JP6807831B2 - 細胞膜透過性ペプチド、並びにこの作製方法及び使用方法 - Google Patents

細胞膜透過性ペプチド、並びにこの作製方法及び使用方法 Download PDF

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Description

連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により認可された補助金番号ＧＭ０６２８２０、ＧＭ１１０２０８、及びＣＡ１３２８５５の下での政府援助と共に行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
原形質膜は、特にペプチド、タンパク質及び核酸等の生物学的製剤に対する薬剤発見において、大きな課題を提示している。膜障壁を破壊して生物学的製剤を細胞内に送達する、１つの見込みのある方法は、生物学的製剤に「細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）」を結合させることである。３０年間の調査にも関わらず、ＣＰＰ活性の基本原理は分かりづらいままである。エンドサイトーシスにより細胞内に入るＣＰＰは、細胞質基質に到達するために、エンドサイトーシス小胞から出なければならない。残念なことに、エンドソーム膜は、これらのＣＰＰによる細胞質送達に対する重要な障壁であることが証明され、多くの場合、ごく少量のペプチドの分画しか細胞内に流出しない（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ａ ｅｔ ａｌ．ＡＡＰＳ Ｊ．，２００９，１１，１３−２２；Ｖａｒｋｏｕｈｉ，ＡＫ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１１，１５１，２２０−２２８；Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，１９，８１９−８３０）。それ故、新規の細胞膜透過性ペプチド、及び種々の細胞型に作用物質を送達するのに使用可能なかかるペプチドを含む組成物が必要とされている。本明細書にて開示した組成物及び方法は、これら及び他の必要性に応える。
細胞膜透過性ペプチドとしての活性を有する化合物を本明細書にて開示する。いくつかの実施例では、化合物は細胞膜透過性ペプチド部位及びカーゴ部位を含むことができる。カーゴ部位は、１つ以上の検出可能部位、１つ以上の治療用部位、１つ以上の標的部位、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
いくつかの実施例では、 細胞膜透過性ペプチド部位は環状である。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位及びカーゴ部位は共に環状であり、これは本明細書において、「環内」配置と呼ばれる。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、カーゴ部位は環状細胞膜透過性ペプチド部位構造に結合している。これは本明細書において、「環外」配置と呼ばれる。いくつかの実施例では、カーゴ部位は環状であり、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、これらは共に縮合二環式環を形成する。これは本明細書において、「二環式」配置と呼ばれる。
いくつかの実施例では、化合物は式Ｉであることができる。

Ｉ
式中、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ６、ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９（即ち、ＡＡ１〜ＡＡ９）は、それぞれ独立してアミノ酸であり、かつｍ、ｎ及びｐは０〜１から独立して選択される。式Ｉのその他の実施例では、ｍ及びｐが１である時に、ｎが２以上となるように、９個を超えるアミノ酸が存在することができる。これらのより大きなペプチドは、本明細書のそれぞれの式、例えばＩＡ、ＩＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、及びＩＩｃと共に開示されている。いくつかの実施例では、３つ以上のアミノ酸はアルギニンであり、１つ以上のアミノ酸はフェニルアラニンである。更にその他の実施例では、１つ以上のアミノ酸はナフチルアラニンまたはトリプトファンである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、化合物は式Ｉａであることができる。

Ｉａ
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りであり、曲線は共有結合を示す。
いくつかの実施例では、化合物は更にカーゴ部位を含み、化合物は式ＩＩの式であることができる。

ＩＩ
式中、カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含むことができ、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位及びカーゴ部位は共に環状であり、化合物は式ＩＩａである。

ＩＩａ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、カーゴ部位は環状細胞膜透過性ペプチド部位構造に付属しており、化合物は式ＩＩｂである。

ＩＩｂ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、カーゴ部位は環状であり、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、これらは共に縮合二環式環を形成し、化合物は式ＩＩｃである。

ＩＩｃ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
アミノ酸はペプチド結合により結合可能である。アミノ酸はカーゴ部位に、アミノ基、カルボキシレート基、または側鎖にて結合可能である。
いくつかの実施例では、少なくとも１つのアミノ酸は、ナフチルアラニン、またはこの類似体もしくは誘導体を含む。いくつかの実施例では、少なくとも３つのアミノ酸は独立して、アルギニン、またはこの類似体もしくは誘導体を含む。いくつかの実施例では、少なくとも１つのアミノ酸はフェニルアラニン、またはこの類似体もしくは誘導体を含む。いくつかの実施例では、少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン、またはこの類似体もしくは誘導体を含む。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は配列番号：１〜配列番号：９０のいずれかとすることができる。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は配列番号：１〜配列番号：９０のいずれかの変異体であることができる。
カーゴ部位は、任意の対象のカーゴ、例えばリンカー部位、検出可能部位、治療用部位、標的部位等、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
カーゴ部位は細胞膜透過性ペプチド部位に、アミノ基、カルボキシレート基、または細胞膜透過性ペプチド部位のアミノ酸のいずれかの側鎖（例えば、アミノ基、カルボキシレート基、またはＡＡ１〜ＡＡ９のいずれかの側鎖）にて結合されることが可能である。
いくつかの実施例では、治療用部位は標的部位を含む。標的部位は例えば、１つ以上の酵素ドメインを標的化することができるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施例では、標的部位は、癌、嚢胞性線維症、糖尿病、肥満、またはこれらの組み合わせ等の病気において役割を果たすタンパク質に対する阻害剤を含むことができる。いくつかの実施例では、治療用部位は、Ｒａｓ（例えばＫ−Ｒａｓ）、ＰＴＰ１Ｂ、Ｐｉｎ１、Ｇｒｂ２ ＳＨ２、ＣＡＬ ＰＤＺ等、またはこれらの組み合わせに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる。
本明細書で記載される化合物を含む組成物もまた、本明細書で開示される。開示した化合物の製薬上許容できる塩及びプロドラッグもまた、本明細書で開示される。
本明細書で記載される化合物または組成物の使用方法もまた、本明細書で提供される。必要な対象において、該対象に、本明細書で記載される有効量の化合物または組成物のいずれかを投与することを含む、疾病または病状の治療方法もまた、本明細書で提供される。
対象における癌の治療、予防、または緩和方法もまた、本明細書で提供される。本方法は、本明細書で記載される有効量の１つ以上の化合物もしくは組成物、または薬剤として許容されるその塩を対象に投与することを含む。本明細書で記載される癌の治療または予防方法は更に、１つ以上の追加の作用物質（例えば抗癌剤または電離放射線）を含むことができる。
対象内における腫瘍細胞の殺傷方法もまた本明細書で記載する。本方法は、腫瘍細胞を、本明細書に記載した有効量の化合物または組成物と接触させることを含み、所望により、腫瘍細胞を有効量の電離放射線で照射する工程を含む。更に、腫瘍の放射線治療方法を本明細書において提供する。本方法は、腫瘍細胞を、本明細書に記載した有効量の化合物または組成物と接触させること、及び腫瘍を有効量の電離放射線で照射することを含む。
対象における癌または腫瘍の治療、予防または緩和方法の実施例において、対象に投与される化合物または組成物は、Ｒａｓ（例えばＫ−Ｒａｓ）、ＰＴＰ１Ｂ、Ｐｉｎ１、Ｇｒｂ２ ＳＨ２、またはこれらの組み合わせに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。
開示した主題はまた、代謝異常または条件を有する対象の治療方法にも関する。一実施形態では、本明細書にて開示した、有効量の１つ以上の化合物または組成物は、代謝異常を有し、その治療を必要としている対象に投与される。いくつかの実施例では、代謝異常は２型糖尿病を含むことができる。対象における代謝異常の治療、予防または緩和方法のいくつかの実施例では、対象に投与される化合物または組成物は、ＰＴＰ１Ｂに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。
開示した主題はまた、免疫不全または状態を有する対象の治療方法にも関する。一実施形態では、本明細書にて開示した、有効量の１つ以上の化合物または組成物は、免疫不全を有し、その治療を必要としている対象に投与される。対象における免疫不全の治療、予防または緩和方法のいくつかの実施例では、対象に投与される化合物または組成物は、Ｐｉｎ１に対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。
開示した主題はまた、嚢胞性線維症を有する対象の治療方法にも関する。一実施形態では、本明細書にて開示した、有効量の１つ以上の化合物または組成物は、嚢胞性線維症を有し、その治療を必要としている対象に投与される。対象における嚢胞性線維症の治療方法のいくつかの実施例では、対象に投与される化合物または組成物は、ＣＡＬ ＰＤＺに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。
１つ以上の本発明の実施形態の詳細は、添付図面及び以下の明細書で説明される。本発明のその他の特徴、目的、及び利点は明細書及び図面、並びに特許請求の範囲により明らかとなるであろう。
本明細書の一部に組み込まれ、一部を構成する添付図面は、後述のいくつかの態様を示す。
ｃＦΦＲ４による、カーゴ（ライトグレーで示す）の環内（Ａ）、環外（Ｂ）及び二環式（Ｃ）送達におけるカーゴ結合を示す構造を示す。 本研究で用いたいくつかのペプチドの構造を示す。 ｃＦΦＲ４−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰの合成を示すスキームを示す。 ｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂの合成を示すスキームを示す。 ＦＩＴＣ標識ｃＦΦＲ４、Ｒ９、及びＴａｔの、（Ａ）ＳＵＶ及び（Ｂ）硫酸ヘパリンへの結合を示す。 ローダミンＢ標識ペプチド、及び流体相取り込みマーカー（デキストランＦＩＴＣ）で２時間処理したＨＥＫ２９３細胞の、代表的な生細胞の共焦点画像を示す。（Ａ）同一のＺ断面における、５μＭのｃＦΦＲ４−Ａ５及びデキストランＦＩＴＣで処理した細胞。（Ｂ）同一のＺ断面における、５μＭのｃＦΦＲ４−Ｒ５及びデキストランＦＩＴＣで処理した細胞。 ヒーラー細胞によるデキストランＡｌｅｘａ４８８のエンドサイトーシスにおける、ｃＦΦＲ４の効果を示す。ヒーラー細胞を、補充物を含有しないＤＭＥＭ、 １μＭのｃＦΦＲ４のみ、１００μＭのデキストランＡｌｅｘａ４８８のみ、または１μＭのｃＦΦＲ４と１００μＭのデキストランＡｌｅｘａ４８８の両方を含有するＤＭＥＭで処理した。ＭＦＩは平均蛍光強度である。 キャップ蛍光におけるｐＨの影響を示す。ｃＦΦＲ４−ＰＣＰは、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化し、ＨＰＬＣにより精製し、示したｐＨにおける蛍光を測定した。 ｐＣＡＰ含有ペプチドの培養細胞：Ｉ、タグを外したＰＣＰ；ＩＩ、ｃＦΦＲ４−ＰＣＰ；ＩＩＩ、ｃＦΦＲ４−ＰＣＰ及びＮａ３ＶＯ４；ＩＶ、Ｒ９−ＰＣＰ；Ｖ、Ｔａｔ−ＰＣＰ；並びにＶＩ、Ａｎｔｐ−ＰＣＰ内への内在化を示す。（Ａ）５μＭのペプチドで処理したＨＥＫ２９３細胞の代表的な生細胞の共焦点画像。上面はＤＲＡＱ５による核染色であり、底面は同一のＺ断面でのＣＡＰ蛍光である。（Ｂ）０または１０μＭのペプチドで処理したヒーラー細胞のフローサイトメトリー。（Ｃ）バックグラウンド蛍光（未処理細胞）を除去した後の、（Ｂ）からのＣＡＰ蛍光。ＭＦＩは平均蛍光強度である。 ローダミンＢで標識したペプチド（それぞれ５μＭ）、及び流体相エンドサイトーシスマーカー（デキストランＦＩＴＣ、０．５ｍｇ／ｍＬ）で２時間処理した、ＨＥＫ２９３の代表的な生細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。ローダミンＢの赤色蛍光、及び同一のＺ断面からのデキストランＦＩＴＣの緑色蛍光、並びにこれらを合わせた画像を各パネルに示す。内在化ペプチドの細胞内分布を示すために、各場合において、典型的な細胞の拡大画像を示す。（Ａ）ビシクロ（ＦΦＲ４−Ａ５）Ｒｈｏ； （Ｂ）モノシクロ（ＦΦＲ４−Ａ５）Ｒｈｏ；（Ｃ）ビシクロ（ＦΦＲ４−Ａ７）Ｒｈｏ；（Ｄ）モノシクロ（ＦΦＲ４−Ａ７）Ｒｈｏ；（Ｅ）ビシクロ（ＦΦＲ４−ＲＡＲＡＲ）Ｒｈｏ；及び（Ｆ）ビシクロ（ＦΦＲ４−ＤＡＤＡＤ）Ｒｈｏで処理した細胞。 （Ａ）ＣＰＰ−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰコンジュゲートの構造、（Ｂ）１μＭのＧＦＰ（Ｉ）、Ｔａｔ−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰ（ＩＩ）、またはｃＦΦＲ４−Ｓ−ＳＧＰ（ＩＩＩ）及び核染色ＤＲＡＱ５による、２時間の処理の後の、哺乳類細胞の生細胞の共焦点画像を示す。全ての画像は同一のＺ断面で記録した。 （Ａ）０〜５００ｎＭのＰＴＰ１ＢまたはｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂによる処理の後の、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞のグローバルｐＹタンパク質レベルのウェスタンブロット分析（ＩＢ：抗ｐＹ抗体４Ｇ１０）を示す。（Ｂ）（Ａ）と同じサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色により分析した。Ｍは分子量マーカーである。 （Ａ）ｃＦΦＲ４、Ｔａｔ、Ｒ９、及びＡｎｔｐの血清安定性の比較、（Ｂ）ｃＦΦＲ４の細胞毒性を示す。示した細胞株をＤＭＳＯ（対照）、５μＭまたは５０μＭのｃＦΦＲ４で２４時間処理し、生細胞の割合をＭＴＴアッセイにより測定した。 （Ａ）４８時間、または（Ｂ）７２時間の、ｃＦΦＲ４（５または５０μＭ）での処理の後の種々の哺乳類細胞のＭＴＴアッセイを示す。 ｃＦΦＲ４、Ｒ９、及びＴａｔが細胞質内に入り、特定の阻害剤が機能するように提示される、エンドサイトーシス経路に沿った箇所を示す図を示す。 直鎖ペプチジルカーゴを哺乳類細胞内に送達する、可逆的環化法を示すスキームを示す。ＧＳＨはグルタチオンである。 （Ａ）ジスルフィド結合で環化したペプチドの合成、（Ｂ）チオエーテル結合で環化したペプチドの合成を示す。試薬及び条件：（ａ）標準的なＦｍｏｃ／ＨＡＴＵ化学作用；（ｂ）ピペリジン／ＤＭＦ；（ｃ）３，３’−ジチオジプロピオン酸／ＤＩＣ；（ｄ）β−メルカプトエタノール／ＤＭＦ；（ｅ）変性試薬Ｋ；（ｆ）粉砕；（ｇ）ＤＭＳＯ／ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）；（ｈ）４−ブロモ酪酸／ＤＩＣ；（ｉ）１％ ＴＦＡ／ＤＣＭ；（ｊ）１％ ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ；ＰＧ＝保護基。Ｔｒｔ＝トリチル；Ｍｍｔ＝メトキシトリチル。（Ｃ）ＦＩＴＣ標識ペプチド１及び２の構造。（Ｄ）ペプチド１−ＰＣＰ及び２−ＰＣＰを含有するｐＣＡＰ（ホスホクマリンアミノプロピオン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｃｏｕｍａｒｙｌ ａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の構造。 （Ｅ）カスパーゼ蛍光原基質３〜７を含有するＡｍｃ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の構造。（Ｆ）ＦＩＴＣ標識したＣＡＬ−ＰＤＺドメインリガンド９〜１１の構造。 （Ａ）５μＭのＦＩＴＣ標識ペプチド１（Ｉ）または２（ＩＩ）、エンドサイトーシスマーカーであるデキストランＲｈｏ（０．５ｍｇ ｍＬ−１）、及び核染色ＤＲＡＱ５で処理したヒーラー細胞の生細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。異なる蛍光チャネルの画像は全て、同一のＺ断面で記録した。（Ｂ）５μＭのＦＩＴＣ標識ペプチド１、２、またはＦＩＴＣのみで処理したヒーラー細胞のフローサイトメトリー。 （Ａ）０または５μＭのペプチド１−ＰＣＰ、２−ＰＣＰで２時間処理したヒーラー細胞のＦＡＣＳ分析、（Ｂ）バックグラウンド蛍光（未処理細胞）を除去した後での、（Ａ）からのＣＡＰ蛍光を示す。ＭＦＩは平均蛍光強度である。 ペプチド１及び２のタンパク質分解安定性の比較を示す。 １００μＭのカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（ＦＭＫ）の不存在下及び存在下において、ペプチド３〜７（５μＭ）で処理したＪｕｒｋａｔ細胞による、蛍光クマリン生成物の時間依存性放出を示す。 （Ａ）ＣＡＬ−ＰＤＺ阻害剤８の構造、（Ｂ）還元試薬の存在下または不存在下における、ペプチド８のＣＡＬ−ＰＤＺドメインへの結合、（Ｃ）同一Ｚ断面における、ペプチド８（５μＭ）及びＤＲＡＱ５で処理したヒーラー細胞の生細胞の顕微鏡画像を示す。Ｉは内在化ペプチド８の緑色蛍光であり、ＩＩは、緑色のペプチド蛍光と青色の核染色の重なりである。（Ｄ）Ｃｏｒｒ−４ａ（１０μＭ）及び非標識ペプチド８（５０μＭ）の存在下または不存在下における、ＣＦＴＲの分布を示す免疫蛍光染色。（Ｅ）ＶＸ８０９（２０μＭ）及びペプチド８（５０μＭ）の不存在下または存在下における、ＣＦＴＲ特異的刺激により誘発された蛍光増加の勾配を示すＳＰＱアッセイ。Ｐ値は両側ｔ検定から計算した。 細胞膜透過性ＰＴＰ１Ｂ阻害剤の進化の概略図を示す。 環状ペプチドライブラリーの設計及び合成の概略図を示す。試薬及び条件：（ａ）標準的なＦｍｏｃ／ＨＢＴＵ化学作用；（ｂ）水に浸漬；（ｃ）０．１当量のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（δ−ＮＨＳ）−ＯＡｌｌ、０．４当量のＢｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ（Ｅｔ２Ｏ／ＣＨ２Ｃｌ２中）；（ｄ）ピペリジン；（ｅ）２部に分割；（ｆ）Ｆｍｏｃ／ＨＡＴＵ化学作用によるスプリットプール合成法；（ｇ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４；（ｈ）ＰｙＢＯＰ、ＨＯＢｔ； 及び（ｉ）試薬Ｋ。Ｘ２＝１０％ Ｆ２Ｐｍｐ及び９０％Ｔｙｒ；Ｘ１及びＸ３〜Ｘ５、無作為位置；Φ＝Ｌ−２−ナフチルアラニン；ＣＰＰ＝細胞膜透過性モチーフＦΦＲ４またはＲ４ΦＦ。 単環式ペプチド阻害剤２による、ＰＴＰ１Ｂの競合阻害を示す。（Ａ）種々の濃度（０、２２．５、４５，及び９０ｎＭ）の阻害剤２の存在下における、ｐＮＰＰ（０〜２４ｍＭ）の、ＰＴＰ１Ｂ触媒による加水分解のラインウィーバー＝バークプロット。（Ｂ）［Ｉ］の関数としての、ミカエリス定数比（Ｋ／Ｋ０）の二次プロット。 （ａ）５μＭのＦＩＴＣ標識阻害剤２（上面）または４（底面）、及びエンドサイトーシスマーカーのデキストランＲｈｏ（１．０ｍｇ／ｍＬ）で２時間処理した後の、Ａ５４９癌細胞の生細胞の共焦点顕微鏡画像（同一Ｚ断面）、（ｂ）阻害剤４（０、２８、５６、及び１１２ｎＭ）によるＰＴＰ１Ｂの競合阻害を示すラインウィーバー＝バークプロット、（ｃ）阻害剤４による阻害に対する、種々のＰＴＰの感度（全ての活性は、阻害剤が不存在である活性に対するものであった）を示す。 阻害剤４の固相合成を示す。試薬及び条件：ａ）標準的なＦｍｏｃ化学作用；ｂ）トリメシン酸、ＨＢＴＵ；ｃ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、Ｎ−メチルアニリン；ｄ）ＰｙＢＯＰ；ｅ）ＴＦＡ。 単環式ＰＴＰ１Ｂ阻害剤２及び二環式阻害剤４の血清安定性の比較を示す。 ０〜５μＭの阻害剤４で２時間処理した後の、Ａ５４９細胞でのグローバルｐＹタンパク質濃度を示す。（ｂ）（ａ）と同じサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（クマシーブルー染色）は、全てのレーンにおいて均一なサンプル担持を示す。（ｃ）Ｔｙｒ１１６２及びｔｙｒ１１６３部位における、インスリン受容体リン酸化反応での阻害剤４の効果。ＨｅｐＧ２細胞を、提示濃度の阻害剤４で２時間処理し、次いで５分間、インスリン（１００ｎＭ）で刺激した後、抗ＩＲ ｐＹ１１６２／ｐＹ１１６３抗体によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングを行った。（ｄ）（ｃ）からのＩＲ ｐＹ濃度の定量化（示すデータは、独立した５つの実験からの平均値±標準偏差）。 不透過性Ｐｉｎ１阻害剤の、細胞膜透過性二環式阻害剤への変換を示す。 Ｐｉｎ１阻害剤５〜９の、Ｐｉｎ１への結合のＦＡ分析を示す。 阻害剤５及び７による、Ｐｉｎ１への結合の競合を示す。各反応は、０．１μＭのＦＩＴＣ標識阻害剤５、１μＭのＰｉｎ１、０〜５μＭの非標識阻害剤５（ａ）または阻害剤７（ｂ）を含有し、ＦＡ値を測定し、競合濃度に対してプロットした。 Ｐｉｎ１阻害剤の細胞取り込みを示す。（ａ，ｂ）５μＭのＦＩＴＣ標識Ｐｉｎ１阻害剤５（ａ）または７（ｂ）、及び１ｍｇ／ｍＬのエンドサイトーシスマーカーであるデキストランＲｈｏで２時間処理したＨＥＫ２９３細胞の生細胞の共焦点顕微鏡画像。全ての画像は同一のＺ断面で記録した。（ｃ）ＤＭＳＯまたは５μＭのＦＩＴＣ標識Ｐｉｎ１阻害剤５、７、８、または９で２時間処理した後の、ヒーラー細胞のＦＡＣＳ分析。ＭＦＩは平均蛍光強度である。手順：ヒーラー細胞を６ウェルプレート（ウェルあたり２×１０５個の細胞）で２４時間培養した。実験の日に、細胞を、１％ＦＢＳを補充した、フェノールレッドを含有しないＤＭＥＭ内で５μＭのＦＩＴＣ標識二環式ペプチドまたは対照単環式ペプチドでインキュベーションした。２時間後、ペプチド溶液を除去し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．２５％のトリプシンで５分間処理し、ＤＰＢＳで再び洗浄した。最終的に、細胞をフローサイトメトリー緩衝液中に懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）により５３５ｎｍの励起で分析した。 癌細胞増殖における、Ｐｉｎ１阻害剤５、７、８、及び９の効果を示す。ヒーラー細胞（１００μＬ／各ウェル、５×１０４細胞／ｍＬ）を９６ウェル培養プレートに播種し、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で一晩増殖させた。種々の濃度のＰｉｎ１阻害剤（０〜５μＭ）をウェルに添加し、細胞を７２時間、５％のＣＯ２と共に３７℃でインキュベーションした。その後、１０μＬのＭＴＴ原液（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で４時間インキュベーションし、１００μＬのＳＤＳ−ＨＣｌ可溶化溶液を各ウェルに添加した後、完全に混合した。プレートを３７℃で一晩インキュベーションし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーにて、５７０ｎｍにてホルマザン生成物の吸光度を測定した。各実験は３通りで実施し、ペプチドで処理していない細胞を対照として使用した。 ５μＭのｃ（ＦΦＲＲＲＲＱ）−Ｋ（ＦＩＴＣ）（ａ）及びｃ（ｆΦＲｒＲｒＱ）−Ｋ（ＦＩＴＣ）（ｂ）で３時間処理した後の、マウスの心室心筋細胞の生細胞の共焦点画像を示す。（ｃ）ジスルフィド結合による、環式細胞膜透過性ペプチドでのカルモジュリン（Ｔ５Ｃ）の標識。（ｄ）６μＭの、ｃＦΦＲ４でコンジュゲート化し、Ｃｙ３で標識したカルモジュリンによる３時間の処理の後の、マウスの心室心筋細胞の生細胞の共焦点画像。 Ｐｉｎ１に対する、二環式ペプチド阻害剤の進化を示す。ライブラリースクリーニングに由来する構造部位は灰色で示されているが、最適化の間に行われた変更はライトグレーで示されている。 ペプチド３７の性質決定を示す。（ａ）蛍光異方性（ＦＡ）により分析した、ＦＩＴＣ標識ペプチド３７のＰｉｎ１への結合。（ｂ）ＦＡにより監視した、Ｐｉｎ１（４００ｎＭ）への結合に対する、ペプチド３７とＦＩＴＣ標識ペプチド１（１００ｎＭ）との競合。（ｃ）Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを基質として用いた、Ｐｉｎ１、Ｐｉｎ４、ＦＫＢＰ１２、及びサイクロフィリンＡのシストランスイソメラーゼ活性でのペプチド３７の影響。（ｄ）ペプチド１及び３７の血清安定性の比較。 ペプチド３７の細胞活性を示す。（ａ）フローサイトメトリーにより分析した、ヒーラー細胞によるペプチド１、３７、及び４６（５μＭ）の細胞取り込み。ＭＦＩは平均蛍光強度であり、「なし」は未処理細胞（ペプチドなし）である。（ｂ）ＭＴＴアッセイにより測定した、ヒーラー細胞でのペプチド３７、４６、及び４７の抗増殖性効果。（ｃ）ヒーラー細胞内でのＰＭＬのタンパク質濃度に対する、ペプチド１、３７及び４７の効果を示すウェスタンブロット。βアクチンをローディング対照として使用した。（ｄ）（ｃ）からのウェスタンブロット結果の定量化。報告データは、バックグラウンド除去後のものであり、３つの独立実験からの平均値±標準偏差を示す。
本明細書で記載される化合物、組成物及び方法は、開示した主題の特定の態様に関する以下の詳細の説明、並びにこれらの説明に含まれる実施例及び図を参照してより速やかに理解することができる。
本発明の化合物、組成物及び方法を開示及び説明する前に、後述の態様は、もちろんこれらのようなものが変化し得るように、特定の合成方法または特定の試薬に限定されるものではないものと理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は特定の態様を記述することのみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されなければならない。
また、本明細書を通して、種々の広報が参照される。これらの広報の開示は、開示された主題に関係する現況技術をより完全に記載するために、それら全体が本出願に参照として組み込まれる。開示された参照はまた、参考文献を頼りにする文章において論じられる、参考文献に含まれる物質のために、本明細書に参照として個々に、及び特異的に組み込まれる。
一般的な定義
本明細書、及び後続の特許請求の範囲において、多数の用語が参照され、これらの用語は以下の意味を有すると定義されなければならない。
明細書、及び本明細書の特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、及びこの単語の他の形態、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「を含むがこれらに限定されない」を意味し、例えば他の添加剤、構成成分、整数、または工程を除外することを意図しない。
明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別様が規定されない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及は、２つ以上のかかる組成物の混合物を含み、「作用物質（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への言及は、２つ以上のかかる作用物質の混合物を含み、「構成成分（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」への言及は、２つ以上のかかる構成成分の混合物を含む。
「任意」または「任意に」は、以下で説明する事象または結果が生じ得るまたは生じ得ないこと、かつその説明が、事象または結果が生じる場合、及び事象または結果が生じない場合を含むことを意味する。
範囲は本明細書において、「約」ある特定の値から、及び／または「約」別の特定の値まで、として表現されることができる。「約」は、値の５％以内、例えば値の４、３、２、または１％以内を意味する。かかる範囲が表現される場合、別の態様は、その特定の値から、及び／またはその他の特定の値までを含む。同様に、値が概算として表現される場合は、先に「約」を用いることで、その特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。範囲のそれぞれの終点は、他の終点との関係にて、及び他の終点とは独立して、の両方で重要であることも更に理解されよう。
本明細書で使用する場合、「対象」は個体を意味する。したがって、「対象」はペット（例えばネコ、イヌ等）、家畜（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット等）、及び鳥を含むことができる。「対象」はまた、霊長類またはヒト等の哺乳類を含むこともできる。したがって、対象はヒトまたは獣医患者であることができる。用語「患者」とは、臨床医、例えば医師による治療下にある対象を意味する。
用語「阻害する」とは、活性、応答、状態、疾病、または他の生物学的パラメーターの低下を意味する。これは活性、応答、状態、または疾病の完全な除去を含むことができるが、これらに限定されない。これはまた、例えば、自然または対照レベルと比較しての、活性、応答、状態または疾病の１０％の低下を含むことができる。したがって、低下は、自然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または任意の量の低下であることができる。
「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、またはこの単語の他の形態、例えば「低下させる（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」もしくは「低下」は、事象または特徴（例えば腫瘍増殖）を低下させることを意味する。低下は通常、いくつかの標準的な、または予想される値と関係がある。換言すると、相対的であるものの、標準的または相対的な値が必ずしも言及される必要はないと理解されている。例えば、「腫瘍増殖を低下させる」とは、標準または対照に対して、腫瘍の増殖速度が低下することを意味する。
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、もしくはこの単語の他の形態、例えば「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防」は、特定の事象または特徴を停止すること、特定の事象または特徴の進展もしくは進行を安定させるか、もしくは遅らせること、または、特定の事象または特徴が発生する機会を最小限に抑えることを意味する。予防は、例えば低下よりも、一般的には一層絶対的なものであるため、対照との比較を必要としない。本明細書で使用する場合、あるものが低下されると、予防されることはできない。しかし、低下されたあるものは、予防されることもまた可能である。同様に、あるものが予防されると、低下されることはできない。しかし、予防されたあるものは、低下されることもまた可能である。低下または予防が用いられる場合、別様に特に示されることがない限り、他の単語の使用もまた、明示的に開示されると理解されている。例えば、用語「予防する」または「抑制する」とは、疾病もしくは状態の開始を未然に防ぐかもしくは遅らせる、または疾病もしくは状態の重症度を低下させる治療を意味することができる。したがって、治療が、疾病の症状を有する対象の疾病を治療することができるのであれば、治療はまた、症状のいくつか、または全てに未だに罹っていない対象において、疾病を予防または抑制することもできる。
用語「治療」とは、疾病、病状、または疾患を治療、緩和、安定化、または予防する意図を有する患者の医学的管理を意味する。この用語は積極的治療、即ち、特に疾病、病状、または疾患の改善に向けられる治療を含み、また、原因治療、即ち、関連する疾病、病状、または疾患の原因除去に向けられる治療も含む。更に、この用語は姑息的治療、即ち、疾病、病状、または疾患の治療ではなく、症状の緩和を目的とした治療；予防的治療、即ち、関連する疾病、病状、または疾患の進展を最小限に抑えるか、または部分的にもしくは完全に阻害することを目的とする治療；及び、支持治療、即ち、関連する疾病、病状、または疾患の改善のための、別の特定の療法を補完するために用いられる治療を含む。
用語「抗癌の」とは、任意の濃度で細胞増殖及び／または腫瘍増殖を治療または制御する能力を意味する。
用語「治療的に有効な」とは、用いられる組成物の量が、疾病または疾患の１つ以上の原因または症状を緩和するのに十分な量であることを意味する。かかる緩和には低下または変化が必要なだけであり、除去は必ずしも必要ではない。
用語「製薬上許容できる」とは、医学的良識の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または妥当なベネフィット・リスク比に見合った他の問題もしくは合併症なしに、ヒト及び動物の組織と接触して用いるのに好適なこれらの化合物、材料、組成物、及び／または投薬形態を意味する。
用語「担体」とは、化合物または組成物と組み合わせた際に、調製、保存、投与、送達、有効性、選択性、または意図する使用もしくは目的のための、化合物または組成物の任意の他の特徴を補助または容易にする化合物、組成物、物質、または構造体を意味する。例えば、担体は、有効成分の任意の劣化を最小限に抑え、かつ対象における任意の副作用を最小限に抑えるために選択されることが可能である。
用語「ペプチド」「タンパク質」及び「ポリペプチド」は同じ意味で用いられ、あるアミノ酸のカルボキシル基が別のαアミノ基に結合した、２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成分子を意味する。
そうでないことが述べられない限り、実線のみで、くさび形線または破線では示されない化学結合を有する式は、可能なそれぞれの異性体、例えば各エナンチオマー、ジアステレオマー、及びメソ化合物、並びに異性体の混合物（ラセミ混合物またはスケールミック混合物）を考慮する。
ここで、参照は開示した材料、化合物、組成物、物品及び方法の特定の態様について詳細に行われ、これらの実施例は添付の実施例及び図で示される。
化合物
細胞膜透過性ペプチドとしての活性を有する化合物を本明細書にて開示する。いくつかの実施例では、化合物は細胞膜透過性ペプチド部位及びカーゴ部位を含むことができる。カーゴ部位は、１つ以上の検出可能部位、１つ以上の治療用部位、１つ以上の標的部位、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
いくつかの実施例では、 細胞膜透過性ペプチド部位は環状である。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位及びカーゴ部位は共に環状である。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、カーゴ部位は環状細胞膜透過性ペプチド部位構造に結合している。いくつかの実施例では、カーゴ部位は環状であり、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、これらは共に縮合二環式環を形成する。
細胞膜透過性ペプチド部位は、５つ以上、より特異的には６つ以上、例えば６〜１２個、または６〜９個のアミノ酸を含むことができる。６〜９個のアミノ酸が存在する場合、化合物は式Ｉであることができる。

