처리되지 않은 동물로부터의 조직에 비해 조직학적으로 정상인 것을 암시한다. 미토콘드리아 기능이상의 가미트리닙 유도가 종양에 대해 선택적이나 정상 세포에는 그렇지 않다는 것을 결정하기 위해, 종양 및 정상 세포를 처리하기 위해 가미트리닙를 사용하였다. 가미트리닙의 효과적인 농도는 정상 인간 섬유모세포의 미토콘드리아 막 전위(CsA의 존재 및 부재하(도 18E))에 영향을 미치지 않았다. 가미트리닙은 정상 인간 섬유모세포의 시토크롬 c 함량에도 영향을 미치지 않았다(도 18F). 완전한 종양 세포 사멸을 유도하는 가미트리닙의 농도는 정상 인간 세포 유형의 생활력을 감소시키지 않았다(도 18G).
이러한 결과는 가미트리닙이 선택적이고, 효과적이고, 안전함을 나타낸다.
실시예 12: 향미토콘드리아성 샤페론 억제제를 확인하기 위한 전산적 방법.
모든 도킹 계산에 사용된 Hsp90의 결정 구조를 pdb 코드 IYET.pdb에 해당하는 좌표(coordinate)를 갖는 단백질 데이터 은행으로부터 입수하였다(Stebbins et al., Cell, 89:239-250 (1997)). 본래의 X-선 구조는 활성 부위로부터 분리되어 Hsp90의 아포-개방 형태를 발생시키는 리간드 겔나다마이신(GA)를 함유하였다. 가미트리닙은 가미트리닙-Hsp90 복합체의 최소 자유에너지를 나타내는 콘센서스 구조를 규정하기 위한 다양한 도킹 절차, 다양한 전산적 접근 프로그램 및 에너지 함수를 이용하여 Hsp90의 활성 부위에 도킹하였다. 첫번째로, 가미트리닙의 구조는 물 용매의 효과를 고려하여, 마크로모델(Macromodel) 프로그램(Mohamadi et al., J. Comp. Chem., 11:440-467 (1990)), AMBER 역장(Duan et al., J. Comp. Chem., 24: 1999-2012 (2003)) 및 GB/SA 접근법(Rami Reddy et al., J. Comp. Chem., 19:769-780 (1998))을 이용하여 최소화시켰다.
첫번째 세트의 도킹 계산에서, 가미트리닙의 에너지 최소화된 구조를 프로그램 오토도크(AutoDock)를 이용하여 추정적인 N-말단 Hsp90 수용체에 대한 맹검(blind) 도킹 실험에 적용시켰다(Morris et al., J. Comp. Chem. 19: 1639-1662 (1998)). 질량-집중 격자(Mass-centered grid) 맵을 Hsp90의 ATPase 포켓 주위에서 프로그램 오토그리드(Autogrid)에 의해 0.35Å 간격으로 발생시켰다. 레너드-존스(Lennard-Jones) 파라미터 12-10 및 12-6(프로그램 패키지 내의 디폴트 파라미터)을 H-결합 및 반데르발스 상호작용 각각을 모델링하는데 사용하였다. 멜러 및 솔마저(Mehler and Solmajer)의 거리 의존성 유전율(Mehler and Solmajer, Protein Eng, 4:903-910 (1991))을 정전기 격자 맵의 계산에 사용하였다. 라마키안 유전 알고리듬(LGA) 및 슈도-솔리스 및 웨스트(pseudo-Solis and West) 방법을 디폴트 파라미터를 이용하여 최소화에 적용시켰다. 발생의 수를 모든 수행에서 2500만으로 설정하였고, 따라서 정지 기준은 에너지 평가의 전체 수에 의해 규정되었다. 리간드에 대해 격자 상의 무작위 시작 위치, 무작위 배향, 및 비틀림(가요성 리간드 단독)을 이용하였다. 전체 310개를 수행하였다. 도킹 수행 종료시, 리간드의 형태를 증가하는 에너지 순으로 목록을 만들었다. 이후, 가장 낮은 에너지를 갖는 리간드 형태를 기준으로 사용하였고, 기준으로부터 <1.5Å의 질량 중심 거리를 갖는 모든 형태를 첫번째 군집에 속하는 것으로 취하였다. 형태가 군집으로 지정된 후, 이는 다른(에너지적으로 덜 바람직한) 군집으로 다시 이용하지 않았다. 이후, 모든 형태가 군집에 놓여질때 까지 상기 과정을 모든 지금까지의 분류되지 않은 형태에 대해 반복하였다. 도킹된 구조 대부분은 복합체의 전역 최소값(global minimum)의 구조로 원형적으로 표시되는 공통의 형태적 특징을 공유하였다. 오토도크 수행으로부터 수득된 자유에너지 최소 구조의 17-AAG 영역은 0.56Å의 모든 중원자의 제곱평균제곱근 편차(rmsd)를 갖는 GA의 벤조퀴논 안사마이신 백본에 잘 중첩(superimposible)하였다.
두번째 세트의 도킹 계산에서, 가미트리닙의 최소화된 구조를 글라이드(Glide) 소프트웨어를 이용하여 Hsp90 수용체에 도킹시켰다(Friesner et al., J. Med. Chem., 47: 1739-1749 (2004); and Halgren et al., J. Med. Chem., 47: 1750-1759 (2004)). 각각의 측면에 대한 14Å 길이의 입방 바운딩 박스를 ATPase 결합 포켓 주위의 리간드에 대해 확립시켰다. 리간드에 대해 완전한 가요성이 허용되었고, 도킹 포즈를 글라이드 표준-정밀도(standard-precision, SP) 방식을 이용하여 기록하였다. 상기 과정으로부터 수득된 최적의 도킹 포즈의 가미트리닙의 17-AAG 영역은 한번 더 X-선 구조(Stebbins et al., Cell, 89:239-250 (1997)), 및 이전의 도킹 계산(0.51Å의 rmsd)에서 GA의 벤조퀴논 안사마이신 백본에 중첩되었다
최종적으로, 가요성 리간드의 다양한 형태가 다양한 복합체 기하학을 결정할 수 있는 가능성을 평가하기 위해, 가미트리닙를 용액 중에 분리하여 예비 형태 분석에 적용시켰고, 이는 GB/SA 방법을 통한 물의 암시적 표현이다. 가미트리닙의 형태적 공간을 연구하기 위해, 비틀림 기반의 형태 조사를 마크로모델(Macromodel)에서 수행된, 10000단계의 몬테 카를로 다중 최소 방법(Monte Carlo Multiple Minimum method)(Chang et al., J. Am. Chem. Soc, 111:4379-4386 (1989)) 및 AMBER 역장을 이용하여 수행하였다. 4223개의 독특한 형태를 확인하였고, 리간드를 위해 남겨두었다. 이후, 상기 계산으로부터 수득된 모든 형태를 단순 글라이드 도킹 접근법에 기재된 바와 동일한 절차를 이용하는 Hsp90 수용체에 대한 도킹 계산을 위한 리간드로 사용하였다. 각각의 형태는 다양한 스코어로 수용체에 도킹하였다. 중요하게는, 상위 랭크의 226개의 포즈는 한번 더 GA의 벤조퀴논 안사마이신 백본에 대해 17-AAG 영역에서 완전히 중첩되었고, 0.6Å의 평균 rmsd를 가졌다.
실시예 13: (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 테트라키스 헥사플루오로포스페이트 염(가미트리닙-G4,1)의 합성
Figure pct00026
단계 1. ((2R, 8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸메탄술포네이트, 테트라키스 헥사플루오로포스페이트 염 4:
아세토니트릴(5 mL) 중의 알코올 3(문헌[Fernandez-Carneado et al., J. Am. Chem. Soc, 127:869-874 (2005)]에 기재된 바와 같이 합성됨, 445 mg, 0.276 mmol)를 N2 하에서 실온에서 N-메틸모르폴린(0.30 mL, 2.76 mmol) 및 메탄술폰산 무수물(240 mg, 1.38 mmol)로 처리하였다. 실온에서 5시간 동안 교반한 후, 휘발성 물질 대부분을 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 디클로로메탄(30 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(20 mL)으로 세척하였다. 수성상을 추가의 디클로로메탄(30 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 2-5% MeOH)로 정제하여 테트라헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 4(452 mg, 97%, 담갈색 포말)를 생성시켰다. 1H-NMR (600 MHz, 아세톤-d6) δ 7.72-7.67 (m, 4H), 7.52-7.48 (m, 2H), 7.48-7.43 (m, 4H), 7.35- 7.00 (br, 염 양성자), 4.46 (dd, 1H, J= 4.2 Hz, 10.8 Hz), 4.28 (dd, 1H, J= 7.2 Hz, 10.2 Hz), 4.00-3.95 (m, 1H), 3.85-3.68 (m, 9H), 3.60-3.47 (m, 16 H), 3.18 (s, 3H), 3.04-2.95 (m, 6H), 2.76-2.68 (m, 6H), 2.28-2.14 (m, 8H), 2.05-1.89 (m, 8H), 1.06 (s, 9H).
단계 2. S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸 에탄티오에이트, 테트라키스 헥사플루오로포스페이트 염 5:
테트라히드로푸란(THF, 8 mL)/H2O(3 mL) 중의 메실레이트 4(452 mg, 0.267 mmol) 및 포타슘 티오아세테이트(153 mg, 1.34 mmol)의 용액을 16시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄(30 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(20 mL)로 세척하였다. 수성상을 추가의 디클로로메탄(30 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 0.1M 수성 NH4PF6(20 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 디에틸 에테르-헥산(1:1)으로부터 분쇄시켜 테트라헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 5(420 mg, 94%, 담갈색 고형물)를 생성시켰다. 1H-NMR (400 MHz, 아세톤-d6) δ 7.73-7.66 (m, 4H), 7.53-7.42 (m, 6H), 7.22-6.92 (br, 염 양성자), 3.85- 3.65 (m, 10H), 3.62-3.46 (m, 16H), 3.16 (d, 2H, J= 6.4 Hz), 3.04-2.86 (m, 6H), 2.77- 2.67 (m, 6 H), 2.37 (s, 3H), 2.29-2.14 (m, 8H), 2.04-1.88 (m, 8H), 1.06 (s, 9H); MS (EI) m/z 1087 (M+1), 1233 (M+HPF6+1).
