CN106852146A - 细胞穿透肽及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了具有作为细胞穿透肽的活性的化合物。在一些实例中，所述化合物可以包含细胞穿透肽部分和货物部分。所述货物部分可以包含一个或多个可检测部分、一个或多个治疗部分、一个或多个靶向部分或其任意组合。在一些实例中，所述细胞穿透肽部分为环状。在一些实例中，所述细胞穿透肽部分和货物部分一起为环状。在一些实例中，所述细胞穿透肽部分为环状，并且所述货物部分附接到环状细胞穿透性肽部分结构。在一些实例中，所述货物部分为环状，并且所述细胞穿透肽部分为环状，并且它们一起形成稠合双环体系。

Description

细胞穿透肽及其制备和使用方法
关于联邦资助研究的声明
本发明在由美国国立卫生研究院授予的授权号GM062820、GM110208和CA132855的政府支持下进行。政府对本发明享有一定权利。
背景
质膜是药物(尤其是生物制品例如肽、蛋白质和核酸)开发中的一个主要挑战。破坏膜屏障并将生物制品递送到细胞中的一个潜在策略是将生物制剂与“细胞穿透肽(CPP)”相连。尽管进行了三十年的研究，CPP活性的根本基础仍不清楚。经由内吞作用进入细胞的CPP必须从内吞囊泡排出以到达细胞质。遗憾的是，内体膜已被证实是通过这些CPP进行细胞质递送的重要屏障；通常可忽略部分的肽逃逸到细胞内部(El-Sayed，A等，AAPS J.，2009,11,13-22；Varkouhi，AK等，J.Controlled Release，2011,151,220-228；Appelbaum，JS等，Chem.Biol.，2012,19,819-830)。因此需要可用于将试剂递送至各种细胞类型的新型细胞穿透肽和包含此类肽的组合物。本文公开的组合物和方法解决了这些及其它需要。
概述
本文公开了具有作为细胞穿透肽的活性的化合物。在一些实例中，所述化合物可包含细胞穿透肽部分和货物部分(cargo moiety)。货物部分可包含一个或多个可检测部分、一个或多个治疗部分、一个或多个靶向部分或其任意组合。
在一些实例中，所述细胞穿透肽部分为环状。在一些实例中，细胞穿透肽部分和货物部分一起为环状；本文中将其称为“环内”构型。在一些实例中，细胞穿透肽部分为环状，并且货物部分附接到环状细胞穿透性肽部分结构；在本文中将其称为“环外”构型。在一些实例中，货物部分为环状，并且细胞穿透肽部分为环状，并且它们一起形成稠合双环体系；在本文中将其称为“双环”构型。
在一些实例中，化合物可以具有式I：
其中，AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8和AA9(即，AA1-AA9)各自独立地为氨基酸；并且m、n和p独立地选自0和1。在式I的另一些实例中，可以有超过9个氨基酸，使得当m和p为1时，n为2或更大。这些较大的肽以本文中的各式公开，例如IA、II、IIa、IIb和IIc。在一些实例中，三个或更多个氨基酸是精氨酸，并且一个或多个是苯丙氨酸。在另一些实例中，一个或多个氨基酸是萘基丙氨酸或色氨酸。
在一些实例中，所述细胞穿透肽部分为环状，并且化合物可以是式Ia化合物：
其中AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义，并且其中曲线表示共价键。
在一些实例中，所述化合物还包含货物部分，且所述化合物可具有式II：
其中所述货物部分可包含可检测部分、治疗部分、靶向部分或其组合，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在一些实例中，细胞穿透肽部分和货物部分一起为环状，并且化合物具有式IIa：
其中所述货物部分如式II中所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在一些实例中，细胞穿透肽部分为环状，并且货物部分附接至环状细胞穿透肽部分结构，并且化合物具有式IIb：
其中货物部分如式II所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在一些实例中，货物部分为环状，并且细胞穿透肽部分为环状，货物部分与细胞穿透肽部分一起形成稠合双环体系，化合物具有式IIc：
其中货物部分如式II所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
所述氨基酸可以通过肽键偶联。所述氨基酸可以在氨基、羧酸酯基团或侧链处偶联至货物部分。
在一些实例中，至少一个氨基酸包括萘基丙氨酸或其类似物或衍生物。在一些实例中，至少三个氨基酸独立地包括精氨酸或其类似物或衍生物。在一些实例中，至少一个氨基酸包括苯丙氨酸或其类似物或衍生物。在一些实例中，至少一个氨基酸包含谷氨酰胺或其类似物或衍生物。
在一些实例中，细胞穿透肽部分可以是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90中的任一个。在一些实例中，细胞穿透肽部分可以是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：90中任一个的变体。
货物部分可以包括任何感兴趣的货物，例如接头部分、可检测部分、治疗部分、靶向部分等，或其任意组合。
货物部分可以在细胞穿透肽部分的任意氨基酸的氨基、羧酸酯基或侧链上连接到细胞穿透肽部分(例如，在氨基、羧酸酯基或侧链或AA1-AA9中的任一个)。
在一些实例中，治疗部分包含靶向部分。靶向部分可以包含，例如，可以靶向一个或多个酶结构域的氨基酸序列。在一些实例中，靶向部分可包含针对蛋白质的抑制剂，其可在疾病例如癌症、囊性纤维化、糖尿病、肥胖症或其组合中起作用。在一些实例中，治疗部分可包含可用作针对Ras(例如K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2SH2、CAL PDZ等或其组合的抑制剂的靶向部分。
本文还公开了包含本文所述的化合物的组合物。本文还公开了所公开的化合物的药学上可接受的盐和前药。
本文还提供了本文所述的化合物或组合物的使用方法。本文还提供了用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病状的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任意化合物或组合物。
本文还提供了治疗、预防或改善受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐。本文所述的治疗或预防癌症的方法还可包括用一种或多种另外的试剂(例如，抗癌剂或电离辐射)进行治疗。
本文还描述了杀死受试者中的肿瘤细胞的方法。该方法包括使肿瘤细胞与有效量的本文所述的化合物或组合物接触，并且任选地包括用有效量的电离辐射辐照肿瘤细胞的步骤。另外，本文提供了肿瘤放射治疗的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的本文所述的化合物或组合物接触，并用有效量的电离辐射辐照肿瘤。
在治疗、预防或改善受试者的癌症或肿瘤的治疗方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对Ras(例如，K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2SH2或其组合的抑制剂的靶向部分。
所公开的主题还涉及用于治疗患有代谢病症或疾患的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用至患有代谢病症及有此治疗需要的受试者。在一些实例中，所述代谢病症可包括II型糖尿病。在治疗、预防或改善受试者的代谢病症的治疗方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对PTP1B的抑制剂的靶向部分。
所公开的主题还涉及用于治疗患有免疫病症或疾患的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用至患有免疫障碍及有此治疗需要的受试者。在治疗、预防或改善受试者的免疫障碍的治疗方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对Pin1的抑制剂的靶向部分。
所公开的主题还涉及用于治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用至患有囊性纤维化及有此治疗需要的受试者。在治疗受试者的囊性纤维化的方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对CAL PDZ的抑制剂的靶向部分。
在附图和下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从说明书和附图以及从权利要求书中，本发明的其它特征、目的和优点将是显而易见的。
附图描述
结合在本说明书中并构成本说明书一部分的附图对下述若干方面进行了说明。
图1显示通过cFΦR4在货物(显示为浅灰色)的内环(A)、环外(B)和双环递送(C)期间货物附接的结构。
图2显示本研究中使用的一些肽的结构。
图3显示示出cFΦR4-S-S-GFP的合成的方案。
图4显示示出cFΦR4-PTP1B的合成的方案。
图5显示FITC标记的cFΦR4、R9和Tat与(A)SUV和(B)硫酸乙酰肝素的结合。
图6显示用罗丹明B标记的肽和流体相摄取标志物葡聚糖FITC处理2小时的HEK293细胞的代表性活细胞共聚焦图像。(A)用5μM cFΦR4-A5和葡聚糖FITC处理的在同一Z-截面的细胞。(B)用5μM cFΦR4-R5和葡聚糖FITC处理的在同一Z-截面的细胞。
图7显示cFΦR4对HeLa细胞对葡聚糖Alexa488的内吞作用的影响。HeLa细胞用不含补充物、仅1μM cFΦR4、仅100μM葡聚糖Alexa488或者1μM cFΦR4和100μM葡聚糖Alexa488的澄清DMEM处理。MFI，平均荧光强度。
图8显示pH对CAP荧光的影响。cFΦR4-PCP通过碱性磷酸酶脱磷酸化并通过HPLC纯化，并测量其在指定pH下的荧光。
图9显示含有pCAP的肽向培养细胞的内化：I，未标记的PCP；II，cFΦR4-PCP；III，cFΦR4-PCP和Na3VO4；IV，R9-PCP；V，Tat-PCP；和VI，Antp-PCP。(A)用5μM肽处理的HEK293细胞的代表性活细胞共聚焦图像。上图，使用DRAQ5进行的核染色；下图，在同一Z-截面上的CAP荧光。(B)用0或10μM肽处理的HeLa细胞的流式细胞术。(C)从(B)减去本底荧光(未处理的细胞)后的CAP荧光。MFI，平均荧光强度。
图10显示用罗丹明B标记的肽(均为5μM)和流体相内吞标志物葡聚糖FITC(0.5mg/mL)处理2小时的HEK293细胞的代表性活细胞共聚焦显微镜图像。每幅图中显示了来自同一Z-截面的罗丹明B的红色荧光和葡聚糖FITC的绿色荧光及其合并图像。在每种情况下显示典型细胞的放大图像以示出内化肽的细胞内分布。(A)用双环(FΦR4-A5)Rho处理的细胞；(B)单环(FΦR4-A5)Rho；(C)双环(FΦR4-A7)Rho；(D)单环(FΦR4-A7)Rho；(E)双环(FΦR4-RARAR)Rho；和(F)双环(FΦR4-DADAD)Rho。
图11显示(A)CPP-S-S-GFP缀合物的结构。(B)用1μM GFP(I)、Tat-S-S-GFP(II)或cFΦR4-S-S-GFP(III)和核染色DRAQ5处理2小时后哺乳动物细胞的活细胞共聚焦图像。全部图像以同一Z截面记录。
图12显示(A)用0-500nM PTP1B或cFΦR4-PTP1B(IB：抗pY抗体4G10)处理后，NIH3T3细胞的整体pY蛋白质水平的蛋白质印迹分析。(B)通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析与(A)中相同的样品。M，分子量标志物。
图13显示(A)cFΦR4、Tat、R9和Antp的血清稳定性的比较。(B)cFΦR4的细胞毒性。用DMSO(对照)、5μM或50μM cFΦR4处理指定的细胞系24小时，通过MTT测定法测定活细胞的百分比。
图14显示用cFΦR4(5或50μM)处理(A)48小时或(B)72小时后各种哺乳动物细胞的MTT测定。
图15显示示出沿着胞吞途径的点的图，其中cFΦR4、R9和Tat逃逸到细胞质中并且其中提出特异性抑制剂起作用。
图16显示示出用于将线性肽基货物递送到哺乳动物细胞中的可逆环化策略的方案。GSH，谷胱甘肽。
图17显示(A)二硫键环化肽的合成。(B)硫醚键环化肽的合成。试剂和条件：(a)标准Fmoc/HATU化学；(b)哌啶/DMF；(c)3,3'-二硫代二丙酸/DIC；(d)β-巯基乙醇/DMF；(e)改性试剂K；(f)研磨；(g)DMSO/DPBS(pH7.4)。(h)4-溴丁酸/DIC；(i)1％TFA/DCM；(j)1％DIPEA/DMF；PG，保护基。Trt，三苯甲基；Mmt，甲氧基三苯甲基。(C)FITC标记的肽1和2的结构。(D)含有肽1-PCP和2-PCP的pCAP(磷酸香豆基氨基丙酸)的结构。(E)含有胱天蛋白酶荧光底物3-7的Amc(7-氨基-4-甲基香豆素)的结构。(F)FITC标记的CAL-PDZ结构域配体9-11的结构。
图18显示(A)用5μM FITC-标记的肽1(I)或2(II)、内吞作用标志物葡聚糖Rho(0.5mg mL-1)和核染色剂DRAQ5处理的HeLa细胞的活细胞共聚焦显微镜图像。不同荧光通道中的图像均以同一Z截面记录。(B)用5μM FITC-标记的肽1,2或单独的FITC处理的HeLa细胞的流式细胞术。
图19显示(A)用0或5μM肽1-PCP、2-PCP处理2小时的HeLa细胞的FACS分析。(B)从(A)减去本底荧光(未处理细胞)后的CAP荧光。MFI，平均荧光强度。
图20显示肽1和2的蛋白水解稳定性的比较。
图21显示在不存在和存在100μM半胱天冬酶抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK(FMK)的情况下，用肽3-7(5μM)处理的Jurkat细胞的荧光香豆素产物的时间依赖性释放。
图22显示(A)CAL-PDZ抑制剂8的结构。(B)在存在或不存在还原剂的情况下，肽8与CAL-PDZ结构域的结合。(C)用肽8(5μM)和DRAQ5处理的HeLa细胞在同一Z-截面的活细胞显微镜图像。I，内化肽8的绿色荧光；II，绿色肽荧光和蓝色核染色的重叠。(D)显示在存在或不存在Corr-4a(10μM)和未标记肽8(50μM)的情况下CFTR的分布的免疫荧光染色。(E)SPQ测定显示在存在或不存在VX809(20μM)和肽8(50μM)的情况下，CFTR特异性刺激诱导荧光的斜率的增加。P值由双尾t检验计算。
图23显示细胞可通透(cell-permeable)的PTP1B抑制剂的进化的示意图。
图24显示了环肽文库的设计和合成的示意图。试剂和条件：(a)标准Fmoc/HBTU化学；(b)浸入水中；(c)0.1当量Fmoc-Glu(δ-NHS)-OAll，0.4当量Boc-Met-OH在Et2O/CH2Cl2中；(d)哌啶；(e)分为两部分；(f)通过Fmoc/HATU化学分裂和合并合成；(g)Pd(PPh3)4；(h)PyBOP，HOBt；和(i)试剂K.X2,10％F2Pmp和90％Tyr；X1和X3-X5，随机位置；Φ，L-2-萘基丙氨酸；CPP，细胞穿透基序FΦR4或R4ΦF。
图25显示通过单环肽抑制剂2的PTP1B的竞争性抑制。(A)在不同浓度的抑制剂2(0、22.5、45和90nM)的存在下，pNPP(0-24mM)的PTP1B催化水解的Lineweaver-Burk图)。(B)作为[I]的函数的米氏常数比(K/K0)的二次图。
图26显示用5μM FITC标记的抑制剂2(上图)或4(下图)和内吞作用标志物葡聚糖Rho(1.0mg/mL)处理2小时后A549肺癌细胞的(a)活细胞共聚焦显微镜图像(同一Z-截面)。(b)Lineweaver-Burk图，其显示0、28、56和112nM抑制剂4对PTP1B的竞争性抑制。(c)各种PTP对抑制剂4的抑制的敏感性(所有活性均相对于不存在抑制剂时)。
图27显示抑制剂4的固相合成。试剂和条件：a)标准Fmoc化学；b)均苯三酸，HBTU；c)Pd(PPh3)4，N-甲基苯胺；d)PyBOP；e)TFA。
图28显示单环PTP1B抑制剂2和双环抑制剂4的血清稳定性的比较。
图29是用0-5μM抑制剂4处理2小时后A549细胞中整体pY蛋白质水平的图。(b)来自(a)的相同样品的SDS-PAGE分析(考马斯蓝染色)显示在所有泳道中均匀的样品加载。(c)抑制剂4对Tyr1162和Tyr1163位点的胰岛素受体磷酸化的影响。用指定浓度的抑制剂4处理HepG2细胞2小时，然后用胰岛素(100nM)刺激5分钟，随后用抗-IRpY1162/pY1163抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹。(d)来自(c)的IR pY水平的定量(所示数据是来自五次独立实验的平均值±SD)。
图30显示不可通透的Pin1抑制剂转化成细胞可通透的双环抑制剂。
图31显示Pin1抑制剂5-9与Pin1的结合的FA分析。
图32显示抑制剂5和7竞争与Pin1的结合。每个反应含有0.1μMFITC标记的抑制剂5、1μM Pin1和0-5μM未标记的抑制剂5(a)或抑制剂7(b)，测量FA值并对竞争剂浓度作图。
图33显示Pin1抑制剂的细胞摄取。(a，b)用5μM FITC标记的Pin1抑制剂5(a)或7(b)和1mg/mL胞吞标志物葡聚糖Rho处理2小时的HEK293细胞的活细胞共聚焦显微镜图像。所有图像均以同一Z截面记录。(c)用DMSO或5μM FITC标记的Pin1抑制剂5、7、8或9处理2小时后HeLa细胞的FACS分析。MFI，平均荧光强度。步骤：在六孔板(每孔2×105个细胞)中培养Hela细胞24小时。在实验当天，在补充有1％FBS的无酚红DMEM中用5μM FITC标记的双环肽或对照单环肽孵育细胞。2小时后，除去肽溶液，用DPBS洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶处理5分钟，再次用DPBS洗涤。最后，将细胞重悬于流式细胞术缓冲液中，并通过流式细胞术(BDFACS Aria)进行分析，在535nm处激发。
图34显示Pin1抑制剂5、7、8和9对癌细胞增殖的影响。将HeLa细胞(每孔100μL，5×104个细胞/mL)接种在96孔培养板中，使其在补充有10％FBS的DMEM中生长过夜。将不同浓度的Pin1抑制剂(0-5μM)加入孔中，并将细胞在37℃下用5％CO2孵育72小时。之后，向每个孔中加入10μL MTT储液(5mg/mL)。将板在37℃下孵育4小时，并将100μL的SDS-HCl增溶溶液加入每个孔中，然后充分混合。将板在37℃孵育过夜，并在Molecular Devices SpectramaxM5读板仪上于570nm测量甲瓒产物的吸光度。每个实验一式三份进行，并且将未用肽处理的细胞用作对照。
图35显示用5μM c(FΦRRRRQ)-K(FITC)(a)和c(fΦRrRrQ)-K(FITC)(b)处理3小时后小鼠心室心肌细胞的活细胞共聚焦图像。(c)用环状细胞穿透肽通过二硫键标记钙调素(T5C)。(d)用6μM cFΦR4缀合的Cy3标记的钙调蛋白处理3小时后小鼠心室心肌细胞的活细胞共聚焦图像。
图36显示针对Pin1的双环肽抑制剂的进展。来源于文库筛选的结构部分以灰色显示，而在优化期间进行的改变以浅灰色显示。
图37显示肽37的表征。(a)通过荧光各向异性(FA)分析的FITC标记的肽37与Pin1的结合。(b)通过FA监测的肽37和FITC标记的肽1(100nM)竞争与Pin1(400nM)的结合。(c)使用Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-pNA作为底物，肽37对Pin1、Pin4、FKBP12和亲环素A的顺式-反式异构酶活性的影响。(d)肽1和37的血清稳定性的比较。
图38显示肽37的细胞活性。(a)通过流式细胞术分析的HeLa细胞对肽1、37和46(5μM)的细胞摄取。MFI，平均荧光强度；无，未处理的细胞(无肽)。(b)通过MTT测定法测量的肽37、46和47对HeLa细胞的抗增殖效应。(c)显示肽1、37和47对HeLa细胞中PML蛋白质水平的影响的蛋白质印迹。β-肌动蛋白用作加载对照。(d)来自(c)的蛋白质印迹结果的定量。报告的数据为本底扣除后并且表示来自3个独立实验的平均值±SD。
详述
本文所述的化合物、组合物和方法可以通过参考以下对所公开主题的具体方面的详细描述以及其中包括的实施例和图更容易地理解。
在公开和描述本发明的化合物、组合物和方法之前，应当理解，下面描述的方面不限于特定的合成方法或特定的试剂，因此当然可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述特定方面的目的，而不意图是限制性的。
此外，在本说明书中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以便更全面地描述所公开的内容所属的领域的状态。所公开的参考文献也单独地和具体地通过引用而并入本文中所包含的材料中，所述材料在依赖于参考文献的句子中讨论。
一般定义
在本说明书和所附权利要求中，将参考多个术语，其将被定义为具有以下含义。
在本申请的整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词的其他形式例如“包含”和“含有”是指包括但不限于，并且不意图排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。
如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指称。因此，例如，提到“组合物”包括两种或更多种这样的组合物的混合物，提到“试剂”包括两种或更多种这样的试剂的混合物，提及“该组分”包括两种或更多种这样的组分的混合物等。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或情况发生的情况和不发生的情况。
范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。“约”是指在该值的5％内，例如在该值的4％、3％、2％或1％内。当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解特定值形成另一方面。还应当理解，每个范围的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是重要的。
本文所用“受试者”是指个体。因此，“受试者”可包括驯养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如，小鼠、兔、豚鼠等)和鸟类。“受试者”还可以包括哺乳动物，例如灵长类动物或人。因此，受试者可以是人或兽患者。术语“患者”是指在临床医师(例如，医生)治疗下的受试者。
术语“抑制”是指活性、反应、病症、疾病或其它生物学参数的降低。这可以包括但不限于活性、反应、病症或疾病的完全消除。这还可以包括例如与天然或对照水平相比，活性、反应、病症或疾病减少10％。因此，与天然或对照水平相比，减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何减少量。
“减少”或该词的其他形式，例如“降低”或“减轻”是指事件或特征(例如肿瘤生长)的减少。应当理解，这通常与一些标准或预期值相关，换句话说，它是相对的，但是并不总是需要参考标准或相对值。例如，“减少肿瘤生长”意指肿瘤生长的速率相对于标准或对照降低。
“预防”或该词的其它形式例如“防止”或“防范”是指停止特定事件或特征、稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或者使特定事件或特征发生的机会最小化。阻止不需要与对照进行比较，因为它通常比例如减小更绝对。如本文所使用的，某些事情可以减少但不能防止，而某些可以减小的事情也可以防止。同样，某些事情可以防止但不能减少，但是可以防止的某些事情也可以减少。应当理解，在使用减少或防止的情况下，除非另有明确说明，否则还明确地公开了使用其它词语。例如，术语“预防”或“抑制”可以指预防或减缓疾病或病症的发作或降低疾病或病症的严重程度的治疗。因此，如果治疗可以治疗具有疾病症状的受试者的疾病，则其还可以预防或抑制尚未遭受一些或全部症状的受试者的疾病。
术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症的患者的医学管理。该术语包括积极治疗，即特异性针对疾病、病理状况或病症的改善的治疗，并且还包括因果治疗，即针对去除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即涉及最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充针对改善相关疾病、病理状况或病症的另一种特定治疗的治疗。
术语“抗癌”是指以任何浓度治疗或控制细胞增殖和/或肿瘤生长的能力。
术语“治疗有效”是指所使用的组合物的量具有足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状的量。这种改善仅需要减少或改变，而不一定消除。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性反应或与合理的利益/风险比相称的其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合为和/或剂型。
术语“载体”是指当与化合物或组合物组合时有助于或促进化合物或组合物的制备、储存、施用、递送、有效性、选择性或用于其预期用途或目的的任何其它特征的化合物、组合物、物质或结构。例如，可以选择载体以使活性成分的任何降解最小化并且使受试者中的任何不良副作用最小化。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，以指包含通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α氨基连接的两个或更多个氨基酸的天然或合成分子。
除非有相反的说明，否则具有仅显示为实线而不是楔形或虚线的化学键的化学式涵盖每种可能的异构体，例如每种对映异构体、非对映异构体和内消旋化合物以及异构体的混合物，例如外消旋或scalemic混合物。
现在将详细描述所公开的材料、化合物、组合物、制品和方法的具体方面，其实例在所附实施例和图中示出。
化合物
本文公开了具有作为细胞穿透肽的活性的化合物。在一些实例中，所述化合物可包含细胞穿透肽部分和货物部分。货物部分可包含一个或多个可检测部分、一个或多个治疗部分、一个或多个靶向部分或其任意组合。
在一些实例中，所述细胞穿透肽部分为环状。在一些实例中，细胞穿透肽部分和货物部分一起为环状。在一些实例中，细胞穿透肽部分为环状，并且货物部分附接到环状细胞穿透性肽部分结构。在一些实例中，货物部分为环状，并且细胞穿透肽部分为环状，并且它们一起形成稠合双环体系。
所述细胞穿透肽部分可包含五个或更多个、更具体地六个或更多个例如六至十二、或六至九个氨基酸。当有六至九个氨基酸时，化合物可以具有式I：
其中，AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7,AA8和AA9(即，AA1-AA9)各自独立地为氨基酸；并且m、n和p独立地选自0和1。在有超过9个氨基酸时，式I中m和p均为1，n可为2或更大，例如2至10或2至5。在一些实例中，三个或更多个氨基酸是精氨酸，并且一个或多个是苯丙氨酸。在另一些实例中，一个或多个氨基酸是萘基丙氨酸或色氨酸。
在一些实例中，所述化合物可以具有式I：
其中，AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7,AA8和AA9(即，AA1-AA9)各自独立地为氨基酸；并且m、n和p独立地选自0和1。
在一些实例中，所述细胞穿透肽部分为环状，并且化合物可以是式Ia化合物：
其中AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义，并且其中所述曲线表示共价键。曲线可以是肽主链中的共价键(即，一个AA的羧酸与另一个AA的α-胺形成酰胺键)、两个AA的侧链之间的键、来自AA的一个侧链与另一个AA的主链羧酸或α-胺的键或两个AA之间的二硫键。
在一些实例中，所述化合物还包含货物部分，且所述化合物可以具有式II：
其中所述货物部分可包含可检测部分、治疗部分、靶向部分或其组合，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在一些实例中，细胞穿透肽部分和货物部分一起为环状，并且化合物具有式IIa：
其中所述货物部分如式II中所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在一些实例中，细胞穿透肽部分为环状，并且货物部分附接至环状细胞穿透肽部分结构，并且化合物具有式IIb：
其中货物部分如式II所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在一些实例中，货物部分为环状，并且细胞穿透肽部分为环状，货物部分与细胞穿透肽部分一起形成稠合双环体系，化合物具有式IIc：