Ｉ
式中、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ６、ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９（即ち、ＡＡ１〜ＡＡ９）は、それぞれ独立してアミノ酸であり、かつｍ、ｎ及びｐは０〜１から独立して選択される。９個を超えるアミノ酸が存在する場合、式Ｉは、ｍ及びｐがそれぞれ１であることができ、ｎは２以上、例えば２〜１０、または２〜５であることができる。いくつかの実施例では、３つ以上のアミノ酸はアルギニンであり、１つ以上のアミノ酸はフェニルアラニンである。更にその他の実施例では、１つ以上のアミノ酸はナフチルアラニンまたはトリプトファンである。
いくつかの実施例では、化合物は式Ｉであることができる。

Ｉ
式中、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ６、ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９（即ち、ＡＡ１〜ＡＡ９）は、それぞれ独立してアミノ酸であり、かつｍ、ｎ及びｐは０〜１から独立して選択される。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、化合物は式Ｉａであることができる。

Ｉａ
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りであり、曲線は共有結合を示す。曲線は、ペプチド骨格（即ち、別のＡＡのαアミンとアミン結合を形成する、あるＡＡのカルボン酸）における共有結合、２つのＡＡの側鎖間の結合、ＡＡのある側鎖からの、別のＡＡの骨格カルボン酸もしくはαアミンのいずれかへの結合、または２つのＡＡ間のジスルフィド結合であることができる。
いくつかの実施例では、化合物は更にカーゴ部位を含み、化合物は式ＩＩの式であることができる。

ＩＩ
式中、カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含むことができ、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位及びカーゴ部位は共に環状であり、化合物は式ＩＩａである。

ＩＩａ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、カーゴ部位は環状細胞膜透過性ペプチド部位構造に付属しており、化合物は式ＩＩｂである。

ＩＩｂ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、カーゴ部位は環状であり、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、これらは共に縮合二環式環を形成し、化合物は式ＩＩｃである。

ＩＩｃ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
細胞膜透過性ペプチド
細胞膜透過性ペプチド部位は、少なくとも５個、より特異的には少なくとも６個のアミノ酸、更により特異的には、６〜１２個、６〜９個、６〜７個、７〜８個、８〜９個、及びより特異的には６、７、８、または９個のアミノ酸を含む。環内モチーフに関して、少なくとも５個のアミノ酸を使用することができる。環内構造に関して、透過性ペプチド部位内のいくつかのアミノ酸もまた、カーゴ部位の一部であることができることもまた、本明細書にて開示されている。例えば、ＦＮａｌとカーゴ部位間に２つのＡｒｇが存在する場合、ペプチド透過性部位ＦＮａｌＲＲが形成可能である。この場合、２つのＡｒｇ残基は２つの機能を発揮する。したがって、場合によっては、ペプチド透過性部位を参照する場合、カーゴ部位の配列を考慮に入れる。
環外モチーフに関して、少なくとも６個のアミノ酸を、例えばカーゴに結合するために用いられるグルタミンと共に用いることができる。
各アミノ酸は天然、または非天然アミノ酸であることができる。用語「非天然アミノ酸」とは、天然アミノ酸に類似の構造を有するため、天然アミノ酸の構造及び反応性によく似ているという点で、天然アミノ酸の同種である有機化合物を意味する。非天然アミノ酸は、修飾アミノ酸、及び／または、２０個の一般的な天然アミノ酸、または希少な天然アミノ酸であるセレノシステインもしくはピロリシンではないアミノ酸類似体であることができる。非天然アミノ酸はまた、天然アミノ酸のＤ異性体であることもできる。好適なアミノ酸の例としては、アラニン、アロイソロイシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ナフチルアラニン、フェニルアラニン、プロリン、ピログルタミン酸、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、または誘導体もしくはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これら、及び他のアミノ酸は、本明細書で使用するそれらの略称と共に表１に列挙されている。

＊１文字での略称：本明細書で大文字で表す場合、Ｌアミノ酸の形態を示し、本明細書で小文字で表す場合、Ｄアミノ酸の形態を示す。
アミノ酸はペプチド結合により結合可能である。アミノ酸はカーゴ部位に、アミノ基、カルボキシレート基、または側鎖にて結合可能である。
式Ｉのいくつかの実施例では、少なくとも１つのアミノ酸は、ナフチルアラニンまたはトリプトファン、またはこれらの類似体もしくは誘導体を含む。式Ｉのいくつかの実施例では、アミノ酸の少なくとも３つは独立して、アルギニン、またはこの類似体もしくは誘導体を含む。式Ｉのいくつかの実施例では、少なくとも１つのアミノ酸は、フェニルアラニン、フェニルグリシン、もしくはヒスチジン、またはこれらの類似体もしくは誘導体を含む。式Ｉのいくつかの実施例では、少なくとも１つのアミノ酸はグルタミン、またはこの類似体もしくは誘導体を含む。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）部位は、表２に一覧にした配列のいずれか１つであることができる。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチドは、表２に一覧にした配列のいずれかの逆であることができる。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド配列は、表２に一覧にした配列のいずれかの環状形態であることができる。

Φ＝Ｌ−ナフチルアラニン、φ＝Ｄ−ナフチルアラニン；Ω＝Ｌ−ノルロイシン
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は、配列番号：１〜配列番号：２９のいずれかであることができる。いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は配列番号：１〜配列番号：２９のいずれかの変異体であることができる。ペプチド変異体は当業者に十分に理解されており、アミノ酸配列修飾を伴うことができる。例えば、アミノ酸配列修飾は通常、３分類：置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体の１つ以上に分類される。挿入としては、アミノ及び／またはカルボキシル末端縮合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端縮合の挿入よりも小さく、例えば、１〜３個の残基のオーダーである。欠失は、ペプチド配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。典型的には、ペプチド内の任意の１つの部位において、１〜３個以下の残基が欠失される。アミノ酸置換基は典型的には単一の残基であるが、一度に多数の異なる位置で発生することができる。挿入は通常、約１〜３個のアミノ酸残基のオーダーであり、欠失は約１〜３個の残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは隣接する対で行われる、即ち、２個の残基の欠失、または２個の残基の挿入である。置換、欠失、挿入、またはこれらの任意の組み合わせにより、最終の構成物にたどり着くことができる。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている変異体である。かかる置換は通常、以下の表３に従い行われ、保存的置換と称される。
機能の大きな変化は、表３のものほど保存されていない置換を選択すること、即ち、（ａ）置換領域において、例えばシートもしくはヘリックス構造として、ペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位において、分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、を維持する効果が、より著しく異なる残基を選択することにより行われる。通常、タンパク質の性質を最も変更することが予想される置換は、（ａ）親水性残基（例えばセリルもしくはスレオニル）が疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニル）で（により）置換される；（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基で（により）置換される；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基（例えばリジル、アルギニルもしくはヒスチジル）が、負電荷残基（例えばグルタミルもしくはアスパルチル）で（により）置換される；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）が、側鎖を有しない残基（例えばグリシン）で（により）（この場合（ｅ）部位の数を硫酸化及び／もしくはグリコシル化のために増加することで）置換される、ものである。
例えば、アミノ酸残基の、生物学的及び／または化学的に類似の別のアミノ酸残基との置き換えは、当業者には保存的置換として知られている。例えば、保存的置換はある疎水性残基を別の疎水性残基で、またはある極性残基を別の極性残基で置き換えることである。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組み合わせを含む。それぞれの明示的に開示された配列の、かかる保存的置換変異体は、本明細書において提供するペプチドに含まれる。
開示された細胞膜透過性ペプチド部位の変異体を規定する一方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点から、変異体を規定することによる、と理解されている。例えば、配列番号：１〜配列番号：２９はそれぞれ、特定の配列を示している。配列番号：１〜配列番号：２９に少なくとも８５％、９０％、９５％、または９７％の相同性を有するこれらのペプチドの変異体が具体的に開示されている。当業者は速やかに、２つのタンパク質の相同性の測定方法を理解する。例えば、相同性は２つの配列をアラインメントした後に計算することができるため、相同性は最も高いレベルとなっている。
更に、配列番号：１〜配列番号：２９の変異体は、開示した方法及び組成物においても機能するこれらのペプチドの誘導体である。誘導体は、１つ以上の残基を修飾残基で置き換えることにより形成され、ここでは、残基の側鎖が修飾されている。更なる実施例を表６及び１８で示し、これらの例は変異体も含む。
カーゴ部位
カーゴ部位は、任意の対象のカーゴ、例えばリンカー部位、検出可能部位、治療用部位、標的部位等、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施例では、カーゴ部位は、１つ以上の追加のアミノ酸（例えばＫ、ＵＫ、ＴＲＶ）；リンカー（例えば二官能性リンカーＬＣ−ＳＭＣＣ）；補酵素Ａ；ホスホクマリルアミノプロピオン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｃｏｕｍａｒｙｌ ａｍｉｎｏ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｐＣＡＰ）；８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ｍｉｎｉＰＥＧ）；Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸（ＤａｐもしくはＪ）；Ｌ−β−ナフチルアラニン；Ｌ−ピペコリン酸（Ｐｉｐ）；サルコシン；トリメシン酸；７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｍｃ）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；Ｌ−２−ナフチルアラニン；ノルロイシン；２−アミノ酪酸；ローダミンＢ（Ｒｈｏ）；デキサメタゾン（ＤＥＸ）；またはこれらの組み合わせを含むことができる。
いくつかの実施例では、カーゴ部位は、表４に一覧にしたもののいずれか、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含むことができる。
＊ｐＣＡＰ＝ホスホクマリルアミノプロピオン酸；Ω＝ノルロイシン；Ｕ＝２−アミノ酪酸。
検出可能部位
検出可能部位は、任意の検出可能な標識を含むことができる。好適な検出可能な標識の例としては、ＵＶ−Ｖｉｓ標識、近赤外標識、発光基、燐光基、磁気スピン共鳴標識、光増感剤、光開裂部位、キレート化中心（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｃｅｎｔｅｒ）、重原子、放射性同位体、同位体で検出可能なスピン共鳴標識、常磁性部位、発色団、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、標識は更なる試薬を添加することなく検出可能である。
いくつかの実施形態において、検出可能部位は、化合物が種々の生物学的用途での使用に好適であることができるような、生体適合性の検出可能部位である。本明細書で使用する場合、「生体適合性の」及び「生物学的に適合性の」とは、通常、任意の代謝産物または分解生成物と共に、通常細胞及び組織に対して無毒性であり、化合物が存在する場合に細胞及び組織がインキュベーションされた（例えば培養された）際に、細胞及び組織に任意の著しい悪影響を引き起こさない化合物を意味する。
検出可能部位は、蛍光標識または近赤外標識等の発光団を含有することができる。好適な発光団の例としては、金属ポルフィリン；ベンゾポルフィリン；アザベンゾポルフィリン；ナフトポルフィリン；フタロシアニン；ペリレン、ペリレンジイミン、ピレン等の多環式芳香族炭化水素；アゾ染料；キサンテン染料；ジピロメテンホウ素、ジピロメテンアザホウ素、シアニン染料、金属配位錯体（ビピリジン、ビピリジル、フェナントロリン、クマリン、並びにルテニウム及びイリジウムのアセチルアセトネート）；アクリジン、オキサジン誘導体（例えばベンゾフェノキサジン）；アザ−アヌレン、スクアライン；８−ヒドロキシキノリン、ポリメチン、発光生成ナノ粒子（例えば量子ドット、ナノ結晶）；カルボスチリル；テルビウム錯体；無機蛍光体、イオノフォア（例えばクラウンエーテルを取り込んだ、もしくはクラウンエーテルから誘導体化された染料）；またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好適な発光団の具体例としては、オクタエチルポルフィリンパラジウム（ＩＩ）；オクタエチルポルフィリン白金（ＩＩ）；テトラフェニルポルフィリンパラジウム（ＩＩ）；テトラフェニルポルフィリン白金（ＩＩ）；メソテトラフェニルポルフィリンテトラベンゾポルフィリンパラジウム（ＩＩ）；メソテトラフェニルメチルベンゾポルフィリン白金（ＩＩ）；オクタエチルポルフィリンケトンパラジウム（ＩＩ）；オクタエチルポルフィリンケトン白金（ＩＩ）；メソテトラ（ペンタフルオロフェニル）ポルフィリンパラジウム（ＩＩ）；メソテトラ（ペンタフルオロフェニル）ポルフィリン白金（ＩＩ）；トリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕ（ｄｐｐ）３）；トリス（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３）、トリス（２，２’−ビピリジン）塩化ルテニウム（ＩＩ）六水和物（Ｒｕ（ｂｐｙ）３）；エリトロシンＢ；フルオレセイン；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；エオシン；（（Ｎ−メチル−ベンゾイミダゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン）イリジウム（ＩＩＩ）；（（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン））−２−（アセチルアセトネート）インジウム（ＩＩＩ）；Ｌｕｍｏｇｅｎ染料；Ｍａｃｒｏｆｌｅｘ蛍光レッド；Ｍａｃｒｏｌｅｘ蛍光イエロー；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ；ローダミンＢ；ローダミン６Ｇ；イオウローダミン；ｍ−クレゾール；チモールブルー；キシレノールブルー；クレゾールレッド；クロロフェノールブルー；ブロモクレゾールグリーン；ブロモクレゾールレッド；ブロモチモールブルー；Ｃｙ２；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；４−ニトロフェノール；アリザリン；フェノールフタレイン；ｏ−クレゾールフタレイン；クロロフェノールレッド；カルマガイト；ブロモキシレノール；フェノールレッド；ニュートラルレッド；ニトラジン（ｎｉｔｒａｚｉｎｅ）；３，４，５，６−テトラブロモフェノールフタレイン；コンゴレッド；フルオレセイン；エオシン；２’，７’−ジクロロフルオロセイン；５（６）−カルボキシフルオロセイン；カルボキシナフトフルオロセイン；８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸；セミナフトローダフルオル；セミナフトフルオロセイン；トリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物；（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）テトラフェニルホウ素；オクタエチルポルフィリン白金（ＩＩ）；ジアルキルカルボシアニン；ジオクタデシルシクロキサカルボシアニン（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｃｙｃｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）；フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド；７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｍｃ）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；及びこれらの誘導体または組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施例では、検出可能部位は、ローダミンＢ（Ｒｈｏ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｍｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含むことができる。
検出可能部位は、アミノ基、カルボキシレート基、または細胞膜透過性ペプチド部位のいずれかのアミノ基の側鎖（例えばアミノ基、カルボキシレート基、またはＡＡ１−ＡＡＸのいずれかの側鎖）にて、細胞膜透過性ペプチド部位に結合することができる。
治療用部位
開示する化合物はまた、治療用部位を含むことができる。いくつかの実施例では、カーゴ部位は治療用部位を含む。検出可能部位は治療用部位に結合可能であるか、または検出可能部位が治療用部位としても機能することができる。治療用部位とは、対象に投与された時に、疾病または疾患の１つ以上の症状を低下させる基を意味する。
治療用部位は、アンタゴニスト（例えば酵素阻害剤）、及びアゴニスト（例えば、所望の遺伝子産物の発現の増加をもたらす転写因子）（当業者には理解されているが、アゴニスト転写因子もまた使用可能である）を含む多種多様の薬剤を含むことができ、これらが全て含まれる。更に、治療用部位は、体内の健全及び／または不健全な細胞に対して直接毒性を誘発可能、及び／または毒性を誘発可能なこれらの作用物質を含む。また、治療用部位は潜在的な病原体に対して免疫系を誘発及び／または刺激することが可能である。
治療用部位は例えば、抗癌剤、抗ウイルス薬、抗菌剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、麻酔剤、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
治療用部位は、抗癌剤を含むことができる。作用物質の例としては、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン、５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アキュテイン、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン、アドルシル、アグリリン、アラ−コート、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ、アルケラン、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸、α−インターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、アラネスプ、アレディア、アリミデックス、アロマシン、三酸化砒素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、アバスチン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス、Ｃ２２５、ロイコボリンカルシウム、キャンパス、カンプトサール、カンプトテシン−１１、カペシタビン、Ｃａｒａｃ、カルボプラチン、カルマスティン、カルマスティンウエハー、カソデックス、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボルム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン、シタラビン、シタラビンリポソーム、シトサール−Ｕ、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、デカドロン、デルタ−コルテフ（Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ）、デルタソン、デニロイキンジフチトクス、ＤｅｐｏＣｙｔ、デキサメタゾン、デキサメタゾンアセタート、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、デキサソン、デクスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、Ｄｉｏｄｅｘ、ドセタキセル、ドキシル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、ドロキシア、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ、デュラロン、エフディクス、エリガード、エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、エロキサチン、Ｅｌｓｐａｒ、Ｅｍｃｙｔ、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルビタックス、エルウィニア Ｌ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール、エトポフォス、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン、エビスタ、エキセメスタン、フェアストン、フェソロデックス、フェマーラ、フィルグラスチム、フロクシウリジン、フルダラ、フルダラビン、フルオロプレックス、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、ＦＵＤＲ、フルベストラント、Ｇ−ＣＳＦ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール、グリベック、リュープリン、リュープリンデポ、マチュレーン、マキシデックス、メクロレタミン、メクロレタミンヒドロクロリン、メドラロン、メドロール、メゲース、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、ミロセル、レトロゾール、ネオサール、ニューラスタ、ニューメガ、ニューポジェン、ニランドロン、ニルタミド、ナイトロジェンマスタード、ノバルデックス、ノバントロン、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンコスパー、オンコビン、Ｏｎｔａｋ、Ｏｎｘａｌ、オプレルベキン、オラプレド、オラソン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、パンレチン、パラプラチン、ペジアプレッド、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧイントロン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、フェニルアラニンマスタード、プラチノール、プラチノール−ＡＱ、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン、プロカルバジン、ＰＲＯＣＲＩＴ、プロロイキン、カルムスチンインプラントを有するプロリフェプロスパン２０、プリントール、ラロキシフェン、リウマトレックス、リツキサン、リツキシマブ、ロベロン−Ａ（Ｒｏｖｅｒｏｎ−Ａ）（インターフェロンα−２ａ）、ルベックス、塩酸ルビドマイシン、サンドスタチン、サンドスタチンＬＡＲ、サルグラモスチム、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ、ソル・メドロール、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タルグレチン、タキソール、タキソテール、テモダール、テモゾロミド、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、サロミド、ＴｈｅｒａＣｙｓ、チオグアニン、チオグアニンタブロイド、チオホスフォアミド、チオプレックス、チオテパ、ＴＩＣＥ、トポサール、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、トレクサール、トリセノックス、ＴＳＰＡ、ＶＣＲ、Ｖｅｌｂａｎ、ベルケード、ベプシド、ベサノイド、Ｖｉａｄｕｒ、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、Ｖｉｎｃａｓａｒ Ｐｆｓ、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＰ−１６、Ｖｕｍｏｎ、ゼローダ、ザノサール、ゼヴァリン、ザインカード、ゾラデックス、ゾレドロン酸、ゾメタ、ギリアデルウエハ、グリベック、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、ハロテスチン、ハーセプチン、ヘキサドロール、ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン、ハイドレア、ヒドロコルチゾン酢酸エステル、ハイドロコルチゾン、ハイドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ハイドロコルチゾンナトリウムサクシネート、リン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダマイシン、イダルビシン、アイフェックス、ＩＮＦα、イホスファミド、ＩＬ−２、ＩＬ−１１、イマチニブメシラート、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（インターフェロンα−２ｂ）、ロイコボリン、リューケラン、リューカイン、ロイプロリド、ロイコクリスチン、ロイスタチン、リポソーム化Ａｒａ−Ｃ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｒｅｄ、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、メチコルテン、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、マイトキサントロン、Ｍ−プレドニゾール、ＭＴＣ、ＭＴＸ、ムスタルゲン、ムスチン、マイトマイシン、マイレラン、イレッサ、イリノテカン、イソトレチノイン、キドロラーゼ、ラナコルト、Ｌ−アスパラギナーゼ、及びＬＣＲが挙げられる。治療用部位はまた、バイオ製剤（例えば抗体等）も含むことができる。
いくつかの実施例では、治療用部位は、抗ウイルス薬（例えばガンシクロビル、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）等）を含むことができる。
いくつかの実施例では、治療用部位は、アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン（ａｌａｍｅｃｉｎ）；アレキシジン；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル；アミシクリン；アミフロキサシン；メシル酸アミフロキサシン；アミカシン；硫酸アミカシン；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンフォマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；硫酸アストロマイシン；アビラマイシン；アボパルシン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；塩酸バカンピシリン；バシトラシン；メチレンジサリチル酸バシトラシン；バシトラシン亜鉛；バンベルマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリトマイシン（ｂｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）；硫酸ベタマイシン（ｂｅｔａｍｉｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）；ビアペネム；ビニラマイシン（ｂｉｎｉｒａｍｙｃｉｎ）；塩酸ビフェネミン；ビスピリチオンマグスルフェックス（ｂｉｓｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ ｍａｇｓｕｌｆｅｘ）；ブチカシン；硫酸ブチロシン；硫酸カプレオマイシン；カルバドックス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム；セファクロル；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナファート；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフルールナトリウム（ｃｅｆａｚａｆｌｕｒ ｓｏｄｉｕｍ）；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル；セフェピム；塩酸セフェピム；セフェテコール（ｃｅｆｅｔｅｃｏｌ）；セフィキシム；塩酸セフメノキシム；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシド一ナトリウム（ｃｅｆｏｎｉｃｉｄ ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ）；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；塩酸セフォチアム；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール（ｃｅｆｐｉｍｉｚｏｌｅ）；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；硫酸セフピロム；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアキセチル；セフロキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；塩酸セファレキシン；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；塩酸セトシクリン；セトフェニコール；クロラムフェニコール；パルミチン酸クロラムフェニコール；パントテン酸クロラムフェニコール複合体；コハク酸ナトリウムクロラムフェニコール；クロルヘキシジンホスファニレート；クロロキシレノール；重硫酸クロルテトラサイクリン；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン；クラリスロマイシン；塩酸クリナフロキサシン（ｃｌｉｎａｆｌｏｘａｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；クリンダマイシン；塩酸クリンダマイシン；塩酸パルミチン酸クリンダマイシン；リン酸クリンダマイシン；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン（ｃｌｏｘｙｑｕｉｎ）；コリスチメスエートナトリウム；硫酸コリスチン；クメルマイシン；クメルマイシンナトリウム；シクラシリン；サイクロセリン；ダルホプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；塩酸デメクロサイクリン；デメサイクリン（ｄｅｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）；デノフンギン；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；硫酸ジヒドロストレプトマイシン；ジピリチオン（ｄｉｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ）；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンフォスファテックス（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ ｆｏｓｆａｔｅｘ）；ドキシサイクリンヒクラート；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン（ｅｐｉｃｉｌｌｉｎ）；塩酸エピテトラサイクリン；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストラート；エリスロマイシンエストレート；エチルコハク酸エリスロマイシン；グルコヘプトン酸エリスロマイシン；ラクトビオン酸エリスロマイシン；プロピオン酸エリスロマイシン；ステアリン酸エリスロマイシン；塩酸エタンブトール；エチオナミド；フレロキサシン；フルクロキサシリン；フルダラニン；フルメキン；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキシシリン（ｆｕｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）；塩化フラゾリウム；酒石酸フラゾリウム；フシジン酸ナトリウム；フシジン酸；硫酸ゲンタマイシン；グロキシモナン（ｇｌｏｘｉｍｏｎａｍ）；グラミシジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン（ｈｅｘｅｄｉｎｅ）；イバフロキサシン（ｉｂａｆｌｏｘａｃｉｎ）；イミペネム；イソコナゾール；イセパマイシン；イソニアジド；ジョサマイシン；硫酸カナマイシン；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン（ｌｅｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）；リンコマイシン；塩酸リンコマイシン；ロメフロキサシン；塩酸ロメフロキサシン；メシル酸ロメフロキサシン；ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン（ｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ）；スルホサリチル酸メクロサイクリン；メガロマイシンリン酸カリウム；メキドックス；メロペネム；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；馬尿酸メテナミン；マンデル酸メテナミン；メチシリンナトリウム；メチオプリム；塩酸メトロニダゾール；リン酸メトロニダゾール；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；塩酸ミノサイクリン;塩酸ミリンカマイシン；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジクス酸ナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン（ｎｅｂｒａｍｙｃｉｎ）；パルミチン酸ネオマイシン；硫酸ネオマイシン；ウンデセン酸ネオマイシン；硫酸ネチルマイシン；ニュートラマイシン；ニフイラデン（ｎｉｆｕｉｒａｄｅｎｅ）；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン（ｎｉｆｕｒａｔｒｏｎｅ）；ニフルダジル；ニフリミド（ｎｉｆｕｒｉｍｉｄｅ）；ニフィウピリノール（ｎｉｆｉｕｐｉｒｉｎｏｌ）；ニフラキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロシクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド（ｎｉｔｒｏｍｉｄｅ）；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オンネトプリム（ｏｎｎｅｔｏｐｒｉｍ）；オキサシリン；オキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；塩酸オキシテトラサイクリン；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；パフロキサチン；メシル酸パフロキサチン；ペナメシリン；ペニシリンＧベンザチン；ペニシリンＧカリウム；ペニシリンＧプロカイン；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリンＶ；ペニシリンＶベンザチン；ペニシリンＶヒドラバミン；ペニシリンＶカリウム；ペンチジドンナトリウム；アミノサリチル酸フェニル；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム（ｐｉｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ｓｏｄｉｕｍ）；ピリジシリンナトリウム；塩酸ピルリマイシン；塩酸ピバンピシリン；パモ酸塩ピバンピシリン；ピバンピシリンプロベナート（ｐｉｖａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｐｒｏｂｅｎａｔｅ）；硫酸ポリミキシンＢ；ポルフィロマイシン；プロピカシン（Ｐｒｏｐｉｋａｃｉｎ）；ピラジナミド；ピリチオン亜鉛；酢酸キンデカミン；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；ラニマイシン（ｒａｎｉｍｙｃｉｎ）；レロマイシン；レプロマイシン；リファブチン；リファメタン；リファメキシル（ｒｉｆａｍｅｘｉｌ）；リファミド；リファンピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロサミシン；酪酸ロサミシン；プロピオン酸ロサミシン；ロサミシンリン酸ナトリウム；ステアリン酸ロサミシン；ロソキサシン（ｒｏｓｏｘａｃｉｎ）；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネムナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン（ｓａｒｐｉｃｉｌｌｉｎ）；スコパフンギン；シソマイシン（ｓｉｓｏｍｉｃｉｎ）；硫酸シソマイシン；スパルフロキサシン；塩酸スペクチノマイシン；スピラマイシン；塩酸スタリマイシン；ステフィマイシン；硫酸ストレプトマイシン；ストレプトニコジド（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｃｏｚｉｄ）；スルファベンズ（ｓｕｌｆａｂｅｎｚ）；スルファベンズアミド；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファシチン；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン（ｓｕｌｆａｌｅｎｅ）；スルファメラジン；スルファメテル（ｓｕｌｆａｍｅｔｅｒ）；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニル酸亜鉛；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト（ｓｕｌｆａｚａｍｅｔ）；スルフイソキサゾール；スルフイソキサゾールアセチル；スルフィスボキサゾールジオラミン（ｓｕｌｆｉｓｂｏｘａｚｏｌｅ ｄｉｏｌａｍｉｎｅ）；スルホミクシン（ｓｕｌｆｏｍｙｘｉｎ）；スロペネム（ｓｕｌｏｐｅｎｅｍ）；スルタミシリン；スンシリンナトリウム；塩酸タランピシリン（ｔａｌａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；テイコプラニン；塩酸テマフロキサシン（ｔｅｍａｆｌｏｘａｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；テモシリン；テトラサイクリン；塩酸テトラサイクリン；リン酸テトラサイクリン複合体；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン；塩化チオドニウム（ｔｉｏｄｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トブラマイシン；硫酸トブラマイシン；トスフロキサシン；トリメトプリム；硫酸トリメトプリム；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；硫酸トロスペクトマイシン；チロスリシン；バンコマイシン；塩酸バンコマイシン；バージニアマイシン；またはゾルバマイシン等の抗菌剤を含むことができる。
いくつかの実施例では、治療用部位は抗炎症剤を含むことができる。
いくつかの実施例では、治療用部位はデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含むことができる。
別の実施例において、治療用部位は治療用タンパク質を含む。例えば、ヒトによっては、一定の酵素が不足している場合がある（例えばリソソーム蓄積症）。酵素／タンパク質を、開示されている細胞膜透過性ペプチドの１つに結合させることにより、ヒト細胞にかかる酵素／タンパク質を送達することが本明細書において開示されている。開示した細胞膜透過性ペプチドはタンパク質（例えばＧＦＰ、ＰＴＰ１Ｂ、アクチン、カルモジュリン、トロポニンＣ）と共に試験をし、作用することが示されている。
いくつかの実施例では、治療用部位は標的部位を含む。標的部位は例えば、１つ以上の酵素ドメインを標的化することができるアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施例では、標的部位は、癌、嚢胞性線維症、糖尿病、肥満、またはこれらの組み合わせ等の疾病において役割を果たすことができる酵素に対する阻害剤を含むことができる。例えば、標的部位は表５に一覧にした配列のいずれかを含むことができる。