단계 3. (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 테트라키스 헥사플루오로포스페이트 염 1:
실온에서 N2 하에서 탈기된 MeOH(4 mL) 중의 화합물 5(118 mg, 0.071 mmol)의 용액에 포타슘 터트-부톡시드(0.21 mL, 0.21 mmol, THF 중 1M)를 처리하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 1N 수성 HCl(약 0.1 mL)으로 중화시키고, 0.1N 포스페이트 완충액(pH 6, 3 mL)을 처리하였다. 실온에서 N2 하에서 완충된 용액에 탈기된 MeOH(2 mL) 중의 젤다나마이신-말레이미드 2(문헌[Mandler, et al. Bioconjug. Chem. 13:786-791 (2002)]에 기재된 바와 같이 합성됨, 65 mg, 0.085 mmol)의 용액을 첨가하였다. 2시간 후, 반응물을 약 3 mL로 농축시켰다. 생성된 반응 혼합물을 디클로로메탄(20 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(30 mL)로 세척하였다. 수성상을 디클로로메탄(20 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 분취용 HPLC(물 중의 5-50% 아세토니트릴, 0.1% TFA)에 의한 분리 후에 원심분리에 의해 트리플루오로아세테이트(TFA) 염으로서 화합물 1을 생성시켰다. TFA 염을 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(2 mL x 5)로 연속적으로 세척하였다. 원심분리 후 디에틸 에테르-헥산(1:1)으로부터의 분쇄로 테트라헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 1을 생성시켰다(88 mg, 52%, 자주색 고형물). 화합물 1의 순도는 254 nm에서의 HPLC에 의해 99%를 초과하였다. HRMS에 의해 측정된 화합물 1의 측정된 분자 질량([M+3H]3+, m/z 604.9698)은 이론적 질량(m/z 604.9736)과 일치하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3CN) δ 9.25 (s, 1H), 7.70-7.60 (m, 4H), 7.53-7.40 (m, 6H), 7.30 (br s, 1H), 7.11 (d, 1H, J= 8.4 Hz), 7.06 (s, 2H), 6.80-6.40 (br, 염 양성자), 6.74 (dt, 1H, J= 18.8 Hz, J= 6 Hz), 6.63 (t, 1H, J= 11.2 Hz), 5.83 (t, 1H, J = 10 Hz), 5.68 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 5.24 (br s, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.43 (d, 1H, J= 9.2 Hz), 3.98-3.86 (m, 1H), 3.86-3.78 (m, 1H), 3.75-3.68 (m, 1H), 3.67-3.60 (m, 1H), 3.60-3.42 (m, 14H), 3.42-3.23 (m, 21H), 3.22-3.10 (m, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.03 (dd, 1H, J= 14 Hz, 5 Hz), 2.92-2.52 (m, 7H), 2.52-2.40 (m, 9H), 2.40-2.30 (m, 1H), 2.25-2.00 (m, 10H), 1.97 (s, 3H), 1.86-1.70 (m, 14H), 1.71 (s, 3H), 1.05 (s, 9H), 0.95 (d, 3H, J= 6.4 Hz), 0.92 (d, 3H, J= 6.8 Hz); MS(EI) m/z 1812.5 (M+1).
실시예 14: (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 헥사플루오로포스페이트 염(가미트리닙-G1, I)의 합성
Figure pct00027
단계 1. S-((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸 에탄티오에이트, 헥사플루오로포스페이트 염 I-2:
THF(40 mL)/H2O(16 mL) 중의 화합물 I-1(문헌[Fernandez-Carneado et al., J. Am. Chem. Soc, 127:869-874 (2005)]에 기재된 바와 같이 합성됨, 2.30 g, 3.48 mmol) 및 포타슘 티오아세테이트(794 mg, 6.95 mmol)의 교반된 용액을 16시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄(100 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(50 mL)으로 세척하였다. 수성상을 추가의 디클로로메탄(50 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 0.1M 수성 NH4PF6(30 mL)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(25% 헥산/에틸 아세테이트에서 100% 에틸 아세테이트)에 의한 정제 및 농축으로 헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 I-2를 생성시켰다(2.12 g, 95%, 담황색 고형물). 1H-NMR (400 MHz, 아세톤-d6) δ 7.72-7.65 (m, 4H), 7.52-7.41 (m, 6H), 6.98 (br, 2H), 3.85-3.73 (m, 3H), 3.73-3.64 (m, 1H), 3.61-3.46 (m, 4H), 3.15 (d, 2H, J= 6.4 Hz), 2.36 (s, 3H), 2.23-2.10 (m, 2H), 2.08- 1.91 (m, 2H) 1.06 (s, 9H).
단계 2. (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 헥사플루오로포스페이트 염 I:
실온에서 N2 하에서 탈기된 MeOH(3 mL) 중의 화합물 I-2(100 mg, 0.156 mmol)의 용액에 포타슘 터트-부톡시드(0.47 mL, 0.47 mmol, THF 중의 1M)를 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 1N 수성 HCl(약 0.5 mL)로 중화시키고, 0.1N 포스페이트 완충액(pH = 6, 2 mL)으로 처리하였다. 실온에서 N2 하에서 완충된 용액에 탈기된 MeOH(1 mL) 중의 젤다나마이신-말레이미드 2(144 mg, 0.188 mmol)의 용액을 첨가하였다. 2시간 후, 반응물을 약 2 mL로 농축시켰다. 생성된 반응 혼합물을 디클로로메탄(30 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(30 mL)으로 세척하였다. 수성상을 디클로로메탄(30 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 분취용 HPLC(물 중의 5-50% 아세토니트릴, 0.1 % TFA)에 의한 정제 및 농축으로 TFA 염으로서 화합물 I을 생성시켰다. 생성된 TFA 염을 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(2 mL x 5)로 세척하였다. 농축 후의 디에틸 에테르로부터의 분쇄로 헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 I(107 mg, 50%, 자주색 고형물)을 생성시켰다. 화합물 I의 순도는 254 nm에서의 HPLC에 의해 98%를 초과하였다. HRMS에 의해 측정된 화합물 I의 측정된 분자 질량([M+H]+, 1221.6073)은 이론적 질량(m/z 1221.6090)과 일치하였다. 1H-NMR (600 MHz, 아세톤-d6) δ 9.40 (d, 1H, J= 5.4 Hz), 7.75-7.60 (m, 4H), 7.53-7.40 (m, 6H), 7.40-7.23 (m, 2H), 7.11 (s, 1H), 6.93-6.85 (m, 1H), 6.66 (t, 1H, J= 11 Hz), 5.85 (t, 1H, J= 10 Hz), 5.78 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 5.12 (s, 1H), 4.55 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 4.12-4.05 (br d, 1H), 4.06-3.98 (m, 1H), 3.98-3.93 (m, 1H), 3.85-3.45 (m, 13H), 3.39-3.15 (m, 5H), 3.32 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.05-2.95 (m, 1H), 2.87 (s, 3H), 2.77-2.68 (m, 1H), 2.64-2.58 (m, 1H), 2.53-2.39 (m, 2H), 2.30-2.13 (m, 4H), 2.05-1.91 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.88-1.76 (m, 4H), 1.75 (s, 3H), 1.75-1.67 (m, 2H), 1.06 (s, 9H), 1.00 (d, 3H), 0.91 (d, 3H) MS (EI) m/z 1221.58 (M+1).
실시예 15: (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 비스 헥사플루오로포스페이트 염(가미트리닙-G2, II)의 합성
Figure pct00028
단계 1. S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸 에탄티오에이트, 비스 헥사플루오로포스페이트 염 II-2:
THF(20 mL)/H2O(8 mL) 중의 화합물 II-1(문헌[Fernandez-Carneado et al., J. Am. Chem. Soc, 127:869-874 (2005)]에 기재된 바와 같이 합성됨, 1.71 g, 1.70 mmol) 및 포타슘 티오아세테이트(583 mg, 5.10 mmol)의 교반된 용액을 16시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄(100 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(50 mL)로 세척하였다. 수성상을 추가 디클로로메탄(50 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 0.1M 수성 NH4PF6(50 mL)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(100% 에틸 아세테이트 → 디클로로메탄 중의 5% MeOH) 및 농축에 의해 디헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 II-2(1.45 g, 87%, 다갈색 고형물)를 생성시켰다. 1H-NMR (400 MHz, 아세톤-d6) δ 7.73-7.67 (m, 4H), 7.53-7.42 (m, 6H), 7.27 (br d, 2H), 7.11 (br d, 2H), 3.85-3.63 (m, 6H), 3.62-3.48 (m, 8H), 3.61-3.46 (m, 4H), 3.14 (d, 2H, J= 6 Hz), 2.99 (dd, 2H, J= 14, 4.6 Hz), 2.73 (ddd, 2H, J= 14, 9, 4.6 Hz), 2.36 (s, 3H), 2.28-2.12 (m, 4H), 2.05-1.89 (m, 4H) 1.06 (s, 9H).
