JPH08502488A - 前立腺癌および初期神経悪性疾患に対するベンゾキノイドアンサマイシンの殺腫瘍活性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一定のアンサマイシンベンゾキノンの使用を包含する、選択されたヒト悪性瘍を処置するための方法及び組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 前立腺癌および初期神経悪性疾患に対するベンゾキノイドアンサマイシンの殺腫 瘍活性 発明の背景 ベンゾキノイドアンサマイシン抗生物質は、1970年代の後期において、いくつ かの放線菌種の培養ブイヨンから分離された。それらの異常な細胞間橋（ansa b ridge）構造はかなりの興味を発生し、そしてヘルビマイシンＡ（HA）およびゲ ルダナマイシン（GA）を包含するある数の化合物は可能な抗レトロウイルス剤お よび抗腫瘍剤としてスクリーニングされた。その時期の通常の被験細胞系、例え ば、Ｌ1210およびＰ-388に対する結果は失望するものであった。抗腫瘍活性につ いて要求される濃度は全動物において非常に毒性であり、そしてそれ以上の開発 は放棄された。 HAがチロシンキナーゼ腫瘍遺伝子形質転換細胞系の表現型を非常に適度な濃度 において復帰できることが認められたとき、1980年代後期において熱狂の新しい 波が起こった。ある数のモデル系における脈管形成の阻害および分化の誘発が、 また、報告された。HAおよびGAは、報告されるようにsrc族のタンパク質のチロ シンキナーゼのそれらの阻害のために、ある数の生体外モデル系において分化を 誘発することが示された。 初期の神経の誘導の小児および大人の癌は、転移、局所的に散在しているか、 あるいは再発しているにかかわらず、現在の多物理療法の処置の養生法による治 癒に対して最も無反応性である悪性疾患の中に入る。 発明の要約 本発明は、初期神経外胚葉腫瘍、前立腺癌、黒色腫、および転移性ユーイング 肉腫から成る群より選択されるヒト悪性疾患を処置する方法を提供する。この方 法は、悪性疾患を有する動物に有効投与量のアンサマイシンベンゾキノンを投与 することからなる。投与は好ましくは非経口的、例えば、静脈内である。 有効投与量は通常0.1mgの薬物／受容体動物のkg体重（mg／kg）〜約20mg／kg の範囲から選択される。好ましくは、有効投与量は約１mg／kg〜約10mg／kgの範 囲から選択される。より好ましくは、有効投与量は約５mg／kgである。 アンサマイシンベンゾキノンは、典型的には、ゲルダナマイシンおよびその誘 導体、ヘルビマイシンＡおよびその誘導体、およびマクベシンＩおよびマクベシ ンIIを包含するその誘導体から成る群より選択される。アンサマイシンベンゾキ ノンの一般化学式は第１図に表示されている。認められるように、側基Ｒ₁，Ｒ₂ ，Ｒ₃およびＲ₄は、典型的には、水素、アルキルまたはアルコキシである。用語 「アルキル」は飽和炭化水素基である置換基を呼ぶ。アルキル基は直鎖状または 分枝鎖状であり、立体障害によってのみ制限される。より短いアルキル基、例え ば、１〜４炭素原子が好ましい。用語「アルコキシ」は、他の炭化水素基に共有 結合することができる酸素置換基をまた有するアルキル基（例えば、メトキシま たはエトキシ基）を呼ぶために使用される。アルキル基と同様に、より短いアル コキシ基が好ましい。用語「独立に選択される」は、種々のＲ基、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃ およびＲ₄が同一であるか、あるいは異なることができることを示すために使用 される。 本発明は、ヒトに有効投与量のゲルダナマイシンおよびその誘導体、ヘルビマ イシンＡおよびその誘導体、マクベシンＩおよびマク ベシンIIを包含するその誘導体から成る群より選択されるアンサマイシンベンゾ キノンを非経口的に投与することからなる、初期神経外胚葉腫瘍、前立腺癌、黒 色腫、および転移性ユーイング肉腫から成る群より選択されるヒト悪性疾患を処 置する方法を包含する。有効投与量は癌の症状または徴候を改善するために十分 な量である。量は一般に0.1mg／kg〜約20mg／kgの範囲である。ゲルダナマイシ ン誘導体は、好ましくは17−デス−Ｏ−メチルゲルダナマイシン、ゲルダナマイ シンアセテート、７′，８′−ベンゾデメトキシゲルダノキサゾン、ヒドロゲル ダナマイシン−18，21−ジアセテート、７′−（および８′）−フルオロデメト キシゲルダナジン、７′−ブロモデメトキシゲルダノキサジノン、19−ピペリジ ノゲルダナマイシン、ゲルダンピシン、８′−ブロモデメトキシゲルダノキサジ ノン、７′−（または８′）−フルオロデメトキシゲルダナジン、および17−ア ミノ−17−デメトキシゲルダナマイシンから成る群より選択されるゲルダナマイ シン誘導体である。 