KR101406278B1 - 독소루비신 및 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 독소루비신 및 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 약물의 병용 처리는 독소루비신의 부작용을 최소화하면서 상승적 항암 효과를 나타낼 수 있으므로, 다양한 암의 치료에 보다 안전하고 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

독소루비신 및 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF A CANCER COMPRISING DOXORUBICIN AND GAMITRINIB AS ACTIVE INGREDIENTS}

본 발명은 독소루비신 및 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

하기 화학식 1의 안트라사이클린 항생제인 독소루비신(doxorubicin, DOX, 제품명: 아드리아마이신)은 가장 효과적인 항암제 중 하나로서 유방암을 포함하는 수많은 고형암 외에도, 급성 백혈병 및 악성 림프종 등에 광범위하게 사용되고 있다. DOX 및 기타 안트라사이클린 유사물질은 주로 DNA 토포이소머라아제 II를 억제하여 DNA를 손상시킴으로써 항종양 활성을 나타낸다(Minotti G et al., Pharmacol . Rev., 56:185-229, 2004; Wang, J. C., Annu . Rev . Biochem ., 65:635-692, 1996). 또한, DOX는 산소 유래 자유 라디칼을 생성하여 종양 조직에 손상을 가하며, 이는 한편으로는 심근병증(cardiomyopathy)의 원인이 된다.

<화학식 1>

하지만, 상기 유용성에도 불구하고, DOX는 누적 용량과 치료 스케줄에 따라 정상 세포에 대해 빈맥, 저혈압, 울혈성 심부전 등의 심각한 심장독성(cardiotoxicity)을 야기하는 문제가 있어, 제한적으로 사용되고 있다. 또한, 상기 심장독성은 다른 항종양제와 병용 투여시 낮은 누적 용량에서도 유발되는 단점이 있다. 이에 DOX를 장기적으로 지속해서 주입하거나, 독성이 낮은 DOX 유사물질을 개발하거나, 항산화제 또는 철 킬레이트제와 병용하거나, 대안적인 약물 전달 시스템을 개발하고자 하는 시도가 진행되고 있으나, 아직 심장독성을 완화할 수 있는 효과적인 방법은 개발되지 않은 실정이다. 따라서, 상기 DOX의 부작용을 개선시킬 수 있는 새로운 방법이 요구된다.

열 충격 단백질 90(heat shock protein 90, Hsp90)은 클라이언트(client) 단백질의 안정성 및 활성을 조절하는 ATP 의존성 샤페론(chaperone) 분자로서, 일반적으로 거의 모든 암세포에서 과발현되며, 정상 세포보다 암세포에서 높은 활성을 갖는다. Hsp90은 암세포 생존 및 종양형성을 돕는 여러 중요한 세포 신호전달 분자를 안정화시키는 역할을 한다. 따라서, Hsp90 억제제와 같은 Hsp90을 억제할 수 있는 물질이 항암제로 사용될 수 있을 것으로 여겨지며, 실제 이들 중 일부가 임상시험 중에 있다. 암세포의 생존에 Hsp90 및 그의 미토콘드리아 동족체(homolog)인 종양 괴사 인자 수용체-관련 단백질 1(TRAP-1)의 미토콘드리아 풀(pool)이 중요하다고 보고되었다. 암세포에서는 미토콘드리아 샤페론이 과발현되는 반면, 정상세포에서는 상기 샤페론이 거의 검출되지 않는 것으로 나타났다. 상기 미토콘드리아 샤페론은 미토콘드리아 내막에 있는 투과성 변이공(permeability transition pore)의 조절 성분인 사이클로필린 D(cyclophilin D, Cyp-D)에 결합하여, 그 기공 열림(pore opening) 활성을 없애 세포 사멸의 개시를 억제한다.

하기 화학식 2의 구조를 갖는 개미트리닙(gamitrinib, GA mitochondrial matrix inhibitor)은 미토콘드리아 Hsp90 억제제로서, 조합 화학(combinatorial chemistry)에 의해 개발되었다(Kang et al., J. Clin . Invest ., 119:454-464). 개미트리닙은 미토콘드리아로 약물을 전달하는 부위와 목적 단백질을 저해하는 부위 및 이들을 연결하는 링커(linker)로 이루어져 있다. 상기 약물전달부위는 사이클릭 구아니디늄(cyclic guanidinium)이 1개부터 4개까지 연결된 구조 혹은 트리페닐 포스포늄(triphenyl phosphonium) 하나로 이루어진 구조로 되어 있고 이들 구조에 따라서 G1, G2, G3, G4 또는 TPP로 개미트리닙을 구분한다. 개미트리닙은 목적단백질인 Hsp90와 TRAP-1을 저해하기 위해서 이들의 ATP 포켓에 결합하는 젤다나마이신(geldanamycin)을 포함하고 있다.