단계 2. (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 비스 헥사플루오로포스페이트 염 II:
실온에서 N2 하에서 탈기된 MeOH(4 mL) 중의 화합물 II-2(110 mg, 0.112 mmol)의 용액에 포타슘 터트-부톡시드(0.34 mL, 0.34 mmol, THF 중의 1M)를 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 1N 수성 HCl(약 0.3 mL)로 중화시키고, 0.1N 포스페이트 완충액(pH 6, 0.5 mL)을 처리하였다. 실온에서 N2 하에서 완충된 용액에 탈기된 MeOH(2 mL) 중의 젤다나마이신-말레이미드 2(94 mg, 0.122 mmol)의 용액을 첨가하였다. 2시간 후, 반응물을 약 2 mL로 농축시켰다. 생성된 반응 혼합물을 디클로로메탄(30 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(30 mL)로 세척하였다. 수성상을 디클로로메탄(30 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 분취용 HPLC(물 중의 5-50% 아세토니트릴, 0.1% TFA)에 의한 정제 및 농축으로 TFA 염으로서 화합물 II를 생성시켰다. 생성된 TFA 염을 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(2 mL x 5)로 세척하였다. 농축 후의 디에틸 에테르로부터의 분쇄로 디헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 II(55 mg, 29%, 자주색 고형물)를 생성시켰다. 화합물 II의 순도는 254 nm에서의 HPLC에 의해 99%를 초과하였다. HRMS에 의해 측정된 화합물 II의 측정된 분자 질량([M+2H]2+, m/z 709.8534)은 이론적 질량(m/z 709.8577)과 일치하였다. 1H-NMR (600 MHz, CD3CN) δ 9.26 (s, 1H), 7.70-7.65 (m, 4H), 7.52-7.43 (m, 6H), 7.13-7.08 (m, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.87 (br, 1H), 6.78-6.68 (m, 1H), 6.64-6.55 (m, 2H), 6.46 (br, 1H), 5.83 (t, 1H, J= 10 Hz), 5.72-5.65 (m, 1H), 5.21 (br, 2H), 5.07 (s, 1H), 4.46-4.42 (m, 1H), 3.82-3.78 (m, 1H), 3.73-3.69 (m, 1H), 3.66-3.62 (m, 1H), 3.62-3.41 (m, 9H), 3.41-3.25 (m, HH), 3.29 (s, 3H), 3.22-3.03 (m, 3H), 3.20 (s, 3H), 2.93-2.71 (m, 3H), 2.70-2.58 (m, 2H), 2.56-2.39 (m, 3H), 2.38-2.32 (m, 1H), 2.25-2.03 (m, 5H), 1.98-1.95 (m, 6H), 1.85-1.70 (m, 8H), 1.71 (s, 3H), 1.05 (s, 9H), 0.97-0.93 (m, 3H), 0.92 (d, 3H) MS (EI) m/z 1418.51 (M+1).
실시예 16: (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 트리스 헥사플루오로포스페이트 염(가미트리닙-G3, III)의 합성
Figure pct00029
단계 1. ((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메탄올, 트리스 헥사플루오로포스페이트 염 III-1:
THF(10 mL)/H2O(4 mL) 중의 메실레이트 I-1(545 mg, 0.82 mmol) 및 포타슘 티오아세테이트(188 mg, 1.65 mmol)의 교반된 용액을 16시간 동안 환류시켰다. 메탄술폰산(0.27 mL, 4.12 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. 실온으로의 냉각 후, 유기상 및 수성상을 디에틸 에테르(50 mL) 및 물(50 mL) 중에 분리시켰다. 수성상을 추가의 물(20 mL)로 재추출하였다. 결합된 수성상을 디에틸 에테르로 세척하였다. 이후, 수성상을 포타슘 비카보네이트(495 mg, 4.94 mmol)로 중화시키고, 용매를 증발시켜 건조시켰다. 이러한 생성된 용액에 MeOH(100 mL)을 첨가하고, 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 이러한 과정을 MeOH/CH2Cl2 시스템(MeOH/CH2Cl2 = 50/50 → 5/95)을 이용하여 2회 반복하였다. 농축시켜 미정제 황색 포말을 생성시켰다. 실온에서 MeOH(10 mL) 중의 상기 생성물의 용액에 세슘 카보네이트(322 mg, 0.99 mmol) 및 트리부틸포스핀(0.12 mL, 0.49 mmol)을 첨가하였다. 40분 동안 교반한 후, THF(10 mL) 중의 메실레이트 II-1(697 mg, 0.69 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이후, 진공하에서 대부분의 휘발성 물질을 제거하였다. 잔여물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(30 mL)으로 세척하였다. 수성상을 추가 디클로로메탄(30 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(MeOH/CH2Cl2: 2% 내지 5 %)에 의한 정제로 트리헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 III-1(560 mg, 64%, 백색 고형물)을 생성시켰다. 1H-NMR (400 MHz, 아세톤-d6) δ 7.74-7.70 (m, 4H), 7.54-7.44 (m, 6H), 4.28 (t, 1H, J= 5.2 Hz), 3.84-3.60 (m, 8H), 3.60-3.44 (m, 14 H), 3.07-2.97 (m, 4H), 2.75-2.58 (m, 4H), 2.27-2.14 (m, 5H), 2.14-1.74 (m, 7H), 1.06 (s, 9H).
단계 2. ((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)- 2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메탄티올, 트리스 헥사플루오로포스페이트 염 III-2:
N2 하에서 실온에서 THF(5 mL) 중의 알코올 III-1(433 mg, 0.34 mmol)의 용액에 N-메틸모르폴린(0.19 mL, 1.70 mmol) 및 메탄술폰산 무수물(178 mg, 1.02 mmol)을 처리하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄(30 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(20 mL)으로 세척하였다. 수성상을 추가의 디클로로메탄(30 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 컬럼 크로마토그래피(MeOH/CH2Cl2: 2% 내지 5%)에 의한 정제로 트리헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 III-2(359 mg, 78%, 담갈색 포말)를 생성시켰다. 1H-NMR (400 MHz, 아세톤-d6) δ 7.80-7.65 (m, 4H), 7.55-7.40 (m, 6H), 4.41 (dd, 1H, J= 10.4 Hz, 4.4 Hz), 4.25 (dd, 1H, J= 10.4 Hz, 7.6 Hz), 3.95-3.87 (m, 1H), 3.84-3.58 (m, 7H), 3.58-3.40 (m, 12H), 3.20 (s, 3H), 3.07-2.94 (m, 4H), 2.76-2.57 (m, 4H), 2.28-2.10 (m, 6H), 2.05-1.86 (m, 6H), 1.06 (s, 9H).
단계 3. S-((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸 에탄티오에이트, 트리스 헥사플루오로포스페이트 염 III-3:
THF(8 mL)/H2O(3 mL) 중의 메실레이트 III-2(359 mg, 0.27 mmol) 및 포타슘 티오아세테이트(97 mg, 0.85 mmol)의 교반된 용액을 16시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(30 mL)로 세척하였다. 수성상을 추가의 디클로로메탄(30 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 0.1M 수성 NH4PF6(20 mL)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 디에틸 에테르-헥산(1:1)으로부터의 분쇄로 트리헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 III-3(294 mg, 83%, 담황색 고형물)을 생성시켰다. 1H-NMR (600 MHz, 아세톤-d6) δ 8.20-7.74 (br, 염 양성자), 7.74-7.68 (m, 4H), 7.53-7.44 (m, 6H), 3.86-3.75 (m, 3H), 3.73-3.56 (m, 5H), 3.56-3.44 (m, 12H), 3.21 (dd, 1H, J= 13.8, 6 Hz), 3.08-2.95 (m, 5H), 2.80-2.61 (m, 4H), 2.37 (s, 3H), 2.24-2.10 (m, 6H), 2.00-1.82 (m, 6H) 1.06 (s, 9H).
단계 4. (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(3-(4-(3-(((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((((2R,8R)-8-((터트-부틸디페닐실릴옥시)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)메틸)-2,3,4,6,7,8-헥사히드로-1H-피리미도[1,2-a]피리미딘-2-일)메틸티오)-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)부탄아미도)프로필아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트, 트리스 헥사플루오로포스페이트 염 III:
실온에서 N2 하에서 탈기된 MeOH(4 mL) 중의 화합물 III-1(209 mg, 0.157 mmol)의 용액에 포타슘 터트-부톡시드(0.47 mL, 0.47 mmol, THF 중의 1M)를 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 1N 수성 HCl(약 0.1 mL)을 이용하여 중화시키고, 0.1N 포스페이트 완충액(pH 6, 3 mL)으로 처리하였다. 실온에서 N2 하에서 완충된 용액에 탈기된 MeOH(2 mL) 중의 젤다나마이신-말레이미드 2(133 mg, 0.173 mmol)의 용액을 첨가하였다. 2시간 후, 반응물을 약 3 mL로 농축시켰다. 생성된 반응 혼합물을 디클로로메탄(20 mL)으로 희석시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(30 mL)으로 세척하였다. 수성상을 디클로로메탄(20 mL)으로 재추출하였다. 결합된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 분취용 HPLC(물 중의 5-50% 아세토니트릴, 0.1% TFA)에 의한 정제 및 농축으로 TFA 염으로서 화합물 III을 생성시켰다. 생성된 TFA 염을 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(2 mL x 5)로 세척하였다. 농축 후의 디에틸 에테르-헥산(1:1)로부터의 분쇄로 트리헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 III(110 mg, 34%, 자주색 고형물)를 생성시켰다. 화합물 III의 순도는 254 nm에서의 HPLC에 의해 96%를 초과하였다. HRMS에 의해 측정된 화합물 III의 측정된 분자 질량([M+3H]+, m/z 539.2695)은 이론적 질량(m/z 539.2740)과 일치하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3CN) δ 9.26 (s, 1H), 7.70-7.63 (m, 4H), 7.52-7.40 (m, 6H), 7.15-7.08 (br, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.81-6.68 (m, 2H), 6.65-6.57 (m, 2H), 6.45-6.15 (br, 6H), 5.83 (t, 1H, J= 10.2 Hz), 5.69 (d, 1H, J= 7.2 Hz), 5.21 (br s, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.44 (dd, 1H, J= 9.6, 4.8 Hz), 3.83-3.78 (m, 1H), 3.73-3.70 (m, 1H), 3.66-3.61 (m, 1H), 3.61-3.42 (m, 10H), 3.42- 3.25 (m, 18H), 3.22-3.14 (m, 3H), 3.20 (s, 3H), 2.85-2.71 (m, 7H), 2.71-2.41 (m, 7H), 2.38-2.32 (m, 1H), 2.25-2.18 (m, 1H), 2.18-2.04 (m, 8H), 1.97 (s, 3H), 1.85-1.70 (m, 10H), 1.72 (s, 3H), 1.06 (s, 9H), 1.01 (d, 3H), 0.95 (dd, 3H) MS (EI) m/z 1615.51 (M+1).