其中货物部分如式II所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
细胞穿透肽
细胞穿透肽部分包含至少5个，更具体地至少6个氨基酸，甚至更具体地6至12个、6至9个、6至7个、7至8个、8至9个和更具体地6、7、8或9个氨基酸。对于内环基序，可以使用至少5个氨基酸。本文还公开了对于内环结构，穿透肽部分中的一些氨基酸也可以是货物部分的一部分。例如，可以由FNal和具有两个Arg的货物部分形成肽戊化部分FNalRR。在这种情况下，两个Arg残基执行双重功能。因此，在一些情况下，当提及肽穿透部分时，考虑货物部分的序列。
对于环外基序，可以使用至少6个氨基酸，例如，用谷氨酰胺连接货物。
每个氨基酸可以是天然或非天然氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指作为天然氨基酸同源物的有机化合物，其具有类似于天然氨基酸的结构，使得其模拟天然氨基酸的结构和反应性。非天然氨基酸可以是不是20种常见天然氨基酸或稀有天然氨基酸硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸之一的经修饰氨基酸和/或氨基酸类似物。非天然氨基酸也可以是天然氨基酸的D-异构体。合适的氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸、别-异亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、奈基丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、衍生物或其组合。这些和其他以及在本文中使用的其缩写列在表1中。
表1.氨基酸缩写
*单字母缩写：当在本文中以大写字母显示时，其表示L-氨基酸形式，当在本文中以小写字母显示时，其表示D-氨基酸形式
所述氨基酸可以通过肽键偶联。所述氨基酸可以在氨基、羧酸酯基团或侧链处偶联至货物部分。
在式I的一些实例中，至少一个氨基酸包括萘基丙氨酸或色氨酸或其类似物或衍生物。在式I的一些实例中，至少三个氨基酸独立地包括精氨酸或其类似物或衍生物。在式I的一些实例中，至少一个氨基酸包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸或组氨酸或其类似物或衍生物。在式I的一些实例中，至少一个氨基酸包含谷氨酰胺或其类似物或衍生物。
在一些实例中，细胞穿透肽(CPP)部分可以是表2中所列的任意序列。在一些实例中，细胞穿透肽可以是表2中所列任意序列的反向序列。在一些实例中，细胞穿透肽序列可以是表2中所列任意序列的环状形式。
表2.CPP序列-线性或环状
SEQ ID NO CPP序列 #AA’s #R残基
1 FΦRRRQ 6 3
2 FΦRRRC 6 3
3 FΦRRRU 6 3
4 RRRΦFQ 6 3
5 RRRRΦF 6 4
6 FΦRRRR 6 4
7 FφrRrRq 7 3
8 FφrRrRQ 7 3
9 FΦRRRRQ 7 4
10 fΦRrRrQ 7 4
11 RRFRΦRQ 7 4
12 FRRRRΦQ 7 4
13 rRFRΦRQ 7 4
14 RRΦFRRQ 7 4
15 CRRRRFWQ 7 4
16 FfΦRrRrQ 8 4
17 FFΦRRRRQ 8 4
18 RFRFRΦRQ 8 4
19 URRRRFWQ 8 4
20 CRRRRFWQ 8 4
21 FΦRRRRQK 8 4
22 FΦRRRRQC 8 4
23 fΦRrRrRQ 8 5
24 FΦRRRRRQ 8 5
25 RRRRΦFDΩC 9 4
26 FΦRRR 5 3
27 FWRRR 5 3
28 RRRΦF 5 3
29 RRRWF 5 3
Φ＝L-奈基丙氨酸；φ＝D-奈基丙氨酸；Ω＝L-正亮氨酸
在一些实例中，细胞穿透肽部分可以是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：29中的任一个。在一些实例中，细胞穿透肽部分可以是SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：29中任一个的变体。肽变体是本领域技术人员公知的，并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常落入三个类别中的一个或多个：替换、插入或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是比氨基或羧基末端融合的插入更小的插入，例如，约1至3个残基。缺失的特征在于从肽序列中除去一个或多个氨基酸残基。通常，在肽中的任何一个位点处缺失不超过1至3个残基。氨基酸替换通常是单个残基，但可同时发生在多个不同位置；插入通常为约1至3个氨基酸残基；而缺失为约1至3个残基。缺失或插入优选在相邻对进行，即缺失2个残基或插入2个残基。替换、缺失、插入或其任意组合可以组合以得到最终构建体。替换变体是其中至少一个残基已被除去并且不同残基插入其位置的变体。这样的替换通常根据下表3进行，并且被称为保守替换。
表3.氨基酸替换
通过选择比表3中那些保守性更低的替换来进行功能的实质性改变，即选择在维持(a)替换区域中肽主链的结构例如作为片或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性或(c)侧链的体积的效果方面更显著不同的残基。通常预期产生蛋白质性质最大变化的替换将是如下那些：其中(a)亲水性残基例如丝氨酰或苏氨酰替换(或被替换)为疏水性残基，例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸替换(或被替换)为任何其它残基；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)替换(或被替换)为电负性残基，例如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(d)具有大体积侧链的残基，例如苯丙氨酸替换(或被替换)为不具有侧链的残基，例如甘氨酸，在这种情况下，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化的位点数。
例如，用生物学和/或化学相似的另一氨基酸残基替换一个氨基酸残基对于本领域技术人员来说是已知的保守替换。例如，保守替换将一个疏水性残基替换为另一个疏水性残基，或者将一个极性残基替换为另一个极性残基。所述替换包括组合例如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。每个明确公开的序列的这种保守替换的变体包括在本文提供的肽内。
应当理解，定义所公开的细胞穿透肽部分的变体的一种方式是通过根据与特定的已知序列的同源/同一定义变体。例如，SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：29均给出了特定的序列。具体公开了这些肽的变体，其与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：29具有至少85％、90％、95％或97％的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质的同源性。例如，可以在比对两条序列之后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
除了SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：29的变体外，这些肽的衍生物也在所公开的方法和组合物中起作用。衍生物通过用经修饰残基替换一个或多个残基而形成，其中残基的侧链已经被修饰。另外的实施例示于表6和18中并包括其变体。
货物部分
货物部分可以包括任何感兴趣的货物，例如接头部分、可检测部分、治疗部分、靶向部分等，或其任意组合。在一些实例中，货物部分可以包含一个或多个另外的氨基酸(例如，K、UK、TRV)；接头(例如，双功能接头LC-SMCC)；辅酶A；磷酸香豆酰基氨基丙酸(pCAP)；8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(miniPEG)；L-2,3-二氨基丙酸(Dap或J)；L-β-萘基丙氨酸；L-哌啶酸(Pip)；肌氨酸；均苯三酸；7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)；异硫氰酸荧光素(FITC)；L-2-萘基丙氨酸；正亮氨酸；2-氨基丁酸；罗丹明B(Rho)；地塞米松(DEX)；或其组合。
在一些实例中，货物部分可以包括表4中所列的那些中的任一种或其衍生物或组合。
表4.实施例货物部分
SEQ ID NO 缩写 序列*
30 RRRRR
31 AAAAA
32 FFFF
33 PCP DE(pCAP)LI
34 AAAAAAA
35 RARAR
36 DADAD
37 DΩUD
38 UTRV
*pCAP，膦酸香豆酰基氨基丙酸；Ω，正亮氨酸；U，2-氨基丁酸。
可检测部分
可检测部分可以包含任何可检测标记。合适的可检测标记的实例包括但不限于UV-Vis标记、近红外标记、发光基团、磷光基团、磁性自旋共振标记、光敏剂、光可裂解部分、螯合中心、重原子、放射性同位素、同位素可检测的自旋共振标记、顺磁性部分、发色团或其任意组合。在一些实施方案中，在不添加其它试剂的情况下可检测标记。
在一些实施方案中，可检测部分是生物相容性可检测部分，使得所述化合物可适用于多种生物应用。本文所用“生物相容的”和“生物相容的”通常是指这样的化合物，其与其任何代谢物或降解产物一起对细胞和组织通常是无毒的，并且在其存在下孵育(例如，培养)细胞和组织时对细胞和组织不造成任何显著的不利影响。
可检测部分可以包含发光体，例如荧光标记或近红外标记。合适的发光体的实例包括但不限于金属卟啉；苯并卟啉；氮杂苯并卟啉；萘并卟啉、酞菁；多环芳烃，例如苝、苝二亚胺、芘；偶氮染料；呫吨染料；硼二吡咯亚甲基、氮杂-硼二吡咯亚甲基、花青染料、金属-配体络合物例如联吡啶、联吡啶基、菲咯啉、香豆素以及钌和铱的乙酰丙酮化物；吖啶、噁嗪衍生物例如苯并吩噁嗪；氮杂-轮烯、方酸菁；8-羟基喹啉、聚甲炔、发光产生纳米颗粒例如量子点、纳米晶体；喹诺酮、铽络合物；无机荧光体；离子载体例如冠醚附着或衍生染料；或它们的组合。合适的发光团的具体实例包括但不限于Pd(II)八乙基卟啉；Pt(II)-八乙基卟啉；Pd(II)四苯基卟啉；Pt(II)四苯基卟啉；Pd(II)内消旋-四苯基卟啉四苯并吗啡；Pt(II)内消旋-四苯基甲基苯并卟啉；Pd(II)八乙基卟啉酮；Pt(II)八乙基卟啉酮；Pd(II)内消旋-四(五氟苯基)卟啉；Pt(II)内消旋-四(五氟苯基)卟啉；Ru(II)三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)(Ru(dpp)3)；Ru(II)三(1,10-菲咯啉)(Ru(phen)3)、三(2,2'-联吡啶)六水合氯化钌(II)(Ru(bpy)3)；赤藓红B；荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；曙红；铱(III)((N-甲基-苯并咪唑-2-基)-7-(二乙基氨基)-香豆素))；铟(III)((苯并噻唑-2-基)-7-(二乙基氨基)-香豆素)-2-(乙酰丙酮化物)；Lumogen染料；Macroflex荧光红；Macrolex荧光黄；德克萨斯红；罗丹明B；罗丹明6G；硫罗丹明；间甲酚；百里酚蓝；二甲苯酚蓝；甲酚红；氯酚蓝；溴甲酚绿；溴甲酚红；溴百里酚蓝；Cy2；Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；4-硝基苯酚；茜素；酚酞；邻甲酚酞；氯酚红；钙黄绿素；溴二甲酚；酚红；中性红；硝嗪；3,4,5,6-四溴酚酞；刚果红；荧光素；曙红；2'，7'-二氯荧光素；5(6)-羧基-荧光素；羧基萘并荧光素；8-羟基苯乙烯-1,3,6-三磺酸；半萘并二氟；半萘并荧光素；三(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)二氯化钌(II)；(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉)钌(II)四苯基硼；铂(II)八乙基卟啉；二烷基碳菁；双十八烷基环二羰花青；芴基甲氧基羰基氯；7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)；绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物或组合。
在一些实例中，可检测部分可包括罗丹明B(Rho)、异硫氰酸荧光素(FITC)、7-氨基-4-甲基香豆素(Amc)、绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物或组合。
可检测部分可以在细胞穿透肽部分的氨基、羧酸酯基或任意氨基酸的侧链连接到细胞穿透肽部分(例如，在氨基、羧酸酯基或侧链或AA1-AAx中的任一个)。
治疗部分
所公开的化合物还可以包含治疗部分。在一些实例中，货物部分包含治疗部分。可检测部分可以连接到治疗部分，或者可检测部分也可用作治疗部分。治疗部分是指当施用至受试者时将减少疾病或病症的一种或多种症状的基团。
治疗部分可以包括多种药物，包括拮抗剂例如酶抑制剂，激动剂例如导致期望的基因产物的表达增加的转录因子(尽管如本领域技术人员将理解的，也可以使用拮抗性转录因子)都包括在内。另外，治疗部分包括能够指导毒性和/或能够诱导对身体中的健康和/或不健康细胞的毒性的那些试剂。此外，治疗部分能够诱导和/或引发针对潜在病原体的免疫系统。
治疗部分可以例如包含抗癌剂、抗病毒剂、抗微生物剂、抗炎剂、免疫抑制剂、麻醉剂或其任意组合。
治疗部分可以包括抗癌剂。抗癌剂的实例包括13-顺-视黄酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、异维生素A酸(Accutane)、放线菌素D、阿霉素、Adrucil、安归宁、Ala-Cort、阿地白介素、阿仑单抗、阿里维A酸(Alitretinoin)、Alkaban-AQ、爱克兰、全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、鲁米特、阿那格雷、安得乐、阿那曲唑、阿糖胞苷、安然爱斯普、阿可达、瑞宁得、阿诺、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、阿瓦斯汀、BCG、BCNU、贝伐单抗、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、BiCNU、Blenoxane、博来霉素、硼替佐米、白消安、Busulfex、C225、亚叶酸钙、Campath、坎普土沙、喜树碱-11、卡培他滨、Carac、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀片、Casodex、CCNU、CDDP、CeeNU、正定霉素、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、亚叶酸因子、克拉屈滨(Cladribine)、可的松、可美净、CPT-11、环磷酰胺、Cytadren、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U、Cytoxan、达卡巴嗪(Dacarbazine)、放线菌素、达泊霉素α、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、DaunoXome、Decadron、Delta-Cortef、强的松、地尼白介素-毒素连接物、DepoCyt、地塞米松(Dexamethasone)、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、Dexasone、右雷佐生(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、Diodex、多西他赛(Docetaxel)、Doxil、阿霉素、多柔比星脂质体、Droxia、DTIC、DTIC-Dome、杜拉隆、Efudex、艾里咖、艾伦斯、乐沙定、爱施巴、Emcyt、表阿霉素、α依伯汀、爱必妥、欧文氏菌L-天门冬酰胺酶、雌莫司汀、Ethyol、凡毕复、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、Eulexin、易维特、依西美坦、法乐通、法洛德、复乳纳、非格司亭、氟尿苷、福达华、氟达拉滨、Fluoroplex、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮、氟他胺、氟胺酸、FUDR、氟维司群、G-CSF、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、Gemzar、格列卫、醋酸亮丙瑞林、储库型醋酸亮丙瑞林(Lupron Depot)、Matulane、Maxidex、氮芥、-盐酸氮芥、美卓龙、甲泼尼龙、Megace、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司那、Mesnex、氨甲喋呤、甲氨蝶呤钠、甲泼尼龙、Mylocel、来曲唑、Neosar、Neulasta、纽密伽、优保津、Nilandron、尼鲁米特、氮芥、Novaldex、诺肖林、奥曲肽、醋酸奥曲肽、Oncospar、长春新碱、Ontak、Onxal、欧普瑞维尔金、Orapred、Orasone、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、Panretin、伯尔定、Pediapred、PEG干扰素、培门冬酶、培非司亭、PEG-INTRON、PEG-L-天冬酰胺酶、苯丙氨酸氮芥、Platinol、Platinol-AQ、泼尼松龙、泼尼松、Prelone、丙卡巴肼、PROCRIT、普留净、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan20、Purinethol、雷洛昔芬、氨克生、美罗华、利妥昔单抗、Roveron-A(干扰素α-2a)、Rubex、盐酸鲁贝多霉素、善得定、善得定LAR、沙格莫丁、Solu-Cortef、Solu-Medrol、STI-571、链尿霉素(Streptozocin)、他莫昔芬(Tamoxifen)、塔格雷汀(Targretin)、他克唑、泰索帝(Taxotere)、Temodar、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA、沙利度胺、撒利多迈、TheraCys、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤药片、硫代磷酰胺、Thioplex、塞替派(Thiotepa)、TICE、Toposar、拓扑替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、Trexall、Trisenox、TSPA、VCR、Velban、万珂、凡毕士、凡善能、Viadur、长春碱、硫酸长春碱、Vincasar Pfs、长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VP-16、威猛、希罗达、Zanosar、泽娃灵、Zinecard、诺雷德、唑来膦酸、择泰、格立得晶片、Glivec、GM-CSF、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、氟甲睾酮、赫赛汀、Hexadrol、Hexalen、六甲蜜胺、HMM、和美新、Hydrea、乙酸氢化可通、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢化可的松、羟基脲、异贝莫单抗、替坦异贝莫单抗、埃得霉素、伊达比星、Ifex、IFN-α、异环磷酰胺、IL2、IL-11、甲磺酸伊马替尼、咪唑羧酰胺、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白细胞介素2、白细胞介素-11、内含子A(干扰素α-2b)、甲酰四氢叶酸、留可然、Leukine、亮丙瑞林、闻克斯丁、乐司他丁、脂质体Ara-C、Liquid Pred、洛莫司汀、L-PAM、L-沙可来新、Meticorten、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、M-泼尼松、MTC、MTX、氮芥、密吐霉素、Myleran、Iressa、爱莱诺迪肯、Isotretinoin、Kidrolase、Lanacort、L-门冬酰胺酶和LCR。治疗性部分还可以包含生物药物，例如抗体。
在一些实例中，治疗部分可包括抗病毒剂，例如更昔洛韦、叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)等。
在一些实例中，治疗部分可包括抗菌剂，例如阿卡泊隆、乙酰砜钠、阿莱霉素(alamecin)、阿莱西定(alexidine)、氮卓西林、匹美西林、阿米环素、氨氟沙星、甲磺酸氨氟沙星、阿米卡星、硫酸阿米卡星、氨基水杨酸、氨基水杨酸钠、阿莫西林、两性霉素、氨苄青霉素、氨苄青霉素钠、阿帕西林钠、安普霉素、天冬氨酸、硫酸天冬氨酸、阿维霉素、阿伏霉素、阿奇霉素、阿洛西林、阿洛西林钠、盐酸巴卡西林、杆菌肽、杆菌肽亚甲基二水杨酸酯、杆菌肽锌、班贝霉素、苯甲酰钙、硫酸红霉素、硫酸倍他霉素、比阿培南、比尼霉素、盐酸苯柳胺酯、硫酸镁双巯氧吡啶、布替卡星、硫酸丁酰苷菌素、硫酸卷曲霉素、卡巴多、羧苄青霉素二钠、羧苄青霉素茚基钠、羧苄青霉素苯钠、羧苄青霉素钾、香豆素钠、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢孟多酯钠、头孢孟多钠、头孢帕罗、头孢曲松、头孢唑啉钠、头孢唑啉、头孢唑啉钠、头孢哌酮、头孢地尼、头孢吡肟、盐酸头孢吡肟、头孢醇、头孢克肟、盐酸头孢甲肟、头孢美唑、头孢美唑钠、头孢尼西单钠、头孢尼西钠、头孢哌酮钠、头孢地尼、头孢噻肟钠、头孢替坦、头孢替坦二钠、盐酸头孢替安、头孢西丁、头孢西丁钠、头孢咪唑、头孢哌齐钠、头孢匹胺、头孢匹胺钠、硫酸头孢匹罗、头孢泊肟丙酯、头孢丙烯、头孢罗定、头孢磺啶钠、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟钠、头孢曲松钠、头孢呋辛、头孢呋辛酯、cefuroxime pixoxetil、头孢乙腈钠、头孢氨苄、盐酸头孢氨苄、头孢菌素、头孢噻啶、头孢噻吩钠、头孢匹林钠、头孢拉啶、盐酸西托环素(cetocycline hydrochloride)、乙酰氯霉素、氯霉素、氯霉素棕榈酸酯、氯霉素泛酸盐复合物、氯霉素琥珀酸钠、氨基苯磷酸氯己定、氯二甲苯酚、金霉素硫酸氢盐、盐酸金霉素、西诺沙星、环丙沙星、盐酸环丙沙星、西罗霉素、克拉霉素、盐酸克林沙星、克林霉素、盐酸克林霉素、克林霉素棕榈酸盐酸盐、磷酸克林霉素、氯法齐明、苄星邻氯青霉素、邻氯青霉素钠、氯羟喹(cloxyquin)、粘菌素甲磺酸钠、香豆霉素、香豆霉素钠、环西林、环丝氨酸、达福普汀、氨苯砜、达托霉素、地美环素、盐酸地美环素、去甲环素、地奴真菌素、敌菌净、双氯西林、双氯西林钠、硫酸二氢链霉素、二吡啶硫酮、地红霉素、多西环素、多西环素钙、多西环素磷酸复合物、盐酸多西环素、屈沙星钠、依诺沙星、依匹西林、盐酸差向四环素、红霉素、醋硬脂酸红霉素、依托红霉素、琥乙红霉素、葡庚糖酸红霉素、乳糖醛酸红霉素、丙酸红霉素、硬脂酸红霉素、乙胺丁醇盐酸盐、乙硫异烟胺、氟罗沙星、氟氯西林、氟氚丙氨酸、氟甲喹、磷霉素、磷霉素氨基丁三醇、呋莫西林、氯化呋喃鎓、酒石酸呋喃鎓、夫西地酸钠、夫西地酸、硫酸庆大霉素、格洛莫南、短杆菌肽、卤丙炔氧苯、海他西林、海他西林钾、海克西定(hexedine)、伊巴沙星、亚胺培南、异康唑、异帕米星、异烟肼、交沙霉素、硫酸卡那霉素、基达霉素、左氧氟沙星、左旋丙基西林钾、来红霉素、林可霉素、盐酸林可霉素、洛美沙星、盐酸洛美沙星、甲磺酸洛美沙星、氯碳头孢(loracarbef)、磺胺米隆(mafenide)、甲氯环素、磺基水杨酸甲氯环素、巨霉素磷酸钾、mequidox、美罗培南、美他环素、盐酸美他环素、乌洛托品(methenamine)、马尿酸乌洛托品、扁桃酸乌洛托品、甲氧西林钠、美替普林(metioprim)、盐酸甲硝哒唑、磷酸甲硝哒唑、美洛西林、美洛西林钠、米诺环素、盐酸米诺环素、盐酸吡霉素、莫能菌素、莫能菌素钠、萘夫西林钠、萘啶酸钠、萘啶酸、纳豆霉素、尼布霉素、新霉素棕榈酸酯、硫酸新霉素、十一碳烯酸新霉素、硫酸奈替米星、中性霉素、硝呋唑烯、硝呋地腙、硝呋太尔、硝呋隆、硝呋达齐、硝呋米特、硝呋吡醇、硝呋喹唑、硝基噻唑、硝基环素、呋喃妥因、硝基米特、诺氟沙星、新生霉素钠、氧氟沙星、昂纳妥普瑞、苯唑西林、苯唑西林钠、肟、肟钠、草酸、土霉素、土霉素钙、盐酸土霉素、帕利霉素、对氯苯酚、保罗霉素、培氟沙星、甲磺酸培氟沙星、青霉素、青霉素G苄星、青霉素G钾、青霉素G普鲁卡因、青霉素G钠、青霉素V、青霉素V苄星、海巴青霉素V、青霉素V钾、戊唑酮钠、苯基氨基水杨酸盐/酯、哌拉西林钠、吡苯青霉素钠、吡西林钠、盐酸普利霉素、盐酸匹氨青霉素、双羟萘酸匹氨青霉素(pivampicillinpamoate)、丙苯酸匹氨青霉素、硫酸多粘菌素B、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、普匹卡星、吡嗪酰胺、锌吡硫、乙酸喹乙胺、醋酸喹地卡明、奎奴普丁、消旋甲砜霉素、雷莫拉宁、雷尼霉素(ranimycin)、雷洛霉素(relomycin)、雷帕霉素、利福布汀、利福美坦、利福昔尔、利福酰胺、利福平、利福喷丁、利福昔明、罗利环素、硝酸罗利环素、罗沙米星、丁酸罗沙米星、丙酸罗沙米星、罗沙米星磷酸钠、硬脂酸罗沙米星、罗索沙星、罗沙胂、罗红霉素、三环素、三萜醇钠、萨莫青霉素、沙莫西林、司可芬净、西索米星、硫酸西索米星、司帕沙星、盐酸壮观霉素、螺旋霉素、盐酸偏端菌素(stallimycin hydrochloride)、西替霉素、硫酸链霉素、烟肼链霉素、磺胺苯、磺胺苯酰、磺乙酰胺、磺乙酰胺钠、磺胺西汀、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶钠、磺胺多辛、磺胺林、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、氨苯磺酸锌、磺胺硝苯、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噻唑、磺胺噻唑、磺胺吡唑、磺胺异噁唑、乙酰硫代异噁唑、磺胺异噁唑二乙醇胺、磺粘菌素、硫培南、舒他西林、磺氨苄青霉素钠、盐酸酞氨西林、替考拉宁、盐酸替马沙星、替莫西林四环素、盐酸四环素、磷酸四环素络合物、四氧嘧啶、甲砜霉素、噻吩西林钾、替卡西林甲酚钠(ticarcillin cresylsodium)、替卡西林二钠、替卡西林单钠、替克拉酮、氯化氯苯噻碘、妥布霉素、硫酸妥布霉素、托氟沙星、甲氧苄啶、硫酸甲氧苄啶、三磺嘧啶、醋竹桃霉素、硫酸丙大观霉素、短杆菌素、万古霉素、盐酸万古霉素、维及霉素或拉来霉素(zorbamycin)。
在一些实例中，治疗部分可包含抗炎剂。
在一些实例中，治疗部分可包含地塞米松(Dex)。
在另一些实例中，治疗部分包括治疗性蛋白质。例如，一些人的某些酶(例如溶酶体贮积病)存在缺陷。本文公开了通过将酶/蛋白质连接到所公开的细胞穿透肽之一来将这些酶/蛋白质递送至人细胞。所公开的细胞穿透肽已用蛋白质(例如GFP、PTP1B、肌动蛋白、钙调素、肌钙蛋白C)测试并显示有效。
在一些实例中，治疗部分包括靶向部分。靶向部分可以包括，例如，可以靶向一个或多个酶结构域的氨基酸序列。在一些实例中，靶向部分可包含针对可在疾病例如癌症、囊性纤维化、糖尿病、肥胖症或其组合中起作用的酶的抑制剂。例如，靶向部分可以包括表5中所列的任何序列。
表5.靶向部分的实例
*Fpa，Σ：L-4-氟苯丙氨酸；Pip，Θ：L-高脯氨酸；Nle，Ω：L-正亮氨酸；Phg，ΨL-苯基甘氨酸；F2Pmp，Λ：L-4-(膦酰二氟甲基)苯丙氨酸；Dap，L-2,3-二氨基丙酸；Nal，Φ'：L-β-萘基丙氨酸；Pp，θ：L-哌啶酸；Sar，Ξ：肌氨酸；Tm，均苯三甲酸。
靶向部分和细胞穿透肽部分可以重叠，即形成细胞穿透肽部分的残基也可以是形成靶向部分的序列的一部分，反之亦然。
治疗部分可以在细胞穿透肽部分的氨基、羧酸酯基或任意氨基酸的侧链上连接到细胞穿透肽部分(例如，在氨基、羧酸酯基或侧链或AA1-AAx中的任一个)。在一些实例中，治疗部分可以连接到可检测部分。
在一些实例中，治疗部分可包含可用作针对Ras(例如K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2SH2、CAL PDZ等或其组合的抑制剂的靶向部分。
Ras是在人类中由RAS基因编码的蛋白质。正常的Ras蛋白在正常组织信号传导中发挥必要的功能，并且Ras基因的突变涉及许多癌症的发展。Ras可用作分子开/关切换，一旦其被打开，Ras募集并激活为生长因子和其他受体信号的传播所必需的蛋白质。Ras的突变形式涉及各种癌症，包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和各种白血病。