<화학식 2>

개미트리닙은 미토콘드리아 막 전위(△Ψ_m)를 급격히 감소시키며, 사이토크롬 c를 세포질 내로 방출시키고, 암세포에서 부수적인 거대 세포를 사멸시키며, 다양한 마우스 종양 이식 모델 및 유전학적 마우스 모델에서 종양 성장 및 발전을 효과적으로 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 보고에 따르면, 개미트리닙은 미토콘드리아에서 미접힘(unfolded) 단백질 반응을 유발하고, 부수적으로 NF-κB 신호전달 경로를 억제하며, 종양 세포를 아폽토시스성 세포사멸에 민감하게 할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명자들은 효과적인 암 치료를 위해 DOX의 부작용을 최소화시키고자 부단히 노력하던 중, 개미트리닙을 DOX와 병용투여하는 경우, DOX의 부작용을 최소화하면서 동시에 종양 치료 효능을 증대시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 독소루비신의 부작용을 최소화하면서 상승적 효과를 갖는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 독소루비신 및 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 독소루비신과 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 작용 메커니즘이 전혀 다른 독소루비신과 개미트리닙이 조합되어 독소루비신의 부작용을 최소화하면서 상승적 항암 효과를 나타낼 수 있으므로, 다양한 암의 치료에 보다 안전하고 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1A 내지 1C는 독소루비신(DOX) 단독 처리 또는 독소루비신과 개미트리닙(G-TPP)의 병용 처리에 의한 난소암 세포주(SK-OV3), 전립선암 세포주(CWR22rv) 및 자궁경부암 세포주(HeLa)의 생존율을 보여주는 그래프이고, 도 1D는 상기 약물들의 단독 또는 병용 처리에 의한 각 세포주의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 2A는 HeLa 세포주에 DMSO 단독, 독소루비신 단독(0.25 μM) 및 개미트리닙 단독(2.5 μM), 및 독소루비신과 개미트리닙을 병용(0.25 μM + 2.5 μM) 처리한 후 유세포분석기에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 2B는 SK-OV3 및 CWR22rv에 DMSO 단독, 독소루비신 단독, 개미트리닙 단독, 및 독소루비신과 개미트리닙을 병용 처리한 후, 캐스파아제 활성화를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이며, 도 2C는 CWR22rv 세포주에 DMSO 단독, 독소루비신 단독(0.25 μM), 개미트리닙 단독(2.5 μM), 독소루비신과 개미트리닙 병용, 및 독소루비신, 개미트리닙과 zVAD-fmk를 병용 처리한 다음, DMSO 대조군에 대한 퍼센트 생존율을 측정한 결과이다.
도 3A는 대조군 세포주와 Bcl-2 발현 세포주에서의 Bcl-2 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 결과이고, 도 3B 내지 3D는 상기 세포주에 개미트리닙 단독, 독소루비신 단독, 및 이들을 병용 처리한 다음, MTT 분석에 의해 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4A는 미토콘드리아 막 투과성에 대한 약물 효과를 나타내는 결과로서, 전립선암세포주 CWR22rv에 독소루비신(0.5 μM) 단독, 개미트리닙(5 μM) 단독, 및 독소루비신과 개미트리닙을 병용 처리한 후, JC-1 염색하여 유세포분석기에 의해 분석한 결과이고, 도 4B는 미토콘드리아의 막 전위를 나타낸 결과로서, CWR22rv에 독소루비신(0.5 μM) 단독, 개미트리닙(5 μM) 단독, 및 독소루비신과 개미트리닙을 병용 처리한 후, JC-1 염색하여 유세포분석기에 의해 분석한 결과이고, 도 4C는 CWR22rv로부터 분리한 미토콘드리아에 DMSO 단독, G-TPP 단독, DOX 단독, 및 DOX+G-TPP 병용 처리한 후, 미토콘드리아 펠렛(P) 및 상층액(S)을 대상으로 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이며, 도 4D는 Bcl-2 발현 HeLa 세포주를 미토트랙커(Mitotracker, 녹색)로 표지화한 후, 10 μM DOX(적색)으로 24시간 처리하여 공초점 현미경으로 분석한 결과이다.
도 5A는 마우스 심장으로부터 분리한 정상 미토콘드리아에 DMSO 단독, DOX 단독(1 μM), G-TPP 단독(10 μM), DOX와 G-TPP 병용 처리, 및 양성 대조군으로서 Ca^{2 +}와 함께 배양한 다음, JC-1으로 라벨링하고, 유세포분석기에 의하여 분석한 결과이고, 도 5B는 심장 미토콘드리아로부터 사이토크롬 c 방출을 조사한 결과로서, 미토콘드리아에 약물을 처리한 다음, 미토콘드리아 펠렛(P) 및 상층액(S)을 대상으로 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 도 5C는 랫트 심장 유래 세포에 약물 처리 후 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 6A는 약물의 병용 처리 후 17일간 종양 크기를 측정한 그래프이고, 도 6B는 17일째의 종양 크기를 나타낸 것이며, 도 6C는 약물 처리 초기 및 말기에 각 군의 마우스의 체중을 측정하여 체중 백분율을 계산한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 방광암, 유방암, 위암, 폐암, 난소암, 갑상선암, 자궁경부암, 중추신경암, 교아종, 간암, 피부암, 췌장암, 위암, 대장암, 직장암, 식도암, 신장암, 폐암, 상피암, 혈액암, 전립선암, 연조직육종, 다발성 경화증 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "암의 치료" 또는 "항암"은 암을 갖는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서, 암이 진행되는 것을 억제하거나, 암을 경감시키는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 독소루비신 및 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분 중 하나인 독소루비신(doxorubicin)은 하기 화학식 1의 구조를 가지며, 방광암, 유방암, 위암, 폐암, 난소암, 갑상선암, 연조직육종, 다발성 경화증 등의 암 뿐만 아니라 백혈병 및 호지킨 림프종을 치료하는데 통상적으로 사용되고 있으며, 상표명 아드리아마이신(Adriamycin)으로 상업적으로 이용가능하다.