실시예 17: (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(6-(트리페닐포스포니오)헥실아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트 헥사플루오로포스페이트(가미트리닙-TPP, 9)의 합성
Figure pct00030
단계 1. 터트-부틸 6-(트리페닐포스포니움)헥실카르바메이트, 브로마이드 염 7:
아세토니트릴(10 mL) 중의 화합물 6(문헌[Egbertson, et al. J. Med. Chem., 37:2537-2551 (1994)]에 기재된 바와 같이 합성됨, 1.60 g, 5.71 mmol)의 용액에 트리페닐포스핀(1.57 g, 5.99 mmol)을 첨가하고, 반응물을 16시간 동안 환류시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 과량의 트리페닐포스핀을 n-헥산을 이용한 추출(100 mL x 3)에 의해 제거하였다. 농축 및 진공하에서의 건조로 포스포니움 염 7(3.09 g, 99%, 백색 고형물)을 생성시켰다. 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.89-7.84 (m, 3H), 7.80-7.71 (m, 12H), 6.72 (br t, 1H), 3.57-3.50 (m, 2H), 2.85-2.79 (m, 2H), 1.50-1.38 (m, 4H), 1.30-1.16 (m, 4H).
단계 2. 6-(트리페닐포스포늄)헥산-1-아민 클로라이드 히드로클로라이드 8:
실온에서 디클로로메탄(100 mL) 중의 포스포늄 염 7(1.5 g, 0.765 mmol)의 용액에 HCl 용액(1,4-디옥산 중의 4N, 171 mL)을 처리하였다. 3시간 동안 교반한 후, 반응물을 농축시켰다. 진공하에서 건조시켜 아민 8(1.31 g, 99%, 백색 고형물)을 생성시켰다. 아민 8을 추가 정제 없이 사용하였다. 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.12 (br s, 3H), 7.94-7.88 (m, 3H), 7.86-7.75 (m, 12H), 3.70-3.60 (m, 2H), 2.75-2.68 (m, 2H), 1.58-1.44 (m, 6H), 1.38-1.30 (m, 2H).
단계 3. (4E,6Z,8S,9S,10E,12S,13R,14S,16R)-19-(6-(트리페닐포스포니오)헥실아미노)-13-히드록시-8,14-디메톡시-4,10,12,16-테트라메틸-3,20,22-트리옥소-2-아자비시클로[16.3.1]도코사-1(21),4,6,10,18-펜타엔-9-일 카르바메이트 헥사플루오로포스페이트 9:
실온에서 N2 하에서 클로로포름(25 mL) 중의 젤다나마이신(GA, 150 mg, 0.27 mmol)의 용액에 아민 8(390 mg, 0.81 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.47 mL, 2.70 mmol)을 첨가하였다. 3시간 동안 교반한 후, 추가 아민 8(390 mg, 0.81 mmol)을 첨가하였다. 10시간 후, 반응물을 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중의 2-10% 메탄올)에 의해 정제하였다. 생성된 염을 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고, 0.1M 수성 NH4PF6(2 mL x 5)로 세척하였다. 농축 후의 디에틸 에테르로부터의 분쇄로 헥사플루오로포스페이트 염으로서 화합물 9(173 mg, 62%, 자주색 고형물)를 생성시켰다. 화합물 9의 순도는 254 nm에서의 HPLC에 의해 98%를 초과하였다. HRMS에 의해 측정된 화합물 9의 측정된 분자 질량(M+, m/z 890.4559)은 이론적 질량(m/z 890.4509)과 일치하였다. 1H-NMR (600 MHz, 아세톤-d6) δ 9.39 (s, 1H), 8.00-7.87 (m, 9H), 7.87-7.75 (m, 6H), 7.30 (d, 1H, J= 11.4 Hz), 7.10 (s, 1H), 6.66 (t, 1H, J= 11 Hz), 6.58 (br, 1H), 5.85 (t, 1H, J= 10 Hz), 5.78 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 5.11 (s, 1H), 4.55 (d, 1H, J= 9.6 Hz), 4.06 (d, 1H, J= 6 Hz), 3.66-3.55 (m, 4H), 3.54-3.47 (m, 1H), 3.37-3.33 (m, 1H), 3.31 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 2.78-2.68 (m, 1H), 2.59 (dd, 1H, J= 13.8, 4.2 Hz), 2.40 (dd, 1H, J= 13.8, 9.6 Hz), 2.01 (s, 3H), 1.90-1.77 (m, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.74-1.62 (m, 6H), 1.54-1.45 (m, 3H), 0.97 (d, 3H, J= 7.2 Hz), 0.91 (d, 3H, J= 7.2 Hz) MS (EI) m/z 890.08 (M+).
실시예 18: 미토콘드리아 투과성 GA의 디자인 및 화학적 합성
말레이미도 GA 유도체 17-(3-(4-말레이미도부티르카르복사미도)프로필아미노)-데메톡시젤다나마이신(17-GMB-APA-GA)을 인비트로겐(Invivogen)사에서 구입하였다. 아미노 말단 FITC 기, 및 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKKC(서열번호40)을 갖는 COOH 말단에서의 아미드 (CONH2)-캡핑(capping)된 Cys 잔기를 갖거나 이를 갖지 않는 세포 투과성 헬릭스 III 안테나페디아(Antennapedia) 펩티드(ANT)를 합성하였다. ANT에서의 COOH-말단 Cys의 술프히드릴 기를 17-GMB-APA-GA의 말레이미드 기와 반응시켜 티오에테르 결합을 발생시켰다. 컨쥬게이션 반응을 위해, ANT 및 17-GMB-APA-GA를 각각 10 mM의 최종 농도로 50 mM Hepes, pH 7.0, 및 DMSO에 용해시키고, 가벼운 혼합과 함께 22℃에서 1시간 동안 1:1 ANT:17-GMB-APAGA 비로 혼합시켰다. 생성된 ANT-17-GMB-APA-GA 컨쥬게이트를 질량 분광 분석법으로 분석하고, 미토콘드리아 투과성 전이 및 세포 생활력의 분석에 사용하였다.
일반 방법
화학적 특성규명. 배리언 이노바(Varian Inova) 400NB (400 MHz) 또는 배리언 이노바 600 (600 MHz) 분광계에서 1H-NMR 스펙트럼을 수득하였다. 질량 스펙트럼을 HP1100 시리즈 LC/MS 분광계에서 기록하였다. TLC 플레이트(형광지시약 UV254를 갖는 Macherey-Nagel 0.25 mm 실리카 겔 60)에서 반응의 진행을 확인하고, UV 광(254 nm) 하에서 및/또는 닌히드린 또는 Ce-Mo 염색 용액으로의 TLC 플레이트를 침지시킨 후의 탄화(charring) 후에 스폿(spot)을 시각화시켰다. 실리카 겔(Merck 9385 silica gel 60) 상에서 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 최종 생성물을 YMC-Pack Pro CisRS 컬럼(YMC)이 구비된 HPLC(Waters alliance)에 의해 분석하고, 254 nm에서 검출하였다. 합성된 화합물의 화학적 확인은 잠금 질량(lock mass) 기준으로서 [M+2H]2+ 이온 또는 [Glu1]-피브리노펩티드 B(CAS 103213-49-6)로부터의 단일 하전된 생성 이온을 이용하는 워터스 Q-TOF 프리미어(Waters Q-TOF Premier) 질량 분광계를 이용하는 고 해상도 질량분광계(HRMS)에 의해 확인하였다. 이론적 분자 질량을 MassLynx™ 소프트웨어(Waters Corp.)를 이용하여 계산하고, 측정된 질량과 비교하였다. 모든 측정된 질량은 이론적 값의 측정 오차(5 amu) 이내였고, 예상 원소 조성과 일치한다. 모든 시약 및 용매(아세토니트릴, 메탄올, 디에틸 에테르 및 헥산)을 시약 등급으로 구입하고, 추가 정제 없이 사용하였다. 테트라히드로푸란 및 디클로로메탄을 각각 Na-벤조페논 및 CaH2로부터 증류시켰다.