蛋白-酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是PTP超家族的原型成员，并且在真核细胞信号传导期间发挥许多作用。PTP1B是胰岛素信号传导途径的负调节剂，并且被认为是有希望的潜在治疗靶标，特别是用于治疗II型糖尿病。PIP1B也参与乳腺癌的发展。
Pin1是一种结合蛋白质亚组并且在调节蛋白质功能中作为后磷酸化控制的作用的酶。Pin1活性可以调节脯氨酸定向激酶信号转导的结果，从而可以调节细胞增殖和细胞存活。Pin1的失调可在各种疾病中起作用。Pin1的上调可能涉及某些癌症，Pin1的下调可能涉及阿尔茨海默氏病。Pin1抑制剂可对癌症和免疫疾病具有治疗意义。
Grb2是参与信号转导和细胞通讯的衔接蛋白。Grb2蛋白含有一个SH2结构域，其可以结合酪氨酸磷酸化序列。Grb2广泛表达，是多种细胞功能所必需的。抑制Grb2功能可有损于发育过程，并且可以阻断各种细胞类型的转化和增殖。
最近报道，囊性纤维化膜电导调节剂(CFTR)(在囊性纤维化(CF)患者中突变的氯离子通道蛋白)的活性通过其PDZ结构域(CAL-PDZ)经CFTR相关配体(CAL)负调节)(Wolde，M等，J.Biol.Chem.2007,282,8099)。CFTR/CAL-PDZ相互作用的抑制显示改善ΔPhe508-CFTR的活性，所述ΔPhe508-CFTR是CFTR突变的最常见形式(Cheng，SH等.Cell 1990,63,827；Kerem，BS等，Science 1989，245,1073)，通过降低其蛋白酶体介导的降解(Cushing，PR等，Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9907)。因此，本文公开了一种通过施用有效量的本文公开的化合物或组合物来治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。施用至受试者的化合物或组合物可以包含治疗部分，其可以包含可用作针对CAL PDZ的抑制剂的靶向部分。此外，本文公开的化合物或组合物可与校正CFTR功能的分子一起施用。
具体实例
在一些实例中，化合物可以具有式I：
其中，AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7,AA8和AA9(即，AA1-AA9)各自独立地为氨基酸；并且m、n和p独立地选自0和1。
在式I的一些实例中，m、n和p为0，并且化合物具有式I-1：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6
I-1
其中，AA1-AA6如式I中所定义。
在式I的一些实例中，m为1，n和p为0，并且化合物具有式I-2：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7
I-2
其中，AA1-AA7如式I中所定义。
在式I的一些实例中，m和n为1，p为0，并且化合物具有式I-3：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8
I-3
其中，AA1-AA8如式I中所定义。
在式I的一些实例中，m、n和p为1，并且化合物具有式I-4：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9
I-4
其中，AA1-AA9如式I中所定义。
在一些实例中，细胞穿透肽部分为环状，并且化合物可以具有式Ia：
其中，AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义，并且其中曲线表示共价键。
在式Ia的一些实例中，m、n和p为0，并且化合物具有式Ia-1：
其中，AA1-AA6如式I中所定义。
在式Ia的一些实例中，m为1，n和p为0，并且化合物具有式Ia-2：
其中，AA1-AA7如式I中所定义。
在式Ia的一些实例中，m和n为1，p为0，并且化合物具有式Ia-3：
其中，AA1-AA8如式I中所定义。
在式Ia的一些实例中，m、n和p为1，并且化合物具有式Ia-4：
其中，AA1-AA9如式I中所定义。
在一些实例中，所述化合物还包含货物部分，并且所述化合物可具有式II：
其中所述货物部分可包含可检测部分、治疗部分、靶向部分或其组合，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在式II的一些实例中，m、n和p为O，并且所述化合物具有式II-1：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-货物
II-1
其中，AA1-AA6如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式II的一些实例中，m为1，n和p为0，并且所述化合物具有式II-2：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-货物
II-2
其中，AA1-AA7如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式II的一些实例中，m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式II-3：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-货物
II-3
其中，AA1-AA8如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式II的一些实例中，m和n和p为1，并且所述化合物具有式II-4：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-货物
II-4
其中，AA1-AA9如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在一些实例中，细胞穿透肽部分和货物部分一起为环状，并且化合物具有式IIa：
其中所述货物部分如式II中所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在式IIa的一些实例中，m、n和p为0，并且所述化合物具有式IIa-1：
其中，AA1-AA6如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。本文还公开了这样的式IIa-1，其中不存在AA1-AA6中之一(即，内环结构中有5个氨基酸)。
在式IIa的一些实例中，m为1，n和p为0，并且所述化合物具有式IIa-2：
其中，AA1-AA7如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIa的一些实例中，m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式IIa-3：
其中，AA1-AA8如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIa的一些实例中，m、n和p为1，并且所述化合物具有式IIa-4：
其中AA1-AA9如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在一些实例中，细胞穿透肽部分为环状，并且货物部分附接至环状细胞穿透肽部分结构，并且化合物具有式IIb：
其中货物部分如式II所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在式IIb的一些实例中，m、n和p为0，并且所述化合物具有式IIb-1：
其中，AA1-AA6如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIb的一些实例中，m为1，n和p为0，并且所述化合物具有式IIb-2：
其中，AA1-AA7如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIb的一些实例中，m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式IIb-3：
其中，AA1-AA8如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIb的一些实例中，m、n和p为1，并且所述化合物具有式IIb-4：
其中AA1-AA9如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在一些实例中，货物部分为环状，并且细胞穿透肽部分为环状，货物部分与细胞穿透肽部分一起形成稠合双环体系，并且所述化合物具有式IIc：
其中货物部分如式II所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
在式IIc的一些实例中，m、n和p为0，并且所述化合物具有式IIc-1：
其中AA1-AA6如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIc的一些实例中，m为1，n和p为0，并且所述化合物具有式IIc-2：
其中AA1-AA7如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIc的一些实例中，m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式IIc-3：
其中AA1-AA8如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在式IIc的一些实例中，m、n和p为1，并且所述化合物具有式IIc-4：
其中AA1-AA9如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
在一些实例中，所述化合物可以包含表6中的任意化合物。其它实例示于下表18中。
表6.实例化合物
*Fpa，Σ：L-4-氟苯丙氨酸；Pip，Θ：L-高脯氨酸；Nle，Ω：L-正亮氨酸；Phg，ΨL-苯基甘氨酸；F2Pmp，Λ：L-4-(膦酰二氟甲基)苯丙氨酸；Dap，J：L-2,3-二氨基丙酸；Nal，Φ'：L-β-萘基丙氨酸；Pp，θ：L-哌啶酸；Sar，Ξ：肌氨酸；Tm，均苯三酸；Φ，L-2-萘基丙氨酸；Rho，罗丹明B；Dex，地塞米松；FITC，异硫氰酸荧光素；miniPEG，8-氨基-3,6-二氧杂辛酸；pCAP，磷酰基香豆基氨基丙酸；Amc，7-氨基-4-甲基香豆素；FITC，异硫氰酸荧光素；U，2-氨基丁酸。
表7.此前报道的细胞穿透肽
本文还公开了包含本文所述的化合物的组合物。
本文还公开了所公开的化合物的药学上可接受的盐和前药。药学上可接受的盐包括根据化合物上发现的具体取代基用酸或碱制备的所公开化合物的盐。在本文公开的化合物具有足够碱性或酸性以形成稳定的无毒酸或碱盐的条件下，作为盐施用所述化合物可以是合适的。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐或镁盐。生理上可接受的酸加成盐的实例包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、碳酸、硫酸和有机酸例如乙酸、丙酸、苯甲酸、琥珀酸、富马酸、扁桃酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、丙二酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、α-糖磷酸、马来酸、甲苯磺酸、甲磺酸等。因此，本文公开的是盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-糖磷酸盐、马来酸盐、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐。化合物的药学上可接受的盐可以利用本领域公知的标准规程获得，例如通过使足够碱性的化合物(例如胺)与提供生理学上可接受的阴离子的合适的酸反应。也可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
制备方法
本领域技术人员可以理解，本文所述的化合物可以以有机合成领域的技术人员已知的各种方法或其变化形式制备。本文所述的化合物可以由容易获得的起始材料制备。最佳反应条件可随所用的具体反应物或溶剂而变化，但这些条件可由本领域技术人员确定。
本文所述化合物的变化包括如对每种化合物所述的各种成分的加入、减去或移动。类似地，当分子中存在一个或多个手性中心时，可以改变分子的手性。另外，化合物合成可涉及各种化学基团的保护和脱保护。保护和脱保护的使用以及合适的保护基团的选择可以由本领域技术人员确定。保护基团的化学可以在例如Wuts和Greene，Protective Groupsin Organic Synthesis，第4版，Wiley&Sons，2006中找到，其通过引用整体并入本文。
用于制备所公开的化合物和组合物的起始材料和试剂可以从商业供应商例如Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI)、Acros Organics(Morris Plains，NJ)、FisherScientific(Pittsburgh，PA)、Sigma(St.Louis，MO)、Pfizer(New York，NY)、GlaxoSmithKline(Raleigh，NC)、Merck(Whitehouse Station,NJ)、Johnson&Johnson(NewBrunswick,NJ)、Aventis(Bridgewater,NJ)、AstraZeneca(Wilmington,DE)、Novartis(Basel,Switzerland)、Wyeth(Madison,NJ)、Bristol-Myers-Squibb(New York,NY)、Roche(Basel,Switzerland)、Lilly(Indianapolis,IN)、Abbott(Abbott Park,IL)、ScheringPlough(Kenilworth,NJ)或Boehringer Ingelheim(Ingelheim,Germany)或者通过本领域技术人员已知的方法根据参考文献中阐述的规程制备，所述参考文献例如Fieser和Fieser's Reagents for Organic Synthesis，第1-17卷(John Wiley and Sons，1991)；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds，第1-5卷及补充(Elsevier SciencePublishers，1989)；Organic Reactions，第1-40卷(John Wiley and Sons，1991)；March'sAdvanced Organic Chemistry，(John Wiley and Sons，第4版)；和Larock'sComprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.，1989)。其它材料例如本文公开的药物载体可以从商业来源获得。
产生本文所述化合物的反应可在溶剂中进行，其可由有机合成领域的技术人员选择。在进行反应的条件下，即温度和压力下，溶剂可基本上不与起始原料(反应物)、中间体或产物反应。反应可以在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。可以根据本领域已知的任何合适的方法监测产物或中间体形成。例如，可以通过光谱手段监测产物形成，例如核磁共振光谱法(例如，1H或13C)红外光谱法、分光光度法(例如，UV-可见光)或质谱法，或通过色谱法例如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱法。
所公开的化合物可以通过固相肽合成来制备，其中氨基酸α-N-末端被酸或碱保护基保护。这样的保护基团应具有对肽键形成条件稳定的性质，同时易于除去而不破坏生长的肽链或其中所含的任何手性中心的外消旋作用。合适的保护基是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、联苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、邻硝基苯基硫基、2-氰基-叔丁氧基羰基等。对于所公开的化合物的合成，特别优选9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基。其它优选的侧链保护基是对于侧链氨基例如赖氨酸和精氨酸、2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧基羰基；对于酪氨酸、苄基、邻溴苄氧基-羰基、2,6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于丝氨酸、叔丁基、苄基和四氢吡喃基；对于组氨酸、三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2,4-二硝基苯基；对于色氨酸、甲酰基；对于天冬氨酸和谷氨酸、苄基和叔丁基，对于半胱氨酸、三苯甲基(三苯甲基)。在固相肽合成方法中，α-C末端氨基酸连接到合适的固体支持物或树脂上。用于上述合成的合适的固体载体是对试剂和逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件呈惰性以及不溶于所用介质的那些物质。用于合成α-C末端羧基肽的固体支持物是得自Applied Biosystems(Foster City，Calif)的4-羟甲基苯氧基甲基共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)或4-(2'，4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基树脂)。α-C-末端氨基酸通过如下连接到树脂：N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、有或无4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)或双(2-氧代-3-噁唑烷基)膦氯化物(BOPCl)，在溶剂例如二氯甲烷或DMF中于10℃至50℃的温度下介导偶联约1至约24小时。当固体载体是4-(2'，4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，用仲胺、优选哌啶裂解Fmoc基团，然后如上所述与α-C-末端氨基酸偶联。用于偶联至脱保护的4(2'，4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂的一种方法是O-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)的DMF溶液。连续的被保护的氨基酸的偶联可以在自动多肽合成仪中进行。在一个实例中，生长的肽链的氨基酸中的α-N-末端用Fmoc保护。通过用仲胺、优选哌啶处理，完成Fmoc保护基从生长肽的α-N-末端侧的去除。然后每个保护的氨基酸以大约3倍摩尔过量引入，偶联优选在DMF中进行。偶联剂可以是O-苯并三唑-1-基-N，N，N'，N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。在固相合成结束时，将多肽从树脂中除去并脱保护，可以连续地进行或在单次操作中进行。多肽的去除和脱保护可以通过用包含噻吩甲醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的裂解剂处理树脂结合的多肽在单一操作中完成。在多肽的α-C末端是烷基酰胺的情况下，通过用烷基胺氨解来裂解树脂。或者，可以通过酯交换除去肽，例如用甲醇，随后氨解或通过直接转酰胺化。受保护的肽可以在此时纯化或直接用于下一步骤。侧链保护基的去除可以使用上述裂解混合物完成。完全脱保护的肽可以通过使用任何或所有以下类型的色谱步骤的纯化：在弱碱性树脂(乙酸盐形式)上的离子交换；在underivitized聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如，Amberlite XAD)上的疏水吸附色谱；硅胶吸附色谱；羧甲基纤维素上的离子交换色谱；分配色谱，例如在Sephadex G-25，LH-20或逆流分布；高效液相色谱(HPLC)，特别是对辛基或十八烷基硅烷基-二氧化硅键合相柱填料的反相HPLC。
使用方法
本文还提供了本文所述的化合物或组合物的使用方法。本文还提供了用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病状的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任意化合物或组合物。
本文还提供了治疗、预防或改善受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的一种或多种本文所述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐。本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐可用于治疗人类(例如儿科和老年人群)和动物(例如兽医学应用)的癌症。所公开的方法可以任选地包括鉴定正在或可能需要治疗癌症的患者。可通过本文所述的化合物和组合物治疗的癌症类型的实例包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖器癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌。其他实例包括肛门、胆管、骨、骨髓、肠(包括结肠和直肠)、眼、胆囊、肾、口、喉、食管、胃、睾丸、子宫颈、间皮瘤、神经内分泌、阴茎、皮肤、脊髓、甲状腺、阴道、外阴、子宫、肝、肌肉、血细胞(包括淋巴细胞和其他免疫系统细胞)的癌症或肿瘤。可通过本文所述的化合物和组合物治疗的癌症的其它实例包括癌、卡波西氏肉瘤、黑素瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、胰腺癌、肺癌、白血病(急性淋巴细胞、急性髓细胞、慢性淋巴细胞、慢性髓细胞等)和淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)以及多发性骨髓瘤。
本文所述的治疗或预防癌症的方法还可包括用一种或多种其它试剂(例如抗癌剂或电离辐射)治疗。如本文所述的一种或多种其它试剂及化合物和组合物或其药学上可接受的盐可以以任何顺序施用，包括同时施用，以及在时间上间隔约多达几天。所述方法还可以包括多于单次施用一种或多种其它试剂和/或本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐。如本文所述的一种或多种其它试剂及化合物和组合物或其药学上可接受的盐的施用可以通过相同或不同的途径。当用一种或多种其它试剂治疗时，本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐可以组合成包含一种或多种其它试剂的药物组合物。
例如，本文所述的化合物或组合物或其药学上可接受的盐可以与其它抗癌剂组合成药物组合物，所述抗癌剂例如13-顺-视黄酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、异维生素A酸(Accutane)、放线菌素D、阿霉素、Adrucil、安归宁、Ala-Cort、阿地白介素、阿仑单抗、阿里维A酸(Alitretinoin)、Alkaban-AQ、爱克兰、全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、鲁米特、阿那格雷、安得乐、阿那曲唑、阿糖胞苷、安然爱斯普、阿可达、瑞宁得、阿诺、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、阿瓦斯汀、BCG、BCNU、贝伐单抗、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、BiCNU、Blenoxane、博来霉素、硼替佐米、白消安、Busulfex、C225、亚叶酸钙、Campath、坎普土沙、喜树碱-11、卡培他滨、Carac、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀片、Casodex、CCNU、CDDP、CeeNU、正定霉素、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、亚叶酸因子、克拉屈滨(Cladribine)、可的松、可美净、CPT-11、环磷酰胺、Cytadren、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂质体、Cytosar-U、Cytoxan、达卡巴嗪、放线菌素、达泊霉素α、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、DaunoXome、Decadron、Delta-Cortef、强的松、地尼白介素-毒素连接物、DepoCyt、地塞米松(Dexamethasone)、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、Dexasone、右雷佐生、DHAD、DIC、Diodex、多西他赛、Doxil、阿霉素、多柔比星脂质体、Droxia、DTIC、DTIC-Dome、杜拉隆、Efudex、艾里咖、艾伦斯、乐沙定、爱施巴、Emcyt、表阿霉素、α依伯汀、爱必妥、欧文氏菌L-天门冬酰胺酶、雌莫司汀、Ethyol、凡毕复、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、Eulexin、易维特、依西美坦、法乐通、法洛德、复乳纳、非格司亭、氟尿苷、福达华、氟达拉滨、Fluoroplex、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮、氟他胺、氟胺酸、FUDR、氟维司群、G-CSF、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、Gemzar、格列卫、醋酸亮丙瑞林、储库型醋酸亮丙瑞林(Lupron Depot)、Matulane、Maxidex、氮芥、-盐酸氮芥、美卓龙、甲泼尼龙、Megace、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司那、Mesnex、氨甲喋呤、甲氨蝶呤钠、甲泼尼龙、Mylocel、来曲唑、Neosar、Neulasta、纽密伽、优保津、Nilandron、尼鲁米特、氮芥、Novaldex、诺肖林、奥曲肽、醋酸奥曲肽、Oncospar、长春新碱、Ontak、Onxal、欧普瑞维尔金、Orapred、Orasone、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、Panretin、伯尔定、Pediapred、PEG干扰素、培门冬酶、培非司亭、PEG-INTRON、PEG-L-天冬酰胺酶、苯丙氨酸氮芥、Platinol、Platinol-AQ、泼尼松龙、泼尼松、Prelone、Procarbazine(丙卡巴肼)、PROCRIT、普留净、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、Purinethol、雷洛昔芬、氨克生、美罗华、利妥昔单抗、Roveron-A(干扰素α-2a)、Rubex、盐酸鲁贝多霉素、善得定、善得定LAR、沙格莫丁、Solu-Cortef、Solu-Medrol、STI-571、链尿霉素(Streptozocin)、他莫昔芬(Tamoxifen)、塔格雷汀(Targretin)、他克唑、泰索帝(Taxotere)、Temodar、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA、沙利度胺、撒利多迈、TheraCys、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤药片、硫代磷酰胺、Thioplex、塞替派(Thiotepa)、TICE、Toposar、拓扑替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、Trexall、Trisenox、TSPA、VCR、Velban、万珂、凡毕士、凡善能、Viadur、长春碱、硫酸长春碱、Vincasar Pfs、长春新碱、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨、VLB、VP-16、威猛、希罗达、Zanosar、泽娃灵、Zinecard、诺雷德、唑来膦酸、择泰、格立得晶片、Glivec、GM-CSF、戈舍瑞林(Goserelin)、粒细胞集落刺激因子、氟甲睾酮、Herceptin(赫赛汀)、Hexadrol、Hexalen、六甲蜜胺、HMM、和美新、Hydrea、Hydrocort乙酸酯、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢化可的松、羟基脲、异贝莫单抗(Ibritumomab)、替坦异贝莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、埃得霉素、伊达比星、Ifex、IFN-α、异环磷酰胺、IL 2、IL-11、甲磺酸伊马替尼、咪唑羧酰胺、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白细胞介素2、白细胞介素-11、内含子A(干扰素α-2b)、甲酰四氢叶酸、留可然、Leukine、亮丙瑞林、闻克斯丁、乐司他丁、脂质体Ara-C、Liquid Pred、洛莫司汀、L-PAM、L-沙可来新、Meticorten、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌、M-泼尼松、MTC、MTX、氮芥、密吐霉素、Myleran、Iressa、爱莱诺迪肯、Isotretinoin、Kidrolase、Lanacort、L-门冬酰胺酶和LCR。其它抗癌剂还可以包含生物药物，例如抗体。