＊Ｆｐａ，Σ：Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン；Ｐｉｐ，Θ：Ｌ−ホモプロリン；Ｎｌｅ，Ω：Ｌ−ノルロイシン；Ｐｈｇ，Ψ Ｌ−フェニルグリシン；Ｆ２Ｐｍｐ，Λ：Ｌ−４−（ホスホノジフルオロメチル）フェニルアラニン；Ｄａｐ，Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎａｌ，Φ’：Ｌ−β−ナフチルアラニン；Ｐｐ，θ：Ｌ−ピペコリン酸；Ｓａｒ，Ξ：サルコシン；Ｔｍ，トリメシン酸。
標的部位及び細胞膜透過性ペプチド部位は重なることが可能である。即ち、細胞膜透過性ペプチド部位を形成する残基は、標的部位を形成する配列の一部であることが可能であり、その逆もまた同様である。
治療用部位は、アミノ基、カルボキシレート基、または細胞膜透過性ペプチド部位のアミノ酸のいずれかの側鎖（例えば、アミノ基、カルボキシレート基、またはＡＡ１−ＡＡＸのいずれかの側鎖）にて細胞膜透過性ペプチド部位に結合することができる。いくつかの実施例では、治療用部位は検出可能部位に結合することができる。
いくつかの実施例では、治療用部位は、Ｒａｓ（例えばＫ−Ｒａｓ）、ＰＴＰ１Ｂ、Ｐｉｎ１、Ｇｒｂ２ ＳＨ２、ＣＡＬ ＰＤＺ等、またはこれらの組み合わせに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる。
Ｒａｓは、ヒトにおいてＲａｓ遺伝子によりコードされるタンパク質である。通常のＲａｓタンパク質は、通常の組織シグナル伝達において不可欠な機能を発揮し、Ｒａｓ遺伝子の変異は、多くの癌の進行に関与している。Ｒａｓは、分子のオン／オフスイッチとして機能することができ、スイッチがオンになると、ＲＡＳによって増殖因子及び他の受容体シグナルの伝播に必要なタンパク質が動員されて活性化される。Ｒａｓの変異形態は、肺癌、大腸癌、膵癌、及び種々の白血病を含む種々の癌に関与している。
プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）はＰＴＰスーパーファミリーのプロトタイプメンバーであり、真核細胞シグナル伝達中に種々の役割を果たす。ＰＴＰ１Ｂはインスリンシグナル伝達経路の陰性制御因子であり、特にＩＩ型糖尿病の治療に対する、将来性のある潜在的な治療標的として考えられている。ＰＴＰ１Ｂはまた、乳癌の進行に関与している。
Ｐｉｎ１はタンパク質のサブセットに結合する酵素であり、タンパク質機能の調節において、リン酸化反応制御後での役割を果たす。Ｐｉｎ１活性は、プロリン指向性キナーゼシグナル伝達の結果を制御することができ、結果的に細胞増殖及び細胞生残を制御することができる。Ｐｉｎ１の制御緩和は、種々の病気で役割を果たすことができる。Ｐｉｎ１の上方制御は特定の癌に関与し得る。また、Ｐｉｎ１の下方制御はアルツハイマー病に関与し得る。Ｐｉｎ１の阻害剤は癌及び免疫不全に治療的に関与する可能性がある。
Ｇｒｂ２は、シグナル伝達及び細胞コミュニケーションに関与するアダプタータンパク質である。Ｇｒｂ２タンパク質は１つのＳＨ２ドメインを含有し、このドメインはチロシンリン酸化配列に結合可能である。Ｇｒｂ２は広範にわたり発現しており、複数の細胞機能にとって不可欠である。Ｇｒｂ２機能を阻害すると、成長プロセスが損なわれる可能性があり、種々の細胞型の形質転換及び増殖をブロックすることができる。
嚢胞性線維症（ＣＦ）患者内で変異した塩化物イオンチャネルタンパク質である、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の活性は、ＣＦＴＲが会合したリガンド（ＣＡＬ）により、そのＰＤＺドメイン（ＣＡＬ−ＰＤＺ）を介して、陰性に制御されることが近年報告されている（Ｗｏｌｄｅ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，２８２，８０９９）。ＣＦＴＲ／ＣＡＬ−ＰＤＺの相互作用を阻害すると、プロテアソームが仲立ちする分解を減少させることにより（Ｃｕｓｈｉｎｇ，ＰＲ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９，９９０７）、ＣＦＴＲ変異の最も一般的な形態である、ΔＰｈｅ５０８−ＣＦＴＲの活性が改善されることが示された（Ｃｈｅｎｇ，ＳＨ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９０，６３，８２７；Ｋｅｒｅｍ，ＢＳ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４５，１０７３）。したがって、本明細書にて開示した有効量の化合物または組成物を投与することにより、嚢胞性線維症を有する対象を治療する方法を本明細書にて開示する。対象に投与される化合物または組成物は、ＣＡＬ ＰＤＺに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。また、本明細書にて開示した化合物または組成物は、ＣＦＴＲ機能を修正する分子と共に投与されることができる。
具体例
いくつかの実施例では、化合物は式Ｉであることができる。

Ｉ
式中、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ６、ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９（即ち、ＡＡ１〜ＡＡ９）は、それぞれ独立してアミノ酸であり、かつｍ、ｎ及びｐは０〜１から独立して選択される。
式Ｉのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは０であり、化合物は式Ｉ−１である。

Ｉ−１
式中、ＡＡ１〜ＡＡ６は式Ｉで規定した通りである。
式Ｉのいくつかの実施例では、ｍは１、ｎ及びｐは０であり、化合物は式Ｉ−２である。

Ｉ−２
式中、ＡＡ１〜ＡＡ７は式Ｉで規定した通りである。
式Ｉのいくつかの実施例では、ｍ及びｎは１、ｐは０であり、化合物は式Ｉ−３である。

Ｉ−３
式中、ＡＡ１〜ＡＡ８は式Ｉで規定した通りである。
式Ｉのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは１であり、化合物は式Ｉ−４である。

Ｉ−４
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９は式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、化合物は式Ｉａであることができる。

Ｉａ
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りであり、曲線は共有結合を示す。
式Ｉａのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは０であり、化合物は式Ｉａ−１である。

Ｉａ−１
式中、ＡＡ１〜ＡＡ６は式Ｉで規定した通りである。
式Ｉａのいくつかの実施例では、ｍは１、ｎ及びｐは０であり、化合物は式Ｉａ−２である。

Ｉａ−２
式中、ＡＡ１〜ＡＡ７は式Ｉで規定した通りである。
式Ｉａのいくつかの実施例では、ｍ及びｎは１、ｐは０であり、化合物は式Ｉａ−３である。

Ｉａ−３
式中、ＡＡ１〜ＡＡ８は式Ｉで規定した通りである。
式Ｉａのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは１であり、化合物は式Ｉａ−４である。

Ｉａ−４
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９は式Ｉで規定した通りである。
いくつかの実施例では、化合物は更にカーゴ部位を含み、化合物は式ＩＩの式であることができる。

ＩＩ
式中、カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含むことができ、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
式ＩＩのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは０であり、化合物は式ＩＩ−１である。

ＩＩ−１
式中、ＡＡ１〜ＡＡ６は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩのいくつかの実施例では、ｍは１、ｎ及びｐは０であり、化合物は式ＩＩ−２である。

ＩＩ−２
式中、ＡＡ１〜ＡＡ７は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩのいくつかの実施例では、ｍ及びｎは１、ｐは０であり、化合物は式ＩＩ−３である。

ＩＩ−３
式中、ＡＡ１〜ＡＡ８は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは１であり、化合物は式ＩＩ−４である。

ＩＩ−４
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位及びカーゴ部位は共に環状であり、化合物は式ＩＩａである。

ＩＩａ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
式ＩＩａのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは０であり、化合物は式ＩＩａ−１である。

ＩＩａ−１
式中、ＡＡ１〜ＡＡ６は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。本明細書ではまた、式ＩＩａ−１もまた開示され、式中、ＡＡ１〜ＡＡ６の１つは存在しない（即ち、環内構造に５つのアミノ酸がある）。
式ＩＩａのいくつかの実施例では、ｍは１、ｎ及びｐは０であり、化合物は式ＩＩａ−２である。

ＩＩａ−２
式中、ＡＡ１〜ＡＡ７は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩａのいくつかの実施例では、ｍ及びｎは１、ｐは０であり、化合物は式ＩＩａ−３である。

ＩＩａ−３
式中、ＡＡ１〜ＡＡ８は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩａのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは１であり、化合物は式ＩＩａ−４である。

ＩＩａ−４
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
いくつかの実施例では、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、カーゴ部位は環状細胞膜透過性ペプチド部位構造に付属しており、化合物は式ＩＩｂである。

ＩＩｂ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
式ＩＩｂのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは０であり、化合物は式ＩＩｂ−１である。

ＩＩｂ−１
式中、ＡＡ１〜ＡＡ６は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩｂのいくつかの実施例では、ｍは１、ｎ及びｐは０であり、化合物は式ＩＩｂ−２である。

ＩＩｂ−２
式中、ＡＡ１〜ＡＡ７は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩｂのいくつかの実施例では、ｍ及びｎは１、ｐは０であり、化合物は式ＩＩｂ−３である。

ＩＩｂ−３
式中、ＡＡ１〜ＡＡ８は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩｂのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは１であり、化合物は式ＩＩｂ−４である。

ＩＩｂ−４
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
いくつかの実施例では、カーゴ部位は環状であり、細胞膜透過性ペプチド部位は環状であり、これらは共に縮合二環式環を形成し、化合物は式ＩＩｃである。

ＩＩｃ
式中、カーゴ部位は式ＩＩで規定した通りであり、かつＡＡ１〜ＡＡ９、ｍ、ｎ、及びｐは式Ｉで規定した通りである。
式ＩＩｃのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは０であり、化合物は式ＩＩｃ−１である。

ＩＩｃ−１
式中、ＡＡ１〜ＡＡ６は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩｃのいくつかの実施例では、ｍは１、ｎ及びｐは０であり、化合物は式ＩＩｃ−２である。

ＩＩｃ−２
式中、ＡＡ１〜ＡＡ７は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩｃのいくつかの実施例では、ｍ及びｎは１、ｐは０であり、化合物は式ＩＩｃ−３である。

ＩＩｃ−３
式中、ＡＡ１〜ＡＡ８は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
式ＩＩｃのいくつかの実施例では、ｍ、ｎ、及びｐは１であり、化合物は式ＩＩｃ−４である。

ＩＩｃ−４
式中、ＡＡ１〜ＡＡ９は式Ｉで規定した通りであり、カーゴは式ＩＩで規定した通りである。
いくつかの実施例では、化合物は表６の化合物のいずれかを含むことができる。更なる例を以下の表１８に示す。