本発明は、さらに、少なくとも１種の薬学的に許容されうる賦形剤および製剤 組成物を少なくとも１回投与する哺乳動物における癌を処置するために有効量の アンサマイシンベンゾキノンからなる製剤組成物を包含する。癌は初期神経外胚 葉腫瘍、前立腺癌、黒色腫、および転移性ユーイング肉腫からなる群より選択さ れる。 典型的には、哺乳動物はヒトであり、そしてアンサマイシンベンゾキノンの量 は約0.1mg／kg〜約20mg／kgの範囲から選択される。好ましくは、アンサマイシ ンベンゾキノンの量は約１mg／kg〜約15mg／kgの範囲から選択される。より好ま しくは、アンサマイシンベンゾキノンの量は約５mg／kgである。組成物は好まし くは非経口的投与、例えば、静脈内投与に適合する。 組成物中のアンサマイシンベンゾキノンは、通常ゲルダナマイシ ンおよびその誘導体、ヘルビマイシンＡおよびその誘導体、マクベシンＩおよび マクベシンIIを包含するその誘導体から成る群より選択される。ゲルダナマイシ ン誘導体が好ましくは上に特定した群から選択される。 図面の簡単な説明 第１図は、アンサマイシンベンゾキノンの化学構造式である。 第２図は、投与量依存的方法ベンゾキノイドアンサマイシンは細胞の増殖およ び生存を阻害することをグラフで示す。 第３図は、シクロヘキシミドがHA誘発DNA分解を阻害することを示すDNA電気泳 動アッセイである。 第４図は、培養における一次ニューロンに対するベンゾキノイドアンサマイシ ンの毒性の欠如を証明する。 第５図は、ヌードマウスにおける前立腺腫瘍の増殖のHAの阻害を示す。 第６図は、腫瘍を有するマウスのHAを使用する全身的処置を示す。 好ましい態様の説明 初期の神経の誘導の転移性および局所的に散在した癌は、処置に対して最も無 反応性のものの間に止まる。本発明は、選択した範囲のヒト腫瘍に対して生体外 で、そしてある種のヒト腫瘍のマウスのモデルにおいて生体内で、ベンゾキノイ ドアンサマイシンが非常に効力のある細胞致死活性を有することを示す。本発明 は、また、一次ニューロン、いくつかの造血細胞系およびマウス線維芽系統に対 する毒性をほとんど発見しなかった。小児癌の神経芽細胞腫、神経上皮腫および 髄芽細胞腫の細胞系をモデル系として使用し、ここで アンサマイシンベンゾキノンの治療の可能性を探査した。 ベンゾキノイドアンサマイシンは、初期の神経の特徴を有する高度に悪性のヒ ト腫瘍細胞系のパネルに対して生体外で効力のある細胞毒素である。線維芽、一 次ニューロン培養物およびいくつかの白血病細胞系の増殖および／または生存は 、感受性系統において99％より大きい細胞損失を生ずる濃度において影響を受け ない。感受性細胞系のヌードマウスにおける腫瘍発生は、全動物に対する明らか な毒性なしに、これらの薬物の全身的または局所的投与により顕著に減少させる ことができる。これらのアンサマイシンの細胞致死作用は非常に急速に開始され 、不可逆的であり、そして従来報告されたsrc族のキナーゼの阻害の遅延から明 瞭に区別される。それらの効能、すなわち、作用の相対的選択性および１または ２以上の新規なメカニズムのために、これらの薬物はある数のヒト癌、とくに神 経誘導の癌の治療において臨床的に有用であることを証明することができる。 ベンゾキノイドアンサマイシンは商業的に入手可能であるか、あるいは天然源 から単離することができる。例えば、ゲルダナマイシンの製造は、DcBoerら、“ Geldanamycin，A New Antibiotic，”The Jaurnal of Antibiotics 23：9，442- 447（September 1970）に記載されている。ヘルビマイシンの単離については、O muraら、“Herbimycin，A New Antibiotic Porduces By A Strain Of Streptomy ces，”The Journal of Antibiotics 32：4，255-261（April 1979）参照。マク ベシンＩおよびIIの単離については、Muroiら、“Macbecins I and II，New Ant itumor Antibiotics，”The Journal of Antibiotics 33：2，205-212（Februar y 1980）参照。通常、親化合物、例えば、HAおよびGAは発酵ブロスから単離され 、そして誘導体は親の化学的操作により製造される。誘導体の製造は普通の 化学的技術を包含し、そして当業者の技量の範囲内である。アンサマイシンベン ゾキノン、例えば、HAおよびGAは、研究の目的で、ナショナル・キャンサー・イ ンスチチュート（NCI）貯蔵所から入手可能である。それらはベセスダ・リサー チ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Lab）（BRL）マリイランド州ロックビ レから商業的に入手可能である。 癌の処置について言及するとき、改善されたまたは減少した症状が包含される 。すなわち、「処置」は腫瘍の大きさの客観的退行に限定されないばかりでなく 、かつまた患者の主観的状態の彼の報告を包含する。 