세포주 및 항체. 자궁경부 암종 HeLa, 직장결장 선암종 HCT116, 유방 선암종 MCF-7 및 MDA-MB-231, 폐 선암종 H460 및 H1975, 전립선 선암종 PC3 및 DU145, 표피양 편평 세포 암종 A431, 및 B-림프모구양(B-lymphoblastoid) Raji, HL-60 및 U937 세포를 미국 미생물보존센터(ATCC, Manassas, VA)에서 입수하고, 공급자의 명세서에 따라 배양 상태로 유지시켰다. 급성기의 인간 만성 골수성 백혈병 K562, 단핵구 백혈병 THP-1, 교모세포종 U87MG, 자궁경부 암종 HeLa, 직장결장 선암종 HCT116, 유방 선암종 MCF-7(ER-양성) 및 MDA-MB-231(에스트로겐 수용체-음성), 폐 선암종 H460 및 H1975, 전립선 선암종 PC3 및 DU145, 표피양 편평 세포 암종 A431, 및 B-림프아구양 Raji, 골수성 백혈병 HL-60 및 U937 세포를 미국 미생물보존센터로부터 입수하고, 공급자의 명세서에 따라 배양 상태로 유지시켰다. 정상 인간 세포 유형 HGF, 포피 섬유모세포 HFF, 상피 섬유모세포 WS-1, 및 장 상피 INT를 ATCC로부터 입수하였다. 소 대동맥 내피 세포 및 인간 제대 정맥 내피 세포를 분리시키고, 공개 프로토콜 16(Mesri et al., "Suppression of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by Survivin targeting," Am. J. Pathol, 158: 1757- 1765 (2001))에 따라 배양 상태로 유지시켰다. Bax-/- 및 p53-/- HCT116 세포는 버트 보겔슈타인 박사(Dr. Bert Vogelstein)(Johns Hopkins University)에 의해 제공되었다. 다음과 같은 항체를 사용하였다: 시토크롬 c(Clontech), Cox-IV(Clontech), Hsp90(BD Biosciences), TRAP-1(BD Biosciences), 사이클로필린 D(CypD, peptidylprolyl isomerase F, ppif, Calbiochem), Bcl-2(BD Biosciences), Smac(ProSci), mt-Hsp70(ABR), 및 β-액틴(Sigma- Aldrich).
펩티드, 플라스미드 및 재조합 단백질 발현. HPLC-정제된 세포 투과성 레트로-인버소(retro-inverso) 쉬페르딘(Shepherdin) 펩티드 모방체(수비빈(survivin) 서열 Lys79-Leu87) 및 이의 스크램블된 세포 투과성 변이체를 문헌[Plescia et al, Cancer Cell, 7:457-468, (2005)]에 기재된 바와 같이 합성하고, 세포 생활력, 시토크롬 c 방출 및 미토콘드리아 막 전위의 분석에 사용하였다. FITC 컨쥬게이션된 천연 Sheph, 및 세포 투과성 Sheph-ANT, Scram, Scram-ANT를 또한 문헌[Plescia et al., 2005, 상기 참조]에 기재된 바와 같이 합성하였다. CypD의 포유동물 유전자 수집(MGC) 전장 클론을 인비트로겐사로부터 구입하고, 프라이머 5'-AAAAAGAATTCCTGGCGCTGCGCTGCGGCTC-3'(서열번호 31) 및 5'-AAAAACTCGAGCAGATTAGCTCAACTGGCCACAGTC-3'(서열번호32) 또는, 대안적으로, 5'-AAAAAGAATTCGGCGGCATGTGCAGCAAGGGCTCCGGCG-3 '(서열번호 33) 및 5'-AAAAACTCGAGCAGATTAGCTCAACTGGCCACAGTC-3'(서열번호 34)를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다.
TRAP-1(GenBank ACC. No. NM_004257(단백질은 NP004248임))의 MGC 전장 클론을 인비트로겐사로부터 구입하고, 트랜스펙션 실험에 사용되는 전장 클론 및 Ser60에서 시작하는 단백질의 성숙 형태에 해당하는 전사물을 정방향 프라이머 5'-AAAAAGGATCCGTACGACATGGCGCGCGA-3'(서열번호 35) 및 5'-AAAAAGGATCCAGCACGCAGACCGCCGAGG-3'(서열번호 36), 각각, 및 3' 역방향 프라이머: 5'-AAAAACTCGAGCTAGTGTCGCTCCAGGGCCTT-3'(서열번호 37)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 EcoRⅠ/XhoⅠ(CypD) 또는 BamHⅠ/XhoⅠ(TRAP-1)으로 절단하고, 원핵생물 또는 진핵생물/시험관내 번역 발현을 위해 각각 pGEX-4T(Pharmacia) 또는 pcDNA3.0(Invitrogen)에 라이게이션시켰다. pGEX-CypD, pGEX-TRAP-1, 또는 pGEX-Hsp90 cDNA를 BL21-CodonPlus-RIL 대장균(E. Coli) 균주(Stratagene)로 형질전환시켰다.
마우스 PiC(용질 담체 패밀리 25(미토콘드리아 담체, 포스페이트 담체), member 3(GenBank Ace. No. AL360268(단백질은 CAI13838임))의 전장 클론을 인비트로겐사로부터 구입하였다. PiC cDNA를 프라이머 5'-AAAAAGGATCCAGGAGGATGTTCTCGTCCGTAGC-3'(서열번호38) 및 5'-AAAAACTCGAGCTACTCAGTTAACCCAAGCTTCTTCTTC-3'(서열번호39)을 이용하여 증폭시키고, PCR 생성물을 BamHⅠ/XhoⅠ으로 절단하고, pcDNA3로 서브클로닝하여 pcDNA-PiC를 생성시켰다. 재조합 단백질을 5시간 동안 30℃에서 0.2 mM IPTG로 유도시키고, 문헌[Fortugno et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(24): 13791-6, (2003)]에 기재된 바와 같이 박테리아 추출물로부터 정제하였다.
단백질 농도를 기준으로서 우혈청 알부민(BSA)을 이용하여 단백질 검정 시약(Bio-Rad)으로 결정하였다.
서브미토콘드리아 분획화. 서브미토콘드리아 분획화를 약간 변형시켜 상기 기재된 바와 같은 포스페이트 팽창-수축으로 수행하였다(Bijur and Jope, J. Neurochem., 87: 1427-1435, (2003); Hovius et al., Biochim. Biophys. Acta, 1021:217-226, (1990)). 간단히, 상기 기재된 바와 같이 수크로오스 단계 구배에 의해 분리된 고도로 정제된 미토콘드리아 펠렛을 팽창 완충액(10 mM KH2PO4, pH 7.4 및 프로테아제 억제제)에 현탁시키고, 가벼운 혼합과 함께 0℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 팽창된 미토콘드리아를 동등한 부피의 수축 완충액(10 mM KH2PO4, pH 7.4, 32% 수크로오스, 30% 글리세롤, 10 mM MgCl2 및 프로테아제 억제제)과 혼합하고, 0℃에서 추가 20분 동안 인큐베이션하였다. 10분 동안 10,000 x g에서 원심분리한 후, 외막 및 내막 미토콘드리아 분획(OM & IMS)을 함유하는 상층액을 수집하였다. 펠렛을 팽창/수축 완충액의 1:1 혼합물로 3회 세척하고, 팽창 완충액에 현탁시키고, 초음파 처리하여 내막을 분열시키고, 이를 내막 및 기질 미토콘드리아 분획(IM & MA)을 함유하는 것으로 수집하였다. OM & IMS 및 IM & MA를 4℃에서 1시간 동안 150,000 x g에서의 원심분리에 의해 추가로 분획화시켰다. 펠렛을 각각 OM 및 IM 분획으로 수집하였다. 상층액을 센트리콘(Centricon) 1OK 및 마이크로콘(Microcon) 1OK 원심분리 필터 장치(Millipore)를 이용하여 추가로 농축시키고, 각각 IMS 및 MA 분획으로 수집하였다.
다른 실험에서, HeLa 세포 또는 마우스 뇌로부터 분리된 미토콘드리아(2 μg/μl, 15 μl)를 SHE 완충액(HE 완충액 중의 250 mM 수크로오스)에 현탁시키고, 135 μl의 SHE 완충액 또는 HE 완충액(10 mM Hepes, 1 mM EDTA, pH 7.2)에 희석시키고, 반복된 피펫팅(pipetting)에 의한 미토콘드리아 외막의 기계적 파열과 함께 0℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 0℃에서 10분 동안 50 μg/ml의 단백질분해효소 K(Roche)와 함께 인큐베이션하고, 10분 동안 10,000 x g에서 원심분리하고, 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 대안적으로, 샘플을 미토콘드리아 막을 투과시키는 디지토닌(0-0.4%)의 증가하는 농도로 처리하고, 펠렛으로부터 상층액으로의 미토콘드리아 단백질의 재분배를 문헌[Dohi et al., J. Clin. Invest. 114(8): 1117-27, (2004)]에 기재된 바와 같이 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다.
미토콘드리아의 분리 및 약물의 '미토콘드리오트로픽(mitochondriotropic)' 특성. 이전의 문헌[Kang et al., Cell, 131 :257-270 (2007)]에 기재된 바와 같이 HeLa 세포로부터 미토콘드리아를 분리시켰다. 간단히, HeLa 세포를 수거하고, TD 완충액(135 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Tris, pH 7.6)으로 세척하였다. 세포 펠렛을 CaRSB 완충액(10 mM NaCl, 1.5 mM CaCl2, 10 mM Tris, pH 7.5, 프로테아제 억제제)에 현탁시키고, 0℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 팽창된 세포를 다운스(Dounce) 분쇄기에서 균질화시키고, 즉시 1.5 부피의 MS 완충액(210 mM 만니톨, 70 mM 수크로오스, 5 mM Tris, pH 7.6, 5 mM EDTA)와 혼합시켰다. 핵 및 기타 세포 부스러기를 15분 동안 600 x g에서의 원심분리에 의해 제거하였다. 샘플을 0℃에서 5분 동안 2600 μg의 미토콘드리아 당 200 μM의 가미트리닙 또는 17-AAG를 이용하여 추가로 인큐베이션하고, 처리된 미토콘드리아를 10분 동안 6,000 x g에서의 인큐베이션에 의해 다시 분리시켰다. 미토콘드리아 펠렛을 MS 완충액에 현탁시키고, 110,000 x g에서 1.5시간 동안 프로테아제 억제제가 더해진 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 7.6, 2 mM DTT 중에 1M/1.5M 수크로오스 단계 구배로 적용시켰다. 미토콘드리아 밴드를 분리시키고, MS 완충액 중에서 세척하고, 프로테아제 억제제가 더해진 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.4, 0.5% IGEPAL CA-630, 1 mM EDTA 함유 완충액 중에서 용해시켰다. 기준으로서 BSA를 이용한 바이오-래드(Bio-Rad) 단백질 검정 시약을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 동등한 단백질 농도에 대한 흡광도를 DU530 분광광도계(Beckman Coulter)를 이용하여 338 nm에서 결정하였다. 17AAG 및 가미트리닙에 대한 최대 흡수 및 동등한 신호로 인해, 338 nm에서의 흡광도를 약물 검출을 위해 이용하였다.