<화학식 1>

본 발명의 유효성분 중 하나인 개미트리닙 TPP(Gamitrinib-TPP)는 하기 화학식 3의 구조를 가지며, 전립선암을 비롯한 다양한 암종에서 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

<화학식 3>

개미트리닙은 미토콘드리아로 약물을 전달하는 부위(운반체)와 목적 단백질을 저해하는 부위(젤다나마이신) 및 이들을 연결하는 링커(linker)로 이루어져 있으며, 상기 약물전달부위의 구조에 따라 개미트리닙 G1, G2, G3, G4 또는 TPP로 구분된다. 모든 개미트리닙들은 미토콘드리아로 운반되어 Hsp90/TRAP1을 저해하는 공통된 작용기전을 가지고 있으나 운반체에 따라서 운반효능 및 약물 반응 속도에서 약간의 차이를 보인다. 본 발명에서 사용된 개미트리닙 TPP는 다른 개미트리닙과 비교하여 우수한 약물 반응 속도 및 경제적인 합성이 가능한 화합물이다. 상기 개미트리닙의 유기합성 과정은 문헌[J. Clin . Invest ., 2009, Mar, 119(3):454-64; US 2009/0099080]에 상세히 설명되어 있다. 본 발명은 개미트리닙 TPP를 이용하여 수행되었으나, 본 기술분야의 숙련자라면 다른 개미트리닙도 동일한 작용 기전을 가지므로 상기 개미트리닙 TPP 대신에 다른 개미트리닙을 사용하여도 동일한 효과를 얻을 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 개미트리닙 G1, G2, G3 및 G4를 사용하는 약학 조성물도 본 발명의 범주에 포함된다.

전술한 DOX 및 개미트리닙은 본질적으로 다른 약물 작용 메커니즘을 갖는다. DOX는 미토콘드리아-매개 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 유전자독성(genotoxic) 효과를 갖는 반면, 개미트리닙은 미토콘드리아 막 투과성을 직접적으로 촉발시킨다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 DOX 및 개미트리닙을 10:1 내지 1:10의 중량비, 바람직하게는 5:1 내지 1:5의 중량비로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 암 치료용 약학 조성물은 독소루비신을 0.1 내지 20 μM, 바람직하게는 0.25 내지 10 μM의 양으로 포함할 수 있으며, 개미트리닙을 1 내지 20 μM, 바람직하게는 2.5 내지 10 μM의 양으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 독소루비신 및 개미트리닙은 다양한 암세포의 성장을 상승적으로 억제하므로(실시예 1 및 6 참조), 포유동물, 바람직하게는 인간에 대한 암 치료 용도를 갖는다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 분야에서의 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 주사용 제제; 또는 연고제 등의 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다.

상기 독소루비신과 개미트리닙의 1회 투여량은 각각 1~50 mg/kg체중과 1~10 mg/kg체중이며, 바람직하게는 주 2회 수주에 걸쳐서 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 암세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 시험관내 암세포 성장 억제 효과 측정

본 발명에 따른 독소루비신 및 개미트리닙의 암세포 성장 저해 능력을 확인하기 위해, 시험 화합물을 다양한 암세포에 처리한 후, MTT 분석에 의해 암세포 생존율을 측정하였다.