化合物の有効量は、症状の主観的軽減を提供し、腫瘍の重荷を減少するか、あ るいは同定可能な腫瘍マーカーを減少する量である。化合物の投与は医学的また は薬学的に許容されるルートによる。典型的には、非経口的ルートは好ましい。 例は静脈内、筋肉内、および皮下の投与を包含する。局所的適用はまた有効であ る。投与量の範囲は、患者の体重に基づいて、好ましくは抗体0.1〜約20mg／kg である。さらに詳しくは、この範囲は約１〜約10mg／kg／日である。 ベンゾキノイドアンサマイシンの投与量は、当業者によく知られている多数の 因子に依存する。因子は、例えば、投与のルート、特定の化合物の効能、処置さ れる状態、および患者の年令、体重、および心臓、肝臓および腎臓の機能を包含 する健康の全体的状態を包含する。 好ましい投与のスケジュールは、制限された期間、典型的には約５〜10日間の 通常１または２回／日の非経口的または局所的投与である。このスケジュールは 好ましくは適当な間隔で、通常約14〜28日間反復し、最初のサイクルの第１日を 日１と計数する。あるいは 、投与量は１日置きにあるいは３〜４日置きに与えることができる。好ましい非 経口的ルートは静脈内（IV）である。好ましくはIV投与量は約30〜60分かけて注 入される。 本発明の組成物は、適当な量または配合のベンゾキノイドアンサマイシンを含 有する単位投与形態、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒、水性の溶 液または懸濁液および油中水乳濁液でヒトおよび動物に投与される。 用語「単位投与形態」は、ヒトの被検者および動物のための単一の投与として 適当な物理的に離散した単位を意味し、各単位は所望の薬学的効果を生成するよ うに計算された前もって決定した量の活性物質を含有する。適当な単位投与形態 のいくつかの例は、錠剤、丸剤、粉末ポケット、オブラート、顆粒、茶匙一杯、 食匙一杯、点滴器一杯、アンプル剤、およびバイアルである。 ベンゾキノイドアンサマイシンは、この分野において知られているように、組 み合わせるか、あるいは種々の溶液および他の化合物と混合することができる。 例えば、それは水、生理食塩水または緩衝化賦形剤中に溶解して投与することが できる。ベンゾキノイドアンサマイシンは、経口的、局所的および非経口的（例 えば、静脈内または筋肉内）注射を包含する任意の普通の方法により投与するこ とができる。処置は単一の投与から成るか、あるいはある期間にわたる複数の投 与から成ることができる。薬物は適当な投与量の化合物と組み合わせることがで きる。薬学的に有効量の薬物は、薬学的に許容される担体、例えば、添加剤また は希釈剤とともに使用することができる。 非経口的使用のために好ましい配合物は、アンサマイシンベンゾキノンおよび 少なくとも１種の乳化剤を含む乳濁液である。例えば、賦形剤クレモフォル（Cr emophor）を乳化剤として使用することが できる。非イオン性でありかつ複雑な脂肪酸を含有する乳化剤は好ましい。さら に、洗浄剤は乳濁液の調製において有用であることがある。他の好ましい配合は 、親化合物、例えば、HAまたはGAを水溶液中に可溶性の塩に変更することができ る。例えば、反応性基のエステル化を実施して、アンサマイシンベンゾキノンの 水溶性の同族体または類似体を生成することができる。親化合物は水中に不溶性 である傾向があるので、親の変更なしに水溶液としての投与は好ましさに劣るが 、可能な別法である。 実施例 実施例１ 細胞培養物。CHP-100細胞はA．エバンス（Evans）博士（フィラデルフィアの 子供の病院）から入手した。細胞系TC-32およびNIH3T3はM．ツソコス（Tsokos） 博士（NCI、病理学研究所）から入手した。使用したすべての他の細胞系は、ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collec tion）ATCC、マリイランド州ロックビレ）から購入した。一次新生児ラット皮質 ニューロンは標準の技術により確立され、そしてM．ケーニヒ（Koenig）博士（A rmed Forces Research Institute、ワシントンDC）により供給された。すべての 細胞系は、マイコテクト（Mycotect^R）キット（GIBCO Laboratories、ニューヨ ーク州グランドアイランド）を使用して試験し、そしてマイコプラズマの汚染を 含まないことが発見された。すべての培地に10％の胎児ウシ血清（FBS）（Whitt aker Bioproducts、マリイランド州ウォーカースビレ）を補充した。 細胞系CHP-100，TC-32，IMR-32，SKNSH，CEMおよびHL-60をRPMI-1640（Biofluid s，Inc．、マリイランド州ロックビレ）中で増殖させた。細胞系D283Med，D341M ed，SKNMC，SK-MEL-1，SK-MEL-2、 およびRPMI 7951は、１％の非必須アミノ酸および１mMのピルビン酸ナトリウム を含むイーグルMEM 中で培養した（すべてはBiofluids，Inc．