许多肿瘤和癌症具有存在于肿瘤或癌细胞中的病毒基因组。例如，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)与许多哺乳动物恶性肿瘤相关。本文公开的化合物还可以单独使用或与抗癌剂或抗病毒剂例如更昔洛韦、叠氮胸苷(AZT)、拉米夫定(3TC)等组合使用以治疗感染了可导致细胞转化的病毒的患者和/或以治疗患有与细胞中病毒基因组的存在相关的肿瘤或癌症的患者。本文公开的化合物还可以与基于病毒的肿瘤疾病治疗组合使用。
本文还描述了在受试者中杀死肿瘤细胞的方法。该方法包括使肿瘤细胞与有效量的本文所述的化合物或组合物接触，并且任选地包括用有效量的电离辐射照射肿瘤细胞的步骤。另外，本文提供了肿瘤放射治疗的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的本文所述的化合物或组合物接触，并用有效量的电离辐射照射肿瘤。本文所用术语电离辐射是指包括具有足够能量或可以通过核相互作用产生足够能量以产生电离的粒子或光子的辐射。电离辐射的实例是x辐射。电离辐射的有效量是指当与本文所述的化合物组合施用时产生细胞损伤或死亡增加的电离辐射剂量。电离辐射可以根据本领域已知的方法递送，包括施用放射性标记的抗体和放射性同位素。
本文所述的方法和化合物可用于预防性治疗和治疗性治疗二者。本文所用术语治疗包括预防、延迟发病、减轻、根除或延迟发病后体征或症状的加重以及预防复发。对于预防性使用，将治疗有效量的本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐在发病前(例如，在癌症的明显迹象之前)、早期发病期间(例如，在出现癌症的初始体征和症状时)或在癌症的确定发展之后施用。预防性施用可以在感染症状的表现之前发生数天至数年。预防性施用可以用于例如对呈现癌前病变的受试者、被诊断为早期恶性肿瘤的受试者以及对特定癌症具有易感性(例如家族、种族和/或职业)的亚组的化学预防性治疗。治疗性治疗包括在诊断出癌症后向受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物和组合物或其药学上可接受的盐。
在治疗、预防或改善受试者的癌症或肿瘤的方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对Ras(例如，K-Ras)、PTP1B、Pin1、Grb2SH2或其组合的抑制剂的靶向部分。
所公开的主题还涉及治疗患有代谢病症或疾患的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的本文所公开的一种或多种化合物或组合物施用至患有代谢性疾病的且有此治疗需要的受试者。在一些实例中，代谢病症可以包括II型糖尿病。在治疗、预防或改善受试者的代谢病症的方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对PTP1B的抑制剂的靶向部分。在该方法的一个特定实例中，受试者是肥胖的，并且所述方法包括通过施用本文公开的组合物来治疗受试者的肥胖症。
所公开的主题还涉及用于治疗患有免疫病症或疾患的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用至患有免疫障碍且有此治疗需要的受试者。在治疗、预防或改善受试者的免疫障碍的治疗方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对Pin1的抑制剂的靶向部分。
所公开的主题还涉及治疗患有囊性纤维化的受试者的方法。在一个实施方案中，将有效量的本文公开的一种或多种化合物或组合物施用至患有囊性纤维化且有此治疗需要的受试者。在治疗受试者的囊性纤维化的方法的一些实例中，施用至受试者的化合物或组合物可包含治疗部分，其可包含可用作针对CAL PDZ的抑制剂的靶向部分。
组合物、制剂和施用方法
所公开的化合物和包含它们的组合物的体内应用可以通过本领域技术人员目前或前瞻性已知的任何合适的方法和技术来实现。例如，所公开的化合物可以以生理学上或药学上可接受的形式配制并通过本领域已知的任何合适的途径施用，包括例如经口、鼻、直肠、局部和肠胃外施用途径。本文所用术语肠胃外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内施用，例如通过注射。所公开的化合物或组合物的施用可以是单次施用，或者以本领域技术人员容易确定的连续或不同间隔施用。
本文公开的化合物和包含它们的组合物也可以利用脂质体技术、缓释胶囊、可植入泵和可生物降解的容器施用。这些递送方法可有利地在延长的时间段内提供均匀的剂量。所述化合物也可以以其盐衍生物形式或结晶形式施用。
本文公开的化合物可以根据制备药学上可接受的组合物的已知方法配制。制剂在本领域技术人员熟知和容易获得的许多来源中详细描述。例如，E.W.Martin(1995)的Remington's Pharmaceutical Science描述了可以与所公开的方法结合使用的制剂。一般而言，本文公开的化合物可以配制成使有效量的化合物与合适的载体组合以便于化合物的有效施用。所使用的组合物也可以是多种形式。这些包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉剂、液体溶剂或混悬剂、栓剂、可注射和可输注的溶液剂和喷雾剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。所述组合物还优选包括本领域技术人员已知的常规药学上可接受的载体和稀释剂。与化合物一起使用的载体或稀释剂的实例包括乙醇、二甲亚砜、甘油、氧化铝、淀粉、盐水和等效载体及稀释剂。为了提供用于所需治疗性处理的这样的剂量的施用，本文公开的组合物可有利地包含基于包含载体或稀释剂的组合物的总重量，总量为约0.1％至100％的一种或多种主题化合物。
适于施用的制剂包括例如水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性及和非水性无菌混悬剂，其可包括混悬剂和增稠剂。制剂可以在使用前存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在仅需要无菌液体载体条件的冷冻干燥(冻干)条件下，例如注射用水。临时注射溶液和混悬剂可以由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应当理解，考虑到所讨论的制剂类型，除了上述特别提及的成分之外，本文公开的组合物可以包括本领域中常规的其他试剂。
本文公开的化合物和包含它们的组合物可以通过与细胞直接接触或通过载体手段递送至细胞。用于将化合物和组合物递送到细胞的载体手段在本领域中是已知的，例如将组合物包封在脂质体部分中。用于将本文公开的化合物和组合物递送至细胞的另一种手段包括将化合物连接至靶向递送至靶细胞的蛋白质或核酸。美国专利No.6,960,648和美国申请公开No.20030032594和20020120100公开了可以与另一种组合物偶联并使得组合物通过生物膜转运的氨基酸序列。美国申请公开No.20020035243还描述了用于将生物部分转移穿过细胞膜进行细胞内递送的组合物。化合物也可以掺入聚合物中，其实例包括用于颅内肿瘤的聚(D-L丙交酯-共-乙交酯)聚合物；聚[双(对羧基苯氧基)丙烷：癸二酸](摩尔比为20:80)(如GLIADEL中所用)；软骨素；甲壳质和壳聚糖。
为了治疗肿瘤障碍，本文公开的化合物可以与其它抗肿瘤或抗癌物质和/或与放射和/或光动力治疗和/或与外科手术治疗联合施用至需要治疗的患者以除去肿瘤。这些其它物质或治疗可以与本文公开的化合物同时给予或不同时给予。例如，本文公开的化合物可以与有丝分裂抑制剂(例如，紫杉醇或长春碱)、烷化剂(例如环磷酰胺或异环磷酰胺)、抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶或羟基脲)、DNA嵌入剂(例如阿霉素或博来霉素)、拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷或喜树碱)、抗血管生成剂(例如血管抑制素)、抗雌激素(例如他莫昔芬)和/或其它抗癌药物或抗体例如分别为GLEEVEC(Novartis PharmaceuticalsCorporation)和HERCEPTIN(Genentech，Inc)或免疫治疗剂(例如伊匹单抗和硼替佐米)组合使用。
在某些实例中，本文公开的化合物和组合物可以在一个或多个解剖部位(例如不想要的细胞生长部位(例如肿瘤部位或良性皮肤生长，例如注射或局部应用于肿瘤或皮肤生长))局部施用、任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂组合。本文公开的化合物和组合物可以全身施用，例如静脉内或口服，任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体组合用于口服递送。它们可以包在硬或软壳明胶胶囊中，可以压制成片剂，或者可以直接掺入患者的饮食的食物。对于经口治疗施用，活性化合物可与一种或多种赋形剂组合，并以可摄取片剂、颊含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片剂(wafer)、气溶胶喷雾剂等形式使用。
所公开的组合物是生物可利用的并且可以口服递送。口服组合物可以是片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等，并且还可以含有以下物质：粘合剂例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；并且可以加入甜味剂例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或调味剂例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的材料之外，其还可以包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可用作包衣存在或以其它方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆剂或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂例如樱桃或橙味。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应当是药学上可接受的的，并且在所使用的量下基本上无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和装置中。
本文公开的化合物和组合物，包括其药学上可接受的盐或前药，可以通过输注或注射静脉内、肌内或腹膜内施用。活性剂或其盐的溶液可以在水中制备，任选与无毒表面活性剂混合。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中和在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射或输注的药物剂型可包括包含活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其适于临时制备无菌可注射或可输注的溶液或分散体，任选地包封于脂质体中。最终剂型应在制造和储存条件下是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或载剂可以是溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适的混合物。可以例如通过形成脂质体通过在分散体的情况下维持所需的粒度或通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。任选地，可以通过各种其它抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂例如糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
通过根据在合适的溶剂中添加所需量的本文公开的化合物和/或试剂与各种其它如上列举的成分，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上先前无菌过滤的溶液中存在的任何额外的所需成分的粉末。
对于局部施用，本文公开的化合物和试剂可用作液体或固体施用。然而，通常期望将其作为组合物与皮肤病学可接受的载体(其可以是固体或液体)组合地局部施用至皮肤。本文公开的化合物和试剂和组合物可以局部施用至受试者的皮肤以减小恶性或良性生长物的尺寸(并且可以包括完全去除)或治疗感染部位。本文公开的化合物和试剂可以直接施用至生长或感染部位。优选地，将化合物和试剂以制剂例如软膏、乳膏、洗剂、溶液剂、酊剂等施用至生长或感染部位。
有用的固体载体包括细分散的固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。可用的液体载体包括水、醇或二醇或者水-醇/二醇共混物，其中化合物可以以有效水平溶解或分散，任选地借助于无毒的表面活性剂。可以加入佐剂例如香料和另外的抗微生物剂以优化给定用途的性质。所得液体组合物可以从吸收垫施用，用于浸渍绷带和其它敷料，或者使用例如泵型或气溶胶喷雾器喷涂到受影响的区域上。
增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料也可以与液体载体一起使用以形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，以直接施用至使用者的皮肤。
本文公开的化合物和试剂及药物组合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和动物模型的体内活性来确定。将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人的方法是本领域已知的。
施用组合物的剂量范围是足够大以产生其中症状或障碍受影响的所需效果的剂量范围。剂量不应大到引起不良副作用，例如不需要的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随着患者的年龄、状况、性别和疾病的程度而变化，并且可以由本领域技术人员确定。剂量可以在任何对抗的情况下由个体医生调整。剂量可以变化，并且可以每天施用一次或多次剂量，施用一天或数天。
还公开了包含本文公开的化合物与药学上可接受的载体组合的药物组合物。适于口服、局部或肠胃外施用的包含一定量的化合物的药物组合物构成优选方面。施用至患者(特别是人)的剂量应足以在合理的时间范围内在患者中实现治疗反应，而没有致死毒性，并且优选引起不超过可接受水平的副作用或发病率。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包括受试者的状况(健康)、受试者的体重、同时治疗的类型(如果有的话)、治疗频率、治疗比以及病理状态的严重程度和所处阶段。
还公开了在一个或多个容器中包含本文公开的化合物的试剂盒。所公开的试剂盒可以任选地包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一个实施方案中，试剂盒包括本文所述的一种或多种其它组分、助剂或佐剂。在另一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种抗癌剂，例如本文所述的那些试剂。在一个实施方案中，试剂盒包括描述如何施用试剂盒的化合物或组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可以为任何合适材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且为任何合适的尺寸、形状或构造。在一个实施方案中，本文公开的化合物和/或试剂在试剂盒中作为固体(例如片剂、丸剂或粉末形式)提供。在另一个实施方案中，本文公开的化合物和/或试剂在试剂盒中作为液体或溶液提供。在一个实施方案中，试剂盒包含含有液体或溶液形式的本文公开的化合物和/或试剂的安瓿或注射器。
已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。
实施例
阐述以下实施例以说明根据所公开主题的方法和结果。这些实施例无意于包括本文所公开的主题的所有方面，而是示出代表性的方法和结果。这些实施例无意于排除对本领域技术人员显而易见的等同变体和变化。
已经做出努力以确保数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度为℃或环境温度，压力是大气压或接近大气压。存在可用于优化从所述方法获得的产物纯度和产率的反应条件(例如组分浓度、温度、压力和其它反应范围和条件)的多种变化和组合。只需要合理和常规的实验来优化这样的工艺条件。
实施例1
发现环状七肽环(FΦRRRRQ)(cFΦR4，其中Φ是L-2-萘基丙氨酸)被哺乳动物细胞有效内化。在这项研究，通过经引入药理剂和遗传突变干扰各种内吞事件对其内化的机制进行了研究。结果表明，cFΦR4可以直接结合到膜磷脂，可以通过内吞作用内化到人类癌细胞中，并可以从早期核内体逃逸到细胞质中。用各种分子检测其货物容量，所述分子包括小分子染料、各种电荷状态的线性肽和环肽以及蛋白质。根据货物的性质，它们可以通过环内(将货物插入到cFΦR4环中)、环外(货物附接到Gln侧链)或双环途径(cFΦR4和环状货物环的融合)来递送。cFΦR4的总递送效率(即，货物递送到细胞质和细胞核中)比非精氨酸(R9)、HIV Tat衍生肽(Tat)或穿膜肽(Antp)的总递送效率高4至12倍。更高的递送效率加之优越的血清稳定性、最小的毒性和易合成使得cFΦR4成为细胞内货物递送的有用转运体，并且是用于研究核内体逃逸机制的合适系统。
引言
质膜是药物(尤其是对于生物制品例如肽、蛋白质和核酸)开发的一个主要挑战。破坏膜屏障并将生物制剂递送到细胞中的一个潜在策略是将它们连接到“细胞穿透肽(CPP)”。自从在20世纪80年代末最初观察到转录的HIV反式激活剂，Tat内化到哺乳动物细胞中并激活病毒复制(Frankel，AD和Pabo，CO.Cell，1988,55,1189-1193；Green，M和Loewenstein，PM.Cell，1988,55,1179-1188)，已报道了大量由6-20个残基组成的CPP(Langel,Cell-penetrating peptides:methods and protocols,Humana Press,NewYork,2011,p xv；Schmidt,N等.FEBS Lett.,2010,584,1806-1813；Futaki,S.Adv.DrugDelivery Rev.,2005,57,547-558；Stewart,KM等.Org.Biomol.Chem.,2008,6,2242-2255；Deshayes,S等.Cell.Mol.Life Sci.,2005,62,1839-1849；Goun,EA等.ChemBioChem,2005,7,1497-1515)。PCP已用于通过共价附着或静电缔合将小分子药物(Rothbard,JB等.Nat.Med.,2000,6,1253-1257；Nori,A等.Bioconjugate Chem.,2003,14,44-50)、DNA(Hoyer,J和Neundorf,I.Acc.Chem.Res.,2012,45,1048-1056；Eguchi,A等.J.Biol.Chem.,2001,276,26204-26210)、RNA(Nakase,I等.Acc.Chem.Res.,2012,45,1132-1139；Andaloussi,SE等.Nucleic Acids Res.,2011,39,3972-3987；Jeong,JH等.BioconjugateChem.,2009,20,5-14；Muratovska,A和Eccles,MR.FEBS Lett.,2004,558,63-68)、蛋白质(Wadia,JS和Dowdy,SF.Adv.Drug Delivery Rev.,2005,57,579-596；Pooga,M等.FASEBJ.,2001,15,1451-1453；Schwarze,SR等.Science,1999,285,1569-1572)和纳米颗粒(Josephson,L等.Bioconjugate Chem.,1999,10,186-191；Gupta,B等.Adv.Drug DeliveryRev.,2005,57,637-651；Liu,J等.Biomacromolecules,2001,2,362-8)递送入哺乳动物细胞和组织。许多CPP在生理相关浓度下显示出最小毒性和免疫原性(Saar,K等.Anal.Biochem.,2005,345,55-65；Suhorutsenko,J等.Bioconjugate Chem.,2011,22,2255-2262)，并且已发现掺入特异性非天然氨基酸(Rueping,M等.ChemBioChem,2002,3,257-259)和其它化学部分(Cooley,CB等.J.Am.Chem.Soc.,2009,131,16401-16403；Pham,W等.Chembiochem,2004,5,1148-1151)可增加稳定性和细胞溶质递送。
尽管进行了三十年的研究，但CPP活性的根本基础仍不清楚。已经提出了对于其主要序列的特征在于具有多个精氨酸残基的CPP的两种不同且非相互排斥的机制。在第一种机制(直接膜易位)中，精氨酸胍基与质膜的磷脂相互作用以产生被动扩散穿过膜的中性离子对(Herce,HD和Garcia,AE.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2007,104,20805-20810；Hirose,H等.Mol.Ther.,2012,20,984-993)或促进使得CPP穿过脂质双层的瞬时孔的形成(Herce,HD等.Biophys.J.,2009,97,1917-1925；Palm-Apergi,C等.FASEB J.,2009,23,214-223)。在第二种机制中，CPP与细胞表面糖蛋白和膜磷脂缔合，通过内吞作用内化到细胞中(Richard,JP等.J.Biol.Chem.,2005,280,15300-15306；Ferrari,A等.Mol.Ther.,2003,8,284-294；Fittipaldi,A等.J.Biol.Chem.,2003，278,34141-34149；Kaplan,IM等.J.Controlled Release,2005，102,247-253；Nakase,I等.Biochemistry,2007,46,492-501)，并随后从核内体排出进入细胞质。总之，大多数数据显示在低CPP浓度下，细胞摄取主要通过内吞作用发生，而直接膜易位在高于10μM的浓度下变得普遍(Duchardt,F等.Traffic,2007,8,848-866)。然而，进入的机制和摄取的效率可随着CPP身份(identity)、货物、细胞类型和其它因素而变化(Mueller,J等.Bioconjugate Chem.,2008,19,2363-2374；Maiolo,JR等.Biochim.Biophys.Acta.,2005,1712,161-172)。
经由内吞作用进入细胞的CPP必须从内吞囊泡中排出以便到达细胞质。遗憾的是，内体膜已被证明是这些CPP进行细胞质递送的重要屏障；通常可忽略部分的肽逃逸到细胞内部(El-Sayed,A等.AAPS J.,2009,11,13-22；Varkouhi,AK等.J.Controlled Release,2011,151,220-228；Appelbaum,JS等.Chem.Biol.,2012,19,819-830)。例如，即使在已经证实增强内体货物释放的促融合血凝素肽HA2的存在下，在初始摄取后24小时，>99％的Tat-Cre融合蛋白保持包埋在大染色体中(Kaplan,IM等.J.Controlled Release,2005，102,247-253)。最近，已经发现了具有改进的内体逃逸效率的两种新类型的CPP。Appelbaum等示出含有离散的五精氨酸基序的折叠的微型蛋白能够有效地克服内体截留并到达哺乳动物细胞的细胞质(Appelbaum,JS等.Chem.Biol.,2012,19,819-830)。该基序由跨α螺旋的三个转角的五个精氨酸组成，并且含有该基序的蛋白质从早期(Rab5+)内体释放到细胞内部中。还已经发现，某些富含精氨酸的CPP的环化增强了它们的细胞摄取(Qian,Z等.ACSChem.Biol.,2013,8,423-431；Lattig-Tunnemann,G等.Nat.Commun.,2011,2,453；Mandal,D等.Angew.Chem.Int.Ed.,2011,50,9633-9637；Zhao,K等.Soft Matter,2012,8,6430-6433)。两亲性小环肽例如环(FΦRRRRQ)(cFΦR4，其中Φ是L-2-萘基丙氨酸)被哺乳动物细胞以能量依赖性方式内化，并以比非精氨酸(R9)高2至5倍的效率进入细胞质和细胞核(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.,2013,8,423-431)。此外，膜不通透的货物例如磷酸肽可以插入cFΦR4环，导致它们递送到靶细胞的细胞质中。然而，货物插入到环肽环中，这在本文中称为“内环”递送方法(图1A)，限于相对较短的肽(≤7个氨基酸)，因为大环显示出差的内化效率(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.,2013,8,423-431)。
为了了解cFΦR4作用机制和潜在地设计更高效率的环状CPP，本文通过使用人工膜和药理学试剂以及干扰各种内吞事件的遗传突变来研究cFΦR4的内化机制。数据显示cFΦR4可以直接结合到质膜磷脂上，并且可以通过内吞作用进入细胞。如同显示五精氨酸基序的微型蛋白质(Appelbaum,JS等.Chem.Biol.,2012,19,819-830)，cFΦR4可以从早期内体逃逸到胞质溶胶中。对cFΦR4通过环外(将货物附接到Gln侧链上；图1B)或双环递送方法(cFΦR4和环状货物环的融合；图1C)将多种货物分子(包括不同电荷的线性肽、环肽和大蛋白)递送到哺乳动物细胞的细胞质中的能力进行了检查。发现cFΦR4耐受货物的大小和性质，并有效地将所有测试的货物运输到哺乳动物细胞的细胞质和细胞核中。此外，cFΦR4相对于线性CPP表现出优越的针对蛋白质水解的稳定性，但最小的细胞毒性。因此，cFΦR4提供了用于细胞溶质货物递送的实际有用的转运蛋白以及用于研究早期内体释放的机制的体系。
材料。用于肽合成的试剂购自Advanced ChemTech(Louisville，KY)、NovaBiochem(La Jolla，CA)或Anaspec(San Jose，CA)。2,2'-二吡啶基二硫化物、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、异硫氰酸荧光素(FITC)、地塞米松(Dex)、辅酶A三锂盐、FITC标记的葡聚糖(葡聚糖FITC)和人血清购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。细胞培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素、0.25％胰蛋白酶-EDTA、Hoescht33342、Alexa488标记的葡聚糖(葡聚糖Alexa488)、杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(2.67mM氯化钾、1.47mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、8.06mM磷酸氢二钠)和Lipofectamine 2000购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。PD-10脱盐柱购自GE-Healthcare(Piscataway，NJ)。核染色染料DRAQ5TM购自Thermo Scientific(Rockford，IL)，而细胞增殖试剂盒(MTT)购自Roche(Indianapolis，IN)。抗磷酸酪氨酸(pY)抗体(克隆4G10)购自Millipore(Temecula，CA)。