구체적으로, 인간 난소암 세포주(SK-OV3, 한국세포주연구재단), 전립선암 세포주(CWR22rv, 한국세포주연구재단) 및 자궁경부암 세포주(HeLa, 한국세포주연구재단)를 96-웰 플레이트에 5x10³의 수로 세포를 분주하고, 100 μL의 배지(DMEM, RPMI, Lonza)에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고, 인간 난소암 세포주인 SKOV3와 자궁경부암 세포주인 HeLa에 대해 실험군으로서 0 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM 또는 10 μM 농도의 독소루비신(DOX) 및 0 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM 또는 10 μM 농도의 개미트리닙(G-TPP)을 조합한 배지를 처리하고, 전립선암 세포주인 CWR22rv에 대해 실험군으로서 0 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1.25 μM 또는 2.5 μM 농도의 독소루비신(DOX) 및 0 μM, 0.25 μM, 0.5 μM, 1.25 μM 또는 2.5 μM의 농도로 개미트리닙(G-TPP)을 조합한 배지를 처리하였다. 양성 대조군으로서 개미트립신 대신에 DMSO를, 음성 대조군으로서 DMSO가 단독으로 포함된 배지를 처리하여 24시간 배양 후, MTT 분석을 실시하였다. 0.5 mg/mL의 MTT 용액을 각 웰에 넣고 4 시간 동안 반응시킨 후 배지를 제거하고 DMSO를 가하여 포르마잔을 용해시키고 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 2회씩 3번 반복하여 수행하였고, 음성 대조군에 대한 퍼센트 생존율(percent viability)을 평균±SEM(standard error of the mean)으로 나타내었다.

난소암 세포주, 전립선암 세포주 및 자궁경부암 세포주에 대한 실험결과를 각각 도 1A 내지 1C에 나타내었다. 실험에 사용된 독소루비신 및 개미트리닙의 농도를 각 도에 표시하였다.

도 1A 내지 1C에서 보는 바와 같이, 독소루비신을 단독으로 처리한 대조군에 비해 독소루비신과 개미트리닙을 병용 처리한 실험군에서 암세포 생존율이 현저히 저하되었다. 특히, SK-OV3에 독소루비신을 단독 처리한 경우 10 μM의 농도에서도 세포 생존율에 큰 변화가 나타나지 않은 반면, G-TPP와 병용 처리시 암세포의 생존율이 현저히 감소하였다. 다른 암세포에서도 독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리는 암세포의 민감성을 증가시켜 증식 억제 효과를 나타내었다.

한편, 독소루비신 및 개미트리닙의 상승 효과를 확인하기 위하여, 실험군으로서 독소루비신과 개미트리닙을 병용하여 처리한 다음, 전술한 MTT 분석에 의해 암세포의 생존율을 측정하였다. 양성 대조군의 경우 독소루비신 또는 개미트리닙을 단독으로 처리하였고, 음성 대조군의 경우 DMSO를 단독으로 처리하였다. 독소루비신 및 개미트리닙(G-TPP)의 농도는 예비실험을 통해 확인된 최적 농도로서, SK-OV3, CWR22rv 및 HeLa에 대해 각각 10 μM DOX/10 μM G-TPP, 0.25 μM DOX/2.5 μM G-TPP 및 2 μM DOX/5 μM G-TPP였다.

실험결과를 도 1D에 나타내었다. 도 1D에서 보는 바와 같이, 독소루비신 단독 처리군 및 개미트리닙 단독 처리군의 경우 70~90% 정도의 생존율을 나타낸 반면, 독소루비신 및 개미트리닙 병용 처리군의 경우 30% 이하의 현저히 낮은 생존율을 나타내었다. 이는 독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리시, 단독 약물들의 상가(相加) 효과 이상의 상승 효과를 얻을 수 있음을 보여준다.

실시예 2: 병용 처리의 세포사멸 메커니즘 분석 (1)

독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리의 세포 사멸 메커니즘을 알아보기 위해, 약물 처리 후 유세포분석(flow cytometry)에 의해 캐스파아제(caspase) 활성화를 분석하였다.

구체적으로, CWR22rv 세포 주에 음성 대조군으로 DMSO를, 양성 대조군으로 독소루비신 단독(0.25 μM) 및 개미트리닙 단독(2.5 μM)을, 실험군으로 독소루비신 및 개미트리닙을 병용(0.25 μM + 2.5 μM)하여 처리한 다음, 캐스파태그(CaspaTag^TM) 캐스파아제-3/7(Caspase-3/7) In Situ 분석 키트 및 플루오레세인(Fluorescein; CHMICON)을 이용하여 활성 캐스파아제를 측정하였다. 각 시료를 빛을 차단한 상태에서 플루오레크롬 캐스파아제 억제제(Fluorechrome caspase inhibitor; FLICA)로 37℃에서 1시간 동안 염색한 다음, 세척 완충액으로 3회 세척하고 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)로 염색한 후 녹색 신호(Green signal, FL1)를 통해 세포 내 존재하는 활성 캐스파아제의 양을 유세포분석기(Beckman coulter, FC500)로 분석하였다.