から）。NIH3T3細 胞を4.5ｇ／ｌのグルコースを含むダルベッコMEM（Biofluids，Inc）中で培養し た。ヘルビマイシンＡ（National Service Center NSC 305978）およびゲルダナ マイシン（NSC 122750）はドラッグ・シンセシス・アンド・ケミストリー・ブラ ンチ（Drug Synthesis and Chemistry Branch）、ナショナル・キャンサー・イ ンスチチュート（NCI）から入手し、ジメチルスルホキシド（Sigma Chemical Co .、ミゾリー州セントルイス）中の２mg／mlの原溶液として配合し、そして４℃ において暗所で貯蔵した。 初期神経細胞系に対するHAおよびGAの選択的細胞障害活性。データを第２図に 次の凡例を使用してグラフにする。白抜きの円は細胞系CHP-100を意味する。閉 鎖したボックスは細胞系NIH3T3を意味する。パネルＡは培地に添加したHAを有し 、そして³Ｈ−チミジンの取り込みを48時間後にアッセイした。パネルＢは培地 に添加したGAを有し、そして³Ｈ−チミジンの取り込みを48時間後にアッセイし た。パネルＣは培地に添加したHAを有し、そしてMTTの減少を５日後にアッセイ した。パネルＤは培地に添加したGAを有し、そしてMTTの減少を５日後にアッセ イした。データは薬物を添加しないで同時にプレートした対照ウェルに関して、 cpm％または光学密度として表す。すべての点は三重反復実験の決定の平均を表 す。標準偏差は10％より小さい。 第２図、パネルＡは、薬物を使用する２日間の培養後の³Ｈ−チミジンの取り 込みの阻害により測定した。初期神経外胚葉細胞系CHP-100に対するHAの効力の ある増殖阻害活性を示す。この細胞系は、HAの阻害活性に対して生体外で、非腫 瘍発生性マウス線維芽細胞系NIH3T3よりもほぼ10倍感受性である。パネルＢは関 係するアンサ マイシンGAについての細胞型選択的の同様なパターンを示し、そしてGAはHAより もほぼ10倍効力がある。 DNA合成の阻害よりむしろ生存へのHAおよびGAの効果をアッセイする実験を、 また、これらの２つの細胞系を使用して実施した。96ウェルのマイクロタイター プレートのフォーマットにおいて処理した細胞によるMTTの減少の自動化分析は パネルＡおよびＢに類似する投与量応答曲線の発生を可能としたが、終点は５日 間の条件下に後に残留する生存可能な細胞の相対数であった。パネルＣおよびＤ が示すように、CHP-100で完全な細胞損失を生ずるHAまたはGAの濃度は線維芽細 胞系に影響を与えない。相対的効能および選択性は、MTT分析およびチミジン取 り込み分析により同様であった。MTT実験において見られた効果は増殖の簡単な 阻害ではなかった。値は最初のプレート時間から実際に傾斜し、細胞損失を示し た（データは示されていない）。分析前に処理したウェルの顕微鏡検査は、また 、細胞破片のみが残留することを確証した。 細胞の増殖および生存の研究。チミジン取り込みの研究は従来記載されたよう に実施した（Whitesell L，Rosolen A，Neckers LM、“エピソーム発生N-mycア ンチセンスRNAは初期神経外胚葉細胞系の分化可能性を制限する（Episome-gener ated N-myc antisense RNA restricts the dfferentiation potential of proim itive neuroectodermal cell lines）”，Mol．Ccll Biol．11：1360-1371（199 1））が、ただしHAまたはGAの段階希釈物を三重反復実験のウェルの試験する細 胞系のための適当な増殖培地の100μｌの中に添加した。 プレートを48〜72時間の間培養し、次いで〔メチル−³Ｈ〕−チミジン（Dupon t、マサチュセッツ州ボストン）で４時間の間パルスし、次いで自動化細胞収穫 および液体シンチレーションカウンティ ングを実施した。 相対的生存可能な細胞数のアッセイとして、３−〔４，５−ジメチルチアゾル −２−イル〕 ２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）のミトコン ドリアの減少を使用した（Alley MCら、“ミクロ培養テトラゾリウムアッセイを 使用してヒト腫瘍細胞系のパネルを使用する薬物のスクリーニングの可能性（Fe asibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay）”，Cancer Res.，48：589-601（1988）） 。96ウェルの組織培養プレートをAlleyに記載されているように構成したが、５ 〜６日間培養した。20μｌのリン酸塩緩衝液（PBS）中のMTT（Sigma、ミゾリー 州セントルイス）の５mg／ml溶液をすべてのウェニに添加し、そしてプレートを さらに４時間の暗所でインキュベートした。 