Rink树脂LS(100-200目，0.2mmol/g)购自Advanced ChemTech。LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰氨基己酸酯])购自ThermoScientific(Rockford，IL)，而1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸(1'-rac-甘油)(钠盐)(POPG)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷乙醇胺(POPE)、鞘磷脂(脑，猪)和胆固醇购自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)。硫酸乙酰肝素(HO-03103，批号HO-10697)得自Celcus Laboratories(Cincinnati，OH)。
肽合成和标记。使用标准Fmoc化学在Rink Resin LS(0.2mmol/g)上合成肽。典型的偶联反应包含5当量的Fmoc-氨基酸、5当量的2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和10当量的二异丙基乙胺(DIPEA)，并使其继续进行混合75分钟。加入最后(N-末端)残基之后，通过用无水DCM(3×15分钟)中的Pd(PPh3)4和苯基硅烷(分别为0.1和10当量)处理除去C-末端Glu残基上的烯丙基基团。通过用DMF中的20％哌啶处理除去N-末端Fmoc基团，并通过用DMF中的苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基-六氟磷酸鏻(PyBOP)/HOBt/DIPEA(5、5和10当量)处理3小时来使肽环化。通过用82.5:5:5:5:2.5(v/v)TFA/茴香硫醚/水/苯酚/乙二硫醇处理2小时使肽脱保护并从树脂中释放。将肽用冷乙醚(3×)研磨，并在C18柱上通过反相HPLC纯化。通过MALDI-TOF质谱法证实每种肽的真实性。
通过将纯化的肽(～1mg)溶解于300μL的1:1:1(体积/体积)DMSO/DMF/150mM碳酸氢钠(pH8.5)中并与10μL的FITC在DMSO中(100mg/mL)混合来进行用FITC标记肽。在室温下20分钟后，在C18柱上对反应混合物进行反相HPLC以分离FITC标记的肽。为了产生罗丹明和Dex-标记的肽(图2)，将Nε-4-甲氧基三苯甲基-L-赖氨酸加入到C-末端。在固相肽合成后，使用CH2Cl2中的1％(v/v)三氟乙酸对赖氨酸侧链选择性地脱保护。用DMF中的丽丝胺罗丹明B磺酰氯/DIPEA(各5当量)孵育树脂过夜。将肽完全脱保护，用二乙醚研磨，并通过HPLC纯化。通过将用DMF中的地塞米松-21-硫代丙酸/HBTU/DIPEA(5、5和10当量)孵育树脂3小时来产生Dex-标记的肽(Appelbaum,JS等.Chem.Biol.,2012,19,819-830)。然后将肽脱保护、研磨并通过HPLC纯化。如先前所述合成双环肽、磷酸香豆基氨基丙酸(pCAP)和含有pCAP的肽(PCP)(Lian,W等.J.Am.Chem.Soc.,2013,135,11990-11995；Mitra,S和Barrios,AM.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2005,15,5124-5145；Stanford,SM等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2012,109,13972-13977)。通过MALDI-TOF质谱法证实每种肽的真实性。
cFΦR4-蛋白质缀合物的制备。使用PTP1B cDNA作为模板，并且使用5'-ggaattccatatggagatggaaaaggagttcgagcag-3'和5'-gggatccgtcgacattgtgtggctccaggattcgtttgg-3'作为引物通过聚合酶链反应扩增编码PTP1B催化结构域(氨基酸1-321)的基因。用核酸内切酶Nde I和Sal I消化所得DNA片段，并插入原核载体pET-22b(+)-ybbR中(Yin，J等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，2005,102,15815-15820)。该克隆过程导致向PTP1B的N末端添加ybbR标签(VLDSLEFIASKL)。如先前所述进行ybbR标记的PTP1B的表达和纯化(Ren，L等，Bioche mistry，2011,50,2339-2356)。
将含有C-末端半胱氨酸的肽cFΦR4(cFΦR4-SH，～10μmol；图3)溶解在1mL脱气的DPBS中，并与溶于丙酮(0.5mL)中的2,2'-二吡啶基二硫化物(5当量)混合。在室温下2小时后，通过反相HPLC纯化反应产物cFΦR4-SS-Py。用DPBS中的辅酶A(2当量)孵育产物2小时。通过反相HPLC再次纯化所得的cFΦR4-SS-CoA加合物。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达含有N-末端ybbR标签(VLDSLEFIASKL)和C-末端六组氨酸标签的绿色荧光蛋白(GFP)，并如此前所述进行纯化(Yin,J等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2005,102,15815-15820)。接下来，在50mM HEPES(pH7.4)、10mM MgCl2(总体积1.5mL)中混合ybbR-GFP(30μM)、cFΦR4-SS-CoA(30μM)和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp(0.5μM)，并在37℃孵育15分钟。通过使反应混合物通过PD-10脱盐柱将标记的蛋白质cFΦR4-S-S-GFP(图3)与未反应的cFΦR4-SS-CoA分离。以类似的方式制备与Tat缀合的GFP(Tat-S-S-GFP)和cFΦR4缀合的PTP1B(cFΦR4-PTP1B)(图4)。
在固相上合成含有C-末端赖氨酸的肽(cFΦR4-Lys，～10μmol；图4)，脱保护并从支持物上释放，溶解于脱气的DPBS(pH7.4，1mL)中，并与溶解于DMSO(0.2mL)中的双功能连接子LC-SMCC(5当量)混合。在室温下孵育2小时后，通过装备有C18柱的反相HPLC纯化反应产物cFΦR4-SMCC(图4)。然后将产物与DPBS中的辅酶A(2当量)混合，并孵育2小时。再次通过反相HPLC纯化所得cFΦR4-SMCC-CoA加合物。接下来，在50mM HEPES(pH 7.4)、10mM MgCl2(总体积1.5mL)中混合ybbR标记的PTP1B(30μM)、cFΦR4-SMCC-CoA(30μM)和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp(0.5μM)并在37℃下孵育15分钟。通过使反应混合物通过用DPBS洗脱的PD-10脱盐柱将标记的蛋白质(cFΦR4-PTP1B；图4)与未反应的cFΦR4-SMCC-CoA分离。
细胞培养和转染。将HEK293、HeLa、MCF-7、NIH 3T3和A549细胞维持在由DMEM、10％FBS和1％青霉素/链霉素组成的培养基中。将Jurkat、H1650和H1299细胞在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640中生长。在37℃、5％CO2的加湿孵育箱中培养细胞。对于HeLa细胞转染，将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔板上。附着后，用编码Rab5-绿色荧光蛋白融合物(Rab5-GFP)、Rab7-GFP(Addgene质粒#28047)、糖皮质激素受体(C638G)-GFP融合物(GR-GFP)(Holub,JM等.Biochemistry,2013,50,9036-6046)、DsRed-Rab5WT(Addgene质粒#13050)或DsRed-Rab5Q79L(Addgene质粒#29688)遵循Lipofectamine 2000制造商方案转染细胞。
小单层囊泡(SUV)的制备。通过修改先前报道的方法(Magzoub,M等.Biochim.Biophys.Acta,2002,1563,53-63)制备SUV。将适当的脂质混合物溶解于试管中的氯仿中。通过在溶液上吹氩气轻轻地干燥脂质混合物，并保持在干燥器中过夜。在DPBS中再水化干燥的脂质至最终的总脂质浓度为10mM。通过涡旋和在冰上超声处理将混悬液剧烈混合，直到其变得澄清。典型的制备产生包含平均直径为～80nm和通过使用Zeta SizerNano Series(Malvern，Brookhaven，CT)的动态光散射测量法测定的多分散性(PdI)指数<0.15的囊泡的均匀溶液。将SUV溶液储存在4℃，并在同一天用于FP实验。
荧光偏振。通过在室温下用DPBS中不同浓度的硫酸乙酰肝素(0-5,000nM)孵育100nM FITC-标记的肽2小时来进行典型的实验。在Molecular Devices Spectramax M5分光荧光计上测量FP值，激发波长和发射波长分别为485nm和525nm。通过对作为硫酸乙酰肝素浓度的函数的FP值作图并使用GraphPad PRISM ver.6软件拟合到四参数逻辑曲线来确定EC50。
为了获得具有脂质膜的CPP的EC50值，使用100nM FITC标记的肽与DPBS中增加浓度的SUV溶液(0-10mM)类似地进行FP实验。类似地对FP值进行测量、作图和分析。
图像分析。使用imageJ一致地修改原图。使用Just Another ColocalizationPlugin(JACoP)(Bolte，S和Cordelieres，FP.J.Microsc.，2006,224,213-232)从内体区获得Pearson相关系数(R)。对于GR-GFP易位测定，将单独的GFP和Hoescht图像加载到定制的CellProfiler管道中并着色为灰色(Carpenter，AE等.Genome Biol.，2006,7，R100)。经由Otsu自动三类阈值处理将核与Hoescht图像区分开，将中间强度类别的像素分配给本底。将聚集的物体使用拉普拉斯高斯建模识别并通过形状分离。将核区域定义为缩小1μm的Hoescht物体的直径，而胞质环区域定义为核直径和扩大2μm的核直径之间的区域。将易位比定义为核区内部的平均GFP信号除以每个细胞测量的细胞溶质区域内的平均GFP信号，并且对于每个测试的条件捕获来自15-30个图像的30-70个细胞。
共聚焦显微术。为了检查罗丹明标记的环肽(cFΦR4Rho)和Rab5+或Rab7+内体之间的共定位，在实验前一天将用Rab5-GFP或Rab7-GFP转染的HeLa细胞涂铺(200μL，104个细胞/孔，96孔玻璃底部MatriPlates)。在实验当天，用补充有300nM Hoescht 33342的DMEM培养基中的1μM cFΦR4Rho处理HeLa细胞30分钟。之后，用HKR缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，140mM NaCl，2mM KCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2)洗涤细胞，并使用PerkinElmer LiveView旋转盘共焦显微镜成像。
对于GR易位测定，如上所述对用GR-GFP转染的HeLa细胞进行涂铺(Holub,JM等.Biochemistry,2013,50,9036-6046)。用含有1μM Dex或Dex-肽缀合物和300nM Hoescht33342的DMEM培养基处理细胞30分钟，并使用配备有Ziess Axiocam mRM照相机和EXFO-Excite系列120Hg弧灯的Zeiss Axiovert 200M落射荧光显微镜成像。为了研究内吞作用抑制剂的作用，在与Dex或Dex-肽缀合物孵育之前，用含有抑制剂的澄清DMEM预处理转染的HeLa细胞30分钟。为了测试内质逃逸是否需要Rab5活性，用GR-GFP和DsRed-Rab5 WT或DsRed-Rab5Q79L转染HeLa细胞，之后用Dex或Dex-肽缀合物处理，并如上所述成像(Appelbaum,JS等.Chem.Biol.,2012,19,819-830)。
为了研究罗丹明标记的肽的内化，将5×104个HEK293细胞涂铺在35mm玻璃底的微孔皿(MatTek)中。在实验当天，在37℃下用肽溶液(5μM)和0.5mg/mL葡聚糖FITC孵育细胞2小时。将细胞用DPBS轻轻洗涤两次，并在Visitech Infinity 3Hawk 2D-阵列活细胞成像共聚焦显微镜上成像。为了检测含有pCAP的肽的内化，将HEK293细胞类似地涂铺，并在37℃下用肽溶液(5μM)孵育60分钟。除去培养基后，用含有过钒酸钠(1mM)的DPBS轻轻洗涤细胞两次，并在含有5μM核染色染料DRAQ5的DPBS中孵育10分钟。将所得细胞用DPBS洗涤两次并在旋转盘共聚焦显微镜(UltraView Vox CSUX1系统)上成像。为了监测GFP内化，将5×104个HEK293细胞接种在35mm玻璃底的微孔皿中并培养过夜。在37℃下，用cFΦR4-S-S-GFP(1μM)处理细胞2小时。除去培养基后，将细胞在含有5μM DRAQ5的DPBS中孵育10分钟。用DPBS洗涤细胞两次并在Visitech Infinity 3Hawk2D-阵列活细胞成像共聚焦显微镜上成像。
流式细胞术。为了定量含有pCAP的肽的递送效率，将HeLa细胞在六孔板(每孔5×105个细胞)中培养24小时。在实验当天，在37℃下用含有于1％FBS的澄清DMEM中的含10μMpCAP的肽孵育细胞2小时。将细胞用含有1mM过钒酸钠的DPBS洗涤，用含有0.25％胰蛋白酶从平板脱落，混悬于含1％牛血清白蛋白的DPBS中，并在BD FACS Aria流式细胞仪上以355nm激发分析。用Flowjo软件(Tree Star)分析数据。
为了评估cFΦR4对内吞作用的影响，将HeLa细胞接种在6孔板(每孔5×105个细胞)中并使其贴附过夜。贴附后，在标准细胞培养条件下用不含补充物、1μM cFΦR4肽、100μM葡聚糖Alexa488(LifeTechnologies，D-22910)或1μM环肽和100μM葡聚糖Alexa488二者的澄清DMEM处理细胞30分钟。将细胞用DPBS洗涤两次，用0.25％胰蛋白酶从板上移除，稀释到含有10％FBS的澄清DMEM中，以300g沉淀5分钟，用DPBS洗涤一次，并重悬于200μL DPBS中。使用制造商FL1激光器和过滤器组在BD Accuri C6流式细胞仪上分析全细胞葡聚糖摄取。
免疫印迹。在完全生长培养基中培养NIH3T3细胞以达到80％汇合。将细胞在无血清培养基中饥饿3小时，并用不同浓度的cFΦR4-PTP1B或未标记的PTP1B处理2小时，随后在补充有1mM过钒酸钠的培养基中孵育30分钟。除去溶液，并用冷DPBS洗涤细胞两次。在50mMTris-HCl，pH7.4、150mM NaCl，1％NP-40、10mM焦磷酸钠、5mM碘乙酸、10mM NaF、1mM EDTA、2mM过钒酸钠、0.1mg/mL苯基甲磺酰氟、1mM苄脒和0.1mg/mL胰蛋白酶抑制剂中使细胞脱落并裂解。在冰上孵育30分钟后，将细胞裂解物在微量离心机中以15,000rpm离心25分钟。通过SDS-PAGE分离总细胞蛋白并将其电泳转移至PVDF膜，使用抗pY抗体4G10进行免疫印迹。
血清稳定性试验。通过修改先前报道的程序(Nguyen,LT等.PLoS One,2010,5,e12684)进行稳定性测试。将稀释的人血清(25％)以15,000rpm离心10分钟，并收集上清液。将肽储液稀释到上清液中，对于cFΦR4和Antp，终浓度为5μM，而对于肽R9和Tat，终浓度为50μM，并在37℃下孵育。在各个时间点(0-6小时)，取出200-μL等分试样并与50μL的15％三氯乙酸混合，并在4℃下孵育过夜。将最终混合物在微量离心机中以15,000rpm离心10分钟，并通过装备有C18柱(Waters)的反相HPLC分析上清液。通过对肽峰下方的面积(在214nm监测)积分来确定剩余肽的量(％)并将其与对照反应(无血清)的相比较。
细胞毒性测定。进行MTT测定以评价环肽对几种哺乳动物细胞系的细胞毒性(Mosmann,T.J.Immunol.Methods,1983,65,55-63)。将100μL的MCF-7、HEK293、H1299、H1650、A549(1×105个细胞/mL)细胞置于96孔培养板的各孔中，并使其生长过夜。将不同浓度的肽(5或50μM)加入到每个孔中，并在37℃下用5％CO2孵育细胞24至72小时。将10μL MTT储液加入每个孔中。向生长培养基(无细胞)中加入10μL溶液作为阴性对照。将板在37℃下孵育4小时。然后向每个孔中加入100μL SDS-HCl增溶缓冲液，并将所得溶液充分混合。将板在37℃下再孵育4小时。使用Molecular Devices Spectramax M5读板仪在570nm下测量甲瓒产物的吸光度。每个实验一式三份进行，并且处理未添加任何肽的细胞作为对照。
cFΦR4结合至膜磷脂。之前观察到，用含有带负电荷的磷脂(90％磷脂酰胆碱(PC)和10％磷脂酰甘油(PG))的囊泡孵育1μM FITC标记的环肽cFΦR4FITC导致肽荧光猝灭，这与cFΦR4与磷脂的直接结合相一致(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.,2013,8,423-431)。为了测试在CPP的内吞摄取期间膜结合的潜在作用，制备模拟哺乳动物细胞外膜(45％PC、20％磷脂酰乙醇胺、20％鞘磷脂和15％胆固醇)的SUV，并通过荧光偏振(FP)测定测试与FITC-标记的cFΦR4、R9和Tat(均为100nM)的结合。cFΦR4以EC 50值(结合cFΦR4FITC的一半的脂质浓度)为2.1±0.1mM结合至中性SUV(图5A)。R9显示出与人工膜的结合弱得多(EC50>10mM)，而Tat根本不结合。接下来，测试CPP与硫酸乙酰肝素的结合，硫酸乙酰肝素先前被提出作为阳离子CPP的主要结合靶标(Nakase,I等.Biochemistry,2007,46,492-501；Rusnati,M等.J.Biol.Chem.,1999,274,28198-28205；Tyagi,M等.J.Biol.Chem.,2001,276,3254-3261；Ziegler,A和Seelig,J.Biophys.J.,2004,86,254-263；Goncalves,E等.Biochemistry,2005,44,2692-2702；Ziegler,A.Adv.Drug Delivery Rev.,2008,60,580-597)。R9和Tat均以高亲和力结合至硫酸乙酰肝素，EC50值分别为144nM和304nM(图5B)。在相同条件下，cFΦR4显示检测不到与硫酸乙酰肝素的结合。这些结果与先前的观察结果一致，即非两亲性阳离子CPP(例如Tat和R9)与细胞表面蛋白聚糖(例如，硫酸乙酰肝素)紧密结合，但仅与膜脂质弱结合(Ziegler,A.Adv.Drug Delivery Rev.,2008,60,580-597)。cFΦR4的正电荷数量不足可能是由于其缺乏与硫酸乙酰肝素的强静电相互作用。另一方面，cFΦR4的两亲性质和更刚性的环状结构应当有助于其结合中性脂质膜。这些数据与上述通过各种内吞抑制剂的抑制模式一起表明cFΦR4可以直接结合至质膜磷脂，并且可以以背负方式通过所有内吞机制内化。
肽基货物的细胞内递送。由于cFΦR4的环内递送限于七肽或更小的货物(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.,2013,8,423-431)，在本研究中，对cFΦR4递送连接到Gln侧链的不同大小和物理化学性质的货物(图1B，环外递送)的能力进行了测试。首先，将带正电荷的(RRRRR)、中性(AAAAA)、疏水(FFFF)和带负电荷的肽[DE(pCAP)LI]共价连接到cFΦR4。前三种肽在C末端赖氨酸侧链用罗丹明B标记(图2)，并且通过活细胞共聚焦显微术对其被内化到HEK293细胞中进行检测。用5μM肽cFΦR4-A5(图6A)或cFΦR4-R5(图6B)孵育细胞2小时显示了点状荧光和漫射荧光两者的证据，后者几乎均匀地分布在整个细胞中。相比之下，流体相内吞标志物葡聚糖FITC主要显示点状荧光，指示内体定位。漫射罗丹明荧光表明一部分肽到达细胞的胞质溶胶和细胞核。细胞与cFΦR4(1μM)和葡聚糖Alexa488的共孵育增加内吞标志物的内化15％(图7)，表明cFΦR4可以激活培养细胞的内吞作用。cFΦR4-F4由于其水溶性差而未进行测试。
设计肽cFΦR4-DE(pCAP)LI(cFΦR4-PCP；图2)以测试cFΦR4递送带负电荷的货物的能力以及比较cFΦR4与其他广泛使用的CPP(例如R9、Tat和穿膜肽(Antp))的细胞质递送效率。因此，还制备了未标记的PCP[Ac-DE(pCap)LI-NH2]和与R9缀合的PCP(R9-PCP)、与Tat缀合的PCP(Tat-PCP)或与Antp缀合的PCP(Antp-PCP)。注意，cFΦR4-PCP在生理pH下携带净电荷为零。pCAP是非荧光的，但在进入细胞内部后，应当通过内源蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)快速去磷酸化以产生荧光产物，香豆酰基氨基丙酸(CAP，激发355nm；发射450nm)(Mitra,S和Barrios,AM.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2005,15,5124-5145；Stanford,SM等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2012,109,13972-13977)。当在体外针对PTP组进行测定时，全部四种CPP-PCP缀合物均有效地被去磷酸化(表8)。该测定仅检测在细胞质和细胞核内的CPP-货物，其中全部已知的哺乳动物PTP的催化结构域被定位(Alonso,A等.Cell,2004,117,699-711)。此外，CAP仅在其去质子化状态(pKa＝7.8)下是荧光的；即使在内体(pH6.5-4.5)或溶酶体(pH 4.5)内发生一些脱磷酸化，其对总荧光贡献也基本没有(图8)。用5μM cFΦR4-PCP处理HEK293细胞60分钟导致整个细胞的漫射蓝色荧光，表明cFΦR4-PCP到达细胞内部，而未标记的PCP在相同条件下不能进入细胞(图9A)。当用PTP抑制剂过钒酸钠预处理HEK293细胞1小时，然后用cFΦR4-PCP(5μM)进行孵育时，细胞中的CAP荧光减少到本底水平。在相同条件下用R9-PCP、Antp-PCP或Tat-PCP处理的HEK293细胞显示弱的荧光，这与这些肽接近细胞内部的能力差相一致(图9A)。为了对相对细胞内PCP递送效率进行定量，用每种肽处理HeLa细胞，并通过荧光激活细胞分选进行分析(图9B)。cFΦR4-PCP被HeLa细胞最有效地内化，平均荧光强度(MFI)为3510个任意单位(AU)，而R9-PCP、Antp-PCP、Tat-PCP和未标记的PCP分别产生960、400、290和30AU的MFI值(图9C)。此外，当在存在过钒酸钠的情况下用cFΦR4-PCP处理细胞时，CAP荧光的量降低至接近本底水平(70AU)。因此，cFΦR4能够将具有不同物理化学性质的肽基货物递送到细胞质中，其效率比R9、Antp和Tat高3.7-12倍。
表8.针对含pCAP的肽的重组PTP的动力学活性(kcat/KM，M-1s-1)a
a如前所述(Ren,L等.Biochemistry,2011,50,2339-2356)测量kcat/KM。
环肽的细胞内递送。近年来，对环肽作为治疗剂和生物医学研究工具已有很大的兴趣(Driggers,EM等.Nat.Rev.Drug Discov.,2008,7,608-624；Marsault,E和Peterson,ML.J.Med.Chem.,2011,54,1961-2004)。例如，环肽对于抑制蛋白质-蛋白质相互作用有效(Lian,W等.J.Am.Chem.Soc.,2013,135,11990-11995；Liu,T等.ACS Comb.Sci.,2011,13,537-546；Dewan,V等.ACS Chem.Biol.,2012,7,761-769；Wu,X等.Med.Chem.Commun.,2013,4,378-382)，这是常规小分子的有挑战性的靶标。开发环肽治疗剂的主要障碍是它们对细胞膜通常是不能穿透细胞膜(Kwon,YU和Kodadek,T.Chem.Biol.,2007,14,671-677；Rezai,T等.J.Am.Chem.Soc.,2006,128,2510-2511；Chatterjee,J等.Acc.Chem.Res.,2008,41,1331-1342)。通过环内方法经cFΦR4递送环肽的尝试仅获得了有限的成功；货物大小增加1至7个残基导致逐渐更差的细胞摄取，可能是因为更大、更柔性的环与细胞膜结合更差(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.,2013,8,423-431)。为了克服这种限制，研究了双环肽体系，其中一个环含有CPP基序(例如，FΦR4)，而另一个环由对所需靶标具有特异性的肽序列组成(图1C)。双环体系原则上应能够容纳任何大小的货物，因为货物不改变CPP环的结构并且应对其递送效率具有更小的影响。双环结构的额外刚性也应当改善其代谢稳定性以及靶结合亲和力和特异性。双环肽通过以下容易地合成：在均苯三甲酰支架和相应线性肽上的三个氨基基团之间形成三个酰胺键(即N-末端胺、C-末端二氨基丙酸(Dap)的侧链和嵌入在CPP与靶标结合基序之间的赖氨酸(或鸟氨酸，Dap)的侧链)(Lian,W等.J.Am.Chem.Soc.,2013,135,11990-11995)。为了测试该方法的有效性，在C-末端环中选择FΦR4作为CPP部分，并且选择不同长度和电荷的肽(AAAAA、AAAAAAA、RARAR或DADAD)作为货物(表8，化合物13-16)。为了比较，还制备了含有作为转运蛋白的FΦR4和作为货物的肽A5和A7的两种单环肽(表8，化合物17和18)。将所有肽在C末端赖氨酸侧链用罗丹明B标记(图2)，并通过活细胞共聚焦显微术检测它们向HEK293细胞的内化。用5μM肽处理细胞2小时导致全部六种肽的有效内化(图10)，但FACS分析表明双环(FΦR4-A5)Rho的摄取比相应的单环肽(化合物17)的效率高约3倍。内化肽的细胞内分布在双环肽和单环肽之间相当不同。虽然四种双环肽显示出它们存在于细胞质/细胞核(如由漫射罗丹明荧光指示)和内体(如由荧光斑点指示)的证据，但是单环肽主要显示与内吞标志物葡聚糖FITC重叠的点状荧光。在所有情况下，内吞标志物仅显示点状荧光，表明在用肽处理的细胞中内体是完整的。这些结果表明双环肽的增加的结构刚性促进通过内吞作用的初始摄取和内体释放，这可能是由于它们改进的对血浆和内体膜的结合。双环体系可以提供环肽和双环肽的细胞内递送的一般策略。
蛋白质货物的细胞内递送。为了测试cFΦR4是否能够将全长蛋白质转运到哺乳动物细胞中，通过二硫键将GFP连接到cFΦR4的N-末端(图11A和图3)。选择GFP是因为其固有的荧光。二硫化物交换反应是高特异性的、有效的和可逆的；在进入细胞质后，CPP-S-S-蛋白质缀合物可以快速还原以释放天然蛋白质。尽管cFΦR4可以直接连接到货物蛋白上的天然或工程化的表面半胱氨酸残基，但是使用在其N-末端含有12个氨基酸ybbR标签的GFP变体，并且使用磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp酶促地连接cFΦR4到ybbR标签(Yin,J等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2005,102,15815-15820)。这使得可以以位点特异性方式将单个cFΦR4单元连接到GFP。为了比较，以相同的方式产生Tat-S-S-GFP缀合物。在1μM cFΦR4-S-S-GFP存在下孵育HEK293细胞导致细胞内绿色荧光的积累(图11B)。荧光信号是弥散的，并存在于整个细胞体积内，但在核中具有较高的浓度。一些细胞含有强绿色荧光的小斑点(由图11B中的箭头指示)，其可以表示细胞内的内体隐蔽的cFΦR4-S-S-GFP或聚集的GFP。未标记的GFP不能进入细胞，而Tat-S-S-GFP比cFΦR4-S-S-GFP更低效地进入细胞(图11B)；用1μM蛋白质处理的HaLa细胞的FACS分析表明后者的总细胞内荧光高5.5倍。细胞周围的荧光斑点以及在Tat-S-S-GFP处理的细胞的核区域中缺乏任何可检测的荧光表明Tat-S-S-GFP主要被包埋在内体中，这与先前的报道一致(Kaplan,IM等.J.ControlledRelease,2005，102,247-253)。因此，对于作为货物的蛋白质，就最初的摄取和内体逃逸两者而言，cFΦR4也具有比Tat更高的效率。