분리된 미토콘드리아의 형광 분석. FITC-컨쥬게이션된 쉬페르딘과 함께 인큐베이션된 개별적 미토콘드리아 소분획물(subfraction)(20 μg)을 3 ml의 20 mM Tris 완충액에서 인큐베이션하고, 형광 밀도(U, 임의의 단위)를 CARY ECLIPSE 형광 분광광도계(Varian Inc. CA, USA)를 이용하여 497 nm의 여기 파장 및 525 nm의 방출 파장에서 측정하였다. 몇몇 실험에서, MCF-7 세포를 30분 동안 20 μM의 FITC-쉬페르딘 또는 FITC-스크램블된 펩티드로 처리하였다. 세포를 수거하고, 미토콘드리아를 PIERCE사의 미토콘드리아 분리 키트를 이용하여 분획화시켰다. 기준으로서 BSA를 이용하여, 단백질 검정 시약(Bio-Rad)을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 50 μg의 단백질 샘플을 3 ml의 20 mM Tris 완충액, pH 7.4과 혼합하고, 형광 강도를 분광광도계(Varian Inc. CA, USA) 상에서 497/525 nm의 여기/방출 파장에서 측정하였다.
시험관내 미토콘드리아 유입 분석(import assay). 분리된 미토콘드리아 분획에서의 재조합 단백질의 유입을 약간 변형시킨 문헌[Young et al, Cell, 112:41-50, (2003)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, 분리된 마우스 뇌 미토콘드리아를 기술된 바와 같이 250 mM 수크로오스, 80 mM 아세트산칼륨, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 5 mM 아세트산마그네슘을 함유하는 MC 완충액 중에서 세척하였다. 시험관내 전사되고 번역된 35S-표지된 단백질을 1부피의 MCS 완충액(500 mM 수크로오스, 80 mM 아세트산칼륨, 20 mM HEPES-KOH(pH 7.5), 5 mM 아세트산마그네슘)으로 희석시키고, 1 μM의 발리노마이신의 존재 또는 부재하에서 30℃에서 1시간 동안 정제된 미토콘드리아(30 μg)를 갖는 50 μl의 전체 부피로 혼합시켰다. 샘플을 얼음 상에서 냉각시키고, 0℃에서 10분 동안 50 μg/ml의 단백질분해효소 K를 처리하였다. 단백질 분해성 절단을 1 mM PMSF를 첨가하여 중지시키고, 10분 동안 6,000xg에서의 원심분리에 의해 미토콘드리아를 다시 분리시켰다. 미토콘드리아로의 차별적 단백질 유입을 자가방사선술에 의해 결정하였다.
면역침전, 풀 다운 검정 및 친화성 크로마토그래피. 분리된 Raji 미토콘드리아를 일정한 교반하에서 4℃에서 1시간 동안 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.4, 1% Triton X-100, 0.5% IGEPAL CA-630 + 프로테아제 억제제(Roche)를 함유하는 완충액 중에서 용해시켰다. 4℃에서 10분 동안 13,000 x g에서의 원심분리 후, 상층액을 4℃에서 3시간 동안 단백질 G-아가로오스 비드(Calbiochem)로 예비정제(preclear)시키고, 200 μg의 예비정제된 단백질 추출물을 CsA(5 μM) 또는 GA(10 μM)의 존재 또는 부재하에서 4℃에서 16시간 동안 Hsp90 또는 TRAP-1에 대한 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 침전된 면역 복합체를 용해 완충액에서 세척하고, 결합된 단백질을 SDS 겔 전기영동에 의해 분리시키고, 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 풀 다운 실험을 위해, GSH-비드-결합된 GST-CypD, GST-TRAP-1, 또는 GST-Hsp90을 20 mM Hepes, pH 7.7, 75 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 2.5 mM MgCl2, 0.05% NP40, 1 mM DTT + 1 mg/ml BSA를 함유하는 H-완충액으로 블로킹시켰다. 블로킹된 비드를 CsA 또는 GA의 존재하에서 4℃에서 16시간 동안 H-완충액 중의 정제된 재조합 단백질 또는 35S-표지된 단백질과 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 종결시, 펠렛화된 비드를 H 완충액에서 세척하고, 결합된 단백질을 SDS 겔 전기영동에 의해 분리시키고, 웨스턴 블로팅 또는 자가방사선술로 분석하였다. 생체내 포획 검정을 위해, GST 또는 GST-CypD를 CsA (5 μM) 또는 (10 μM) GA의 존재하에서 4℃에서 16시간 동안 H-완충액 중에서 분리된 Raji 미토콘드리아와 함께 혼합시켰다. 결합된 단백질을 세척하고, 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 몇몇 실험에서, 쉬페르딘 또는 스크램블된 펩티드 모방체(5 mg/ml)를 세파로오스 비드에 커플링시키고, 정제된 Raji 미토콘드리아를 분회화시키기 위해 사용하였다. 세척 후, 결합된 물질을 0.1 M glycine, pH 2.5를 이용하여 용리시키고, 즉시 중화시키고, 웨스턴 블로팅으로 분석하였다.
시토크롬 c 방출. 종양 세포 유형을 대조군 또는 다양한 Hsp90 길항제로 처리하고, 세포질 추출물을 5 내지 30분의 증가하는 시간 간격으로 수거하고, 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 세포 비함유 시스템에서의 실험을 위해, 정제된 미토콘드리아(20 μg)를 500 μl의 SB 완충액(0.2M 수크로오스, 10 mM Tris-MOPS, pH 7.4, 5 mM 숙시네이트, 1 mM 인산나트륨, 10 μM EGTA-Tris, 및 2 μM 로테논)에 현탁시켰다. 샘플을 22℃에서 20분 동안 대조군 또는 다양한 Hsp90으로 처리하였다. 각각의 인큐베이션 반응 종료시, 10분 동안 6,000 x g에서의 원심분리에 의해 미토콘드리아 및 상층액을 분리시키고, 웨스턴 블로팅으로 분석하였다.
미토콘드리아 막 전위. Raji 세포를 쉬페르딘 또는 대조군인 스크램블된 펩티드 모방체(100 μM) 또는 17-AAG(5 μM)로 처리하고, 미토콘드리아 막 전위 민감성 형광 염료 JC-1을 로딩시키고, 유세포분석에 의해 녹색/적색 형광 비의 변화에 대해 분석하였다. 세포 비함유 시스템에서의 실험을 위해, 정상적인 일차 세포, 다양한 종양 세포 유형, 또는 정상 마우스 기관으로부터 분리된 정제된 미토콘드리아를 SB 완충액에 현탁시켰다. 샘플(100 μg)을 SB 완충액 중의 0.1 μM 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM)와 함께 인큐베이션시키고, CsA(5 μM)의 존재 또는 부제하에서 쉬페르딘 또는 대조군인 스크램블된 펩티드 모방체(0.5-1.5 μM), 17-AAG(1.5 μM), 또는 ANT-GA(1-1.5 μM)로 처리하고, 549 nm 여기 및 575 nm 방출(Photon Technology International, Inc)에서 연속적으로 분석하였다. 상기 실험을 위해, SB 완충액 중의 TMRM-로딩된 미토콘드리아를 안정적인 형광에 도달하도록 하였고, 이를 완전히 분극화된 상태(최대 막 전위)로 설정하였다. 2 mM CaCl2 처리 후의 형광 밀도를 최대 막 전위(완전히 분극화된 상태)로 설정하였다. 각각의 처리 후의 형광 밀도의 변화를 최대 막 전위와 최소 막 전위 사이의 비로 작도하였다. 몇몇 실험에서, HeLa 또는 MCF-7 세포로부터 분리된 TMRM-로딩된 미토콘드리아의 증가하는 농도(10-100 μg)를 3 ml의 SB 완충액에 희석시키고, BSA를 이용하여 500 μg의 전체 단백질 농도로 표준화시키고, 대조군 또는 다양한 Hsp90 길항제에 대한 반응에서의 막 전위의 변화에 대해 분석하였다.
미토콘드리아 기능. 정상 또는 종양 미토콘드리아(100 μg)에 0.1 mM 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM)를 로딩하고, CsA의 존재 또는 부재하에서 가미트리닙 또는 17-AAG와 함께 인큐베이션하고, 549 nm 여기 및 575 nm 방출(Photon Technology International, Inc.)에서의 내막 전위의 변화에 대해 연속적으로 분석하였다. 2 mM CaCl2의 처리 후의 형광 강도가 완전히 분극화된 상태에 해당하였다. 대안적으로, H460 세포를 형광 염료 JC-1(Molecular Probes)로 표지하고, 다변수 유세포분석에 의해 다양한 작용제의 처리 후의 적색/녹색(F1-2/F1-1) 형광 비의 변화에 대해 분석하였다. 분리된 약물 처리 미토콘드리아의 펠렛 또는 상층액 내의 시토크롬 c 함량을 웨스턴 블로팅에 의해 결정하였다.