プレートを遠心し、培養を除去し、そして150μｌのジメチルスルホキシド（S igma、ミゾリー州セントルイス）を各ウェルに添加した。暗所で震盪しながら10 分間インキュベーションした後、540nmにおける光学密度をバイオカイネティッ クス（Biokinetics）プレートリーダー（EL-312型、Bio-Tek Instruments Inc． バーモント州ウィノースキ）を使用して決定した。光学密度は各ウェルにおいて 発生したフェルマザン濃度の測度として使用した。実施例２ HAおよびGAの細胞障害性の特性。HAおよびGAがCHP100細胞に対して実際に細胞 障害性であることが証明されると、この細胞障害性を検査した。細胞の死亡は細 胞の型に依存しかつ刺激を開始する活性または受動的プロセスであることができ る。DNA分解は両者のプロセスの終点としてしばしば使用される。細胞の死亡の トランスダクションにおいて進行するタンパク質合成のための要件は活性な型の プログラムを示唆する。 CHP-100細胞（５×10⁶／10cmの組織培養皿）を、HA（500nM）、80nMのシクロ ヘキシイミド（³Ｈ−ロイシン取り込みにより測定して75％だけタンパク質合成 を阻害すると前もって決定された濃度）またはそれら２つの組み合わせの存在下 にプレートした。プレート後68時間に、細胞をトリプシン処理により収穫し、そ して細胞数および生存能力を血球計チャンバー中でトリパンブルー排除により決 定した。細胞をPBS中で１回洗浄し、そして高分子量DNAを従来報告された方法に 従い調製した（Rodriguez-Tarduchy G，Lopez-Rivas A.、“フォルボールエステ ルはIL-2依存性Ｔリンパ球のアポプトーシスを阻害する（Phorbol esters ihibi t apoptosis in IL-2 dpendent T-lyphocytes）”，Biochem．Biophys．Res．Co mm.，164：1069-1075（1989））。 簡単に述べると、細胞ペレットを37℃において0.5mlの溶解緩衝液（200mMのTR IS pH8.5、100mMのEDTA、50μｇ／mlのプロテイナーゼＫ、１％のSDS）中で少な くとも４時間インキュベーションした。DNAをフェノール抽出し、そして水性相 を10mMのTRIS，pH7.5、１mMのEDTAに対して一夜透析した。DNAを37℃において50 μｇ／mlのRNアーゼＡとインキュベーションした。５時間後、120μｇ／mlのプ ロテイナーゼＫを添加し、そしてインキュベーションを５時間続けた。DNAをフ ェノールで、次いでクロロホルムで抽出し、そしてエタノール／酢酸ナトリウム で沈澱させた。水中に再溶解した後、５μｇのDNAを1.4％のアガロースゲル上に レーンにつき負荷し、そして35ボルトで16時間電気泳動させた後、臭化エチジウ ムで染色しそして写真撮影した。 第３図におけるレーンは次の意味を有する。CTRLは対照を示しそして薬物を添 加しなかった。HAは500nMのHAを添加したことを意味 する。CHXは80nMのシクロヘキシイミドを添加したことを意味する。CHX／HAは両 者の薬物を同時に添加したことを意味する。前述したようにDNAを単離し、そし て電気泳動にかけた。高分子量DNAの分解はレーンHAのみであった。第３図はタ ンパク質合成がHA誘発の細胞の死亡のために必要であることを証明する。この実 験において、500nMのHAの存在下に非特異的タンパク質合成インヒビターのシク ロヘキシイミドを使用するか、あるいは使用しないで細胞を培養した。68時間後 、細胞を収穫し、生存能力についてアッセイし、そして高分子量DNAを調製した 。未処理細胞の生存能力は82％であり、80nMのシクロヘキシイミドで処理した細 胞のそれは57％であり、HA処理した細胞のそれは26％であり、そしてHA／シクロ ヘキシイミドで処理した細胞のそれは66％であった。シクロヘキシイミドの処理 はHAの細胞障害性活性を明瞭に阻害した。 高分子量DNAの分析はHA処理した細胞において実質的なDNA分解を明らかにした （第３図、レーンHA）が、アポプトーシスのヌクレオソームの開裂特性は見られ なかった。しかしながら、DNA分解は細胞をシクロヘキシイミドとの同時インキ ュベーシヨンにより妨害された（レーンCHX／HA）。そのレーンにおける高分子 量DNAの品質は、未処理細胞（レーンCTRL）またはシクロヘキシイミド単独処理 の細胞（レーンCHX）のそれと区別することができない。これらの発見は、HAが 感受性細胞に対して細胞障害性であることおよびこの細胞障害性が活性な細胞の 参加を必要とすることを確証する。 HAおよびGAにより表示される活性のスペクトルをさらに評価するために、初期 神経外胚葉細胞系のパネルを³Ｈ−チミジンの取り込みおよび終点としてMTTの減 少の両者を使用してスクリーニングした。