为了证实cFΦR4的蛋白质递送的一般性，选择功能酶PTP1B的催化结构域(氨基酸1-321)递送至细胞内部。为了显示不可裂解的键连也与递送方法相容，经由硫醚键将cFΦR4与ybbR-tagged PTP1B相缀合(cFΦR4-PTP1B)(图4)。使用对硝基苯基磷酸酯作为底物的体外测定示出添加cFΦR4标签不影响PTP1B的活性(表9)。在无标记的PTP1B或cFΦR4-PTP1B存在下孵育NIH 3T3细胞2小时，并通过抗pY蛋白质印迹分析其全局pY蛋白质水平(图12A)。用cFΦR4-PTP1B而非未标记的PTP1B处理细胞导致大多数但非全部蛋白质的pY水平的浓度依赖性降低。如通过考马斯蓝染色检测的总细胞蛋白质水平未改变(图12B)，表明观察到的pY水平的降低是由于cFΦR4-PTP1B对pY蛋白的去磷酸化和/或由引入cFΦR4-PTP1B(例如，细胞蛋白酪氨酸激酶的失活)引起的次级作用导致的。有趣的是，不同的蛋白质表现出不同的去磷酸化动力学。在添加62nMcFΦR4-PTP1B后，150-200kD范围内的几种蛋白质被完全去磷酸化，而约80kD的蛋白质在500nM cFΦR4-PTP1B处保持磷酸化。pY模式的变化与PTP1B的广泛底物特异性相一致(Ren,L等.Biochemistry,2011,50,2339-2356)，并且非常类似于由PTP1B在哺乳动物细胞的胞质溶胶内的过表达所引起的(LaMontagne Jr.,KR等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95,14094-14099)。这些结果表明，cFΦR4可以以催化活性形式和足以干扰细胞信号传导过程的水平将PTP1B递送到NIH 3T3细胞的内部。cFΦR4因此提供了用于将其它功能性蛋白质，特别是不能遗传表达的蛋白质(例如，毒性和化学修饰的蛋白质)引入哺乳动物细胞中以研究其细胞功能的工具。
表9.PTP1B和cFΦR4-PTP1B针对pNPP的动力学活性(kcat/KM，M-1s-1)a
apNPP＝对硝基苯基磷酸酯；如前所述测量kcat/KM(Ren,L等.Biochemistry,2011,50,2339-2356)。
cFΦR4的稳定性和细胞毒性。通过在37℃下在25％人血清中孵育CPP，并且按照全长肽消失通过反相HPLC来测定cFΦR4、R9、Tat和Antp(表8，化合物19-22)针对蛋白水解降解的相对稳定性。含阳离子色氨酸的肽Antp在四种CPP中最不稳定；它在半衰期<20分钟时降解，并在2小时后完全消化(图13A)。R9和Tat比Antp稍稳定，半衰期为约30分钟。相比之下，cFΦR4对血清蛋白酶非常稳定。孵育6小时后降解小于10％；在血清中孵育24小时后，>70％的cFΦR4保持完整。许多其它研究也已经证实肽的环化提高了它们的蛋白水解稳定性(Nguyen,LT等.PLoS One,2010,5,e12684)。用五种不同的人细胞系(HEK293、MCF-7、A549、H1650和H1299)通过MTT测定评估cFΦR4的潜在细胞毒性。在用高达50μM的cFΦR4孵育24或48小时后，对于任何细胞系没有显著的生长抑制(图13B和图14)。72小时后，在50μM观察到轻微的生长抑制(高达20％)(图14)。因此，cFΦR4对哺乳动物细胞相对无毒。
在本研究中，证明cFΦR4可以有效地将小分子、肽和蛋白质货物环外递送到哺乳动物细胞的细胞质和细胞核中。通过使用含有pCAP的肽作为货物/报告物，显示cFΦR4可以比用于细胞质货物递送的R9、Tat和Antp的效率高3.7-12倍，使得cFΦR4成为迄今已知最活跃的CPP之一。虽然存在多碱性CPP的修饰，例如之前已经报道添加疏水性酰基基团以类似的量级增加细胞摄取(Pham,W等.Chembiochem,2004,5,1148-1151)，但是这些先前的研究尚未确定增强的摄取是否转化成细胞质CPP浓度的类似增加。本文所述的基于pCAP的报道系统可以提供简单、稳健的方法来定量评估其他CPP的细胞质递送效率。几个证据表明，cFΦR4可以通过多种内吞机制进入细胞，包括其在4℃或在叠氮化钠的存在下不能进入细胞，在cFΦR4Rho的荧光斑点与流体相内吞标志物葡聚糖FITC之间的部分重叠，cFΦR4Rho和内体蛋白Rab5和Rab7的共定位，以及在施用内吞抑制剂后降低的cFΦR4 Dex摄取。除了cFΦR4与Rab5+内体之间观察到的强共定位外，PI3K抑制剂渥曼青霉素和Rab5Q79L突变对cFΦR4的细胞质递送的最小影响表明cFΦR4可以从早期内体逃逸(图15)。相比之下，Tat已被证实通过内吞作用进入细胞并从晚期内体释放，而在Rab7募集之前，R9逃逸到内体(Appelbaum,JS等.Chem.Biol.,2012,19,819-830)。早期内体释放可以提供优势，特别是对于肽和蛋白质货物，因为它可以最小化由后期内体和溶酶体蛋白酶进行的货物降解和在内体成熟期间由酸化引起的变性。实际上，通过cFΦR4递送到细胞质中的GFP和PTP1B二者处于其折叠的活性形式，分别由绿色荧光和使细胞内pY蛋白脱磷酸的能力证明。此外，由于其更刚性的结构，cFΦR4可以比线性肽对抗蛋白水解降解更加稳定，并且由于其更小的大小，cFΦR4可以不那么昂贵地合成并且可能不太可能干扰货物功能。这些性质可使cFΦR4成为细胞溶质递送小分子到蛋白质货物的有用转运蛋白。直接蛋白质递送可以提供有用的研究工具，例如用于研究蛋白质的细胞功能，因为其可以提供对DNA转染和随后的基因表达的改善的时间控制，并且可以使其递送经化学修饰的蛋白质和其过表达可以引起毒性的蛋白质。cFΦR4从早期内体逃逸的能力及其简单的结构也可以提供用于阐明内体逃逸机制的优异系统和影响逃避效率的因素。
实施例2
肽配体的环化可以有效地改善它们对蛋白水解降解的稳定性以及在一些情况下它们的细胞穿透性。然而，该策略与识别延伸构象(例如，β-链和α-螺旋)的肽配体的蛋白质不相容。在这项工作中，通过将其与两亲性序列基序(例如，RRRRΦF，其中Φ是L-萘基丙氨酸)融合并通过二硫键环化所得缀合物开发出了用于细胞内递送线性肽配体的一般策略。环化肽可以具有增强的蛋白水解稳定性和膜通透性；当进入细胞的细胞质/细胞核后，可以通过还原细胞内环境切割二硫键以释放线性的生物活性肽。该策略适用于产生作为半胱天冬酶底物的细胞可通透肽和针对CAL PDZ结构域的抑制剂，用于囊性纤维化的潜在治疗。
线性肽作为药物的适用性通常受限于它们对蛋白水解切割的易感性和膜通透性差。肽的环化可以有效改善它们的蛋白水解稳定性(Nguyen,LT等.PLoS One,2010,5,e12684)。此外，最近报道了某些两亲性肽(例如，FΦRRRR，其中Φ是L-2-萘基丙氨酸)的环化可以通过主动转运机制使它们成为细胞可通透的(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423)。通过在生物活性环肽中掺入这些短序列基序，可将生物活性环肽递送到哺乳动物细胞的细胞质和细胞核中(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423)。然而，在许多情况下，结合至分子靶标(例如PDZ(Doyle,DA等.Cell 1996,85,1067；Morais Cabral,JH等,Nature1996,382,649)和BIR结构域(Wu,G等l.Nature 2000,408,1008))可能需要肽基配体以其延伸构象(例如α-螺旋和β-链)存在，并且环化可能干扰靶结合。在本文中，对通过可逆的二硫键介导的环化将线性肽配体递送到哺乳动物细胞中的潜在的一般策略进行了研究。当存在于氧化性细胞外环境中时，肽可作为大环存在，其可以具有增强的对蛋白水解的稳定性和细胞通透性。在进入细胞(即细胞质和/或细胞核)后，二硫键可以被细胞内硫醇还原以产生线性生物活性肽(图16)(Cascales,L等.J.Biol Chem.2011,286,36932；Jha,D等.Bioconj Chem.2011,22,319)。
材料。用于肽合成的试剂购自Advanced ChemTech(Louisville，KY)、NovaBiochem(La Jolla，CA)或Anaspec(San Jose，CA)。Rink树脂LS(100-200目，0.2mmol/g)购自Advanced Chem Tech。葡聚糖Rho、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。细胞培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、0.25％胰蛋白酶-EDTA和DPBS购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。核染色染料DRAQ5TM购自Thermo Scientific(Rockford，IL)。半胱天冬酶-3，人重组蛋白购自EMD Chemicals(San Diego，CA)。
肽合成。使用标准Fmoc化学在Rink Resin LS(0.2mmol/g)上合成大多数肽。典型的偶联反应含有5当量的Fmoc-氨基酸、5当量的2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和10当量的二异丙基乙胺(DIPEA)，并使其继续混合75分钟。通过用92.5:2.5:2.5:2.5(v/v)三氟乙酸(TFA)/水/苯酚/三异丙基硅烷(TIPS)处理2小时使肽脱保护并从树脂中释放。用冷乙醚(3×)研磨肽，并通过装备有C18柱的反相HPLC纯化。通过将纯化的肽(各约1mg)溶解于300μL的1:1:1的DMSO/DMF/150mM碳酸氢钠(pH8.5)中并与10μL的于DMSO(100mg/mL)中的FITC混合来进行用异硫氰酸荧光素(FITC)标记肽。在室温下20分钟后，在C18柱上对反应混合物进行反相HPLC以分离FITC标记的肽。
为了产生二硫键介导的环肽，通过用DMF中的20％(v/v)哌啶处理来除去N-末端Fmoc保护基团后，使用10当量的N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和0.1当量的4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)在无水DCM中将3,3'-二硫代二丙酸(10当量)偶联在N-末端，持续2小时。然后将树脂在DMF中的20％β-巯基乙醇中孵育2小时，进行2次，以暴露游离硫醇。将研磨的粗线性肽在pH 7.4的PBS缓冲液中的5％DMSO中孵育过夜(Tam,JP等.J.Am.Chem.Soc.1991,113,6657)，然后如上所述研磨和进行HPLC纯化(Tam,JP等.J.Am.Chem.Soc.1991,113,6657)。
为了产生硫醚介导的环肽，在通过用DMF中的20％(v/v)哌啶处理除去N-末端Fmoc保护基团后，使用10当量DIC和0.1当量DMAP在无水DCM中将4-溴丁酸(10当量)偶联在N-末端，持续2小时。使用在DCM中的1％三氟乙酸(TFA)选择性去除L-半胱氨酸侧链上的4-甲氧基三苯甲基(Mmt)保护基团。通过在氮气保护下在DMF中的1％DIPEA中孵育树脂过夜来进行硫醚形成。然后如上所述将环化的肽研磨和纯化(Roberts,KD等.Tetrahedron Lett.1998,39,8357)。
使用Fmoc-Asp(Wang-树脂)-AMC(AMC＝7-氨基-4-甲基香豆素)(NovaBiochem)作为固体支持物来合成荧光半胱天冬酶底物。采用标准Fmoc化学来在固相上合成肽。通过用95:2.5:2.5(v/v)TFA/苯酚/水处理2小时从树脂中释放这些肽(Maly,DJ等.J.Org.Chem.2002,67,910)。
细胞培养。将HeLa细胞维持在由DMEM、10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素组成的培养基中。将Jurkat细胞维持在由RPMI-1640、10％FBS和1％青霉素/链霉素组成的培养基中。将对于ΔF508-CFTR突变纯合的支气管上皮CFBE细胞系保持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的含L-谷氨酰胺的DMEM中。使用人纤连蛋白(1mg/ml)、牛胶原蛋白I(3mg/ml)和牛血清白蛋白(1mg/ml)包被组织培养板。在加湿孵育箱中于37℃、5％CO2下培养细胞。
共聚焦显微术。为了检测肽内化，将1mL HeLa细胞混悬液(5×104个细胞)接种在35mm玻璃底的微孔皿(MatTek)中，并培养过夜。用DPBS轻轻洗涤细胞两次，并在5％CO2的存在下于37℃用含有1％血清的无酚红DMEM中的FITC标记的肽(5μM)和葡聚糖Rho(0.5mg mL-1)处理1小时。除去培养基后，用DPBS轻轻洗涤细胞两次，并用DPBS中的5μM DRAQ5孵育10分钟。再次用DPBS洗涤细胞两次，并在Visitech Infinity 3Hawk 2D-阵列活细胞成像共聚焦显微镜上成像。在相同参数下捕获图像，并使用MetaMorph(Molecular Devices)在相同设置下进行调节。
流式细胞术。在六孔板(每孔5×105个细胞)中培养HeLa细胞24小时。在实验当天，在37℃下用含有1％FBS的澄清DMEM中的5μM FITC标记的肽孵育细胞2小时。用DPBS洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶使细胞从板上脱落，稀释到含有10％FBS的澄清DMEM中，以250g沉淀5分钟，用DPBS洗涤一次并重悬浮于含有1％牛血清白蛋白的DPBS中，并在BD FACS Aria流式细胞仪上分析。用Flowjo软件(Tree Star)分析数据。
为了对PCP缀合的肽的递送效率进行定量，在六孔板(每孔5×105个细胞)中培养HeLa细胞24小时。在实验当天，在37℃下用含1％FBS的澄清DMEM中的5μM含pCAP的肽孵育细胞2小时。用含有1mM过钒酸钠的DPBS洗涤细胞，用0.25％胰蛋白酶使细胞从板上脱落，悬浮于含有1％牛血清白蛋白的DPBS中，并在BD FACS Aria流式细胞仪上以355nm激发进行分析。
肽蛋白水解稳定性测定。通过稍微修改先前报道的方法进行稳定性试验(Frackenpohl,J等.Chembiochem2001,2,445)。在37℃下用于200μL工作缓冲液(50mMTris-HCl，pH 8.0，NaCl(100mM)，CaCl2(10mM))中的30μL 50μM α-胰凝乳蛋白酶和30μL 50μM胰蛋白酶孵育24μL的1.5mM肽溶液。在不同的时间点(0-12小时)取出40μL等分试样并与40μL的15％三氯乙酸混合，并在4℃下孵育过夜。将最终混合物在微量离心机中以15,000rpm离心10分钟，并通过装备有C18柱(Waters)的反相HPLC分析上清液。通过对肽峰下方的面积(在214nm处监测)积分来确定剩余肽的量(％)并与对照反应(无蛋白酶)的相比较。
Cellulo中荧光测定。在实验前1小时将100μL Jurkat细胞悬浮液(5×105个细胞/mL)接种在96孔板中。将10μL的星形孢菌素储液(10μM)加入一半孔中以诱导凋亡，而将10μL培养基加入到其他孔中。孵育1小时后，将半胱天冬酶-3荧光底物加入细胞至终浓度为5μM。在Spectramax M5读板仪上在360和440nm的激发和发射波长下于不同时间点(0-6小时)测量释放的香豆素的荧光。将诱导和未诱导细胞之间的荧光单位(FU)增加相对于呈现使用活细胞中的各种荧光底物实时测量的半胱天冬酶-3活性的时间作图。进行三组独立的实验，每组一式三份进行。
体外荧光测定。首先在96孔板中用90μL反应缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，100mMNaCl，10mM DTT)孵育0.5μL(100U/μL)半胱天冬酶-3酶30分钟。将荧光底物(10μL，100μM)混合到上述溶液中以开始反应，并在Spectramax M5读板仪(Ex＝360nm，Em＝440nm)(Molecular Devices)上测量板。将1分钟间隔的荧光单位(FU)增加与由于蛋白酶活性导致的Amc释放相关联。从反应曲线的线性部分计算ΔFU/min。报告的值是具有所示标准偏差的三次试验的平均值。
荧光各向异性。通过在室温下用FA缓冲液(20mM HEPES，pH7.4,150mM NaCl，5mM谷胱甘肽，0.1％(w/v)牛血清白蛋白)中不同浓度(0-6μM)的CAL-PDZ(Cushing,PR等.Biochemistry 2008,47,10084)孵育100nM荧光团标记的肽基配体2小时进行完全荧光各向异性(FA)滴定实验。在Molecular Devices Spectramax M5分光荧光计上测量FA值，激发波长和发射波长分别为485nm和525nm。通过对作为CAL-PDZ浓度的函数的荧光各向异性值作图来测定平衡解离常数(KD)。将滴定曲线拟合至以下方程，其假设1:1的结合化学计量
其中Y是在给定的CAL-PDZ浓度x下测量的各向异性；L是双环肽浓度；Qb/Qf是染料-蛋白质相互作用的校正因子；A最大值是当所有肽都结合到CAP-PDZ时的最大各向异性，而A最小值是当所有肽都游离时的最小各向异性。
免疫荧光染色。简言之，在存在和不存在50 μM未标记的肽8的情况下，用10mMCorr-4a处理对于DF508-CFTR突变为纯合的支气管上皮CFBE细胞。处理后，将细胞在冷甲醇中固定20分钟。然后将载玻片在1％BSA/PBS中孵育10分钟，随后在37℃下用小鼠抗人单克隆CFTR抗体(R&D Systems)孵育1小时。此后，将载玻片在37℃下用Alexa488-缀合的抗小鼠IgG2a二抗孵育45分钟。在Leica TCS SP2 AOBS共焦激光扫描显微镜上显现细胞。所有测量都是由两个独立的研究者以双盲方式进行的。
SPQ细胞内氯化物浓度测定。利用SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉鎓)测定法评估CFBE细胞中ΔF508-CFTR活性的转运活性，因为SPQ的荧光与增加浓度的细胞内氯化物负相关(Illsley，NP和Verkman，AS.Biochemistry 1987,26,1215)。使用补充有L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养基，使CFBE细胞在用1mg/ml人纤连蛋白、3mg/ml牛胶原蛋白I和1mg/ml牛血清白蛋白预先涂覆的96孔板上生长。首先将细胞在存在或不存在20μM CFTR校正物VX809(Van Goor,F等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2011,108,18843)的情况下处理24小时和用50μM CAL-PDZ结构域抑制剂处理1小时。然后使用含有1：1(v/v)Opti-MEM/水溶液的10mM SPQ在37℃下采用低渗休克15分钟向细胞加载SPQ。然后洗涤细胞，并用荧光猝灭NaI缓冲液(130mM NaI，5mM KNO3，2.5mM Ca(NO3)2、2.5mM Mg(NO3)2、10mM D-葡萄糖、10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES，pH 7.4))孵育两次，持续10分钟。随后，将细胞用CFTR激活混合物(10μM毛喉素和50μM染料木黄酮)转换至脱猝灭等渗NaNO3缓冲液(与NaI缓冲液相同，除了130mM NaI被130mM NaNO3替代)。通过用激活混合物和CFTR特异性抑制剂GlyH101(10μM)孵育细胞来测量对CFTR介导的碘化物流出物具有非特异性的荧光。通过高于基础水平的荧光增加速率评价CAL-PDZ抑制剂的效果。使用具有在350nm下的激发波长和DAPI发射滤光片的读板仪VICTOR X3(Perkin Elmer)测量去淬灭的SPQ的荧光。数据表示为来自至少三个独立实验的平均值±标准差。
已经报道了共切两亲性环肽环(FΦRRRRQ)(cFΦR4)作为高活性细胞穿透肽(CPP)，其可以通过内吞作用和内体逃逸进入哺乳动物细胞的细胞质(Qian,Z等.ACSChem.Biol.2013,8,423)。为了测试可逆环化策略的有效性，合成了N-3-巯基丙酰基-FΦRRRRCK-NH2肽，然后通过形成分子内二硫键而环化(图17；表10，肽1)。还通过用丁酰基基团替换N-末端3-巯基丙酰基基团和用2-氨基丁酸(Abu或U)替换C-末端半胱氨酸来合成相同序列的线性肽(表10，肽2)。两种肽都用异硫氰酸荧光素(FITC)在C-末端赖氨酸残基处标记，并通过活细胞共聚焦显微术和流式细胞术评估它们的细胞摄取。用环肽(5μM)处理的HeLa细胞在整个细胞体积中显示出强的弥散绿色荧光，而内吞作用标志物罗丹明标记的葡聚糖(葡聚糖Rho)在细胞质区域中仅显示点状荧光(图18A)。在细胞质和核区域中FITC荧光的几乎均匀分布表明环肽被HeLa细胞有效内化，并且像亲本环肽cFΦR4一样能够有效地从内体中逃逸。相比之下，用线性对照肽处理的细胞在相同的成像条件下显示出弱得多的细胞内荧光。通过荧光激活的细胞分选(FACS)对总细胞内荧光的定量给出了分别用二硫化物环化肽、线性肽和单独的FITC处理的细胞的平均荧光强度(MFI)为27,100、5530和1200任意单位(AU)(图18B)。高度带负电荷五肽Asp-Glu-pCAP-Leu-Ile(PCP，其中pCAP是磷酸香豆基氨基丙酸)也用作货物，并通过聚乙二醇接头连接到肽1和2(图17)。pCAP是非荧光的，但当递送到哺乳动物细胞质中时，其经历快速去磷酸化以产生荧光产物香豆酰基氨基丙酸(CAP)(Stanford,SM等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,13972)。因此，pCAP测定提供了不同CPP的细胞质/核浓度的定量评估(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423)。用5μM肽1-PCP和肽2-PCP处理的HeLa细胞的FACS分析分别得到3020和700的MFI值(图19)。因此，上述结果表明FΦRRRR通过二硫键的环化可以具有与N-至-C环化相似的效果，并且可以将其细胞摄取效率提高约5倍(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423)。此外，通过二硫键形成的环化可以增强肽的蛋白水解抗性。用蛋白酶混合物将肽1孵育12小时导致<50％降解，而线性肽2在相同条件下以约20分钟的半衰期降解(图20)。
表10.肽的序列。
aAmc，7-氨基-4-甲基香豆素；FITC，异硫氰酸荧光素；Φ，L-2-奈基丙氨酸；Ω，正亮氨酸；U，2-氨基丁酸。
为了说明可逆环化策略的效用，将其用于将特定的半胱天冬酶底物递送到细胞中并实时监测细胞内半胱天冬酶活性(Riedl,SJ和Shi,Y.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004,5,897)。虽然肽基香豆素衍生物已被广泛用于在体外检测半胱天冬酶活性(Maly,DJ等.Chembiochem2002,3,16)，但由于哺乳动物细胞膜的不可通透性，它们通常不适于体内应用。为了产生细胞可通透的半胱天冬酶底物，将半胱天冬酶3/7底物Ac-Asp-Nle-Abu-Asp-Amc(Thornberry,NA等.J.Biol.Chem.1997,272,17907)(表10，肽3，其中Amc是7-氨基-4-甲基香豆素，Nle是正亮氨酸)与CPP基序RRRRΦF融合。随后通过向其N末端添加3-巯基丙酰基基团、用半胱氨酸置换C末端Abu并形成分子内二硫键，使融合肽环化以得到环肽4(表10)。为了比较，通过在N-末端溴丁酰基部分和C-末端半胱氨酸之间形成硫醚键合成异构的但不可逆环化的肽(表10，肽5)(图17)。同样如上所述制备相同序列的线性对照肽(表10肽6)。最后，将半胱天冬酶3/7底物与非精氨酸(R9)缀合以产生阳性对照肽(表10，肽7)。体外动力学分析揭示，半胱天冬酶3/7底物与RRRRΦF和R9的融合相对于肽3分别降低了53％和72％的活性，而通过硫醚形成的环化使得肽对重组半胱天冬酶3失活(表11)。肽4对半胱天冬酶3的活性无法可靠地测定，因为半胱天冬酶测定需要将切割二硫键的还原环境。鉴于肽4与5之间的结构相似性，可以假定环状形式的肽4对半胱天冬酶也是无活性的，但在二硫键的还原性切割后与肽6具有类似的活性。
表11.多种荧光底物对重组半胱天冬酶-3酶的体外活性。
用激酶抑制剂星形孢菌素对Jurkat细胞进行预处理以诱导半胱天冬酶活性，从而诱导凋亡(Belmokhtar,CA等.Biochem.J.1996,315,21)。然后用肽3-7孵育这些细胞，并在不同时间点(0-10小时)监测释放的Amc的量。不可通透的半胱天冬酶底物(肽3)在10小时的时间段几乎不产生荧光增加(图21)。肽4产生最快的荧光增加，达到459个荧光单位(FU)，接着是肽7和6。对半胱天冬酶3无活性的肽5也以时间依赖性方式产生AMC，尽管速率慢得多(99FU)。这种缓慢的AMC释放速率可以归因于其他细胞内蛋白酶和肽酶的水解。与该解释一致，用胰蛋白酶抑制剂Z-VAD(OMe)-FMK(Slee,EA等.Biochem J.1996,315,21)预处理Jurkat细胞、然后用肽4孵育以类似于单独的肽5的速率的速率释放了AMC。上述观察结果的一个解释是肽4和5都可以有效地进入细胞内部，但是仅有肽4可以转化为细胞内的线性半胱天冬酶底物。
许多蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)由以其延伸构象(例如α-螺旋和β-链)结合短肽的蛋白质结构域介导(Pawson,T和Nash,P.Science2003,300,445)。例如，PDZ结构域是在细菌对人的信号传导蛋白中发现的80-90个氨基酸的共同结构结构域(Doyle,DA等.Cell1996,85,1067；Morais Cabral,JH等,Nature1996,382,649；Lee,HJ和Zheng,JJ.CellCommun.Signal.2010,8,8)。PDZ结构域识别其结合伴侣的C末端的特异性序列，并且结合的肽配体处于其延伸的β-链构象(Doyle,DA等.Cell 1996,85,1067；Songyang,Z等.Science1997,275,73)。最近报道，囊性纤维化膜电导调节剂(CFTR)—囊性纤维化(CF)患者中突变的氯离子通道蛋白—的活性通过其PDZ结构域(CAL-PDZ)经CFTR相关配体(CAL)负调节(Wolde,M等.J.Biol.Chem.2007,282,8099)。CFTR/CAL-PDZ相互作用的抑制显示通过降低其蛋白酶体介导的降解(Cushing,PR等.Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9907)改善ΔPhe508-CFTR的活性，所述ΔPhe508-CFTR是CFTR突变的最常见形式(Cheng,SH等.Cell1990,63,827；Kerem,BS等.Science 1989,245,1073)。以前的文库筛选和合理设计已经鉴定出几种中等效力的CAL-PDZ结构域的肽基抑制剂(KD值在高nM至低μM范围内)(Cushing,PR等.Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9907；Roberts,KE等.PLos Comput.Biol.2008,8,e1002477；Kundu,R等.Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,7217-7220)。然而，没有肽抑制剂是细胞可通透的，这限制了它们的治疗潜力。
从CAL-PDZ结构域的六肽配体WQVTRV(Roberts,KE等.PLos Comput.Biol.2008,8,e1002477)开始，通过将序列CRRRRF添加到其N末端并用半胱氨酸代替-3位的Val来设计二硫键介导的环肽(表10，肽8)。因此，在肽8中，在-5位置的色氨酸残基被设计为用于PDZ结合和膜易位的双重功能。为了促进亲和力测量及其细胞摄取的定量，将FITC基团添加到肽8的N-末端。FA分析显示在不存在还原剂的情况下，肽8没有显示出与CAL-PDZ结构域的可检测的结合(图22A)。在可以还原二硫键的2mM三(羧基乙基)膦的存在下，肽8以489nM的KD值结合到CAL-PDZ结构域。肽8容易通透细胞；用5μM肽8孵育HeLa细胞2小时导致在整个细胞中的强荧光和漫射荧光(图22B)。
如所预期的，肽8容易通透细胞(图25C)。在存在和不存在50μM未标记肽8的情况下，用10μM Corr-4a处理对于ΔF508-CFTR突变为纯合的支气管上皮CFBE细胞。预期肽8通过抑制CAL-PDZ结构域的功能增加转移到质膜的ΔF508-CFTR蛋白的量，而Corr-4a是帮助递送到质膜的ΔF508-CFTR蛋白的折叠的小分子。未处理的细胞的免疫染色(图25D，图I)显示大部分表达的ΔF508-CFTR在围绕细胞核的内质网中。相比之下，用Corr-4a和肽8处理细胞在细胞表面产生的蛋白质的量多得多(图25D，图II)。细胞群体的定量揭示小但显著百分比的细胞在细胞表面具有ΔF508-CFTR的野生型样分布(图25D)。最后，使用SPQ测定来对未经处理或用CTFR折叠校正物VX809和肽8处理的ΔF508-CFTR CFBE细胞的离子通道活性进行定量。同样，VX809和肽8协同作用以改善ΔF508-CFTR的通道活性的功能(图25E)。
实施例3
环肽具有作为治疗剂和研究工具的巨大潜力，但通常对细胞膜不可通透。环肽与环状细胞穿透肽的融合可以产生可以是细胞可通透的并且可以保留识别特异性细胞内靶标的能力的双环肽。这种策略应用于蛋白酪氨酸磷酸酶1B和肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1导致针对酶的有效、选择性、蛋白水解稳定和生物活性抑制剂。