세포 사멸 분석. 세포 생활력의 조절을 MTT에 의해 결정하였다(Kang et al., "Regulation of tumor cell mitochondrial homeostasis by an organelle- specific Hsp90 chaperone network," Cell, 131 :257-270 (2007)). 아폽토시스의 결정을 위해, 세포를 다변수 유세포분석에 의해 CaspaTag(Intergen, Burlington, MA)를 이용하여 카스파아제 활성(DEVDase 활성) 및 원형질막 온전성(프로피듐 요오다이드)에 대해 분석하였다(Kang et al., "Regulation of tumor cell mitochondrial homeostasis by an organelle-specific Hsp90 chaperone network," Cell, 131:257-270 (2007)).
Hsp90 기능의 분석. GA-비드 경쟁 실험을 위해, SkBr3 유방암 세포를 TNESV 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4,1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM 소듐 오르토바나데이트, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, ml당 20 μg의 아프로니닌 및 류펩틴)에서 용해시켰다. 상층을 정화시키기 위한 원심분리 후, 용해질을 30분 동안 얼음 상에서 0, 0.5, 1 또는 10 μM 가미트리닙, 또는 0, 0.05, 0.1 또는 0.5 μM의 GA와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 용해질(동등한 단백질)을 GA-비드 침전을 이용하는 Hsp90의 친화성 정제에 적용시키고, 이전의 문헌[Marcu et al., "Novobiocin and related coumarins and depletion of heat shock protein 90-dependent signaling proteins," J Natl Cancer Inst, 92:242-248 (2000)]에 기재된 바와 같이 Hsp90에 대해 블로팅하였다. 용해질에 남아있는 Hsp90의 수준을 웨스턴 블로팅에 의해 시각화된 Hsp90 밴드의 스캐닝 및 이미지 분석에 의한 농도계측식 정량으로 결정하였다. 데이터는 동일한 결과를 갖는 2개의 독립적인 실험을 나타내었고, 이는 가미트리닙이 Hsp90 결합에 대한 GA-비드와의 경쟁에서 GA 만큼 효과적임을 나타낸다.
다른 실험에서, 샤페론-의존성 GST-Chk1 구성을 이전에 기술된 바(Arlander et al, "Chaperoning checkpoint kinase 1 (Chkl), an Hsp90 client, with purified chaperones," J Biol Chem, 281 :2989-2998 (2006))와 같이 결정하였다. 간단히, 각각의 샘플은 0.7 μg의 수지 결합된 GST-Chk1(잔기 1-265), 1 μg의 정제된 인간 Hsp90α, 및 다음과 같은 양의 다른 정제된 샤페론 단백질을 함유하였다: 10 μg Hsp70, 2 μg Hdj1, 2 μg p50cdc37, 0.06 유닛 CK2, 2.5 μg p60Hop. 가미트리닙 또는 17-AAG의 존재 및 부재하에서의 Cdc25의 Chk1-의존성 인산화로 인한 광학 밀도를 결정하고, 첨가되는 샤페론 단백질이 결핍된 샘플을 초과하는 활성화의 배수로써 작도하였다. 몇몇 실험에서, HeLa 세포를 24시간 동안 가미트리닙(G1-G4) 또는 17-AAG(5 μM)로 처리하고, 분리된 추출물을 웨스턴 블로팅에 의해 Akt 또는 Hsp70 발현의 조절에 대해 분석하였다.
세포 영상화. 형광 표지 연구를 위해, HeLa 세포를 미토콘드리아 마커인 미토트래커(MitoTracker)의 존재하에서 FITC-컨쥬게이션된 쉬페르딘 또는 세포 투과성의 스크램블된 펩티드 모방체와 함께 인큐베이션하였다. 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) CSU-10 스피닝-디스크 동일초점 스캐너(spinning-disc confocal scanner)를 이용하여 도립현미경(Zeiss Axiovert 200) 상에서 이미지를 포착하였다. 하마마츠(Hamamatsu) ORCA 카메라를 이용하여 전체 세포에 대해 0.3 μm마다 Z-섹션을 수집하고, 메타모르프(Metamorph) 6.3r5(Universal Imaging Corp.)를 이용하여 투영으로 제시하였다. 저속 촬영 비디오현미경(time lapse videomicroscopy)을 위해, HeLa 세포를 35 mm 유리-바닥 조직 배양 접시(Mat-tek)에서 유지시켰다. 영상화 전, 세포를 15분의 성장 조건하에서 400 nM CM-H2XRos(M7513, 분자 프로브)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 새로운 배지를 첨가하고, 세포를 37℃에서 CO2 교환(0.5 리터/분)과 함께 완전 배지 중에서 환경 챔버(PDMI-2; Harvard Apparatus)에서 이미지를 획득하였다. 세포를 도립현미경(Olympus IX-70) 상에서 녹색 간섭 필터를 갖는 100x 위상차(phase contrast) 렌즈를 이용하여 1분마다 이미지를 획득하였다. 쿨스냅(CoolSnap) HQ CCD 카메라(Roper Scientific)에서 이미지를 획득하고, 메타모르프 소프트웨어(Metamorph software)(Universal Imaging Corp.)를 이용하여 연결시켰다. 세포를 처음 저속 촬영의 10분 동안 임의의 시약의 부재하에서 이미지를 획득하고, 이 시점에서 쉬페르딘 또는 세포 투과성의 스크램블된 펩티드 모방체를 획득 사이에 적가하였다. CM-H2XRos 표지의 존재하에서 미토콘드리아의 위상차 이미지를 확인하였다. 몇몇 실험에서, 분리된 미토콘드리아를 ANT-GA로 평형화시키고, 50 μg/ml 단백질분해효소 K로 처리하고, 형광 현미경으로 분석하였다.
전자 현미경. 분리된 HeLa 세포 미토콘드리아를 37℃에서 10분 동안 3% 포름알데히드 및 0.1% 글루타르알데히드(EM 등급)에서 고정시키고, 22℃에서 60분 동안 PBS 중의 50 mM NH4Cl, pH 7.4에서 아미니데이트 유리 알데히드로 인큐베이션시키고, 100%까지의 점진적인 일련의 에탄올을 통해 탈수시키고, 22℃에서 밤새 50:50(v/v)의 수지(Lowicryl K4M):100% 에탄올의 혼합물로 이동시켰다. 샘플을 새로운 수지(x3)의 분취량으로 이동시키고, 60℃에서 24시간 동안 엠베딩(embedding) 캡슐을 충전하도록 적용시켰다. 초미세절단기(Reichert-Jung Ultracut E)를 이용하여 얇은 섹션을 절단하고, 금 지지체 리드(rid)에 두고, 22℃에서 30분 동안 블로킹(Zymed)시키고, Hsp90의 N-도메인 또는 대조군인 비결합 IgG에 대한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 금 컨쥬게이션된 이차 항체(1:20, Jackson ImmunoResearch Laboratories)의 첨가 후, 샘플을 세척하고, 22℃에서 1시간 동안 OsO4 증기에 노출시키고, 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 후염색시키고, 문헌[Dohi et al, J. Clin. Invest. 114(8): 1117-27, (2004)]에 기재된 바와 같이 80 kV에서 필립스 EM10 전자현미경(Philips EM10 electron microscope)에서 분석하였다.
세포 생활력 및 아폽토시스 분석. 정상 또는 종양 세포 유형을 37℃에서 1-2.5시간 동안 증가하는 농도의 Hsp90 길항제 또는 이의 각각의 대조군(세퍼딘, 0-150 μM; 17-AAG, 0-100 μM; ANT-GA, 0-100 μM)을 처리하고, MTT 검정에 의해 세포 생활력의 상실에 대해 분석하였다(Plescia et al., Cancer Cell, 7:457-468, (2005)). 대안적으로, HeLa 세포를 CypD 억제제인 CsA(1 μM)로 처리하거나, 대조군인 비표적화된 siRNA 또는 CypD에 대한 스마트풀(SmartPool) siRNA(Dharmacon)로 트랜스펙션시키고, 48시간 후에 쉬페르딘 또는 대조군인 스크램블된 펩티드 모방체와 함께 인큐베이션시키고, MTT에 의해 세포 생활력에 대해 분석하였다. 다른 실험에서, HeLa 세포를 대조군인 비표적화된 siRNA 또는 TRAP-1-특이적 siRNA(Dharmacon)로 트랜스펙션시키고, CsA(1 μM)의 존재 또는 부재하에서 인큐베이션시키고, 48시간 후에 MTT에 의해 세포 생활력을 분석하였다. siRNA 표적화의 다양한 실험에서의 단백질 발현의 변화를 웨스턴 블로팅으로 평가하였다. TRAP-1-특이적 세포보호의 분석을 위해, 원발성의 형질전환되지 않은 인간 섬유모세포 HFF 및 WS-1을 24시간 동안 리포펙타민(lipofectamine)에 의해 대조군 pcDNA3 또는 TRAP-1 cDNA로 트랜스펙션시키고, 증가하는 농도(0-1 μM)의 세포 사멸 자극 스타우로스포린(STS)에 노출시키고, MTT에 의해 추가적인 24시간의 인큐베이션 후에 세포 생활력에 대해 분석하였다. 아폽토시스의 분석을 위해, p53+/+ 또는 p53-/- HCT116 세포를 대조군 또는 ANT-GA(100 μM)로 처리하고, 문헌[Dohi et al, J. Clin. Invest. 114(8): 1117- 27, (2004); Plescia et al., Cancer Cell, 7:457-468, (2005)]에 기재된 바와 같이 자극성 다변수 유세포분석에 의해 DEVDase 활성(CaspaTag) 및 프로피듐 요오다이드 염색에 대해 분석하였다.