種々の神経細胞系および非神経細胞系 の両者についてのチミジンアッセイにより得られた投与量応答データの要約であ る表１を参 照のこと。非神経細胞型、例えば、造血系統HL-60およびCEMは、HAおよびGAによ る増殖阻害に対して非常に抵抗性であった。検査したすべての初期神経外胚葉細 胞系、末梢神経系誘導（例えは、CHP-100，SKNMC，TC-32）および中枢神経系誘 導（例えは、D283Med，D341Med）の両者はHAおよびGAに対して非常に感受性であ ることを証明した。再発した、高度に前処置されたユーイング肉腫の患者の悪性 胸膜滲出液の一次培養からの細胞は、また、MTTアッセイにより決定してHAに対 して感受性であった（IC₉₅＝400nM）。 より成熟した神経表現型の細胞は、HAの細胞障害活性に対して比較的不感受性 であった。神経芽細胞腫細胞系IMR-32およびSKNSHについてのチミジン取り込み のデータを表１に示す。高度に分化したラットのクロム親和性細胞腫細胞系PC-1 2は、また、MTTアッセイによりHAに対して比較的不感受性であった（IC₉₅＞500n M）。 データは第４図に棒グラフとして表されている。472nMのHAまたは40nMのGAを 確立された新生児ラット小脳ニューロン培養物に添加した。プレートをさらに４ 日間インキュベーョンし、次いで生存可能な細胞数／細胞を反映するMTT色素の 減少を540nmにおける光学密度としてアッセイした。棒の高さは四重反復実験の ウェルの平均吸収を表す。誤差の棒は平均の標準偏差を示す。 第４図は、新生児ラット小脳ニューロンの一次培養物が472nMのHAまたは40nM のGAにおける培養により影響を受けないことを証明する。この実験を、また、新 生児ラット脳皮質ニューロンを使用して数回反復し、同一の結果が得られた。最 後に、黒色腫細胞系SK-MEL-1，SK-MEL-2およびRPMI 7951を、また、MTTアッセイ によりHAに対してスクリーニングした。感受性であることが発見された１つの系 統、RPMI 7951（HA IC₅₀＝125nM）は、Houghtonら、“メラニン細胞および黒色 腫の表面抗原（Surface antigens of melanocytes an d melnomas）”，J．Exp．Med.，156：1755-1766（1982））により定めて、初期 の、最小の分化の表現型を有すると報告される。 実施例３ 腫瘍発生性の研究。CHP-100細胞をコンフルエンス以下の単層から収穫し、そ してPBSの中に５×10⁷細胞／mlで再懸濁させた。100μｌを６週齢の無胸腺ヌー ドマウス（Frederick Cancer Reseach Facility、マリイランド州フレデリック ）の右および左の鼠径区域に第０日に皮下接種した。 HAまたはGAを使用する治療を、腫瘍接種の日または触知可能な腫瘍が明らかで あるときの接種後10日に開始した。薬物は腫瘍細胞接種の部位にジメチルスルホ キシド中の薬物の２mg／ml溶液の５μｌの塗布により局所的に投与するか、ある いはジメチルスルホキシド中で配合した薬物の腹腔内注射により全身的に投与し た。 対照動物には適当な賦形剤単独で同一の処置を与えた。動物を細胞接種後21日 に殺し、そしてよくカプセル化された腫瘍を切除しそして秤量した。マウスの使 用を含むすべての研究は、概観しそしてナショナル・キャンサー・インスチチュ ート（National Cancer Institute）の動物の管理および使用のサブコミッティ ー（Animal and Use Sub-committee）により承認されたプロトコール下に実施し た。 生体内抗腫瘍活性。選択したヒト癌の処置における効力のある化学療法剤とし てベンゾキノイドアンサマイシンを、腫瘍異種移植／ヌードマウスのモデルを使 用して評価した。無胸腺ラットにおける予備的実験において、４mg／kg（または 24mg／Ｍ²）のGAの静脈内注入は顕在的直ちまたは遅延の毒性なしによく耐えら れることが証明された。 表２は、腫瘍細胞の接種時における動物への薬物の局所的または全身的投与の 効果を示す。ヌードマウスに腫瘍細胞を皮下接種し、そして治療を同一の日に開 始した。局所的治療は、ジメチルスルホ キシド中の薬物の２mg／ml溶液の５μｌを腫瘍接種部位の上に横たわる皮膚に毎 日５日間適用することから成っていた。全身的治療は、4.5mg／kg体重、または 約90μｇでGAを毎日５日間腹腔内注射することから成っていた。腫瘍の形成は、 細胞の接種後21日に、100mgまたはそれ以上の明確な塊の切除により決定して評 価した。引き続く腫瘍形成の顕著な減少は、HAおよびGAの両者後明らかであった 。薬物処置した動物において形成した腫瘍の平均重量は、また、有意により小さ かった。重量損失、運動活性の減少または局所的皮膚反応により証明される顕在 的毒性は認められなかった。 １つの場合において、局所的GA処置にかかわらず形成した腫瘍を無菌的に切除 し、組織培養培地中で離解し、そしてGAの存在または不存在下に生体外で９日間 増殖させた。