环肽(和缩酚酸肽)表现出广泛范围的生物活性(Pomilio,AB等.Curr.Org.Chem.2006,10,2075-2121)。最近已经开发出几种创新型方法来合成环肽，单独地(Meutermans,WDF等.J.Am.Chem.Soc.1999,121,9790-9796；Schafmeister,CE等.J.Am.Chem.Soc.2000,122,5891-5892；Sun,Y等.Org.Lett.2001,3,1681-1684；Kohli,RM等.Nature 2002,418,658-661；Qin,C等.J.Comb.Chem.2004,6,398-406；Turner,RA等.Org.Lett.2007,9,5011-5014；Hili,R等.J.Am.Chem.Soc.2010,132,2889-2891；Lee,J等.J.Am.Chem.Soc.2009,131,2122-2124；Frost,JR等.ChemBioChem 2013,14,147-16)或组合地(Eichler,J等.Mol.Divers.1996,1,233-240；Giebel,LB等.Biochemistry 1995,34,15430-15435；Scott,CP等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,13638-13643；Millward,SW等.J.Am.Chem.Soc.2005,127,14142-14143；Sako,Y等.J.Am.Chem.Soc.2008,130,7232-7234.；Li,S等.Chem.Commun.2005,581-583.；Joo,SH等.J.Am.Chem.Soc.2006,128,13000-13009；Heinis,C等.Nat.Chem.Biol.2009,5,502-507；Tse,BN等.J.Am.Chem.Soc.2008,130,15611-15626)，并筛选它们的生物活性。环肽的特别令人兴奋的应用是抑制蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)(Leduc,AM等.Proc.Natl.Acad.Sic.USA 2003,100,11273-11278；Millward,SW等.ACS Chem Biol 2007,2,625-634；Tavassoli,A等.ACS Chem.Biol.2008,3,757-764.；Wu,X等.Med.Chem.Commun.2013,4,378-382；Birts,CN等.Chem.Sci.2013,4,3046-3057；Kawakami,T等.ACS Chem.Biol.2013,8,1205-1214；Lian,W等.J.Am.Chem.Soc.2013,135,11990-11995)，其仍然是常规小分子的挑战性目标。然而，环肽的主要限制是它们通常不能通透细胞膜，排除了针对细胞内靶标的任何应用，其包括大多数治疗相关的PPI。尽管分子内氢键(Rezai,T等.J.Am.Chem.Soc.2006,128,14073-14080)的形成或肽主链的Nα-甲基化(Chatterjee,J等.Acc.Chem.Res.2008,41,1331-1342；White,TR等.Nat.Chem.Biol.2011,7,810-817)可以改善某些环肽的膜通透性，但清楚地需要提高环肽的细胞通透性的替代策略。
蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是PTP超家族的原型成员，并且在真核细胞信号传导期间发挥许多作用。由于其在负调节胰岛素和瘦蛋白受体信号传导中的作用，PTP1B是治疗II型糖尿病和肥胖症的有效靶标(Elchelby,M等.Science 1999,283,1544–1548；Zabolotny,JM等.Dev.Cell 2002,2,489-495)。已经报道了大量的PTP1B抑制剂(He,R等.New Therapeutic Strategies for Type 2 Diabetes:Small MoleculeApproaches.R.M.Jones编辑,RSC Publishing 2012,第142页)，然而它们都没有在临床上取得成功。设计PTP抑制剂是具有挑战性的，因为大多数磷酸酪氨酸(pY)等排体例如二氟膦酰基甲基苯丙氨酸(F2Pmp)(Burke Jr.,TR等.Biochem.Biophys.Res.Commun.1994,204,129-134)不能通透细胞膜。另外，因为所有PTP共享相似的活性位点，所以实现对单个PTP的选择性是困难的。在本文中，报道了设计针对细胞内蛋白质(例如PTP1B)的细胞可通透的环状肽基抑制剂的潜在一般方法。
材料。Fmoc保护的氨基酸购自Advanced ChemTech(Louisville，KY)、PeptidesInternational(Louisville，KY)或Aapptec(Louisville，KY)。Fmoc-F2Pmp-OH购自EMDMillipore(Darmstadt，Germany)。氨基甲基-ChemMatrix树脂(0.66mmol/g)来自SJPC(Quebec，Canada)。Rink树脂LS(100-200目，0.2mmol/g)和N-(9-芴基甲氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)购自Advanced ChemTech。O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂-1H-苯丙三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)购自Aapptec。1-mL密封的安瓿中的异硫氰酸苯酯、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明B标记的葡聚糖(葡聚糖Rho)购自Sigma-Aldrich。细胞培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素、0.25％胰蛋白酶-EDTA、杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(2.67mM氯化钾、1.47mM磷酸二氢钾、137mM氯化钠、8.06mM磷酸氢二钠)和抗磷酸-IR/IGF1R抗体购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。核染色染料DRAQ5TM和抗β-肌动蛋白抗体购自ThermoScientific(Rockford，IL)。抗体4G10购自Millipore(Temecula，CA)。所有溶剂及其他化学试剂均获自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，并且除非另有说明，否则无需进一步纯化而使用。
细胞培养。将A549、HEK293和HepG2细胞在37℃、5％CO2的加湿孵育箱中维持在补充有10％FBS的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)中。
蛋白质表达、纯化和标记。使用PTP1B cDNA作为模板并使用寡核苷酸5'-ggaattccatatggagatggaaaaggagttcgagcag-3'和5'-gggatccgtcgacattgtgtggctccaggattcgtttgg-3'作为引物通过聚合酶链反应扩增编码PTP1B催化结构域(氨基酸1-321)的基因。将所得DNA片段用核酸内切酶Nde I和Sal I消化，并插入原核载体pET-22b(+)-ybbR中(Yin,J等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,15815-15820)。该克隆程序导致向PTP1B的N末端添加ybbR标签(VLDSLEF IASKL)。如前所述进行ybbR标记的PTP1B的表达和纯化(Ren,L等.Biochemistry 2011,50,2339-2356)。通过在室温下在具有Sfp磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(1μM)和德克萨斯红-CoA(100μM)的50mMHEPES，pH 7.4,10mM MgCl2中处理ybbR标记的PTP1B蛋白(80μM)30分钟来进行PTP1B的德克萨斯红标记(Yin,J等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,15815-15820)。使反应混合物通过在30mM HEPES，pH 7.4,150mM NaCl中平衡的G-25快速脱盐柱，以除去任何游离染料分子。如前所述(Liu,T等.J.Med.Chem.2010,53,2494-2501)，从大肠杆菌中表达并纯化全长人S16A/Y23A突变体Pin1。
文库合成。在1.35g氨基甲基-ChemMatrix树脂(0.57mmol/g)上合成环肽文库。除非另有说明，否则文库合成在室温下进行。使用标准Fmoc化学合成接头序列(BBM)。典型的偶联反应含有5当量的Fmoc-氨基酸、5当量的HBTU和10当量的二异丙基乙胺(DIPEA)，并使其继续混合2小时。通过用DMF中的20％(v/v)哌啶处理两次(5+15分钟)来除去Fmoc基团，并用DMF(6×)彻底洗涤珠粒。为了将珠粒在空间上分离成外层和内层，将树脂(在除去N-末端Fmoc基团之后)用DMF和水洗涤，并在水中浸泡过夜。将树脂迅速排干并悬浮于Fmoc-Glu(δ-NHS)-OAl1(0.10当量)、Boc-Met-OSu(0.4当量)和N-甲基吗啉(2当量)在20mL 1:1(v/v)DCM/二乙醚中的溶液中(Joo,SH等.J.Am.Chem.Soc.2006,128,13000-13009)。将混合物在旋转式摇床上孵育30分钟。用1:1DCM/二乙醚(3×)和DMF(8×)洗涤珠粒。接下来，通过哌啶处理除去Fmoc基团。然后，通过标准Fmoc化学将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(4×)、Fmoc-Nal-OH和Fmoc-Phe-OH顺序偶联至树脂的一半。另一半与相同的氨基酸以相反序列偶联。合并树脂，并通过使用5当量Fmoc-氨基酸、5当量HATU和10当量DIPEA作为偶联剂的分裂-和-合并法合成随机序列。重复偶联反应一次以确保在每个步骤完全偶联。对于随机位置，基于它们的结构多样性、代谢稳定性和商业可用性选择24-氨基酸组，包括10种蛋白原性α-L-氨基酸(Ala、Asp、Gln、Gly、His、Ile、Ser、Trp、Pro和Tyr)、5种非蛋白原性α-L-氨基酸(L-4-氟苯丙氨酸(Fpa)、L-高脯氨酸(Pip)、L-正亮氨酸(Nle)、L-苯基甘氨酸(Phg)和L-4-(膦酰二氟苯基氨基)苯丙氨酸(F2Pmp))和9种α-D-氨基酸(D-2-萘基丙氨酸(D-Nal)、D-Ala、D-Asn、D-Glu、D-Leu、D-Phe、D-Pro、D-Thr和D-Val)。为了在PED-MS分析期间区分同量异位氨基酸，将4％(mol/mol)的CD3CO2D加入到D-Ala、D-Leu和D-Pro的偶联反应中，同时将4％CD3CD2CO2D加入Nle反应。使用HATU/DIPEA将Fmoc-F2Pmp-OH(0.06当量)和Fmoc-Tyr-OH(0.54当量)置于随机位置的中间。在合成整个序列后，通过用含有四(三苯基膦)钯[Pd(PPh3)4，0.25当量]和苯基硅烷(5当量)的DCM溶液处理15分钟，除去C-末端Glu残基上的烯丙基基团(3×)。依次用DMF中的0.5％(v/v)DIPEA、DMF中的0.5％(w/v)二甲基二硫代氨基甲酸钠水合物、DMF(3×)、DCM(3×)和DMF(3×)洗涤珠粒。如上所述，用哌啶除去N-末端无规残基上的Fmoc基团。用DMF(6×)、DCM(3×)和于DMF(3×)中的1M HOBt洗涤珠粒。对于肽环化，将PyBOP/HOBt/DIPEA(分别为5、5、10当量)在DMF中的溶液与树脂混合，并在旋转式摇床上孵育混合物3小时。用DMF(3×)和DCM(3×)洗涤树脂并在真空下干燥>1小时。用改性试剂K78.5:7.5:5:5:2.5:1:1(v/v)TFA/苯酚/水/硫代苯甲醚/乙二硫醇/苯甲醚/三异丙基硅烷)进行侧链脱保护3小时。用TFA和DCM洗涤树脂，并在真空干燥，然后储存在-20℃。
文库筛选和肽测序。将文库树脂(100mg，约300,000个珠粒)在DCM中溶胀，用DMF、双蒸水H2O充分洗涤，并在4℃下，在1mL含20nM德克萨斯红标记的PTP1B的封闭缓冲液(PBS，pH 7.4,150mM NaCl，0.05％Tween 20和0.1％明胶)中孵育3小时。在配备有荧光照明器(Olympus America，Center Valley，PA)的OlympusSZX12显微镜下检查珠粒，并手动收集最强荧光珠粒作为阳性命中物。含有编码线性肽的珠粒通过部分Edman降解-质谱法(PED-MS)单独测序(Liu,T等.J.Med.Chem.2010,53,2494-2501)。
单个肽合成和标记。使用标准Fmoc化学在Rink Resin LS(0.2mmol/g)上合成单环肽和双环肽。对于单环肽，在偶联最后(N-末端)残基之后，通过用无水DCM中的Pd(PPh3)4和苯基硅烷(分别为0.1和10当量)处理除去C-末端Glu残基上的烯丙基基团(3×15分钟)。通过用DMF中的20％(v/v)哌啶处理除去N-末端Fmoc基团，并通过用DMF中的PyBOP/HOBt/DIPEA(5、5和10当量)处理3小时使肽环化。对于双环肽，用哌啶除去N末端Fmoc基团，并且使用HBTU作为偶联剂将苯均三酸偶联在N-末端胺上。通过用无水DCM中的Pd(PPh3)4和苯基硅烷(分别为0.1和10当量)处理2小时除去两个Dap残基的侧链上的烯丙氧基羰基基团。如上所述用PyBOP使所得肽环化。通过用82.5:5:5:5:2.5(v/v)TFA/茴香硫醚/水/苯酚/乙二硫醇处理2小时使肽脱保护并从树脂中释放。将肽与冷乙醚一起研磨(3×)，并在C18柱上通过反相HPLC纯化。通过MALDI-TOF质谱法确认每种肽的真实性。通过将纯化的肽(约1mg)溶解在300μL的1:1:1(体积/体积)DMSO/DMF/150mM碳酸氢钠(pH8.5)中并与DMSO(100mg/mL)中10μL的FITC混合进行用FITC标记肽。在室温下20分钟后，在C18柱上对反应混合物进行反相HPLC以分离FITC标记的肽。
PTP抑制测定。在石英微量小池(microcuvette)(总体积150μL)中进行PTP测定。反应混合物含有100mM Tris-HCl，pH7.4、50mM NaCl、2mM EDTA、1mM TCEP、0-1μM PTP抑制剂和500μM磷酸对硝基苯酯(pNPP)。通过加入PTP(终浓度15-75nM)开始酶促反应并在UV-VIS分光光度计上于405nm下连续监测。从反应进程曲线(通常<60秒)计算初始速率。半数最大抑制常数(IC50)被定义为将酶活性降低至50％的抑制剂的浓度，并且通过将速率(V)对抑制剂浓度[I]作图并将数据按如下方程式拟合获得：
其中V0是不存在抑制剂时的酶反应速率。通过测量固定酶浓度(15nM)但不同浓度的pNPP(0-24mM)和抑制剂(0-112nM)下的初始速率来测定抑制常数(Ki)。将反应速率(V)对pNPP浓度([S])作图，并按如下方程拟合：
以获得米氏常数(Michaelis constant)K。通过将K值对抑制剂浓度[I]作图并拟合到如下方程式获得Ki值：
其中K0是在不存在抑制剂([I]＝0)时的米氏常数。
共聚焦显微术.将约5×104个A549细胞接种在含有1mL培养基的35-mm玻璃底微孔皿(MatTek)中并培养1天。用DPBS轻轻洗涤A549细胞一次，并在5％CO2存在下用FITC标记的PTP1B抑制剂(5μM)、葡聚糖Rho(1mg mL-1)在生长培养基中于37℃处理2小时。除去含肽的培养基，并用DPBS洗涤细胞三次，并在1mL含有5μM DRAQ5的DPBS中孵育10分钟。再次用DPBS洗涤细胞两次。然后在5％CO2存在下于37℃使细胞在Visitech Infinity 3 Hawk2D-阵列活细胞成像共聚焦显微镜(具有60×油浸透镜)上成像。类似地进行用FITC标记的Pin1抑制剂处理后的HEK293细胞的活细胞共聚焦显微镜成像。
免疫印迹。在完全生长培养基中培养A549细胞以达到80％汇合。将细胞在无血清培养基中饥饿3小时，并用不同浓度的PTP1B抑制剂处理2小时，随后在补充有1mM过钒酸钠的培养基中孵育30分钟。除去溶液，并用冷DPBS洗涤细胞两次。使细胞脱落，并在50mMTris-HCl、pH 7.4、150mM NaCl、1％NP-40、10mM焦磷酸钠、5mM碘乙酸、10mM NaF、1mM EDTA、2 mM过钒酸钠、0.1mg/mL苯基甲磺酰氟、1mM苄脒和0.1mg/mL胰蛋白酶抑制剂中裂解。在冰上孵育30分钟后，将细胞裂解物在微量离心机中以15,000rpm离心25分钟。通过SDS-PAGE分离总细胞蛋白，并电泳转移至PVDF膜，使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10进行免疫印迹。在单独的SDS-PAGE凝胶上分析相同的样品并通过考马斯亮蓝染色以确定在所有泳道中相等的样品加载。
为了测试抑制剂对胰岛素信号途径的影响，培养HepG2细胞以达到80％汇合。将细胞在无血清DMEM培养基中饥饿4小时，之后用PTP1B抑制剂处理(2小时)，然后用100nM胰岛素刺激5分钟。如上所述通过SDS-PAGE分析样品，并使用抗磷酸-IR/IGF1R抗体进行免疫印迹。还通过作为加样对照的抗β-肌动蛋白抗体探测PVDF膜。
血清稳定性试验。通过修改先前报道的程序(Nguyen,LT等.PLoSOne,2010,5,e12684)进行稳定性测试。将稀释的人血清(25％)以15,000rpm离心10分钟，并收集上清液。将肽储液稀释到上清液中至终浓度为5μM，并在37℃下孵育。在各个时间点(0-24小时)，取出200-μL等分试样并与50μL的15％三氯乙酸混合，并在4℃下孵育过夜。将最终混合物在微量离心机中以15,000rpm离心10分钟，并通过装备有C18柱的反相HPLC分析上清液。通过对肽峰下方的面积(在214nm监测)积分来确定剩余肽的量(％)并与对照反应(无血清)的相比较。
荧光各向异性。通过在室温下用于20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、2mM醋酸镁和0.1％牛血清白蛋白(BSA)中的不同浓度的蛋白质孵育100nM FITC标记的肽2小时进行FA实验。在Molecular Devices Spectramax M5读板仪上测量FA值，激发波长和发射波长分别为485nm和525nm。通过对作为蛋白质浓度的函数的FA值作图并拟合曲线至如下方程来测定平衡解离常数(KD)：
其中Y是在给定的蛋白质浓度x下的FA值；L是肽浓度；Qb/Qf是荧光团-蛋白质相互作用的校正因子；A最大值是当所有肽都结合到蛋白质时的最大FA，而A最小值是当所有肽都游离时的最小FA值。通过将100nM FITC标记的Pin1抑制剂5用1μM Pin1孵育然后加入0-5μM未标记的抑制剂进行FA竞争测定。在读板仪上类似地测量FA值。通过对FA值针对竞争剂浓度作图和使用四参数剂量-响应抑制方程进行曲线拟合来获得IC50值(Prism 6，GraphPad)。
最近发现了一类细胞穿透肽(CPP)、环(Phe-Nal-Arg-Arg-Arg-Arg-Gln)(cFΦR4，其中Φ或Nal是L-萘基丙氨酸)(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423-431)。不同于以前通常是线性肽并且主要截留在内体中的CPP，cFΦR4可以有效地从内体逃逸到细胞质中。短肽货物(1-7aa)可以通过直接掺入到cFΦR4环中而被递送到哺乳动物细胞中。对开发含细胞穿透性和靶结合序列二者作为针对细胞内蛋白质的细胞通透性抑制剂的双功能环肽的可能性进行了研究。为了产生针对PTP1B的特异性抑制剂，在空间分离的ChemMatrix树脂上合成单珠粒二化合物文库(Liu,R等.J.Am.Chem.Soc.2002,124,7678-7680)，其中每个珠粒在其表面上显示双功能环肽，并且在其内部包含相应的线性肽作为编码标签(图23和图24)。双功能环肽的特征都是在一侧具有两亲性CPP基序FΦR4(或其反向序列RRRRΦF)，而在另一侧具有随机五肽序列(X1X2X3X4X5)，其中X2表示Tyr和F2Pmp的9:1(mol/mol)混合物，而X1和X3-X5是包括如下的24种氨基酸中任意一种：10种蛋白原性L-氨基酸(Ala、Asp、Gln、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Tyr、Trp)、5种非天然α-L-氨基酸(F2Pmp，L-4-氟苯丙氨酸(Fpa)、L-正亮氨酸(Nle)、L-苯基甘氨酸(Phg)、L-哌啶酸(Pip))和9α-D-氨基酸(D-Ala、D-Asn、D-Glu、D-Leu、L-β-萘基丙氨酸(D-Nal)、D-Phe、D-Pro、D-Thr和D-Val)。在X2位置使用9：1Tyr/F2Pmp比连同表面肽负载的5倍减少将珠粒表面处含有F2Pmp的肽的量减少50倍，从而增加了严格性并使在文库筛选期间的非特异性结合最小化(Chen,X等.J.Comb.Chem.2009,11,604-611)。针对德克萨斯红标记的PTP1B的文库(理论多样性6.6×105)的筛选产生65个阳性珠粒，其通过部分Edman降解-质谱法(PED-MS)单独测序(Thakkar,A等.Anal.Chem.2006,78,5935-5939)，得到42个完整序列(表12)。有趣的是，大多数选择的PTP1B抑制剂含有反向CPP基序(RRRRΦF)。
表12.选自针对PTP1B的环肽文库的肽序列a
aFpa，L-4-氟苯基丙氨酸；Pip，L-高脯氨酸；Nle，L-正亮氨酸；Phg，L-苯基甘氨酸；F2Pmp，L-4-(膦酰二氟甲基)苯丙氨酸。
*进行进一步分析的序列。
将三个命中序列(D-Thr-D-Asn-D-Val-F2Pmp-D-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg-Nal-Phe-Gln(抑制剂1)、Ser-D-Val-Pro-F2Pmp-His-Arg-Arg-Arg-Arg-Nal-Phe-Gln(抑制剂2)和Ile-Pro-Phg-F2Pmp-Nle-Arg-Arg-Arg-Arg-Nal-Phe-Gln(抑制剂3))再合成并通过HPLC纯化。所有三种肽是竞争性PTP1B抑制剂(表13)，其中肽2是最有效的(KI＝54nM)(图25)。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抑制剂2处理的人细胞的共聚焦显微镜分析表明细胞摄取肽较差(图26a)。先前已经显示，随着插入到cFΦR4环中的货物的大小增加，环肽的细胞摄取效率降低(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423-431)。较大的环可以是更构象上柔性的，并且在内吞作用期间可以较不紧密地结合至细胞表面受体(例如，膜磷脂)。带负电荷的F2Pmp也可以与FΦR4基序在分子内相互作用并干扰其CPP功能。
表13.所选单环肽抑制剂针对PTP1B的效力
为了提高抑制剂2的细胞通透性，探讨了其中CPP基序位于一个环而靶结合序列构成另一个环的双环体系(图23)。双环体系将CPP环保持为最小尺寸，根据先前观察到的趋势(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423-431)这可以导致更有效的细胞摄取。双环体系应该能够适应任何大小的货物，因为后者的掺入不改变CPP环的大小，因此不应该影响环状CPP的递送效率。刚性支架(例如，苯均三酸)的使用还可以帮助保持CPP和货物基序彼此远离并且最小化任何相互干扰。与其单环对应物相比，双环肽的更小的环可以导致更大的结构刚性并改善代谢稳定性。
为了将单环PTP1B抑制剂2转化为双环肽，用(S)-2,3-二氨基丙酸(Dap)替换Gln残基(用于附着于固体支持物和肽环化)，并在CPP和PTP1B结合序列(C末端至His)的接合处插入第二Dap残基(图23)。通过在苯均三酸与N-末端胺和两个Dap残基的侧链之间形成三个酰胺键来完成双环的合成(图27)(Lian,W等.J.Am.Chem.Soc.2013,135,11990-11995)。简言之，使用标准Fmoc化学和Nβ-烯丙氧基羰基(Alloc)保护的Dap在Rink酰胺树脂上合成线性肽。除去N-末端Fmoc基团后，用苯均三酸酰化暴露的胺。用Pd(PPh3)4除去Alloc基团，然后用PyBOP处理，得到所需的双环结构。为了便于用荧光探针标记，将赖氨酸加到C-末端。用TFA对双环肽(肽4)脱保护，并通过HPLC纯化至均一。
双环肽4可用作PTP1B的竞争性抑制剂，其KI值为37nM(图26b)。它可以对PTP1B具有高度选择性。当针对磷酸对硝基苯酯作为底物(500μM)进行测定时，抑制剂4对于PTP1B和TCPTP分别具有30和500nM的IC50值(图26c和表14)。它表现出对任何其他测试的PTP的最小抑制(在1μM抑制剂浓度下对HePTP、SHP-1、PTPRC、PTPH1或PTPRO的≤10％抑制)。如通过用FITC标记的抑制剂4处理的A549细胞的活细胞共聚焦显微术检测到的，抑制剂4具有超过肽2的改善的细胞通透性(图26a)。处理的细胞显示遍及细胞质和细胞核的漫射荧光以及荧光斑点，表明一部分抑制剂到达细胞质和细胞核，而其余的可能被截留在内体中。抑制剂4在人血清中于37℃下孵育24小时导致约10％的降解，而91％的抑制剂2在相同条件下降解(图28)。总之，抑制剂4在效力、对高度相似的TCPTP的选择性(17倍)、细胞通透性和稳定性方面与迄今报道的小分子PTP1B抑制剂相媲美(Qian,Z等.ACS Chem.Biol.2013,8,423-431)。
表14.双环抑制剂4针对多种PTP的选择性a
aNA，在1μM抑制剂下无显著抑制。
接下来测试抑制剂4在细胞信号传导期间干扰PTP1B功能的能力。用抑制剂4(0-5μM)处理A549细胞导致大量蛋白质的磷酸酪氨酸(pY)水平的剂量依赖性增加，这与PTP1B的广泛底物特异性一致(Ren，L等.Biochemistry 2011，50，2339)(图29a)。通过考马斯蓝染色对相同样品的分析在所有样品中显示相似量的蛋白质(图29b)，表明增加的pY水平反映了增加的磷酸化(或降低的PTP反应)，而不是总蛋白水平的变化。引人注目的是，酪氨酸磷酸化的增加在8nM抑制剂4下已经是明显的。有趣的是，抑制剂浓度进一步增加超过1μM逆转了对酪氨酸磷酸化的作用，这是先前由Zhang和同事用不同的PTP1B抑制剂观察到的(Xie,L等.Biochemistry 2003,42,12792-12804)。为了获得细胞内PTP1B被肽4抑制的进一步证据，通过用针对pY1162pY1163位点的特异性抗体的免疫印迹来监测胰岛素受体(IR)(即体内明确的PTP1B底物)的pY水平(Elchelby,M等.Science 1999,283,1544–1548；Zabolotny,JM等.Dev.Cell 2002,2,489-495)。再次，用抑制剂4处理引起高达1μM抑制剂的胰岛素受体磷酸化的剂量依赖性增加，并且在较高浓度下效应趋于平稳(图29c，d)。总之，这些数据表明双环抑制剂4可以有效地进入哺乳动物细胞并且可以在体内抑制PTP1B。更高抑制剂浓度的减少的磷酸化可以由其他PTP的非特异性抑制(其可以继而下调蛋白酪氨酸激酶)引起。它还可以反映由PTP1B发挥的多效性作用，其可以负面和正面调节不同蛋白激酶的活性(Lessard,L等.Biochim.Biophys.Acta2010,1804,613)。
为了测试双环方法的一般性，将其适用于设计针对肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的细胞通透性抑制剂，所述肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1是治疗包括癌症在内的多种人类疾病的潜在靶标(Lu,KP和Zhou,XZ.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2007,8,904-916)，对于其仍然缺乏有效的、选择性的和生物活性的抑制剂(More,JD和Potter,A.Bioorg.Med.Chem.Lett.2013,23,4283-91)。因此，先前报道的单环肽(5)是针对Pin1的体外有效抑制剂(KD 258nM)，但是膜不可通透的(Liu,T等l.J.Med.Chem.2010,53,2494-2501)，与cFΦR4融合(图30)。此外，pThr+3位的L-Tyr被Arg取代以提高水溶性。所得双环肽6结合Pin1，其KD值为131nM(表15和图31)。在pThr+5位置处插入D-Ala以增加Pin1结合和细胞穿透基序之间的分离将抑制剂效力提高约2倍(抑制剂7的KD＝72nM)。抑制剂7与FITC标记的抑制剂5竞争结合至Pin1(图32)，表明这两者都可以结合到Pin1活性位点。用抑制剂7的D-pThr取代D-pThr使其效力降低约10倍(对于抑制剂8，KD＝620nM，表16)，而用D-Ala进一步替换哌可基残基消除了Pin1抑制活性(肽9)。双环抑制剂7-9是细胞可通透的(图33)。用抑制剂7处理HeLa细胞导致细胞生长的时间和剂量依赖性抑制(在20μM抑制剂7处理3天后抑制45％)，而单环抑制剂5和无活性肽9没有效果(图34)。肽8也抑制细胞生长，但抑制程度比抑制剂7低。