조직 획득 및 면역조직화학.
인간 유방 선암종, 췌장 선암종, 폐 선암종, 결장 선암종, 및 이의 각각의 정상 조직의 익명의 일차 수술 표본을 유매스 메모리얼 암센터 조직 은행(UMass Memorial Cancer Center Tissue Bank)으로부터 식별자 없이 수득하였다. 조직 표본을 완충된 포르말린에서 고정시키고, 파라핀에 엠베딩시켰다. 조직 염색을 위해, 섹션을 파라핀 제거하고, 물에 재수화시키고, 내인성 과산화효소에 대해 켄칭시켰다. 에피토프 가열 회복(Epitope heat retrieval)을 60분 동안 10% 시트르산나트륨에서 슬라이드에 김을 쏘임으로써 수행하였다. 가공된 슬라이드를 PBS 중에서 헹구고, 표준 아비딘-비오틴-과산화효소 기술(Histostain-plus, Zymed Laboratories)을 이용하여 TRAP-1 또는 대조군 IgG에 대한 항체로 염색하였다. 슬라이드를 색소원으로 DAB와 함께 인큐베이션하고, 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 각각의 병리조직학적 진단 마다 2개의 독립적인 증례(case), 및 각각의 정상 조직은 동일한 결과를 이용하여 분석하였다.
통계적 분석. 데이터를 윈도우용의 그래프패드 소프트웨어 패키지(Prism 4.0)에서의 양측성의 언페어드 t 검정(two-sided unpaired t test)을 이용하여 분석하였다. 0.05의 p 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
기타 구체예
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기재되었으나, 전술한 기재는 예시를 위한 것으로, 첨부된 청구항의 범위의 의해 규정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아님이 이해되어야 한다. 기타 양태, 이점, 및 변형이 하기 청구항의 범위에 속한다.

Claims (41)

  1. 하기 화학식, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물(composition):
    A-B,
    상기 식에서, A는 분자 샤페론 억제자(molecular chaperone inhibitor)이고 B는 미토콘드리아-관통성 모이어티(mitochondria-penetrating moiety)이며 A와 B는 연결 모이어티에 의해 연결되거나 연결 모이어티 없이 연결되고,
    여기서 A가 쉬페르딘(Shepherdin) 또는 이의 단편인 경우, B는 안테나페디아 헬릭스 III 호메오도메인 세포-관통성 펩티드(Antennapedia helix III homeodomain cell-penetrating peptide; ANT) 또는 이의 단편이 아니다.
  2. 제 1항에 있어서, A가 안사마이신(Ansamycin) 클래스 Hsp90 억제자; 젤다나마이신 유사체 Hsp90 억제자; 퓨린-스캐폴드 클래스 Hsp90 억제자; 레조르시놀 Hsp90 억제자; 및 매크로락톤-Hsp90 억제자로 구성된 군에서 선택된 소분자인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, A가 Hsp90의 펩티드 억제자인, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, A가 서열번호 2(His-Ser-Ser-Gly-Cys)를 포함하는 쉬페르딘 펩티드인, 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, A가 Hsp90에 결합하고 이를 억제시키는, 서열번호 1과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 펩티드인, 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, B가 미토콘드리아 관통성 펩티드인, 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, B가 마이토푸신(mitofusin) 펩티드, 미토콘드리아 표적성 신호 펩티드, TAT 펩티드, ANT 펩티드, VP22 펩티드, 또는 Pep-1 펩티드로 구성된 군에서 선택된 것인, 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, B가 RNA 미토콘드리아 관통성 신호인, 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, B가 구아니딘-풍부 펩토이드(guanidine-rich peptoids), 구아니딘-풍부 폴리카바메이트(guanidine-rich polycarbamates), β-올리고아르기닌, 및 프롤린-풍부 덴드리머(proline-rich dendrimers)로 구성된 군에서 선택된 것인, 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, A가 17-알릴아미노-데메톡시젤다마이신(17-AAG)을 포함하는, 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, A가 라디시콜(radicicol)을 포함하는, 조성물.
  12. 제 1항에 있어서, A가 퓨린-스캐폴드 클래스 Hsp90 억제자를 포함하는, 조성물.
  13. 제 1항에 있어서, A가 17-디메틸아미노젤다나마이신을 포함하는, 조성물.
  14. 제 1항에 있어서, B가
    Figure pct00031
    이고,
    여기서, R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 RaRbRcSi이고, Ra, Rb, 및 Rc는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인, 조성물.
  15. 제 1항에 있어서, B가
    Figure pct00032
    이고, Ra, Rb, 및 Rc가 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되고; n이 1, 2, 또는 3인, 조성물.
  16. 제 1항에 있어서, B가 (아릴)3P-인, 조성물.
  17. 제 1항에 있어서, B가
    Figure pct00033
    인, 조성물.
  18. 제 1항에 있어서, A가
    Figure pct00034
    이고,
    여기서, R2가 H, 알킬, 아릴, 또는 아릴알킬이고; R3가 H, 알킬이고; R4가 H, 알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 또는 ORd이고, 여기서 Rd가 H, 알킬, 또는 아릴알킬인, 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, R2가 H 또는 알킬이고; R3가 H, 알킬이고; R4가 H, 또는 ORd이고, 여기서 Rd가 H, 알킬인, 조성물.
  20. 제 18항에 있어서, R2가 H이고; R3가 메틸이고; R4가 H인, 조성물.
  21. 제 10항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, B가 ANT 또는 이의 미토콘드리아-관통성 단편인, 조성물.
  22. 제 1항에 있어서, A와 B 사이에 연결 모이어티를 포함하는, 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 연결 모이어티가 펩티드 링커 및 화학적 링커로 구성된 군에서 선택된 것인, 조성물.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 링커 모이어티가 2가이고 알킬렌, 알케닐렌, 아키닐렌, 시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 및 펩티드 링커로 구성된 군에서 선택되며, 상기 알킬렌, 알케닐렌, 또는 아키닐렌의 임의의 2개의 인접한 탄소-탄소 결합은, O, NH, S, PRe, C(O)NRf, 아릴렌, 헤테로시클로알킬렌, 또는 헤테로아릴렌 중 하나 이상으로 대체되거나 비대체될 수 있고; 여기서 Re 및 Rf는 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택되는, 조성물.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 링커 모이어티가:
    Figure pct00035
    인, 조성물.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 링커 모이어티가 알킬렌인, 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 링커 모이어티가 6개의 탄소 원자를 지니는 알킬렌인, 조성물.
  28. 제 1항에 있어서, A-B가 하기 화학식을 갖는, 조성물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00036

    여기서, R1은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 RaRbRcSi이고;
    R2가 H, 알킬, 아릴, 또는 아릴알킬이고;
    R3가 H, 알킬이고;
    R4가 H, 알킬, 알케닐, 아릴, 아릴알킬, 또는 ORd이고, 여기서 Rd가 H, 알킬, 또는 아릴알킬이고;
    Ra, Rb, 및 Rc가 알킬 또는 아릴중에서 독립적으로 선택되고;
    n이 1 내지 10 중의 정수이다.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 염이 헥사플루오로포스페이트 염인, 조성물.
  30. 제 26항에 있어서, R1이 RaRbRcSi이고, 여기서 Ra, Rb, 및 Rc가 알킬 또는 아릴중에서 독립적으로 선택되고; R2가 H이고; R3가 H, 알킬이고; R4가 H이고; n이 1, 2, 3, 또는 4인, 조성물.
  31. 제 1항에 있어서, A-B가
    Figure pct00037

    Figure pct00038

    및
    Figure pct00039

    중에서 선택되는 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 염이 헥사플루오로포스페이트 염인, 조성물.
  33. 제 1항에 있어서, A-B가
    Figure pct00040
    이고,
    여기서 q가 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
    X가 약제학적으로 허용되는 카운터-이온인, 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, q가 3인, 조성물.
  35. 제 33항에 있어서, 아릴이 페닐이고 q가 3인, 조성물.
  36. 제 33항에 있어서, X가 헥사플루오로포스페이트인, 조성물.
  37. 제 1항에 있어서, A-B가
    Figure pct00041
    인, 조성물.
  38. 암 세포 사멸을 유도하는데 충분한 양으로 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항의 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 피검체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양 세포 사멸을 유도하는 방법.
  39. 암 또는 종양을 지니는 피검체를 식별하는 단계;
    상기 암 또는 종양의 세포가 대조 세포와 비교하여 샤페론의 증가된 미토콘드리아 농도를 지니는지 여부를 결정하는 단계;
    상기 피검체가 상기 샤페론의 증가된 미토콘드리아 수준을 지니는 경우, 하기 화학식을 포함하는 미토콘드리아-표적화된 샤페론 억제자를 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양 세포 사멸을 유도하는 방법:
    A-B,
    상기 식에서, A는 샤페론 억제자이고 B는 미토콘드리아-관통성 모이어티이고 A 및 B는 연결 모이어티에 의해 연결되거나 비연결된다.
  40. 하나 이상의 샤페론 및 시클로필린(Cyclophilin) D를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 샘플과 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
    상기 시험 물질의 존재 및 부재시에 상기 샘플내의 상기 샤페론 및 시클로필린 D의 결합을 검출하는 단계로서, 여기서 결합을 억제하는 시험 물질은 샤페론 활성을 억제시키는 후보 물질인, 단계;를 포함하는, 샤페론 활성을 억제시키는 후보 물질을 식별하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 샤페론이 Hsp60, HspA9, Hsp90, 또는 TRAP-1인, 방법.
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