실험결과를 도 2A에 나타내었다. 도 2A에서 보는 바와 같이, 양성 대조군인 독소루비신 단독 처리군 및 개미트리닙 단독 처리군의 경우, 음성 대조군인 DMSO 처리군에 비해 캐스파아제 활성이 약간 증가한 반면, 실험군인 병용 처리군의 경우 캐스파아제 활성 및 부수적인 세포 사멸이 급격하게 증가하였다. 상기 결과는 독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리가 캐스파아제 활성화에 의한 아폽토시스성 세포사멸을 촉진시킴을 입증한다.

병용 처리가 캐스파아제 활성화에 미치는 효과를 웨스턴 블롯을 통해 재확인하였다. 구체적으로, SK-OV3 및 CWR22rv에 음성 대조군으로서 DMSO를, 양성 대조군으로서 독소루비신 단독 및 개미트리닙 단독을, 그리고 실험군으로서 독소루비신과 개미트리닙을 병용하여 처리하였다. SK-OV3에는 10 μM DOX/10 μM G-TPP를 처리하였고, CWR22rv에는 0.25 μM DOX/2.5 μM G-TPP를 처리하였으며, 캐스파아제 억제제인 zVAD-fmk는 30 μM로 처리하였고, 이후 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포로부터 총 세포 용해물(total cell lysates)을 제조하여 전기영동하고, PVDF 막에 이동시킨 후, 막에 프로캐스파아제3 항체(Biosciences), 활성화된 캐스파아제3 항체(Biosciences), 파프 항체(Biosciences)를 4℃에서 24시간 동안 처리하였다. 다음날, 이차 항체(퍼옥시다아제가 접합되어 있는 마우스 항체, KPL)를 처리하고, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약(Western blotting Detection Reagent, Amersham)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.

상기 실험 결과를 도 2B에 나타내었다. 도 2B에서 보는 바와 같이, 독소루비신 및 개미트리닙 단독 처리군에서는 캐스파아제 활성화를 나타내지 않은 반면, 병용 처리군에서는 프로캐스파아제-3의 감소, 활성화된 절단형(cleaved form)의 캐스파아제-3의 생성, 및 캐스파아제 기질 단백질인 폴리(ADP-리보오스)폴리머라아제(PARP)의 절단과 같은, 캐스파아제 활성화를 나타내었다(도 2B). 또한, 캐스파아제 활성화를 억제하기 위해 범-캐스파아제 억제제인 zVAD-fmk(30 μM)를 사용한 경우, 병용 처리군에서 상기 캐스파아제 활성화가 완전히 사라졌는데(도 2B), 이는 독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리가 아폽토시스성 세포사멸을 활성화시킨다는 것을 입증한다.

한편, CWR22rv 세포주에 각각 DMSO 단독, 독소루비신 단독(0.25 μM), 개미트리닙 단독(2.5 μM), 독소루비신과 개미트리닙 병용, 및 독소루비신, 개미트리닙과 zVAD-fmk를 병용 처리한 다음, DMSO 대조군에 대한 퍼센트 생존율을 실시예 1에서와 같이 측정하였다. 실험은 2회씩 3번 수행하였고, 결과를 평균±표준편차로 나타내었다.

실험결과를 도 2C에 나타내었다. 상기 결과에서 보는 바와 같이, 독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리에 의하여 감소했던 생존율이 zVAD-fmk에 의해 다시 증가하였는데, 이는 독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리가 단독 처리와는 달리 캐스파아제 활성화에 의해 매개되는 아폽토시스성 세포사멸을 유도한다는 것을 추가로 입증한다.

실시예 3: 병용 처리의 세포사멸 메커니즘 분석 (2)

약물 상승작용의 메커니즘을 이해하기 위해, 내인성 아폽토시스성 경로인 Bcl-2 조절 미토콘드리아 경로를 억제하는 항아폽토시스성 단백질 Bcl-2를 과발현시킨 다음, Bcl-2 과발현이 병용 처리에 미치는 효과를 분석하였다.