この方法で回収した細胞培養物はよく増殖しそして、重要なことに は、前もってGAで生体内処置したにもかかわらず、生体外でその細胞障害作用に 対して完全に止まった。この発見が示唆するように、局所的GAはすべての動物に おいて腫瘍の形成を阻害することができなかったのは、活性薬物への不適切な暴 露および腫瘍耐性の不獲得の結果であった。 同様な実験において、ヌードマウスにヒト前立腺癌細胞を皮下注射した。これ らのマウスを５mg/kgのHAで腹腔内（IP）処置した。第５図を参照のこと。５×1 0⁶のヒト前立腺癌細胞を皮下接種した。処置は腫瘍細胞接種の日に開始し、そし て合計３投与について１日置きに反復した。処置は腹腔内注射として５mg／kgの ヘルビマイシンＡから成っていた。動物を殺し、そして腫瘍を切除し、そして接 種後２週に秤量した。 確立された腫瘍の増殖を阻害するHAの能力を、また、ヌードマウスのモデルに おいて検査した。腫瘍細胞接種後10日において４投与で３日置きに腹腔内に与え た、1.5mg／kgの投与量のHA処置の開始は、腫瘍細胞接種後第21日に決定して、 腫瘍の質量を減少した（第６図）。確立された皮下腫瘍をもつヌードマウスに、 腫瘍細胞接種後10，13，16および19日にHA 1.5mg／kgまたは等しい体積の賦形剤 を腹腔内注射した。各点は第21日に切除した個々の腫瘍の塊の重量を描写する。 破線の水平線は、賦形剤処置したマウスから切除した腫瘍の平均重量を示す。lo g変換データについて実施したスチューデン式テストによる対照／HA処置腫瘍重 量の比較はｐ＝0.057を生ずる。 HAおよびGAは選択的に細胞致死性であると思われるので、基本的生物学ならび に臨床的薬物開発の両者の観点からそれらの作用の正確なメカニズムを定めるこ とは非常に重要である。例えば、これら の薬物の作用のメカニズムを理解することは、他の感受性の腫瘍の型の同定を可 能とする。参照、Whitesellら、“ベンゾキノイドアンサマイシンはsrcキナーゼ 阻害に対して無関係の選択的殺腫瘍活性を有する（Benzoquinoid Ansamycins Po ssess Selective Tumoricidal Activity Unrelated to src Kinase Inhibition ）”，Cancer Research 52：1721-1728（April 1，1992）。黒色腫細胞系は、こ れらのアンサマイシンの発育／表現型を特別に定めるためのアプローチとして評 価されている。 さらに、GA誘導体のパネルは組織培養モデル系における効能および選択性につ いてスクリーニングした。培養における腫瘍の発育に対して活性であった薬物を 列挙する表３を参照のこと。発生した構造−活性の関係は活性のための要求され る重要な特徴を正確に定めるべきであり、そしてこれらの薬物のための細胞内標 的を同様に示唆する。 最後に、報告された異種移植の腫瘍の結果は、ベンゾキノイドアンサマイシン についての有望な生体内抗腫瘍活性を示唆する。基礎の薬学的情報がほぼ完全に 欠如していることから、生体内の抗腫瘍活性の検出は促進されている。ここに記 載する抗生物質は小さい親油性分子であり、大量生産が比較的容易でありそして 、全身的投与後、充実腫瘍およびさらに血液−脳障壁を容易に浸透すべきである 。これらのような化合物は、生物学特異性および殺腫瘍薬学の両者を有する新規 な薬物の世代の開発のためのモデルとしてよく働くことができるであろう。 表３ 17−デス−Ｏ−メチルゲルダナマイシン、 ゲルダナマイシンアセテート、 ７′，８′−ベンゾデメトキシゲルダノキサゾン、 ヒドロゲルダナマイシン−18，21−ジアセテート、 ７′−（および８′）−フルオロデメトキシゲルダナジン、 ７′−ブロモデメトキシゲルダノキサジノン、 19−ピペリジノゲルダナマイシン、 ８′−ブロモデメトキシゲルダノキサジノン、 ７′−（または８′）−フルオロデメトキシゲルダナジン、および 17−アミノ−17−デメトキシゲルダナマイシン。 以上の説明および実施例は例示であり、そしてすべての参考文献は引用によっ て加える。投与、スケジュール、適応および毒性に関して手順の適当な変化を当 業者は速やかに認識するであろう。こうして、本発明は添付する請求の範囲によ ってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トリペル，ジェーン アメリカ合衆国，メリーランド 20816, ベセスダ，ウィッショミング ロード 5121 (72)発明者 マイアーズ，チャールズ アメリカ合衆国，メリーランド 20852, ロックビル，ラルストン ロード 11111