表15.如通过FA分析测定的单环肽和双环肽针对Pin1的解离常数
aDap，L-2,3-二氨基丙酸；Nal，L-β-奈基丙氨酸；Pip，L-2-哌啶酸；Sar，肌氨酸；Tm，苯均三酸。对于FA分析，所有肽均在C-末端赖氨酸侧链处用FITC标记。
总之，开发了设计针对细胞内靶标的细胞可通透的双环肽的潜在一般方法。这些初步研究显示，用不同物理化学性质的其他肽序列替换PTP1B结合基序也导致它们有效递送到培养的哺乳动物细胞中。一般的细胞内递送方法的可用性应当极大地扩展环肽在药物开发和生物医学研究中的效用。
实施例4
本文还讨论了表16中的CPP序列。所有摄取/递送效率在表17中并且均相对于cFΦR4的摄取/递送效率(290-1F，100％)。SUV1是模拟哺乳动物细胞的中性外膜的小单层囊泡[45％磷脂酰胆碱(PC)、20％磷脂酰乙醇胺(PE)、2％鞘磷脂(SM)和15％胆固醇(CHO)]。SUV2是模拟哺乳动物细胞的负电荷内体膜的小单层囊泡[50％PC、20％PE、10％磷脂酰肌醇(PI)和20％双(单酰基甘油)磷酸盐]。
使用FITC标记的环肽针对增加浓度的囊泡进行荧光偏振的测量。以pH 7.4和5.5(pH在晚期内体内)进行实验。
总递送效率似乎与CPP在pH 7.4下对内体膜的结合亲和力相关，即更紧密的结合导致更高的递送效率。
表16.环状CPP及其细胞摄取和膜结合特性。
Φ＝L-奈基丙氨酸；φ＝D-奈基丙氨酸；f＝D-苯基丙氨酸；r＝D-精氨酸；q＝D-谷氨酰胺
实施例5
心肌细胞通常难以用DNA转染并且通过使用先前的CPP将蛋白质递送到其中是不成功的。因此，存在将治疗性蛋白质递送到心脏组织中的未满足的需要。
所公开的环状CPP在将蛋白质递送到心肌细胞中是非常有效的。合成异硫氰酸荧光素(FITC)标记的环状CPP[c(FΦRRRRQ)-K(FITC)-NH2和c(fΦRrRrQ)-K(FITC)-NH2]，并通过用5μM FITC标记的肽处理细胞3小时测试其内化至小鼠心室心肌细胞中。洗去细胞外肽后，通过荧光活细胞共聚焦显微术检查CPP的内化。两种肽在整个细胞中表现出显著的和主要漫射的荧光，表明CPP有效内化到心肌细胞中(图35a和35b)。测试环状CPP是否能够将全长蛋白质转运到心肌细胞中。通过二硫键将钙调蛋白(具有工程改造的Thr5Cys)(一种多功能钙结合信使蛋白)缀合至N末端附近的Cys残基处的c(FΦRRRRQ)-C-NH2缀合。二硫化物交换反应是高度特异性的、有效的和可逆的。此外，在进入细胞的胞质溶胶时，预期二硫键连减少以释放天然蛋白质(图35c)。CPP-蛋白缀合物在氨基基团上用青色素3化学标记，这使其内化钙调素的可视化。用6μM的CPP-钙调蛋白缀合物孵育小鼠心室心肌细胞3小时，并通过活细胞共聚焦显微术检查。细胞内荧光信号存在于整个细胞体积中并显示出肌节模式(图35d)，表明内化的钙调蛋白被适当地整合到细胞机制中。这些数据表明所公开的环状CPP例如c(FΦRRRRQ)独特地能够以高效率将小分子以及蛋白质(可能以其天然形式)递送到心肌细胞中，从而为未来的治疗应用打开了大门。
实施例6
Pin1是磷酸化依赖性肽基脯氨酰顺/反异构酶(PPIase)。它含有N末端WW结构域和C末端催化结构域，两者都识别其蛋白质底物中的特定磷酸丝氨酸(pSer)/磷酸-苏氨酸(pThr)-Pro基序。通过特定pSer/pThr-Pro键的顺反异构化，Pin1调节各种磷酸蛋白的水平、活性以及细胞内定位。例如，Pin1控制细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的体内稳定性，并在其不活泼不稳定形式和活性稳定形式之间切换c-Jun、c-Fos和NF-κB。Pin1的异构化也调节许多细胞周期信号蛋白例如磷酸酶CDC25C和激酶Wee1的催化活性。最后，Pin1催化的β-连环蛋白和NF-κB的构象变化导致亚细胞易位。
鉴于其在细胞周期调节中的关键作用和在人类癌症中增加的表达水平和活性，已经提出Pin1作为抗癌药物的开发的潜在靶标。Pin1还涉及神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)。因此，对开发针对Pin1的特异性抑制剂有显著的兴趣。小分子抑制剂例如Juglone、PiB、硫化双亚戊基秋兰姆和卤化苯基异噻唑酮(TME-001)通常缺乏足够的效力和/或特异性。已经报道了许多有效的肽基Pin1抑制剂，并且其比小分子抑制剂更具选择性。然而，肽基抑制剂通常不能通透细胞膜，因此其作为治疗剂或体内探针的作用有限。一种针对Pin1的可通透细胞的双环肽基抑制剂，其中一个环(A环)的特征是Pin1结合磷酸肽基序[D-pThr-Pip-Nal，其中Pip和Nal分别是(R)-哌啶-2-羧酸和L-奈基丙氨酸]，而含有细胞穿透肽Phe-Nal-Arg-Arg-Arg-Arg的第二个环(B环)显示于图36，肽1。尽管双环肽基抑制剂在细胞测定中是有效的(KD＝72nM)并且具有活性，其D-pThr部分可能由于非特异性磷酸酶的水解而代谢不稳定。磷酸根基团的负电荷也可能阻碍抑制剂的细胞进入。这里，通过筛选肽文库和命中优化来制备针对Pin1的非磷酸化双环肽基抑制剂。所得到的双环肽基抑制剂在体外针对Pin1是有效的且有选择性、可通透细胞并且在生物测定中代谢稳定。
尽管除去肽1的磷酰基基团显著降低了其针对Pin1的效力，但非磷酸化肽(图36，肽2)仍然是相对有效的Pin1抑制剂(KD＝0.62μM)。可以通过优化侧接于D-Thr-Pip-Nal基序的序列来进一步改善肽2的效力。因此，第二代双环肽文库双环[Tm-(X1X2X3-Pip-Nal-Arg-Ala-D-Ala)-Dap-(Phe-Nal-Arg-Arg-Arg-Arg-Dap)]-β-Ala-β-Ala-Pra-β-Ala-Hmb-β-Ala-β-Ala-Met-树脂(图35，其中Tm是苯均三酸，Dap是2,3-二氨基丙酸，β-Ala是β-丙氨酸，Pra是L-炔丙基甘氨酸，且Hmb是4-羟甲基苯甲酸)通过随机化肽2的三个N-末端残基。X1和X2代表包括以下的27个氨基酸结构单元中的任意一个：12个蛋白原性L-氨基酸[Arg、Asp、Gln、Gly、His、Ile、Lys、Pro、Ser、Thr、Trp和Tyr]、5个非蛋白原性α-L-氨基酸[L-4-氟苯丙氨酸(Fpa)、L-正亮氨酸(NIe)、L-鸟氨酸(Orn)、L-苯基甘氨酸(Phg)和L-Nal]、6个α-D-氨基酸[D-Ala、D-Asn、D-Glu、D-Leu、D-Phe和D-Val]和4个Nα-甲基化L-氨基酸[L-Nα-甲基丙氨酸(Mal)，L-Nα-甲基亮氨酸(Mle)、L-Nα-甲基苯基丙氨酸(Mpa)和肌氨酸(Sar)]，而X3是Asp、Glu、D-Asp、D-Glu或D-Thr。预期这些非蛋白原性氨基酸的掺入增加文库肽的结构多样性和蛋白水解稳定性。该文库具有5×27×27或3645种不同双环肽的理论多样性，预期其中大多数(如果不是全部)是可细胞通透的。在500mg TentaGel微珠(130μm，约7.8×105个珠粒/g，约350pmol肽/珠粒)上合成文库。通过在Tm与两个Dap残基的N-末端胺和侧链胺之间形成三个酰胺键来实现肽环化。
表17.来自肽文库筛选的命中序列a
a命中物1-3选自第一轮筛选，而命中物4-7在第二轮筛选后选择。
β-Ala提供柔性接头，而Pra用作通过点击化学用荧光探针对双环肽珠粒上标记的柄。Hmb的酯键连使得能够从树脂中选择性释放双环肽用于溶液相结合分析。最后，C末端Met使其在MS分析前通过CNBr裂解从树脂中释放肽。
针对具有缺陷WW结构域的S16A/Y23A突变体Pin1筛选文库(100mg树脂)。在N-末端产生突变体Pin1作为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合体。在第一轮筛选期间，用肽文库孵育德克萨斯红标记的MBP-Pin1，并在显微镜下从文库中除去荧光珠粒。三个阳性珠粒具有比其余命中物显著更高的荧光强度，并且通过部分Edman降解质谱法(PED-MS)直接进行肽测序(表17)。将其他13个荧光珠粒进行第二轮筛选，期间每个珠粒上的双环肽用在Pra残基处的四甲基罗丹明(TMR)叠氮化物标记，并通过用NaOH溶液处理从珠粒中释放。
表18.所用肽的序列和Pin1结合亲和力
用5μM MBP-Pin1孵育释放的肽，并测量荧光各向异性(FA)的增加。对于显示≥50％FA增加(相对于无蛋白质对照)的双环肽，通过PED-MS对相应的珠粒(5个珠粒，其仍含有线性编码肽)进行测序，得到4个另外的完整序列(表1)。所有7个命中序列在X3位置处含有D-氨基酸，这与先前观察到的Pin1在该位置相对于pThr偏好D-pThr相一致。在X1位置存在对疏水特别是芳族疏水残基的强烈偏好，但在X2位置处没有明显的选择性。
命中物优化。将6条命中序列(命中物1和2具有相同的序列)用添加到其C端的Lys再合成，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记，并通过FA测试与Pin1的结合(表18，肽3-8)。所有六种肽以适度亲和力(KD～1μM)结合至Pin1，但对肽2(KD＝0.62μM)没有改善。肽3和4用于结构-活性关系分析和优化。扩展或收缩Pin1结合环(A环)的大小降低了结合亲和力(表18，肽9-16)。用包括Arg、Asp、Ser、Tyr和Val的含有不同物理化学性质的侧链的氨基酸替换肽3的Ala残基也不能显著改善结合亲和力(表18，肽17-21)。另一方面，D-Ala残基的修饰披露在该位置的D-Phe的取代使Pin1抑制活性增加约2倍(肽22的KD＝0.48μM)。
对肽4进行类似的SAR研究。如针对肽3所观察到的，肽4的Ala残基修饰(为Gly)几乎没有影响(肽26)，但是用D-Phe替换D-Ala残基将针对Pin1的结合亲和力提高约2倍(表18，肽27的KD＝0.27μM)。在X2位置处的Fpa残基的修饰(例如，用其他卤化苯丙氨酸类似物替换)都降低了抑制剂效力(肽28-32)。同样，在X1位置处除去芳族侧链对Pin1结合是有害的(肽33和34)。然而，卤化D-Phe类似物的取代改善了Pin1结合活性(肽35-38)。特别地，用D-4-氟苯丙氨酸(D-Fpa)替换D-Phe产生该系列的最有效的Pin1抑制剂(肽37的KD＝0.12μM)(图36和37a)。进一步尝试修饰D-Thr残基或CPP基序未能改善Pin1活性(表18，肽39-45)。
生物评价。为了确定肽37是否结合至Pin1的催化位点，通过FA分析对其与肽1竞争结合Pin1的能力进行检查。先前已经显示肽1结合到Pin1活性位点。如所预期的，肽37抑制肽1与Pin1的结合，其IC50值为190nM(图37b)。接下来，监测在增加浓度的肽37存在下Pin1对肽底物Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-pNA的催化活性。肽37以浓度依赖性方式抑制Pin1活性，其IC50值为170nM(图37c)。这些结果表明肽37在Pin1的活性位点处(或附近)结合。
通过两个不同的试验评估肽37的选择性。首先，测试肽37与任意选择的蛋白质组(包括牛血清白蛋白(BSA)、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B、SHP1和SHP2、Grb2SH2结构域、Ras和肿瘤坏死因子-α)的结合。肽37弱结合至BSA(KD为约20μM)，但不结合任何其他六种蛋白质。接下来测试肽37对Pin4、FKBP12和亲环蛋白A(三种其它常见的人肽基-脯氨酰顺反异构酶)的潜在抑制。尽管Pin4在结构上与Pin1相似，并且与Pin1的功能部分重叠，但肽37仅轻微抑制Pin4(在5μM抑制剂时约15％)，估计IC50值为约34μM(图37c)。肽37对高达5μM浓度的FKBP12或亲环蛋白A的催化活性没有影响。这些数据表明肽37是Pin1的高度特异性抑制剂。
通过将肽37在人血清中孵育不同的时间段并通过反相HPLC分析反应混合物来评价肽37的代谢稳定性。使用含有pThr的Pin1抑制剂1作为对照。孵育6小时后，97％的肽37保持完整，而约50％的双环肽1在3小时后降解(图37d)。肽1的损失伴随着在HPLC中新峰的同时出现。新物类的质谱分析将其鉴定为肽1的去磷酸化产物(肽2)。这个结果与我们先前的观察结果一致，即结构受限的双环肽对蛋白水解降解具有高度耐受性。D-pThr部分保持对人血清中非特异性磷酸酶的水解易感。
通过用FITC标记的肽(5μM)孵育HeLa细胞2小时并且通过流式细胞分析对总细胞内荧光进行定量来评估肽37、肽1和先前报道的膜不可通透的单环Pin1抑制剂(表18，肽46)的细胞摄取效率。如所预期的，未处理的细胞和用肽46处理的细胞几乎不显示细胞荧光，分别具有101和193的平均荧光强度(MFI)值(图38a)。相比之下，用肽1和37处理的细胞分别得到2562和8792的MFI值。因此，与肽1相比，肽37被HeLa细胞内化更有效约4倍。据推测，肽1的带负电荷的磷酸根基团与带正电荷的CPP基序静电相互作用并降低了后者的细胞摄取效率。
抑制Pin1活性先前已显示减少细胞增殖。通过使用MTT细胞存活力测定来检查肽37对HeLa细胞生长的影响。将膜不可通透肽46和细胞可通透但无活性(Pin1结合缺陷)双环肽(表18，肽47)用作对照。肽37以浓度依赖性方式抑制HeLa细胞生长，其IC50值为1.0μM(图38b)。如所预期的，肽46和47都对细胞生长没有任何影响。时程研究在用5μM肽37但不用肽46或47处理3天后也显示出显著的生长抑制(>60％)。在类似的测试条件下磷酸化的双环肽1具有1.8μM的IC50值。
最后，为了确定Pin1是肽37在体内的分子靶标，通过蛋白质印迹分析对已确立的Pin1底物早幼粒细胞白血病蛋白(PML)的细胞内蛋白质水平进行了检查。Pin1以磷酸化依赖性方式负调节PML水平，并且预期Pin1活性的抑制将稳定PML并增加其细胞内水平。事实上，用肽37(0.2-5μM)处理HeLa细胞导致PML水平的浓度依赖性增加(图38c，d)。该效果在0.2μM抑制剂(PML水平增加1.8倍)时已经是显著的，并在约1μM(3.3倍增加)时达到平台期。再次，双环肽47在相同条件下没有效果，而肽1(阳性对照，5μM)将PML水平提高3.1倍。
通过筛选肽文库，接着是常规药物化学方法，已经公开了针对人Pin1的第一有效的、选择性的、代谢稳定的和细胞可通透的肽基抑制剂。其高效力和选择性应使其成为探索Pin1细胞功能的有用的化学探针。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。本文引用的出版物和其引用的材料通过引用特别地并入。
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。这些等同形式旨在被所附权利要求所涵盖。

Claims (61)

1.一种式I的细胞穿透肽化合物：
其中AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8和AA9各自独立地为氨基酸；并且m、n和p独立地选自0和1，其中所述氨基酸中的三个或更多个是精氨酸。
2.根据权利要求1所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为0并且所述化合物具有式I-1：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6
I-1
其中AA1-AA6如式I中所定义。
3.根据权利要求1所述的细胞穿透肽化合物，其中m为1，且n和p为0，并且所述化合物具有式I-2：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7
I-2
其中AA1-AA7如式I中所定义。
4.根据权利要求1所述的细胞穿透肽化合物，其中m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式I-3：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8
I-3
其中AA1-AA8如式I中所定义。
5.根据权利要求1所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为1，并且所述化合物具有式I-4：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9
I-4
其中AA1-AA9如式I中所定义。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞穿透肽，其中所述细胞所述细胞穿透肽化合物为环状。
7.根据权利要求1所述的细胞穿透肽化合物，其中所述细胞所述细胞穿透肽化合物为环状，并且所述化合物具有式Ia：
其中AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义，并且其中曲线表示共价键。
8.根据权利要求7所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为0并且所述化合物具有式Ia-1：
其中AA1-AA6如式I中所定义。
9.根据权利要求7所述的细胞穿透肽化合物，其中m为1，n和p为0，并且所述化合物具有式Ia-2：
其中AA1-AA7如式I中所定义。
10.根据权利要求7所述的细胞穿透肽化合物，其中m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式Ia-3：
其中AA1-AA8如式I中所定义。
11.根据权利要求7所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为1，并且所述化合物具有式Ia-4：
其中AA1-AA9如式I中所定义。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中所述细胞穿透肽化合物还包含货物部分，其中所述货物部分可包含可检测部分、治疗部分、靶向部分或其组合。
13.根据权利要求1所述的细胞穿透肽化合物，其中所述细胞穿透肽化合物具有式II：
其中所述货物部分可包含可检测部分、治疗部分、靶向部分或其组合，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
14.根据权利要求13所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为0并且所述化合物具有式II-1：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-货物
II-1
其中AA1-AA6如式I中所定义，并且货物如式II中所定义。
15.根据权利要求13所述的细胞穿透肽化合物，其中m为1，且n和p为0，并且所述化合物具有式II-2：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-货物
II-2
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
16.根据权利要求13所述的细胞穿透肽化合物，其中m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式II-3：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-货物
II-3
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
17.根据权利要求13所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为1并且所述化合物具有式II-4：
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-货物
II-4
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
18.根据权利要求12-16中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中所述细胞穿透肽部分和货物部分一起为环状。
19.根据权利要求13所述的细胞穿透肽化合物，其中所述细胞穿透肽化合物具有式IIa：
其中所述货物部分如式II中所定义且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
20.根据权利要求19所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为0并且所述化合物具有式IIa-1：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
21.根据权利要求19所述的细胞穿透肽化合物，其中m为1，且n和p为0，并且所述化合物具有式IIa-2：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
22.根据权利要求19所述的细胞穿透肽化合物，其中m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式IIa-3：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
23.根据权利要求19所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为1，并且所述化合物具有式IIa-4：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
24.根据权利要求12-16中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中所述细胞穿透肽部分为环状并且所述货物部分附接至所述环状细胞穿透肽部分。
25.根据权利要求13所述的细胞穿透肽化合物，所述化合物具有式IIb：
其中所述货物部分如式II所定义且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
26.根据权利要求25所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为0并且所述化合物具有式IIb-1：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
27.根据权利要求25所述的细胞穿透肽化合物，其中m为1，且n和p为0，并且所述化合物具有式IIb-2：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
28.根据权利要求25所述的细胞穿透肽化合物，其中m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式IIb-3：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
29.根据权利要求25所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为1，并且所述化合物具有式IIb-4：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
30.根据权利要求12-16中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中所述货物部分为环状且所述细胞穿透肽部分为环状，并且它们一起形成稠合双环体系。
31.根据权利要求13所述的细胞穿透肽化合物，其中所述化合物具有式IIc：
其中所述货物部分如式II所定义，且AA1-AA9、m、n和p如式I中所定义。
32.根据权利要求31所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为0并且所述化合物具有式IIc-1：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
33.根据权利要求31所述的细胞穿透肽化合物，其中m为1，且n和p为0，并且所述化合物具有式IIc-2：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
34.根据权利要求31所述的细胞穿透肽化合物，其中m和n为1，p为0，并且所述化合物具有式IIc-3：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
35.根据权利要求31所述的细胞穿透肽化合物，其中m、n和p为1，并且所述化合物具有式IIc-4：
其中AA1-AA6如式I中所定义并且货物如式II中所定义。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中至少一个氨基酸是萘基丙氨酸、色氨酸或苯丙氨酸或其衍生物或类似物。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中所述氨基酸中的至少三个是精氨酸。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中所述氨基酸中的至少一个是苯丙氨酸。
39.根据权利要求12-38中任一项所述的细胞穿透肽化合物，其中所述货物部分包含治疗部分。
40.根据权利要求39所述的细胞穿透肽化合物，其中所述治疗部分可包含可用作针对Ras、PTP1B、Pin1、Grb2SH2、CAL PDZ等或其组合的抑制剂的靶向部分。
41.一种组合物，其包含根据权利要求1-40中任一项所述的化合物。
42.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-41中任一项所述的化合物。
43.一种用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-42中任一项所述的化合物或组合物。
44.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-43中任一项所述的化合物或组合物。
45.根据权利要求44中任一项所述的方法，其还包括施用第二化合物或组合物，其中所述第二化合物或组合物包含抗癌剂。
46.根据权利要求44-45中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用有效量的电离辐射。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的所述化合物或组合物可包含治疗部分，所述治疗部分可包含可用作针对Ras、PTP1B、Pin1、Grb2SH2或其组合的抑制剂的靶向部分。
48.一种在受试者中杀死肿瘤细胞的方法，其包括：使所述肿瘤细胞与有效量的根据权利要求1-42中任一项所述的化合物或组合物接触。
49.根据权利要求48所述的方法，其还包括使所述肿瘤细胞与第二化合物或组合物接触，其中所述第二化合物或组合物包含抗癌剂。
50.根据权利要求48-49中任一项所述的方法，其还包括用有效量的电离辐射辐照所述肿瘤细胞。
51.根据权利要求49-50中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的所述化合物或组合物可包含治疗部分，所述治疗部分可包含可用作针对Ras、PTP1B、Pin1、Grb2SH2或其组合的抑制剂的靶向部分。
52.一种用于治疗患有代谢病症或疾患的受试者的方法，其包括施用有效量的根据权利要求1-42中任一项所述的化合物或组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述代谢病症是2型糖尿病。
54.根据权利要求52-53中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的所述化合物或组合物可包含治疗部分，所述治疗部分可包含可用作针对PTP1B的抑制剂的靶向部分。
55.一种用于治疗患有免疫病症或疾患的受试者的方法，其包括施用有效量的根据权利要求1-42中任一项所述的化合物或组合物。
56.权利要求55所述的方法，其中施用至所述受试者的所述化合物或组合物可包含治疗部分，所述治疗部分可包含可用作针对Pin1的抑制剂的靶向部分。
57.一种用于治疗患有囊性纤维化的受试者的方法，其包括施用有效量的根据权利要求1-42中任一项所述的化合物或组合物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中施用至所述受试者的所述化合物或组合物可包含治疗部分，所述治疗部分可包含可用作针对CAL PDZ的抑制剂的靶向部分。
59.根据权利要求57所述的方法，其中校正CFTR功能的分子也与所述化合物或组合物一起施用。
60.一种将化合物递送至心肌细胞的方法，其包括：使所述心肌细胞与有效量的根据权利要求1-42中任一项所述的化合物或组合物接触。
61.一种化合物，其如表1、6或18中任一项所示。
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