<3-1> Bcl -2 과발현 세포주의 제조

인간세포에서 작용하는 발현 벡터인 pcDNA3.0(invtrogen) 및 PCR을 이용하여 증폭시킨 Bcl-2 유전자 서열(NM_000633.2, NCBI)을 제한효소 Hind III 및 Xho I으로 처리한 다음, 엑스핀 진올 겔 SV(Expin GeneAll Gel SV; GeneAll) 추출 키트를 이용하여 분리하고, T4-DNA 리가아제(NEB)를 이용하여 상기 벡터와 Bcl-2 유전자를 결합시켰다. 상기 생성된 재조합 발현 벡터를 pcDNA3-Bcl-2로 명명하였다. HeLa 세포를 100 ㎜ 디쉬에서 24시간 동안 배양한 후, pcDNA3-Bcl-2를 리포펙타민(Lipofectamin; invitrogen)을 이용하여 세포 내로 형질 감염시키고, 24시간 동안 배양하였다. 벡터 내에 포함되어 있는 항생제 내성을 이용하여 세포를 선별하기 위해, 배지를 1 mg/mL의 G418(invitrogen)이 첨가된 배지로 교환하고, 항생제 내성을 가진 세포가 콜로니(colony)로 증식할 때까지 배양하였다. 세포의 콜로니가 확립된 후 각 세포주를 분리하여 증식시켰고, 대조군으로는 공벡터(pcDNA3.0)를 사용하여 전술한 방법에 따라 형질 감염시켜 Bcl-2를 발현하지 않는 세포주를 제조하였다.

<3-2> Bcl -2 발현 확인

배양된 세포주로부터 총 세포 용해물(total cell lysates)을 제조하여 전기영동하고, PVDF 막에 이동시킨 후, Bcl-2 항체(Biosciences)를 이용하여 4℃에서 24시간 동안 처리하였다. 다음날, 이차 항체(퍼옥시다아제가 접합되어 있는 마우스 항체, KPL)를 처리하고, ECL Western blotting Detection Reagent(Amersham)을 이용하여 <3-1>에서 제조된 대조군 세포주와 Bcl-2 발현 세포주의 Bcl-2 발현을 비교하였다.

상기 결과를 도 3A에 나타내었다. 상기 결과에서 보는 바와 같이, 공벡터로 형질감염된 대조군 세포주에서는 Bcl-2가 발현되지 않는 반면, pcDNA-Bcl-2로 형질감염된 세포주에서는 Bcl-2가 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

<3-3> Bcl -2 과발현이 병용 처리에 미치는 영향 분석

Bcl-2 과발현이 독소루비신과 개미트리닙의 병용 처리에 미치는 효과를 살펴보기 위하여, 상기 <3-1>에서 제조된 대조군 세포주 및 Bcl-2 발현 세포주에 개미트리닙 단독, 독소루비신 단독, 및 이들을 병용 처리한 다음, MTT 분석에 의해 세포 생존율을 측정하였다. 개미트리닙 단독 처리군의 경우 0, 1, 2, 5, 10, 15 및 20 μM 농도의 개미트리닙으로 처리한 후 IC₅₀ 값을 측정하였고, 독소루비신 단독 처리군의 경우 0, 2, 5, 10, 15, 20 및 30 μM의 독소루비신을 사용하였고, 병용 처리군의 경우 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5 및 10 μM의 DOX 및 0, 1, 2, 5 및 10 μM의 G-TPP를 조합하여 사용하였다.

실험결과를 각각 도 3B 내지 3D에 나타내었다. 상기 결과들에서 보는 바와 같이, DOX의 세포독성 활성은 Bcl-2 과발현에 의해 약화된 반면, G-TPP는 Bcl-2의 발현 상태와 관계없이 두 세포주에 대해 비슷하게 효과적이었다(도 3B 및 C). 이는 독소루비신과 개미트리닙이 전혀 다른 메커니즘을 갖는다는 것을 보여준다. 또한, 병용 처리시, Bcl-2 발현 세포주에서는 약물의 상승적 활성이 완전히 차단되어 병용 처리에 내성을 갖는 것으로 나타났다(도 3D). 이는 DOX에 의한 유전자독성 공격이 Bcl-2 단백질 관련 경로를 통해 미토콘드리아로 모인다는 것을 보여준다.

상기 결과들에서 보는 바와 같이, 독소루비신은 Bcl-2에 의하여 억제가 될 수 있으나 G-TPP는 억제가 되지 않으므로 두 약물이 서로 다른 작용 기전을 가짐을 알 수 있다.

실시예 4: 미토콘드리아에 대한 DOX 의 효과 분석

아폽토시스 동안에, 미토콘드리아는 미토콘드리아 내막 및 외막 투과성을 조절함으로써 세포 사멸 경로를 조절하는 주된 역할을 한다. 약물 상승작용의 메커니즘을 좀더 입증하기 위해, 미토콘드리아 막 투과성에 대한 약물 효과를 조사하였다.