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．悪性疾患を有する動物に有効投与量のアンサマイシンベンゾキノンを投与 することからなる、初期神経外胚葉腫瘍、前立腺癌、黒色腫、および転移性ユー イング肉腫から成る群より選択されるヒト悪性疾患を処置する方法。 ２．投与が非経口的である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．投与が静脈内である請求の範囲第２項記載の方法。 ４．有効投与量が約0.1mg／kg〜約20mg／kgの範囲から選択される請求の範囲 第１項記載の方法。 ５．有効投与量が約１mg／kg〜約10mg／kgの範囲から選択される請求の範囲第 ４項記載の方法。 ６．有効投与量が約５mg／kgである請求の範囲第５項記載の方法。 ７．アンサマイシンベンゾキノンがゲルダナマイシンおよびその誘導体、ヘル ビマイシンＡおよびその誘導体、およびマクベシンＩおよびその誘導体から成る 群より選択される請求の範囲第１項記載の方法。 ８．前記アンサマイシンベンゾキノンが、下記式： 〔式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄はＨ、低級アルキル、低級アルコキシ、および ヒドロキシから成る群より独立に選択される〕で表わされる請求の範囲第１項記 載の方法。 ９．前記Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄がＨ、メチル、メトキシ、およびヒドロキシ から成る群より独立に選択される請求の範囲第８項記載の方法。 10．ヒトに有効投与量のゲルダナマイシンおよびその誘導体、ヘルビマイシン Ａおよびその誘導体、およびマクベシンＩおよびその誘導体から成る群より選択 されるアンサマイシンベンゾキノンを非経口的に投与することからなり、 前記有効投与量が癌の症状または徴候を改善するために十分な量であり、前記 量が0.1mg／kg〜約20mg／kgの範囲である、 初期神経外胚葉腫瘍、前立腺癌、黒色腫、および転移性ユーイング肉腫から成る 群より選択されるヒト悪性疾患を処置する方法。 11．前記アンサマイシンベンゾキノンが、 17−デス−Ｏ−メチルゲルダナマイシン、 ゲルダナマイシンアセテート、 ７′，８′−ベンゾデメトキシゲルダノキサゾン、 ヒドロゲルダナマイシン−18，21−ジアセテート、 ７′−（および８′）−フルオロデメトキシゲルダナジン、 ７′−ブロモデメトキシゲルダノキサジノン、 19−ピペリジノゲルダナマイシン、 ８′−ブロモデメトキシゲルダノキサジノン、 ７′−（または８′）−フルオロデメトキシゲルダナジン、および 17−アミノ−17−デメトキシゲルダナマイシン、 から成る群より選択されるゲルダナマイシン誘導体である請求の範 囲第１項記載の方法。 12．少なくとも１種の薬学的に許容されうる賦形剤および製剤組成物を少なく とも１回投与する哺乳動物における癌を処置するために有効量のアンサマイシン ベンゾキノンからなり、前記癌は初期神経外胚葉腫瘍、前立腺癌、黒色腫、およ び転移性ユーイング肉腫からなる群より選択される、医薬組成物。 13．前記アンサマイシンベンゾキノンが、下記式： 〔式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄はＨ、低級アルキル、低級アルコキシ、および ヒドロキシから成る群より独立に選択される〕で表わされる請求の範囲第12項記 載の方法。 14．前記Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄がＨ、メチル、メトキシ、およびヒドロキシ から成る群より独立に選択される請求の範囲第12項記載の方法。 15．前記哺乳動物がヒトである請求の範囲第12項記載の方法。 16．前記アンサマイシンベンゾキノンの量が約0.1mg／kg〜約20mg／kgの範囲 から選択される請求の範囲第12項記載の方法。 17．前記アンサマイシンベンゾキノンの量が約１mg／kg〜約15mg／kgの範囲か ら選択される請求の範囲第16項記載の方法。 18．前記アンサマイシンベンゾキノンの量が約５mg／kgである請 求の範囲第１７項記載の方法。 19．前記組成物が非経口的投与に適合する請求の範囲第12項記載の方法。 20．前記組成物が静脈内投与に適合する請求の範囲第19項記載の方法。 21．前記アンサマイシンベンゾキノンがゲルダナマイシンおよびその誘導体、 ヘルビマイシンＡおよびその誘導体、およびマクベシンＩおよびその誘導体から 成る群より選択される請求の範囲第12項記載の組成物。 22．前記アンサマイシンベンゾキノンが、 17−デス−Ｏ−メチルゲルダナマイシン、 ゲルダナマイシンアセテート、 ７′，８′−ベンゾデメトキシゲルダノキサゾン、 ヒドロゲルダナマイシン−18，21−ジアセテート、 ７′−（および８′）−フルオロデメトキシゲルダナジン、 ７′−ブロモデメトキシゲルダノキサジノン、 19−ピペリジノゲルダナマイシン、 ８′−ブロモデメトキシゲルダノキサジノン、 ７′−（または８′）−フルオロデメトキシゲルダナジン、および 17−アミノ−17−デメトキシゲルダナマイシン、 から成る群より選択されるゲルダナマイシン誘導体である請求の範囲第12項記載 の方法。