＊Ｆｐａ，Σ：Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン；Ｐｉｐ，Θ：Ｌ−ホモプロリン；Ｎｌｅ，Ω：Ｌ−ノルロイシン；Ｐｈｇ，Ψ Ｌ−フェニルグリシン；Ｆ２Ｐｍｐ，Λ：Ｌ−４−（ホスホノジフルオロメチル）フェニルアラニン；Ｄａｐ，Ｊ：Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎａｌ，Φ’：Ｌ−β−ナフチルアラニン；Ｐｐ，θ：Ｌ−ピペコリン酸；Ｓａｒ，Ξ：サルコシン；Ｔｍ＝トリメシン酸；Φ＝Ｌ−２−ナフチルアラニン；Ｒｈｏ＝ローダミンＢ；Ｄｅｘ＝デキサメタゾン；ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネート；ｍｉｎｉＰＥＧ＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；ｐＣＡＰ＝ホスホクマリンアミノプロピオン酸；Ａｍｃ＝７−アミノ−４−メチルクマリン；ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネート；Ｕ＝２−アミノ酪酸。
本明細書で記載される化合物を含む組成物もまた、本明細書で開示される。
開示した化合物の製薬上許容できる塩及びプロドラッグもまた、本明細書で開示される。製薬上許容できる塩としては、化合物に見られる特定の置換基に応じて酸または塩基により調製される、開示された化合物の塩が挙げられる。本明細書にて開示された化合物が、安定した無毒性の酸または塩基塩を形成するのに十分酸性または塩基性である条件下において、化合物を塩として投与することを適切とすることができる。製薬上許容できる塩基添加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、またはマグネシウム塩が挙げられる。生理学的に許容できる酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、炭酸、硫酸、及び有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、安息香酸、コハク酸、フマル酸、マンデル酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、マロン酸、アスコルビン酸、α−ケトグルタル酸、α−グリコリン酸（ｇｌｙｃｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、マレイン酸、トシル酸、メタンスルホン酸等）が挙げられる。したがって、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、マロン酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、α−グリコリン酸塩、マレイン酸塩、トシル酸塩、及びメタンスルホン酸塩を本明細書にて開示する。化合物の製薬上許容できる塩は、当該技術分野において周知の手順を用いて、例えば、アミン等の十分に塩基性の化合物を、好適な酸と反応させて生理学的に許容できるアニオンを得ることにより、入手することができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えばナトリウム、カリウムもしくはリチウム）塩、またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩もまた作製することが可能である。
作製方法
本明細書で記載される化合物は、有機合成またはその変法（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）の当業者により周知の種々の方法により、当業者が理解する通りに調製することができる。本明細書で記載される化合物は、速やかに入手可能な出発材料から調製可能である。最適な反応条件は使用する特定の反応物質または溶媒によって変化し得るが、かかる条件は当業者により決定されることができる。
本明細書で記載される化合物の変形形態としては、各化合物について記載した種々の成分の添加、除外、または移動が挙げられる。同様に、１つ以上のキラル中心が分子内に存在する場合、分子のキラリティを変更することができる。更に、化合物の合成には、種々の化学基の保護及び脱保護を伴うことができる。保護及び脱保護の使用、及び適切な保護基の選択は、当業者により決定されることができる。保護基の化学的性質は、例えば、Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００６に見出すことができ、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
開示した化合物及び組成物の調製で用いられる出発物質及び試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）、Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｗｙｅｔｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｌｉｌｌｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、Ａｂｂｏｔｔ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）、もしくはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の市販の業者から入手されるか、またはＦｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−１７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏｄｄ’ｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４０（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）；及びＬａｒｏｃｋ’ｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，１９８９）等の参考文献で説明される手順に従って、当業者に知られている方法で調製されるかのいずれかである。本明細書にて開示した医薬担体等のその他の物質は、民間の供給元から得ることができる。
本明細書で記載される化合物を生成するための反応は溶媒中で実施することができ、溶媒は有機合成の当業者により選択されることができる。溶媒は実質的に、反応が実施される条件（即ち温度及び圧力）下にて、出発物質（反応物質）、中間体、または生成物とは非反応性であることができる。反応は１つの溶媒、または２つ以上の溶媒の混合物中で実施することができる。生成物または中間体の形成は、当該技術分野において公知の任意の好適な方法に従い監視することができる。例えば、生成物の形成は、核磁気共鳴分光法（例えば１Ｈもしくは１３Ｃ）、赤外分光法、分光測光法（例えばＵＶ〜可視光）等の分光分析方法、または質量分析、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにより監視することができる。
開示される化合物はペプチド固相合成法により調製することができ、アミノ酸のα−Ｎ末端は酸または塩基保護基により保護される。かかる保護基は、生長するペプチド鎖を破壊することなく、またはペプチド鎖内のキラル中心のいずれかのラセミ化を行うことなく速やかに除去可能でありながら、ペプチド結合形成の条件に対して安定である性質を有しなければならない。好適な保護基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ビフェニルイソプロピロキシカルボニル、ｔ−アミロキシカルボニル（ａｍｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、イソボルニロキシカルボニル（ｉｓｏｂｏｒｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジロキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシカルボニル等である。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基は、開示した化合物の合成に特に好ましい。他の好ましい側鎖保護基は、リジン及びアルギニン等の側鎖アミノ基に関しては、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼンスルホニル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、及びアダマンチルオキシカルボニル；チロシンに関しては、ベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシ−カルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロペンチル及びアセチル（Ａｃ）；セリンに関しては、ｔ−ブチル、ベンジル及びテトラヒドロピラニル；ヒスチジンに関しては、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、ｐ−トルエンスルホニル及び２，４−ジニトロフェニル；トリプトファンに関しては、ホルミル；アスパラギン酸及びグルタミン酸に関しては、ベンジル及びｔ−ブチル；並びに、システインに関してはトリフェニルメチル（トリチル）である。ペプチド固相合成法では、α−Ｃ末端のアミノ酸は好適な固体支持体または樹脂に結合される。上記合成に有用な、好適な固体支持体は、段階的な縮合脱保護反応の試薬及び反応条件に対して不活性であり、使用する媒体に不溶性である材料である。α−Ｃ末端カルボキシペプチドの合成のための固体支持体は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）から入手可能な４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリマー（スチレン−１％ジビニルベンゼン）または４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミドエチル樹脂である。α−Ｃ末端アミノ酸は樹脂に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）またはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロリド（ＢＯＰＣｌ）と共にまたはそれら無しで、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはＯ−ベンゾトリアゾール１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を用いた、ジクロロメタンまたはＤＭＦ等の溶媒中での、１０℃〜５０℃の温度にて約１〜２４時間の媒介カップリングにより結合される。固体支持体が４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂である場合、Ｆｍｏｃ基は二級アミン、好ましくはピペリジンにより、上述のα−Ｃ末端アミノ酸とのカップリングの前に切断される。脱保護した４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂へのカップリングの１方法は、ＤＭＦ中のＯ−ベンゾトリアゾール１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。連続した、保護アミノ酸のカップリングは自動ポリペプチドシンセサイザー内で実施することができる。一実施例において、生長ペプチド鎖のアミノ酸のα−Ｎ末端はＦｍｏｃで保護される。生長ペプチドのα−Ｎ末端側からＦｍｏｃ保護基を除去することは、二級アミン、好ましくはピペリジンによる処理で達成される。保護した各アミノ酸を次に、約３倍モル超過の中に導入し、カップリングは好ましくはＤＭＦ中で実施される。カップリング剤はＯ−ベンゾトリアゾール１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）であることができる。固相合成の最後に、樹脂からポリペプチドを除去して、連続して、または単一の操作のいずれかで脱保護する。ポリペプチドの除去及び脱保護は、樹脂に結合したポリペプチドを、チオアニソール、水、エタンジチオール及びトリフルオロ酢酸を含む切断試薬で処理することにより単一操作で達成可能である。ポリペプチドのα−Ｃ末端がアルキルアミドである場合は、樹脂はアルキルアミンのアミノリシスにより切断される。あるいは、ペプチドは、例えばメタノールによるエステル交換、続いてアミノリシスまたは直接アミド基転移により除去されることができる。保護されたペプチドはこの時点で精製されるか、または次工程に直接持ち込まれる。側鎖保護基の除去は、上記切断カクテルを用いて達成することができる。完全に脱保護されたペプチドは、以下の種類：弱い塩基性樹脂上でのイオン交換（酢酸形）；非誘導体化ポリスチレン−ジビニルベンゼン（例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ）での疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロースでのイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、ＬＨ−２０または向流分配）；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（特に、オクチルまたはオクタデシルシリルシリカ結合相カラム充填での逆相ＨＰＬＣ）のいずれかまたは全てを用いるクロマトグラフ工程の順序により精製することができる。
使用方法
本明細書で記載される化合物または組成物の使用方法もまた、本明細書で提供される。必要な対象において、該対象に、本明細書で記載される有効量の化合物または組成物のいずれかを投与することを含む、疾病または病状の治療方法もまた、本明細書で提供される。
本明細書においては、対象における癌の治療、予防、または緩和方法もまた提供される。本方法は、本明細書で記載される有効量の１つ以上の化合物もしくは組成物、または薬剤として許容されるその塩を対象に投与することを含む。本明細書に記載される化合物及び組成物、または薬学的に許容可能なそれらの塩類は、ヒト、例えば小児集団及び高齢者集団、並びに動物、例えば獣医学用途での癌治療に有用である。開示した方法は所望により、癌治療が必要な、または必要な可能性のある患者を識別することを含むことができる。本明細書に記載される化合物及び組成物により治療可能な癌の種類の例としては、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、子宮頚癌、胃腸癌、泌尿生殖器癌、頭頸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎癌、皮膚癌、及び睾丸癌が挙げられる。更なる実施例としては、肛門、胆管、骨、骨髄、腸（結腸及び直腸を含む）、目、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、子宮頸、中皮腫、神経内分泌系、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰、子宮、肝臓、筋肉、血液細胞（リンパ球及び他の免疫系細胞を含む）の癌及び／または腫瘍が挙げられる。本明細書に記載される化合物及び組成物により治療可能な癌の更なる例としては、癌、カポジ肉腫、黒色腫、中皮腫、軟部組織肉腫、膵臓癌、肺癌、白血病（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病ほか）、並びにリンパ腫（ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、並びに多発性骨髄腫が挙げられる。
本明細書で記載される癌の治療または予防方法は更に、１つ以上の追加の作用物質（例えば抗癌剤または電離放射線）を含むことができる。本明細書に記載した１つ以上の追加の作用物質並びに化合物及び組成物、または薬学的に許容可能なそれらの塩類は、同時投与、及び最大数日間隔での、一時的に間隔の開いた順序を含む任意の順序で投与されることができる。本方法はまた、１つ以上の追加の、本明細書に記載した作用物質並びに／または化合物及び組成物、もしくは薬学的に許容可能なそれらの塩類の２回以上の投与も含むことができる。本明細書に記載した、１つ以上の追加の作用物質並びに化合物及び組成物、または薬学的に許容可能なそれらの塩類の投与は、同一または異なる経路とすることができる。１つ以上の追加の作用物質で治療をする場合、本明細書に記載した化合物及び組成物、または薬学的に許容可能なそれらの塩類を組み合わせて、１つ以上の追加の作用物質を含む医薬組成物にすることができる。
例えば、本明細書に記載した化合物もしくは組成物、または薬学的に許容可能なそれらの塩類を組み合わせて、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−ＣｄＡ、２−クロロデオキシアデノシン、５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アキュテイン、アクチノマイシン−Ｄ、アドリアマイシン、アドルシル、アグリリン、Ａｌａ−Ｃｏｒｔ、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ、アルケラン、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸、αインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、アラネスプ、アレディア、アリミデックス、アロマシン、三酸化砒素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡ、アバスチン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス、Ｃ２２５、ロイコボリンカルシウム、キャンパス、カンプトサール、カンプトテシン−１１、カペシタビン、Ｃａｒａｃ、カルボプラチン、カルムスチン、カルマスティンウエハー、カソデックス、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボルム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン、シタラビン、シタラビンリポソーム、シトサール−Ｕ、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンα、ダウノマイシン、ダウノルビシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ、デカドロン、デルタ−コルテフ、デルタソン、デニロイキンジフチトクス、ＤｅｐｏＣｙｔ、デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、デキサソン、デクスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、Ｄｉｏｄｅｘ、ドセタキセル、ドキシル、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、ドロキシア、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ、デュラロン、エフディクス、エリガード、エレンス、エロキサチン、Ｅｌｓｐａｒ、Ｅｍｃｙｔ、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルビタックス、エルウィニア Ｌ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール、エトポフォス、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン、エビスタ、エキセメスタン、フェアストン、フェソロデックス、フェマーラ、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラ、フルダラビン、フルオロプレックス、フルオロウラシル、フルオロウラシル（クリーム）、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、ＦＵＤＲ、フルベストラント、Ｇ−ＣＳＦ、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール、グリベック、リュープリン、リュープリンデポ、マチュレーン、マキシデックス、メクロレタミン、メクロレタミンヒドロクロリン、メドラロン、メドロール、メゲース、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、ミロセル、レトロゾール、ネオサール、ニューラスタ、ニューメガ、ニューポジェン、ニランドロン、ニルタミド、ナイトロジェンマスタード、ノバルデックス、ノバントロン、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンコスパー、オンコビン、Ｏｎｔａｋ、Ｏｎｘａｌ、オプレルベキン、オラプレド、オラソン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、パンレチン、パラプラチン、ペジアプレッド、ＰＥＧインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−イントロン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、フェニルアラニンマスタード、プラチノール、プラチノール−ＡＱ、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン、プロカルバジン、プロロイキン、カルムスチンインプラントを有するプロリフェプロスパン２０、プリントール、ラロキシフェン、リウマトレックス、リツキサン、リツキシマブ、ロベロン−Ａ（インターフェロンα−２ａ）、ルベックス、塩酸ルビドマイシン、サンドスタチン、サンドスタチンＬＡＲ、サルグラモスチム、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ、ソル・メドロール、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タルグレチン、タキソール、タキソテール、テモダール、テモゾロミド、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、サロミド、ＴｈｅｒａＣｙｓ、チオグアニン、チオグアニンタブロイド、チオホスフォアミド、チオプレックス、チオテパ、ＴＩＣＥ、トポサール、トポテカン、トレミフェン、トラスツズマブ、トレチノイン、トレクサール、トリセノックス、ＴＳＰＡ、ＶＣＲ、Ｖｅｌｂａｎ、ベルケード、ベプシド、ベサノイド、Ｖｉａｄｕｒ、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、Ｖｉｎｃａｓａｒ Ｐｆｓ、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＰ−１６、Ｖｕｍｏｎ、ゼローダ、ザノサール、ゼヴァリン、ザインカード、ゾラデックス、ゾレドロン酸、ゾメタ、ギリアデルウエハー、グリベック、ＧＭ−ＣＳＦ、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子、ハロテスチン、ハーセプチン、ヘキサドロール、ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン、ハイドレア、ヒドロコルチゾン酢酸エステル、ハイドロコルチゾン、ハイドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ハイドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、リン酸ヒドロコルトン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダマイシン、イダルビシン、アイフェックス、ＩＦＮ−α、イホスファミド、ＩＬ−２、ＩＬ−１１、メシル酸イマチニブ、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（インターフェロンα−２ｂ）、ロイコボリン、リューケラン、リューカイン、ロイプロリド、ロイコクリスチン、ロイスタチン、リポソーム化Ａｒａ−Ｃ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｐｒｅｄ、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、メチコルテン、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、マイトキサントロン、Ｍ−プレドニゾール、ＭＴＣ、ＭＴＸ、ムスタルゲン、ムスチン、マイトマイシン、マイレラン、イレッサ、イリノテカン、イソトレチノイン、キドロラーゼ、ラナコルト、Ｌ−アスパラギナーゼ、及びＬＣＲ等の追加の抗癌剤を有する医薬組成物にすることができる。追加の抗癌剤はまた、例えば抗体等のバイオ製剤も含むことができる。
多くの腫瘍及び癌は、腫瘍または癌細胞内に存在するウイルスゲノムを有する。例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）は多数の哺乳類の悪性腫瘍と関係している。本明細書にて開示された化合物はまた、細胞の形質転換を引き起こすウイルスに感染した治療を治療するために、かつ／または細胞内にウイルスゲノムが存在していることと関係した腫瘍もしくは癌を有する患者を治療するために、単独で使用することもでき、または、ガンシクロビル、アジドチミジン（ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ）等の抗癌剤または抗ウイルス薬と組み合わせて使用することもできる。本明細書にて開示された化合物はまた、ウイルス性腫瘍疾病の治療と組み合わせて使用することもできる。
対象内における腫瘍細胞の殺傷方法もまた本明細書で記載する。本方法は、腫瘍細胞を、本明細書に記載した有効量の化合物または組成物と接触させることを含み、所望により、腫瘍細胞を有効量の電離放射線で照射する工程を含む。更に、腫瘍の放射線治療方法を本明細書において提供する。本方法は、腫瘍細胞を、本明細書に記載した有効量の化合物または組成物と接触させること、及び腫瘍を有効量の電離放射線で照射することを含む。本明細書で使用する場合、電離放射線とは、核相互作用により電離を生み出すのに十分なエネルギーを有する、または十分なエネルギーを生成することができる粒子または光子を含む放射線を意味する。電離放射線の例はＸ線である。有効量の電離放射線とは、本明細書で記載される化合物と組み合わせて投与した場合に、細胞の損傷または殺傷の増加をもたらす用量の電離放射線を意味する。電離放射線は、放射性標識した抗体及び放射性同位体を投与することを含む、当技術分野において既知の方法に従い送達されることができる。
本明細書に記載した方法及び化合物は、予防的処置及び治療的処置の両方に有用である。本明細書で使用する場合、用語「治療すること」または「治療」は、予防；発症の遅延；発症後の徴候または症状の減少、根絶、または遅延；及び再発の予防を含む。予防的使用に関して、本明細書に記載した治療に有効な量の化合物及び組成物、または薬学的に許容可能なそれらの塩類は、発症の前（例えば、癌の明白な徴候の前）、発症初期の間（例えば癌の初期の徴候及び症状の際）、または癌の確立した発症の後で、対象に投与される。予防的投与は、感染症の症状の発現の数日〜数年前に行うことが可能である。予防的投与は例えば、前癌性病変を示す対象、初期段階の悪性腫瘍と診断された対象、並びに特定の癌に罹りやすい亜群（例えば家族、人種的亜群、及び／または職業的亜群）の化学的予防治療において使用することができる。治療的処置には、癌が診断された後で、本明細書に記載した治療に有効な量の化合物及び組成物、または薬学的に許容可能なそれらの塩類を対象に投与することが伴う。
対象における癌または腫瘍の治療、予防または緩和方法の実施例において、対象に投与される化合物または組成物は、Ｒａｓ（例えばＫ−Ｒａｓ）、ＰＴＰ１Ｂ、Ｐｉｎ１、Ｇｒｂ２ ＳＨ２、またはこれらの組み合わせに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。
開示した主題はまた、代謝異常または条件を有する対象の治療方法にも関する。一実施形態では、本明細書にて開示した、有効量の１つ以上の化合物または組成物は、代謝異常を有し、その治療を必要としている対象に投与される。いくつかの実施例では、代謝異常は２型糖尿病を含むことができる。対象における代謝異常の治療、予防または緩和方法のいくつかの実施例では、対象に投与される化合物または組成物は、ＰＴＰ１Ｂに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。本方法のある特定の実施例においては、対象は肥満症であり、本方法は、本明細書にて開示する組成物を投与することにより、肥満症の対象を治療することを含む。
開示した主題はまた、免疫不全または状態を有する対象の治療方法にも関する。一実施形態では、本明細書にて開示した、有効量の１つ以上の化合物または組成物は、免疫不全を有し、その治療を必要としている対象に投与される。対象における免疫不全の治療、予防または緩和方法のいくつかの実施例では、対象に投与される化合物または組成物は、Ｐｉｎ１に対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。
開示した主題はまた、嚢胞性線維症を有する対象の治療方法にも関する。一実施形態では、本明細書にて開示した、有効量の１つ以上の化合物または組成物は、嚢胞性線維症を有し、その治療を必要としている対象に投与される。対象における嚢胞性線維症の治療方法のいくつかの実施例では、対象に投与される化合物または組成物は、ＣＡＬ ＰＤＺに対する阻害剤として機能することができる標的部位を含むことができる治療用部位を含むことができる。
投与組成物、投与配合物、及び投与方法
開示した化合物、及び化合物を含有する組成物のｉｎ ｖｉｖｏ適用は、当業者に現在知られている、または将来知られることになる任意の好適な方法及び技術により達成することができる。例えば、開示された化合物は、生理学的に、または製薬上許容できる形態で配合されることができ、例えば経口、経鼻、直腸、局所、及び非経口の投与経路を含む、当該技術分野において公知の任意の好適な経路により投与されることができる。本明細書で使用する場合、用語「非経口の」には、注射等による皮下、皮内、静脈内、筋肉内、腹腔内、及び胸骨内投与を含む。開示される化合物または組成物の投与は単回投与でも、連続または異なる間隔で投与されることも可能であり、これらは当業者により容易に決定されることができる。
本明細書にて開示された化合物、及び化合物を含む組成物はまた、リポソーム技術、持続放出カプセル、埋め込み可能なポンプ、及び生分解性容器を利用して投与されることもできる。これらの送達方法は、長期間にわたり均一な用量を効果的に提供することができる。化合物はまた、その塩誘導体の形態または結晶形態でも投与されることができる。
本明細書にて開示された化合物は、製薬上許容できる組成物を調製するための既知の方法に従い配合することができる。配合物は多数の出典に詳細に記述されており、これらは当業者に周知であり、容易に入手可能である。例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（１９９５）は、開示した方法と組み合わせて使用可能な配合物について記載している。一般に、本明細書にて開示された化合物は、化合物の効果的な投与を促進するために、有効量の化合物を好適な担体と組み合わせて配合可能である。使用する組成物は種々の形態とすることもできる。これらとしては、例えば、固体、半固体、及び液体用量剤形、例えば錠剤、丸薬、粉末、溶液、または懸濁液、座薬、注射可能及び注入可能な溶液、並びにスプレーが挙げられる。好ましい形態は、意図する投与方法及び治療用途に依存する。組成物はまた、好ましくは当業者に知られている従来の製薬上許容できる担体及び希釈剤も含む。化合物と共に用いるための担体または希釈剤の例としては、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルミナ、デンプン、生理食塩水、並びに等価な担体及び希釈剤が挙げられる。所望の治療用処置用のかかる用量の投与を提供するために、本明細書にて開示した組成物は、担体及び希釈剤を含む全組成物の重量を基準にして、合計重量が約０．１〜１００％の主題化合物の１つ以上を効果的に含むことができる。
投与に好適な配合物としては、例えば、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び配合物に目的のレシピエント血液と等張性となるような溶質を含むことができる滅菌注射水溶液；並びに沈殿防止剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水滅菌懸濁液を含有することができる。配合物は単一用量または複数用量の容器、例えば密封アンプル及びバイアルに存在することが可能であり、使用前に滅菌液担体、例えば注射用水の条件のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件にて保存可能である。即席の注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤等から調製可能である。上で特に述べた成分に加えて、開示された組成物は、問題の配合物の種類を考慮して、当該技術分野においては従来の他の作用物質を含むことができると理解されるべきである。
本明細書にて開示した化合物、及び化合物を含む組成物は、細胞との直接接触により、または担体手段を介して、のいずれかにより、細胞に送達されることができる。細胞の化合物及び組成物を送達する担体の手段は当技術分野において既知であり、例えば、組成物をリポソーム部位に封入することが挙げられる。本明細書にて開示した化合物及び組成物を細胞に送達するための別の手段は、化合物を、標的細胞への送達を目標としたタンパク質または核酸に結合させることを含む。米国特許第６，９６０，６４８号、並びに米国特許出願第２００３００３２５９４号及び同２００２０１２０１００号は、別の組成物に結合可能であり、生物膜を通して組成物を転座できるアミノ酸配列について開示している。米国特許出願第２００２００３５２４３号はまた、細胞内送達のために、細胞膜を通して生物学的部を転座するための組成物についても記載している。化合物はポリマー中に組み込むこともまた可能であり、この例としては、頭蓋内腫瘍用のポリ（Ｄ−Ｌラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマー；２０：８０のモル比の、ポリ［ビス−（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン：セバシン酸（ギリアデルにて使用される）；コンドロイチン；キチン；及びキトサンが挙げられる。
腫瘍疾患の治療に関して、本明細書にて開示された化合物を、他の抗腫瘍もしくは抗癌物質と組み合わせて、並びに／または放射線及び／もしくは光線力学的治療により、並びに／または腫瘍を取り除くための外科治療と共に、治療の必要な患者に投与することができる。これらその他の物質または治療は、本明細書にて開示された化合物と同時に、または異なる時間にて与えられることができる。例えば、本明細書にて開示された化合物は、タキソールもしくはビンブラスチン等の分裂抑制剤、シクロホスファミドもしくはイホスファミド等のアルキル化剤、５−フルオロウラシルもしくはヒドロキシ尿素等の抗代謝剤、アドリアマイシンもしくはブレオマイシン等のＤＮＡインターカレーター、エトポシドもしくはカンプトテシン等のトポイソメラーゼ阻害剤、アンギオスタチン等の血管新生阻害剤、タモキシフェン等の抗エストロゲン薬、並びに／または、例えばそれぞれグリベック（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）といった他の抗癌剤もしくは抗体、またはイピリムマブ及びボルテゾミブ等の免疫治療薬と組み合わせて使用することができる。
特定の実施例において、本明細書にて開示した化合物及び組成物は、所望により、不活性希釈剤等の製薬上許容できる担体と組み合わせて、不必要な細胞増殖の部位等の、１つ以上の解剖学的部位にて局所的に投与されることができる（腫瘍部位または良性の皮膚腫瘍等、例えば腫瘍または皮膚腫瘍に注射または局所適用される）。本明細書にて開示した化合物及び組成物は、所望により不活性希釈剤等の製薬上許容できる担体、または経口送達用の吸収可能な食用担体と組み合わせて、静脈内または経口投与により全身に投与されることができる。これらはハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されることができるか、圧縮して錠剤にすることができるか、または患者の食事の食物と共に直接取り込まれることができる。経口での治療用投与に関して、活性化合物は１つ以上の賦形剤と組み合わせることができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハース、エアゾールスプレー等の形態で使用される。
開示された組成物は生体適合性であり、経口送達が可能である。口腔用組成物は錠剤、トローチ剤、丸薬、カプセル等であることができ、以下を含有することもまたできる：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤；リン酸２カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、馬鈴薯澱粉、アルギン酸等の崩壊剤；マグネシウムステアリン酸等の潤滑剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテーム等の甘味剤。またはペパーミント、冬緑油、もしくはチェリーフレーバリング等の着香剤もまた加えることができる。単位剤形がカプセルである場合、上の種類の材料に加えて、一定の液体担体、例えば植物油またはポリエチレングリコールを含有することができる。種々の他の材料がコーティング剤として、または別様においては固体単位剤形の物理的形態を変形するために存在することができる。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルを、ゼラチン、ワックス、セラック、または糖等でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、染料、並びにチェリーまたはオレンジフレーバー等のフレーバリングを含有することができる。もちろん、任意の単位剤形の調製で用いる任意の材料は製薬上許容できるものであり、用いる量において実質的に無毒性でなければならない。更に、活性化合物は持続放出調製物及びデバイスに組み込まれることができる。
製薬上許容できる塩またはそのプロドラッグを含む、本明細書にて開示した化合物及び組成物は、注入または注射により、静脈内、筋肉内、または腹腔内投与が可能である。活性剤またはその塩の溶液は水中で調製することができ、所望により無毒性界面活性剤と混合することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びこれらの混合物内並びに油中で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有することができる。
注入または注射に好適な薬剤の投薬形態は、有効成分を含む滅菌水溶液もしくは分散液、または滅菌粉末を含むことができ、これらは無菌注射または注入可能な溶液または分散液の即席調製に適しており、所望によりリポソームに封入される。最終的な剤形は、製造及び保存条件下にて滅菌されており、液体でありかつ安定していなければならない。液体担体またはビヒクルは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、無毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む、溶媒または液体分散媒であることができる。適切な流動性は、例えばリポソームの形成により、分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、または界面活性剤の使用により維持することができる。所望により、微生物の作用の防止は、種々の他の抗菌及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらされることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらされることができる。
無菌注射可能な溶液は、好適な溶媒中にある、本明細書にて開示した必要量の化合物及び／または作用物質に、上で列挙した種々の他の成分を組み込み、必要により、続いて濾過滅菌を行うことにより調製される。無菌注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合は、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより有効成分の粉末に加えて、予め滅菌濾過した溶液に存在する、任意の追加の所望成分が得られる。
局所投与に関しては、本明細書にて開示した化合物及び作用物質は、液体または固体として適用することができる。しかし、固体または液体であることができる、皮膚科学的に許容できる担体と組み合わせて、化合物及び作用物質を組成物として皮膚に局所投与することが通常望ましい。本明細書にて開示した化合物及び作用物質及び組成物を対象の皮膚に局所適用して、悪性もしくは良性腫瘍のサイズを減少（完全な除去を含めることができる）するか、または感染部位を治療することができる。本明細書にて開示した化合物及び作用物質は、腫瘍または感染部位に直接適用することができる。好ましくは、化合物及び作用物質は、例えば軟膏、クリーム、ローション、溶液、チンキ剤等の剤形で腫瘍または感染部位に適用される。
有用な固体担体としては、微粉化した固体、例えばタルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等が挙げられる。有用な液状担体としては水、アルコール、もしくはグリコール、または水−アルコール／グリコールのブレンドが挙げられ、これらの中で、所望により無毒性界面活性剤を使用して、化合物は効果的な濃度で溶解または分散されることができる。香料及び追加の抗菌剤といったアジュバントを添加して、所与の使用のための性質を最適化することができる。得られる液体組成物は、例えば吸水パッドとして貼り付け可能であるか、包帯及び他の包帯剤に含浸するのに使用可能であるか、またはポンプ型もしくはエアゾール噴霧器を使用して患部にスプレー可能である。
合成ポリマー、脂肪酸、酸性塩及びエステル、脂肪族アルコール、変性セルロースまたは変性無機質材料等の増粘剤もまた、液状担体と共に使用して、使用者の皮膚への直接塗布のために展延可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸等を形成することができる。
本明細書にて開示した化合物及び作用物質及び医薬組成物の有用な用量は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性と動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定可能である。マウス及び他の動物における効果的な用量をヒト用に推定する方法は、当業者に既知である。
組成物の投与のための用量範囲は、症状または疾患が影響を受ける所望の効果を生み出すのに十分な多さである。用量は、例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー型反応等の有害な副作用を引き起こす程多いものであってはならない。一般に、用量は年齢、状態、性別、及び患者の疾患の程度と共に変化し、当業者により決定することができる。用量は、任意の禁忌の場合には個々の医師により調節されることができる。用量は変えることができ、１日または数日間で毎日、１回以上の用量投与で投与されることができる。
製薬上許容できる担体と組み合わせた、本明細書にて開示した化合物を含む医薬組成物もまた開示されている。経口、局所または非経口的投与に適した、一定量の化合物を含む医薬組成物は、好ましい態様を構成する。患者、特にヒトに投与される用量は、致死毒性なしに妥当な時間枠で、患者にて治療応答を達成するのに十分なものでなければならず、許容レベルを超える副作用または罹患を引き起こさないのが好ましい。当業者は、用量は、対象の状態（健康）、対象の体重、存在する場合は平行した治療の種類、治療頻度、治療可能比、並びに病状の重症度及び段階を含む種々の要因に依存することを理解するであろう。
１つ以上の容器に本明細書にて開示した化合物を含むキットもまた開示されている。開示したキットは所望により、製薬上許容できる担体及び／または希釈剤を含むことができる。一実施形態では、キットは、本明細書に記載した１つ以上の他の成分、添加剤、またはアジュバントを含む。別の実施形態において、キットは、本明細書で記載される作用物質等の、１つ以上の抗癌剤を含む。一実施形態では、キットは、キットの化合物または組成物の投与方法を説明する取扱説明書またはパッケージ材料を含む。キットの容器は、任意の好適な材料、例えばガラス、プラスチック、金属等であることができ、かつ任意の好適なサイズ、形状、または構成であることができる。一実施形態では、本明細書にて開示した化合物及び／または作用物質は、固体、例えば錠剤、丸薬、または粉末形態としてキット内で提供される。別の実施形態において、本明細書にて開示した化合物及び／または作用物質は、キット内で液体または溶液として提供される。一実施形態では、キットは、液体または溶液形態で、本明細書にて開示した化合物及び／または作用物質を含有するアンプルまたはシリンジを含む。
多数の本発明の実施形態を説明してきた。しかし、本発明の精神及び範囲から逸脱することなしに、種々の変形を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
以下の実施例は、開示した主題に係る方法及び結果を示すために説明される。これらの実施例は、本明細書にて開示した主題の全ての態様を含むことを目的とせず、むしろ、例示的な方法及び結果を示すことを目的とする。これらの実施例は、当業者に明らかである等価物及び変形形態を除外することを目的としない。
数（例えば量、温度等）に関して、正確性を確保するための努力がなされたが、若干の誤差及びずれは考慮されなければならない。特に指示がない限り、部は重量部であり、温度は摂氏（℃）または周囲温度であり、かつ圧力は大気圧またはその付近である。反応条件、例えば成分濃度、温度、圧力、及び他の反応範囲、並びに、生成物の純度、及び記載されたプロセスから得られる収率を最適化することができる条件には、多数の変化及び組み合わせが存在する。かかるプロセス条件を最適化するには、妥当かつ定型化した実験が必要なだけある。
実施例１
環状ヘプタペプチドシクロ（ＦΦＲＲＲＲＱ）（ｃＦΦＲ４、式中ΦはＬ−２−ナフチルアラニンである）が、哺乳類細胞に効率的に内在化されることが見出された。本研究では、内在化メカニズムは、薬理学的作用物質及び遺伝子変異を導入することで、種々のエンドサイトーシスの事象を乱すことにより調査した。結果は、ｃＦΦＲ４は膜のリン脂質に直接結合することができ、エンドサイトーシスによりヒト癌細胞に内在化することができ、かつ初期エンドソームから細胞質に移動することができることを示している。カーゴ能力は、低分子染料、状態が様々に変化した直鎖及び環状ペプチド、並びにタンパク質を含む多種多様の分子により調査した。カーゴの性質に応じて、カーゴは環内（ｃＦΦＲ４環内へのカーゴの挿入）、環外（Ｇｌｎ側鎖へのカーゴの結合）、または二環式アプローチ（ｃＦΦＲ４と環状カーゴ環の縮合）により送達されてよい。ｃＦΦＲ４の全体的な送達効率（即ち、カーゴの細胞質及び核への送達）は、非アルギニン（Ｒ９）、ＨＩＶ Ｔａｔ由来のペプチド（Ｔａｔ）、またはペネトラチン（Ａｎｔｐ）の効率よりも４〜１２倍高かった。優れた血清安定性、最少の毒性、及び合成の実施容易性と合わさった高い送達効率は、ｃＦΦＲ４を、細胞内カーゴ送達のための有用なトランスポーターに、及びエンドソームエスケープのメカニズムを調査するための好適なシステムにする。
導入
原形質膜は、特にペプチド、タンパク質及び核酸等の生物学的製剤に対する薬剤発見において、大きな課題を提示している。膜障壁を破壊して生物学的製剤を細胞内に送達する、１つの見込みのある方法は、生物学的製剤に「細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）」を結合させることである。ＨＩＶの転写のトランス活性化因子（Ｔａｔ）が哺乳類細胞に内在化して、ウイルス性複製を活性化することが１９８０年代後半に初めて見つかって以来（Ｆｒａｎｋｅｌ，ＡＤ ａｎｄ Ｐａｂｏ，ＣＯ．Ｃｅｌｌ，１９８８，５５，１１８９−１１９３；Ｇｒｅｅｎ，Ｍ ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，ＰＭ．Ｃｅｌｌ，１９８８，５５，１１７９−１１８８）、６〜２０個の残基を有する多数のＣＰＰが報告されている（Ｌａｎｇｅｌ，U．Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１，ｐ ｘｖ；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｎ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０１０，５８４，１８０６−１８１３；Ｆｕｔａｋｉ，Ｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，２００５，５７，５４７−５５８；Ｓｔｅｗａｒｔ，ＫＭ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８，６，２２４２−２２５５；Ｄｅｓｈａｙｅｓ，Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２００５，６２，１８３９−１８４９；Ｇｏｕｎ，ＥＡ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００５，７，１４９７−１５１５）。ＣＰＰは、低分子作用物質（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０００，６，１２５３−１２５７；Ｎｏｒｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００３，１４，４４−５０）、ＤＮＡ（Ｈｏｙｅｒ，Ｊ ａｎｄ Ｎｅｕｎｄｏｒｆ，Ｉ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２０１２，４５，１０４８−１０５６；Ｅｇｕｃｈｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６，２６２０４−２６２１０）、ＲＮＡ（Ｎａｋａｓｅ，Ｉ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２０１２，４５，１１３２−１１３９；Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ，ＳＥ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１１，３９，３９７２−３９８７；Ｊｅｏｎｇ，ＪＨ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００９，２０，５−１４；Ｍｕｒａｔｏｖｓｋａ，Ａ ａｎｄ Ｅｃｃｌｅｓ，ＭＲ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２００４，５５８，６３−６８）、タンパク質（Ｗａｄｉａ，ＪＳ ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ，ＳＦ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，２００５，５７，５７９−５９６；Ｐｏｏｇａ，Ｍ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２００１，１５，１４５１−１４５３；Ｓｃｈｗａｒｚｅ，ＳＲ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８５，１５６９−１５７２）、及びナノ粒子（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１９９９，１０，１８６−１９１；Ｇｕｐｔａ，Ｂ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，２００５，５７，６３７−６５１；Ｌｉｕ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，２，３６２−８）を、共有結合または静電会合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のいずれかにより哺乳類細胞及び組織に送達するために使用されてきた。多くのＣＰＰは、生理学的に関係のある濃度において、最少の毒性及び免疫原性を示し（Ｓａａｒ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００５，３４５，５５−６５；Ｓｕｈｏｒｕｔｓｅｎｋｏ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１１，２２，２２５５−２２６２）、特定の非天然アミノ酸の導入（Ｒｕｅｐｉｎｇ，Ｍ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００２，３，２５７−２５９）、及び他の化学部位（Ｃｏｏｌｅｙ，ＣＢ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１，１６４０１−１６４０３；Ｐｈａｍ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，５，１１４８−１１５１）は、安定性及び細胞質基質への送達を増加させることが見出された。
３０年間の調査にも関わらず、ＣＰＰ活性の基本原理は分かりづらいままである。２つの異なる、相互に排他的でないメカニズムが、一次配列が複数のアルギニン残基を有することを特徴とするＣＰＰに関して提案されてきた。最初のメカニズム（直接の膜移動）においては、アルギニングアニジウム基は原形質膜のリン脂質と相互作用して 膜内で受動的に拡散する中性のイオン対を生成する（Ｈｅｒｃｅ，ＨＤ ａｎｄ Ｇａｒｃｉａ，ＡＥ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００７，１０４，２０８０５−２０８１０；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１２，２０，９８４−９９３）か、またはＣＰＰに脂質二分子膜を超えることを可能にする一時的な孔の形成を容易にさせる（Ｈｅｒｃｅ，ＨＤ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２００９，９７，１９１７−１９２５；Ｐａｌｍ−Ａｐｅｒｇｉ，Ｃ ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２００９，２３，２１４−２２３）。２つ目のメカニズムでは、ＣＰＰは細胞表面の糖タンパク質及び膜リン脂質と会合し、エンドサイトーシスによって細胞内に内在化し（Ｒｉｃｈａｒｄ，ＪＰ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００５，２８０，１５３００−１５３０６；Ｆｅｒｒａｒｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００３，８，２８４−２９４；Ｆｉｔｔｉｐａｌｄｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３， ２７８，３４１４１−３４１４９；Ｋａｐｌａｎ，ＩＭ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０２，２４７−２５３；Ｎａｋａｓｅ，Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，４６，４９２−５０１）、続いてエンドソームから抜け出して細胞質内に移動する。これらを合わせると、データの大部分は、低いＣＰＰ濃度では、細胞の取り込みは殆どがエンドサイトーシスによって発生するものの、直接の膜転座は１０μＭを超える濃度で優性となることを示す（Ｄｕｃｈａｒｄｔ，Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ，２００７，８，８４８−８６６）。しかし、中に入るメカニズム、及び取り込み効率はＣＰＰの同一性、カーゴ、細胞の種類、及び他の要因で変化し得る（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００８，１９，２３６３−２３７４；Ｍａｉｏｌｏ，ＪＲ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，２００５，１７１２，１６１−１７２）。
エンドサイトーシスにより細胞内に入るＣＰＰは、細胞質基質に到達するために、エンドサイトーシス小胞から出なければならない。残念なことに、エンドソーム膜は、これらのＣＰＰの細胞質送達における重要な障壁であることが証明されている。多くの場合、ごく少量のペプチドの分画しか細胞内に流出しない（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ａ ｅｔ ａｌ．ＡＡＰＳ Ｊ．，２００９，１１，１３−２２；Ｖａｒｋｏｕｈｉ，ＡＫ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１１，１５１，２２０−２２８；Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，１９，８１９−８３０）。例えば、エンドソームでのカーゴ放出を向上させることが示されている、膜融合性ヘマグルチニンペプチドＨＡ２の存在下においても、９９％を超えるＴａｔ−Ｃｒｅ融合タンパク質は、初期の取り込みの２４時間後にマクロピノソーム（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｓｏｍｅ）内に閉じ込められたままである（Ｋａｐｌａｎ，ＩＭ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０２，２４７−２５３）。近年、エンドソームエスケープ効率が向上した、新たに２つの種類のＣＰＰが発見されている。Ａｐｐｅｌｂａｕｍらは、個々のペンタアルギニンモチーフを含有する、フォールディングされたミニチュアタンパク質（ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ） は、エンドソームの閉じ込めを効果的に克服し、哺乳類細胞の細胞質基質に到達可能であることを示した（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，１９，８１９−８３０）。このモチーフは、３巻きのαヘリックスに５つのアルギニンが含まれ、このモチーフを含有するタンパク質は、初期（Ｒａｂ５＋）エンドソームから放出されて細胞内に到達する。一定のアルギニンリッチなＣＰＰの環化は、その細胞取り込みを向上させることもまた見出された（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，４２３−４３１；Ｌａｔｔｉｇ−Ｔｕｎｎｅｍａｎｎ，Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，２，４５３；Ｍａｎｄａｌ，Ｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１１，５０，９６３３−９６３７；Ｚｈａｏ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ，２０１２，８，６４３０−６４３３）。シクロ（ＦΦＲＲＲＲＱ）（ｃＦΦＲ４、式中、ΦはＬ−２−ナフチルアラニンである）等の両親媒性の小型環状ペプチド はエネルギーに依存した方法で哺乳類細胞により内在化され、非アルギニン（Ｒ９）よりも２〜５倍高い効率で、細胞質及び核内に入る（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，４２３−４３１）。更に、ホスホペプチド等の細胞膜非透過性カーゴは、ｃＦΦＲ４環内に挿入されることができ、標的細胞の細胞質内へのカーゴの送達をもたらす。しかし、「環内」送達法（図１Ａ）と本明細書で呼ばれる、カーゴの環状ペプチド環への挿入は、大型の環は不十分な内在化効率を示すため、比較的短いペプチド（７個のアミノ酸以下）に限定される（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，４２３−４３１）。
ｃＦΦＲ４の作用メカニズムを考察し、依然として高い効率の環状ＣＰＰを場合により設計するために、本明細書では、種々のエンドサイトーシスの事象を乱す人工膜及び薬理学的作用物質、並びに遺伝子変異を使用して、ｃＦΦＲ４の内在化メカニズムを調査した。データは、ｃＦΦＲ４は原形質膜のリン脂質に直接結合可能であり、エンドサイトーシスにより細胞内に入ることを示している。ペンタアルギニンモチーフを示すミニチュアタンパク質（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，１９，８１９−８３０）と同様に、ｃＦΦＲ４は初期のエンドソームで流出して細胞質基質に達することができる。種々の電荷の直鎖ペプチド、環状ペプチド、及び大型タンパク質を含む、広範囲のカーゴ分子を、環外（Ｇｌｎ側鎖へのカーゴの結合；図１Ｂ）、または二環式送達法（ｃＦΦＲ４及び環式カーゴ環の縮合；図１Ｃ）により哺乳類細胞の細胞質内に送達するｃＦΦＲ４の能力もまた調査した。ｃＦΦＲ４はカーゴのサイズ及び性質に対して許容範囲が高く、試験したカーゴ全てを、哺乳類細胞の細胞質及び核内に効率的に輸送したことが見出された。更に、ｃＦΦＲ４は、直鎖ＣＰＰに対するタンパク質分解には優れた安定性、及び最少の細胞毒性を示した。したがって、ｃＦΦＲ４は細胞質基質カーゴ送達に特に有用なトランスポーター、及び初期エンドソームでのカーゴ放出のメカニズムを調査するためのシステムを提供する。
材料。ペプチド合成の試薬は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、またはＡｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。２，２’−ジピリジルジスルフィド、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、 デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、補酵素Ａトリリチウム塩、ＦＩＴＣ標識デキストラン（デキストランＦＩＴＣ）及びヒト血清は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。細胞培地である、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン−ストレプトマイシン、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ Ｈｏｅｓｃｈｔ ３３３４２、 Ａｌｅｘａ４８８標識デキストラン（デキストランＡｌｅｘａ４８８）、ダルベッコリン酸塩−緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（２．６７ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸カリウム（一塩基性）、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、８．０６ｍＭのリン酸ナトリウム（二塩基性））、及びリポフェクタミン２０００は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ＰＤ−１０脱塩カラムは、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。核染色染料ＤＲＡＱ５（商標）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入したが、細胞増殖キット（ＭＴＴ）はＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。抗ホスホチロシン（ｐＹ）抗体（クローン４Ｇ１０）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。
Ｒｉｎｋ樹脂ＬＳ（１００−２００メッシュ、０．２ｍｍｏｌ／ｇ）はＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈから購入した。ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入したが、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ（１'−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）（ＰＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、スフィンゴミエリン（Ｂｒａｉｎ、Ｐｏｒｃｉｎｅ）、及びコレステロールは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。ヘパラン硫酸（ＨＯ−０３１０３、ロット番号ＨＯ−１０６９７） はＣｅｌｃｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）から入手した。
ペプチド合成及びラベリング。ペプチドは、標準的なＦｍｏｃの化学的性質を使用して、Ｒｉｎｋ樹脂ＬＳ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。通常のカップリング反応は、５当量のＦｍｏｃアミノ酸、５当量の２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及び１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含有し、７５分間混合することで処理した。最後の（Ｎ末端）残基を添加した後で、Ｃ末端のＧｌｕ残基上にあるアリル基を、無水ＤＣＭ中でのＰｄ（ＰＰｈ３）４及びフェニルシラン（それぞれ０．１及び１０当量）で処理（３×１５分）することにより除去した。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンで処理することにより除去し、ペプチドを、ＤＭＦ中でベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ（５、５、及び１０当量）により３時間処理して環化した。８２．５：５：５：５：２．５（体積／体積）のＴＦＡ／チオアニソール／水／フェノール／エタンジチオールで２時間処理することにより、ペプチドを脱保護し樹脂から外した。ペプチドを冷却したエチルエーテルで粉砕し（３回）、Ｃ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。各ペプチドの確実性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認した。
ＦＩＴＣでのペプチドのラベリングは、１：１：１（体積／体積）のＤＭＳＯ／ＤＭＦ／１５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）３００μＬに精製ペプチド（１ｍｇ以下）を溶解させ、ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍＬ）中のＦＩＴＣ（１０μＬ）で混合することにより実施した。室温で２０分後に、反応混合物をＣ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣに通し、ＦＩＴＣ標識ペプチドを単離した。ローダミン標識、及びＤｅｘ標識ペプチド（図２）を生成するために、Ｎε−４−メトキシトリチル−Ｌ−リジンをＣ末端に添加した。ペプチド固相合成法の後、ＣＨ２Ｃｌ２中のトリフルオロ酢酸（１％、体積／体積）を使用して、リジン側鎖を選択的に脱保護した。ＤＭＦ中のリサミンローダミンＢスルホニルクロリド／ＤＩＰＥＡ（それぞれ５当量）により、樹脂を一晩インキュベーションした。ペプチドを完全に脱保護し、ジエチルエーテルで粉砕してＨＰＬＣで精製した。ＤＭＦ中のデキサメタゾン−２１−チオプロピオン酸／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡＵ（５、５、及び１０当量）で３時間インキュベーションすることにより、Ｄｅｘ標識ペプチドを生成した（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，１９，８１９−８３０）。次にペプチドを脱保護し、粉砕してＨＰＬＣにより精製した。二環式ペプチド、ホスホクマリンアミノプロピオン酸（ｐＣＡＰ）、及びｐＣＡＰ含有ペプチド（ＰＣＰ）を、先に記した通りに合成した（Ｌｉａｎ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１３，１３５，１１９９０−１１９９５；Ｍｉｔｒａ，Ｓ ａｎｄ Ｂａｒｒｉｏｓ，ＡＭ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００５，１５，５１２４−５１４５；Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＳＭ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０１２，１０９，１３９７２−１３９７７）。各ペプチドの確実性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認した。
ｃＦΦＲ４−タンパク質コンジュゲートの調製。ＰＴＰ１Ｂの触媒領域（アミノ酸１〜３２１）をコードするための遺伝子を、ＰＴＰ１Ｂ ｃＤＮＡをテンプレートとして、並びにオリゴヌクレオチド５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇａｇａｔｇｇａａａａｇｇａｇｔｔｃｇａｇｃａｇ−３’及び５’−ｇｇｇａｔｃｃｇｔｃｇａｃａｔｔｇｔｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇａｔｔｃｇｔｔｔｇｇ−３’をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。得られたＤＮＡ断片をエンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＳａｌＩで消化し、原核細胞のベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ｙｂｂＲ内に挿入した（Ｙｉｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００５，１０２，１５８１５−１５８２０）。このクローニング手順は、ＰＴＰ１ＢのＮ末端にｙｂｂＲタグ（ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ）の添加をもたらした。ｙｂｂＲタグＰＴＰ１Ｂの発現及び精製は、上述した通りに実施した（Ｒｅｎ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５０，２３３９−２３５６）。
Ｃ末端システインを含有するペプチドｃＦΦＲ４（ｃＦΦＲ４−ＳＨ、約１０μｍｏｌ；図３）を、脱気したＤＰＢＳ（１ｍＬ）に溶解させ、アセトン（０．５ｍＬ）に溶解させた２，２’−ジピリジルジスルフィド（５当量）と混合した。室温で２時間後に、反応生成物ｃＦΦＲ４−ＳＳ−Ｐｙを逆相ＨＰＬＣで精製した。生成物をＤＰＢＳ中の補酵素Ａ（２当量）で２時間インキュベーションした。得られたｃＦΦＲ４−ＳＳ−ＣｏＡ付加化合物を逆相ＨＰＬＣで再び精製した。Ｎ末端ｙｂｂＲタグ（ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ）及びＣ末端の６個のヒスチジンタグを含有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を大腸菌内で発現させ、上述の通りに精製した（Ｙｉｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００５，１０２，１５８１５−１５８２０）。次に、ｙｂｂＲ−ＧＦＰ（３０μＭ）、ｃＦΦＲ４−ＳＳ−ＣｏＡ（３０μＭ）、及びホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＳｆｐ（０．５μＭ）を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（総体積１．５ｍＬ）内で混合し、 ３７℃で１５分間インキュベーションした。標識したタンパク質であるｃＦΦＲ４−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰ（図３）を、ＰＤ−１０脱塩カラムに反応混合物を通すことで、未反応のｃＦΦＲ４−ＳＳ−ＣｏＡから分離した。ＴａｔにコンジュゲートしたＧＦＰ（Ｔａｔ−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰ）、及びｃＦΦＲ４がコンジュゲートしたＰＴＰ１Ｂ（ｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂ）を同様にして調製した（図４）。
Ｃ末端リジンを含有するペプチド（ｃＦΦＲ４−Ｌｙｓ、約１０μｍｏｌ、図４）を固相上で合成し、脱保護して支持体から外し、脱気したＤＰＢＳ（ｐＨ７．４、１ｍＬ）中に溶解し、ＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）に溶解させた二官能性リンカーＬＣ−ＳＭＣＣ（５当量）と混合した。２時間室温でインキュベーションした後、反応生成物であるｃＦΦＲ４−ＳＭＣＣ（図４）を、Ｃ１８カラムを装着した逆相ＨＰＬＣで精製した。次に、生成物をＤＰＢＳ中の補酵素Ａ（２当量）で混合し、２時間インキュベーションした。得られたｃＦΦＲ４−ＳＭＣＣ−ＣｏＡ付加化合物を、逆相ＨＰＬＣで再び精製した。次に、ｙｂｂＲタグＰＴＰ１Ｂ（３０μＭ）、ｃＦΦＲ４−ＳＭＣＣ−ＣｏＡ（３０μＭ）、及びホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＳｆｐ（０．５μＭ）を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２（総体積１．５ｍＬ）中で混合し、３７℃で１５分間インキュベーションした。標識タンパク質（ｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂ；図４）を、ＰＤ−１０脱塩カラムに反応混合物を通してＤＰＢＳで溶出することで、未反応のｃＦΦＲ４−ＳＭＣＣ−ＣｏＡから分離した。
細胞培養及びトランスフェクション。ＨＥＫ２９３、ヒーラー、ＭＣＦ−７、ＮＩＨ３Ｔ３及びＡ５４９細胞を、ＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンからなる培地中で維持した。Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ１６５０、及びＨ１２９９細胞を、１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。細胞を、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で、３７℃で培養した。ヒーラー細胞のトランスフェクションに関しては、細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート上に播種した。付着させた後、リポフェクタミン２０００メーカーのプロトコールに従い、Ｒａｂ５−緑色蛍光タンパク質融合（Ｒａｂ５−ＧＦＰ）、Ｒａｂ７−ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号２８０４７）、グルココルチコイド受容体（Ｃ６３８Ｇ）−ＧＦＰ融合（ＧＲ−ＧＦＰ）（Ｈｏｌｕｂ，ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，５０，９０３６−６０４６）、ＤｓＲｅｄ−Ｒａｂ５ ＷＴ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１３０５０）またはＤｓＲｅｄ−Ｒａｂ５Ｑ７９Ｌ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号２９６８８）をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクションした。
小型単層膜ベシクル（ＳＵＶ）の調製。先に報告した手順（Ｍａｇｚｏｕｂ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５６３，５３−６３）を変更することにより、ＳＵＶを調製した。適切な脂質混合物を試験管内のクロロホルムに溶解させた。溶液にアルゴンを吹き込むことで、脂質混合物を緩やかに乾燥させ、デシケータに一晩保管した。乾燥した脂質をＤＰＢＳ中で再び水和させ、脂質の総濃度を最終的に１０ｍＭとした。懸濁液が透明になるまで、氷上で懸濁液を攪拌して音波処理することによって激しく混合させた。通常の調製では、約８０ｎｍの平均直径、及びＺｅｔａ Ｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ，ＣＴ）を使用して静的光散乱測定により測定した多分散度（ＰｄＩ）指標が０．１５未満のベシクルを含有する均一溶液が得られる。ＳＵＶ溶液を４℃で保管し、同じ日にＦＰ実験で使用した。
蛍光偏光。室温で２時間、種々の濃度のＤＰＢＳ中のヘパラン硫酸（０〜５，０００ｎＭ）で、１００ｎＭのＦＩＴＣ標識ペプチドをインキュベーションすることにより通常の実験を実施した。ＦＰ値をＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５分光蛍光光度計で測定した。励起及び発光波長はそれぞれ４８５及び５２５ｎｍであった。ヘパラン硫酸濃度の関数としてＦＰ値をプロットすることによりＥＣ５０を測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６）により４パラメータロジスティック曲線に合わせた。
脂質膜を有するＣＰＰのＥＣ５０値を得るために、濃度を増加させてＤＰＢＳ中のＳＵＶ溶液（０〜１０ｍＭ）と共にＦＩＴＣ標識ペプチド（１００ｎＭ）を使用して、ＦＰ実験を同様に実施した。ＦＰ値を同様に測定、プロット、及び分析した。
画像分析。ｉｍａｇｅＪを使用して原画像を均一に修正した。Ｊｕｓｔ Ａｎｏｔｈｅｒ Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｌｕｇｉｎ（ＪＡＣｏＰ）を使用して、エンドソーム領域からピアソンの相関係数（Ｒ）を入手した（Ｂｏｌｔｅ，Ｓ ａｎｄ Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ，ＦＰ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．，２００６，２２４，２１３−２３２）。ＧＲ−ＧＦＰ位置変更アッセイに関して、個々のＧＦＰ及びＨｏｅｓｃｈｔ画像を、改造したＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒパイプラインにロードし、灰色に着色した（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ＡＥ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，２００６，７，Ｒ１００）。大津の自動３クラス閾値化によりＨｏｅｓｃｈｔ画像から細胞核を区別し、中間の強度クラスのピクセルはバックグラウンドに割り当てた。ＧａｕｓｓｉａｎのＬａｐｌａｃｉａｎモデリング（Ｌａｐｌａｃｉａｎ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を使用して固めたオブジェクトを識別し、形状により分離した。核領域は、Ｈｏｅｓｃｈｔオブジェクトの直径が１μｍ収縮したとして定義し、一方で、細胞質基質環領域は、核の直径と核の直径の間が２μｍ拡大した領域として定義した。転座率は、細胞あたりで測定した細胞質基質領域内の平均ＧＦＰシグナルで、核領域内の平均ＧＦＰシグナルを割ったものとして定義し、１５〜３０個の画像から３０〜７０個の細胞を、試験した各条件について捕捉した。
共焦点顕微鏡法。ローダミン標識環状ペプチド（ｃＦΦＲ４ Ｒｈｏ）とＲａｂ５＋またはＲａ７＋エンドソーム間での共局在性を試験するために、実験の前日に、Ｒａｂ５−ＧＦＰまたはＲａｂ７−ＧＦＰでトランスフェクションしたヒーラー細胞を配置した（２００μＬ、１０４細胞／ウェル、９６ウェルのガラス底ＭａｔｒｉＰｌａｔｅｓ）。実験の日に、３００ｎＭのＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２を補充したＤＭＥＭ培地内で３０分間、ヒーラー細胞を１μＭのｃＦΦＲ４ Ｒｈｏで処理した。その後、細胞をＨＫＲ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２）で洗浄し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬｉｖｅＶｉｅｗのスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。
ＧＲ転座アッセイに関して、ＧＲ−ＧＦＰでトランスフェクションしたヒーラー細胞を上述の通りに配置した（Ｈｏｌｕｂ，ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３，５０，９０３６−６０４６）。１μＭのＤｅｘまたはＤｅｘペプチドコンジュゲート、及び３００ｎＭのＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２を含有するＤＭＥＭ培地で、細胞を３０分間処理し、Ｚｉｅｓｓ Ａｘｉｏｃａｍ ｍＲＭカメラとＥＸＦＯ−Ｅｘｃｉｔｅシリーズの１２０Ｈｇアークランプを外付けした、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ落射蛍光顕微鏡を使用してイメージングした。エンドサイトーシス阻害剤の効果を調べるために、ＤｅｘまたはＤｅｘペプチドコンジュゲートによりインキュベーションする前に、阻害剤を含有する透明なＤＭＥＭで、トランスフェクションしたヒーラー細胞を３０分間前処理した。Ｒａｂ５活性がエンドソームエスケープに必要か否かを試験するために、ＤｅｘまたはＤｅｘペプチドコンジュゲートで処理し、上述の通りにイメージングする前に、ヒーラー細胞を、ＧＲ−ＧＦＰとＤｓＲｅｄ−Ｒａｂ５ ＷＴまたはＤｓＲｅｄ−Ｒａｂ５Ｑ７９Ｌでトランスフェクションした（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，１９，８１９−８３０）。
ローダミン標識ペプチドの内在化を調べるために、５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を、３５ｍｍのガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に配置した。実験の日に、細胞をペプチド溶液（５μＭ）と０．５ｍｇ／ｍＬのデキストランＦＩＴＣで、３７℃で２時間インキュベーションした。細胞をＤＰＢＳで２回、穏やかに洗浄し、Ｖｉｓｉｔｅｃｈ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ３ Ｈａｗｋ ２Ｄアレイ生細胞イメージング共焦点顕微鏡でイメージングした。ｐＣＡＰ含有ペプチドの内在化を検出するために、ＨＥＫ２９３細胞を同様に配置して、ペプチド溶液（５μＭ）により３７℃で６０分間インキュベーションした。培地を取り除いた後、ペルバナジウム酸ナトリウム含有のＤＰＢＳ（１ｍＭ）で２回、細胞を穏やかに洗浄し、５μＭの核染色染料ＤＲＡＱ５を含有するＤＰＢＳ中で１０分間インキュベーションした。得られた細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、スピニングディスク共焦点顕微鏡（ＵｌｔｒａＶｉｅｗ Ｖｏｘ ＣＳＵＸ１システム）でイメージングした。ＧＦＰの内在化を監視するために、３５ｍｍのガラス底マイクロウェルディッシュ内に５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を播種し、一晩培養した。細胞を、ｃＦΦＲ４−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰ（１μＭ）により３７℃で２時間処理した。培地を取り除いた後、細胞を、５μＭのＤＲＡＱ５を含有するＤＰＢＳで１０分間インキュベーションした。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｖｉｓｉｔｅｃｈ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ３ Ｈａｗｋ ２Ｄアレイ生細胞イメージング共焦点顕微鏡でイメージングした。
フローサイトメトリー。ｐＣＡＰ含有ペプチドの送達効率を定量化するために、ヒーラー細胞を６ウェルプレート（ウェルあたり５×１０５個の細胞）内で２４時間培養した。実験の日に、１％のＦＢＳを含む透明なＤＭＥＭ内にて、３７℃で２時間、細胞を１０μＭのｐＣＡＰ含有ペプチドでインキュベーションした。１ｍＭのペルバナジウム酸ナトリウムを含有するＤＰＢＳで細胞を洗浄し、０．２５％トリプシンでプレートから分離し、１％のウシ血清アルブミンを含有するＤＰＢＳ中に懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーターにより３５５ｎｍの励起で分析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）でデータを分析した。
エンドサイトーシスでのｃＦΦＲ４の効果を判断するため、ヒーラー細胞を６ウェルプレート（ウェルあたり５×１０５個の細胞）に播種し、一晩付着させた。付着の後、補助成分非含有の透明ＤＭＥＭ、１μＭのｃＦΦＲ４ペプチド、１００μＭのデキストランＡｌｅｘａ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄ−２２９１０）、または１μＭの環状ペプチドと１００μＭのデキストランＡｌｅｘａ４８８の両方を含有する透明ＤＭＥＭで、標準的な細胞培養条件下にて３０分間細胞を処理した。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％トリプシンでプレートから取り除き、１０％ＦＢＳを含有する透明ＤＭＥＭ内に希釈し、３００ｇで５分間ペレット操作し、ＤＰＢＳにて１回洗浄し、２００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁した。細胞全体でのデキストラン取り込みを、メーカーのＦＬ１レーザー及びフィルタセットを使用してＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターで分析した。
免疫ブロット法。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を完全増殖培地で培養し、８０％コンフルエンスに到達させた。細胞を血清非含有培地内で３時間飢餓状態にし、異なる濃度のｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂまたは非タグＰＴＰ１Ｂで２時間処理し、続いて、１ｍＭのペルバナジウム酸ナトリウムを補充した培地内で３０分インキュベーションした。溶液を取り除き、細胞を冷却したＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞を取り外し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、５ｍＭのヨード酢酸、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのペルバナジウム酸ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍＬのフッ化フェニルメタンスルホニル、１ｍＭのベンズアミジン、及び０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤中で溶解させた。氷上での３０分のインキュベーション後、細胞可溶化物を微細遠心分離器で２５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞タンパク質を全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に電気泳動により移動させ、これを抗ｐＹ抗体４Ｇ１０を用いて免疫ブロッティングした。
血清安定性試験。安定性試験は、先に報告した手順を修正して実施した（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＴ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０，５，ｅ１２６８４）。希釈したヒト血清（２５％）を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集した。ペプチド原液を上清に希釈させて、最終濃度はｃＦΦＲ４及びＡｎｔｐに関しては５μＭ、ペプチドＲ９及びＴａｔに関しては５０μＭにし、３７℃でインキュベーションした。種々の時点（０〜６時間）において、２００μＬのアリコートを取り出し、１５％のトリクロロ酢酸（５０μＬ）と混合して一晩４℃でインキュベーションした。最終混合物を１５，０００ｒｐｍで１０分間、微細遠心分離器で遠心分離し、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を装着した逆相ＨＰＬＣで上清を分析した。ペプチドピーク（２１４ｎｍで監視）の下の面積を積分することにより、残存ペプチドの量（％）を測定し、対照反応（血清なし）での残存ペプチドの量と比較した。
細胞毒性アッセイ。ＭＴＴアッセイを行い、複数の哺乳動物細胞に対する環状ペプチドの細胞毒性を評価した（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３，６５，５５−６３）。１００μＬのＭＣＦ−７、ＨＥＫ２９３、Ｈ１２９９、Ｈ１６５０、Ａ５４９（１×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ）細胞を９６ウェル培養プレートの各ウェルに配置し、一晩増殖させた。種々の濃度のペプチド（５または５０μＭ）を各ウェルに加え、５％ ＣＯ２で細胞を３７℃にて２４〜７２時間インキュベーションした。１０μＬのＭＴＴ原液を各ウェルに添加した。増殖培地への１０μＬの溶液の添加（細胞なし）を陰性対照として使用した。プレートを３７℃で４時間インキュベーションした。次に、１００μＬのＳＤＳ−ＨＣｌ可溶化緩衝液を各ウェルに添加し、得られた溶液を完全に混合した。プレートを更に４時間、３７℃でインキュベーションした。ホルマザン生成物の吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーを使用して５７０ｎｍにて測定した。各実験を３通りで実施し、いかなるペプチドも加えていない細胞を対照として処理した。
ｃＦΦＲ４は膜のリン脂質に結合する。負に荷電したリン脂質（９０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）及び１０％ホスファチジルグリセロ−ル（ＰＧ））を含有するベシクルにより１μＭのＦＩＴＣ標識環状ペプチドｃＦΦＲ４ ＦＴＩＣをインキュベーションすると、ペプチドの蛍光がクエンチされ、ｃＦΦＲ４のリン脂質への直接結合と一致することが、以前に観察されている （Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，４２３−４３１）。エンドサイトーシスでのＣＰＰの取り込みの間における、膜結合の潜在的な役割を試験するために、哺乳類細胞の外膜を模したＳＵＶ（４５％のＰＣ、２０％のホスファチジルエタノールアミン、２０％のスフィンゴミエリン、及び１５％のコレステロール）を調製し、蛍光偏光（ＦＰ）アッセイにより、ＦＩＴＣ標識ｃＦΦＲ４、Ｒ９、及びＴａｔ（それぞれ１００ｎＭ）への結合を試験した。ｃＦΦＲ４は２．１±０．１ｍＭのＥＣ５０値（ｃＦΦＲ４ ＦＴＩＣの半分が結合した脂質濃度）で中性ＳＵＶに結合した（図５）。Ｒ９は、人工膜には更に弱い結合（ＥＣ５０＞１０ｍＭ）を示したが、Ｔａｔは全く結合しなかった。次に、ヘパラン硫酸への結合に関してＣＰＰを試験した。これは、以前にカチオン性ＣＰＰの主要な結合標的として提示されていた（Ｎａｋａｓｅ，Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，４６，４９２−５０１；Ｒｕｓｎａｔｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，２８１９８−２８２０５；Ｔｙａｇｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６，３２５４−３２６１；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ａ ａｎｄ Ｓｅｅｌｉｇ，Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２００４，８６，２５４−２６３；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，４４，２６９２−２７０２；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，２００８，６０，５８０−５９７）。Ｒ９とＴａｔは共に、高い親和性でヘパラン硫酸に結合し、それぞれ１４４ｎＭと３０４ｎＭのＥＣ５０値を有していた（図５Ｂ）。同一条件下にて、ｃＦΦＲ４はヘパラン硫酸に対して検出可能な結合を示さなかった。これらの結果は、非両親媒性のカチオン性ＣＰＰ（例えばＴａｔ及びＲ９）は細胞表面のプロテオグリカン（例えばヘパラン硫酸）に強力に結合するが、膜脂質にはわずかに弱くしか結合しないという以前の観察と一致する（Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，２００８，６０，５８０−５９７）。ｃＦΦＲ４の正電荷数が不十分であることは、ヘパラン硫酸との強力な静電相互作用を欠いていることの原因となっているように思われる。一方、ｃＦΦＲ４の両親媒性性質、及び更に強固な環状構造は、中性脂質膜への結合を容易にするはずである。これらのデータは、上述した種々のエンドサイトーシス阻害剤の阻害パターンと合わせて、ｃＦΦＲ４は原形質膜のリン脂質に直接結合可能であり、全てのエンドサイトーシスメカニズムにより、ピギーバック法で内在化することができることを示唆している。
ペプチジルカーゴの細胞内送達。ｃＦΦＲ４による環内送達はヘプタペプチドまたはより小さいカーゴに限られるため（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，４２３−４３１）、本研究では、Ｇｌｎ側鎖に結合した種々のサイズのカーゴをｃＦΦＲ４が送達できる能力、 及びカーゴの物理化学的性質（図１Ｂ、環外送達）を試験した。まず、正に荷電した（ＲＲＲＲＲ）、中性（ＡＡＡＡＡ）、疎水性（ＦＦＦＦ）及び負に荷電したペプチド［ＤＥ（ｐＣＡＰ）ＬＩ］をｃＦΦＲ４に共有結合させた。最初の３つのペプチドは、Ｃ末端リジン側鎖をローダミンＢで標識し（図２）、ＨＥＫ２９３細胞への内在化を生細胞共焦点顕微鏡法により調査した。５μＭのペプチドｃＦΦＲ４−Ａ５（図６Ａ）またはｃＦΦＲ４−Ｒ５（図６Ｂ）で２時間インキュベーションした細胞は、点状と拡散の両方を備えた蛍光の証拠を示し、後者は細胞を通してほぼ均一に分布されている。対照的に、流体相のエンドサイトーシスマーカーデキストランＦＩＴＣは、エンドソームの局在化を示す、点状が優勢した蛍光を示した。拡散したローダミン蛍光は、ペプチドの分画が細胞の細胞質基質と核に到達したことを示唆している。ｃＦΦＲ４（１μＭ）及びデキストランＡｌｅｘａ４８８との細胞の共培養は、エンドサイトーシスマーカーの内在化を１５％増加させ（図７）、これは、培養細胞内でｃＦΦＲ４がエンドサイトーシスを活性化可能であることを示唆している。ｃＦΦＲ４−Ｆ４は水への溶解度が不十分なため、試験をしなかった。
ペプチドｃＦΦＲ４−ＤＥ（ｐＣＡＰ）ＬＩ（ｃＦΦＲ４−ＰＣＰ；図２）を、負に荷電したカーゴをｃＦΦＲ４が送達する能力を試験し、かつ、広範にわたって使用される他のＣＰＰ（例えばＲ９、Ｔａｔ、及びペネトラチン（Ａｎｔｐ））との、ｃＦΦＲ４の細胞質送達効率を比較するために設計した。したがって、非タグＰＣＰ［Ａｃ−ＤＥ（ｐＣａｐ）ＬＩ−ＮＨ２］、及びＲ９（Ｒ９−ＰＣＰ）、Ｔａｔ（Ｔａｔ−ＰＣＰ）、またはＡｎｔｐ（Ａｎｔｐ−ＰＣＰ）とコンジュゲートしたＰＣＰもまた調製した。生理的ｐＨでは、ｃＦΦＲ４−ＰＣＰの実効電荷は０であることを記しておく。ｐＣＡＰは非蛍光性であるが、細胞内に入る際には、内因性のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）により速やかに脱リン酸化され、蛍光性生成物であるクマリンアミノプロピオン酸（キャップ、励起３５５ｎｍ；発光４５０ｎｍ）を生成しなければならない（Ｍｉｔｒａ，Ｓ ａｎｄ Ｂａｒｒｉｏｓ，ＡＭ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００５，１５，５１２４−５１４５；Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＳＭ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０１２，１０９，１３９７２−１３９７７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＴＰパネルに対してアッセイをしたとき、４つのＣＰＰ−ＰＣＰコンジュゲートは全て、効率的に脱リン酸化された（表８）。このアッセイは、細胞質内及び核内のＣＰＰカーゴのみを検出し、ここでは、既知の全ての哺乳類ＰＴＰの触媒ドメインが局在化される（Ａｌｏｎｓｏ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，２００４，１１７，６９９−７１１）。更に、キャップは脱プロトン化状態（ｐＫａ＝７．８）の時しか蛍光性でない。若干の脱リン酸化がエンドソーム（ｐＨ６．５〜４．５）またはリソソーム（ｐＨ４．５）内で生じても、全体の蛍光には殆ど寄与しない（図８）。ＨＥＫ２９３細胞を５μＭのｃＦΦＲ４−ＰＣＰで６０分間処理することは、細胞全体への青色の蛍光の拡散をもたらし、このことは、ｃＦΦＲ４−ＰＣＰは細胞内に到達したが、非タグＰＣＰは同一条件下にて細胞内に入ることができなかったことを示唆している（図９Ａ）。ｃＦΦＲ４−ＰＣＰ（５μＭ）とインキュベーションする前にＨＥＫ２９３細胞をＰＴＰ阻害剤のペルバナジウム酸ナトリウムで１時間前処理した際、細胞内のＣＡＰ蛍光はバックグラウンドレベルまで低減した。同一条件下にてＲ９−ＰＣＰ、Ａｎｔｐ−ＰＣＰ、またはＴａｔ−ＰＣＰで処理したＨＥＫ２９３細胞は弱い蛍光を示し、これは、これらのペプチドの細胞内に到達する能力が不十分であることと一致する（図９Ａ）。相対的な細胞内ＰＣＰ送達効率を定量化するために、ヒーラー細胞を各ペプチドで処理し、蛍光活性化細胞選別により分析した（図９Ｂ）。ｃＦΦＲ４−ＰＣＰは平均蛍光強度（ＭＦＩ）が３５１０（任意単位、ＡＵ）でヒーラー細胞により最も効率的に内在化されたが、Ｒ９−ＰＣＰ、Ａｎｔｐ−ＰＣＰ、Ｔａｔ−ＰＣＰ及び非タグ式ＰＣＰは、それぞれ９６０、４００、２９０、及び３０ＡＵのＭＦＩ値を出した（図９Ｃ）。ここで再び、ペルバナジウム酸ナトリウムの存在下で細胞をｃＦΦＲ４−ＰＣＰにより処理した場合、ＣＡＰ蛍光の量がバックグラウンドレベル付近（７０ＡＵ）まで減少した。したがって、ｃＦΦＲ４は、Ｒ９、Ａｎｔｐ及びＴａｔよりも３．７〜１２倍の効率で、種々の物理化学的性質を有するペプチジルカーゴを細胞質に送達することができる。