구체적으로, 전립선암세포주 CWR22rv에 독소루비신(0.25 μM) 단독, 개미트리닙(2.5 μM) 단독, 및 독소루비신과 개미트리닙을 병용 처리한 후, 세포막전위 변화를 관찰할 수 있는 JC-1(Invitrogen) 염료 2.5 μg/mL로 37℃에서 30분 동안 염색하였다. JC-1 염료는 세포막 전위가 파괴되면 녹색 형광이 강해지고 적색 형광이 약해지는 특성을 가지고 있다. 상기 약물에 따른 세포막전위 변화를 유세포분석기(Beckman coulter, FC500)를 이용하여 녹색 신호(FL1)와 적색 신호(FL2) 비율로 분석하였다.

실험결과를 도 4A에 나타내었다. 도 4A의 좌측 상단부에는 온전한 막전위를 갖는 미토콘드리아의 백분율을, 우측 하단부에는 상실된 막전위를 갖는 미토콘드리아를 나타내었다. 도 4A에서 보는 바와 같이, 단독 약물 처리군의 경우에는 DMSO 대조군에 비해 특별한 차이를 보이지 않았으나, 병용 처리군에서는 미토콘드리아 내막 투과성이 급격하게 높아져 JC-1 형광성이 적색에서 녹색으로 이동하였다.

한편, CWR22rv 세포주로부터 미토콘드리아 추출 키트(Thermo Scientific)를 이용하여 미토콘드리아를 분리하고, 전술한 바와 동일한 농도로 약물을 처리한 다음, 30℃에서 30분간 반응시켰다. 그리고 나서, 2.5 μg/ml의 농도로 JC-1(invitrogen)을 처리하여 상온에서 10분간 염색한 다음, 유세포분석기(Beckton-Dickenson)를 이용하여 분석하였다.

또한, CWR22rv로부터 분리한 미토콘드리아에 DMSO, 10 μM의 G-TPP, 1 μM의 DOX를 각각 처리하고 1 μM의 DOX + 10 μM의 G-TPP를 병용 처리한 다음, 30℃에서 30분간 반응시키고 원심 분리하여, 미토콘드리아 펠렛(P)과 상층액(S)을 분리하였다. 미토콘드리아막의 투과성을 측정하기 위해 각 시료에 대해 웨스턴 블롯을 수행하였고, 사이토크롬 c 항체(Santa cruz)을 처리하여 사이토크롬 c의 방출을 확인하였다.

실험 결과를 각각 도 4B 및 4C에 나타내었다. 도 4B 및 4C에서 보는 바와 같이, DOX는 단일 또는 병용 처리시 미토콘드리아 내막 및 외막 투과성에 영향을 미치지 않은 반면, G-TPP는 미토콘드리아 내막 및 외막 투과를 효과적으로 유도하였다.

나아가, 실시예 <3-1>에서 제조된 Bcl-2 발현 HeLa 세포주를 미토트랙커(Mitotracker, invitrogen, 녹색)로 표지화한 후, 10 μM DOX(적색)으로 24시간 처리하여 공초점 현미경(FV1000, confocal microscope, ORYMPUS)으로 분석하였다. 또한 공초점 현미경으로 분석된 세포 이미지를 FV10 ASW 소프트 프로그램(ORYMPUS)을 이용하여 세포의 세포질을 절개하여 절개면의 형광 강도를 분석하였다.

상기 결과를 도 4D에 나타내었다. 상기 결과에서 보는 바와 같이, DOX는 고농도에서도 Bcl-2 발현 세포에서 미토트랙커와 함께 위치하지 않았다(도 4D). 따라서, DOX는 내부 미토콘드리아 사멸 경로가 아니라 외부 사멸 경로를 작동시켜 암세포에서 세포 사멸에 영향을 미치는 것으로 보인다.

상기 결과들은 개미트리닙은 미토콘드리아에 직접적으로 영향을 주는 반면, 독소루비신은 간접적으로 영향을 주는 서로 다른 약물 기전을 가짐을 보여준다.

실시예 5: 병용 처리가 심장세포 및 정상 미토콘드리아에 미치는 영향 분석

정상 조직에서의 약물 병용의 효과를 조사하기 위해 마우스 심장으로부터 미토콘드리아를 분리하고, DMSO 단독, DOX 단독(1 μM), G-TPP 단독(10 μM), 및 DOX와 G-TPP를 병용 처리하였다. 양성 대조군의 경우에는 미토콘드리아를 Ca^{2 +}와 함께 배양하였다. 상기 처리 후, JC-1으로 라벨링하고, 유세포분석기에 의하여 분석하였다.

상기 실험결과를 도 5A에 나타내었다. 도 5A에서 보는 바와 같이, 통상적으로 사용되는 약물 농도보다 2배 이상 높은 농도로 병용 처리시에도 미토콘드리아 내막 및 외막 투과성에는 변화가 없었다.