ａＫｃａｔ／ＫＭを前述の通りに測定した（Ｒｅｎ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５０，２３３９−２３５６）。
環状ペプチドの細胞内送達。近年、治療薬及び生物医学用調査道具としての環状ペプチドに一層の興味が持たれている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ，ＥＭ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，２００８，７，６０８−６２４；Ｍａｒｓａｕｌｔ，Ｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ＭＬ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，５４，１９６１−２００４）。例えば、環状ペプチドはタンパク質とタンパク質の相互作用を阻害するのに効果的であり（Ｌｉａｎ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１３，１３５，１１９９０−１１９９５；Ｌｉｕ，Ｔ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．，２０１１，１３，５３７−５４６；Ｄｅｗａｎ，Ｖ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，７，７６１−７６９；Ｗｕ，Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３，４，３７８−３８２）、これは従来の低分子に対しては困難な目標である。環状ペプチド治療薬の開発における主な障害は、これらが通常、細胞膜を透過しないことである（Ｋｗｏｎ，ＹＵ ａｎｄ Ｋｏｄａｄｅｋ，Ｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００７，１４，６７１−６７７；Ｒｅｚａｉ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００６，１２８，２５１０−２５１１；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００８，４１，１３３１−１３４２）。環内法によりｃＦΦＲ４の環状ペプチドを送達する試みは、限定的にしか成功していない。カーゴのサイズを１〜７残基に増加させると、細胞の取り込みは漸進的に不十分となるが、これは、カーゴが大きくなればなるほど、柔軟な環が細胞膜により不十分に結合するためと思われる（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１３，８，４２３−４３１）。この制限を克服するために、二環式ペプチド系が調査され、この系では、一方の環はＣＰＰモチーフ（例えばＦΦＲ４）を含有しているが、他方の環は所望の標的に特異的なペプチド配列からなる（図１Ｃ）。カーゴはＣＰＰ環の構造を変えず、送達効率にはあまり影響を与えないはずで、二環式環は原則として、任意のサイズのカーゴを収容可能なはずである。二環式構造の更なる硬直性はまた、代謝安定性、並びに標的結合親和性及び特異性を改善するはずである。二環式ペプチドは、１つのトリメソイルスキャホールドと、対応する直鎖ペプチド上の３つのアミノ基（即ち、Ｎ末端アミン、Ｃ末端ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）の側鎖、及びＣＰＰと標的結合モチーフ間に埋め込まれたリジン（またはオルニチン、Ｄａｐ）の側鎖）との間で３つのアミドを形成することにより容易に合成される（Ｌｉａｎ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１３，１３５，１１９９０−１１９９５）。本手法の妥当性を試験するために、ＦΦＲ４をＣＰＰ部位としてＣ末端環内で選択し、異なる長さ及び電荷のペプチド（ＡＡＡＡＡ、ＡＡＡＡＡＡＡ、ＲＡＲＡＲ、またはＤＡＤＡＤ）をカーゴとして選択した（表８、化合物１３〜１６）。比較のため、ＦΦＲ４をトランスポーターとして、並びにペプチドＡ５及びＡ７をカーゴとして含有する２つの単環式ペプチド（表８、化合物１７及び１８） もまた調製した。ペプチドは全て、Ｃ末端リジン側鎖をローダミンＢで標識し（図２）、ＨＥＫ２９３細胞への内在化を生細胞共焦点顕微鏡法により調査した。５μＭのペプチドで２時間細胞を処理することで、６つのペプチド全ての効率的な内在化がもたらされた（図１０）が、ＦＡＣＳ分析は、ビシクロ（ＦΦＲ４−Ａ５）Ｒｈｏの取り込みは、対応する単環式ペプチド（化合物１７）よりも約３倍効率的であったことを示した。内在化ペプチドの細胞内分布は二環式ペプチドと単環式ペプチドとの間で極めて異なっていた。４つの二環式ペプチドは、ペプチドが細胞質／核（拡散したローダミン蛍光により示された）及びエンドソーム（蛍光の斑点により示された）内の両方に存在するという証拠を示したが、単環式ペプチドは主に、エンドサイトーシスマーカーデキストランＦＩＴＣの蛍光と重なった、優勢な点状の蛍光を示した。全ての場合において、エンドサイトーシスマーカーは点状の蛍光のみを示し、このことは、エンドソームはペプチドで処理した細胞内でインタクトであったことを示唆している。これらの結果は、おそらくは、原形質膜とエンドソーム膜への結合が改善されたために、二環式ペプチドの構造的硬直性の増加が、エンドサイトーシスによる初期取り込み及びエンドソーム放出の両方を容易にしたことを示している。二環式環は、環状及び二環式ペプチドの細胞内送達に対する全体的な戦略を提供し得る。
タンパク質カーゴの細胞内送達。ｃＦΦＲ４が完全長タンパク質を哺乳類細胞内に輸送することが可能か否かを試験するため、ジスルフィド結合により、ＧＦＰをｃＦΦＲ４のＮ末端に結合させた（図１１Ａ及び図３）。ＧＦＰは、固有の蛍光を理由として選択した。ジスルフィド交換反応は非常に特異的で効率がよく、かつ可逆的である。細胞質内に入る際、 ＣＰＰ−Ｓ−Ｓ−タンパク質のコンジュゲートは速やかに還元され、天然タンパク質を放出する。ｃＦΦＲ４は、カーゴタンパク質上の天然または改変した表面システイン残基に直接結合することができるが、Ｎ末端に１２個のアミノ酸ｙｂｂＲタグを含有するＧＦＰ変異体を使用し、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＳｆｐを使用して、ｃＦΦＲ４をｙｂｂＲタグに酵素によって結合させた（Ｙｉｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００５，１０２，１５８１５−１５８２０）。これは、単一のｃＦΦＲ４ユニットを部位特異的な方法でＧＦＰに結合させることを可能にした。比較のため、Ｔａｔ−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰコンジュゲートを同様の方法で生成した。１μＭのｃＦΦＲ４−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰの存在下にてＨＥＫ２９３細胞をインキュベーションすることにより、細胞内での緑色蛍光の蓄積がもたらされた（図１１Ｂ）。蛍光シグナルは拡散して細胞の容量全体に存在したが、核内では濃度が更に高かった。細胞のいくつかは強い緑色蛍光の小さな点（図１１Ｂで矢印により示す）を含有し、これは、細胞内でエンドソームにより封鎖されたｃＦΦＲ４−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰまたは凝集ＧＦＰを表す。非タグＧＦＰは細胞内に入ることができなかったが、Ｔａｔ−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰはｃＦΦＲ４−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰよりも非効率的に細胞内に入った（図１１Ｂ）。１μＭのタンパク質で処理したヒーラー細胞のＦＡＣＳ分析は、後者よりも合計で５．５倍高い細胞内蛍光を示した。細胞周辺部における蛍光斑点、及びＴａｔ−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰで処理した細胞の核領域における検出可能な任意の蛍光の欠如は、Ｔａｔ−Ｓ−Ｓ−ＧＦＰは大部分がエンドソーム内に閉じ込められおり、以前の報告（Ｋａｐｌａｎ，ＩＭ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００５，１０２，２４７−２５３）と一致することを示す。したがって、カーゴとしてのタンパク質と共に、ｃＦΦＲ４はまた、初期取り込み及びエンドソームエスケープの両方に関して、Ｔａｔよりも高い効率を有する。
タンパク質送達に関するｃＦΦＲ４の普遍性を実証するために、機能性酵素（ＰＴＰ１Ｂの触媒領域：アミノ酸１〜３２１）を選択し、細胞内に送達した。非切断結合もまた送達方法と適合性があることを示すため、ｃＦΦＲ４を、チオエーテル結合を介してｙｂｂＲタグＰＴＰ１Ｂとコンジュゲートさせた（ｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂ）（図４）。ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ｃＦΦＲ４タグの添加は、ＰＴＰ１Ｂの触媒活性に影響を与えなかったことを示した（表９）。非タグＰＴＰ１ＢまたはｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂの存在下にてＮＩＨ３Ｔ３を２時間インキュベーションし、抗ｐＹウェスタンブロッティングにより、グローバルｐＹタンパク質レベルを分析した（図１２Ａ）。非タグＰＴＰ１Ｂではなく、ｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂで細胞を処理すると、全てではないが、大部分のタンパク質のｐＹレベルの濃度依存性低下がもたらされた。クマシーブルー染色により検出した細胞タンパク質の総量は変化せず（図１２Ｂ）、これは、観察されたｐＹレベルの低下が、ｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１ＢによるｐＹタンパク質の脱リン酸化、及び／またはｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂの導入により引き起こされた二次的影響（例えば、細胞プロテインチロシンキナーゼの失活）によるものであったことを示す。 興味深いことに、異なるタンパク質は種々の脱リン酸化反応速度を示した。いくつかの、範囲が１５０〜２００ｋＤのタンパク質は、６２ｎＭのｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂを添加した際に完全に脱リン酸化されたが、約８０ｋＤのタンパク質は５００ｎＭのｃＦΦＲ４−ＰＴＰ１Ｂで、リン酸化されたままであった。ｐＹパターンの変化はＰＴＰ１Ｂの広範な基質特異性と一致しており（Ｒｅｎ，Ｌ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５０，２３３９−２３５６）、哺乳類細胞の細胞質基質内でのＰＴＰ１Ｂの過剰発現により引き起こされた変化に非常に類似している（ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ Ｊｒ．，ＫＲ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９８，９５，１４０９４−１４０９９）。これらの結果は、ｃＦΦＲ４は、ＰＴＰ１ＢをＮＩＨ３Ｔ３細胞内に、触媒活性形態で、かつ細胞シグナル伝達プロセスを乱すのに十分な量で送達可能であることを示している。したがって、ｃＦΦＲ４は、細胞機能を調査するために、他の機能性タンパク質、特に、遺伝子的に発現不可能なタンパク質（例えば、毒性かつ化学修飾したタンパク質）を、哺乳類細胞内に導入するための手段を提供する。

ａｐＮＰＰ＝ｐ−ニトロフェニルホスフェート；ｋｃａｔ／ＫＭは上述の通りに測定した（Ｒｅｎ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１，５０，２３３９−２３５６）。
ｃＦΦＲ４の安定性及び細胞毒性。タンパク質分解に対するｃＦΦＲ４、Ｒ９、Ｔａｔ及びＡｎｔｐ（表８、化合物１９〜２２）の相対的安定性は、２５％のヒト血清中で、３７℃にてＣＰＰをインキュベーションし、続いて逆相ＨＰＬＣにより完全長ペプチドの消失を観察することにより測定した。カチオン性トリプトファン含有ペプチドであるＡｎｔｐは、４つのＣＰＰの中では最も安定性が低く、２０分未満の半減期で分解し、２時間後には完全に消化された（図１３Ａ）。Ｒ９及びＴａｔはＡｎｔｐよりもわずかに安定しており、約３０分の半減期を有した。対照的に、ｃＦΦＲ４は血清プロテアーゼに対しては非常に安定していた。６時間インキュベーションした後、分解は１０％未満であり、血清中で２４時間インキュベーションした後は、７０％を超えるｃＦΦＲ４がインタクトなままであった。他の多数の研究もまた、ペプチドの環化は、タンパク質分解安定性を増大させることを示した（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＴ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０，５，ｅ１２６８４）。ｃＦΦＲ４の潜在的細胞毒性は、５つの異なるヒト細胞（ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ−７、Ａ５４９、Ｈ１６５０、及びＨ１２９９）によりＭＴＴアッセイで評価した。最大５０μＭのｃＦΦＲ４により、２４〜４８時間インキュベーションした後、細胞株のいずれにおいても、著しい増殖阻害は存在しなかった（図１３Ｂ及び図１４）。７２時間後、わずかな増殖阻害（最大２０％）が５０μＭで観察された（図１４）。したがって、ｃＦΦＲ４は哺乳類細胞に対して比較的無毒である。
本研究では、ｃＦΦＲ４は、低分子、ペプチド及びタンパク質カーゴを、哺乳類細胞の細胞質及び核内に環外送達するのに効果的であることができることが示された。ｐＣＡＰ含有ペプチドをカーゴ／レポーターとして用いることにより、ｃＦΦＲ４は細胞質カーゴ送達に関して、Ｒ９、Ｔａｔ、及びＡｎｔｐよりも３．７〜１２倍効率的であることができ、ｃＦΦＲ４を、今日まで最も活性な既知のＣＰＰとしていることが示された。疎水性アシル基の添加等により多塩基ＣＰＰを修飾することは、類似の程度で細胞取り込みを向上させることが以前から報告されている（Ｐｈａｍ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，５，１１４８−１１５１）が、これらの以前の研究は、向上した取り込みが細胞質でのＣＰＰ濃度の同様の増加に変わるか否かについては確立していない。本明細書で記載されるｐＣＡＰ系のレポーターシステムは、他のＣＰＰの細胞質送達効率を定量的に評価するための、簡便かつ頑強な方法を提供することができる。一連のいくつかの証拠は、ｃＦΦＲ４は、アジ化ナトリウムの存在下において４℃で細胞内に入れないこと、ｃＦΦＲ４ Ｒｈｏの蛍光斑点と流体相エンドサイトーシスマーカーのデキストランＦＩＴＣとの部分的な重なり、ｃＦΦＲ４ Ｒｈｏと、タンパク質Ｒａｂ５及びＲａｂ７の共局在化、並びに、エンドサイトーシス阻害剤の投与時における、ｃＦΦＲ４ Ｄｅｘ取り込みの減少を含む、複数のエンドサイトーシスメカニズムにより、細胞内に入ることができることを示している。ｃＦΦＲ４とＲａｂ５＋エンドソーム間で観察される強力な共局在化に加えて、ｃＦΦＲ４の細胞質送達における、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるワートマニンの最少の効果、及びＲａｂ５ Ｑ７９Ｌ変異は、ｃＦΦＲ４は初期エンドソームから流出することができることを示唆している（図１５）。比較すると、Ｔａｔは、エンドサイトーシスにより細胞内に入り、及び後期エンドソームからの放出されることが示され、一方で、Ｒ９はＲａｂ７動員の前にエンドソームから流出する（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，１９，８１９−８３０）。初期エンドソーム放出は、特にペプチド及びタンパク質カーゴに対して利点を提供することができる。これは、初期エンドソーム放出が、後期エンドソーム及びリポソームプロテアーゼによるカーゴ分解、並びにエンドソーム成熟中における酸性化により引き起こされる変性によるカーゴの分解を最小限に抑えることができるためである。実際、ｃＦΦＲ４により細胞質内に送達されたＧＦＰ及びＰＴＰ１Ｂは共に、折りたたまれた活性形態となっていて、これらはそれぞれ、緑色蛍光、及び細胞内のｐＹタンパク質の脱リン酸化能力によって示された。更に、より硬直した構造のために、ｃＦΦＲ４は直鎖ペプチドよりもタンパク質分解に対して一層安定であることができ、かつサイズがより小さいために、ｃＦΦＲ４は合成するのにそれほど高価ではなく、潜在的にカーゴ機能との干渉が起こりにくい。これらの性質は、ｃＦΦＲ４を、低分子をタンパク質カーゴに細胞質基質送達するための有用なトランスポーターにすることができる。ＤＮＡトランスフェクション及びその後の遺伝子発現において、向上した時間制御を提供することができ、かつ、化学修飾タンパク質、及び発現により毒性を引き起こす可能性があるタンパク質の送達を可能にするため、直接タンパク質送達は、例えばタンパク質の細胞機能を研究するための、有用な研究ツールを提供することができる。ｃＦΦＲ４が初期エンドソームで流出する能力、及びｃＦΦＲ４の簡便な構造はまた、エンドソームエスケープのメカニズム、及び流出効率に影響を及ぼす因子を明らかにする優れたシステムも提供することができる。
実施例２
ペプチドリガンドの環化は、タンパク質分解に対する安定性の向上、及び場合によっては細胞膜透過性に関して効果的であることができる。しかし、この方法は、拡張したコンホメーション（例えばβストランド及びαヘリックス）のペプチドリガンドを認識するタンパク質とは適合性がない。本研究では、直鎖ペプチドリガンドを、両親媒性配列モチーフ（例えばＲＲＲＲΦＦ、式中ΦはＬ−ナフチルアラニンである）と縮合させ、得られたコンジュゲートをジスルフィド結合を介して環化させることにより、直鎖ペプチドリガンドの細胞内送達の一般的方法を開発した。環化ペプチドは、向上したタンパク質分解安定性及膜透過性を有することができる。細胞の細胞質／核内に入る際、ジスルフィド結合は還元細胞内環境により切断され、直鎖の生物学的に活性なペプチドを放出することができる。本方法は、カスパーゼ基質としての細胞膜透過性ペプチド、及び嚢胞性線維症の潜在的治療のためのＣＡＬ ＰＤＺドメインに対する阻害剤を生成するために適用された。
直鎖ペプチドの、薬剤としての適用性は多くの場合、タンパク質分解切断を受けやすいこと、及び不十分な膜透過性により制限されてきた。ペプチドの環化は、ペプチドのタンパク質分解安定性を向上させるのに効果的であることができる（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＴ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１０，５，ｅ１２６８４）。更に、一定の両親媒性ペプチド（ＦΦＲＲＲＲ、式中ΦはＬ−２−ナフチルアラニンである）を環化すると、このペプチドを能動輸送メカニズムより細胞膜透過性とすることができることが近年では報告された（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３）。生物学的に活性な環状ペプチドは、このペプチド内にこれらの短い配列モチーフを導入することにより、哺乳類細胞の細胞質及び核内に送達可能である（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３）。しかし、多くの状況において、分子標的への結合（例えばＰＤＺ（Ｄｏｙｌｅ，ＤＡ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９６，８５，１０６７；Ｍｏｒａｉｓ Ｃａｂｒａｌ，ＪＨ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２，６４９）及びＢＩＲドメイン（Ｗｕ，Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０００，４０８，１００８））には、ペプチジルリガンドが拡張コンホメーション（例えばαヘリックス及びβストランド）内に存在する必要がある可能性があり、環化が標的結合と干渉する場合がある。本明細書において、直鎖ペプチドリガンドを、可逆的なジスルフィド結合が仲立ちする環化により哺乳類細胞内に送達するための潜在的な一般的方法を試験する。酸化細胞外環境に存在する場合、ペプチドは大員環として存在することができ、これはタンパク質分解及び細胞膜透過性に対する安定性を有することができる。細胞内（即ち細胞質及び／または核）に入る際、ジスルフィド結合は細胞内のチオールにより還元され、直鎖の生物学的に活性なペプチドを生成することができる（図１６）（Ｃａｓｃａｌｅｓ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６，３６９３２；Ｊｈａ，Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ．２０１１，２２，３１９）。
材料。ペプチド合成の試薬は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、またはＡｎａｓｐｅｃ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。Ｒｉｎｋ樹脂ＬＳ（１００−２００メッシュ、０．２ｍｍｏｌ／ｇ）はＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈから購入した。デキストランＲｈｏ、トリプシン及びα−キモトリプシンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。細胞培養培地、ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ、及びＤＰＢＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。核染色染料ＤＲＡＱ５（商標）はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。カスパーゼ−３ヒト組み換えタンパク質はＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
ペプチド合成。大部分のペプチドは、標準的なＦｍｏｃ化学的性質を使用して、Ｒｉｎｋ樹脂ＬＳ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。通常のカップリング反応は、５当量のＦｍｏｃアミノ酸、５当量の２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及び１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含有し、７５分間混合することで処理した。ペプチドを脱保護し、９２．５：２．５：２．５：２．５（体積／体積）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／フェノール／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）で２時間処理することにより、ペプチドを脱保護し樹脂から外した。ペプチドを冷却したエチルエーテルで粉砕し（３回）、Ｃ１８カラムを装着した逆相ＨＰＬＣにより精製した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）によるペプチド標識は、精製タンパク質（それぞれ約１ｍｇ）を、３００μＬの１：１：１のＤＭＳＯ／ＤＭＦ／１５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中に溶解させ、ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍＬ）中のＦＩＴＣ（１０μＬ）と混合することにより実施した。室温で２０分後に、反応混合物をＣ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣに通し、ＦＩＴＣ標識ペプチドを単離した。
ジスルフィド結合が仲立ちする環状ペプチドを作成するため、ＤＭＦ中の２０％（体積／体積）ピペリジンにより処理することで、Ｎ末端のＦｍｏｃ保護基を除去した後で、無水ＤＣＭ中のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１０当量）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（０．１当量）を２時間使用して、３，３’−ジチオジプロピオン酸（１０当量）をＮ末端にカップリングした。次に、樹脂をＤＭＦ中の２０％β−メルカプトエタノールで２時間２回インキュベーションし、遊離チオールにさらした。粉砕した粗直鎖ペプチドを、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中の５％ＤＭＳＯで一晩インキュベーションし（Ｔａｍ，ＪＰ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３，６６５７）、続いて、上述の通りに粉砕し、ＨＰＬＣ精製した（Ｔａｍ，ＪＰ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３，６６５７）。
チオエーテルが仲立ちする環状ペプチドを作製するために、ＤＭＦ中の２０％（体積／体積）ピペリジンにより処理することで、Ｎ末端のＦｍｏｃ保護基を除去した後で、無水ＤＣＭ中の、１０当量のＤＩＣ及び０．１当量のＤＭＡＰを２時間使用して、４−ブロモ酪酸（１０当量）をＮ末端にカップリングした。Ｌ−システイン側鎖上の４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）保護基を、ＤＣＭ中の１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて選択的に除去した。チオエーテルの形成は、ＤＭＦ中の１％ＤＩＰＥＡ内で、窒素保護下にて一晩樹脂をインキュベーションすることにより実施した。次に環化したペプチドを、上述の通りに粉砕して精製した（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＫＤ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９８，３９，８３５７）。
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｗａｎｇ−樹脂）−ＡＭＣ（ＡＭＣ＝７−アミノ−４−メチルクマリン）（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）を固体支持体として使用し、蛍光性カスパーゼ基質を合成した。標準的なＦｍｏｃの化学的特徴を用いて、固相上でペプチドを合成した。これらのペプチドを、９５：２．５：２．５（体積／体積）のＴＦＡ／フェノール／水で２時間処理することにより、樹脂から取り外した（Ｍａｌｙ，ＤＪ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９１０）。
細胞培養。ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンからなる培地中でヒーラー細胞を保管した。ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンからなる培地中でＪｕｒｋａｔ細胞を保管した。１０％ＦＢＳ、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭ中で、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異とホモ接合した、気管支上皮ＣＦＢＥ細胞株を保管した。ヒトフィブロネクチン（１ｍｇ／ｍＬ）、ウシＩ型コラーゲン（３ｍｇ／ｍＬ）を用いて組織培養皿を覆い、５％ ＣＯ２の加湿したインキュベーター内で、３７℃にてウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍＬ）細胞をインキュベーションした。
共焦点顕微鏡法。ペプチドの内在化を検出するために、１ｍＬのヒーラー細胞懸濁液（５×１０４個の細胞）を、３５ｍｍのガラス底マイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）内に播種し、一晩培養した。細胞をＤＰＢＳで穏やかに２回洗浄し、５％ ＣＯ２の存在下にて３７℃で１時間、１％の血清を含有する、フェノールレッド非含有ＤＭＥＭ中のＦＩＴＣ標識ペプチド（５μＭ）及びデキストランＲｈｏ（０．５ｍｇ ｍＬ−１）で処理した。培地を取り除いた後、細胞をＤＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、ＤＰＢＳ中の５μＭのＤＲＡＱ５で１０分間インキュベーションした。細胞を再び、ＤＰＢＳで２回洗浄し、Ｖｉｓｉｔｅｃｈ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ３ Ｈａｗｋ ２Ｄアレイ生細胞イメージング共焦点顕微鏡でイメージングした。画像を同一パラメーターの下で捕捉し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して同一条件下で調節した。
フローサイトメトリー。ヒーラー細胞を６ウェルプレート（ウェルあたり５×１０５個の細胞）内で２４時間培養した。実験の日に、細胞を３７℃で２時間、１％ＦＢＳを有する透明ＤＭＥＭ中の、５μＭのＦＩＴＣ標識ペプチドでインキュベーションした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンでプレートから分離し、１０％ＦＢＳを含有する透明ＤＭＥＭ内に希釈し、２５０ｇを５分間ペレット操作し、ＤＰＢＳにて１回洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含有するＤＰＢＳ中で再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーターで分析した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）でデータを分析した。
ＰＣＰコンジュゲートペプチドの送達効率を定量化するため、ヒーラー細胞を６ウェルプレート（ウェルあたり５×１０５個の細胞）内で２４時間培養した。実験の日に、１％のＦＢＳを含む透明なＤＭＥＭ中にて、３７℃で２時間、細胞を５μＭのｐＣＡＰ含有ペプチドでインキュベーションした。１ｍＭのペルバナジウム酸ナトリウムを含有するＤＰＢＳで細胞を洗浄し、０．２５％トリプシンでプレートから分離し、１％のウシ血清アルブミンを含有するＤＰＢＳ中に懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーターにより３５５ｎｍの励起で分析した。
ペプチドのタンパク質分解安定性アッセイ。安定性試験は、以前に報告した手順（Ｆｒａｃｋｅｎｐｏｈｌ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ２００１，２，４４５）をわずかに修正することにより実施した。１．５ｍＭのペプチド溶液（２４μＬ）を、２００μＬの作業緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ８．０、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ））中の５０μＭのα−キモトリプシン（３０μＬ）、及び、５０μＭのトリプシン（３０μＬ）により３７℃でインキュベーションした。種々の時点（０〜１２時間）において、４０μＬのアリコートを取り出し、１５％のトリクロロ酢酸（４０μＬ）と混合し、４℃で一晩インキュベーションした。最終混合物を１５，０００ｒｐｍで１０分間、微細遠心分離器で遠心分離し、上清を、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を装着した逆相ＨＰＬＣで分析した。残存ペプチドの量（％）をペプチドピーク（２１４ｎｍで監視）の下の面積を積分することにより求め、対照反応（プロテアーゼなし）の量と比較した。
細胞内蛍光分析アッセイ。１００μＬのＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、実験の１時間前に９６ウェルプレートに播種した。１０μＬのスタウロスポリン原液（１０μＭ）を半分のウェルに加えてアポトーシスを誘発した一方で、１０μＬの培地を他のウェルに加えた。１時間のインキュベーションの後、カスパーゼ−３蛍光原基質を細胞に加え、最終濃度を５μＭにした。放出したクマリンの蛍光を、種々の時点（０〜６時間）で、励起及び発光波長を３６０及び４４０ｎｍとして、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。誘発細胞及び非誘発細胞間での蛍光単位（ＦＵ）の増加を時間に対してプロットし、生細胞内でリアルタイムで種々の蛍光原基質を用いて測定したカスパーゼ−３活性を示した。それぞれ３通りで実施した、３つの独立した一連の実験を行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの蛍光分析アッセイ。０．５μＬ（１００Ｕ／μＬ）のカスパーゼ−３酵素を、まず９６ウェルプレート内で３０分間、９０μＬの反応緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＤＴＴ）でインキュベーションした。蛍光原基質（１０μＬ、１００μＭ）を上記溶液に混合して反応を開始させ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｅｘ＝３６０ｎｍ、Ｅｍ＝４４０ｎｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でプレートを測定した。１分間隔での蛍光単位（ＦＵ）の増加は、プロテアーゼ活性によるＡｍｃの放出と相関した。ΔＦＵ／分を、反応曲線の直線部分から計算した。報告値は、３つの試験の平均であり、標準偏差と共に示している。
蛍光異方性。完全な蛍光異方性（ＦＡ）滴定実験を、１００ｎＭのフルオロフォア標識ペプチジルリガンドを、室温で２時間、ＦＡ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのグルタチオン、０．１％（重量／体積）のウシ血清アルブミン）中にて種々の濃度（０〜６μＭ）のＣＡＬ−ＰＤＺ（Ｃｕｓｈｉｎｇ，ＰＲ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８，４７，１００８４）によりインキュベーションすること により実施した。ＦＡ値を、励起及び発光波長はそれぞれ、４８５ｎｍ及び５２５ｎｍにて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５分光蛍光光度計で測定した。ＣＡＬ−ＰＤＺ濃度の関数として蛍光異方性値をプロットすることにより、平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。滴定曲線は以下の等式に一致し、この等式は１：１の結合化学量論を推定する。
式中、Ｙは所与のＣＡＬ−ＰＤＺ濃度ｘにおける測定された異方性であり、Ｌは二環式ペプチドの濃度であり、Ｑｂ／Ｑｆは染料−タンパク質の相互作用に関する補正係数であり、Ａｍａｘは、ペプチド全てがＣＡＰ−ＰＤＺに結合した場合の最大の異方性であり、一方、Ａｍｉｎはペプチド全てが遊離した場合の最少の異方性である。
免疫蛍光染色。簡単に説明すると、ＤＦ５０８−ＣＦＴＲ変異体とホモ接合した気管支上皮ＣＦＢＥ細胞を、５０μＭの非標識ペプチド８の存在下及び不在下において、１０ｍＭのＣｏｒｒ−４ａで処理した。処理の後、細胞を冷却したメタノール中で２０分間固定した。次に、スライドを１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１０分間インキュベーションした後、マウス抗ヒトモノクロナールＣＦＴＲ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により１時間、３７℃でインキュベーションした。その後、スライドを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−コンジュゲート化抗マウスＩｇＧ２ａ二次抗体で４５分間、３７℃でインキュベーションした。細胞をＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ共焦点レーザー走査顕微鏡で可視化した。全ての測定は、２つの独立した調査員により、二重盲検法で実施した。
ＳＰＱの細胞内塩素濃度アッセイ。ＳＰＱの蛍光は 細胞内塩素の濃度の増加と負の相関があるため（Ｉｌｌｓｌｅｙ，ＮＰ ａｎｄ Ｖｅｒｋｍａｎ，ＡＳ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７，２６，１２１５）、ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム）アッセイを用いて、ＣＦＢＥ細胞内におけるΔＦ５０８−ＣＦＴＲ活動の輸送活性を推定した。Ｌ−グルタミン及び１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地を用いて、ＣＦＢＥ細胞を９６ウェルプレート上で増殖させた。プレートは１ｍｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン、３ｍｇ／ｍＬのウシＩ型コラーゲン、及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンでプレコートした。まず、細胞を２０μＭのＣＦＴＲコレクタＶＸ８０９（Ｖａｎ Ｇｏｏｒ，Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１，１０８，１８８４３）の存在下または不存在下にて２４時間、及び５０μＭのＣＡＬ−ＰＤＺドメイン阻害剤で１時間処理した。次に細胞に、１０ｍＭの１：１（体積／体積）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ／水溶液を含有するＳＰＱにより、１５分間３７℃にて、低張ショックを使用してＳＰＱと共に担持した。次に、細胞を蛍光クエンチＮａＩ緩衝液（１３０ｍＭのＮａＩ、５ｍＭのＫＮＯ３、２．５ｍＭのＣａ（ＮＯ３）２、２．５ｍＭのＭｇ（ＮＯ３）２、１０ｍＭのＤ−グルコース、１０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン）酸（ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４））により２回洗浄して、１０分間インキュベーションした。その後、細胞を、ＣＦＴＲ活性化カクテル（１０μＭのフォルスコリン及び５０μＭのゲニステイン）と共に脱クエンチ等張性ＮａＮｏ３緩衝液（１３０ｍＭのＮａＩを１３０ｍＭのＮａＮＯ３で置き換えたことを除いて、ＮａＩ緩衝液と同一）に移し替えた。ＣＦＴＲが仲立ちするヨウ化物に非特異的な蛍光の発散は、細胞を、活性化カクテル及びＣＦＴＲ特異的阻害剤のＧｌｙＨ１０１（１０μＭ）でインキュベーションすることにより測定した。ＣＡＬ−ＰＤＺ阻害剤の効果を、基本量を上回る蛍光の増加割合により評価した。脱クエンチしたＳＰＱの蛍光を、３５０ｎｍでの励起波長を有し、及びＤＡＰＩ発光フィルターを備えたプレートリーダーＶＩＣＴＯＲ Ｘ３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。データは、少なくとも３つの別の実験からの、平均値±標準偏差として示した。
ホモデクティック（ｈｏｍｏｄｅｃｔｉｃ）な両親媒性環状ペプチドであるシクロ（ＦΦＲＲＲＲＱ）（ｃＦΦＲ４）は、エンドサイトーシス及びエンドソームエスケープにより哺乳類細胞の細胞質内に入ることができる、非常に活性の細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）として報告されている（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３）。可逆的環化方法の有効性を試験するために、Ｎ−３−メルカプトプロピオニル−ＦΦＲＲＲＲＣＫ−ＮＨ２ペプチドを合成した後、分子内ジスルフィド結合を形成することにより環化した（図１７；表１０、ペプチド１）。同一配列の直鎖ペプチド（表１０、ペプチド２） もまた、Ｎ末端の３−メルカプトプロピオニル基をブチリル基で、かつＣ末端のシステインを２−アミノ酪酸（ＡｂｕまたはＵ）で置き換えることにより合成した。ペプチドは共に、Ｃ末端リジン残基をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識し、生細胞共焦点顕微鏡法及びフローサイトメトリーにより、これらの細胞取り込みを評価した。環状ペプチド（５μＭ）で処理したヒーラー細胞は、細胞の容量全体を通して強力で拡散した緑色蛍光を示したが、エンドサイトーシスマーカーであるローダミン標識デキストラン（デキストランＲｈｏ）は、細胞質領域でのみ点状の蛍光を示した（図１８Ａ）。細胞質及び核領域の両方における、ＦＩＴＣ蛍光のほぼ一様な分布は、環状ペプチドはヒーラー細胞により効率的に内在化され、かつ同様に、親環状ペプチドであるｃＦΦＲ４は、エンドソームから効率的に流出できたことを示唆している。対照的に、直鎖の対照ペプチドで処理した細胞は、同一のイメージング条件下において、一層弱い細胞内蛍光を示した。蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）による、細胞内蛍光の全ての定量化では、ジスルフィド環化ペプチド、直鎖ペプチド、及びＦＩＴＣのみで処理した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、それぞれ２７，１００、５５３０、及び１２００任意単位（ＡＵ）であった（図１８Ｂ）。非常に負に荷電したペンタペプチドのＡｓｐ−Ｇｌｕ−ｐＣＡＰ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ（ＰＣＰ、ｐＣＡＰはホスホクマリルアミノプロピオン酸）もまたカーゴとして使用し、ポリエチレングリコールリンカーを介してペプチド１及び２に結合した（図１７）。ｐＣＡＰは非蛍光性であるが、哺乳類細胞質内に送達した場合、速やかに脱リン酸化を受けて、蛍光生成物であるクマリルアミノプロピオン酸（ＣＡＰ）を生成した（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＳＭ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１２，１０９，１３９７２）。それゆえ、ｐＣＡＰアッセイは、異なるＣＰＰの細胞質／核濃度の定量的評価を提供する（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３）。５μＭのペプチド１−ＰＣＰ及びペプチド２−ＰＣＰで処理したヒーラー細胞のＦＡＣＳ分析では、ＭＦＩ値はそれぞれ３０２０及び７００となった（図１９）。したがって、上の結果は、ジスルフィド結合を介したＦΦＲＲＲＲの環化 は、Ｎ〜Ｃ環化と類似の効果を有することができ、細胞取り込み効率を約５倍増加させることができることを示している（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３）。更に、ジスルフィド結合形成による環化は、ペプチドのタンパク質分解耐性を向上させることができる。プロテアーゼカクテルでペプチド１を１２時間インキュベーションすると、５０％未満が分解されたが、直鎖ペプチド２は同一条件下にて約２０分の半減期で分解した（図２０）。