한편, 심장 미토콘드리아로부터 사이토크롬 c 방출을 조사하였다. 구체적으로, 마우스에서 심장을 분리하고, 심장을 잘게 쪼갠 후, 트립신을 처리하여 세포 조직이 분리될 수 있도록 반응시켰다. 그리고 나서, 원심분리를 통해 세포를 수확한 다음 미토콘드리아 추출 키트(Thermo Scientific)를 이용하여 미토콘드리아를 분리하고, 전술한 바와 동일한 농도로 약물을 처리하여 30℃에서 30분간 반응시켰다. 이후, 원심 분리하여, 미토콘드리아 펠렛(P)과 상층액(S)을 분리하고, 사이토크롬 c 항체(Santa cruz)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

웨스턴 블롯 결과를 도 5B에 나타내었다. 도 5B에서 보는 바와 같이, G-TPP 및 DOX는 단일 또는 병용 치료시 분리된 심장 미토콘드리아에 영향을 미치지 않았다.

랫트 심장으로부터 유래한 H9C2(한국세포주연구재단)를 이용하여 약물 병용요법이 정상심장세포에 대해서도 상승적인 세포사멸을 유도하는지 도 5C에서 확인하였다. 전술한 MTT 분석에 약물 병용요법 처리후 정상심장세포의 생존율을 측정하였다. 독소루비신의 정상세포에 대한 독성은 2.5 μM 혹은 5 μM 농도의 개미트리닙을 처리하는 것과는 무관하게 작용하여, 도 1A, B, C에서와 같은 암세포에서의 약물 상승작용을 확인할 수 없었다.

상기 결과에서 보는 바와 같이, 두 가지 약물 모두 암세포 미토콘드리아에 대해서는 직/간접으로 영향을 준 반면, 정상세포 미토콘드리아에 대해서는 영향을 주지 않았으며, 정상 심장세포에 대해서도 약물 상승작용이 일어나지 않는 것으로 확인할수 있었다. 이는 약물 상승작용이 암세포 특이적임을 보여준다.

실시예 6: 병용 처리의 생체내 효과

약물 병용의 생체내 효능을 알아보기 위해, 1×10⁷ 개의 CWR22rv 세포를 누드 마우스의 양 옆구리의 피하로 주사하였다. 주사한 부위에 100mm³ 이내의 종양(접종 1주 후)을 갖는 마우스를 5 마리씩 4군으로 무작위로 나누었다: 대조군(DMSO, 10 mg/kg), DOX 군(독소루비신, 3 mg/kg), TPP군(개미트리닙, 10 mg/kg), DOX(3 mg/kg)와 TPP(10 mg/kg) 병용 군. 약물을 일주일 동안 2회에 걸쳐, DOX는 정맥내로, TPP는 복강내로 단독 또는 병용 처리하였고, 17일간 종양크기와 마우스 체중을 측정하였다. 종양은 칼리퍼 방법(caliper method)을 이용하여 측정하였으며, 종양 크기는 하기와 같이 계산하였다: 종양크기= (장경×단경×단경)/2.

종양 크기 결과를 도 6A의 좌측에 나타내었고, 도 6A의 우측에는 17일째의 종양 크기를 나타내었다. 측정 결과, G-TPP 단독 처리 그룹 및 DOX 단독 처리 그룹의 경우, 종양 성장이 DMSO 대조군에 비해 약간 감소한 반면, 병용 처리군의 경우에는 종양 성장이 급격하게 억제되었다. 한편, 약물 처리 초기 및 말기에 각 군의 마우스의 체중을 측정하여 체중 백분율을 계산한 결과, 단독 처리군과 병용 처리군 사이에 유의적인 차이가 없었다. 상기 결과들은 G-TPP 병용 처리로 인한 추가 독성이 없다는 것과, 병용 치료가 생체내 종양 성장을 억제하는데 매우 효과적임을 보여준다.

Claims (8)

1. 독소루비신 및 개미트리닙을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 개미트리닙이 개미트리닙 G1, G2, G3, G4 또는 TPP(triphenyl phosphonium)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 개미트리닙이 개미트리닙 TPP인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 독소루비신 및 개미트리닙이 10:1 내지 1:10의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 독소루비신이 0.1 내지 20 μM의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 개미트리닙이 1 내지 20 μM의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물이 독소루비신으로 인한 심장독성을 심화시키지 않는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 암이 방광암, 유방암, 위암, 폐암, 난소암, 갑상선암, 자궁경부암, 중추신경암, 교아종, 간암, 피부암, 췌장암, 위암, 대장암, 직장암, 식도암, 신장암, 폐암, 상피암, 혈액암, 전립선암, 연조직육종, 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

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