ａＡｍｃ＝７−アミノ−４−メチルクマリン；ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネート；Φ＝Ｌ−２−ナフチルアラニン；Ω＝ノルロイシン；Ｕ＝２−アミノ酪酸。
可逆的環化法の実用性を示すため、この環化法を使用して特異的カスパーゼ基質を細胞内に送達し、細胞内カスパーゼ活性をリアルタイムで監視した（Ｒｉｅｄｌ，ＳＪ ａｎｄ Ｓｈｉ，Ｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４，５，８９７）。ペプチジルクマリン誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでカスパーゼ活性を検出するために幅広く使用されてきている（Ｍａｌｙ，ＤＪ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ２００２，３，１６）が、この誘導体は通常、哺乳動物細胞への不透過性のために、ｉｎ ｖｉｖｏ用途には適していない。細胞膜透過性カスパーゼ基質を生成するため、カスパーゼ３／７基質であるＡｃ−Ａｓｐ−Ｎｌｅ−Ａｂｕ−Ａｓｐ−Ａｍｃ（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，ＮＡ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２，１７９０７）（表１０、ペプチド３、式中、Ａｍｃは７−アミノ−４−メチルクマリンであり、Ｎｌｅはノルロイシンである）を、ＣＰＰモチーフＲＲＲＲΦＦと縮合させた。続いて、縮合ペプチドを、３−メルカプトプロピオニル基をＮ末端に添加し、 Ｃ末端のＡｂｕをシステインで置き換え、分子内ジスルフィド結合を形成することにより環化し、環状ペプチド４（表１０）を得た。比較のため、等配電子であり、非可逆的に環化したペプチド（表１０、ペプチド５） を、Ｎ末端のブロモブチリル部位とＣ末端のシステイン間にチオエーテル結合を形成することにより合成した（図１７）。同一配列の直鎖対照ペプチドもまた、上述の通りに調製した（表１０、ペプチド６）。最終的に、カスパーゼ３／７基質を非アルギニン（Ｒ９）とコンジュゲートし、陽性対照ペプチドを生成した（表１０、ペプチド７）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの動力学的分析は、カスパーゼ３／７基質をＲＲＲＲΦＦ及びＲ９に縮合させると、ペプチド３と比較してそれぞれ活性を５３％、７２％低下させたが、一方、チオエーテル形成による環化は、ペプチドを組み換えカスパーゼ３に対して不活性とさせた（表１１）ことを明らかにした。カスパーゼ３に対するペプチド４の活性は、カスパーゼアッセイが、ジスルフィド結合を切断する還元環境を必要としたため、確実に測定できなかった。ペプチド４及び５の構造類似性を考慮すると、環状形態のペプチド４はカスパーゼに対してもまた不活性であるが、ジスルフィド結合の還元切断の後はペプチド６に対して類似の活性を有すると想定することができる。
Ｊｕｒｋａｔ細胞をキナーゼ阻害剤のスタウロスポリンで前処理し、カスパーゼ活性を誘発させることで、アポトーシスを誘発させた（Ｂｅｌｍｏｋｈｔａｒ，ＣＡ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９６，３１５，２１）。次に、これらの細胞をペプチド３〜７でインキュベーションし、放出したＡｍｃの量を種々の時点（０〜１０時間）で監視した。不透過性のカスパーゼ基質（ペプチド３）は、１０時間の間で殆ど蛍光増加を生み出さなかった（図２１）。ペプチド４は最速で蛍光増加を生み出し、４５９蛍光単位（ＦＵ）に達し、ペプチド７及び６が後に続いた。カスパーゼ３に対しては不活性であるペプチド５もまた、大幅に遅い速度ではあるが、時間に依存した方法でＡＭＣを産生した（９９ＦＵ）。この、ＡＭＣ放出の遅い速度は、他の細胞内プロテアーゼ及びペプチダーゼによる加水分解に起因し得る。この解釈と一致するように、Ｊｕｒｋａｔ細胞を汎カスパーゼ阻害剤のＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（Ｓｌｅｅ，ＥＡ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９９６，３１５，２１）により前処理し、続いてペプチド４でインキュベーションすることで、ペプチド５のみの速度と同様の速度でＡＭＣを放出した。上記観測結果の一解釈は、ペプチド４及び５は共に、細胞内に効率的に入ることができるが、ペプチド４のみが細胞内で直鎖カスパーゼ基質に転換できるということである。
多くのタンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）は、拡張コンホメーション（例えばαヘリックス及びβストランド）における、タンパク質ドメイン結合短ペプチドにより仲立ちされる（Ｐａｗｓｏｎ，Ｔ ａｎｄ Ｎａｓｈ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３００，４４５）。例えば、ＰＤＺドメインは、ヒトに対する細菌のシグナル伝達タンパク質で見出される、８０〜９０個のアミノ酸の共通構造ドメイン （Ｄｏｙｌｅ，ＤＡ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９６，８５，１０６７；Ｍｏｒａｉｓ Ｃａｂｒａｌ，ＪＨ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９６，３８２，６４９；Ｌｅｅ，ＨＪ ａｎｄ Ｚｈｅｎｇ，ＪＪ．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｓｉｇｎａｌ．２０１０，８，８）である。ＰＤＺドメインは、結合パートナーのＣ末端における特異的配列を認識し、かつ、結合したペプチドリガンドは、ドメインの拡張βストランドコンホメーション内にある（Ｄｏｙｌｅ，ＤＡ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９６，８５，１０６７；Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７，２７５，７３）。嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）である、嚢胞性線維症（ＣＦ）患者内で変異した塩化物イオンチャネルタンパク質の活性は、ＰＤＺドメイン（ＣＡＬ−ＰＤＺ）を通して、ＣＦＴＲ会合リガンド（ＣＡＬ）により負に調節されることが近年報告されている（Ｗｏｌｄｅ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，２８２，８０９９）。ＣＦＴＲ／ＣＡＬ−ＰＤＺ相互作用の阻害は、プロテアソームが仲立ちする分解を減少させることにより（Ｃｕｓｈｉｎｇ，ＰＲ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９，９９０７）、最も一般的なＣＦＴＲ変異の形態である、ΔＰｈｅ５０８−ＣＦＴＲの活性（Ｃｈｅｎｇ，ＳＨ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９９０，６３，８２７；Ｋｅｒｅｍ，ＢＳ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４５，１０７３）を改善することが示された。以前のライブラリースクリーニング及び合理的設計は、適度な潜在能（高ｎＭから低μＭ範囲でのＫＤ値）を有するＣＡＬ−ＰＤＺドメインの、いくつかのペプチジル阻害剤を識別している（Ｃｕｓｈｉｎｇ，ＰＲ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９，９９０７；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＫＥ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏｓ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２００８，８，ｅ１００２４７７；Ｋｕｎｄｕ，Ｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，７２１７−７２２０）。しかし、ペプチド阻害剤のいずれもが細胞膜透過性ではなく、その治療的可能性を限定している。
ＣＡＬ−ＰＤＺドメインに対するヘキサペプチドリガンドから、ジスルフィドが仲立ちする環状ペプチドであるＷＱＶＴＲＶ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＫＥ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏｓ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．２００８，８，ｅ１００２４７７）を、配列ＣＲＲＲＲＦをＮ末端に添加し、−３位のＶａｌをシステインで置き換えることにより設計した（表１０、ペプチド８）。したがって、ペプチド８では、−５位のトリプトファン残基を、ＰＤＺ結合と膜転座という、二重の機能を果たすように設計した。細胞取り込みの親和性測定及び定量化を容易にするため、ＦＩＴＣ基をペプチド８のＮ末端に添加した。ＦＡ分析は、還元剤の不存在下で、ペプチド８はＣＡＬ−ＰＤＺドメインに検出可能な結合を示さないことを示した（図２２Ａ）。ジスルフィド結合を還元可能な２ｍＭのトリス（カルボキシエチル）ホスフィンの存在下において、ペプチド８はＣＡＬ−ＰＤＺドメインに、４８９ｎＭのＫＤ値で結合した。ペプチド８は容易に細胞膜を透過することができた。５μＭのペプチド８でヒーラー細胞を２時間インキュベーションすることで、細胞全体にわたり、強力かつ拡散した蛍光が得られた（図２２Ｂ）。
予想通り、ペプチド８は容易に細胞膜を透過することができた（図２５Ｃ）。ΔＦ５０８−ＣＦＴＲ変異体とホモ接合した、気管支上皮ＣＦＢＥ細胞を、５０μＭの非標識ペプチド８の存在下及び不存在下において、１０μＭのＣｏｒｒ−４ａで処理した。ＣＡＬ−ＰＤＺドメインの機能を阻害することにより、ペプチド８は、原形質膜に移動したΔＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質の量を増大させることが予想される一方で、Ｃｏｒｒ−４ａは、原形質膜に送達されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質のフォールディングを補助する低分子である。未処理細胞の免疫染色（図２５Ｄ、パネルＩ）は、発現したΔＦ５０８−ＣＦＴＲの大部分は、細胞核を取り巻く小胞体内に存在したことを示した。対照的に、Ｃｏｒｒ−４ａ及びペプチド８での細胞の処理は、細胞表面により大量のタンパク質をもたらした（図２５Ｄ、パネルＩＩ）。細胞集団の定量化により、少量ではあるが、著しい割合の細胞が、細胞表面において野生型同様のΔＦ５０８−ＣＦＴＲ分布を有することが明らかとなった（図２５Ｄ）。最終的に、ＳＰＱアッセイを利用して、未処理、またはＣＦＴＲフォールディングコレクタＶＸ８０９及びペプチド８で処理したΔＦ５０８−ＣＦＴＲ ＣＦＢＥ細胞のイオンチャンネル活性を定量化した。再び、ＶＸ８０９及びペプチド８は相乗的に作用し、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲのチャネル活性の機能を向上させた（図２５Ｅ）。
実施例３
環状ペプチドは、治療薬及び研究手段として大いなる可能性を有するが、通常細胞膜には不透過性である。環状ペプチドを環状細胞膜透過性ペプチドと縮合することで、細胞膜透過性であることができる二環式ペプチドを作製し、特異的な細胞内標的を認識する能力を維持することができる。タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ、及びペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼＰｉｎ１を本方法に適用することで、酵素に対して強力、選択的、タンパク質分解に対して安定であり、かつ生物学的に活性な阻害剤を得た。
環状ペプチド（及びデプシペプチド）は、広範囲の生物活性を示す（Ｐｏｍｉｌｉｏ，ＡＢ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００６，１０，２０７５−２１２１）。個別に（Ｍｅｕｔｅｒｍａｎｓ，ＷＤＦ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，９７９０−９７９６；Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，ＣＥ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，５８９１−５８９２；Ｓｕｎ，Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１，３，１６８１−１６８４；Ｋｏｈｌｉ，ＲＭ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１８，６５８−６６１；Ｑｉｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００４，６，３９８−４０６；Ｔｕｒｎｅｒ，ＲＡ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００７，９，５０１１−５０１４；Ｈｉｌｉ，Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，２８８９−２８９１；Ｌｅｅ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，２１２２−２１２４；Ｆｒｏｓｔ，ＪＲ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１３，１４，１４７−１６０）、または組み合わせにより（Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．１９９６，１，２３３−２４０；Ｇｉｅｂｅｌ，ＬＢ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，３４，１５４３０−１５４３５；Ｓｃｏｔｔ，ＣＰ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９，９６，１３６３８−１３６４３； Ｍｉｌｌｗａｒｄ，ＳＷ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，１４１４２ −１４１４３；Ｓａｋｏ，Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，７２３２−７２３４．；Ｌｉ，Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００５，５８１−５８３．；Ｊｏｏ，ＳＨ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１３０００−１３００９；Ｈｅｉｎｉｓ，Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９，５，５０２−５０７；Ｔｓｅ，ＢＮ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１５６１１−１５６２６）のいずれかで、環状ペプチドを合成し、これらの生物活性をスクリーニングするいくつかの革新的方法論が近年開発されている。環状ペプチドの特に刺激的な用途は、タンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）の阻害（Ｌｅｄｕｃ，ＡＭ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ ２００３，１００，１１２７３−１１２７８；Ｍｉｌｌｗａｒｄ，ＳＷ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００７，２，６２５−６３４；Ｔａｖａｓｓｏｌｉ，Ａ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００８，３，７５７−７６４．；Ｗｕ，Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３，４，３７８−３８２；Ｂｉｒｔｓ，ＣＮ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１３，４，３０４６−３０５７；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｔ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，１２０５−１２１４；Ｌｉａｎ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，１１９９０−１１９９５）であるが、この用途は、従来の低分子に対しては依然として課題目標のままである。しかし、環状ペプチドの主な制限は、通常細胞膜に不透過性であり、治療に関係のあるＰＰＩの大部分を含む細胞内標的に対する、いかなる用途も排除していることである。分子内水素結合（Ｒｅｚａｉ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１４０７３−１４０８０）、またはペプチド骨格のＮａ−メチル化（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００８，４１，１３３１−１３４２；Ｗｈｉｔｅ，ＴＲ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１１，７，８１０−８１７）の形成は、一定の環状ペプチドの膜透過性を改善することができるが、環状ペプチドの細胞膜透過性を増加させる代わりの方法が明確に必要である。
プロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）はＰＴＰスーパーファミリーのプロトタイプメンバーであり、真核細胞シグナル伝達中に種々の役割を果たす。インスリン及びレプチン受容体シグナリングを負に調節する役割のために、ＰＴＰ１Ｂは２型糖尿病及び肥満の治療に関する有効な標的である（Ｅｌｃｈｅｌｂｙ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８３，１５４４-１５４８；Ｚａｂｏｌｏｔｎｙ，ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ２００２，２，４８９−４９５）。多数のＰＴＰ１Ｂ阻害剤が報告されている（Ｈｅ，Ｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｅｄ．Ｒ．Ｍ．Ｊｏｎｅｓ，ＲＳＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ２０１２，ｐｐ１４２）ものの、これらは全て、臨床的には成功していない。ホスホチロシン（ｐＹ）同配体（例えばジフルオロホスホノメチルフェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ））の大部分は細胞膜に不透過性である（Ｂｕｒｋｅ Ｊｒ．，ＴＲ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４，２０４，１２９−１３４）ため、ＰＴＰ阻害剤の設計は困難である。更に、全てのＰＴＰが同様の活性部位を共有しているため、単一のＰＴＰに対する選択性を達成することは困難であった。本明細書においては、細胞内タンパク質（例えばＰＴＰ１Ｂ）に対する細胞膜透過性環状ペプチジル阻害剤を設計するための、潜在的な一般的アプローチを報告している。
材料。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）、またはＡａｐｐｔｅｃ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から購入した。Ｆｍｏｃ−Ｆ２Ｐｍｐ−ＯＨはＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。アミノメチル−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）はＳＪＰＣ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。Ｒｉｎｋ樹脂ＬＳ（１００〜２００メッシュ、０．２ｍｍｏｌ／ｇ）及びＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ）はＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈから購入した。Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）はＡａｐｐｔｅｃから購入した。１ｍＬの密封アンプル内のフェニルイソチオシアネート、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢ標識デキストラン（デキストランＲｈｏ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。細胞培地である、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン−ストレプトマイシン、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ、ダルベッコリン酸塩−緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（２．６７ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸カリウム（一塩基性）、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、８．０６ｍＭのリン酸ナトリウム（二塩基性））、及び抗−ホスホ−ＩＲ／ＩＧＦ１Ｒ抗体 は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。核染色染料ＤＲＡＱ５（商標）及び抗β−アクチン抗体はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。抗体４Ｇ１０はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。全ての溶媒、及び他の化学試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、別段の定めがある場合を除き、更に精製することなく使用した。
細胞培養。Ａ５４９、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｐＧ２細胞は、５％ ＣＯ２を有する３７℃の加湿インキュベーター内で、１０％ ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で保管した。
タンパク質発現、精製及びラベリング。ＰＴＰ１Ｂの触媒領域（アミノ酸１〜３２１）をコードするための遺伝子を、ＰＴＰ１Ｂ ｃＤＮＡをテンプレートとして、並びにオリゴヌクレオチド５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇｇａｇａｔｇｇａａａａｇｇａｇｔｔｃｇａｇｃａｇ−３’及び５’−ｇｇｇａｔｃｃｇｔｃｇａｃａｔｔｇｔｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｇａｔｔｃｇｔｔｔｇｇ−３’をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。得られたＤＮＡ断片をエンドヌクレアーゼＮｄｅ Ｉ及びＳａｌ／Ｉで消化し、原核細胞ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）−ｙｂｂＲ内に挿入した（Ｙｉｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５，１０２，１５８１５−１５８２０）。このクローニング手順は、ＰＴＰ１ＢのＮ末端にｙｂｂＲタグ（ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ）の添加をもたらした。ｙｂｂＲタグＰＴＰ１Ｂの発現及び精製は、上述の通りに実施した（Ｒｅｎ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１，５０，２３３９−２３５６）。ＰＴＰ１ＢのＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中のｙｂｂＲタグＰＴＰ１Ｂタンパク質（８０μＭ）を、Ｓｆｐホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（１μＭ）及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＣｏＡ（１００μＭ）により３０分間、室温で処理することにより実施した（Ｙｉｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００５，１０２，１５８１５−１５８２０）。反応混合物を３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＧ−２５高速脱塩カラムに通し、あらゆる遊離染料分子を除去した。完全長ヒトＳ１６Ａ／Ｙ２３Ａ変異体Ｐｉｎ１が発現し、これを上述の通りに大腸菌から精製した（Ｌｉｕ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，２４９４−２５０１）。
ライブラリー合成。環状ペプチドライブラリーを、１．３５ｇのアミノメチル−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（０．５７ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。ライブラリー合成は、別の記載がない限り室温で実施した。リンカー配列（ＢＢＭ）を、標準的なＦｍｏｃ化学作用を用いて合成した。典型的なカップリング反応は、５当量のＦｍｏｃアミノ酸、５当量のＨＢＴＵ、及び１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含有し、２時間混合しながら進めた。Ｆｍｏｃ基は、ＤＭＦ中の２０％（体積／体積）ピペリジンで２回（５＋１５分）処理することで除去し、ビーズをＤＭＦで完全に洗浄した（６回）。ビーズを外層及び内層に空間的に分離させるため、（Ｎ末端のＦｍｏｃ基を除去した後の）樹脂をＤＭＦと水で洗浄し、水中に一晩浸した。樹脂を速やかに取り除き、２０ｍＬの１：１（体積／体積）のＤＣＭ／ジエチルエーテル中の、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（δ−ＮＨＳ）−ＯＡｌｌ（０．１０当量）、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−Ｏｓｕ（０．４当量）及びＮ−メチルモルホリン（２当量）の溶液に懸濁させた（Ｊｏｏ，ＳＨ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，１３０００−１３００９）。混合物を回転シェーカーで３０分間インキュベーションした。ビーズを１：１ ＤＣＭ／ジエチルエーテル（３回）及びＤＭＦ（８回）で洗浄した。次に、Ｆｍｏｃ基をピペリジン処理により除去した。次いで、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（４回）、Ｆｍｏｃ−Ｎａｌ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを、標準的なＦｍｏｃ化学作用により、連続して樹脂の半分とカップリングさせた。他の半分は逆配列で、同一のアミノ酸とカップリングさせた。樹脂を組み合わせ、５当量のＦｍｏｃアミノ酸、カップリング剤として５当量のＨＡＴＵ及び１０当量のＤＩＰＥＡを使用したスプリットプール法によりランダムな配列を合成した。カップリング反応をもう一度繰り返し、各工程にて確実に完全なカップリングを行った。ランダムな位置に関して、１０個のタンパク質構成α−Ｌ−アミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、及びＴｙｒ）、５つの非タンパク質構成α−Ｌ−アミノ酸（Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン（Ｆｐａ）、Ｌ−ホモプロリン（Ｐｉｐ）、Ｌ−ノルロイシン（Ｎｌｅ）、Ｌ−フェニルグリシン（Ｐｈｇ）及びＬ−４−（ホスホノジフルオロメチル）フェニルアラニン（Ｆ２Ｐｍｐ））、並びに９個のα−Ｄ−アミノ酸（Ｄ−２−ナフチルアラニン（Ｄ−Ｎａｌ）、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｈｒ、及びＤ−Ｖａｌを含む２４個のアミノ酸の集合は、構造の多様性、 代謝安定性、 及び商業上の利用可能性に基づいて選択した。ＰＥＤ−ＭＳ分析中の同重アミノ酸（ｉｓｏｂａｒｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を区別するため、４％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のＣＤ３ＣＯ２ＤをＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ、及びＤ−Ｐｒｏのカップリング反応に添加し、一方で、４％のＣＨ３ＣＤ２ＣＯ２ＤをＮｌｅ反応に加えた。Ｆｍｏｃ−Ｆ２Ｐｍｐ−ＯＨ（０．０６当量）及びＦｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＯＨ（０．５４当量）を、ＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いてランダムな位置の中央に配置した。配列全体を合成した後、Ｃ末端のＧｌｕ残基上にあるアリル基を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム［Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、０．２５当量］及びフェニルシラン（５当量）を含有するＤＣＭ溶液で１５分間（３回）処理することにより除去した。ビーズを、ＤＭＦ中の０．５％（体積／体積）ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ中の０．５％（重量／体積）ジメチルジチオカルバミド酸ナトリウム水和物、ＤＭＦ（３回）、ＤＣＭ（３回）、及びＤＭＦ（３回）で連続して洗浄した。Ｎ末端のランダムな残基上のＦｍｏｃ基を、上述の通りにピペリジンにより除去した。ビーズをＤＭＦ（６回）、ＤＣＭ（３回）、及びＤＭＦ中の１Ｍ ＨＯＢｔ（３回）で洗浄した。ペプチド環化に関して、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ（それぞれ５、５、１０当量）の溶液を樹脂と混合し、混合物を回転シェーカーで３時間インキュベーションした。樹脂をＤＭＦ（３回）及びＤＣＭ（３回）で洗浄し、真空下にて１時間を超えて乾燥させた。側鎖の脱保護は、変性試薬Ｋ（７８．５：７．５：５：５：２．５：１：１（体積／体積）のＴＦＡ／フェノール／水／チオアニソール／エタンジチオール／アニソール／トリイソプロピルシラン）により３時間実施した。樹脂をＴＦＡ及びＤＣＭで洗浄し、真空下にて乾燥させた後−２０℃で保存した。
ライブラリースクリーニング及びペプチド配列決定。ライブラリーの樹脂（１００ｍｇ、約３００，０００個のビーズ）をＤＣＭ中で膨潤させ、ＤＭＦにより広範囲にわたり洗浄し、Ｈ２Ｏで２回蒸留し、２０ｎＭのＴｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ＰＴＰ１Ｂを含有する（１ｍＬ）のブロック緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．１％のゼラチン）中で、４℃にて３時間インキュベーションした。ビーズを、蛍光灯照明器を装着したＯｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１２顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）で調査し、最も強力な蛍光ビーズを、陽性ヒットとして手動で収集した。コード直鎖ペプチドを含有するビーズを、部分Ｅｄｍａｎ分解及び質量分析（ＰＥＤ−ＭＳ）により配列決定した（Ｌｉｕ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，２４９４−２５０１）。
個々のペプチド合成及びラベリング。単環式及び二環式ペプチドを、標準的なＦｍｏｃ化学作用を用いて、Ｒｉｎｋ樹脂ＬＳ（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。単環式ペプチドに関しては、最後（Ｎ末端）の残基をカップリングした後、Ｃ末端のＧｌｕ残基上にあるアリル基を、無水ＤＣＭ中のＰｄ（ＰＰｈ３）４及びフェニルシラン（それぞれ０．１及び１０当量）で処理（３×１５分）することにより除去した。Ｎ末端のＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％（体積／体積）ピペリジンで処理することにより除去し、ＤＭＦ中のＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ（５、５、及び１０当量）で３時間処理することにより、ペプチドを環化した。二環式ペプチドに関しては、Ｎ末端のＦｍｏｃ基をピペリジンで除去し、ＨＢＴＵをカップリング剤として用いて、トリメシン酸をＮ末端アミン上にカップリングした。２つのＤａｐ残基の側鎖上にあるアリルオキシカルボニル基を、無水ＤＣＭ中のＰｄ（ＰＰｈ３）４及びフェニルシラン（それぞれ０．１及び１０当量）で２時間処理することにより除去した。得られたペプチドを、上述の通りＰｙＢＯＰを用いて環化した。８２．５：５：５：５：２．５（体積／体積）のＴＦＡ／チオアニソール／水／フェノール／エタンジチオールで２時間処理することにより、ペプチドを脱保護し樹脂から外した。ペプチドを冷却したエチルエーテルで粉砕し（３回）、Ｃ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣにより精製した。各ペプチドの確実性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確認した。ＦＩＴＣでのペプチドのラベリングは、１：１：１（体積／体積）のＤＭＳＯ／ＤＭＦ／１５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）３００μＬに精製ペプチド（約１ｍｇ）を溶解させ、ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍＬ）中のＦＩＴＣ（１０μＬ）で混合することにより実施した。室温で２０分後に、反応混合物をＣ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣに通し、ＦＩＴＣ標識ペプチドを単離した。
ＰＴＰ阻害アッセイ。石英キュベット（総容積１５０μＬ）内でＰＴＰアッセイを実施した。反応混合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＴＣＥＰ、０〜１μＭのＰＴＰ阻害剤、及び５００μＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を含有する。酵素反応は、ＰＴＰを添加することにより開始し（最終濃度１５〜７５ｎＭ）、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計で４０５ｎｍにて連続的に監視した。初期速度を、反応進行曲線から計算した（通常、６０秒未満）。最大半減阻害定数（ＩＣ５０）を、酵素活性を５０％まで低下させた阻害剤の濃度として定義し、阻害剤濃度［Ｉ］に対する速度（Ｖ）をプロットし、データを等式

に当てはめることで入手した。式中、Ｖ０は、阻害剤の不存在下における酵素反応速度である。阻害定数（Ｋｉ）は、固定した酵素濃度（１５ｎＭ）、かつ種々のｐＮＰＰの濃度（０〜２４ｍＭ）及び阻害剤濃度（０〜１１２ｎＭ）にて、初期速度を測ることにより測定した。反応速度（Ｖ）を、ｐＮＰＰ濃度（［Ｓ］）に対してプロットし、等式

に当てはめ、ミカエリス定数Ｋを得た。Ｋｉ値は、Ｋ値を阻害濃度［Ｉ］に対してプロットし、等式

に当てはめることにより得た。式中、Ｋ０は阻害剤の不存在下（［Ｉ］＝０）における、ミカエリス定数である。
共焦点顕微鏡法。およそ５×１０４個のＡ５４９細胞を、１ｍＬの培地を含有する、３５ｍｍのガラス底マイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）内で播種し、１日培養した。Ａ５４９細胞を、ＤＰＢＳで１回穏やかに洗浄し、５％ ＣＯ２の存在下において、増殖培地中のＦＩＴＣ標識ＰＴＰ１Ｂ阻害剤（５μＭ）、デキストランＲｈｏ（１ｍｇ ｍＬ−１）により、３７℃にて２時間処理した。ペプチド含有培地を取り除き、細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、５μＭのＤＲＡＱ５を含有する１ｍＬのＤＰＢＳ中で１０分間インキュベーションした。細胞を再び、ＤＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を、５％のＣＯ２の存在下において、（６０倍の油浸レンズを備えた）Ｖｉｓｉｔｅｃｈ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ３ Ｈａｗｋ ２Ｄアレイ生細胞イメージング共焦点顕微鏡で、３７℃にてイメージングした。ＦＩＴＣ標識Ｐｉｎ１阻害剤での処理後の、ＨＥＫ２９３細胞の生細胞共焦点顕微鏡イメージングもまた、同様に実施した。
免疫ブロット法。Ａ５４９細胞を完全増殖培地で培養し、８０％コンフルエンスまで到達させた。細胞を血清非含有培地内で３時間飢餓状態にし、種々の濃度のＰＴＰ１Ｂ阻害剤で２時間処理し、続いて、１ｍＭのペルバナジウム酸ナトリウムを補充した培地内で３０分インキュベーションした。溶液を取り除き、細胞を冷却したＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞を取り外し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、５ｍＭのヨード酢酸、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍのＭＥＤＴＡ、２ｍＭのペルバナジウム酸ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍＬのフッ化フェニルメタンスルホニル、１ｍＭのベンズアミジン、及び０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤中で溶解させた。氷上での３０分のインキュベーション後、細胞可溶化物を微細遠心分離器で２５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞タンパク質を全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離してＰＶＤＦ膜に電気泳動により移動させ、これらを、抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０を使用して免疫ブロッティングした。同一サンプルを別のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、クマシーブリリアントブルーにより染色し、全てのレーンにおいて等しいサンプル担持を確認した。
阻害剤の、インスリンシグナル伝達経路への影響を試験するため、ＨｅｐＧ２細胞を培養して８０％コンフルエンスまで到達させた。細胞を血清非含有ＤＭＥＭ中で４時間飢餓状態にさせた後で、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤で処理し（２時間）、続いて１００ｎＭのインスリンで５分間刺激した。サンプルを上述の通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、抗ホスホＩＲ／ＩＧＦ１Ｒ抗体を使用して免疫ブロッティングした。ＰＶＤＦ膜もまた、抗β−アクチン抗体をローディング対照として使用して調査した。
血清安定性試験。安定性試験は、先に報告した手順を修正して実施した（Ｎｇｕｙｅｎ，ＬＴ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１０，５，ｅ１２６８４）。希釈したヒトの血清（２５％）を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集した。ペプチド原液を上清に希釈させて、最終濃度を５μＭとし、３７℃でインキュベーションした。種々の時点（０〜２４時間）において、２００μＬのアリコートを取り出し、１５％のトリクロロ酢酸（５０μＬ）と混合して一晩４℃でインキュベーションした。最終混合物を１５，０００ｒｐｍで１０分間、微細遠心分離器で遠心分離し、Ｃ１８カラムを装着した逆相ＨＰＬＣで上清を分析した。残存ペプチドの量（％）を、ペプチドピーク（２１４ｎｍで監視）の下の面積を積分することにより求め、対照反応（血清なし）の量と比較した。
蛍光異方性。ＦＡ実験を、１００ｎＭのＦＩＴＣ標識ペプチドを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭの酢酸マグネシウム、及び０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内の種々の濃度のタンパク質で、室温で２時間インキュベーションすることにより実施した。ＦＡ値は、励起及び発光波長をそれぞれ４８５及び５２５ｎｍとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーで測定した。ＦＡ値をタンパク質濃度の関数としてプロットし、曲線を以下の式

に当てはめることにより、平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。式中、Ｙは所与のタンパク質濃度ｘにおけるＦＡ値であり、Ｌはペプチドの濃度であり、Ｑｂ／Ｑｆはフルオロフォアタンパク質の相互作用に対する補正係数であり、Ａｍａｘは、ペプチド全てタンパク質に結合した場合の最大のＦＡ値であり、一方で、Ａｍｉｎはペプチド全てが遊離した場合のＦＡ値である。１００ｎＭのＦＩＴＣ標識Ｐｉｎ１阻害剤５を１μＭのＰｉｎ１でインキュベーションし、続いて０〜５μＭの非標識阻害剤を添加することによりＦＡ競合アッセイを実施した。ＦＡ値をプレートリーダーで同様に測定した。４つのパラメーターの用量応答阻害式（Ｐｒｉｓｍ ６，ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、競合濃度に対してＦＡ値をプロットし、曲線に当てはめることによりＩＣ５０値を得た。
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）の一種である、シクロ（Ｐｈｅ−Ｎａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ）（ｃＦΦＲ４、式中、ΦすなわちＮａｌはＬ−ナフチルアラニンである）が近年発見された（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３−４３１）。通常は直鎖ペプチドである、エンドソーム内に優勢に閉じ込められる以前のＣＰＰとは異なり、ｃＦΦＲ４はエンドソームから細胞質に効率的に流入することが可能である。短いペプチドカーゴ（１〜７個のアミノ酸）を、ｃＦΦＲ４環内に直接取り込むことにより、哺乳類細胞内に送達することが可能である。細胞内タンパク質に対する細胞膜透過性阻害剤としての、細胞膜透過性配列及び標的結合配列の両方を含有する二官能性環状ペプチドの開発可能性を試験した。ＰＴＰ１Ｂに対して特異的な阻害剤を作製するために、１ビーズ２化合物ライブラリーを、空間的に分離したＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂上で合成した（Ｌｉｕ，Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，７６７８−７６８０）。このライブラリーでは、各ビーズは表面で二官能性環状ペプチドを示し、内部にコードタグとして対応する直鎖ペプチドを含有した（図２３及び図２４）。二官能性環状ペプチドは全て、片側に両親媒性ＣＰＰモチーフＦΦＲ４（またはその逆配列のＲＲＲＲΦＦ）を、及び逆側にランダムなペンタペプチド配列（Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５）を特徴とした。式中、Ｘ２はＴｙｒ及びＦ２Ｐｍｐの９：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）混合物を示し、 Ｘ１、及びＸ３〜Ｘ５は、１０個のタンパク質構成Ｌ−アミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、５つの非天然α−Ｌ−アミノ酸（Ｆ２Ｐｍｐ、Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン（Ｆｐａ）、Ｌ−ノルロイシン（Ｎｌｅ）、Ｌ−フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、Ｌ−ピペコリン酸（Ｐｉｐ））、並びに、９個のα−Ｄ−アミノ酸（Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｌ−β−ナフチルアラニン（Ｄ−Ｎａｌ）、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｈｒ、及びＤ−Ｖａｌ）を含む２４個のアミノ酸のいずれかである。９：１の比率のＴｙｒ／Ｆ２ＰｍｐをＸ２位で用いると、表面ペプチド担持が５分の１に低下したと共に、ビーズ表面でのＦ２Ｐｍｐ含有ペプチドの量を５０倍低下させ、ライブラリースクリーニング中の厳密性を増加させ、非特異的結合を最小限に抑える（Ｃｈｅｎ，Ｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００９，１１，６０４−６１１）。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識ＰＴＰ１Ｂに対するライブラリー（理論上の多様性は６．６×１０５個）をスクリーニングすることで６５個の陽性ビーズが得られ、これらを別々に、部分Ｅｄｍａｎ分解及び質量分析（ＰＥＤ−ＭＳ）（Ｔｈａｋｋａｒ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，５９３５−５９３９）で配列決定し、４２個の完全な配列を得た（表１２）。興味深いことに、選択したＰＴＰ１Ｂ阻害剤の大部分は、逆ＣＰＰモチーフ（ＲＲＲＲΦＦ）を含んだ。


ａＦｐａ＝Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン；Ｐｉｐ＝Ｌ−ホモプロリン；Ｎｌｅ＝Ｌ−ノルロイシン；Ｐｈｇ＝Ｌ−フェニルグリシン；Ｆ２Ｐｍｐ＝Ｌ−４−（ホスホノジフルオロメチル）フェニルアラニン。
＊配列を更に分析に通した。
３つのヒット配列（Ｄ−Ｔｈｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｆ２Ｐｍｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（阻害剤１）、Ｓｅｒ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｆ２Ｐｍｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（阻害剤２）、及びＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｇ−Ｆ２Ｐｍｐ−Ｎｌｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（阻害剤３））を再び合成し、ＨＰＬＣで精製した。３つのペプチドは全て、競合ＰＴＰ１Ｂ阻害剤であり（表１３）、ペプチド２が最も強力である（ＫＩ＝５４ｎＭ）（図２５）。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識阻害剤２で処理したヒト細胞の共焦点顕微鏡分析は、不十分ペプチドの細胞取り込みを示した（図２６ａ）。ｃＦΦＲ４環内に挿入されるカーゴのサイズが増加すると、環状ペプチドの細胞取り込み効率が低下することが以前から示されている（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３−４３１）。より大きな環は、構造的に一層柔軟であり、エンドサイトーシス中に細胞表面受容体（例えば膜リン脂質）にさほど強力に結合しない場合がある。負に荷電したＦ２Ｐｍｐはまた、ＦΦＲ４モチーフと細胞内で相互作用し、ＣＰＰ機能に干渉する場合がある。

阻害剤２の細胞膜透過性を向上させるために、ＣＰＰモチーフが一方の環内に配置されながら、標的結合配列が別の環を構成する二環式環（図２３）を調査した。二環式環はＣＰＰ環を最少の大きさにとどめ、以前に観察した動向（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３−４３１）によると、より効率的な細胞内取り込みをもたらすことができる。後者の組み込みはＣＰＰ環のサイズを変化させず、それ故に環状ＣＰＰの送達効率に影響を与えるはずはないため、二環式環は任意のサイズのカーゴを収容することができなければならない。硬いスキャフォールド（例えばトリメシン酸）の使用はまた、ＣＰＰ及びカーゴモチーフを互いに離したまま保持し、いかなる相互干渉をも最小限に抑え得る。単環式ペプチドと比較して、二環式ペプチドのより小さな環は、構造的により強い硬さ、及び改善された代謝安定性をもたらすことができる。
単環式ＰＴＰ１Ｂ阻害剤２を二環式ペプチドに転換するため、（固体支持体への結合、及びペプチド環化に使用した）Ｇｌｎ残基を（Ｓ）−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）で置き換え、第２のＤａｐ残基をＣＰＰとＰＴＰ１Ｂ結合配列の分枝点（Ｃ末端からＨｉｓ）に挿入した（図２３）。自転車（ｂｉｃｙｃｌｅ）の合成を、トリメシン酸、Ｎ末端アミン、及び２つのＤａｐ残基の側鎖間に３つのアミド結合を形成することにより達成した（図２７）（Ｌｉａｎ，Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，１１９９０−１１９９５）。手短かに言えば、直鎖ペプチドを、Ｒｉｎｋアミド樹脂上で標準的なＦｍｏｃ化学作用、及びＮβ−アロキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）保護Ｄａｐを使用して合成した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去した後、露出したアミンをトリメシン酸でアシル化した。Ａｌｌｏｃ基をＰｄ（ＰＰｈ３）４で除去した後、ＰｙＢＯＰで処理することにより、所望の二環式構造体を得た。蛍光プローブでのラベリングを容易にするため、Ｃ末端にリジンを添加した。二環式ペプチド（二環式ペプチド４）をＴＦＡで脱保護し、ＨＰＬＣにより均質に精製した。
二環式ペプチド４は、３７ｎＭのＫＩ値を有し、ＰＴＰ１Ｂの競合阻害剤として作用することができる（図２６ｂ）。このペプチドは、ＰＴＰ１Ｂに対して非常に選択的である。基質としてのｐ−ニトロフェニルホスフェート（５００μＭ）に対してアッセイを行った場合、阻害剤４は、ＰＴＰ１Ｂ及びＴＣＰＴＰに対して、それぞれ３０及び５００ｎＭのＩＣ５０値を有した（図２６ｃ及び表１４）。試験した他のＰＴＰのいずれに対しても、最小限の阻害を示した（１μＭの阻害濃度で、ＨｅＰＴＰ、ＳＨＰ−１、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＨ１、またはＰＴＰＲＯを１０％以下で阻害）。ＦＩＴＣ標識阻害剤４で処理したＡ５４９細胞の生細胞共焦点顕微鏡法により検出したように、阻害剤４は、ペプチド２よりも向上した細胞膜透過性を有する（図２６ａ）。処理した細胞は、細胞質及び核全体における拡散した蛍光及び蛍光斑点の両方を示し、このことは、阻害剤の分画が細胞質及び核に到達した一方で、残りはエンドソーム内に取り込まれた可能性が高いことを示唆している。阻害剤４をヒト血清中で、３７℃にて２４時間インキュベーションすると、約１０％が分解した一方、阻害剤２の９１％が同一条件下で分解した（図２８）。全体的に、阻害剤４は、潜在能、非常に類似したＴＣＰＴＰを上回る選択性（１７倍）、細胞膜透過性、及び安定性に関して今日まで報告されている低分子ＰＴＰ１Ｂ阻害剤（Ｑｉａｎ，Ｚ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，８，４２３−４３１）と比較しても遜色がない。

ａＮＡは、１μＭの阻害剤で目立った阻害がなかった。
次に、阻害剤４の細胞シグナル伝達中にＰＴＰ１Ｂ機能を乱す能力について試験した。Ａ５４９細胞を阻害剤４（０〜５μＭ）で処理すると、多数のタンパク質のホスホチロシン（ｐＹ）量が用量に依存して増加し、このことは、ＰＴＰ１Ｂの広範な基質特異性と一致する（Ｒｅｎ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１，５０，２３３９）（図２９ａ）。クマシーブルー染色による同一サンプルの分析は、全てのサンプルにおいて同量のタンパク質を示し（図２９ｂ）、このことは、増加したｐＹの量は、全タンパク質の量の変化の代わりに、リン酸化反応の増加（またはＰＴＰ反応の減少）を反映したことを示している。注目すべきことに、チロシンリン酸化反応の増加は、８ｎＭの阻害剤４で既に明らかであった。興味深いことに、阻害剤濃度が１μＭを超えて更に増加すると、チロシンリン酸化反応の効果が逆転し、この観測結果は以前にも、異なるＰＴＰ１Ｂ阻害剤に関して、Ｚｈａｎｇ及び協力者により出されていた（Ｘｉｅ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，４２，１２７９２−１２８０４）。細胞内ＰＴＰ１Ｂがペプチド４により阻害されたという更なる証拠を得るために、ｉｎ ｖｉｖｏでの、インスリン受容体（ＩＲ）である、十分に確立されたＰＴＰ１Ｂ基質におけるｐＹの量（Ｅｌｃｈｅｌｂｙ，Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８３，１５４４−１５４８；Ｚａｂｏｌｏｔｎｙ，ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ２００２，２，４８９−４９５）を、ｐＹ１１６２ｐＹ１１６３部位に対する、特異的抗体による免疫ブロッティングにより監視した。再び、阻害剤４での処理は、インスリン受容体のリン酸化反応の、１μＭの阻害剤までの用量依存性増加を引き起こし、この効果はより高い濃度では横ばいとなった（図２９ｃ、ｄ）。これらを合わせると、これらのデータは、二環式阻害剤４は哺乳類細胞内に効率的に入ることができ、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＴＰ１Ｂを阻害することができることを示している。高い阻害剤濃度におけるリン酸化反応の減少は、他のＰＴＰの非特異的阻害により引き起こされる場合がある（そして結果的に、プロテインチロシンキナーゼを下方制御し得る）。リン酸化反応の減少はまた、ＰＴＰ１Ｂが果たす多面発現性の役割を反映する場合もあり、これは異なるプロテインキナーゼの活性を負、及び正の両方で制御することができる（Ｌｅｓｓａｒｄ，Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２０１０，１８０４，６１３）。
二環式アプローチの普遍性を試験するため、このアプローチを利用し、強力で選択的、かつ生物学的に活性な阻害剤を依然として欠いている（Ｍｏｒｅ，ＪＤ ａｎｄ Ｐｏｔｔｅｒ，Ａ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１３，２３，４２８３−９１）、癌を含む種々のヒト疾患の治療のための潜在的標的である、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼＰｉｎ１に対する細胞膜透過性阻害剤を設計した（Ｌｕ，ＫＰ ａｎｄ Ｚｈｏｕ，ＸＺ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００７，８，９０４−９１６）。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＰｉｎ１に対する強力阻害剤である（ＫＤは２５８ｎＭ）が、膜不透過性である、以前に報告されている単環式ペプチド（５）（Ｌｉｕ，Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，２４９４−２５０１）を、ｃＦΦＲ４と縮合させた（図３０）。更に、ｐＴｈｒ＋３位のＬ−ＴｙｒをＡｒｇで置き換え、水への可溶性を向上させた。得られた二環式ペプチド６は、１３１ｎＭのＫＤ値でＰｉｎ１に結合した（表１５及び図３１）。Ｄ−ＡｌａをｐＴｈｒ＋５位に挿入することで、Ｐｉｎ１結合及び細胞膜透過モチーフとの分離を増加させて、阻害剤の潜在能が約２倍改善した（阻害剤７に対するＫＤ＝７２ｎＭ）。阻害剤７はＰｉｎ１への結合に関してＦＩＴＣ標識阻害剤５と競合し（図３２）、このことは、これらが共にＰｉｎ１の活性部位に結合できることを示している。阻害剤７のＤ−ｐＴｈｒをＤ−Ｔｈｒで置換することで、潜在能が約１０倍低下した（阻害剤８に関して、ＫＤ＝６２０ｎＭ、表１６）が、ピペコリル残基をＤ−Ａｌａで更に置き換えると、Ｐｉｎ１阻害活性は消失した（ペプチド９）。二環式阻害剤７〜９は細胞膜透過性であった（図３３）。阻害剤７によるヒーラー細胞の処理は、細胞増殖の時間依存性及び用量依存性阻害をもたらした（２０μＭの阻害剤７による処理で、３日後に４５％阻害）が、単環式阻害剤５及び不活性ペプチド９には効果がなかった（図３４）。ペプチド８もまた細胞増殖を阻害したが、阻害剤７よりは小規模だった。

ａＤａｐ＝Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎａｌ＝Ｌ−β−ナフチルアラニン；Ｐｉｐ＝Ｌ−ピペコリン酸；Ｓａｒ＝サルコシン；Ｔｍ＝トリメシン酸。ＦＡ分析に関して、全てのペプチドについて、Ｃ末端リジン側鎖をＦＩＴＣで標識した。
結論として、細胞内標的に対する細胞膜透過性二環式ペプチドを設計する、潜在的に一般的なアプローチが開発された。これらの予備研究は、ＰＴＰ１Ｂ結合モチーフを、異なる物理化学的性質を有する他のペプチド配列で置き換えることでもまた、培養した哺乳類細胞内への効率的な送達が得られたことを示している。 一般的な細胞内送達法の利用可能性は、薬物発見及び生物医学的調査における、環状ペプチドの実用性を大いに拡大するはずである。
実施例４
表１６のＣＰＰ配列についてもまた、本明細書で議論する。全ての取り込み／送達効率は表１７に示し、これらはｃＦΦＲ４（２９０−１Ｆ、１００％）の取り込み／送達効率と比較する。ＳＵＶ１は、哺乳類細胞の中性外膜を模した、単層小ベシクルである［４５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）、２０％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、２０％のスフィンゴミエリン（ＳＭ）、及び１５％のコレステロール（ＣＨＯ）］。ＳＵＶ２は、哺乳類細胞の負に荷電したエンドソーム膜を模した単層小ベシクルである［５０％のＰＣ、２０％のＰＥ、１０％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及び２０％のビス（モノアシルグリセロール）ホスフェート］。
測定は、ＦＩＴＣ標識環状ペプチドを使用して、増加するベシクル濃度に対して蛍光偏光を行った。実験を、ｐＨ７．４及び５．５で実施した（ｐＨは、細胞内の後期エンドソームのもの）。
全体の送達効率は、ｐＨ７．４におけるエンドソーム膜に対するＣＰＰの結合親和性と相関するようである。即ち、結合が強力であると、送達効率は高くなる。


Φ＝Ｌ−ナフチルアラニン；φ＝Ｄ−ナフチルアラニン；ｆ＝Ｄ−フェニルアラニン；ｒ＝Ｄ−アルギニン；ｑ＝Ｄ−グルタミン
実施例５
心筋細胞は通常、ＤＮＡをトランスフェクションすることが困難であり、以前のＣＰＰを用いて細胞内にタンパク質を送達することは成功していない。したがって、心臓組織内に治療用タンパク質を送達する必要が満たされていない。
開示した環状ＣＰＰは、タンパク質を心筋細胞内に送達するのに大変効果的である。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した環状ＣＰＰ［ｃ（ＦΦＲＲＲＲＱ）−Ｋ（ＦＩＴＣ）−ＮＨ２及びｃ（ｆΦＲｒＲｒＱ）−Ｋ（ＦＩＴＣ）−ＮＨ２］を合成し、これらの、マウス心室心筋細胞への内在化を、細胞を５μＭのＦＩＴＣ標識ペプチドで３時間処理することにより、試験した。細胞外ペプチドを洗い流した後、蛍光生細胞共焦点顕微鏡法により、ＣＰＰの内在化を調査した。両方のペプチドが、細胞全体に著しい、かつ優勢な拡散傾向を示し、このことは、ＣＰＰの心筋細胞への効率的な内在化を示す（図３５ａ及び３５ｂ）。環状ＣＰＰが、完全長タンパク質を心筋細胞内に輸送可能であるか否かを試験した。多機能性のカルシウム結合メッセンジャータンパク質であるカルモジュリン（Ｔｈｒ５Ｃｙｓを組み換え）を、Ｎ末端付近のＣｙｓ残基にて、ジスルフィド結合を介してｃ（ＦΦＲＲＲＲＱ）−Ｃ−ＮＨ２にコンジュゲートさせた。ジスルフィド交換反応は非常に特異的、効率的、かつ可逆的である。更に、細胞の細胞質基質に入る際、ジスルフィド結合が還元され、天然のタンパク質を放出することが予想される（図３５ｃ）。ＣＰＰ−タンパク質コンジュゲートを、内在化カルモジュリンの可視化を可能にするシアニン３によりアミノ基上で化学的に標識した。マウスの心室心筋細胞を、６μＭのＣＰＰ−カルモジュリンコンジュゲートで３時間インキュベーションし、生細胞共焦点顕微鏡法により調査した。細胞内蛍光シグナルは、細胞の容量全体を通して現れ、サルコメア模様を示した（図３５ｄ）。このことは、内在化カルモジュリンは適切に、細胞内機構に組み込まれたことを示している。これらのデータは、開示した環状ＣＰＰ（例えばｃ（ＦΦＲＲＲＲＱ）） は低分子及びタンパク質（天然形態と思われる）を心筋細胞内に高効率で、比類無く送達することができることを示しており、将来的な治療用途への扉が開かれている。
実施例６
Ｐｉｎ１は、リン酸化依存性ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）である。Ｐｉｎ１は、Ｎ末端ＷＷドメインとＣ末端触媒領域を含有し、これらは共に、タンパク質基質内で特異的なホスホセリン（ｐＳｅｒ）／ホスホスレオニン（ｐＴｈｒ）−Ｐｒｏモチーフを認識する。特異的ｐＳｅｒ／ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ結合のシス−トランス異性化により、Ｐｉｎ１はその量、活性、及び多種多様のリンタンパク質の細胞内局在性を制御する。例えば、Ｐｉｎ１はサイクリンＤ１とサイクリンＥの生体内安定性を調節し、不活性の不安定形態と活性の安定形態との間で、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、及びＮＦ−κＢを切り替える。Ｐｉｎ１による異性化はまた、ホスファターゼＣＤＣ２５Ｃ及びキナーゼＷｅｅ１等の、多数の細胞周期シグナリングタンパク質の触媒活性も制御する。最終的に、Ｐｉｎ１触媒による、β−カテニン及びＮＦ−κＢのコンホメーション変化は、細胞内転座をもたらした。
ヒトの癌における細胞周期制御、並びに発現レベル及び活性の増加における重要な役割を考慮して、Ｐｉｎ１は抗癌剤の開発のための潜在的標的として提示されてきた。Ｐｉｎ１はまた、アルツハイマー病等の神経変性疾患にも関与している。したがって、Ｐｉｎ１に対する特異的阻害剤の開発に、大きな関心が存在し続けている。ジュグロン、ＰｉＢ、ジペンタメチレンチウラムモノスルフィド及びハロゲン化フェニルイソチアゾロン（ＴＭＥ−００１）等の低分子阻害剤は通常、十分な潜在能及び／または特異性を欠いている。多数の強力なペプチジルＰｉｎ１阻害剤が報告され、これらは低分子阻害剤よりも選択的である。しかし、ペプチジル阻害剤は通常、細胞膜に不透過性であるため、治療薬またはｉｎ ｖｉｖｏプローブとしては実用性が限られている。一方の環（Ａ環）がＰｉｎ１結合ホスホペプチドモチーフ［Ｄ−ｐＴｈｒ−Ｐｉｐ−Ｎａｌ、式中、Ｐｉｐ及びＮａｌはそれぞれ、（Ｒ）−ピペリジン−２−カルボン酸及びＬ−ナフチルアラニンである］であり、一方、第２の環（Ｂ環）が細胞膜透過性ペプチドであるＰｈｅ−Ｎａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇを含有する、Ｐｉｎ１に対する細胞膜透過性二環式ペプチジル阻害剤を、図３６に示す（ペプチド１）。二環式ペプチジル阻害剤が細胞アッセイでは強力（ＫＤ＝７２ｎＭ）かつ活性であるものの、Ｄ−ｐＴｈｒ部位は、非特異的ホスファターゼによる加水分解のため、代謝的に不安定であり得る。ホスフェート基の負電荷はまた、阻害剤の細胞内流入を阻害し得る。ここで、Ｐｉｎ１に対する非リン酸化二環式ペプチジル阻害剤を、ペプチドライブラリーをスクリーニングし、ヒット最適化により調製した。得られた二環式ペプチジル阻害剤は、Ｐｉｎ１に対してはｉｎ ｖｉｔｒｏで強力かつ選択的であり、細胞膜透過性であり、かつ、バイオアッセイで代謝的に安定している。
ペプチド１のホスホリル基を除去すると、Ｐｉｎ１に対する潜在能が著しく低下したが、非リン酸化ペプチド（図３６、ペプチド２）は依然として、比較的強力なＰｉｎ１阻害剤であった（ＫＤ＝０．６２μＭ）。Ｄ−Ｔｈｒ−Ｐｉｐ−Ｎａｌモチーフに隣接する配列を最適化することにより、ペプチド２の潜在能を更に改善させてよい。そのため、第２世代二環式ペプチドライブラリーのビシクロ［Ｔｍ−（Ｘ１Ｘ２Ｘ３−Ｐｉｐ−Ｎａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）−Ｄａｐ−（Ｐｈｅ−Ｎａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｄａｐ）］−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−Ｐｒａ−β−Ａｌａ−Ｈｍｂ−β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−Ｍｅｔ−樹脂（図３５、式中、Ｔｍはトリメシン酸、Ｄａｐは２，３−ジアミノプロピオン酸、β−Ａｌａはβ−アラニン、ＰｒａはＬ−プロパルギルグリシン、及びＨｍｂは４−ヒドロキシメチル安息香酸である）を、ペプチド２の３つのＮ末端残基を無作為化することにより作製した。Ｘ１及びＸ２は、１２個のタンパク質構成Ｌ−アミノ酸［Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ］、５個の非タンパク質構成α−Ｌ−アミノ酸［Ｌ−４−フルオロフェニルアラニン（Ｆｐａ）、Ｌ−ノルロイシン（Ｎｌｅ）、Ｌ−オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｌ−フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、及びＬ−Ｎａｌ］、６個のα−Ｄ−アミノ酸［Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、及びＤ−Ｖａｌ］、並びに４個のＮα−メチル化Ｌ−アミノ酸［Ｌ−Ｎα−メチルアラニン（Ｍａｌ）、Ｌ−Ｎα−メチルロイシン（Ｍｌｅ）、Ｌ−Ｎα−メチルフェニルアラニン（Ｍｐａ）、及びサルコシン（Ｓａｒ）］を含む、２７個のアミノ酸構築ブロックのいずれかを示し、Ｘ３はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、またはＤ−Ｔｈｒであった。これらの非タンパク質原生アミノ酸の組み込みは、ライブラリーペプチドの構造的多様性及びタンパク質分解安定性の両方を増加させることが予想された。ライブラリーは理論上、５×２７×２７、または３６４５個の異なる二環式ペプチドの多様性を有し、これらの（全てではないにせよ）大部分は、細胞膜透過性であることが予想された。ライブラリーは、５００ｍｇのＴｅｎｔａＧｅｌマイクロビーズ（１３０μｍ、約７．８×１０５個のビーズ／ｇ、約３５０ｐｍｏｌのペプチド／ビーズ）上で合成した。ペプチド環化は、Ｔｍ、Ｎ末端アミン、及び２つのＤａｐ残基の側鎖間で３つのアミド結合を形成することにより達成された。

ａヒット１〜３は第１ラウンドのスクリーニングから選択したが、ヒット４〜７は第２ラウンドのスクリーニングから選択した。
β−Ａｌａは柔軟なリンカーを提供する一方、Ｐｒａは二環式ペプチドの、蛍光プローブを用いた、クリックケミストリーによるビーズ上での標識のためのハンドルとして機能する。Ｈｍｂのエステル結合は、溶液相結合分析のための、樹脂から二環式ペプチドの選択的放出を可能にする。最終的に、Ｃ末端のＭｅｔが、ＭＳ分析の前にＣＮＢｒ切断により、樹脂からのペプチド放出を可能にする。
ライブラリー（１００ｍｇの樹脂）を、欠陥ＷＷドメインを有するＳ１６Ａ／Ｙ２３Ａ変異体Ｐｉｎ１に対してスクリーニングした。変異体Ｐｉｎ１を、Ｎ末端にてマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合として作製した。スクリーニングの第１ラウンドの間、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄで標識したＭＢＰ−Ｐｉｎ１をペプチドライブラリーでインキュベーションし、蛍光ビーズを顕微鏡下にてライブラリーから取り除いた。３つの陽性ビーズが、残りのヒットよりも著しく大きい蛍光強度を有し、これらを部分Ｅｄｍａｎ分解および質量分析（ＰＥＤ−ＭＳ）によるペプチド配列決定に直接通した（表１７）。他の１３個の蛍光ビーズをスクリーニングの第２ラウンドに通し、この間に、各ビーズ上の二環式ペプチドをテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）アジドで、Ｐｒａ残基を標識し、ＮａＯＨ溶液による処理でビーズから外した。




放出したペプチドを５μＭのＭＢＰ−Ｐｉｎ１でインキュベーションし、蛍光異方性（ＦＡ）の増加を測定した。（非タンパク質対照と比較して）５０％以上のＦＡ増加を示した二環式ペプチドに関して、対応するビーズ（５ビーズ、依然として直鎖コードペプチドを含有した）をＰＥＤ−ＭＳにより配列決定し、４つの更なる完全配列を得た（表１）。７つのヒット配列は全て、Ｘ３位にＤ−アミノ酸を含有し、これは、Ｐｉｎ１がこの位置にてｐＴｈｒよりもＤ−ｐＴｈｒを好むという観測結果に一致した。Ｘ１位においては、疎水性、特に芳香族疎水性残基が強く好まれるが、Ｘ２位では明確な選択性は存在しない。
ヒット最適化。６つのヒット配列（ヒット１及び２は同一配列を有する）を、リジンをＣ末端に添加して再合成し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識し、ＦＡによりＰｉｎ１への結合を試験した（表１８、ペプチド３〜８）。６つのペプチドは全て、中程度な親和性（ＫＤは約１μＭ）でＰｉｎ１に結合したが、ペプチド２では改善されなかった（ＫＤ＝０．６２μＭ）。ペプチド３及び４を、構造活性関係の分析及び最適化のために使用した。Ｐｉｎ１結合環（Ａ環）のサイズを拡大または縮小するかのいずれかにより、結合親和性が低下した（表１８、ペプチド９〜１６）。ペプチド３のＡｌａ残基を、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌを含む、異なる物理化学的性質の側鎖を含有するアミノ酸で置き換えることでもまた、結合親和性を著しく改善することはできなかった（表１８、ペプチド１７〜２１）。一方、Ｄ−Ａｌａ残基の修飾は、この位置におけるＤ−Ｐｈｅの置換は、Ｐｉｎ１阻害活性を約２倍（ペプチド２２に関して、ＫＤ＝０．４８μＭ）増加させたことを明らかにした。
ペプチド４を、同様にＳＡＲ研究に通した。ペプチド３について観察されたように、ペプチド４のＡｌａ残基を（Ｇｌｙに）修飾することは、殆ど効果がなかった（ペプチド２６）が、Ｄ−Ａｌａ残基をＤ−Ｐｈｅで置き換えることで、Ｐｉｎ１への結合が約２倍改善された（表１８、ペプチド２７に関して、ＫＤ＝０．２７μＭ）。Ｘ２位にてＦｐａ残基を修飾（例えば、他のハロゲン化フェニルアラニン類似体による置き換え）することで、阻害潜在能は全て低下した（ペプチド２８〜３２）。同様に、Ｘ１位における芳香族側鎖の除去は、Ｐｉｎ１結合に有害であった（ペプチド３３及び３４）。しかし、ハロゲン化Ｄ−Ｐｈｅ類似体の置換は、Ｐｉｎ１結合活性を改善した（ペプチド３５〜３８）。特に、Ｄ−ＰｈｅをＤ−４−フルオロフェニルアラニン（Ｄ−Ｆｐａ）で置き換えることで、この一連の中で最も強力なＰｉｎ１阻害剤が得られた（ペプチド３７に関して、ＫＤ＝０．１２μＭ）（図３６及び３７ａ）。Ｄ−Ｔｈｒ残基またはＣＰＰモチーフを修飾する更なる試みでは、Ｐｉｎ１活性を改善することはできなかった（表１８、ペプチド３９〜４５）。
生物学的評価。ペプチド３７がＰｉｎ１の触媒部位に結合するか否かを測定するために、Ｐｉｎ１への結合について、ペプチド１との競合能力をＦＡ分析により調査した。ペプチド１は以前に、Ｐｉｎ１の活性部位に結合することが示されている。予想通り、ペプチド３７は、１９０ｎＭのＩＣ５０値で、ペプチド１のＰｉｎ１への結合を阻害した（図３７ｂ）。次に、濃度が増加するペプチド３７の存在下における、ペプチド基質のＳｕｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡに対するＰｉｎ１の触媒活性を監視した。ペプチド３７は濃度に依存してＰｉｎ１活性を阻害し、ＩＣ５０値は１７０ｎＭであった（図３７ｃ）。これらの結果は、ペプチド３７はＰｉｎ１の活性部位（またはその近く）に結合することを示している。
ペプチド３７の選択性を、２つの異なる試験により評価した。まず、 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ、ＳＨＰ１及びＳＨＰ２、Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメイン、Ｒａｓ、並びに腫瘍壊死因子αを含む、任意に選択したタンパク質のパネルへの結合について、ペプチド３７を試験した。ペプチド３７はＢＳＡにわずかに結合した（ＫＤ＝約２０μＭ）が、他の６つのタンパク質はいずれも結合しなかった。次に、３つの他の、一般的なヒトペプチジル−プロリルシストランスイソメラーゼである、Ｐｉｎ４、ＦＫＢＰ１２、及びサイクロフィリンＡの潜在的阻害に関して、ペプチド３７を試験した。Ｐｉｎ４はＰｉｎ１に構造的に類似し、部分的にはＰｉｎ１と重なる機能を有するが、ペプチド３７はＰｉｎ４をほんのわずかに阻害し（５μＭの阻害剤で約１５％）、推定ＩＣ５０値は約３４μＭである（図３７ｃ）。ペプチド３７は、５μＭの濃度までは、ＦＫＢＰ１２またはサイクロフィリンＡの触媒活性には影響を及ぼさなかった。これらのデータは、ペプチド３７はＰｉｎ１の非常に特異的な阻害剤であることを示唆している。
ペプチド３７の代謝安定性を、種々の時間でヒト血清中にてインキュベーションし、逆相ＨＰＬＣにより反応混合物を分析することにより評価した。ｐＴｈｒ含有Ｐｉｎ１阻害剤１を対照として使用した。６時間のインキュベーション後、９７％のペプチド３７はインタクトなままであったが、二環式ペプチド１の約５０％は３時間後に分解された（図３７ｄ）。ペプチド１の消失は、ＨＰＬＣにて新しいピークが付随的に現れることにより達成された。新しい種の質量分析は、この消失をペプチド１の脱リン酸化生成物（ペプチド２）と識別した。この結果は、構造上制約のある二環式ペプチドが、タンパク質分解に大変耐性があるという我々の以前の観測結果と一致する。Ｄ−ｐＴｈｒ部位は、ヒト血清中において、非特異的ホスファターゼによる加水分解を受けやすいままである。
ペプチド３７、ペプチド１、及び以前に報告した膜不透過性単環式Ｐｉｎ１阻害剤（表１８、ペプチド４６）の細胞取り込み効率を、ＦＩＴＣ標識ペプチド（５μＭ）で２時間、ヒーラー細胞をインキュベーションし、フローサイトメトリー分析により、細胞内の全蛍光を定量化することにより評価した。予想通り、未処理細胞、及びペプチド４６で処理した細胞は殆ど細胞蛍光を示さず、それぞれ１０１、及び１９３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を有した（図３８ａ）。対照的に、ペプチド１及び３７で処理した細胞はそれぞれ、２５６２、及び８７９２のＭＦＩ値を示した。したがって、ペプチド３７はペプチド１よりも、ヒーラー細胞により約４倍効率的に内在化された。おそらく、ペプチド１の負に荷電したホスフェート基が正に荷電したＣＰＰモチーフと静電相互作用を起こし、後者の細胞取り込み効率を低下させた。
Ｐｉｎ１活性の阻害は細胞増殖を低下させることが、以前に示されている。ヒーラー細胞の増殖におけるペプチド３７の効果を、ＭＴＴ細胞生存アッセイを使用して調査した。膜不透過性ペプチド４６、及び細胞膜透過性ではあるが、不活性な（Ｐｉｎ１結合を欠損している）二環式ペプチド（表１８、ペプチド４７）を対照として使用した。ペプチド３７は、１．０μＭのＩＣ５０で、濃度に依存して細胞増殖を阻害した（図３８ｂ）。予想通り、ペプチド４６も４７も、細胞増殖にいかなる影響も及ぼさなかった。経時変化研究もまた、ペプチド４６または４７ではなく、５μＭのペプチド３７で３日処理した後の、著しい増殖阻害（６０％超）を示した。類似の試験条件下での、リン酸化二環式ペプチド１は、１．８μＭのＩＣ５０値を有した。
最終的に、Ｐｉｎ１がｉｎ ｖｉｖｏでのペプチド３７の分子標的であることを確認するために、十分に確立したＰｉｎ１基質の細胞内タンパク質である、前骨レチノイン酸（ｐｒｏｍｙｅｌｏｒｅｔｉｎｏｉｃ）白血病タンパク質（ＰＭＬ）の量を、ウェスタンブロット分析で調査した。Ｐｉｎ１はリン酸化反応に依存してＰＭＬの量を負に調節し、Ｐｉｎ１活性の阻害は、ＰＭＬを安定化させ、ＰＭＬの細胞内の量を増加させることが予想される。実際、ヒーラー細胞をペプチド３７（０．２〜５μＭで処理することで、ＰＭＬ量の濃度依存性増加がもたらされた（図３８ｃ、ｄ）。効果は、０．２μＭの阻害剤で既に著しく（ＰＭＬの量が１．８倍増加）、約１μＭで平坦となった（３．３倍の増加）。再び、二環式ペプチド４７は同一条件下にて影響を及ぼさなかった一方、ペプチド１（陽性対照、５μＭにて）はＰＭＬの量を３．１倍増加させた。
ペプチドライブラリーのスクリーニング、続いて従来の医薬品化学アプローチにより、第１の、ヒトＰｉｎ１に対して強力で選択的、代謝安定的、かつ細胞膜透過性のペプチジル阻害剤が開示された。この高い潜在能及び選択性は、細胞膜透過性ペプチドを、Ｐｉｎ１の細胞機能を調査するための有用な化学プローブとするはずである。
別段定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、開示される発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書で引用した出版物、及びこれらから引用されている材料は明確に、参考として組み込まれる。
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。

Claims (18)

  1. 式Ｉａ、
    Ｉａ

    または薬剤として許容されるその塩を含む、環状ペプチド
    （式中、
    ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９はそれぞれ独立してアミノ酸であり、かつ
    ｍ、ｎ、及びｐは０及び１から独立して選択される）。
  2. ｍ及びｎはそれぞれ０であり、
    ｐは１であり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンである、
    請求項１に記載の環状ペプチド。
  3. ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＬ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンである、
    請求項１に記載の環状ペプチド。
  4. ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＬ−グルタミンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−フェニルアラニンである、
    請求項１に記載の環状ペプチド。
  5. 前記環状ペプチドは、アミノ酸が全てＬ−アミノ酸である同一のアミノ酸配列を有するペプチドよりも、少なくとも約５倍大きな細胞取り込み効率を有する、請求項１に記載の環状ペプチド。
  6. 式ＩＩａ、ＩＩｂ、もしくはＩＩｃ、

    ＩＩａ
    、
    もしくは
    ＩＩｂ
    ＩＩｃ

    または薬剤として許容されるその塩を含む環状ペプチド
    （式中、
    （ｉ）
    ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９はそれぞれ独立してアミノ酸であり、
    ｍは０であり、
    ｎ、及びｐは０及び１から独立して選択され、かつ
    前記カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含むか、あるいは
    （ｉｉ）
    ＡＡ１はＬ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ４はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９はそれぞれ独立してアミノ酸であり、
    ｍは０であり、
    ｎ、及びｐは０及び１から独立して選択され、かつ
    前記カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含む）。
  7. ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍ及びｎはそれぞれ０であり、
    ｐは１であり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンである、
    請求項６に記載の環状ペプチド。
  8. ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＬ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであり、
    前記カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、
    請求項６に記載の環状ペプチド。
  9. ＡＡ１はＬ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ４はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＬ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＤ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであり、
    前記カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含む、
    請求項６に記載の環状ペプチド。
  10. 前記環状ペプチドは、アミノ酸が全てＬ−アミノ酸である同一のアミノ酸配列を有するペプチドよりも、少なくとも約５倍大きな細胞取り込み効率を有する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の環状ペプチド。
  11. 式ＩＩａ、ＩＩｂ、もしくはＩＩｃ、

    ＩＩａ
    、

    、もしくは
    ＩＩｂ
    ＩＩｃ

    または薬剤として許容されるその塩を含む環状ペプチドを細胞に投与することを含む、治療薬を細胞の細胞質に送達する方法
    （式中、
    ＡＡ １ はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９はそれぞれ独立してアミノ酸であるか、あるいは
    ＡＡ １ はＬ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ４はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ７、ＡＡ８、及びＡＡ９はそれぞれ独立してアミノ酸であり、
    ｍは０であり、ｎ、及びｐは０及び１から独立して選択され、かつ
    前記カーゴは治療薬を含む、
    ことで、前記治療薬を前記細胞の前記細胞質に送達する）。
  12. ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍ及びｎはそれぞれ０であり、
    ｐは１であり、かつ
    ＡＡ ９ はＬ−グルタミンである、
    請求項１１に記載の方法。
  13. ＡＡ １ はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ ２ はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ ３ はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ ４ はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ ５ はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ ６ はＤ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＬ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンである、
    請求項１１に記載の方法。
  14. ＡＡ １ はＬ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ ２ はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ ３ はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ ４ はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ ５ はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ ６ はＬ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＤ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンである、
    請求項１１に記載の方法。
  15. 前記治療薬はＲａｓ、ＰＴＰ１Ｂ、Ｐｉｎ１、Ｇｒｂ２、ＳＨ２、またはこれらの組み合わせに対する阻害剤である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 式ＩＩａ
    ＩＩａ

    または薬剤として許容されるその塩を含む環状ペプチド
    （式中、

    （ｉ）ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍ及びｎはそれぞれ０であり、
    ｐは１であり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであるか、
    （ｉｉ）ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＬ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであるか、
    （ｉｉｉ）ＡＡ１はＬ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ４はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＬ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＤ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであり、
    前記カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含む）。
  17. 式ＩＩｂ
    ＩＩｂ

    または薬剤として許容されるその塩を含む環状ペプチド
    （式中、

    （ｉ）ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍ及びｎはそれぞれ０であり、
    ｐは１であり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであるか、
    （ｉｉ）ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＬ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであるか、
    （ｉｉｉ）ＡＡ１はＬ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ４はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＬ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＤ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであり、
    前記カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含む）。
  18. 式ＩＩｃ

    ＩＩｃ

    または薬剤として許容されるその塩を含む環状ペプチド
    （式中、

    （ｉ）ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍ及びｎはそれぞれ０であり、
    ｐは１であり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであるか、
    （ｉｉ）ＡＡ１はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ４はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＤ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＬ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであるか、
    （ｉｉｉ）ＡＡ１はＬ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ２はＤ−フェニルアラニンであり、
    ＡＡ３はＬ−ナフチルアラニンであり、
    ＡＡ４はＬ−アルギニンであり、
    ＡＡ５はＤ−アルギニンであり、
    ＡＡ６はＬ−アルギニンであり、
    ｍは０であり、
    ｎ及びｐはそれぞれ１であり、
    ＡＡ８はＤ−アルギニンであり、かつ
    ＡＡ９はＬ−グルタミンであり、
    前記カーゴ部位は検出可能部位、治療用部位、標的部位、またはこれらの組み合わせを含む）。
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